Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে সীমিত CSS সমর্থন রয়েছে৷সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷ইতিমধ্যে, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করতে, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটিকে রেন্ডার করব।
লিকুইড বায়োপসি (এলবি) একটি ধারণা যা বায়োমেডিকাল ক্ষেত্রে দ্রুত জনপ্রিয়তা অর্জন করছে।ধারণাটি মূলত সঞ্চালন বহির্মুখী ডিএনএ (ccfDNA) এর টুকরো সনাক্তকরণের উপর ভিত্তি করে, যা মূলত বিভিন্ন টিস্যুতে কোষের মৃত্যুর পরে ছোট টুকরো হিসাবে প্রকাশিত হয়।এই টুকরাগুলির একটি ছোট অনুপাত বিদেশী (বিদেশী) টিস্যু বা জীব থেকে উদ্ভূত হয়।বর্তমান কাজে, আমরা এই ধারণাটি ঝিনুকের ক্ষেত্রে প্রয়োগ করেছি, একটি সেন্টিনেল প্রজাতি যা তাদের উচ্চ সমুদ্রের জল পরিস্রাবণ ক্ষমতার জন্য পরিচিত।আমরা সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্য সম্পর্কে তথ্য প্রদানের জন্য বিভিন্ন উত্স থেকে পরিবেশগত ডিএনএ খণ্ডগুলি ক্যাপচার করতে প্রাকৃতিক ফিল্টার হিসাবে কাজ করার জন্য ঝিনুকের ক্ষমতা ব্যবহার করি।আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে ঝিনুক হেমোলিম্ফে ডিএনএ টুকরা রয়েছে যা আকারে 1 থেকে 5 কেবি পর্যন্ত পরিবর্তিত হয়।শটগান সিকোয়েন্সিং দেখায় যে প্রচুর পরিমাণে ডিএনএ খণ্ড বিদেশী মাইক্রোবিয়াল উত্সের।তাদের মধ্যে, আমরা ব্যাকটেরিয়া, আর্কিয়া এবং ভাইরাস থেকে ডিএনএ টুকরা পেয়েছি, যার মধ্যে ভাইরাসগুলি রয়েছে যা সাধারণত উপকূলীয় সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে পাওয়া বিভিন্ন হোস্টকে সংক্রামিত করতে পরিচিত।উপসংহারে, আমাদের অধ্যয়নটি দেখায় যে ঝিনুকের উপর প্রয়োগ করা এলবি ধারণাটি সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের জীবাণু বৈচিত্র্য সম্পর্কে জ্ঞানের একটি সমৃদ্ধ কিন্তু এখনও অনাবিষ্কৃত উত্স উপস্থাপন করে।
সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্যের উপর জলবায়ু পরিবর্তনের প্রভাব (CC) গবেষণার একটি দ্রুত বর্ধনশীল ক্ষেত্র।গ্লোবাল ওয়ার্মিং শুধুমাত্র গুরুত্বপূর্ণ শারীরবৃত্তীয় চাপ সৃষ্টি করে না, বরং সামুদ্রিক জীবের তাপীয় স্থিতিশীলতার বিবর্তনীয় সীমাকেও ঠেলে দেয়, যা অনেক প্রজাতির আবাসস্থলকে প্রভাবিত করে, তাদের আরও অনুকূল অবস্থার সন্ধান করতে প্ররোচিত করে [1, 2]।মেটাজোয়ানের জীববৈচিত্র্যকে প্রভাবিত করার পাশাপাশি, সিসি হোস্ট-মাইক্রোবিয়াল মিথস্ক্রিয়াগুলির সূক্ষ্ম ভারসাম্যকে ব্যাহত করে।এই মাইক্রোবিয়াল ডিসব্যাক্টেরিওসিস সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের জন্য একটি গুরুতর হুমকি সৃষ্টি করে কারণ এটি সামুদ্রিক জীবকে সংক্রামক রোগজীবাণুগুলির জন্য আরও সংবেদনশীল করে তোলে [3, 4]।এটা বিশ্বাস করা হয় যে SS গণ মৃত্যুর ক্ষেত্রে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, যা বিশ্বব্যাপী সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের ব্যবস্থাপনার জন্য একটি গুরুতর সমস্যা [5, 6]।অনেক সামুদ্রিক প্রজাতির অর্থনৈতিক, পরিবেশগত এবং পুষ্টিগত প্রভাবের কারণে এটি একটি গুরুত্বপূর্ণ বিষয়।এটি বিশেষত মেরু অঞ্চলে বসবাসকারী বাইভালভদের জন্য সত্য, যেখানে CK এর প্রভাবগুলি আরও তাত্ক্ষণিক এবং গুরুতর [6, 7]।প্রকৃতপক্ষে, বাইভালভ যেমন মাইটিলাস এসপিপি।সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রের উপর সিসি-এর প্রভাব নিরীক্ষণ করতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়।আশ্চর্যের বিষয় নয়, তাদের স্বাস্থ্যের নিরীক্ষণের জন্য তুলনামূলকভাবে বিপুল সংখ্যক বায়োমার্কার তৈরি করা হয়েছে, প্রায়শই এনজাইমেটিক কার্যকলাপ বা কোষের কার্যকারিতা এবং ফ্যাগোসাইটিক কার্যকলাপের মতো সেলুলার ফাংশনগুলির উপর ভিত্তি করে কার্যকরী বায়োমার্কার জড়িত একটি দ্বি-স্তরের পদ্ধতি ব্যবহার করে [৮]।এই পদ্ধতিগুলির মধ্যে নির্দিষ্ট চাপের সূচকগুলির ঘনত্বের পরিমাপও অন্তর্ভুক্ত রয়েছে যা প্রচুর পরিমাণে সমুদ্রের জল শোষণের পরে নরম টিস্যুতে জমা হয়।যাইহোক, উচ্চ পরিস্রাবণ ক্ষমতা এবং বাইভালভের আধা-খোলা সঞ্চালন ব্যবস্থা তরল বায়োপসি (এলবি) ধারণা ব্যবহার করে নতুন হেমোলিম্ফ বায়োমার্কার বিকাশের একটি সুযোগ প্রদান করে, যা রোগী পরিচালনার জন্য একটি সহজ এবং ন্যূনতম আক্রমণাত্মক পদ্ধতি।রক্তের নমুনা [9, 10]।যদিও মানব এলবি-তে বিভিন্ন ধরণের সঞ্চালনকারী অণু পাওয়া যায়, এই ধারণাটি প্রাথমিকভাবে রক্তরসে সঞ্চালিত বহিরাগত ডিএনএ (ccfDNA) টুকরাগুলির ডিএনএ সিকোয়েন্সিং বিশ্লেষণের উপর ভিত্তি করে।প্রকৃতপক্ষে, মানুষের রক্তরসে সঞ্চালিত ডিএনএর উপস্থিতি 20 শতকের মাঝামাঝি থেকে জানা যায় [১১], তবে সাম্প্রতিক বছরগুলিতে উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির আবির্ভাব ccfDNA-এর উপর ভিত্তি করে ক্লিনিকাল রোগ নির্ণয়ের দিকে পরিচালিত করেছে।কোষের মৃত্যুর পর জিনোমিক ডিএনএ (পারমাণবিক এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল) নিষ্ক্রিয় মুক্তির কারণে এই সঞ্চালিত ডিএনএ খণ্ডগুলির উপস্থিতি আংশিকভাবে ঘটে। সুস্থ ব্যক্তিদের মধ্যে, ccfDNA এর ঘনত্ব সাধারণত কম থাকে (<10 ng/mL) কিন্তু বিভিন্ন প্যাথলজিতে ভুগছেন বা স্ট্রেসের শিকার রোগীদের ক্ষেত্রে 5-10 গুণ বৃদ্ধি পেতে পারে, যার ফলে টিস্যুর ক্ষতি হয়। সুস্থ ব্যক্তিদের মধ্যে, ccfDNA এর ঘনত্ব সাধারণত কম থাকে (<10 ng/mL) কিন্তু বিভিন্ন প্যাথলজিতে ভুগছেন বা স্ট্রেসের শিকার রোগীদের ক্ষেত্রে 5-10 গুণ বৃদ্ধি পেতে পারে, যার ফলে টিস্যুর ক্ষতি হয়। У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у больный низкая ергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. সুস্থ ব্যক্তিদের মধ্যে, cccDNA-এর ঘনত্ব সাধারণত কম (<10 ng/mL), কিন্তু বিভিন্ন প্যাথলজি বা মানসিক চাপের রোগীদের ক্ষেত্রে এটি 5-10 গুণ বৃদ্ধি পেতে পারে যা টিস্যুর ক্ষতির দিকে পরিচালিত করে।在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力渂受度通常较低（，但在患有各种病理或承受压力渂5从而导致组织损伤.在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 司 承受受5-10 倍, 从而 组织.。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 ng/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у павцентрация нг/мл или стрессом, что приводит к повреждению тканей. সুস্থ ব্যক্তিদের মধ্যে ccfDNA ঘনত্ব সাধারণত কম (<10 ng/ml) হয়, কিন্তু বিভিন্ন প্যাথলজি বা স্ট্রেসযুক্ত রোগীদের ক্ষেত্রে 5-10-গুণ বাড়ানো যেতে পারে, যার ফলে টিস্যুর ক্ষতি হয়।ccfDNA খণ্ডের আকার ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়, তবে সাধারণত 150 থেকে 200 bp পর্যন্ত হয়।[১২]।স্ব-উত্পন্ন ccfDNA-এর বিশ্লেষণ, অর্থাৎ, স্বাভাবিক বা রূপান্তরিত হোস্ট কোষ থেকে ccfDNA, পারমাণবিক এবং/অথবা মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনোমে উপস্থিত জেনেটিক এবং এপিজেনেটিক পরিবর্তনগুলি সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে, যার ফলে চিকিত্সকদের নির্দিষ্ট আণবিক-লক্ষ্যযুক্ত থেরাপি নির্বাচন করতে সহায়তা করে [১৩]।যাইহোক, ccfDNA গর্ভাবস্থায় ভ্রূণের কোষ থেকে বা প্রতিস্থাপিত অঙ্গ [14,15,16,17] থেকে বিদেশী উত্স যেমন ccfDNA থেকে প্রাপ্ত করা যেতে পারে।ccfDNA একটি সংক্রামক এজেন্ট (বিদেশী) এর নিউক্লিক অ্যাসিডের উপস্থিতি সনাক্ত করার জন্য তথ্যের একটি গুরুত্বপূর্ণ উত্স, যা রক্তের সংস্কৃতি দ্বারা চিহ্নিত না হওয়া ব্যাপক সংক্রমণের অ-আক্রমণকারী সনাক্তকরণের অনুমতি দেয়, সংক্রামিত টিস্যুর আক্রমণাত্মক বায়োপসি এড়িয়ে যায় [18]।সাম্প্রতিক গবেষণায় প্রকৃতপক্ষে দেখানো হয়েছে যে মানুষের রক্তে তথ্যের একটি সমৃদ্ধ উৎস রয়েছে যা ভাইরাল এবং ব্যাকটেরিয়াজনিত রোগজীবাণু সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে এবং মানুষের রক্তরসে পাওয়া ccfDNA এর প্রায় 1% বিদেশী উত্সের [19]।এই গবেষণাগুলি দেখায় যে একটি জীবের সঞ্চালনকারী মাইক্রোবায়োমের জীববৈচিত্র্য ccfDNA বিশ্লেষণ ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা যেতে পারে।যাইহোক, সম্প্রতি অবধি, এই ধারণাটি একচেটিয়াভাবে মানুষের মধ্যে এবং কম পরিমাণে অন্যান্য মেরুদণ্ডী প্রাণীদের মধ্যে ব্যবহার করা হয়েছিল [20, 21]।
বর্তমান কাগজে, আমরা 35 মিলিয়ন বছর আগে গঠিত একটি বৃহৎ মালভূমির উপরে দ্বীপগুলির একটি গ্রুপ, সাব্যান্টার্কটিক কেরগুলেন দ্বীপপুঞ্জে সাধারণত পাওয়া একটি দক্ষিণ প্রজাতি Aulacomya atra-এর ccfDNA বিশ্লেষণ করতে LB সম্ভাব্যতা ব্যবহার করি।আগ্নেয়গিরির অগ্ন্যুত্পাত.একটি ইন ভিট্রো পরীক্ষামূলক পদ্ধতি ব্যবহার করে, আমরা দেখেছি যে সমুদ্রের জলে ডিএনএ খণ্ডগুলি দ্রুত ঝিনুক দ্বারা গ্রহণ করা হয় এবং হিমোলিম্ফ বগিতে প্রবেশ করে।শটগান সিকোয়েন্সিং দেখিয়েছে যে ঝিনুকের হিমোলিম্ফ ccfDNA এর নিজস্ব এবং অ-স্ব-উৎপত্তির ডিএনএ টুকরা রয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে সিম্বিওটিক ব্যাকটেরিয়া এবং ঠান্ডা আগ্নেয়গিরির সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের বায়োম থেকে ডিএনএ টুকরা।হেমোলিম্ফ ccfDNA-তে বিভিন্ন হোস্ট রেঞ্জের ভাইরাস থেকে প্রাপ্ত ভাইরাল সিকোয়েন্সও রয়েছে।আমরা বহুকোষী প্রাণী যেমন অস্থি মাছ, সামুদ্রিক অ্যানিমোন, শেওলা এবং পোকামাকড় থেকে ডিএনএ খণ্ডগুলিও পেয়েছি।উপসংহারে, আমাদের অধ্যয়নটি দেখায় যে LB ধারণাটি সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে একটি সমৃদ্ধ জিনোমিক সংগ্রহশালা তৈরি করতে সামুদ্রিক অমেরুদণ্ডী প্রাণীদের ক্ষেত্রে সফলভাবে প্রয়োগ করা যেতে পারে।
প্রাপ্তবয়স্কদের (55-70 মিমি লম্বা) মাইটিলাস প্ল্যাটেনসিস (এম. প্ল্যাটেনসিস) এবং আউলাকোমিয়া আট্রা (এ. আট্রা) পোর্ট-অ-ফ্রান্সের আন্তঃজলীয় পাথুরে উপকূল থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল (049°21.235 S, 070°13.490 E.)।ডিসেম্বর 2018-এ Kerguelen দ্বীপপুঞ্জ। অন্যান্য প্রাপ্তবয়স্ক নীল ঝিনুক (Mytilus spp.) একটি বাণিজ্যিক সরবরাহকারী (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, কানাডা) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল এবং একটি তাপমাত্রা নিয়ন্ত্রিত (4°C) বায়ুযুক্ত ট্যাঙ্কে রাখা হয়েছিল যাতে 32‰ কৃত্রিম ব্রিনের 10-20 L থাকে।(কৃত্রিম সমুদ্র লবণ রিফ ক্রিস্টাল, তাত্ক্ষণিক মহাসাগর, ভার্জিনিয়া, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র)।প্রতিটি পরীক্ষার জন্য, পৃথক শেলের দৈর্ঘ্য এবং ওজন পরিমাপ করা হয়েছিল।
এই প্রোগ্রামের জন্য একটি বিনামূল্যের ওপেন অ্যাক্সেস প্রোটোকল অনলাইনে উপলব্ধ (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1)।সংক্ষেপে, এলবি হেমোলিম্ফ অপহরণকারী পেশী থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল যেমন বর্ণনা করা হয়েছিল [22]।হিমোলিম্ফকে 1200×g সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে 3 মিনিটের জন্য পরিষ্কার করা হয়েছিল, ব্যবহার না হওয়া পর্যন্ত সুপারনাট্যান্ট হিমায়িত (-20°C) ছিল।সিএফডিএনএর বিচ্ছিন্নতা এবং পরিশোধনের জন্য, প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে নমুনাগুলি (1.5-2.0 মিলি) নিউক্লিওস্ন্যাপ সিএফডিএনএ কিট (মাচেরি-নাগেল, বেথলেহেন, পিএ) ব্যবহার করে গলানো এবং প্রক্রিয়া করা হয়েছিল।পরবর্তী বিশ্লেষণ না হওয়া পর্যন্ত ccfDNA -80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সংরক্ষণ করা হয়েছিল।কিছু পরীক্ষায়, QIAamp DNA ইনভেস্টিগেটর কিট (QIAGEN, টরন্টো, অন্টারিও, কানাডা) ব্যবহার করে ccfDNA বিচ্ছিন্ন এবং বিশুদ্ধ করা হয়েছিল।বিশুদ্ধ ডিএনএ একটি স্ট্যান্ডার্ড পিকোগ্রিন অ্যাস ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল।বিচ্ছিন্ন ccfDNA এর খণ্ড বন্টন একটি উচ্চ সংবেদনশীলতা ডিএনএ কিট ব্যবহার করে একটি Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) ব্যবহার করে কৈশিক ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে ccfDNA নমুনার 1 μl ব্যবহার করে পরীক্ষাটি করা হয়েছিল।
হিমোলিম্ফ ccfDNA খণ্ডের সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) Illumina MiSeq PE75 কিটের ইলুমিনা ডিএনএ মিক্স কিট ব্যবহার করে শটগান লাইব্রেরি প্রস্তুত করেছে।একটি স্ট্যান্ডার্ড অ্যাডাপ্টার (BioO) ব্যবহার করা হয়েছিল।NCBI সিকোয়েন্স রিড আর্কাইভ (SRR8924808 এবং SRR8924809) থেকে কাঁচা ডেটা ফাইল পাওয়া যায়।FastQC ব্যবহার করে প্রাথমিক পড়ার গুণমান মূল্যায়ন করা হয়েছিল [23]।ট্রিমোমেটিক [২৪] ক্লিপিং অ্যাডাপ্টার এবং খারাপ মানের পাঠের জন্য ব্যবহার করা হয়েছে।পেয়ারড এন্ড সহ শটগান রিডগুলি ফ্ল্যাশকে মিশে যাওয়া এড়ানোর জন্য ন্যূনতম 20 bp এর ওভারল্যাপ সহ দীর্ঘ একক রিডগুলিতে একত্রিত করা হয়েছিল [25]। মার্জড রিডগুলি বাইভালভ এনসিবিআই ট্যাক্সোনমি ডাটাবেস (ই মান <1e−3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে BLASTN-এর সাথে টীকা করা হয়েছিল এবং DUST [26] ব্যবহার করে কম-জটিলতার ক্রমগুলির মাস্কিং করা হয়েছিল। মার্জড রিডগুলি বাইভালভ এনসিবিআই ট্যাক্সোনমি ডাটাবেস (ই মান <1e−3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে BLASTN-এর সাথে টীকা করা হয়েছিল এবং DUST [26] ব্যবহার করে কম-জটিলতার ক্রমগুলির মাস্কিং করা হয়েছিল। Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчативых двустворчатых এবং 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [২৬]। পুলড রিডগুলি এনসিবিআই বাইভালভ ট্যাক্সোনমি ডাটাবেস (ই মান <1e-3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে ব্লাস্টএন দিয়ে টীকা করা হয়েছিল এবং ডাস্ট [26] ব্যবহার করে কম জটিলতার সিকোয়েন্স মাস্কিং করা হয়েছিল।使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读俶释合并的读俶释合并的读俶D复杂度序列的掩蔽.আপনি复杂度 序列 的.. . . 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных -3 এবং 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [২৬]। পুলড রিডগুলি এনসিবিআই বাইভালভ ট্যাক্সোনমিক ডাটাবেস (ই মান <1e-3 এবং 90% হোমোলজি) ব্যবহার করে ব্লাস্টএন দিয়ে টীকা করা হয়েছিল এবং ডাস্ট [26] ব্যবহার করে কম জটিলতার সিকোয়েন্স মাস্কিং করা হয়েছিল।রিড দুটি গ্রুপে বিভক্ত ছিল: বাইভালভ সিকোয়েন্সের সাথে সম্পর্কিত (এখানে স্ব-পঠন বলা হয়) এবং সম্পর্কহীন (অ-স্ব-পঠন)।দুটি গ্রুপ আলাদাভাবে মেগাহিট ব্যবহার করে কনটিগ তৈরি করতে একত্রিত হয়েছিল [27]।এদিকে, এলিয়েন মাইক্রোবায়োম রিডের শ্রেণীবিন্যাস বন্টন ক্র্যাকেন2 ব্যবহার করে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল [২৮] এবং গ্রাফিকভাবে গ্যালাক্সিতে একটি ক্রোনা পাই চার্ট দ্বারা উপস্থাপিত হয়েছিল [২৯, ৩০]।আমাদের প্রাথমিক পরীক্ষা থেকে সর্বোত্তম কিমাররা kmers-59 হতে নির্ধারিত হয়েছিল। একটি চূড়ান্ত টীকাটির জন্য BLASTN (bivalve NCBI ডাটাবেস, e মান < 1e−10 এবং 60% হোমোলজি) এর সাথে সারিবদ্ধকরণের মাধ্যমে স্ব-কন্টিগগুলি চিহ্নিত করা হয়েছিল। একটি চূড়ান্ত টীকাটির জন্য BLASTN (bivalve NCBI ডাটাবেস, e মান < 1e−10 এবং 60% হোমোলজি) এর সাথে সারিবদ্ধকরণের মাধ্যমে স্ব-কন্টিগগুলি চিহ্নিত করা হয়েছিল। Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых, e омология 60%) для окончательной аннотации. চূড়ান্ত টীকাটির জন্য BLASTN (NCBI বাইভালভ ডাটাবেস, ই মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) এর সাথে মিলের মাধ্যমে স্ব-কন্টিগগুলি চিহ্নিত করা হয়েছিল।然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识囏茻囏囏圤囏圥臫齐终注释.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (bazat моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%)। ব্লাস্টএন (এনসিবিআই বাইভালভ ডাটাবেস, ই মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) এর সাথে ম্যাচ করে চূড়ান্ত টীকাটির জন্য স্ব-কনটিগগুলিকে চিহ্নিত করা হয়েছিল। সমান্তরালভাবে, ননসেলফ গ্রুপ কনটিগগুলি ব্লাস্টএন (এনটি এনসিবিআই ডাটাবেস, ই মান < 1e−10 এবং 60% হোমোলজি) দিয়ে টীকা করা হয়েছিল। সমান্তরালভাবে, ননসেলফ গ্রুপ কনটিগগুলি ব্লাস্টএন (এনটি এনসিবিআই ডাটাবেস, ই মান < 1e−10 এবং 60% হোমোলজি) দিয়ে টীকা করা হয়েছিল। Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10%06мои)। সমান্তরালভাবে, বিদেশী গ্রুপ কনটিগগুলি BLASTN (NT NCBI ডাটাবেস, ই মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) দিয়ে টীকা করা হয়েছিল।平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群।平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群। Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, 60%)। সমান্তরালভাবে, নন-সেল্ফ গ্রুপ কনটিগগুলি ব্লাস্টএন (এনটি এনসিবিআই ডাটাবেস, ই মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) দিয়ে টীকা করা হয়েছিল। এনআর এবং রেফসেক প্রোটিন এনসিবিআই ডাটাবেস (ই মান <1e−10 এবং 60% হোমোলজি) ব্যবহার করে ব্লাস্টএক্স ননসেলফ কনটিগগুলিতেও পরিচালিত হয়েছিল। এনআর এবং রেফসেক প্রোটিন এনসিবিআই ডাটাবেস (ই মান <1e−10 এবং 60% হোমোলজি) ব্যবহার করে ব্লাস্টএক্স ননসেলফ কনটিগগুলিতেও পরিচালিত হয়েছিল। ব্লাস্টএক্স ট্যাকজেন ব্ыল প্রোভেডেন অন এনসামোস্টোয়াটেলন কন্টিগাহ এস ইস্পোলজোওয়ানিয়ম বাজ ড্যাননইখ বেলকা এনআর এবং রেফসেক এনসিবিআই (<%1-e010)। এনআর এবং রেফসেক এনসিবিআই প্রোটিন ডেটাবেস (ই মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) ব্যবহার করে ব্লাস্টএক্স নন-সেল্ফ কনটিগগুলিতেও সঞ্চালিত হয়েছিল।还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%.还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和60%. BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr এবং RefSeq NCBI (значение e <1010%)। এনআর এবং রেফসেক এনসিবিআই প্রোটিন ডেটাবেস (ই মান <1e-10 এবং 60% হোমোলজি) ব্যবহার করে ব্লাস্টএক্স নন-সেল্ফ কনটিগগুলিতেও সঞ্চালিত হয়েছিল।অ-স্ব-কন্টিগগুলির BLASTN এবং BLASTX পুলগুলি চূড়ান্ত কনটিগগুলিকে উপস্থাপন করে (পরিপূরক ফাইল দেখুন)।
PCR এর জন্য ব্যবহৃত প্রাইমারগুলি সারণি S1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।তাক ডিএনএ পলিমারেজ (বায়ো বেসিক কানাডা, মার্কহাম, অন) ccfDNA টার্গেট জিনগুলিকে প্রসারিত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।নিম্নলিখিত প্রতিক্রিয়া শর্তগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: 3 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রি সেলসিয়াস, 1 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রি সেলসিয়াস, 1 মিনিটের জন্য অ্যানিলিং তাপমাত্রা সেট করুন, 1 মিনিটের জন্য 72 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে প্রসারিত করুন, 35টি চক্র এবং অবশেষে 10 মিনিটের মধ্যে 72 ডিগ্রি সেলসিয়াস।.পিসিআর পণ্যগুলি 95 V এ SYBRTM সেফ ডিএনএ জেল স্টেইন (ইনভিট্রোজেন, বার্লিংটন, অন, কানাডা) ধারণকারী অ্যাগারোজ জেলে (1.5%) ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল।
ঝিনুক (মাইটিলাস এসপিপি) 500 মিলি অক্সিজেনযুক্ত সামুদ্রিক জলে (32 PSU) 4 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় 24 ঘন্টার জন্য অভ্যস্ত ছিল।মানব গ্যালেক্টিন-7 সিডিএনএ সিকোয়েন্স (এনসিবিআই অ্যাক্সিশন নম্বর L07769) এনকোডিং একটি সন্নিবেশ ধারণকারী প্লাজমিড ডিএনএ 190 μg/μl এর চূড়ান্ত ঘনত্বে শিশিতে যোগ করা হয়েছিল।ডিএনএ সংযোজন ছাড়াই একই অবস্থার অধীনে ঝিনুকের নিয়ন্ত্রণ ছিল।তৃতীয় নিয়ন্ত্রণ ট্যাঙ্কে ঝিনুক ছাড়াই ডিএনএ ছিল।সমুদ্রের জলে ডিএনএর গুণমান নিরীক্ষণের জন্য, নির্দেশিত সময়ে প্রতিটি ট্যাঙ্ক থেকে সমুদ্রের জলের নমুনা (20 μl; তিনটি পুনরাবৃত্তি) নেওয়া হয়েছিল।প্লাজমিড ডিএনএ ট্রেসেবিলিটির জন্য, এলবি ঝিনুকগুলি নির্দেশিত সময়ে কাটা হয়েছিল এবং কিউপিসিআর এবং ডিডিপিসিআর দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।সমুদ্রের জলে উচ্চ লবণের পরিমাণের কারণে, সমস্ত পিসিআর অ্যাসেসের আগে অ্যালিকোটগুলি পিসিআর মানের জলে (1:10) মিশ্রিত হয়েছিল।
ডিজিটাল ড্রপলেট পিসিআর (ddPCR) BioRad QX200 প্রোটোকল (মিসিসাগা, অন্টারিও, কানাডা) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।সর্বোত্তম তাপমাত্রা নির্ধারণ করতে তাপমাত্রা প্রোফাইল ব্যবহার করুন (টেবিল S1)।ড্রপগুলি একটি QX200 ড্রপ জেনারেটর (BioRad) ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল।ddPCR নিম্নরূপ করা হয়েছিল: 5 মিনিটের জন্য 95°C, 30 সেকেন্ডের জন্য 95°C এর 50টি চক্র এবং 1 মিনিটের জন্য একটি প্রদত্ত অ্যানিলিং তাপমাত্রা এবং 30 সেকেন্ডের জন্য 72°C, 5 মিনিটের জন্য 4°C এবং 5 মিনিটের মধ্যে 90°C।QX200 ড্রপ রিডার (BioRad) ব্যবহার করে ড্রপের সংখ্যা এবং ইতিবাচক প্রতিক্রিয়া (কপি/µl সংখ্যা) পরিমাপ করা হয়েছিল।10,000 টিরও কম ফোঁটা সহ নমুনাগুলি প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল।প্রতিবার ddPCR চালানোর সময় প্যাটার্ন নিয়ন্ত্রণ করা হয়নি।
qPCR Rotor-Gene® 3000 (কর্বেট রিসার্চ, সিডনি, অস্ট্রেলিয়া) এবং LGALS7 নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।কোয়ান্টিফাস্ট এসওয়াইবিআর গ্রিন পিসিআর কিট (কিউআইজেন) ব্যবহার করে সমস্ত পরিমাণগত পিসিআর 20 μl এ সঞ্চালিত হয়েছিল।qPCR 95°C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের ইনকিউবেশন দিয়ে শুরু করা হয়েছিল, তারপরে 40টি চক্র 95°C তাপমাত্রায় 10 সেকেন্ডের জন্য এবং 60°C তাপমাত্রায় 60 সেকেন্ডের জন্য একটি ডেটা সংগ্রহের মাধ্যমে।5 সেকেন্ডের জন্য 95°C, 60s-এর জন্য 65°C, এবং qPCR-এর শেষে 97°C এ ধারাবাহিক পরিমাপ ব্যবহার করে গলানো বক্ররেখা তৈরি করা হয়েছিল।নিয়ন্ত্রণ নমুনা ব্যতীত প্রতিটি কিউপিসিআর ট্রিপলিকেটে সঞ্চালিত হয়েছিল।
যেহেতু ঝিনুকগুলি তাদের উচ্চ পরিস্রাবণ হারের জন্য পরিচিত, আমরা প্রথমে তদন্ত করেছি যে তারা সমুদ্রের জলে উপস্থিত ডিএনএ খণ্ডগুলি ফিল্টার করতে এবং ধরে রাখতে পারে কিনা।এই টুকরোগুলি তাদের আধা-খোলা লিম্ফ্যাটিক সিস্টেমে জমা হয় কিনা তা নিয়েও আমরা আগ্রহী ছিলাম।আমরা নীল ঝিনুকের ট্যাঙ্কগুলিতে যুক্ত দ্রবণীয় ডিএনএ টুকরোগুলির ভাগ্য সনাক্ত করে পরীক্ষামূলকভাবে এই সমস্যাটির সমাধান করেছি।ডিএনএ খণ্ডগুলির ট্র্যাকিংয়ের সুবিধার্থে, আমরা মানব গ্যালেক্টিন -7 জিন ধারণকারী বিদেশী (নিজে নয়) প্লাজমিড ডিএনএ ব্যবহার করেছি।ddPCR সামুদ্রিক জল এবং ঝিনুকের মধ্যে প্লাজমিড ডিএনএ খণ্ডের সন্ধান করে।আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে যদি ঝিনুকের অনুপস্থিতিতে সমুদ্রের জলে DNA খণ্ডের পরিমাণ সময়ের সাথে তুলনামূলকভাবে স্থির থাকে (7 দিন পর্যন্ত), তবে ঝিনুকের উপস্থিতিতে এই স্তরটি 8 ঘন্টার মধ্যে প্রায় সম্পূর্ণরূপে অদৃশ্য হয়ে যায় (চিত্র 1a,b)।বহির্মুখী ডিএনএ-এর টুকরো সহজেই 15 মিনিটের মধ্যে অন্তঃসত্ত্বা তরল এবং হিমোলিম্ফ (চিত্র 1c) এর মধ্যে সনাক্ত করা যায়।এই টুকরোগুলি এক্সপোজারের 4 ঘন্টা পরেও সনাক্ত করা যেতে পারে।ডিএনএ খণ্ডের ক্ষেত্রে এই ফিল্টারিং কার্যকলাপটি ব্যাকটেরিয়া এবং শেত্তলাগুলির ফিল্টারিং কার্যকলাপের সাথে তুলনীয় [৩১]।এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে ঝিনুকগুলি তাদের তরল অংশগুলিতে বিদেশী ডিএনএ ফিল্টার এবং জমা করতে পারে।
ddPCR দ্বারা পরিমাপকৃত ঝিনুকের উপস্থিতি (A) বা অনুপস্থিতিতে (B) সমুদ্রের জলে প্লাজমিড ডিএনএর আপেক্ষিক ঘনত্ব।A-তে, ফলাফলগুলিকে শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়, বাক্সের সীমানাগুলি 75 তম এবং 25 তম শতাংশের প্রতিনিধিত্ব করে।লাগানো লগারিদমিক বক্ররেখা লাল রঙে দেখানো হয়েছে, এবং ধূসর রঙে ছায়াযুক্ত এলাকাটি 95% আত্মবিশ্বাসের ব্যবধানকে প্রতিনিধিত্ব করে।B-তে, লাল রেখাটি গড় এবং নীল রেখাটি ঘনত্বের জন্য 95% আত্মবিশ্বাসের ব্যবধানকে প্রতিনিধিত্ব করে।C প্লাজমিড ডিএনএ সংযোজনের পর বিভিন্ন সময়ে হেমোলিম্ফ এবং ঝিনুকের ভালভুলার তরলে প্লাজমিড ডিএনএ জমা হওয়া।ফলাফল পরম কপি সনাক্ত/mL (±SE) হিসাবে উপস্থাপন করা হয়.
এরপরে, আমরা সীমিত নৃতাত্ত্বিক প্রভাব সহ দ্বীপগুলির একটি প্রত্যন্ত গোষ্ঠী কেরগুলেন দ্বীপপুঞ্জের ঝিনুকের বিছানা থেকে সংগৃহীত ঝিনুকগুলিতে ccfDNA এর উত্স অনুসন্ধান করেছি।এই উদ্দেশ্যে, ঝিনুক হেমোলিম্ফস থেকে সিসিডিএনএ বিচ্ছিন্ন এবং সাধারণত মানুষের সিসিডিএনএ [৩২, ৩৩] শুদ্ধ করার জন্য ব্যবহৃত পদ্ধতি দ্বারা বিশুদ্ধ করা হয়েছিল।আমরা দেখেছি যে ঝিনুকের গড় হিমোলিম্ফ ccfDNA ঘনত্ব প্রতি মিলি হিমোলিম্ফ পরিসরে কম মাইক্রোগ্রামে রয়েছে (টেবিল S2, পরিপূরক তথ্য দেখুন)।ঘনত্বের এই পরিসীমা সুস্থ মানুষের তুলনায় অনেক বড় (কম ন্যানোগ্রাম প্রতি মিলিলিটার), কিন্তু বিরল ক্ষেত্রে, ক্যান্সার রোগীদের ক্ষেত্রে, ccfDNA-এর মাত্রা প্রতি মিলিলিটারে বেশ কয়েকটি মাইক্রোগ্রামে পৌঁছাতে পারে [34, 35]।হিমোলিম্ফ ccfDNA-এর আকার বন্টনের একটি বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে এই টুকরোগুলি আকারে ব্যাপকভাবে পরিবর্তিত হয়, 1000 bp থেকে 1000 bp পর্যন্ত।5000 bp পর্যন্ত (চিত্র 2)।সিলিকা-ভিত্তিক QIAamp ইনভেস্টিগেটর কিট ব্যবহার করে অনুরূপ ফলাফল পাওয়া গেছে, একটি পদ্ধতি যা সাধারণত ফরেনসিক বিজ্ঞানে ব্যবহৃত হয় যা ccfDNA [৩৬] সহ কম ঘনত্বের ডিএনএ নমুনাগুলি থেকে জিনোমিক ডিএনএকে দ্রুত বিচ্ছিন্ন এবং বিশুদ্ধ করতে ব্যবহৃত হয়।
ঝিনুক হেমোলিম্ফের প্রতিনিধি ccfDNA ইলেক্ট্রোফোরগ্রাম।নিউক্লিওস্ন্যাপ প্লাজমা কিট (শীর্ষ) এবং QIAamp ডিএনএ ইনভেস্টিগেটর কিট দিয়ে বের করা হয়েছে।B ভায়োলিন প্লট ঝিনুকের মধ্যে হেমোলিম্ফ ccfDNA ঘনত্ব (±SE) বিতরণ দেখাচ্ছে।কালো এবং লাল রেখাগুলি যথাক্রমে মধ্যমা এবং প্রথম এবং তৃতীয় চতুর্থাংশের প্রতিনিধিত্ব করে।
মানুষ এবং প্রাইমেটদের মধ্যে প্রায় 1% ccfDNA এর একটি বিদেশী উত্স রয়েছে [21, 37]।বাইভালভের আধা-খোলা সংবহন ব্যবস্থা, অণুজীব-সমৃদ্ধ সমুদ্রের জল এবং ঝিনুক ccfDNA-এর আকার বন্টনের পরিপ্রেক্ষিতে, আমরা অনুমান করেছি যে ঝিনুক হেমোলিম্ফ ccfDNA-তে মাইক্রোবিয়াল ডিএনএর একটি সমৃদ্ধ এবং বৈচিত্র্যময় পুল থাকতে পারে।এই অনুমান পরীক্ষা করার জন্য, আমরা কেরগুলেন দ্বীপপুঞ্জ থেকে সংগৃহীত আউলাকোমিয়া আট্রা নমুনা থেকে হিমোলিম্ফ ccfDNA ক্রমানুসারে তৈরি করেছি, যা 10 মিলিয়নেরও বেশি পাঠ করেছে, যার 97.6% গুণমান নিয়ন্ত্রণে উত্তীর্ণ হয়েছে।রিডিংগুলি তখন BLASTN এবং NCBI বাইভালভ ডেটাবেস (চিত্র S1, পরিপূরক তথ্য) ব্যবহার করে স্ব এবং অ-স্ব উত্স অনুসারে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল।
মানুষের মধ্যে, পারমাণবিক এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ উভয়ই রক্তের প্রবাহে মুক্তি পেতে পারে [৩৮]।যাইহোক, বর্তমান সমীক্ষায়, ঝিনুকের পারমাণবিক জিনোমিক ডিএনএ বিশদভাবে বর্ণনা করা সম্ভব হয়নি, কারণ A. অ্যাট্রা জিনোম ক্রমানুসারে বা বর্ণনা করা হয়নি।যাইহোক, আমরা বাইভালভ লাইব্রেরি (চিত্র S2, পরিপূরক তথ্য) ব্যবহার করে আমাদের নিজস্ব উৎপত্তির বেশ কিছু ccfDNA খণ্ড শনাক্ত করতে সক্ষম হয়েছি।আমরা সেই A. atra জিনের নির্দেশিত PCR পরিবর্ধনের মাধ্যমে আমাদের নিজস্ব উৎপত্তির DNA খণ্ডের উপস্থিতি নিশ্চিত করেছি (চিত্র 3)।একইভাবে, A. atra-এর মাইটোকন্ড্রিয়াল জিনোম পাবলিক ডাটাবেসে উপলব্ধ থাকায়, A. atra-এর হিমোলিম্ফে মাইটোকন্ড্রিয়াল ccfDNA খণ্ডের উপস্থিতির প্রমাণ পাওয়া যেতে পারে।পিসিআর পরিবর্ধন (চিত্র 3) দ্বারা মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ খণ্ডের উপস্থিতি নিশ্চিত করা হয়েছিল।
বিভিন্ন মাইটোকন্ড্রিয়াল জিন A. atra (লাল বিন্দু - স্টক নম্বর: SRX5705969) এবং M. প্ল্যাটেনসিস (নীল বিন্দু - স্টক নম্বর: SRX5705968) পিসিআর দ্বারা পরিবর্ধিত হিমোলিম্ফে উপস্থিত ছিল।Breton et al., 2011 B থেকে অভিযোজিত চিত্র A. atra থেকে হিমোলিম্ফ সুপারনাট্যান্টের পরিবর্ধন FTA কাগজে সংরক্ষিত।পিসিআর মিক্সযুক্ত পিসিআর টিউবে সরাসরি যোগ করতে একটি 3 মিমি পাঞ্চ ব্যবহার করুন।
সমুদ্রের জলে প্রচুর পরিমাণে মাইক্রোবিয়াল সামগ্রীর পরিপ্রেক্ষিতে, আমরা প্রাথমিকভাবে হেমোলিম্ফে মাইক্রোবিয়াল ডিএনএ সিকোয়েন্সের বৈশিষ্ট্যের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছি।এটি করার জন্য, আমরা দুটি ভিন্ন কৌশল ব্যবহার করি।প্রথম কৌশলটি Kraken2 ব্যবহার করেছিল, একটি অ্যালগরিদম-ভিত্তিক ক্রম শ্রেণিবিন্যাস প্রোগ্রাম যা ব্লাস্ট এবং অন্যান্য সরঞ্জামগুলির সাথে তুলনীয় নির্ভুলতার সাথে মাইক্রোবিয়াল সিকোয়েন্সগুলি সনাক্ত করতে পারে [২৮]।6719 টিরও বেশি পাঠগুলি ব্যাকটেরিয়া উত্সের বলে নির্ধারিত হয়েছিল, যেখানে 124 এবং 64টি যথাক্রমে আর্কিয়া এবং ভাইরাস থেকে ছিল (চিত্র 4)।সবচেয়ে প্রাচুর্য ব্যাকটেরিয়া ডিএনএ টুকরা ছিল Firmicutes (46%), প্রোটিওব্যাকটেরিয়া (27%), এবং Bacteroidetes (17%) (চিত্র 4a)।এই বিতরণটি সামুদ্রিক নীল ঝিনুক মাইক্রোবায়োমের পূর্ববর্তী গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ [39, 40]।গামাপ্রোটোব্যাকটেরিয়া ছিল প্রোটিওব্যাকটেরিয়ার প্রধান শ্রেণী (44%), যার মধ্যে অনেকগুলি Vibrionales (চিত্র 4b) রয়েছে।ddPCR পদ্ধতি A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41] এর ccfDNA-তে Vibrio DNA খন্ডের উপস্থিতি নিশ্চিত করেছে।ccfDNA এর ব্যাকটেরিয়া উৎপত্তি সম্পর্কে আরও তথ্য পেতে, একটি অতিরিক্ত পদ্ধতি নেওয়া হয়েছিল (চিত্র S2, পরিপূরক তথ্য)। এই ক্ষেত্রে, পড়ে যে ওভারল্যাপ করাগুলিকে পেয়ারড-এন্ড রিড হিসাবে একত্রিত করা হয়েছিল এবং BLASTN এবং 1e−3 এর একটি e মান এবং >90% হোমোলজি সহ একটি কাটঅফ ব্যবহার করে সেলফ (বাইভালভ) বা ননসেলফ অরিজিন হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল। এই ক্ষেত্রে, পড়ে যে ওভারল্যাপ করাগুলিকে পেয়ারড-এন্ড রিড হিসাবে একত্রিত করা হয়েছিল এবং BLASTN এবং 1e−3 এর একটি e মান এবং >90% হোমোলজি সহ একটি কাটঅফ ব্যবহার করে সেলফ (বাইভালভ) বা ননসেলফ অরিজিন হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল। В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы как соболывыстеми ски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%। এই ক্ষেত্রে, ওভারল্যাপিং রিডগুলি পেয়ারড-এন্ডেড রিড হিসাবে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং BLASTN এবং 1e-3 এর e মান এবং >90% হোমোলজি সহ কাটঅফ ব্যবহার করে নেটিভ (বাইভালভ) বা অ-অরিজিনাল হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল।在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值和>90% 吪为自身（双壳类）或非自身来源.在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 的 使用 的 使用 使用 ব্লাস্ট 和1 和1>源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。 .. . . . В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собственочевыствылющиеся или несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 এবং порога гомологии> 90%। এই ক্ষেত্রে, ওভারল্যাপিং রিডগুলি পেয়ারড-এন্ডেড রিড হিসাবে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং e BLASTN এবং 1e-3 মান এবং একটি হোমোলজি থ্রেশহোল্ড> 90% ব্যবহার করে নিজস্ব (বাইভালভ) বা অ-মৌলিক হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল।যেহেতু A. অট্রা জিনোম এখনও সিকোয়েন্স করা হয়নি, তাই আমরা মেগাহিট নেক্সট জেনারেশন সিকোয়েন্সিং (এনজিএস) অ্যাসেম্বলারের ডি নভো সমাবেশ কৌশল ব্যবহার করেছি।মোট 147,188টি কনটিগকে মূলের নির্ভরশীল (বাইভালভ) হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছে।এই কনটিগগুলি তখন BLASTN এবং BLASTX ব্যবহার করে 1e-10 এর ই-মান দিয়ে বিস্ফোরিত হয়েছিল।এই কৌশলটি আমাদের A. atra ccfDNA-তে উপস্থিত 482টি নন-বাইভালভ টুকরো সনাক্ত করতে দেয়।এই ডিএনএ খণ্ডগুলির অর্ধেকেরও বেশি (57%) ব্যাকটেরিয়া থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল, প্রধানত সালফোট্রফিক সিম্বিয়ন্টস সহ গিল সিম্বিয়ন্ট এবং গিল সিম্বিয়ন্ট সোলেমিয়া ভেলাম (চিত্র 5) থেকে।
টাইপ স্তরে আপেক্ষিক প্রাচুর্য।B দুটি প্রধান ফাইলের মাইক্রোবিয়াল বৈচিত্র্য (ফিরমিকিউটস এবং প্রোটিওব্যাকটেরিয়া)।ডিডিপিসিআর সি ভিব্রিও এসপিপি এর প্রতিনিধি পরিবর্ধন।A. তিনটি অট্রা হেমোলিম্ফসে 16S rRNA জিনের (নীল) খণ্ড।
মোট 482টি সংগৃহীত কনটিগ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।মেটাজেনমিক কনটিগ টীকা (প্রোক্যারিওটস এবং ইউক্যারিওটস) এর ট্যাক্সোনমিক ডিস্ট্রিবিউশনের সাধারণ প্রোফাইল।B BLASTN এবং BLASTX দ্বারা চিহ্নিত ব্যাকটেরিয়া DNA খণ্ডের বিশদ বিতরণ।
ক্র্যাকেন2 বিশ্লেষণে আরও দেখা গেছে যে ঝিনুক ccfDNA-তে প্রত্নতাত্ত্বিক ডিএনএ খণ্ডগুলি রয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে ইউরিয়ারচাওটা (65%), ক্রেনারচাওটা (24%), এবং থাউরমার্চিওটা (11%) (চিত্র 6a) এর ডিএনএ খণ্ড।পূর্বে ক্যালিফোর্নিয়ার ঝিনুকের জীবাণু সম্প্রদায়ের মধ্যে পাওয়া ইউরিয়ারচাওটা এবং ক্রেনারচাওটা থেকে প্রাপ্ত ডিএনএ খণ্ডের উপস্থিতি অবাক হওয়ার মতো নয় [৪২]।যদিও Euryarchaeota প্রায়শই চরম অবস্থার সাথে যুক্ত থাকে, এটি এখন স্বীকৃত যে Euryarchaeota এবং Crenarcheota উভয়ই সামুদ্রিক ক্রায়োজেনিক পরিবেশের মধ্যে সবচেয়ে সাধারণ প্রোক্যারিওট [43, 44]।কেরগুলেন মালভূমি [৪৫] এবং কেরগুলেন দ্বীপপুঞ্জের উপকূলে পর্যবেক্ষণ করা সম্ভাব্য মাইক্রোবিয়াল মিথেন উৎপাদনের সাম্প্রতিক প্রতিবেদনে ঝিনুকের মধ্যে মিথেনজেনিক অণুজীবের উপস্থিতি আশ্চর্যজনক নয়।
আমাদের মনোযোগ তখন ডিএনএ ভাইরাস থেকে পড়ার দিকে চলে যায়।আমাদের সর্বোত্তম জ্ঞান অনুসারে, এটি ঝিনুকের ভাইরাস বিষয়বস্তুর প্রথম অফ-টার্গেট অধ্যয়ন।প্রত্যাশিত হিসাবে, আমরা ব্যাকটিরিওফেজ (কউডোভাইরালেস) (চিত্র 6বি) এর ডিএনএ খন্ডগুলি পেয়েছি।যাইহোক, সবচেয়ে সাধারণ ভাইরাল ডিএনএ নিউক্লিওসাইটোভাইরাসের একটি ফাইলাম থেকে আসে, যা নিউক্লিয়ার সাইটোপ্লাজমিক লার্জ ডিএনএ ভাইরাস (এনসিএলডিভি) নামেও পরিচিত, যেটি যেকোন ভাইরাসের সবচেয়ে বড় জিনোম রয়েছে।এই ফাইলামের মধ্যে, বেশিরভাগ ডিএনএ ক্রমগুলি মিমিমিডোভিরিডে (58%) এবং পক্সভিরিডে (21%) পরিবারের অন্তর্গত, যাদের প্রাকৃতিক হোস্টের মধ্যে মেরুদণ্ড এবং আর্থ্রোপড রয়েছে, যখন এই ডিএনএ ক্রমগুলির একটি ছোট অনুপাত পরিচিত ভাইরোলজিক্যাল শৈবালের অন্তর্গত।সামুদ্রিক ইউক্যারিওটিক শেত্তলাগুলিকে সংক্রামিত করে।সিকোয়েন্সগুলি প্যান্ডোরা ভাইরাস থেকেও প্রাপ্ত হয়েছিল, যে কোনো পরিচিত ভাইরাল জেনারের মধ্যে সবচেয়ে বড় জিনোম আকারের দৈত্য ভাইরাস।মজার বিষয় হল, ভাইরাস দ্বারা সংক্রামিত হিসাবে পরিচিত হোস্টের পরিসর, হিমোলিম্ফ ccfDNA সিকোয়েন্সিং দ্বারা নির্ধারিত, তুলনামূলকভাবে বড় ছিল (চিত্র S3, পরিপূরক তথ্য)।এটিতে এমন ভাইরাস রয়েছে যা ব্যাকুলোভিরিডে এবং ইরিডোভিরিডির মতো পোকামাকড়কে সংক্রামিত করে, সেইসাথে অ্যামিবা, শেওলা এবং মেরুদণ্ডী প্রাণীকে সংক্রামিত করে।আমরা পিথোভাইরাস সাইবেরিকাম জিনোমের সাথে মিলে যাওয়া সিকোয়েন্সও খুঁজে পেয়েছি।পিটোভাইরাস ("জম্বি ভাইরাস" নামেও পরিচিত) প্রথমে সাইবেরিয়ার 30,000 বছরের পুরনো পারমাফ্রস্ট থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল [47]।এইভাবে, আমাদের ফলাফলগুলি পূর্ববর্তী রিপোর্টগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে দেখায় যে এই ভাইরাসগুলির সমস্ত আধুনিক প্রজাতি বিলুপ্ত নয় [৪৮] এবং এই ভাইরাসগুলি দূরবর্তী সাব-আর্কটিক সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে উপস্থিত থাকতে পারে।
অবশেষে, আমরা পরীক্ষা করেছি যে আমরা অন্যান্য বহুকোষী প্রাণী থেকে ডিএনএ খণ্ড খুঁজে পেতে পারি কিনা।NT, nr এবং RefSeq লাইব্রেরি (জিনোমিক এবং প্রোটিন) সহ BLASTN এবং BLASTX দ্বারা মোট 482 টি বিদেশী কনটিগ সনাক্ত করা হয়েছিল।আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে বহুকোষী প্রাণীর ccfDNA-এর বিদেশী টুকরোগুলির মধ্যে হাড়ের হাড়ের ডিএনএ প্রাধান্য পায় (চিত্র 5)।পোকামাকড় এবং অন্যান্য প্রজাতির ডিএনএ টুকরাও পাওয়া গেছে।ডিএনএ খণ্ডগুলির একটি অপেক্ষাকৃত বড় অংশ চিহ্নিত করা যায়নি, সম্ভবত স্থলজ প্রজাতির তুলনায় জিনোমিক ডাটাবেসে বিপুল সংখ্যক সামুদ্রিক প্রজাতির কম উপস্থাপনের কারণে [৪৯]।
বর্তমান কাগজে, আমরা ঝিনুকের জন্য এলবি ধারণাটি প্রয়োগ করি, যুক্তি দিয়ে যে হেমোলিম্ফ ccfDNA শট সিকোয়েন্সিং সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের গঠনের অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে।বিশেষ করে, আমরা দেখতে পেলাম যে 1) ঝিনুকের হিমোলিম্ফে তুলনামূলকভাবে উচ্চ ঘনত্ব (মাইক্রোগ্রাম স্তর) রয়েছে তুলনামূলকভাবে বড় (~1-5 kb) সঞ্চালিত ডিএনএ টুকরা;2) এই ডিএনএ খণ্ডগুলি স্বাধীন এবং অ-স্বাধীন উভয়ই 3) এই ডিএনএ খণ্ডগুলির বিদেশী উত্সগুলির মধ্যে, আমরা ব্যাকটেরিয়া, প্রত্নতাত্ত্বিক এবং ভাইরাল ডিএনএ, সেইসাথে অন্যান্য বহুকোষী প্রাণীর ডিএনএ পেয়েছি;4) হিমোলিম্ফের মধ্যে এই বিদেশী ccfDNA খণ্ডগুলির জমে দ্রুত ঘটে এবং ঝিনুকের অভ্যন্তরীণ ফিল্টারিং কার্যকলাপে অবদান রাখে।উপসংহারে, আমাদের অধ্যয়নটি দেখায় যে এলবি ধারণাটি, যা এখন পর্যন্ত প্রধানত বায়োমেডিসিনের ক্ষেত্রে প্রয়োগ করা হয়েছে, জ্ঞানের একটি সমৃদ্ধ কিন্তু অনাবিষ্কৃত উত্সকে এনকোড করে যা সেন্টিনেল প্রজাতি এবং তাদের পরিবেশের মধ্যে মিথস্ক্রিয়াকে আরও ভালভাবে বোঝার জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।
প্রাইমেট ছাড়াও, ইঁদুর, কুকুর, বিড়াল এবং ঘোড়া সহ স্তন্যপায়ী প্রাণীদের মধ্যে ccfDNA বিচ্ছিন্নতা রিপোর্ট করা হয়েছে [50, 51, 52]।যাইহোক, আমাদের জানার জন্য, আমাদের অধ্যয়নই প্রথম যেটি একটি উন্মুক্ত সঞ্চালন ব্যবস্থা সহ সামুদ্রিক প্রজাতিতে ccfDNA সনাক্তকরণ এবং সিকোয়েন্সিং রিপোর্ট করে।এই শারীরবৃত্তীয় বৈশিষ্ট্য এবং ঝিনুকের ফিল্টারিং ক্ষমতা, অন্তত আংশিকভাবে, অন্যান্য প্রজাতির তুলনায় DNA খণ্ডের সঞ্চালনের বিভিন্ন আকারের বৈশিষ্ট্য ব্যাখ্যা করতে পারে।মানুষের মধ্যে, রক্তে সঞ্চালিত বেশিরভাগ ডিএনএ খণ্ডগুলি হল ছোট ছোট টুকরো যার আকার 150 থেকে 200 bp পর্যন্ত।সর্বোচ্চ সর্বোচ্চ 167 bp সহ [34, 53]।ডিএনএ খণ্ডের একটি ছোট কিন্তু উল্লেখযোগ্য অংশ আকারে 300 থেকে 500 bp এর মধ্যে এবং প্রায় 5% 900 bp এর থেকে দীর্ঘ।[৫৪]।এই আকারের বন্টনের কারণ হল যে রক্তরসে ccfDNA-এর প্রধান উৎস কোষের মৃত্যুর ফলে ঘটে, হয় কোষের মৃত্যুর কারণে বা সুস্থ ব্যক্তিদের মধ্যে সঞ্চালিত হেমাটোপয়েটিক কোষের নেক্রোসিসের কারণে বা ক্যান্সার রোগীদের টিউমার কোষের অ্যাপোপটোসিসের কারণে (যা পরিচিত টিউমার ডিএনএ নামে পরিচিত)।, ctDNA)।হেমোলিম্ফ ccfDNA-এর আকার বন্টন যা আমরা ঝিনুকের মধ্যে পেয়েছি তা 1000 থেকে 5000 bp পর্যন্ত ছিল, যা প্রস্তাব করে যে ঝিনুক ccfDNA এর একটি ভিন্ন উত্স রয়েছে।এটি একটি যৌক্তিক অনুমান, যেহেতু ঝিনুকের একটি আধা-খোলা ভাস্কুলার সিস্টেম থাকে এবং তারা মাইক্রোবিয়াল জিনোমিক ডিএনএর উচ্চ ঘনত্ব সহ সামুদ্রিক জলজ পরিবেশে বাস করে।প্রকৃতপক্ষে, বহিরাগত ডিএনএ ব্যবহার করে আমাদের পরীক্ষাগার পরীক্ষায় দেখা গেছে যে ঝিনুকগুলি সমুদ্রের জলে ডিএনএ টুকরো জমা করে, অন্তত কয়েক ঘন্টা পরে সেলুলার গ্রহণের পরে এবং/অথবা মুক্তি এবং/অথবা বিভিন্ন সংস্থায় সংরক্ষণ করার পরে সেগুলি হ্রাস পায়।কোষের বিরলতার কারণে (প্রোকারিওটিক এবং ইউক্যারিওটিক উভয়ই), ইন্ট্রাভালভুলার কম্পার্টমেন্টের ব্যবহার স্ব-উৎস এবং বিদেশী উত্স থেকে ccfDNA-এর পরিমাণ হ্রাস করবে।বাইভালভ সহজাত অনাক্রম্যতার গুরুত্ব এবং প্রচুর পরিমাণে সঞ্চালনকারী ফ্যাগোসাইটের গুরুত্ব বিবেচনা করে, আমরা আরও অনুমান করেছি যে এমনকি বিদেশী ccfDNA সঞ্চালনকারী ফ্যাগোসাইটগুলিতে সমৃদ্ধ হয় যা অণুজীব এবং/অথবা সেলুলার ধ্বংসাবশেষ গ্রহণের পরে বিদেশী ডিএনএ জমা করে।একসাথে নেওয়া, আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে বাইভালভ হেমোলিম্ফ ccfDNA হল আণবিক তথ্যের একটি অনন্য ভান্ডার এবং একটি সেন্টিনেল প্রজাতি হিসাবে তাদের অবস্থানকে শক্তিশালী করে।
আমাদের ডেটা নির্দেশ করে যে ব্যাকটেরিয়া থেকে প্রাপ্ত হেমোলিম্ফ ccfDNA খণ্ডগুলির ক্রম এবং বিশ্লেষণ হোস্ট ব্যাকটেরিয়া উদ্ভিদ এবং পার্শ্ববর্তী সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে উপস্থিত ব্যাকটেরিয়া সম্পর্কে মূল তথ্য প্রদান করতে পারে।শট সিকোয়েন্সিং কৌশলগুলি কমেন্সাল ব্যাকটেরিয়া A. atra gill-এর সিকোয়েন্স প্রকাশ করেছে যেটি যদি প্রচলিত 16S rRNA সনাক্তকরণ পদ্ধতি ব্যবহার করা হত, একটি রেফারেন্স লাইব্রেরির পক্ষপাতের কারণে।প্রকৃতপক্ষে, Kerguelen এ একই ঝিনুকের স্তরে M. প্ল্যাটেনসিস থেকে সংগৃহীত এলবি ডেটার আমাদের ব্যবহার দেখায় যে গিল-সম্পর্কিত ব্যাকটেরিয়া সিম্বিয়ন্টের গঠন উভয় ঝিনুকের প্রজাতির জন্য একই ছিল (চিত্র S4, পরিপূরক তথ্য)।দুটি জিনগতভাবে ভিন্ন ঝিনুকের এই মিলটি কেরগুলেনের ঠান্ডা, সালফারস এবং আগ্নেয়গিরির আমানতে ব্যাকটেরিয়া সম্প্রদায়ের গঠনকে প্রতিফলিত করতে পারে [55, 56, 57, 58]।বায়োটার্বেটেড উপকূলীয় অঞ্চল [59] থেকে ঝিনুক সংগ্রহ করার সময় সালফার-হ্রাসকারী অণুজীবের উচ্চ স্তরের ভালভাবে বর্ণনা করা হয়েছে, যেমন পোর্ট-অ-ফ্রান্সের উপকূল।আরেকটি সম্ভাবনা হল যে কমেন্সাল ঝিনুকের উদ্ভিদ অনুভূমিক সংক্রমণ দ্বারা প্রভাবিত হতে পারে [60, 61]।সামুদ্রিক পরিবেশ, সমুদ্রতলের পৃষ্ঠ এবং ঝিনুকের মধ্যে সিম্বিওটিক ব্যাকটেরিয়া গঠনের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক নির্ধারণের জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন।এই গবেষণা বর্তমানে চলমান.
হিমোলিম্ফ ccfDNA এর দৈর্ঘ্য এবং ঘনত্ব, এর বিশুদ্ধকরণের সহজতা এবং দ্রুত শটগান সিকোয়েন্সিং করার জন্য উচ্চ গুণমান হল সামুদ্রিক উপকূলীয় বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্যের মূল্যায়নের জন্য ঝিনুক ccfDNA ব্যবহার করার অনেক সুবিধার মধ্যে কয়েকটি।এই পদ্ধতিটি একটি প্রদত্ত ইকোসিস্টেমে ভাইরাল সম্প্রদায়গুলি (ভাইরোম) চিহ্নিত করার জন্য বিশেষভাবে কার্যকর [62, 63]।ব্যাকটেরিয়া, আর্কিয়া এবং ইউক্যারিওটস থেকে ভিন্ন, ভাইরাল জিনোমে 16S সিকোয়েন্সের মতো ফাইলোজেনেটিকভাবে সংরক্ষিত জিন থাকে না।আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে ঝিনুকের মতো সূচক প্রজাতির তরল বায়োপসিগুলি সাধারণত উপকূলীয় সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্রে বসবাসকারী হোস্টগুলিকে সংক্রামিত করতে পরিচিত তুলনামূলকভাবে বড় সংখ্যক ccfDNA ভাইরাসের টুকরো সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।এর মধ্যে প্রোটোজোয়া, আর্থ্রোপড, পোকামাকড়, গাছপালা এবং ব্যাকটেরিয়া ভাইরাস (যেমন, ব্যাকটেরিওফেজ) সংক্রামিত হওয়ার জন্য পরিচিত ভাইরাস রয়েছে।একই ধরনের বন্টন পাওয়া গেছে যখন আমরা কেরগুলেনে (টেবিল এস 2, পরিপূরক তথ্য) একই ঝিনুকের স্তরে সংগৃহীত নীল ঝিনুকের (এম. প্লাটেনসিস) হিমোলিম্ফ ccfDNA ভাইরোম পরীক্ষা করি।ccfDNA এর শটগান সিকোয়েন্সিং প্রকৃতপক্ষে একটি নতুন পদ্ধতি যা মানুষ বা অন্যান্য প্রজাতির ভাইরোম অধ্যয়নের গতি অর্জন করছে [২১, ৩৭, ৬৪]।এই পদ্ধতিটি ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ ভাইরাস অধ্যয়নের জন্য বিশেষভাবে উপযোগী, যেহেতু বাল্টিমোরের সবচেয়ে বৈচিত্র্যময় এবং বিস্তৃত শ্রেণীর ভাইরাসের প্রতিনিধিত্ব করে, সমস্ত ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ ভাইরাসগুলির মধ্যে কোনও একক জিন সংরক্ষণ করা হয় না [65]।যদিও এই ভাইরাসগুলির বেশিরভাগই অশ্রেণীবদ্ধ রয়ে গেছে এবং ভাইরাল জগতের সম্পূর্ণ অজানা অংশের ভাইরাসগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করতে পারে [৬৬], আমরা দেখতে পেয়েছি যে A. atra এবং M. platensis ঝিনুকের ভাইরোম এবং হোস্ট রেঞ্জ দুটি প্রজাতির মধ্যে পড়ে।একইভাবে (চিত্র S3, অতিরিক্ত তথ্য দেখুন)।এই মিলটি আশ্চর্যজনক নয়, কারণ এটি পরিবেশে উপস্থিত ডিএনএ গ্রহণের ক্ষেত্রে নির্বাচনীতার অভাবকে প্রতিফলিত করতে পারে।বিশুদ্ধ আরএনএ ব্যবহার করে ভবিষ্যতের অধ্যয়নগুলি বর্তমানে আরএনএ ভাইরোমের বৈশিষ্ট্যের জন্য প্রয়োজন।
আমাদের গবেষণায়, আমরা কওয়ারস্কি এবং সহকর্মীদের কাজ থেকে অভিযোজিত একটি খুব কঠোর পাইপলাইন ব্যবহার করেছি [৩৭], যারা নেটিভ ccfDNA এর সমাবেশের আগে এবং পরে পুলড রিডস এবং কনটিগগুলির একটি দ্বি-পদক্ষেপ মুছে ফেলার ব্যবহার করেছিল, যার ফলে অম্যাপড রিডের উচ্চ অনুপাত হয়।অতএব, আমরা অস্বীকার করতে পারি না যে এই আনম্যাপড রিডগুলির মধ্যে কিছুর এখনও তাদের নিজস্ব উত্স থাকতে পারে, প্রাথমিকভাবে কারণ আমাদের কাছে এই ঝিনুক প্রজাতির জন্য একটি রেফারেন্স জিনোম নেই।আমরা এই পাইপলাইনটিও ব্যবহার করেছি কারণ আমরা সেলফ এবং নন-সেলফ রিড এবং ইলুমিনা MiSeq PE75 দ্বারা উত্পন্ন পঠিত দৈর্ঘ্যের মধ্যে কাইমেরা সম্পর্কে উদ্বিগ্ন ছিলাম৷সংখ্যাগরিষ্ঠ অপরিচিত রিডিংয়ের আরেকটি কারণ হ'ল বেশিরভাগ সামুদ্রিক জীবাণু, বিশেষ করে কেরগুলেনের মতো প্রত্যন্ত অঞ্চলে, টীকা করা হয়নি।আমরা ইলুমিনা MiSeq PE75 ব্যবহার করেছি, ccfDNA খণ্ডের দৈর্ঘ্য মানব ccfDNA-এর অনুরূপ।ভবিষ্যত গবেষণার জন্য, আমাদের ফলাফলে দেখা যাচ্ছে যে হিমোলিম্ফ ccfDNA মানুষ এবং/অথবা স্তন্যপায়ী প্রাণীদের চেয়ে বেশি পড়া হয়েছে, আমরা একটি সিকোয়েন্সিং প্ল্যাটফর্ম ব্যবহার করার পরামর্শ দিই যা দীর্ঘ ccfDNA খণ্ডের জন্য আরও উপযুক্ত।এই অনুশীলনটি গভীর বিশ্লেষণের জন্য আরও ইঙ্গিত সনাক্ত করা আরও সহজ করে তুলবে।বর্তমানে অনুপলব্ধ সম্পূর্ণ A. অট্রা পারমাণবিক জিনোম ক্রম প্রাপ্ত করা স্ব এবং অ-স্ব উত্স থেকে ccfDNA এর বৈষম্যকে ব্যাপকভাবে সহজতর করবে।আমাদের গবেষণাটি ঝিনুকের জন্য তরল বায়োপসি ধারণাটি প্রয়োগ করার সম্ভাবনার উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছে, আমরা আশা করি যে এই ধারণাটি ভবিষ্যতের গবেষণায় ব্যবহার করা হলে, ঝিনুকের জীবাণু বৈচিত্র্য অধ্যয়ন করার জন্য এই পদ্ধতির সম্ভাবনা বাড়ানোর জন্য নতুন সরঞ্জাম এবং পাইপলাইন তৈরি করা হবে।সামুদ্রিক বাস্তুতন্ত্র।
একটি অ-আক্রমণাত্মক ক্লিনিকাল বায়োমার্কার হিসাবে, ccfDNA এর উন্নত মানব রক্তরস স্তর বিভিন্ন রোগ, টিস্যু ক্ষতি এবং চাপের অবস্থার সাথে যুক্ত [67,68,69]।এই বৃদ্ধি টিস্যু ক্ষতির পরে তার নিজস্ব উত্সের ডিএনএ টুকরা প্রকাশের সাথে যুক্ত।আমরা তীব্র তাপের চাপ ব্যবহার করে এই সমস্যাটির সমাধান করেছি, যেখানে ঝিনুকগুলি সংক্ষিপ্তভাবে 30 ডিগ্রি সেলসিয়াসের তাপমাত্রায় উন্মুক্ত হয়েছিল।আমরা তিনটি স্বাধীন পরীক্ষায় তিনটি ভিন্ন ধরণের ঝিনুকের উপর এই বিশ্লেষণটি করেছি।যাইহোক, আমরা তীব্র তাপের চাপের পরে ccfDNA স্তরে কোন পরিবর্তন পাইনি (চিত্র S5, অতিরিক্ত তথ্য দেখুন)।এই আবিষ্কারটি অন্তত আংশিকভাবে এই সত্যটি ব্যাখ্যা করতে পারে যে ঝিনুকের একটি আধা-খোলা সংবহন ব্যবস্থা রয়েছে এবং তাদের উচ্চ ফিল্টারিং কার্যকলাপের কারণে প্রচুর পরিমাণে বিদেশী ডিএনএ জমা হয়।অন্যদিকে, ঝিনুক, অনেক অমেরুদণ্ডী প্রাণীর মতো, স্ট্রেস-প্ররোচিত টিস্যুর ক্ষতির জন্য আরও প্রতিরোধী হতে পারে, যার ফলে তাদের হেমোলিম্ফ [70, 71] এ ccfDNA নিঃসরণ সীমিত করে।
আজ অবধি, জলজ বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্যের ডিএনএ বিশ্লেষণ মূলত পরিবেশগত ডিএনএ (ইডিএনএ) মেটাবারকোডিংয়ের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছে।যাইহোক, প্রাইমার ব্যবহার করার সময় এই পদ্ধতিটি সাধারণত জীববৈচিত্র্য বিশ্লেষণে সীমাবদ্ধ থাকে।শটগান সিকোয়েন্সিং ব্যবহার পিসিআর-এর সীমাবদ্ধতা এবং প্রাইমার সেটের পক্ষপাতদুষ্ট নির্বাচনকে বাধা দেয়।এইভাবে, এক অর্থে, আমাদের পদ্ধতিটি সম্প্রতি ব্যবহৃত উচ্চ-থ্রুপুট ইডিএনএ শটগান সিকোয়েন্সিং পদ্ধতির কাছাকাছি, যা সরাসরি খণ্ডিত ডিএনএ সিকোয়েন্স করতে এবং প্রায় সমস্ত জীবকে বিশ্লেষণ করতে সক্ষম হয় [72, 73]।যাইহোক, অনেকগুলি মৌলিক সমস্যা রয়েছে যা LB কে স্ট্যান্ডার্ড eDNA পদ্ধতি থেকে আলাদা করে।অবশ্যই, eDNA এবং LB এর মধ্যে প্রধান পার্থক্য হল প্রাকৃতিক ফিল্টার হোস্টের ব্যবহার।ইডিএনএ অধ্যয়নের জন্য একটি প্রাকৃতিক ফিল্টার হিসাবে স্পঞ্জ এবং বিভালভ (ড্রেসিনা এসপিপি) এর মতো সামুদ্রিক প্রজাতির ব্যবহার রিপোর্ট করা হয়েছে [৭৪, ৭৫]।যাইহোক, ড্রিসেনার গবেষণায় টিস্যু বায়োপসি ব্যবহার করা হয়েছিল যেখান থেকে ডিএনএ বের করা হয়েছিল।এলবি থেকে ccfDNA বিশ্লেষণের জন্য টিস্যু বায়োপসি, বিশেষ এবং কখনও কখনও ব্যয়বহুল সরঞ্জাম এবং ইডিএনএ বা টিস্যু বায়োপসির সাথে যুক্ত রসদ প্রয়োজন হয় না।প্রকৃতপক্ষে, আমরা সম্প্রতি রিপোর্ট করেছি যে এলবি থেকে ccfDNA কোল্ড চেইন বজায় না রেখে এফটিএ সমর্থনের সাথে সংরক্ষণ এবং বিশ্লেষণ করা যেতে পারে, যা প্রত্যন্ত অঞ্চলে গবেষণার জন্য একটি বড় চ্যালেঞ্জ [76]।তরল বায়োপসি থেকে ccfDNA নিষ্কাশনও সহজ এবং শটগান সিকোয়েন্সিং এবং পিসিআর বিশ্লেষণের জন্য উচ্চ মানের ডিএনএ প্রদান করে।ইডিএনএ বিশ্লেষণের সাথে যুক্ত কিছু প্রযুক্তিগত সীমাবদ্ধতা দেওয়া এটি একটি দুর্দান্ত সুবিধা [77]।নমুনা পদ্ধতির সরলতা এবং কম খরচ দীর্ঘমেয়াদী পর্যবেক্ষণ প্রোগ্রামের জন্য বিশেষভাবে উপযুক্ত।তাদের উচ্চ ফিল্টারিং ক্ষমতা ছাড়াও, বাইভালভের আরেকটি সুপরিচিত বৈশিষ্ট্য হল তাদের শ্লেষ্মার রাসায়নিক মিউকোপলিস্যাকারাইড সংমিশ্রণ, যা ভাইরাসের শোষণকে উৎসাহিত করে [78, 79]।এটি জীববৈচিত্র্য এবং একটি প্রদত্ত জলীয় বাস্তুতন্ত্রের জলবায়ু পরিবর্তনের প্রভাবের বৈশিষ্ট্যের জন্য বাইভালভগুলিকে একটি আদর্শ প্রাকৃতিক ফিল্টার করে তোলে।যদিও হোস্ট-উত্পন্ন ডিএনএ খণ্ডের উপস্থিতি ইডিএনএর তুলনায় পদ্ধতির একটি সীমাবদ্ধতা হিসাবে দেখা যেতে পারে, ইডিএনএর তুলনায় এই জাতীয় ccfDNA থাকার সাথে সম্পর্কিত খরচ একই সাথে স্বাস্থ্য অধ্যয়নের জন্য উপলব্ধ বিপুল পরিমাণ তথ্যের জন্য বোধগম্য।অফসেট হোস্ট।এর মধ্যে হোস্ট হোস্টের জিনোমে একত্রিত ভাইরাল সিকোয়েন্সের উপস্থিতি অন্তর্ভুক্ত।এটি ঝিনুকের জন্য বিশেষভাবে গুরুত্বপূর্ণ, বাইভালভগুলিতে অনুভূমিকভাবে প্রেরিত লিউকেমিক রেট্রোভাইরাসের উপস্থিতি [80, 81]।ইডিএনএ-র উপর এলবি-এর আরেকটি সুবিধা হল যে এটি হেমোলিম্ফের রক্তকণিকা সঞ্চালনের ফ্যাগোসাইটিক কার্যকলাপকে কাজে লাগায়, যা অণুজীবকে (এবং তাদের জিনোমগুলিকে) আচ্ছন্ন করে।ফাগোসাইটোসিস হল বাইভালভের রক্ত ​​কোষের প্রধান কাজ [82]।অবশেষে, পদ্ধতিটি ঝিনুকের উচ্চ ফিল্টারিং ক্ষমতা (গড় 1.5 l/h সমুদ্রের জল) এবং দুই দিনের সঞ্চালনের সুবিধা নেয়, যা সমুদ্রের জলের বিভিন্ন স্তরের মিশ্রণকে বাড়িয়ে দেয়, যা হেটেরোলগাস ইডিএনএ ক্যাপচার করার অনুমতি দেয়।[৮৩, ৮৪]।সুতরাং, ঝিনুকের পুষ্টি, অর্থনৈতিক এবং পরিবেশগত প্রভাবের কারণে ঝিনুক ccfDNA বিশ্লেষণ একটি আকর্ষণীয় উপায়।মানুষের কাছ থেকে সংগৃহীত এলবি বিশ্লেষণের মতো, এই পদ্ধতিটি বহির্মুখী পদার্থের প্রতিক্রিয়ায় হোস্ট ডিএনএ-তে জেনেটিক এবং এপিজেনেটিক পরিবর্তনগুলি পরিমাপের সম্ভাবনাও উন্মুক্ত করে।উদাহরণ স্বরূপ, ন্যানোপোর সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে নেটিভ ccfDNA-তে জিনোম-ওয়াইড মিথাইলেশন বিশ্লেষণ করার জন্য তৃতীয়-প্রজন্মের সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির কল্পনা করা যেতে পারে।এই প্রক্রিয়াটি এই সত্যটি দ্বারা সহজতর করা উচিত যে ঝিনুক সিসিএফডিএনএ খণ্ডগুলির দৈর্ঘ্য আদর্শভাবে দীর্ঘ-পঠিত সিকোয়েন্সিং প্ল্যাটফর্মগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যা জিনোম-বিস্তৃত ডিএনএ মেথিলেশন বিশ্লেষণকে একক সিকোয়েন্সিং রান থেকে রাসায়নিক রূপান্তরগুলির প্রয়োজন ছাড়াই অনুমতি দেয় 85৮৮,৮6] এটি একটি আকর্ষণীয় সম্ভাবনা, কারণ এটি দেখানো হয়েছে যে এটি ডিএনএ মেথিলেশনকে প্রতিফলিত করে এবং ডিএনএ মেথিলেশন প্যাটার্নকে প্রতিফলিত করে।অতএব, এটি জলবায়ু পরিবর্তন বা দূষণকারীর সংস্পর্শে আসার পরে প্রতিক্রিয়া নিয়ন্ত্রণকারী অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াগুলির মধ্যে মূল্যবান অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে [87]।যাইহোক, এলবি ব্যবহার সীমাবদ্ধতা ছাড়া নয়।বলা বাহুল্য, এর জন্য ইকোসিস্টেমে নির্দেশক প্রজাতির উপস্থিতি প্রয়োজন।উপরে উল্লিখিত হিসাবে, একটি প্রদত্ত বাস্তুতন্ত্রের জীববৈচিত্র্য মূল্যায়ন করার জন্য LB ব্যবহার করার জন্য একটি কঠোর বায়োইনফরমেটিক্স পাইপলাইন প্রয়োজন যা উৎস থেকে DNA খণ্ডের উপস্থিতি বিবেচনা করে।আরেকটি বড় সমস্যা হল সামুদ্রিক প্রজাতির জন্য রেফারেন্স জিনোমের প্রাপ্যতা।আশা করা যায় যে সামুদ্রিক স্তন্যপায়ী জিনোম প্রকল্প এবং সম্প্রতি প্রতিষ্ঠিত Fish10k প্রকল্প [৮৮] এর মতো উদ্যোগ ভবিষ্যতে এই ধরনের বিশ্লেষণকে সহজতর করবে।সামুদ্রিক ফিল্টার-ফিডিং জীবগুলিতে এলবি ধারণার প্রয়োগটি সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তির সর্বশেষ অগ্রগতির সাথেও সামঞ্জস্যপূর্ণ, যা পরিবেশগত চাপের প্রতিক্রিয়ায় সামুদ্রিক বাসস্থানের স্বাস্থ্য সম্পর্কে গুরুত্বপূর্ণ তথ্য প্রদানের জন্য মাল্টি-ওহম বায়োমার্কারের বিকাশের জন্য উপযুক্ত করে তুলেছে।
জিনোম সিকোয়েন্সিং ডেটা বায়োপ্রজেক্ট SRR8924808-এর অধীনে NCBI সিকোয়েন্স রিড আর্কাইভ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808-এ জমা করা হয়েছে।
ব্রিয়ারলি এএস, কিংসফোর্ড এমজে সামুদ্রিক জীবন এবং বাস্তুতন্ত্রের উপর জলবায়ু পরিবর্তনের প্রভাব।কোল জীববিদ্যা।2009;19: P602–P614।
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.সামুদ্রিক পরিবেশের উপর জলবায়ু পরিবর্তন এবং অন্যান্য স্থানীয় চাপের সম্মিলিত প্রভাব বিবেচনা করুন।সাধারণ বৈজ্ঞানিক পরিবেশ।2021;755:142564।
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.)পহেলা মার্চের বিজ্ঞান।2020; 7:48।
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. পুনরাবৃত্ত তাপ চাপের পরিস্থিতিতে তাপ সহনশীলতা হ্রাস করা নীল ঝিনুকের উচ্চ গ্রীষ্মকালীন মৃত্যুকে ব্যাখ্যা করে।বৈজ্ঞানিক রিপোর্ট 2019;9:17498।
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.প্রাণী মৃত্যুর ফ্রিকোয়েন্সি, কারণ এবং মাত্রায় সাম্প্রতিক পরিবর্তন।Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8।
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.একাধিক অ-প্রজাতি-নির্দিষ্ট প্যাথোজেন পিন্না নোবিলিসের ব্যাপক মৃত্যুর কারণ হতে পারে।জীবন.2020; 10:238।
ব্র্যাডলি এম, কউটস এসজে, জেনকিন্স ই, ও'হারা টিএম।আর্কটিক জুনোটিক রোগের উপর জলবায়ু পরিবর্তনের সম্ভাব্য প্রভাব।ইন্টি জে সার্কামপোলার স্বাস্থ্য।2005;64:468-77।
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.উপকূলীয় দূষণ পর্যবেক্ষণে সংকেত জীব হিসাবে নীল ঝিনুক (মাইটিলাস এডুলিস এসপিপি): একটি পর্যালোচনা।Mar Environ Res 2017;130:338-65।
সিরাভেগ্না জি, মারসোনি এস, সিয়েনা এস, বারডেলি এ। ক্যান্সার চিকিৎসায় তরল বায়োপসির একীকরণ।ন্যাট রেভ ক্লিন অনকল।2017;14:531-48।
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.তরল বায়োপসি পরিপক্কতা: টিউমার ডিএনএ সঞ্চালনের অনুমতি দেয়।ন্যাট রেভ ক্যান্সার।2017;17:223–38।
Mandel P., Metais P. মানুষের রক্তরসে নিউক্লিক অ্যাসিড।Soc Biol সহযোগীদের মিটিং মিনিট।1948;142:241-3।
ব্রঙ্কহর্স্ট এজে, উঙ্গেরার ডব্লিউ, হোল্ডেনরিডার এস। ক্যান্সারের চিকিৎসার জন্য একটি আণবিক মার্কার হিসাবে কোষ-মুক্ত ডিএনএর জন্য একটি নতুন ভূমিকা।বায়োমোলার বিশ্লেষণের পরিমাণ নির্ধারণ।2019;17:100087।
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid বায়োপসি ক্লিনিকে প্রবেশ করেছে – বাস্তবায়নের সমস্যা এবং ভবিষ্যতের চ্যালেঞ্জ।ন্যাট রেভ ক্লিন অনকল।2021;18:297-312।
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW এবং অন্যান্য।ভ্রূণের ডিএনএ মাতৃ রক্তরস এবং সিরামে উপস্থিত থাকে।ল্যানসেট।1997;350:485-7।
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR গর্ভাবস্থার কোর্স এবং গর্ভাবস্থায় মহিলাদের রক্তে সঞ্চালন বহির্মুখী RNA ব্যবহার করে এর জটিলতাগুলির অধ্যয়ন৷ডোপেডিয়াট্রিক্স।2020;8:605219।
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.লিকুইড বায়োপসি: কিডনি গ্রাফটে অ্যালোজেনিক ক্ষত সনাক্ত করতে দাতা কোষ-মুক্ত ডিএনএ ব্যবহার করা হয়।ন্যাট রেভ নেফ্রোল।2021;17:591-603।
জুয়ান এফসি, লো ওয়াইএম ইনোভেশনস ইন প্রসবপূর্ব ডায়াগনস্টিকস: ম্যাটারনাল প্লাজমা জিনোম সিকোয়েন্সিং।আনা এমডি।2016;67:419-32।
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.সংক্রামিত শারীরিক তরল পরবর্তী প্রজন্মের মেটাজেনমিক সিকোয়েন্সিং সহ দ্রুত প্যাথোজেন সনাক্তকরণ।ন্যাট মেডিসিন।2021;27:115-24।