Nature.com দেখার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে সীমিত CSS সমর্থন রয়েছে। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্যতা মোড অক্ষম করুন)। ইতিমধ্যে, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা সাইটটিকে স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই রেন্ডার করব।
ওষুধ পরীক্ষার জন্য হৃদপিণ্ডের শারীরবৃত্তীয় পরিবেশ সঠিকভাবে পুনরুৎপাদন করতে পারে এমন একটি নির্ভরযোগ্য ইন ভিট্রো সিস্টেমের প্রয়োজন। মানুষের হৃদপিণ্ডের টিস্যু কালচার সিস্টেমের সীমিত প্রাপ্যতার কারণে হৃদপিণ্ডের ওষুধের প্রভাবের ভুল ব্যাখ্যা তৈরি হয়েছে। এখানে, আমরা একটি কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার মডেল (CTCM) তৈরি করেছি যা ইলেক্ট্রোমেকানিক্যালি হৃদপিণ্ডের টুকরোগুলিকে উদ্দীপিত করে এবং হৃদপিণ্ড চক্রের সিস্টোলিক এবং ডায়াস্টোলিক পর্যায়ে শারীরবৃত্তীয় প্রসারণের মধ্য দিয়ে যায়। ১২ দিনের কালচারের পর, এই পদ্ধতিটি হৃদপিণ্ডের অংশগুলির কার্যকারিতা আংশিকভাবে উন্নত করে, কিন্তু তাদের কাঠামোগত অখণ্ডতা সম্পূর্ণরূপে সংরক্ষণ করেনি। অতএব, ছোট অণু স্ক্রীনিংয়ের পরে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে আমাদের মাধ্যমে ১০০ nM ট্রাইওডোথাইরোনিন (T3) এবং ১ μM ডেক্সামেথাসোন (Dex) যোগ করার ফলে ১২ দিনের জন্য হৃদপিণ্ডের ক্ষুদ্র গঠন বজায় রাখা হয়েছে। T3/Dex চিকিৎসার সাথে মিলিত হয়ে, CTCM সিস্টেম ১২ দিনের জন্য তাজা হৃদপিণ্ডের টিস্যুর সমান স্তরে ট্রান্সক্রিপশনাল প্রোফাইল, কার্যকারিতা, বিপাকীয় কার্যকলাপ এবং কাঠামোগত অখণ্ডতা বজায় রেখেছে। এছাড়াও, কালচারে কার্ডিয়াক টিস্যুর অত্যধিক স্ট্রেচিং হাইপারট্রফিক কার্ডিয়াক সিগন্যালিংকে প্ররোচিত করে, যা কার্ডিয়াক স্ট্রেচ দ্বারা সৃষ্ট হাইপারট্রফিক অবস্থার অনুকরণ করার জন্য সিটিসিএমের ক্ষমতার প্রমাণ প্রদান করে। উপসংহারে, সিটিসিএম দীর্ঘ সময় ধরে কালচারে হার্টের ফিজিওলজি এবং প্যাথোফিজিওলজি মডেল করতে পারে, যা নির্ভরযোগ্য ওষুধ স্ক্রিনিং সক্ষম করে।
ক্লিনিক্যাল গবেষণার আগে, নির্ভরযোগ্য ইন ভিট্রো সিস্টেমের প্রয়োজন যা মানুষের হৃদপিণ্ডের শারীরবৃত্তীয় পরিবেশকে সঠিকভাবে পুনরুৎপাদন করতে পারে। এই ধরনের সিস্টেমগুলির পরিবর্তিত যান্ত্রিক প্রসারণ, হৃদস্পন্দন এবং ইলেক্ট্রোফিজিওলজিক্যাল বৈশিষ্ট্যের অনুকরণ করা উচিত। প্রাণীর মডেলগুলি সাধারণত কার্ডিয়াক ফিজিওলজির জন্য একটি স্ক্রিনিং প্ল্যাটফর্ম হিসাবে ব্যবহৃত হয়, মানুষের হৃদপিণ্ডে ওষুধের প্রভাব প্রতিফলিত করার ক্ষেত্রে সীমিত নির্ভরযোগ্যতা সহ1,2। পরিশেষে, আদর্শ কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার এক্সপেরিমেন্টাল মডেল (CTCM) হল এমন একটি মডেল যা বিভিন্ন থেরাপিউটিক এবং ফার্মাকোলজিক্যাল হস্তক্ষেপের জন্য অত্যন্ত সংবেদনশীল এবং নির্দিষ্ট, মানুষের হৃদপিণ্ডের শারীরবৃত্তীয় এবং প্যাথোফিজিওলজি সঠিকভাবে পুনরুৎপাদন করে3। এই ধরনের সিস্টেমের অনুপস্থিতি হার্ট ফেইলিউরের জন্য নতুন চিকিৎসা আবিষ্কারকে সীমিত করে4,5 এবং বাজার থেকে বেরিয়ে যাওয়ার একটি প্রধান কারণ হিসেবে ড্রাগ কার্ডিওটক্সিসিটিকে নেতৃত্ব দিয়েছে6।
গত দশকে, আটটি নন-কার্ডিওভাসকুলার ওষুধ ক্লিনিক্যাল ব্যবহার থেকে প্রত্যাহার করা হয়েছে কারণ এগুলি QT ব্যবধান দীর্ঘায়িত করে ভেন্ট্রিকুলার অ্যারিথমিয়া এবং আকস্মিক মৃত্যুর কারণ হয়। অতএব, হৃদরোগের কার্যকারিতা এবং বিষাক্ততা মূল্যায়নের জন্য নির্ভরযোগ্য প্রিক্লিনিক্যাল স্ক্রিনিং কৌশলগুলির ক্রমবর্ধমান চাহিদা রয়েছে। ওষুধের স্ক্রিনিং এবং বিষাক্ততা পরীক্ষায় মানব-প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল-ডেরিভড কার্ডিওমায়োসাইট (hiPS-CM) এর সাম্প্রতিক ব্যবহার এই সমস্যার আংশিক সমাধান প্রদান করে। তবে, hiPS-CM-এর অপরিণত প্রকৃতি এবং কার্ডিয়াক টিস্যুর বহুকোষী জটিলতার অভাব এই পদ্ধতির প্রধান সীমাবদ্ধতা। সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে স্বতঃস্ফূর্ত সংকোচনের সূত্রপাতের পরপরই কার্ডিয়াক টিস্যু হাইড্রোজেল তৈরি করতে প্রাথমিক hiPS-CM ব্যবহার করে এবং সময়ের সাথে সাথে ধীরে ধীরে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা বৃদ্ধি করে এই সীমাবদ্ধতা আংশিকভাবে কাটিয়ে ওঠা যেতে পারে। তবে, এই hiPS-CM মাইক্রোটিস্যুগুলিতে প্রাপ্তবয়স্ক মায়োকার্ডিয়ামের পরিপক্ক ইলেক্ট্রোফিজিওলজিক্যাল এবং সংকোচনশীল বৈশিষ্ট্যের অভাব রয়েছে। এছাড়াও, মানুষের হৃদপিণ্ডের টিস্যুর গঠন আরও জটিল, যা বিভিন্ন ধরণের কোষের মিশ্রণ দ্বারা গঠিত, যার মধ্যে রয়েছে এন্ডোথেলিয়াল কোষ, নিউরন এবং স্ট্রোমাল ফাইব্রোব্লাস্ট, যা নির্দিষ্ট ধরণের বহির্কোষীয় ম্যাট্রিক্স প্রোটিন দ্বারা আন্তঃসংযুক্ত। প্রাপ্তবয়স্ক স্তন্যপায়ী হৃদপিণ্ডে অ-কার্ডিওমায়োসাইট জনসংখ্যার 11,12,13 এই ভিন্নতা পৃথক ধরণের কোষ ব্যবহার করে হৃদপিণ্ডের টিস্যু মডেলিংয়ের ক্ষেত্রে একটি প্রধান বাধা। এই প্রধান সীমাবদ্ধতাগুলি শারীরবৃত্তীয় এবং রোগগত অবস্থার অধীনে অক্ষত মায়োকার্ডিয়াল টিস্যু সংস্কৃতির জন্য পদ্ধতি বিকাশের গুরুত্বের উপর জোর দেয়।
মানব হৃদপিণ্ডের কালচারড পাতলা (300 µm) অংশগুলি অক্ষত মানব মায়োকার্ডিয়ামের একটি প্রতিশ্রুতিশীল মডেল হিসাবে প্রমাণিত হয়েছে। এই পদ্ধতিটি মানব হৃদপিণ্ডের টিস্যুর মতো একটি সম্পূর্ণ 3D বহুকোষী সিস্টেমে অ্যাক্সেস প্রদান করে। তবে, 2019 সাল পর্যন্ত, কালচারড হার্ট সেকশনের ব্যবহার সংক্ষিপ্ত (24 ঘন্টা) কালচার বেঁচে থাকার কারণে সীমিত ছিল। এর কারণ হল শারীরিক-যান্ত্রিক প্রসারণের অভাব, বায়ু-তরল ইন্টারফেস এবং কার্ডিয়াক টিস্যুর চাহিদা পূরণ করে না এমন সরল মাধ্যমের ব্যবহার। 2019 সালে, বেশ কয়েকটি গবেষণা দল দেখিয়েছে যে কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার সিস্টেমে যান্ত্রিক কারণগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করলে কালচারের জীবনকাল বাড়ানো যায়, কার্ডিয়াক এক্সপ্রেশন উন্নত করা যায় এবং কার্ডিয়াক প্যাথলজির অনুকরণ করা যায়। দুটি মার্জিত গবেষণা 17 এবং 18 দেখায় যে কালচারের সময় একঅক্ষীয় যান্ত্রিক লোডিং কার্ডিয়াক ফেনোটাইপের উপর ইতিবাচক প্রভাব ফেলে। তবে, এই গবেষণায় কার্ডিয়াক চক্রের গতিশীল ত্রিমাত্রিক ভৌত-যান্ত্রিক লোডিং ব্যবহার করা হয়নি, কারণ হার্ট সেকশনগুলি আইসোমেট্রিক টেনসাইল ফোর্স 17 বা লিনিয়ার অক্সোটোনিক লোডিং 18 দিয়ে লোড করা হয়েছিল। টিস্যু স্ট্রেচিংয়ের এই পদ্ধতিগুলির ফলে অনেক কার্ডিয়াক জিন দমন করা হয় অথবা অস্বাভাবিক স্ট্রেচ প্রতিক্রিয়ার সাথে সম্পর্কিত জিনের অত্যধিক প্রকাশ ঘটে। উল্লেখযোগ্যভাবে, পিটুলিস এট আল. ১৯ ফোর্স ট্রান্সডুসার ফিডব্যাক এবং টেনশন ড্রাইভ ব্যবহার করে কার্ডিয়াক চক্র পুনর্গঠনের জন্য একটি গতিশীল হার্ট স্লাইস কালচার বাথ তৈরি করেছেন। যদিও এই সিস্টেমটি আরও সঠিক ইন ভিট্রো কার্ডিয়াক চক্র মডেলিংয়ের অনুমতি দেয়, পদ্ধতির জটিলতা এবং কম থ্রুপুট এই সিস্টেমের প্রয়োগকে সীমিত করে। আমাদের পরীক্ষাগার সম্প্রতি বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা এবং একটি অপ্টিমাইজড মাধ্যম ব্যবহার করে একটি সরলীকৃত কালচার সিস্টেম তৈরি করেছে যা শূকর এবং মানুষের হৃদপিণ্ডের টিস্যুর অংশগুলিকে 6 দিন পর্যন্ত 20,21 পর্যন্ত কার্যকরী করে তোলে।
বর্তমান পাণ্ডুলিপিতে, আমরা একটি কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার মডেল (CTCM) বর্ণনা করছি যা শুয়োরের হৃদপিণ্ডের অংশগুলি ব্যবহার করে যা হৃদপিণ্ডের চক্রের সময় ত্রি-মাত্রিক কার্ডিয়াক ফিজিওলজি এবং প্যাথোফিজিওলজিক্যাল ডিসটেনশনের পুনরাবৃত্তি করার জন্য হিউমোরাল সংকেতগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করে। এই CTCM প্রাক-ক্লিনিক্যাল ড্রাগ পূর্বাভাসের নির্ভুলতাকে এমন একটি স্তরে বৃদ্ধি করতে পারে যা আগে কখনও অর্জিত হয়নি, একটি সাশ্রয়ী, মধ্য-থ্রুপুট কার্ডিয়াক সিস্টেম প্রদান করে যা প্রাক-ক্লিনিক্যাল ড্রাগ পরীক্ষার জন্য স্তন্যপায়ী হৃদপিণ্ডের ফিজিওলজি/প্যাথোফিজিওলজির অনুকরণ করে।
ভিট্রো ২২,২৩,২৪-এ কার্ডিওমায়োসাইট ফাংশন বজায় রাখার ক্ষেত্রে হেমোডাইনামিক যান্ত্রিক সংকেতগুলি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। বর্তমান পাণ্ডুলিপিতে, আমরা একটি CTCM (চিত্র ১ক) তৈরি করেছি যা শারীরবৃত্তীয় ফ্রিকোয়েন্সিতে (১.২ হার্জ, প্রতি মিনিটে ৭২ বিট) বৈদ্যুতিক এবং যান্ত্রিক উভয় উদ্দীপনা প্ররোচিত করে প্রাপ্তবয়স্কদের হৃদযন্ত্রের পরিবেশের অনুকরণ করতে পারে। ডায়াস্টোলের সময় অতিরিক্ত টিস্যু প্রসারিত হওয়া এড়াতে, টিস্যুর আকার ২৫% বৃদ্ধি করার জন্য একটি 3D প্রিন্টিং ডিভাইস ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র ১খ)। সি-পেস সিস্টেম দ্বারা প্ররোচিত বৈদ্যুতিক পেসিং সিস্টোলের ১০০ মিলিসেকেন্ড আগে শুরু করার জন্য সময় নির্ধারণ করা হয়েছিল যাতে কার্ডিয়াক চক্র সম্পূর্ণরূপে পুনরুত্পাদন করা যায়। টিস্যু কালচার সিস্টেমটি একটি প্রোগ্রামেবল নিউমেটিক অ্যাকচুয়েটর (এলবি ইঞ্জিনিয়ারিং, জার্মানি) ব্যবহার করে উপরের চেম্বারে হৃদপিণ্ডের টুকরোগুলির প্রসারণের জন্য একটি নমনীয় সিলিকন ঝিল্লিকে চক্রাকারে প্রসারিত করে। সিস্টেমটি একটি চাপ ট্রান্সডুসারের মাধ্যমে একটি বহিরাগত বায়ু লাইনের সাথে সংযুক্ত ছিল, যা চাপ (± ১ মিমিএইচজি) এবং সময় (± ১ এমএস) সঠিকভাবে সামঞ্জস্য করা সম্ভব করেছিল (চিত্র ১গ)।
a ডিভাইসের কালচার চেম্বারের ভেতরে নীল রঙে দেখানো ৭ মিমি সাপোর্ট রিং-এর সাথে টিস্যু অংশটি সংযুক্ত করুন। কালচার চেম্বারের ভেতরের অংশটি একটি পাতলা নমনীয় সিলিকন ঝিল্লি দ্বারা এয়ার চেম্বারের মধ্যে আলাদা করা হয়েছে। লিক প্রতিরোধ করার জন্য প্রতিটি চেম্বারের মধ্যে একটি গ্যাসকেট রাখুন। ডিভাইসের ঢাকনায় গ্রাফাইট ইলেকট্রোড থাকে যা বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রদান করে। b বৃহৎ টিস্যু ডিভাইস, গাইড রিং এবং সাপোর্ট রিংয়ের পরিকল্পিত উপস্থাপনা। টিস্যু অংশগুলি (বাদামী) ডিভাইসের বাইরের প্রান্তে খাঁজে রাখা গাইড রিং সহ বড় আকারের ডিভাইসে স্থাপন করা হয়। গাইড ব্যবহার করে, কার্ডিয়াক টিস্যুর অংশের উপর টিস্যু অ্যাক্রিলিক আঠা দিয়ে লেপা সাপোর্ট রিংটি সাবধানে রাখুন। c প্রোগ্রামেবল নিউমেটিক অ্যাকচুয়েটর (PPD) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত বায়ু চেম্বারের চাপের ফাংশন হিসাবে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার সময় দেখানো গ্রাফ। চাপ সেন্সর ব্যবহার করে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা সিঙ্ক্রোনাইজ করার জন্য একটি ডেটা অর্জন ডিভাইস ব্যবহার করা হয়েছিল। যখন কালচার চেম্বারের চাপ সেট থ্রেশহোল্ডে পৌঁছায়, তখন বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা ট্রিগার করার জন্য C-PACE-EM-এ একটি পালস সংকেত পাঠানো হয়। d একটি ইনকিউবেটর শেলফে রাখা চারটি CTCM-এর ছবি। চারটি ডিভাইস একটি PPD-এর সাথে একটি নিউমেটিক সার্কিটের মাধ্যমে সংযুক্ত থাকে এবং নিউমেটিক সার্কিটের চাপ পর্যবেক্ষণের জন্য হেমোস্ট্যাটিক ভালভের মধ্যে চাপ সেন্সর ঢোকানো হয়। প্রতিটি ডিভাইসে ছয়টি টিস্যু বিভাগ থাকে।
একটি একক নিউমেটিক অ্যাকচুয়েটর ব্যবহার করে, আমরা ৪টি CTCM ডিভাইস নিয়ন্ত্রণ করতে সক্ষম হয়েছি, যার প্রতিটিতে ৬টি টিস্যু সেকশন ধারণ করতে পারে (চিত্র ১d)। CTCM-তে, বায়ু চেম্বারের বায়ুচাপ তরল চেম্বারের সিঙ্ক্রোনাস চাপে রূপান্তরিত হয় এবং হৃদপিণ্ডের স্লাইসের শারীরবৃত্তীয় প্রসারণ ঘটায় (চিত্র ২a এবং পরিপূরক চলচ্চিত্র ১)। ৮০ মিমি Hg-এ টিস্যু স্ট্রেচের মূল্যায়ন। চিত্রে টিস্যু সেকশনের স্ট্রেচিং ২৫% দেখানো হয়েছে (চিত্র ২b)। এই শতাংশ স্ট্রেচ স্বাভাবিক কার্ডিয়াক সেকশন সংকোচনের জন্য ২.২-২.৩ µm শারীরবৃত্তীয় সারকোমের দৈর্ঘ্যের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ দেখানো হয়েছে। কাস্টম ক্যামেরা সেটিংস ব্যবহার করে টিস্যু নড়াচড়া মূল্যায়ন করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র ১)। টিস্যু নড়াচড়ার প্রশস্ততা এবং বেগ (চিত্র ২c, d) কার্ডিয়াক চক্রের সময় স্ট্রেচ এবং সিস্টোল এবং ডায়াস্টোলের সময় সময়ের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ ছিল (চিত্র ২b)। সংকোচন এবং শিথিলকরণের সময় কার্ডিয়াক টিস্যুর স্ট্রেচিং এবং বেগ কালচারে ১২ দিন ধরে স্থির ছিল (চিত্র ২f)। কালচারের সময় সংকোচনের উপর বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার প্রভাব মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা একটি শেডিং অ্যালগরিদম ব্যবহার করে সক্রিয় বিকৃতি নির্ধারণের জন্য একটি পদ্ধতি তৈরি করেছি (পরিপূরক চিত্র 2a, b) এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা সহ এবং ছাড়া বিকৃতির মধ্যে পার্থক্য করতে সক্ষম হয়েছি। হৃৎপিণ্ডের একই অংশ (চিত্র 2f)। কাটার চলমান অঞ্চলে (R6-9), বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার সময় ভোল্টেজ বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার অনুপস্থিতির তুলনায় 20% বেশি ছিল, যা সংকোচনের কার্যকারিতায় বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার অবদান নির্দেশ করে।
বায়ু চেম্বারের চাপ, তরল চেম্বারের চাপ এবং টিস্যু চলাচলের পরিমাপের প্রতিনিধিত্বমূলক চিহ্ন নিশ্চিত করে যে চেম্বারের চাপ তরল চেম্বারের চাপকে পরিবর্তন করে, যার ফলে টিস্যু স্লাইসের অনুরূপ নড়াচড়া হয়। b শতাংশ প্রসারিত (কমলা) এর সাথে সম্পর্কিত টিস্যু বিভাগের শতাংশ প্রসারিত (নীল) এর প্রতিনিধিত্বমূলক চিহ্ন। c কার্ডিয়াক স্লাইসের পরিমাপিত গতি গতির পরিমাপিত গতির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। (d) হৃদপিণ্ডের একটি স্লাইসে চক্রীয় গতি (নীল রেখা) এবং বেগ (কমলা বিন্দুযুক্ত রেখা) এর প্রতিনিধিত্বমূলক ট্র্যাজেক্টোরি। e চক্র সময়ের পরিমাণ নির্ধারণ (n = প্রতি গ্রুপে 19 স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), সংকোচনের সময় (n = প্রতি গ্রুপে 19 স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), শিথিলকরণ সময় (n = 19 স্লাইস প্রতি গ্রুপে, বিভিন্ন শূকর থেকে), টিস্যু চলাচল (n = 25) স্লাইস)/গ্রুপ, শীর্ষ সিস্টোলিক বেগ (n = 24(D0), 25(D12) স্লাইস/গ্রুপ বিভিন্ন শূকর থেকে) এবং শীর্ষ শিথিলকরণ হার (n=24(D0), 25(D12) স্লাইস/গ্রুপ বিভিন্ন শূকর থেকে)। দুই-লেজযুক্ত শিক্ষার্থীর টি-পরীক্ষায় কোনও প্যারামিটারে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখা যায়নি। f প্রতিনিধি স্ট্রেন বিশ্লেষণে (লাল) এবং (নীল) বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা ছাড়াই টিস্যু বিভাগের ট্রেস, একই বিভাগ থেকে টিস্যু বিভাগের দশটি আঞ্চলিক অঞ্চল। নীচের প্যানেলগুলি বিভিন্ন বিভাগ থেকে দশটি অঞ্চলে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা সহ এবং ছাড়াই টিস্যু বিভাগে স্ট্রেনের শতাংশের পার্থক্যের পরিমাণ নির্ধারণ দেখায়। (n = বিভিন্ন শূকর থেকে 8টি স্লাইস/গ্রুপ, দুই-লেজযুক্ত ছাত্র টি-পরীক্ষা করা হয়; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05)। (n = বিভিন্ন শূকর থেকে 8টি স্লাইস/গ্রুপ, দুই-লেজযুক্ত ছাত্র টি-পরীক্ষা করা হয়; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05)। (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,01, *p<00,5)। (n = বিভিন্ন শূকর থেকে 8টি বিভাগ/গ্রুপ, দুই-লেজযুক্ত শিক্ষার্থীর টি-টেস্ট; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)। （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）। （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）। (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05)। (n = 8 টি বিভাগ/গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে, দুই-লেজযুক্ত শিক্ষার্থীর টি-টেস্ট; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)।ত্রুটি বারগুলি গড় ± মানক বিচ্যুতি উপস্থাপন করে।
আমাদের পূর্ববর্তী স্ট্যাটিক বায়োমিমেটিক হার্ট স্লাইস কালচার সিস্টেমে [20, 21], আমরা বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রয়োগ করে এবং মাঝারি গঠন অপ্টিমাইজ করে 6 দিনের জন্য হার্ট স্লাইসের কার্যকারিতা, কার্যকারিতা এবং কাঠামোগত অখণ্ডতা বজায় রেখেছিলাম। তবে, 10 দিন পরে, এই পরিসংখ্যানগুলি তীব্রভাবে হ্রাস পেয়েছে। আমরা আমাদের পূর্ববর্তী স্ট্যাটিক বায়োমিমেটিক কালচার সিস্টেম 20, 21 নিয়ন্ত্রণ শর্ত (Ctrl) এ সংস্কৃত বিভাগগুলিকে উল্লেখ করব এবং আমরা আমাদের পূর্বে অপ্টিমাইজ করা মাধ্যমকে একযোগে যান্ত্রিক এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা (CTCM) এর অধীনে MC অবস্থা এবং সংস্কৃতি হিসাবে ব্যবহার করব। বলা হয়। প্রথমত, আমরা নির্ধারণ করেছি যে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা ছাড়া যান্ত্রিক উদ্দীপনা 6 দিনের জন্য টিস্যুর কার্যকারিতা বজায় রাখার জন্য অপর্যাপ্ত ছিল (পরিপূরক চিত্র 3a, b)। মজার বিষয় হল, STCM ব্যবহার করে ফিজিও-যান্ত্রিক এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রবর্তনের সাথে, 12-দিনের হার্ট সেকশনের কার্যকারিতা MS অবস্থার অধীনে তাজা হার্ট সেকশনের মতোই রয়ে গেছে, কিন্তু Ctrl অবস্থার অধীনে নয়, যেমন MTT বিশ্লেষণ (চিত্র 1) দ্বারা দেখানো হয়েছে। 3a)। এটি ইঙ্গিত দেয় যে কার্ডিয়াক চক্রের যান্ত্রিক উদ্দীপনা এবং সিমুলেশন আমাদের পূর্ববর্তী স্ট্যাটিক কালচার সিস্টেমে রিপোর্ট করা টিস্যু বিভাগগুলিকে দ্বিগুণ সময় ধরে কার্যকর রাখতে পারে। তবে, কার্ডিয়াক ট্রোপোনিন টি এবং কনেক্সিন 43 এর ইমিউনোলেবেলিং দ্বারা টিস্যু বিভাগগুলির কাঠামোগত অখণ্ডতার মূল্যায়নে দেখা গেছে যে একই দিনের নিয়ন্ত্রণের তুলনায় 12 তম দিনে MC টিস্যুতে কনেক্সিন 43 এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল। তবে, অভিন্ন কনেক্সিন 43 এক্সপ্রেশন এবং Z-ডিস্ক গঠন সম্পূর্ণরূপে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়নি (চিত্র 3b)। আমরা টিস্যু স্ট্রাকচারাল অখণ্ডতা পরিমাপ করার জন্য একটি কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা (AI) কাঠামো (AI) ব্যবহার করি, ট্রোপোনিন-টি এবং কনেক্সিন স্টেইনিং 43 এর উপর ভিত্তি করে একটি চিত্র-ভিত্তিক গভীর শিক্ষার পাইপলাইন যা স্থানীয়করণের শক্তির দিক থেকে হৃদপিণ্ডের স্লাইসের কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং প্রতিপ্রভতা স্বয়ংক্রিয়ভাবে পরিমাপ করে। এই পদ্ধতিটি একটি কনভোলিউশনাল নিউরাল নেটওয়ার্ক (CNN) এবং একটি গভীর শিক্ষার কাঠামো ব্যবহার করে স্বয়ংক্রিয় এবং নিরপেক্ষ পদ্ধতিতে কার্ডিয়াক টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতা নির্ভরযোগ্যভাবে পরিমাপ করে, যেমন রেফারেন্সে বর্ণিত হয়েছে। 26. স্ট্যাটিক নিয়ন্ত্রণ বিভাগগুলির তুলনায় MC টিস্যু দিন 0 এর সাথে উন্নত কাঠামোগত মিল দেখিয়েছে। এছাড়াও, ম্যাসনের ট্রাইক্রোম স্টেইনিংয়ে MS অবস্থার অধীনে ফাইব্রোসিসের শতাংশ উল্লেখযোগ্যভাবে কম দেখা গেছে, যা কালচারের ১২ তম দিনে নিয়ন্ত্রণ অবস্থার তুলনায় (চিত্র ৩c)। যদিও CTCM ১২ তম দিনে হৃদপিণ্ডের টিস্যু অংশগুলির কার্যকারিতা তাজা হৃদপিণ্ডের টিস্যুর সমান স্তরে বৃদ্ধি করেছে, এটি হৃদপিণ্ডের অংশগুলির কাঠামোগত অখণ্ডতা উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করতে পারেনি।
একটি বার গ্রাফ স্ট্যাটিক কালচার (D12 Ctrl) অথবা CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) স্লাইস/গ্রুপে বিভিন্ন শূকর থেকে 12 দিনের জন্য তাজা হার্ট স্লাইস (D0) বা হার্ট স্লাইস কালচারের MTT কার্যকারিতার পরিমাণ নির্ধারণ করে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং **p < 0.01 D12 Ctrl এর তুলনায়)। একটি বার গ্রাফ স্ট্যাটিক কালচার (D12 Ctrl) অথবা CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) স্লাইস/গ্রুপে বিভিন্ন শূকর থেকে 12 দিনের জন্য তাজা হার্ট স্লাইস (D0) বা হার্ট স্লাইস কালচারের MTT কার্যকারিতার পরিমাণ নির্ধারণ করে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং **p < 0.01 D12 Ctrl এর তুলনায়)।হিস্টোগ্রামটি বিভিন্ন শূকর থেকে স্ট্যাটিক কালচার (D12 নিয়ন্ত্রণ) অথবা CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 নিয়ন্ত্রণ)), 12 (D12 MC) বিভাগ/গ্রুপে 12 দিনের জন্য MTT তাজা হার্ট সেকশন (D0) বা হার্ট সেকশনের কালচারের কার্যকারিতার পরিমাণ দেখায়, একটি একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়;####p < 0,0001 по сравнению с D0 এবং **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। ####p < 0.0001 এর তুলনায় D0 এবং **p < 0.01 এর তুলনায় D12 Ctrl)। একটি 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单单 曯曯ANOVA相比，####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p <0.01)। একটি 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，###p < 0.0001，Ctrl.12)হিস্টোগ্রামটি বিভিন্ন শূকর থেকে 12 দিনের জন্য স্ট্যাটিক কালচার (D12 নিয়ন্ত্রণ) বা CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 নিয়ন্ত্রণ)), 12 (D12 MC) বিভাগ/গ্রুপে MTT কার্যকারিতার পরিমাণ নির্ধারণ করে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। ####p < 0.0001 এর তুলনায় D0, **p < 0.01 এর তুলনায় D12 Ctrl)।b ট্রপোনিন-টি (সবুজ), কানেক্সিন ৪৩ (লাল) এবং DAPI (নীল) নতুনভাবে বিচ্ছিন্ন হৃদপিণ্ডের অংশে (D0) অথবা স্থির অবস্থায় (Ctrl) অথবা CTCM অবস্থায় (MC) ১২ দিনের জন্য সংস্কৃত হৃদপিণ্ডের অংশে প্রতিনিধিত্বমূলক ইমিউনোফ্লোরেসেন্স চিত্রের (ফাঁকা স্কেল = ১০০ µm)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তার মাধ্যমে হৃদপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাণ নির্ধারণ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) বিভিন্ন শূকর থেকে প্রতিটি স্লাইস/গ্রুপের জন্য, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p < 0.0001 তুলনা করা হয়েছে D0 এবং ****p < 0.0001 তুলনা করা হয়েছে D12 Ctrl)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তার মাধ্যমে হৃদপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাণ নির্ধারণ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) বিভিন্ন শূকর থেকে প্রতিটি স্লাইস/গ্রুপের জন্য, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p < 0.0001 তুলনা করা হয়েছে D0 এবং ****p < 0.0001 তুলনা করা হয়েছে D12 Ctrl)। Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5/12/MC разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 এবং ****p < 0,0001 по сравнению)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তার মাধ্যমে হৃদযন্ত্রের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাপ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) বিভিন্ন শূকরের অংশ/গোষ্ঠী, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < 0.0001 বনাম D0 এবং ****p < 0.0001 এর সাথে তুলনা করা হয়েছে D12 Ctrl এর সাথে)।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) বিভিন্ন শূকরের প্রতিটি স্লাইস/গ্রুপ, ওয়ান-ওয়ে ANOVA পরীক্ষা।相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) বিভিন্ন শূকরের প্রতিটি স্লাইস/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা। ##0p.与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D05), каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 বনাম. হৃদযন্ত্রের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতা পরিমাপের জন্য কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) বিভিন্ন শূকরের প্রতিটি অংশ/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা; ####p<0.0001 বনাম .D0 তুলনার জন্য ****p < 0.0001 D12 Ctrl এর তুলনায়)। c ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ দিয়ে দাগযুক্ত হার্টের টুকরোগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং পরিমাণ নির্ধারণ (ডানে) (স্কেল বেয়ার = 500 µm) (n = বিভিন্ন শূকর থেকে 10টি টুকরো/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং ***p < 0.001 D12 এর তুলনায়)। c ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ দিয়ে দাগযুক্ত হার্টের টুকরোগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং পরিমাণ নির্ধারণ (ডানে) (স্কেল বেয়ার = 500 µm) (n = বিভিন্ন শূকর থেকে 10টি টুকরো/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; #### p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং ***p < 0.001 D12 এর তুলনায়)। গ Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибаслева покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,000p *** D 0,0001 0,001 po сравнению с D12 Ctrl)। c ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ দিয়ে দাগযুক্ত হৃদপিণ্ডের অংশগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং পরিমাণ নির্ধারণ (ডানে) (আবরণবিহীন স্কেল = 500 µm) (n = বিভিন্ন শূকর থেকে 10টি অংশ/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; #### p < 0 .0001 D0 এর তুলনায় এবং ***p < 0.001 D12 Ctrl এর তুলনায়)। c 用ম্যাসন 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度=0m0µm0个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p0r1 <0.0.相比)। সি 用 ম্যাসন 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度度度度带裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单勐 单勐 单勐 单勐আনোভা 0.0001 与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）। c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного однофакторного дисперсионного <##### 0,0001 po сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। c ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ (ফাঁকা = 500 µm) দিয়ে দাগযুক্ত হৃদপিণ্ডের অংশগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং পরিমাণ (ডানে) (n = 10টি অংশ/গ্রুপ, প্রতিটি একটি ভিন্ন শূকর থেকে, বৈচিত্র্যের একমুখী বিশ্লেষণ দ্বারা পরীক্ষিত ;### # p < 0.0001 D0 এর তুলনায়, ***p < 0.001 D12 এর তুলনায় Ctrl)।ত্রুটি বারগুলি গড় ± মানক বিচ্যুতি উপস্থাপন করে।
আমরা অনুমান করেছিলাম যে কালচার মিডিয়ামে ছোট অণু যোগ করলে কার্ডিওমায়োসাইট অখণ্ডতা উন্নত হতে পারে এবং CTCM কালচারের সময় ফাইব্রোসিসের বিকাশ হ্রাস পেতে পারে। তাই আমরা আমাদের স্ট্যাটিক কন্ট্রোল কালচার ব্যবহার করে ছোট অণুগুলির জন্য স্ক্রিনিং করেছি20,21 কারণ এতে বিভ্রান্তিকর কারণগুলির সংখ্যা কম ছিল। এই স্ক্রিনের জন্য ডেক্সামেথাসোন (ডেক্স), ট্রাইওডোথাইরোনিন (T3), এবং SB431542 (SB) বেছে নেওয়া হয়েছিল। এই ছোট অণুগুলি পূর্বে hiPSC-CM কালচারে সারকোমেরের দৈর্ঘ্য, টি-টিউবুল এবং পরিবাহিতা বেগ বৃদ্ধি করে কার্ডিওমায়োসাইটগুলির পরিপক্কতা প্ররোচিত করতে ব্যবহৃত হয়েছে। এছাড়াও, ডেক্স (একটি গ্লুকোকোর্টিকয়েড) এবং SB উভয়ই প্রদাহ দমন করতে পরিচিত29,30। অতএব, আমরা পরীক্ষা করেছি যে এই ছোট অণুগুলির একটি বা সংমিশ্রণ অন্তর্ভুক্ত করলে হৃদপিণ্ডের অংশগুলির কাঠামোগত অখণ্ডতা উন্নত হবে কিনা। প্রাথমিক স্ক্রিনিংয়ের জন্য, প্রতিটি যৌগের ডোজ কোষ সংস্কৃতি মডেলগুলিতে সাধারণত ব্যবহৃত ঘনত্বের উপর ভিত্তি করে নির্বাচন করা হয়েছিল (1 μM Dex27, 100 nM T327, এবং 2.5 μM SB31)। ১২ দিন কালচারের পর, T3 এবং Dex এর সংমিশ্রণের ফলে সর্বোত্তম কার্ডিওমায়োসাইট কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং ন্যূনতম তন্তুযুক্ত পুনর্নির্মাণ ঘটে (পরিপূরক চিত্র 4 এবং 5)। এছাড়াও, T3 এবং Dex এর এই ঘনত্বের দ্বিগুণ বা দ্বিগুণ ব্যবহার স্বাভাবিক ঘনত্বের তুলনায় ক্ষতিকারক প্রভাব তৈরি করে (পরিপূরক চিত্র 6a, b)।
প্রাথমিক স্ক্রিনিংয়ের পর, আমরা ৪টি কালচার অবস্থার একটি মুখোমুখি তুলনা করেছি (চিত্র ৪ক): Ctrl: আমাদের পূর্বে বর্ণিত স্ট্যাটিক কালচারে আমাদের অপ্টিমাইজড মাধ্যম ব্যবহার করে হৃদপিণ্ডের অংশগুলিকে কালচার করা হয়েছে; বুধবার ২০.২১ TD: T3 এবং Ctrl যোগ করা হয়েছে Dex; MC: আমাদের পূর্বে অপ্টিমাইজড মাধ্যম ব্যবহার করে CTCM-এ হার্টের অংশগুলিকে কালচার করা হয়েছে; এবং MT: T3 এবং Dex মাধ্যমে যোগ করা হয়েছে CTCM। ১২ দিন চাষের পর, MS এবং MT টিস্যুর কার্যকারিতা MTT অ্যাসে (চিত্র ৪খ) দ্বারা মূল্যায়ন করা তাজা টিস্যুর মতোই রয়ে গেছে। মজার বিষয় হল, ট্রান্সওয়েল কালচারে (TD) T3 এবং Dex যোগ করার ফলে Ctrl অবস্থার তুলনায় কার্যক্ষমতার উল্লেখযোগ্য উন্নতি হয়নি, যা হৃদপিণ্ডের অংশগুলির কার্যক্ষমতা বজায় রাখার ক্ষেত্রে যান্ত্রিক উদ্দীপনার গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা নির্দেশ করে।
একটি পরীক্ষামূলক নকশা চিত্র যা ১২ দিনের জন্য মাধ্যমের উপর যান্ত্রিক উদ্দীপনা এবং T3/Dex পরিপূরকের প্রভাব মূল্যায়নের জন্য ব্যবহৃত চারটি সংস্কৃতির অবস্থার চিত্র তুলে ধরে। b বার গ্রাফটি ৪টি কালচার অবস্থায় (Ctrl, TD, MC, এবং MT) ১২ দিন পর কালচারের কার্যকারিতার পরিমাণ নির্ধারণ করে, তাজা হার্ট স্লাইস (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), ১২ (D12 MC) স্লাইস/গ্রুপের সাথে বিভিন্ন শূকরের তুলনা করে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 এর সাথে তুলনা করে এবং **p < 0.01 D12 Ctrl এর সাথে তুলনা করে)। b বার গ্রাফটি ৪টি কালচার অবস্থায় (Ctrl, TD, MC, এবং MT) ১২ দিন পর কালচারের কার্যকারিতার পরিমাণ নির্ধারণ করে, তাজা হার্ট স্লাইস (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), ১২ (D12 MC) স্লাইস/গ্রুপের সাথে বিভিন্ন শূকর থেকে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 এর সাথে তুলনা করা হয় এবং **p < 0.01 D12 ctrl এর সাথে তুলনা করা হয়)। b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 усеховирования (CONTROL, TD, MC এবং MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), 12 (12/MC) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 এবং **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। b বার গ্রাফটি ৪টি কালচার অবস্থায় (নিয়ন্ত্রণ, TD, MC, এবং MT) ১২ দিন পর কালচারের কার্যকারিতার পরিমাণ দেখায়, তাজা হৃদপিণ্ডের অংশ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, এবং D12 MT), ১২ (D12 MC) অংশ/গ্রুপের সাথে বিভিন্ন শূকরের, একমুখী ANOVA পরীক্ষা; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 বনাম D0 এবং **p < 0.01 D12 Ctrl এর সাথে তুলনা করে)। b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D1r1D0) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0p <0.0** 0.01 与D12控制)।খ ৪ ১২ (ডি১২ এমসি) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (কোনট্রোল, টিডি, এমসি এবং এমটি) 15 (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, D0, **p <0,01 по сравнению (কন্ট্রোলেম D12 সহ)। b হিস্টোগ্রামে বিভিন্ন শূকর ১২ (D12 MC) বিভাগ/গ্রুপ থেকে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা; ####p<0.0001, ###p<0.001 বনাম D0, **p<0.01 বনাম নিয়ন্ত্রণ D12) থেকে তাজা হৃদপিণ্ডের অংশ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT) এর তুলনা করে ৪টি কালচার অবস্থা (নিয়ন্ত্রণ, TD, MC এবং MT) দেখানো হয়েছে। c বার গ্রাফটি ৪টি কালচার অবস্থায় (Ctrl, TD, MC, এবং MT) ১২ দিন পর গ্লুকোজ ফ্লাক্সের পরিমাণ নির্ধারণ করে, তাজা হার্ট স্লাইস (D0) এর সাথে তুলনা করে (n = ৬টি স্লাইস/গ্রুপ বিভিন্ন শূকর থেকে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ###p < 0.001, D0 এর সাথে তুলনা করে এবং ***p < 0.001 D12 Ctrl এর সাথে তুলনা করে)। c বার গ্রাফটি ৪টি কালচার অবস্থায় (Ctrl, TD, MC, এবং MT) ১২ দিন পর গ্লুকোজ ফ্লাক্সের পরিমাণ নির্ধারণ করে, তাজা হার্ট স্লাইস (D0) এর সাথে তুলনা করে (n = ৬টি স্লাইস/গ্রুপ বিভিন্ন শূকর থেকে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ###p < 0.001, D0 এর সাথে তুলনা করে এবং ***p < 0.001 D12 Ctrl এর সাথে তুলনা করে)। c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усех усех 4 усеховирования (CONTROL, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одноялость свиней, одноясть свиней ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 এবং ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। c হিস্টোগ্রামে ৪টি কালচার অবস্থার (নিয়ন্ত্রণ, TD, MC এবং MT) অধীনে ১২ দিনের গ্লুকোজ ফ্লাক্সের পরিমাণ নির্ধারণ দেখানো হয়েছে, তাজা হৃদপিণ্ডের অংশের (D0) তুলনায় (n = ৬টি বিভাগ/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; ###p < 0.001 D0 এর তুলনায় এবং ***p < 0.001 D12 Ctrl এর তুলনায়)। c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比养切片(D0)天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.001，.0p <0.*0p <0.0**与D12 Ctrl 相比）। সি 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片戇片培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， A NOVA测试；###p <0.001，与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）। গ Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всеховивирования для всеховивирования (CONTROL, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, одроных свиней, одновых свиней тесты ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (CONTROL)। c হিস্টোগ্রামে ১২ দিনের পোস্ট-কালচারে গ্লুকোজ ফ্লাক্সের পরিমাণ নির্ধারণ দেখানো হয়েছে, যা ৪টি কালচার অবস্থার (নিয়ন্ত্রণ, টিডি, এমসি, এবং এমটি) জন্য তাজা হৃদপিণ্ডের অংশের (D0) তুলনা করে (n = 6টি অংশ/গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে, একতরফাভাবে ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছিল, ###p < 0.001 এর তুলনায় D0, ***p < 0.001 এর তুলনায় D12 (নিয়ন্ত্রণ)।d দশটি আঞ্চলিক টিস্যু বিভাগের বিন্দুতে তাজা (নীল), দিন ১২ MC (সবুজ), এবং দিন ১২ MT (লাল) টিস্যুর স্ট্রেন বিশ্লেষণ প্লট (n = ৪টি স্লাইস/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা; গ্রুপগুলির মধ্যে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না)। e ভলকানো প্লট স্ট্যাটিক অবস্থায় (Ctrl) বা MT অবস্থায় (MT) 10-12 দিনের জন্য কালচার করা হৃদপিণ্ডের অংশের তুলনায় তাজা হৃদপিণ্ডের অংশে (D0) পৃথকভাবে প্রকাশিত জিন দেখায়। f প্রতিটি কালচার অবস্থায় কালচার করা হৃদপিণ্ডের অংশের জন্য সারকোমের জিনের হিটম্যাপ। ত্রুটি বারগুলি গড় ± স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি উপস্থাপন করে।
ফ্যাটি অ্যাসিড জারণ থেকে গ্লাইকোলাইসিসে পরিবর্তনের উপর বিপাকীয় নির্ভরতা কার্ডিওমায়োসাইট ডিডিফেরেনশিয়াশনের একটি বৈশিষ্ট্য। অপরিণত কার্ডিওমায়োসাইটগুলি মূলত ATP উৎপাদনের জন্য গ্লুকোজ ব্যবহার করে এবং তাদের হাইপোপ্লাস্টিক মাইটোকন্ড্রিয়া থাকে যার ক্রিস্টা 5,32 থাকে। গ্লুকোজ ব্যবহার বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে MC এবং MT অবস্থার অধীনে, গ্লুকোজ ব্যবহার দিন 0 টিস্যুর মতোই ছিল (চিত্র 4c)। তবে, Ctrl নমুনাগুলি তাজা টিস্যুর তুলনায় গ্লুকোজ ব্যবহারে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি দেখিয়েছে। এটি ইঙ্গিত দেয় যে CTCM এবং T3/Dex এর সংমিশ্রণ টিস্যুর কার্যকারিতা বৃদ্ধি করে এবং 12-দিনের কালচারড হার্ট সেকশনের বিপাকীয় ফেনোটাইপ সংরক্ষণ করে। এছাড়াও, স্ট্রেন বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে MT এবং MS অবস্থার অধীনে 12 দিন ধরে স্ট্রেনের মাত্রা তাজা হার্ট টিস্যুর মতোই ছিল (চিত্র 4d)।
কার্ডিয়াক স্লাইস টিস্যুর বিশ্বব্যাপী ট্রান্সক্রিপশনাল ল্যান্ডস্কেপের উপর CTCM এবং T3/Dex এর সামগ্রিক প্রভাব বিশ্লেষণ করার জন্য, আমরা চারটি ভিন্ন কালচার অবস্থার কার্ডিয়াক স্লাইসের উপর RNAseq পরীক্ষা করেছি (পরিপূরক তথ্য 1)। মজার বিষয় হল, MT বিভাগগুলি তাজা হার্ট টিস্যুর সাথে উচ্চ ট্রান্সক্রিপশনাল মিল দেখিয়েছে, 13,642 জিনের মধ্যে মাত্র 16 টি আলাদাভাবে প্রকাশ করা হয়েছে। যাইহোক, যেমনটি আমরা আগে দেখিয়েছি, Ctrl স্লাইসগুলি 10-12 দিন কালচারের পরে 1229 আলাদাভাবে প্রকাশ করা জিন প্রদর্শন করেছে (চিত্র 4e)। এই তথ্যগুলি হার্ট এবং ফাইব্রোব্লাস্ট জিনের qRT-PCR দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছে (পরিপূরক চিত্র 7a-c)। মজার বিষয় হল, Ctrl বিভাগগুলি কার্ডিয়াক এবং কোষ চক্র জিনের নিম্ননিয়ন্ত্রণ এবং প্রদাহজনক জিন প্রোগ্রামগুলির সক্রিয়করণ দেখিয়েছে। এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে দীর্ঘমেয়াদী কালচারিংয়ের পরে সাধারণত ঘটে যাওয়া ডিডিফেরেন্টিয়েশন, MT অবস্থার অধীনে সম্পূর্ণরূপে হ্রাস পায় (পরিপূরক চিত্র 8a,b)। সারকোমের জিনের যত্ন সহকারে অধ্যয়ন থেকে দেখা গেছে যে শুধুমাত্র MT অবস্থার অধীনে সারকোমের (চিত্র 4f) এবং আয়ন চ্যানেল (পরিপূরক চিত্র 9) এনকোডিং জিনগুলি সংরক্ষিত থাকে, যা Ctrl, TD এবং MC অবস্থার অধীনে তাদের দমন থেকে রক্ষা করে। এই তথ্যগুলি দেখায় যে যান্ত্রিক এবং হিউমোরাল উদ্দীপনা (T3/Dex) এর সংমিশ্রণের সাথে, হার্ট স্লাইস ট্রান্সক্রিপ্টোম 12 দিন কালচারে থাকার পরে তাজা হার্ট স্লাইসের মতো থাকতে পারে।
এই ট্রান্সক্রিপশনাল ফলাফলগুলি এই সত্য দ্বারা সমর্থিত যে হৃদপিণ্ডের অংশগুলিতে কার্ডিওমায়োসাইটের কাঠামোগত অখণ্ডতা MT অবস্থায় 12 দিনের জন্য সর্বোত্তমভাবে সংরক্ষণ করা হয়, যেমনটি অক্ষত এবং স্থানীয় কনেক্সিন 43 (চিত্র 5a) দ্বারা দেখানো হয়েছে। এছাড়াও, MT অবস্থায় হৃদপিণ্ডের অংশগুলিতে ফাইব্রোসিস Ctrl এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে এবং তাজা হৃদপিণ্ডের অংশগুলির মতো (চিত্র 5b)। এই তথ্যগুলি দেখায় যে যান্ত্রিক উদ্দীপনা এবং T3/Dex চিকিত্সার সংমিশ্রণ কার্যকরভাবে সংস্কৃতিতে হৃদপিণ্ডের অংশগুলিতে হৃদপিণ্ডের গঠন সংরক্ষণ করে।
একটি ট্রোপোনিন-টি (সবুজ), কনেক্সিন 43 (লাল), এবং DAPI (নীল) এর প্রতিনিধিত্বমূলক ইমিউনোফ্লোরেসেন্স চিত্র যা নতুনভাবে বিচ্ছিন্ন হৃদপিণ্ডের অংশে (D0) অথবা চারটি হৃদপিণ্ডের অংশের কালচার অবস্থায় 12 দিনের জন্য কালচার করা হয়েছে (স্কেল বার = 100 µm)। বিভিন্ন শূকর থেকে হৃদপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার (n = 7 (D0 এবং D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) টুকরো/গ্রুপের কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তার পরিমাপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং *p < 0.05, অথবা ****p < 0.0001 D12 Ctrl এর তুলনায়)। বিভিন্ন শূকর থেকে হৃদপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার (n = 7 (D0 এবং D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) টুকরো/গ্রুপের কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তার পরিমাপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; #### p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং *p < 0.05, অথবা ****p < 0.0001 D12 Ctrl এর তুলনায়)। Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 এবং D12 Ctrl12, DMCTD22, DMCTD22), MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p <05,***05, сравнению с D12 Ctrl)। বিভিন্ন শূকর থেকে কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা (n = 7 (D0 এবং D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) বিভাগ/গ্রুপ ব্যবহার করে হৃদপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; #### p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং *p < 0.05 বা ****p < 0.0001 D12 Ctrl এর তুলনায়)।对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p <0.0001 与D0 和*p <0.0.** 0.0001 与D12 Ctrl 相比）।对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0001 与D0 和*p <0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）।একমুখী ANOVA পরীক্ষার মাধ্যমে বিভিন্ন শূকরের (n = 7 (D0 এবং D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) বিভাগ/গ্রুপ) কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা ব্যবহার করে কার্ডিয়াক টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাণ নির্ধারণ;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 এবং *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। #### p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং *p < 0.05 অথবা ****p < 0.0001 D12 এর তুলনায় Ctrl)। b ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ (স্কেল বার = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, এবং D12 MC), বিভিন্ন শূকর থেকে 9 (D12 MT) টুকরো/গ্রুপের জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাণ নির্ধারণ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং ***p < 0.001, অথবা ****p < 0.0001 D12 Ctrl এর তুলনায়)। b ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ (স্কেল বার = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, এবং D12 MC), বিভিন্ন শূকর থেকে 9 (D12 MT) টুকরো/গ্রুপের জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাণ নির্ধারণ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং ***p < 0.001, অথবা ****p < 0.0001 D12 Ctrl এর তুলনায়)। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (= мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонных, выполняется односторон; по сравнению с D0 এবং ***p < 0,001 বা ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। b ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ (স্কেল বার = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MC), 9 (D12 MT) বিভাগ/গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে, একমুখী ANOVA সম্পাদিত; ####p < 0.0001 বনাম D0 এবং ***p < 0.001 বা ****p < 0.0001 বনাম D12 Ctrl) দ্বারা দাগযুক্ত হৃদপিণ্ডের অংশগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাণ নির্ধারণ। b 用ম্যাসন 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺=500 µm）（n = 10D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分曠00#0p相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）। b 用 ম্যাসন 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 0 d0m） d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片切片切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.0001D* 0.001,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная =0макейнка =50менка) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p < 0,0001,0001 0,001 বা ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। b ম্যাসনের ট্রাইক্রোম (স্কেল বার = 500 µm) দিয়ে দাগযুক্ত হৃদপিণ্ডের অংশগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাণ নির্ধারণ (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MC), বিভিন্ন শূকর/গোষ্ঠী থেকে 9 (D12 MT) অংশ, একটি ANOVA পদ্ধতি; ####p < 0.0001 D0 এর তুলনায়, ***p < 0.001 বা ****p < 0.0001 D12 Ctrl এর তুলনায়)।ত্রুটি বারগুলি গড় ± মানক বিচ্যুতি উপস্থাপন করে।
অবশেষে, কার্ডিয়াক টিস্যু স্ট্রেচ বৃদ্ধি করে CTCM-এর কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি অনুকরণ করার ক্ষমতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। CTCM-তে, পিক এয়ার চেম্বারের চাপ 80 mmHg থেকে 80 mmHg পর্যন্ত বৃদ্ধি পেয়েছে। Art. (স্বাভাবিক স্ট্রেচ) থেকে 140 mmHg পর্যন্ত Art. (চিত্র 6a)। এটি স্ট্রেচের 32% বৃদ্ধির সাথে মিলে যায় (চিত্র 6b), যা পূর্বে হাইপারট্রফিতে দেখা যায় এমন সারকোমের দৈর্ঘ্য অর্জনের জন্য হৃদপিণ্ডের অংশগুলির জন্য প্রয়োজনীয় সংশ্লিষ্ট শতাংশ স্ট্রেচ হিসাবে দেখানো হয়েছিল। সংকোচন এবং শিথিলকরণের সময় কার্ডিয়াক টিস্যুর স্ট্রেচ এবং বেগ ছয় দিনের কালচারের সময় স্থির ছিল (চিত্র 6c)। MT অবস্থার কার্ডিয়াক টিস্যু ছয় দিনের জন্য স্বাভাবিক স্ট্রেচ (MT (সাধারণ)) বা অতিরিক্ত স্ট্রেচ অবস্থা (MT (OS)) এর শিকার হয়েছিল। ইতিমধ্যে চার দিন কালচার করার পরে, হাইপারট্রফিক বায়োমার্কার NT-ProBNP MT (স্বাভাবিক) অবস্থার (চিত্র 7a) তুলনায় MT (OS) অবস্থার অধীনে মাঝারিভাবে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল। এছাড়াও, ছয় দিন কালচারিংয়ের পর, MT (OS) (চিত্র 7b) তে কোষের আকার MT হৃদপিণ্ডের অংশগুলির (স্বাভাবিক) তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। এছাড়াও, অতিরিক্ত প্রসারিত টিস্যুতে NFATC4 নিউক্লিয়ার ট্রান্সলোকেশন উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 7c)। এই ফলাফলগুলি হাইপারডিসটেনশনের পরে প্যাথলজিকাল রিমডেলিং এর প্রগতিশীল বিকাশ দেখায় এবং এই ধারণাকে সমর্থন করে যে CTCM ডিভাইসটি স্ট্রেচ-প্ররোচিত কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি সিগন্যালিং অধ্যয়নের জন্য একটি প্ল্যাটফর্ম হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে।
বায়ু চেম্বারের চাপ, তরল চেম্বারের চাপ এবং টিস্যু চলাচলের পরিমাপের প্রতিনিধিত্বমূলক চিহ্ন নিশ্চিত করে যে চেম্বারের চাপ তরল চেম্বারের চাপকে পরিবর্তন করে, যার ফলে টিস্যু স্লাইসের অনুরূপ নড়াচড়া হয়। b সাধারণত প্রসারিত (কমলা) এবং অতিরিক্ত প্রসারিত (নীল) টিস্যু বিভাগের জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক প্রসারিত শতাংশ এবং প্রসারিত হারের বক্ররেখা। c বার গ্রাফ চক্র সময় (n = প্রতি গ্রুপে 19 স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), সংকোচনের সময় (n = প্রতি গ্রুপে 18-19 স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), শিথিলকরণ সময় (n = প্রতি গ্রুপে 19 স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), টিস্যু চলাচলের প্রশস্ততা (n = 14 স্লাইস/গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে), সর্বোচ্চ সিস্টোলিক বেগ (n = 14 স্লাইস/গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে) এবং সর্বোচ্চ শিথিলকরণ হার (n = 14 (D0), 15 (D6) ) বিভিন্ন শূকর থেকে), দুই-লেজযুক্ত শিক্ষার্থীর টি-পরীক্ষা কোনও প্যারামিটারে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখায়নি, যা নির্দেশ করে যে ওভারভোল্টেজ সহ 6 দিনের কালচারের সময় এই পরামিতিগুলি স্থির ছিল। ত্রুটি বারগুলি গড় ± মান বিচ্যুতি উপস্থাপন করে।
বিভিন্ন শূকর থেকে MT নরমাল স্ট্রেচ (নর্ম) বা ওভারস্ট্রেচিং (OS) অবস্থার (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, এবং D4 MTOS) স্লাইস/গ্রুপের অধীনে কালচার করা হার্ট স্লাইস থেকে কালচার মিডিয়াতে NT-ProBNP ঘনত্বের একটি বার গ্রাফ পরিমাপ, দ্বিমুখী ANOVA সঞ্চালিত হয়; **p < 0.01 স্বাভাবিক স্ট্রেচের তুলনায়)। বিভিন্ন শূকর থেকে MT নরমাল স্ট্রেচ (নর্ম) বা ওভারস্ট্রেচিং (OS) অবস্থার (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, এবং D4 MTOS) স্লাইস/গ্রুপের অধীনে কালচার করা হার্ট স্লাইস থেকে কালচার মিডিয়াতে NT-ProBNP ঘনত্বের একটি বার গ্রাফ পরিমাপ, দ্বিমুখী ANOVA সঞ্চালিত হয়; **p < 0.01 স্বাভাবিক স্ট্রেচের তুলনায়)।স্বাভাবিক MT স্ট্রেচ (নরম) বা ওভারস্ট্রেচ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, এবং D4).MTOS) স্লাইস/গ্রুপ বিভিন্ন শূকর থেকে কালচার করা হার্ট স্লাইস থেকে কালচার মাধ্যমে NT-ProBNP ঘনত্বের পরিমাণগত হিস্টোগ্রাম, বৈচিত্র্যের দ্বি-ফ্যাক্টর বিশ্লেষণ করা হয়;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)। **p < 0.01 স্বাভাবিক প্রসারিতের তুলনায়)। একটি 在MT 正常拉伸(নর্ম) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度曢坡離4 (D2 MTNorm) 、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < ০.০১)। MT নরমাল স্ট্রেচ (নর্ম) বা ওভারস্ট্রেচ (OS) অবস্থার (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) এর অধীনে সংষ্কৃত হার্টের স্লাইসে NT-ProBNP ঘনত্বের পরিমাপ猪的切片/组，可以双向方方发发动;হিস্টোগ্রাম বিভিন্ন শূকর থেকে স্বাভাবিক MT স্ট্রেচ (নরম) বা ওভারস্ট্রেচ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) এবং D4 MTOS) স্লাইস/গ্রুপের অবস্থার অধীনে কালচার করা হৃদপিণ্ডের স্লাইসে NT-ProBNP ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ, বৈচিত্র্যের দ্বিমুখী বিশ্লেষণ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)। **p < 0.01 স্বাভাবিক প্রসারিতের তুলনায়)। b ট্রোপোনিন-টি এবং WGA (বামে) দিয়ে দাগযুক্ত হার্ট স্লাইস এবং কোষের আকার পরিমাপ (ডানে) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) কোষ/গ্রুপের জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্রগুলি বিভিন্ন শূকরের 10টি ভিন্ন স্লাইস থেকে, দুই-লেজযুক্ত ছাত্র টি-পরীক্ষা করা হয়; ****p < 0.0001 স্বাভাবিক প্রসারিতের তুলনায়)। b ট্রোপোনিন-টি এবং WGA (বামে) দিয়ে দাগযুক্ত হার্ট স্লাইস এবং কোষের আকার পরিমাপ (ডানে) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) কোষ/গ্রুপের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্রগুলি বিভিন্ন শূকরের 10টি ভিন্ন স্লাইস থেকে, দুই-লেজযুক্ত ছাত্র টি-পরীক্ষা করা হয়; ****p < 0.0001 স্বাভাবিক প্রসারিতের তুলনায়)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения (разовенного определения) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-*d*** 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением)। b ট্রোপোনিন-টি এবং AZP (বামে) দিয়ে দাগযুক্ত হৃদপিণ্ডের অংশগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং কোষের আকার পরিমাপ (ডানে) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) কোষ/গ্রুপ বিভিন্ন শূকরের 10টি ভিন্ন অংশ থেকে, দুই-লেজওয়ালা শিক্ষার্থীর টি-পরীক্ষা করা হয়েছিল; ****p < 0.0001 স্বাভাবিক স্ট্রেনের তুলনায়)। b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表性图n3） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）। b ক্যালকারিন-টি এবং WGA (বামে) এবং কোষের আকার (ডানে) দিয়ে দাগযুক্ত হার্ট স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (n = 330 (D6 MTOS), 10টি ভিন্ন স্লাইস থেকে 369 (D6 MTNorm)) কোষ/প্রমাণ, সাধারণ স্ট্রেচিংয়ের সাথে তুলনা করে, ****p < 0.0001)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размева (36) MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента, ***0p0p01; নোর্মালন (স্থায়ীকরণ)। b ট্রোপোনিন-টি এবং AZP (বামে) দিয়ে দাগযুক্ত হৃদপিণ্ডের অংশগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং কোষের আকারের পরিমাণ নির্ধারণ (ডানে) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) বিভিন্ন শূকরের 10টি ভিন্ন অংশ থেকে) কোষ/গোষ্ঠী, দুই-লেজযুক্ত মানদণ্ড শিক্ষার্থীর t; ****p < 0.0001 স্বাভাবিক স্ট্রেনের তুলনায়)। c দিন ০ এবং দিন ষষ্ঠের MTOS হার্ট স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র, ট্রোপোনিন-টি এবং NFATC4 এর জন্য ইমিউনোলেবেল করা হয়েছে এবং বিভিন্ন শূকর থেকে CM-এর নিউক্লিয়াসে NFATC4 এর স্থানান্তরের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছে (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) স্লাইস/গ্রুপ, দুই-লেজযুক্ত ছাত্র টি-পরীক্ষা করা হয়েছে; *p < 0.05)। c দিন ০ এবং দিন ষষ্ঠ MTOS হার্ট স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র, ট্রোপোনিন-টি এবং NFATC4 এর জন্য ইমিউনোলেবেল করা হয়েছে এবং বিভিন্ন শূকর থেকে CM-এর নিউক্লিয়াসে NFATC4 এর স্থানান্তরের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছে (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) স্লাইস/গ্রুপ, দুই-লেজযুক্ত ছাত্র টি-পরীক্ষা করা হয়েছে; *p < 0.05)। c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т এবং NFATC4, и конячена срезов сердца ট্র্যান্সলোকাসিআই NFATC4 এ ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняеветрийское свиней Стьюдента; *p <0,05)। c ০ এবং ৬ দিনের MTOS-এ হৃদপিণ্ডের অংশগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র, ট্রোপোনিন-টি এবং NFATC4-এর জন্য ইমিউনোলেবেলযুক্ত, এবং গুহা কোষের নিউক্লিয়াসে NFATC4 স্থানান্তরের পরিমাণ নির্ধারণ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) বিভিন্ন শূকর থেকে স্লাইস/গ্রুপ) দুই-লেজযুক্ত ছাত্রের টি-পরীক্ষা সম্পাদিত হয়েছে; *p < 0.05)। c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0) ,3 (D0)进行双尾学生t 检验；*p <0.05)। c বিভিন্ন NFATC4 易位至CM কোষের নিউক্লিয়াসের পরিমাণ 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 化 第0天和第6天MTOS হৃদপিণ্ডের টুকরো এবং NFATC4 ইমিউনোলেবেলিং 第0天和第6天MTOS হার্ট স্লাইস) এর প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র时间双尾学生et 电影；*p < ০.০৫)। c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и конличевкастев сердца TRANслокации NFATC4 via ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть;0pюдей c বিভিন্ন শূকরের (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) স্লাইস/গ্রুপ, দুই-লেজযুক্ত t-মানদণ্ড ছাত্রদের; *p < 0.05) থেকে CM-এর নিউক্লিয়াসে NFATC4 ট্রান্সলোকেশনের ট্রপোনিন-T এবং NFATC4 ইমিউনোলেবেলিং এবং পরিমাণ নির্ধারণের জন্য 0 এবং 6 দিনে MTOS হার্ট স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র।ত্রুটি বারগুলি গড় ± মানক বিচ্যুতি উপস্থাপন করে।
ট্রান্সলেশনাল কার্ডিওভাসকুলার গবেষণার জন্য এমন সেলুলার মডেল প্রয়োজন যা হৃদপিণ্ডের পরিবেশ সঠিকভাবে পুনরুৎপাদন করে। এই গবেষণায়, একটি CTCM ডিভাইস তৈরি এবং বৈশিষ্ট্যযুক্ত করা হয়েছে যা হৃদপিণ্ডের অতি-পাতলা অংশগুলিকে উদ্দীপিত করতে পারে। CTCM সিস্টেমে শারীরবৃত্তীয়ভাবে সিঙ্ক্রোনাইজড ইলেক্ট্রোমেকানিক্যাল স্টিমুলেশন এবং T3 এবং Dex তরল সমৃদ্ধকরণ অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। যখন শুয়োরের হৃদপিণ্ডের অংশগুলি এই কারণগুলির সংস্পর্শে আসে, তখন তাদের কার্যকারিতা, কাঠামোগত অখণ্ডতা, বিপাকীয় কার্যকলাপ এবং ট্রান্সক্রিপশনাল এক্সপ্রেশন 12 দিনের কালচারের পরে তাজা হৃদপিণ্ডের টিস্যুর মতোই থাকে। এছাড়াও, হৃদপিণ্ডের টিস্যুর অত্যধিক প্রসারিততা হাইপারএক্সটেনশনের কারণে হৃদপিণ্ডের হাইপারট্রফির কারণ হতে পারে। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি একটি স্বাভাবিক কার্ডিয়াক ফেনোটাইপ বজায় রাখার ক্ষেত্রে শারীরবৃত্তীয় সংস্কৃতির অবস্থার গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা সমর্থন করে এবং ড্রাগ স্ক্রিনিংয়ের জন্য একটি প্ল্যাটফর্ম প্রদান করে।
কার্ডিওমায়োসাইটগুলির কার্যকারিতা এবং বেঁচে থাকার জন্য একটি সর্বোত্তম পরিবেশ তৈরিতে অনেকগুলি কারণ অবদান রাখে। এই কারণগুলির মধ্যে সবচেয়ে স্পষ্ট হল (1) আন্তঃকোষীয় মিথস্ক্রিয়া, (2) ইলেক্ট্রোমেকানিক্যাল উদ্দীপনা, (3) হিউমোরাল ফ্যাক্টর এবং (4) বিপাকীয় স্তর। শারীরবৃত্তীয় কোষ-থেকে-কোষ মিথস্ক্রিয়ার জন্য একটি বহির্কোষীয় ম্যাট্রিক্স দ্বারা সমর্থিত একাধিক কোষ ধরণের জটিল ত্রিমাত্রিক নেটওয়ার্কের প্রয়োজন হয়। এই ধরনের জটিল কোষীয় মিথস্ক্রিয়া পৃথক কোষ ধরণের সহ-সংস্কৃতির মাধ্যমে ইন ভিট্রোতে পুনর্গঠন করা কঠিন, তবে হৃদপিণ্ডের অংশগুলির অর্গানোটাইপিক প্রকৃতি ব্যবহার করে সহজেই অর্জন করা যেতে পারে।
কার্ডিয়াক ফেনোটাইপ 33,34,35 বজায় রাখার জন্য কার্ডিওমায়োসাইটগুলির যান্ত্রিক প্রসারণ এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। যদিও hiPSC-CM কন্ডিশনিং এবং পরিপক্কতার জন্য যান্ত্রিক উদ্দীপনা ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়েছে, বেশ কয়েকটি মার্জিত গবেষণায় সম্প্রতি এক-অক্ষীয় লোডিং ব্যবহার করে কালচারে হৃদপিণ্ডের স্লাইসগুলির যান্ত্রিক উদ্দীপনার চেষ্টা করা হয়েছে। এই গবেষণাগুলি দেখায় যে 2D এক-অক্ষীয় যান্ত্রিক লোডিং কালচারের সময় হৃদপিণ্ডের ফেনোটাইপের উপর ইতিবাচক প্রভাব ফেলে। এই গবেষণায়, হৃদপিণ্ডের অংশগুলি হয় আইসোমেট্রিক টেনসাইল ফোর্স 17, লিনিয়ার অক্সোটোনিক লোডিং 18 দিয়ে লোড করা হয়েছিল, অথবা ফোর্স ট্রান্সডুসার ফিডব্যাক এবং টেনশন ড্রাইভ ব্যবহার করে কার্ডিয়াক চক্রটি পুনরায় তৈরি করা হয়েছিল। যাইহোক, এই পদ্ধতিগুলি পরিবেশগত অপ্টিমাইজেশন ছাড়াই এক-অক্ষীয় টিস্যু প্রসারণ ব্যবহার করে, যার ফলে অনেক কার্ডিয়াক জিন দমন করা হয় বা অস্বাভাবিক প্রসারিত প্রতিক্রিয়ার সাথে যুক্ত জিনের অতিরিক্ত প্রকাশ ঘটে। এখানে বর্ণিত CTCM একটি 3D ইলেক্ট্রোমেকানিক্যাল উদ্দীপনা প্রদান করে যা চক্র সময় এবং শারীরবৃত্তীয় প্রসারিতের ক্ষেত্রে প্রাকৃতিক কার্ডিয়াক চক্রের অনুকরণ করে (25% প্রসারিত, 40% সিস্টোল, 60% ডায়াস্টোল এবং 72 বিট প্রতি মিনিটে)। যদিও এই ত্রিমাত্রিক যান্ত্রিক উদ্দীপনা কেবল টিস্যুর অখণ্ডতা বজায় রাখার জন্য যথেষ্ট নয়, টিস্যুর কার্যকারিতা, কার্যকারিতা এবং অখণ্ডতা পর্যাপ্তভাবে বজায় রাখার জন্য T3/Dex ব্যবহার করে হিউমোরাল এবং যান্ত্রিক উদ্দীপনার সংমিশ্রণ প্রয়োজন।
প্রাপ্তবয়স্কদের হৃদপিণ্ডের ফিনোটাইপ নিয়ন্ত্রণে হিউমোরাল ফ্যাক্টর গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। HiPS-CM গবেষণায় এটি তুলে ধরা হয়েছে যেখানে কোষের পরিপক্কতা ত্বরান্বিত করার জন্য কালচার মিডিয়াতে T3 এবং Dex যোগ করা হয়েছিল। T3 কোষের ঝিল্লি জুড়ে অ্যামিনো অ্যাসিড, শর্করা এবং ক্যালসিয়ামের পরিবহনকে প্রভাবিত করতে পারে36। এছাড়াও, T3 MHC-α এক্সপ্রেশন এবং MHC-β ডাউনরেগুলেশনকে উৎসাহিত করে, ভ্রূণের CM-এ ধীর টুইচ মায়োফাইব্রিলের তুলনায় পরিপক্ক কার্ডিওমায়োসাইটে দ্রুত টুইচ মায়োফাইব্রিল গঠনকে উৎসাহিত করে। হাইপোথাইরয়েড রোগীদের মধ্যে T3 এর অভাবের ফলে মায়োফাইব্রিলার ব্যান্ডের ক্ষতি হয় এবং স্বর বিকাশের হার হ্রাস পায়37। ডেক্স গ্লুকোকোর্টিকয়েড রিসেপ্টরগুলির উপর কাজ করে এবং বিচ্ছিন্ন পারফিউজড হার্টে মায়োকার্ডিয়াল সংকোচনশীলতা বৃদ্ধি করতে দেখা গেছে; 38 এই উন্নতি ক্যালসিয়াম ডিপোজিট-চালিত এন্ট্রি (SOCE) 39,40 এর উপর প্রভাবের সাথে সম্পর্কিত বলে মনে করা হয়। এছাড়াও, ডেক্স তার রিসেপ্টরগুলির সাথে আবদ্ধ হয়, যার ফলে একটি বিস্তৃত আন্তঃকোষীয় প্রতিক্রিয়া তৈরি হয় যা রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা এবং প্রদাহকে দমন করে30।
আমাদের ফলাফল ইঙ্গিত দেয় যে শারীরিক যান্ত্রিক উদ্দীপনা (MS) Ctrl-এর তুলনায় সামগ্রিক কালচার কর্মক্ষমতা উন্নত করেছে, কিন্তু কালচারে 12 দিনের মধ্যে কার্যকারিতা, কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং কার্ডিয়াক এক্সপ্রেশন বজায় রাখতে ব্যর্থ হয়েছে। Ctrl-এর তুলনায়, CTCM (MT) কালচারে T3 এবং Dex যোগ করার ফলে কার্যকারিতা উন্নত হয়েছে এবং 12 দিনের জন্য তাজা হৃদপিণ্ডের টিস্যুর সাথে অনুরূপ ট্রান্সক্রিপশন প্রোফাইল, কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং বিপাকীয় কার্যকলাপ বজায় রাখা হয়েছে। এছাড়াও, টিস্যু প্রসারিত হওয়ার মাত্রা নিয়ন্ত্রণ করে, STCM ব্যবহার করে একটি হাইপারএক্সটেনশন-প্ররোচিত কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি মডেল তৈরি করা হয়েছিল, যা STCM সিস্টেমের বহুমুখীতা চিত্রিত করে। এটি উল্লেখ করা উচিত যে যদিও কার্ডিয়াক রিমডেলিং এবং ফাইব্রোসিস সাধারণত অক্ষত অঙ্গগুলিকে জড়িত করে যার সঞ্চালন কোষগুলি উপযুক্ত সাইটোকাইনের পাশাপাশি ফ্যাগোসাইটোসিস এবং অন্যান্য পুনর্নির্মাণ কারণ সরবরাহ করতে পারে, তবুও হৃদপিণ্ডের অংশগুলি চাপ এবং আঘাতের প্রতিক্রিয়ায় ফাইব্রোটিক প্রক্রিয়ার অনুকরণ করতে পারে। মায়োফাইব্রোব্লাস্টে। এটি পূর্বে এই কার্ডিয়াক স্লাইস মডেলে মূল্যায়ন করা হয়েছে। এটি উল্লেখ করা উচিত যে CTCM প্যারামিটারগুলি চাপ/বৈদ্যুতিক প্রশস্ততা এবং ফ্রিকোয়েন্সি পরিবর্তন করে ট্যাকিকার্ডিয়া, ব্র্যাডিকার্ডিয়া এবং যান্ত্রিক সংবহন সহায়তা (যান্ত্রিক আনলোডেড হার্ট) এর মতো অনেক অবস্থার অনুকরণ করে মডিউল করা যেতে পারে। এটি এই সিস্টেমটিকে ওষুধ পরীক্ষার জন্য একটি মাঝারি থ্রুপুট করে তোলে। অতিরিক্ত পরিশ্রম-প্ররোচিত কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি মডেল করার জন্য CTCM-এর ক্ষমতা ব্যক্তিগতকৃত থেরাপির জন্য এই সিস্টেমটি পরীক্ষা করার পথ প্রশস্ত করে। উপসংহারে, বর্তমান গবেষণাটি দেখায় যে কার্ডিয়াক টিস্যু বিভাগের সংস্কৃতি বজায় রাখার জন্য যান্ত্রিক প্রসারিত এবং হিউমোরাল উদ্দীপনা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ।
যদিও এখানে উপস্থাপিত তথ্য থেকে বোঝা যায় যে CTCM অক্ষত মায়োকার্ডিয়াম মডেলিংয়ের জন্য একটি অত্যন্ত আশাব্যঞ্জক প্ল্যাটফর্ম, এই কালচার পদ্ধতির কিছু সীমাবদ্ধতা রয়েছে। CTCM কালচারের প্রধান সীমাবদ্ধতা হল এটি স্লাইসের উপর ক্রমাগত গতিশীল যান্ত্রিক চাপ চাপিয়ে দেয়, যা প্রতিটি চক্রের সময় সক্রিয়ভাবে কার্ডিয়াক স্লাইস সংকোচন পর্যবেক্ষণ করার ক্ষমতাকে বাধাগ্রস্ত করে। উপরন্তু, কার্ডিয়াক সেকশনের ছোট আকার (7 মিমি) এর কারণে, ঐতিহ্যবাহী বল সেন্সর ব্যবহার করে কালচার সিস্টেমের বাইরে সিস্টোলিক ফাংশন মূল্যায়ন করার ক্ষমতা সীমিত। বর্তমান পাণ্ডুলিপিতে, আমরা সংকোচনশীল ফাংশনের সূচক হিসাবে অপটিক্যাল ভোল্টেজ মূল্যায়ন করে এই সীমাবদ্ধতা আংশিকভাবে অতিক্রম করেছি। যাইহোক, এই সীমাবদ্ধতার জন্য আরও কাজ করার প্রয়োজন হবে এবং ভবিষ্যতে কালচারে হার্ট স্লাইসের কার্যকারিতার অপটিক্যাল পর্যবেক্ষণের পদ্ধতি প্রবর্তন করে সমাধান করা যেতে পারে, যেমন ক্যালসিয়াম এবং ভোল্টেজ-সংবেদনশীল রঞ্জক ব্যবহার করে অপটিক্যাল ম্যাপিং। CTCM এর আরেকটি সীমাবদ্ধতা হল যে কার্যকরী মডেল শারীরবৃত্তীয় চাপ (প্রিলোড এবং আফটারলোড) ম্যানিপুলেট করে না। CTCM-এ, খুব বড় টিস্যুতে ডায়াস্টোল (পূর্ণ প্রসারিত) এবং সিস্টোল (বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার সময় সংকোচনের দৈর্ঘ্য) 25% শারীরবৃত্তীয় প্রসারিত পুনরুত্পাদন করার জন্য বিপরীত দিকে চাপ প্ররোচিত করা হয়েছিল। ভবিষ্যতের সিটিসিএম ডিজাইনে এই সীমাবদ্ধতা দূর করা উচিত, উভয় দিক থেকে কার্ডিয়াক টিস্যুর উপর পর্যাপ্ত চাপ প্রয়োগ করে এবং হৃদপিণ্ডের কক্ষগুলিতে ঘটে যাওয়া সঠিক চাপ-আয়তনের সম্পর্ক প্রয়োগ করে।
এই পাণ্ডুলিপিতে উল্লিখিত ওভারস্ট্রেচ-প্ররোচিত পুনর্নির্মাণটি হাইপারট্রফিক হাইপারস্ট্রেচ সংকেত অনুকরণের মধ্যেই সীমাবদ্ধ। সুতরাং, এই মডেলটি হিউমোরাল বা নিউরাল ফ্যাক্টরের (যা এই সিস্টেমে বিদ্যমান নেই) প্রয়োজন ছাড়াই স্ট্রেচ-প্ররোচিত হাইপারট্রফিক সিগন্যালিং অধ্যয়নে সহায়তা করতে পারে। সিটিসিএমের বহুগুণ বৃদ্ধির জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন, উদাহরণস্বরূপ, ইমিউন কোষের সাথে সহ-সংস্কৃতি, সঞ্চালনকারী প্লাজমা হিউমোরাল ফ্যাক্টর এবং নিউরোনাল কোষের সাথে সহ-সংস্কৃতির সময় উদ্ভাবন সিটিসিএমের সাথে রোগের মডেলিংয়ের সম্ভাবনা উন্নত করবে।
এই গবেষণায় তেরোটি শূকর ব্যবহার করা হয়েছিল। সমস্ত প্রাণী প্রক্রিয়া প্রাতিষ্ঠানিক নির্দেশিকা অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল এবং লুইসভিল বিশ্ববিদ্যালয়ের ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমেল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল। মহাধমনীর খিলানটি ক্ল্যাম্প করা হয়েছিল এবং হৃদপিণ্ডে 1 লিটার জীবাণুমুক্ত কার্ডিওপ্লেজিয়া (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL হেপারিন, pH 7.4 পর্যন্ত) দিয়ে পারফিউম করা হয়েছিল; হৃদপিণ্ডগুলিকে বরফ-ঠান্ডা কার্ডিওপ্লেজিক দ্রবণে সংরক্ষণ করা হয়েছিল যতক্ষণ না বরফের উপর ল্যাবে পাঠানো হয় যা সাধারণত <10 মিনিট। হৃদপিণ্ডগুলিকে বরফ-ঠান্ডা কার্ডিওপ্লেজিক দ্রবণে সংরক্ষণ করা হয়েছিল যতক্ষণ না বরফের উপর ল্যাবে পাঠানো হয় যা সাধারণত <10 মিনিট। сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. বরফের উপর পরীক্ষাগারে পরিবহনের আগে পর্যন্ত হৃদপিণ্ডগুলিকে বরফ-ঠান্ডা কার্ডিওপ্লেজিক দ্রবণে সংরক্ষণ করা হত, যা সাধারণত <10 মিনিট সময় নেয়।将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. বরফের উপর পরীক্ষাগারে পরিবহন না করা পর্যন্ত হৃদপিণ্ডকে বরফের কার্ডিওপ্লেজিয়ার উপর রাখুন, সাধারণত <10 মিনিট।
CTCM ডিভাইসটি সলিডওয়ার্কস কম্পিউটার-এডেড ডিজাইন (CAD) সফটওয়্যার ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছে। কালচার চেম্বার, ডিভাইডার এবং এয়ার চেম্বারগুলি CNC ক্লিয়ার অ্যাক্রিলিক প্লাস্টিক দিয়ে তৈরি। ৭ মিমি ব্যাসের ব্যাক-আপ রিংটি কেন্দ্রে উচ্চ ঘনত্বের পলিথিন (HDPE) দিয়ে তৈরি এবং এর নীচে মিডিয়া সিল করার জন্য ব্যবহৃত সিলিকন ও-রিংটি সামঞ্জস্য করার জন্য একটি ও-রিং খাঁজ রয়েছে। একটি পাতলা সিলিকা ঝিল্লি কালচার চেম্বারকে সেপারেশন প্লেট থেকে আলাদা করে। সিলিকন ঝিল্লিটি ০.০২" পুরু সিলিকন শীট থেকে লেজার কেটে তৈরি করা হয়েছে এবং এর কঠোরতা ৩৫A। নীচের এবং উপরের সিলিকন গ্যাসকেটগুলি ১/১৬" পুরু সিলিকন শীট থেকে লেজার কেটে তৈরি করা হয়েছে এবং এর কঠোরতা ৫০A। ব্লকটি বেঁধে রাখার জন্য এবং একটি বায়ুরোধী সীল তৈরি করার জন্য ৩১৬L স্টেইনলেস স্টিলের স্ক্রু এবং উইং নাট ব্যবহার করা হয়।
একটি ডেডিকেটেড প্রিন্টেড সার্কিট বোর্ড (PCB) C-PACE-EM সিস্টেমের সাথে একীভূত করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে। PCB-তে সুইস মেশিন সংযোগকারী সকেটগুলি রূপালী-ধাতুপট্টাবৃত তামার তার এবং ব্রোঞ্জের 0-60 স্ক্রু দ্বারা গ্রাফাইট ইলেকট্রোডের সাথে সংযুক্ত থাকে, যা ইলেকট্রোডগুলিতে স্ক্রু করা থাকে। প্রিন্টেড সার্কিট বোর্ডটি 3D প্রিন্টারের কভারে স্থাপন করা হয়।
CTCM ডিভাইসটি একটি প্রোগ্রামেবল নিউমেটিক অ্যাকচুয়েটর (PPD) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত যা কার্ডিয়াক চক্রের মতো নিয়ন্ত্রিত সংবহন চাপ তৈরি করে। বায়ু চেম্বারের ভিতরে চাপ বাড়ার সাথে সাথে, নমনীয় সিলিকন ঝিল্লি উপরের দিকে প্রসারিত হয়, যা টিস্যু সাইটের নীচে মাধ্যমকে জোর করে। তরলের এই বহিষ্কারের মাধ্যমে টিস্যুর ক্ষেত্রটি প্রসারিত হবে, যা ডায়াস্টোলের সময় হৃদপিণ্ডের শারীরবৃত্তীয় প্রসারণের অনুকরণ করবে। শিথিলকরণের শীর্ষে, গ্রাফাইট ইলেক্ট্রোডের মাধ্যমে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রয়োগ করা হয়েছিল, যা বায়ু চেম্বারের চাপ কমিয়ে দেয় এবং টিস্যু অংশগুলির সংকোচনের কারণ হয়। পাইপের ভিতরে একটি হেমোস্ট্যাটিক ভালভ রয়েছে যার মধ্যে একটি চাপ সেন্সর রয়েছে যা বায়ু সিস্টেমে চাপ সনাক্ত করতে পারে। চাপ সেন্সর দ্বারা অনুভূত চাপ ল্যাপটপের সাথে সংযুক্ত একটি ডেটা সংগ্রাহকের উপর প্রয়োগ করা হয়। এটি গ্যাস চেম্বারের ভিতরে চাপের ক্রমাগত পর্যবেক্ষণের অনুমতি দেয়। যখন সর্বাধিক চেম্বারের চাপ পৌঁছে যায় (মান 80 mmHg, 140 mmHg OS), ডেটা অধিগ্রহণ ডিভাইসটিকে C-PACE-EM সিস্টেমে একটি সংকেত পাঠানোর নির্দেশ দেওয়া হয়েছিল যাতে 2 ms এর জন্য একটি বাইফেসিক ভোল্টেজ সংকেত তৈরি করা যায়, 4 V তে সেট করা হয়।
হৃদপিণ্ডের অংশগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 6টি কূপের কালচার অবস্থা নিম্নরূপ করা হয়েছিল: ট্রান্সফার ভেসেল থেকে কাটা হৃদপিণ্ডগুলিকে ঠান্ডা (4° সেলসিয়াস) কার্ডিওপ্লেজিয়াযুক্ত ট্রেতে স্থানান্তর করুন। বাম ভেন্ট্রিকলটি একটি জীবাণুমুক্ত ব্লেড দিয়ে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং 1-2 cm3 টুকরো করে কাটা হয়েছিল। এই টিস্যু ব্লকগুলিকে টিস্যু আঠালো দিয়ে টিস্যু সাপোর্টের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল এবং টাইরোডের দ্রবণ ধারণকারী একটি কম্পনকারী মাইক্রোটোম টিস্যু বাথের মধ্যে স্থাপন করা হয়েছিল এবং ক্রমাগত অক্সিজেনযুক্ত করা হয়েছিল (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g)। ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-গ্লুকোজ (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M দ্রবণ), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M দ্রবণ), 1 L ddH2O পর্যন্ত। কম্পনকারী মাইক্রোটোমটি ৮০ হার্জ ফ্রিকোয়েন্সি, ২ মিমি অনুভূমিক কম্পন প্রশস্ততা এবং ০.০৩ মিমি/সেকেন্ড অগ্রিম হারে ৩০০ µm পুরু টুকরো কাটার জন্য সেট করা হয়েছিল। দ্রবণটি ঠান্ডা রাখার জন্য টিস্যু বাথটি বরফ দিয়ে ঘেরা ছিল এবং তাপমাত্রা ৪°C এ বজায় রাখা হয়েছিল। মাইক্রোটোম বাথ থেকে টিস্যু বিভাগগুলিকে একটি ইনকিউবেশন বাথের দিকে স্থানান্তর করুন যেখানে বরফের উপর ক্রমাগত অক্সিজেনযুক্ত টাইরোড দ্রবণ থাকে যতক্ষণ না একটি কালচার প্লেটের জন্য পর্যাপ্ত অংশ পাওয়া যায়। ট্রান্সওয়েল কালচারের জন্য, টিস্যু বিভাগগুলিকে জীবাণুমুক্ত ৬ মিমি প্রশস্ত পলিউরেথেন সাপোর্টের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল এবং ৬ মিলি অপ্টিমাইজড মিডিয়ামে (১৯৯ মিডিয়াম, ১x আইটিএস সাপ্লিমেন্ট, ১০% এফবিএস, ৫ এনজি/মিলি ভিইজিএফ, ১০ এনজি/মিলি এফজিএফ-ক্ষারীয় এবং ২X অ্যান্টিবায়োটিক-অ্যান্টিফাঙ্গাল) স্থাপন করা হয়েছিল। সি-পেসের মাধ্যমে টিস্যু বিভাগগুলিতে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা (১০ ভি, ফ্রিকোয়েন্সি ১.২ হার্জ) প্রয়োগ করা হয়েছিল। টিডি অবস্থার জন্য, প্রতিটি মাধ্যম পরিবর্তনের সময় 100 nM এবং 1 μM হারে তাজা T3 এবং Dex যোগ করা হয়েছিল। দিনে 3 বার প্রতিস্থাপনের আগে মাধ্যমটি অক্সিজেন দিয়ে পরিপূর্ণ করা হয়। টিস্যু অংশগুলিকে একটি ইনকিউবেটরে 37°C এবং 5% CO2 তাপমাত্রায় কালচার করা হয়েছিল।
CTCM কালচারের জন্য, টিস্যু সেকশনগুলি একটি কাস্টম-মেড 3D প্রিন্টারে একটি পেট্রি ডিশে স্থাপন করা হয়েছিল যেখানে পরিবর্তিত টাইরোডের দ্রবণ ছিল। ডিভাইসটি হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের আকার সাপোর্ট রিংয়ের ক্ষেত্রফলের 25% বৃদ্ধি করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে। এটি করা হয় যাতে টাইরোডের দ্রবণ থেকে মাধ্যমে স্থানান্তরিত হওয়ার পরে এবং ডায়াস্টোলের সময় হৃৎপিণ্ডের সেকশনগুলি প্রসারিত না হয়। হিস্টোঅ্যাক্রিলিক আঠা ব্যবহার করে, 300 µm পুরু সেকশনগুলি 7 মিমি ব্যাসের একটি সাপোর্ট রিংয়ের উপর স্থির করা হয়েছিল। সাপোর্ট রিংয়ের সাথে টিস্যু সেকশনগুলি সংযুক্ত করার পরে, অতিরিক্ত টিস্যু সেকশনগুলি কেটে ফেলুন এবং সংযুক্ত টিস্যু সেকশনগুলিকে বরফের উপর (4°C) টাইরোড দ্রবণের স্নানে ফিরিয়ে দিন যতক্ষণ না একটি ডিভাইসের জন্য পর্যাপ্ত সেকশন প্রস্তুত করা হয়। সমস্ত ডিভাইসের জন্য মোট প্রক্রিয়াকরণ সময় 2 ঘন্টার বেশি হওয়া উচিত নয়। 6 টি টিস্যু সেকশন তাদের সাপোর্ট রিংয়ের সাথে সংযুক্ত করার পরে, CTCM ডিভাইসটি একত্রিত করা হয়েছিল। CTCM কালচার চেম্বারটি 21 মিলি প্রি-অক্সিজেনেটেড মিডিয়াম দিয়ে পূর্বেই পূর্ণ করা হয়। টিস্যু অংশগুলিকে কালচার চেম্বারে স্থানান্তর করুন এবং একটি পাইপেট দিয়ে সাবধানে যেকোনো বায়ু বুদবুদ অপসারণ করুন। তারপর টিস্যু অংশটি গর্তে গর্তের মধ্যে নিয়ে যাওয়া হয় এবং আলতো করে চেপে রাখা হয়। অবশেষে, ডিভাইসে ইলেকট্রোড ক্যাপটি রাখুন এবং ডিভাইসটিকে ইনকিউবেটারে স্থানান্তর করুন। তারপর CTCM কে এয়ার টিউব এবং C-PACE-EM সিস্টেমের সাথে সংযুক্ত করুন। নিউম্যাটিক অ্যাকচুয়েটর খোলে এবং এয়ার ভালভ CTCM খুলে দেয়। C-PACE-EM সিস্টেমটি 2 ms এর জন্য বাইফেসিক পেসিংয়ের সময় 1.2 Hz এ 4 V সরবরাহ করার জন্য কনফিগার করা হয়েছিল। দিনে দুবার মাধ্যমটি পরিবর্তন করা হয়েছিল এবং ইলেক্ট্রোডগুলিতে গ্রাফাইট জমা হওয়া এড়াতে দিনে একবার ইলেক্ট্রোডগুলি পরিবর্তন করা হয়েছিল। প্রয়োজনে, টিস্যু অংশগুলি তাদের কালচার ওয়েল থেকে সরানো যেতে পারে যাতে তাদের নীচে পড়ে থাকা যেকোনো বায়ু বুদবুদ বের করে দেওয়া যায়। MT চিকিৎসার অবস্থার জন্য, T3/Dex প্রতিটি মাধ্যমের পরিবর্তনের সাথে 100 nM T3 এবং 1 μM Dex দিয়ে নতুন করে যোগ করা হয়েছিল। CTCM ডিভাইসগুলিকে 37°C এবং 5% CO2 তাপমাত্রায় একটি ইনকিউবেটরে কালচার করা হয়েছিল।
হৃদপিণ্ডের টুকরোগুলির প্রসারিত ট্র্যাজেক্টোরিগুলি পেতে, একটি বিশেষ ক্যামেরা সিস্টেম তৈরি করা হয়েছিল। একটি SLR ক্যামেরা (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ব্যবহার করা হয়েছিল একটি Navitar Zoom 7000 18-108mm ম্যাক্রো লেন্স (Navitar, San Francisco, CA) দিয়ে। তাজা মাধ্যম দিয়ে মাধ্যমটি প্রতিস্থাপন করার পরে ঘরের তাপমাত্রায় ভিজ্যুয়ালাইজেশন করা হয়েছিল। ক্যামেরাটি 51° কোণে স্থাপন করা হয়েছে এবং প্রতি সেকেন্ডে 30 ফ্রেমে ভিডিও রেকর্ড করা হয়েছে। প্রথমে, হৃদপিণ্ডের টুকরোগুলির গতি পরিমাপ করার জন্য Image-J এর সাথে ওপেন সোর্স সফ্টওয়্যার (MUSCLEMOTION43) ব্যবহার করা হয়েছিল। শব্দ এড়াতে হৃদপিণ্ডের টুকরোগুলিকে স্পন্দিত করার জন্য আগ্রহের অঞ্চলগুলি সংজ্ঞায়িত করার জন্য MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) ব্যবহার করে মাস্কটি তৈরি করা হয়েছিল। ম্যানুয়ালি সেগমেন্টেড মাস্কগুলি একটি ফ্রেম সিকোয়েন্সে সমস্ত ছবিতে প্রয়োগ করা হয় এবং তারপর MUSCLEMOTION প্লাগ-ইন-এ স্থানান্তরিত হয়। পেশী গতি রেফারেন্স ফ্রেমের সাপেক্ষে প্রতিটি ফ্রেমের পিক্সেলের গড় তীব্রতা ব্যবহার করে এর গতি পরিমাপ করে। কার্ডিয়াক চক্রের সময়কাল পরিমাপ এবং টিস্যু স্ট্রেচ মূল্যায়নের জন্য ডেটা রেকর্ড, ফিল্টার এবং ব্যবহার করা হয়েছিল। রেকর্ড করা ভিডিওটি প্রথম-ক্রমের শূন্য-পর্যায়ের ডিজিটাল ফিল্টার ব্যবহার করে পোস্ট-প্রসেস করা হয়েছিল। টিস্যু স্ট্রেচ (পিক-টু-পিক) পরিমাপ করার জন্য, রেকর্ড করা সংকেতের পিক এবং ট্রফের মধ্যে পার্থক্য করার জন্য পিক-টু-পিক বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এছাড়াও, সিগন্যাল ড্রিফ্ট দূর করার জন্য ষষ্ঠ ক্রম বহুপদী ব্যবহার করে ডিট্রেন্ডিং করা হয়। বিশ্বব্যাপী টিস্যু গতি, চক্র সময়, শিথিলকরণ সময় এবং সংকোচনের সময় নির্ধারণের জন্য MATLAB-তে প্রোগ্রাম কোড তৈরি করা হয়েছিল (পরিপূরক প্রোগ্রাম কোড 44)।
স্ট্রেন বিশ্লেষণের জন্য, যান্ত্রিক স্ট্রেচ মূল্যায়নের জন্য তৈরি একই ভিডিও ব্যবহার করে, আমরা প্রথমে MUSCLEMOTION সফ্টওয়্যার অনুসারে গতির শিখর (সর্বোচ্চ (উপরের) এবং সর্বনিম্ন (নিম্ন) বিন্দু) প্রতিনিধিত্বকারী দুটি চিত্র সনাক্ত করেছি। তারপরে আমরা টিস্যু অঞ্চলগুলিকে ভাগ করেছিলাম এবং খণ্ডিত টিস্যুতে ছায়াকরণ অ্যালগরিদমের একটি রূপ প্রয়োগ করেছি (পরিপূরক চিত্র 2a)। এরপর খণ্ডিত টিস্যুটিকে দশটি উপ-পৃষ্ঠে বিভক্ত করা হয়েছিল এবং প্রতিটি পৃষ্ঠের চাপ নিম্নলিখিত সমীকরণ ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল: স্ট্রেন = (Sup-Sdown)/Sdown, যেখানে Sup এবং Sdown হল যথাক্রমে ফ্যাব্রিকের উপরের এবং নীচের ছায়া থেকে আকৃতির দূরত্ব (পরিপূরক চিত্র 2b)।
হৃদপিণ্ডের অংশগুলিকে ৪৮ ঘন্টার জন্য ৪% প্যারাফর্মালডিহাইডে স্থির করা হয়েছিল। স্থির টিস্যুগুলিকে ১ ঘন্টার জন্য ১০% এবং ২০% সুক্রোজে, তারপর ৩০% সুক্রোজে রাতারাতি ডিহাইড্রেটেড করা হয়েছিল। এরপর অংশগুলিকে সর্বোত্তম কাটিয়া তাপমাত্রার যৌগ (OCT যৌগ) এ এমবেড করা হয়েছিল এবং ধীরে ধীরে একটি আইসোপেন্টেন/শুষ্ক বরফ স্নানে হিমায়িত করা হয়েছিল। OCT এম্বেডিং ব্লকগুলিকে -৮০ °C তাপমাত্রায় আলাদা না করা পর্যন্ত সংরক্ষণ করুন। স্লাইডগুলি ৮ μm পুরুত্বের অংশ হিসাবে প্রস্তুত করা হয়েছিল।
হৃদপিণ্ডের অংশ থেকে OCT অপসারণ করতে, স্লাইডগুলিকে ৯৫ ডিগ্রি সেলসিয়াসে ৫ মিনিটের জন্য একটি হিটিং ব্লকে গরম করুন। প্রতিটি স্লাইডে ১ মিলি PBS যোগ করুন এবং ঘরের তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন, তারপর ঘরের তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য PBS-তে ০.১% Triton-X সেট করে সেকশনগুলিতে প্রবেশ করুন। অ-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলিকে নমুনার সাথে আবদ্ধ হতে বাধা দিতে, স্লাইডে ১ মিলি ৩% BSA দ্রবণ যোগ করুন এবং ঘরের তাপমাত্রায় ১ ঘন্টা ইনকিউবেট করুন। তারপর BSA অপসারণ করা হয়েছিল এবং স্লাইডগুলি PBS দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনা একটি পেন্সিল দিয়ে চিহ্নিত করুন। প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (১% BSA-তে ১:২০০ মিশ্রিত) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) এবং ট্রোপোনিন-টি (থার্মো সায়েন্টিফিক; #MA5-12960) ৯০ মিনিটের বেশি সময় ধরে যোগ করা হয়েছিল, তারপর সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (১% BSA-তে ১:২০০ মিশ্রিত) মাউস Alexa Fluor 488 (থার্মো সায়েন্টিফিক; #A16079), খরগোশ Alexa Fluor 594 (থার্মো সায়েন্টিফিক; #T6391) এর বিরুদ্ধে অতিরিক্ত ৯০ মিনিটের জন্য PBS দিয়ে ৩ বার ধোয়া হয়েছিল। পটভূমি থেকে টার্গেট স্টেনিং আলাদা করার জন্য, আমরা নিয়ন্ত্রণ হিসাবে শুধুমাত্র সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করেছি। অবশেষে, DAPI নিউক্লিয়ার স্টেন যোগ করা হয়েছিল এবং স্লাইডগুলিকে একটি ভেক্টাশিল্ডে (ভেক্টর ল্যাবরেটরিজ) স্থাপন করা হয়েছিল এবং নেইল পলিশ দিয়ে সিল করা হয়েছিল। -x ম্যাগনিফিকেশন) এবং 40x ম্যাগনিফিকেশন সহ Keyence মাইক্রোস্কোপ।
WGA-Alexa Fluor 555 (থার্মো সায়েন্টিফিক; #W32464) 5 μg/ml PBS-এ WGA স্টেইনিংয়ের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য স্থির অংশে প্রয়োগ করা হয়েছিল। তারপর স্লাইডগুলিকে PBS দিয়ে ধুয়ে প্রতিটি স্লাইডে সুদান ব্ল্যাক যোগ করা হয়েছিল এবং 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। তারপর স্লাইডগুলিকে PBS দিয়ে ধুয়ে ভেক্টাশিল্ড এমবেডিং মিডিয়াম যোগ করা হয়েছিল। 40x ম্যাগনিফিকেশনে একটি Keyence মাইক্রোস্কোপে স্লাইডগুলি ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল।
উপরে বর্ণিত নমুনা থেকে OCT সরানো হয়েছিল। OCT সরানোর পর, স্লাইডগুলিকে রাতারাতি বুইনের দ্রবণে ডুবিয়ে রাখুন। তারপর স্লাইডগুলিকে পাতিত জল দিয়ে 1 ঘন্টা ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপর 10 মিনিটের জন্য Bibrich অ্যালো অ্যাসিড ফুচসিন দ্রবণে রাখা হয়েছিল। তারপর স্লাইডগুলিকে পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে 5% ফসফোমোলিবডেনাম/5% ফসফোটাংস্টিক অ্যাসিডের দ্রবণে 10 মিনিটের জন্য রাখা হয়েছিল। ধুয়ে না ফেলে, স্লাইডগুলিকে সরাসরি অ্যানিলিন নীল দ্রবণে 15 মিনিটের জন্য স্থানান্তর করুন। তারপর স্লাইডগুলিকে পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে 1% অ্যাসিটিক অ্যাসিড দ্রবণে 2 মিনিটের জন্য রাখা হয়েছিল। স্লাইডগুলিকে 200 N ইথানলে শুকিয়ে জাইলিনে স্থানান্তর করা হয়েছিল। 10x অবজেক্টিভ সহ একটি Keyence মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে দাগযুক্ত স্লাইডগুলি ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল। Keyence বিশ্লেষক সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ফাইব্রোসিস এলাকার শতাংশ পরিমাপ করা হয়েছিল।
CyQUANT™ MTT কোষের কার্যকারিতা পরীক্ষা (ইনভিট্রোজেন, কার্লসব্যাড, CA), ক্যাটালগ নম্বর V13154, প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে কিছু পরিবর্তন সহ। বিশেষ করে, MTT বিশ্লেষণের সময় অভিন্ন টিস্যু আকার নিশ্চিত করার জন্য 6 মিমি ব্যাসের একটি সার্জিক্যাল পাঞ্চ ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে MTT সাবস্ট্রেট ধারণকারী 12-কূপ প্লেটের কূপে টিস্যুগুলিকে পৃথকভাবে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। অংশগুলি 37° সেলসিয়াসে 3 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয় এবং জীবন্ত টিস্যু MTT সাবস্ট্রেটকে বিপাক করে একটি বেগুনি ফর্মাজান যৌগ তৈরি করে। MTT দ্রবণটি 1 মিলি DMSO দিয়ে প্রতিস্থাপন করুন এবং হৃদপিণ্ডের অংশ থেকে বেগুনি ফর্মাজান বের করার জন্য 15 মিনিটের জন্য 37°C তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করুন। নমুনাগুলি 96-কূপ পরিষ্কার নীচের প্লেটে DMSO তে 1:10 মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং একটি সাইটেশন প্লেট রিডার (BioTek) ব্যবহার করে 570 nm পরিমাপ করা হয়েছিল। হৃদপিণ্ডের প্রতিটি স্লাইসের ওজন অনুসারে রিডিং স্বাভাবিক করা হয়েছিল।
পূর্বে বর্ণিত গ্লুকোজ ব্যবহারের পরীক্ষার জন্য হার্ট স্লাইস মিডিয়াকে 1 μCi/ml [5-3H]-গ্লুকোজ (মোরাভেক বায়োকেমিক্যালস, ব্রিয়া, সিএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ধারণকারী মিডিয়া দিয়ে প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল। 4 ঘন্টা ইনকিউবেশনের পর, 100 μl 0.2 N HCl ধারণকারী একটি খোলা মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে 100 μl মিডিয়াম যোগ করুন। তারপর টিউবটিকে 500 μl dH2O ধারণকারী একটি সিন্টিলেশন টিউবে স্থাপন করা হয়েছিল যাতে 37°C তাপমাত্রায় 72 ঘন্টার জন্য [3H]2O বাষ্পীভূত হয়। তারপর সিন্টিলেশন টিউব থেকে মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবটি সরিয়ে 10 মিলি সিন্টিলেশন তরল যোগ করুন। ট্রাই-কার্ব 2900TR তরল সিন্টিলেশন বিশ্লেষক (প্যাকার্ড বায়োসায়েন্স কোম্পানি, মেরিডেন, সিটি, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে সিন্টিলেশন গণনা করা হয়েছিল। এরপর গ্লুকোজের ব্যবহার গণনা করা হয়েছিল [5-3H]-গ্লুকোজ নির্দিষ্ট কার্যকলাপ, অসম্পূর্ণ ভারসাম্য এবং পটভূমি, লেবেলবিহীন গ্লুকোজের সাথে [5-3H]-এর তরলীকরণ এবং সিন্টিলেশন কাউন্টার দক্ষতা বিবেচনা করে। তথ্যগুলি হৃৎপিণ্ডের বিভিন্ন অংশের ভর অনুসারে স্বাভাবিক করা হয়।
ট্রিজলে টিস্যু একজাতকরণের পর, প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে কিয়াজেন miRNeasy মাইক্রো কিট #210874 ব্যবহার করে হৃদপিণ্ডের অংশগুলি থেকে RNA বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। RNAsec লাইব্রেরি প্রস্তুতি, সিকোয়েন্সিং এবং ডেটা বিশ্লেষণ নিম্নরূপ সম্পাদিত হয়েছিল:
RNA লাইব্রেরি তৈরির জন্য প্রতি নমুনায় 1 μg RNA ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের সুপারিশ অনুসরণ করে NEBNext UltraTM RNA লাইব্রেরি প্রস্তুতি কিট ফর ইলুমিনা (NEB, USA) ব্যবহার করে সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরি তৈরি করা হয়েছিল এবং প্রতিটি নমুনার জন্য অ্যাট্রিবিউট সিকোয়েন্সে সূচক কোড যোগ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, পলি-টি অলিগোনিউক্লিওটাইডের সাথে সংযুক্ত চৌম্বকীয় পুঁতি ব্যবহার করে মোট RNA থেকে mRNA শুদ্ধ করা হয়েছিল। NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) এ উচ্চ তাপমাত্রায় দ্বি-ভাজক ক্যাটেশন ব্যবহার করে ফ্র্যাগমেন্টেশন করা হয়। প্রথম স্ট্র্যান্ড cDNA র্যান্ডম হেক্সামার প্রাইমার এবং M-MuLV রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ (RNase H-) ব্যবহার করে সংশ্লেষিত করা হয়েছিল। দ্বিতীয় স্ট্র্যান্ড cDNA তারপর DNA পলিমারেজ I এবং RNase H ব্যবহার করে সংশ্লেষিত করা হয়। অবশিষ্ট ওভারহ্যাংগুলি এক্সোন্যুক্লিজ/পলিমারেজ কার্যকলাপ দ্বারা ভোঁতা প্রান্তে রূপান্তরিত হয়। DNA খণ্ডের 3′ প্রান্তের অ্যাডেনাইলেশনের পরে, হাইব্রিডাইজেশনের জন্য প্রস্তুত করার জন্য একটি হেয়ারপিন লুপ কাঠামো সহ একটি NEBNext অ্যাডাপ্টার সংযুক্ত করা হয়। পছন্দসই দৈর্ঘ্যের 150-200 bp এর cDNA টুকরো নির্বাচনের জন্য। AMPure XP সিস্টেম (Beckman Coulter, Beverly, USA) ব্যবহার করে লাইব্রেরির টুকরোগুলি বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। তারপর, 3 μl USER এনজাইম (NEB, USA) একটি অ্যাডাপ্টারের সাথে আবদ্ধ আকার-নির্বাচিত cDNA সহ 37°C তাপমাত্রায় 15 মিনিট এবং তারপর PCR এর আগে 95°C তাপমাত্রায় 5 মিনিট ব্যবহার করা হয়েছিল। তারপর PCR PRODUCT গুলি Pusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers এবং Index (X) primers ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। অবশেষে, PCR পণ্যগুলি বিশুদ্ধ করা হয়েছিল (AMPure XP সিস্টেম) এবং Agilent Bioanalyzer 2100 সিস্টেমে লাইব্রেরির মান মূল্যায়ন করা হয়েছিল। তারপর cDNA লাইব্রেরিটি একটি Novaseq sequencer ব্যবহার করে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল। Illumina থেকে কাঁচা চিত্র ফাইলগুলি CASAVA বেস কলিং ব্যবহার করে কাঁচা পাঠে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। কাঁচা তথ্য FASTQ(fq) ফর্ম্যাট ফাইলগুলিতে সংরক্ষণ করা হয় যাতে পঠিত ক্রম এবং সংশ্লিষ্ট বেস গুণাবলী থাকে। ফিল্টার করা সিকোয়েন্সিং রিডগুলিকে Sscrofa11.1 রেফারেন্স জিনোমের সাথে মেলাতে HISAT2 নির্বাচন করুন। সাধারণভাবে, HISAT2 যেকোনো আকারের জিনোমকে সমর্থন করে, যার মধ্যে ৪ বিলিয়ন বেসের চেয়ে বড় জিনোমও রয়েছে এবং বেশিরভাগ প্যারামিটারের জন্য ডিফল্ট মান সেট করা থাকে। RNA Seq ডেটা থেকে স্প্লিসিং রিড HISAT2 ব্যবহার করে দক্ষতার সাথে সারিবদ্ধ করা যেতে পারে, যা বর্তমানে উপলব্ধ দ্রুততম সিস্টেম, অন্য যেকোনো পদ্ধতির তুলনায় একই বা আরও ভালো নির্ভুলতার সাথে।
ট্রান্সক্রিপ্টের প্রাচুর্য সরাসরি জিনের প্রকাশের স্তরকে প্রতিফলিত করে। জিনের প্রকাশের স্তরগুলি জিনোম বা এক্সনের সাথে সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্টের প্রাচুর্য (সিকোয়েন্সিং কাউন্ট) দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়। পাঠের সংখ্যা জিনের প্রকাশের স্তর, জিনের দৈর্ঘ্য এবং সিকোয়েন্সিং গভীরতার সমানুপাতিক। FPKM (প্রতি মিলিয়ন বেস জোড়ায় সিকোয়েন্স করা ট্রান্সক্রিপ্টের প্রতি হাজার বেস জোড়ার টুকরো) গণনা করা হয়েছিল এবং DESeq2 প্যাকেজ ব্যবহার করে ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশনের P-মান নির্ধারণ করা হয়েছিল। এরপর আমরা বিল্ট-ইন R-ফাংশন "p.adjust" এর উপর ভিত্তি করে বেঞ্জামিনী-হচবার্গ পদ্ধতি9 ব্যবহার করে প্রতিটি P মানের জন্য মিথ্যা আবিষ্কারের হার (FDR) গণনা করেছি।
থার্মো (থার্মো, ক্যাট. নং. ১১৭৫৬০৫০) থেকে সুপারস্ক্রিপ্ট IV ভিলো মাস্টার মিশ্রণ ব্যবহার করে হৃদপিণ্ডের অংশ থেকে বিচ্ছিন্ন RNA কে ২০০ ng/μl ঘনত্বে cDNA তে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। পরিমাণগত RT-PCR একটি অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস এন্ডুরা প্লেট মাইক্রোঅ্যাম্প ৩৮৪-ওয়েল ট্রান্সপারেন্ট রিঅ্যাকশন প্লেট (থার্মো, ক্যাট. নং. ৪৪৮৩৩১৯) এবং মাইক্রোঅ্যাম্প অপটিক্যাল অ্যাডহেসিভ (থার্মো, ক্যাট. নং. ৪৩১১৯৭১) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। বিক্রিয়া মিশ্রণটিতে ৫ µl টাকম্যান ফাস্ট অ্যাডভান্সড মাস্টার মিশ্রণ (থার্মো, ক্যাট # ৪৪৪৪৫৫৭), ০.৫ µl টাকম্যান প্রাইমার এবং ৩.৫ µl H2O প্রতি কূপ মিশ্রিত ছিল। স্ট্যান্ডার্ড qPCR চক্র চালানো হয়েছিল এবং একটি অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস কোয়ান্টস্টুডিও ৫ রিয়েল-টাইম পিসিআর যন্ত্র (৩৮৪-ওয়েল মডিউল; পণ্য # A28135) ব্যবহার করে CT মান পরিমাপ করা হয়েছিল। Taqman প্রাইমারগুলি Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) থেকে কেনা হয়েছিল। সমস্ত নমুনার CT মানগুলি গৃহস্থালির জিন GAPDH-তে স্বাভাবিক করা হয়েছিল।
প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে NT-ProBNP কিট (শূকর) (বিড়াল নং MBS2086979, MyBioSource) ব্যবহার করে NT-ProBNP-এর মিডিয়া রিলিজ মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, প্রতিটি কূপে প্রতিটি নমুনা এবং স্ট্যান্ডার্ডের 250 µl প্রতিলিপিতে যোগ করা হয়েছিল। নমুনা যোগ করার পরপরই, প্রতিটি কূপে 50 µl অ্যাসে রিএজেন্ট A যোগ করুন। প্লেটটি আলতো করে ঝাঁকান এবং সিলান্ট দিয়ে সিল করুন। তারপর ট্যাবলেটগুলি 37°C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। তারপর দ্রবণটি অ্যাসপিরেট করুন এবং 350 µl 1X ওয়াশ দ্রবণ দিয়ে 4 বার ওয়েলগুলি ধুয়ে ফেলুন, প্রতিবার 1-2 মিনিটের জন্য ওয়াশ দ্রবণটি ইনকিউবেট করুন। তারপর প্রতি কূপে 100 µl অ্যাসে রিএজেন্ট B যোগ করুন এবং প্লেট সিলান্ট দিয়ে সিল করুন। ট্যাবলেটটি আলতো করে ঝাঁকান এবং 37°C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। দ্রবণটি অ্যাসপিরেট করুন এবং ৩৫০ µl ১X ওয়াশ দ্রবণ দিয়ে ৫ বার কূপগুলি ধুয়ে নিন। প্রতিটি কূপে ৯০ µl সাবস্ট্রেট দ্রবণ যোগ করুন এবং প্লেটটি সিল করুন। প্লেটটি ৩৭°C তাপমাত্রায় ১০-২০ মিনিটের জন্য সেদ্ধ করুন। প্রতিটি কূপে ৫০ µl স্টপ সলিউশন যোগ করুন। ৪৫০ এনএম সেট করা সাইটেশন (বায়োটেক) প্লেট রিডার ব্যবহার করে প্লেটটি তাৎক্ষণিকভাবে পরিমাপ করা হয়েছিল।
গ্রুপের আকার নির্বাচন করার জন্য পাওয়ার বিশ্লেষণ করা হয়েছিল যা 5% টাইপ I ত্রুটি হার সহ প্যারামিটারে 10% পরম পরিবর্তন সনাক্ত করতে 80% থেকে বেশি শক্তি প্রদান করবে। গ্রুপের আকার নির্বাচন করার জন্য পাওয়ার বিশ্লেষণ করা হয়েছিল যা 5% টাইপ I ত্রুটি হার সহ প্যারামিটারে 10% পরম পরিবর্তন সনাক্ত করতে 80% থেকে বেশি শক্তি প্রদান করবে। অ্যানালিজ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абнаружения প্যারামেট্র এর 5% частотой ошибок TIPA I. ৫% টাইপ I ত্রুটি হারের সাথে ১০% পরম প্যারামিটার পরিবর্তন সনাক্ত করতে ৮০% থেকে বেশি শক্তি প্রদানকারী গ্রুপ আকার নির্বাচন করার জন্য পাওয়ার বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।进行功效分析以选择将提供 > 80％功效以检测参数中10进行功效分析以选择将提供 > 80％功效以检测参数中10 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > ৮০% мощности для обнаружения 10% প্যারামেট্রভ এবং 5% частоты ошибок TIPA I. একটি পাওয়ার বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এমন একটি গ্রুপ আকার নির্বাচন করার জন্য যা 80% থেকে বেশি শক্তি প্রদান করবে যাতে 10% পরম প্যারামিটার পরিবর্তন এবং 5% টাইপ I ত্রুটির হার সনাক্ত করা যায়।পরীক্ষার আগে টিস্যু বিভাগগুলি এলোমেলোভাবে নির্বাচন করা হয়েছিল। সমস্ত বিশ্লেষণ কন্ডিশন ব্লাইন্ড ছিল এবং সমস্ত ডেটা বিশ্লেষণ করার পরেই নমুনাগুলি ডিকোড করা হয়েছিল। সমস্ত পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ সম্পাদনের জন্য গ্রাফপ্যাড প্রিজম সফ্টওয়্যার (সান দিয়েগো, সিএ) ব্যবহার করা হয়েছিল। সমস্ত পরিসংখ্যানের জন্য, <0.05 মানগুলিতে p-মানগুলি তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। সমস্ত পরিসংখ্যানের জন্য, p-মানগুলিকে <0.05 মানের ক্ষেত্রে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচনা করা হয়েছিল। Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. সমস্ত পরিসংখ্যানের জন্য, p-মানগুলিকে <0.05 মানের ক্ষেত্রে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচনা করা হয়েছিল।对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. সমস্ত পরিসংখ্যানের জন্য, p-মানগুলিকে <0.05 মানের ক্ষেত্রে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচনা করা হয়েছিল।মাত্র ২টি তুলনার মাধ্যমে ডেটার উপর দ্বি-লেজযুক্ত শিক্ষার্থীর টি-পরীক্ষা করা হয়েছিল। একাধিক গ্রুপের মধ্যে তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য একমুখী বা দ্বিমুখী ANOVA ব্যবহার করা হয়েছিল। পোস্ট-হক পরীক্ষা করার সময়, একাধিক তুলনার জন্য টুকির সংশোধন প্রয়োগ করা হয়েছিল। পদ্ধতি বিভাগে বর্ণিত FDR এবং p.adjust গণনা করার সময় RNAsec ডেটার বিশেষ পরিসংখ্যানগত বিবেচনা রয়েছে।
অধ্যয়ন নকশা সম্পর্কে আরও তথ্যের জন্য, এই নিবন্ধের সাথে লিঙ্ক করা প্রকৃতি গবেষণা প্রতিবেদনের সারাংশ দেখুন।