Nature.com পরিদর্শন করার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ.আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে সীমিত CSS সমর্থন রয়েছে৷সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিই (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্য মোড অক্ষম করুন)৷ইতিমধ্যে, অব্যাহত সমর্থন নিশ্চিত করতে, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটিকে রেন্ডার করব।
একটি নির্ভরযোগ্য ইন ভিট্রো সিস্টেমের প্রয়োজন যা ওষুধ পরীক্ষার জন্য হৃদয়ের শারীরবৃত্তীয় পরিবেশকে সঠিকভাবে পুনরুত্পাদন করতে পারে।মানুষের হার্ট টিস্যু কালচার সিস্টেমের সীমিত প্রাপ্যতা কার্ডিয়াক ওষুধের প্রভাবের ভুল ব্যাখ্যার দিকে পরিচালিত করেছে।এখানে, আমরা একটি কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার মডেল (CTCM) তৈরি করেছি যা ইলেক্ট্রোমেকানিক্যালি হার্টের স্লাইসগুলিকে উদ্দীপিত করে এবং কার্ডিয়াক চক্রের সিস্টোলিক এবং ডায়াস্টোলিক পর্যায়ে শারীরবৃত্তীয় প্রসারিত হয়।12 দিনের সংস্কৃতির পরে, এই পদ্ধতিটি আংশিকভাবে হৃদযন্ত্রের কার্যকারিতা উন্নত করেছে, তবে তাদের কাঠামোগত অখণ্ডতা সম্পূর্ণরূপে সংরক্ষণ করেনি।অতএব, ছোট অণু স্ক্রীনিংয়ের পরে, আমরা দেখতে পেলাম যে আমাদের মাধ্যমে 100 nM ট্রাইওডোথাইরোনিন (T3) এবং 1 μM ডেক্সামেথাসোন (ডেক্স) যোগ করা 12 দিনের জন্য বিভাগগুলির মাইক্রোস্ট্রাকচার বজায় রাখে।T3/Dex চিকিত্সার সাথে সংমিশ্রণে, CTCM সিস্টেমটি 12 দিনের জন্য তাজা হার্ট টিস্যুর মতো একই স্তরে ট্রান্সক্রিপশনাল প্রোফাইল, কার্যক্ষমতা, বিপাকীয় কার্যকলাপ এবং কাঠামোগত অখণ্ডতা বজায় রাখে।উপরন্তু, সংস্কৃতিতে কার্ডিয়াক টিস্যুর অত্যধিক স্ট্রেচিং হাইপারট্রফিক কার্ডিয়াক সিগন্যালিংকে প্ররোচিত করে, কার্ডিয়াক স্ট্রেচ দ্বারা প্ররোচিত হাইপারট্রফিক অবস্থার অনুকরণ করার জন্য সিটিসিএম-এর ক্ষমতার প্রমাণ প্রদান করে।উপসংহারে, CTCM দীর্ঘ সময়ের মধ্যে হৃদপিণ্ডের শারীরবৃত্ত ও প্যাথোফিজিওলজির মডেল করতে পারে, নির্ভরযোগ্য ড্রাগ স্ক্রিনিং সক্ষম করে।
ক্লিনিকাল গবেষণার আগে, নির্ভরযোগ্য ইন ভিট্রো সিস্টেমের প্রয়োজন হয় যা মানুষের হৃদয়ের শারীরবৃত্তীয় পরিবেশকে সঠিকভাবে পুনরুত্পাদন করতে পারে।এই ধরনের সিস্টেমগুলি পরিবর্তিত যান্ত্রিক প্রসারিত, হার্ট রেট এবং ইলেক্ট্রোফিজিওলজিকাল বৈশিষ্ট্যগুলি অনুকরণ করা উচিত।পশুর মডেলগুলি সাধারণত কার্ডিয়াক ফিজিওলজির স্ক্রীনিং প্ল্যাটফর্ম হিসাবে সীমিত নির্ভরযোগ্যতার সাথে মানুষের হৃদয়ে ওষুধের প্রভাব প্রতিফলিত করে 1,2 ব্যবহার করা হয়।পরিশেষে, আইডিয়াল কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার এক্সপেরিমেন্টাল মডেল (CTCM) হল একটি মডেল যা অত্যন্ত সংবেদনশীল এবং বিভিন্ন থেরাপিউটিক এবং ফার্মাকোলজিকাল হস্তক্ষেপের জন্য নির্দিষ্ট, সঠিকভাবে মানুষের হৃদপিণ্ডের শারীরবৃত্ত ও প্যাথোফিজিওলজিকে পুনরুত্পাদন করে।এই ধরনের সিস্টেমের অনুপস্থিতি হার্ট ফেইলিউরের জন্য নতুন চিকিত্সার আবিষ্কারকে সীমিত করে 4,5 এবং ওষুধ কার্ডিওটক্সিসিটি বাজার থেকে বেরিয়ে যাওয়ার একটি প্রধান কারণ হিসাবে নেতৃত্ব দিয়েছে।
গত এক দশকে, আটটি নন-কার্ডিওভাসকুলার ওষুধ ক্লিনিকাল ব্যবহার থেকে প্রত্যাহার করা হয়েছে কারণ তারা কিউটি ব্যবধান দীর্ঘায়িত করে যার ফলে ভেন্ট্রিকুলার অ্যারিথমিয়া এবং আকস্মিক মৃত্যু7।সুতরাং, কার্ডিওভাসকুলার কার্যকারিতা এবং বিষাক্ততা মূল্যায়ন করার জন্য নির্ভরযোগ্য প্রাক-ক্লিনিকাল স্ক্রীনিং কৌশলগুলির ক্রমবর্ধমান প্রয়োজন রয়েছে।ড্রাগ স্ক্রীনিং এবং বিষাক্ততা পরীক্ষায় মানব-প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল-ডিরাইভড কার্ডিওমায়োসাইটস (hiPS-CM) এর সাম্প্রতিক ব্যবহার এই সমস্যার আংশিক সমাধান প্রদান করে।যাইহোক, hiPS-CM এর অপরিণত প্রকৃতি এবং কার্ডিয়াক টিস্যুর বহুকোষী জটিলতার অভাব এই পদ্ধতির প্রধান সীমাবদ্ধতা।সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে স্বতঃস্ফূর্ত সংকোচনের সূচনার পরে এবং ধীরে ধীরে সময়ের সাথে সাথে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা বাড়ানোর পরে কার্ডিয়াক টিস্যু হাইড্রোজেল গঠনের জন্য প্রাথমিক hiPS-CM ব্যবহার করে এই সীমাবদ্ধতা আংশিকভাবে কাটিয়ে উঠতে পারে।যাইহোক, এই হাইপিএস-সিএম মাইক্রোটিস্যুতে প্রাপ্তবয়স্ক মায়োকার্ডিয়ামের পরিপক্ক ইলেক্ট্রোফিজিওলজিকাল এবং সংকোচনের বৈশিষ্ট্য নেই।উপরন্তু, মানুষের কার্ডিয়াক টিস্যুর একটি আরও জটিল গঠন রয়েছে, যার মধ্যে বিভিন্ন কোষের ভিন্ন ভিন্ন ধরনের মিশ্রণ রয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে এন্ডোথেলিয়াল কোষ, নিউরন এবং স্ট্রোমাল ফাইব্রোব্লাস্ট, এক্সট্রা সেলুলার ম্যাট্রিক্স প্রোটিনের নির্দিষ্ট সেট দ্বারা আন্তঃসংযুক্ত।প্রাপ্তবয়স্ক স্তন্যপায়ী হৃৎপিণ্ডে নন-কার্ডিওমায়োসাইট জনসংখ্যার এই ভিন্নতা 11,12,13 পৃথক কোষের প্রকারগুলি ব্যবহার করে কার্ডিয়াক টিস্যু মডেল করার ক্ষেত্রে একটি প্রধান বাধা।এই প্রধান সীমাবদ্ধতাগুলি শারীরবৃত্তীয় এবং প্যাথলজিকাল অবস্থার অধীনে অক্ষত মায়োকার্ডিয়াল টিস্যু সংস্কৃতির জন্য পদ্ধতিগুলি বিকাশের গুরুত্বের উপর জোর দেয়।
মানুষের হৃদপিণ্ডের সভ্য পাতলা (300 µm) অংশগুলি অক্ষত মানব মায়োকার্ডিয়ামের একটি প্রতিশ্রুতিশীল মডেল হিসাবে প্রমাণিত হয়েছে।এই পদ্ধতিটি মানব হৃদপিণ্ডের টিস্যুর মতো একটি সম্পূর্ণ 3D বহুকোষী সিস্টেমে অ্যাক্সেস সরবরাহ করে।যাইহোক, 2019 সাল পর্যন্ত, সংক্ষিপ্ত (24 ঘন্টা) সংস্কৃতি বেঁচে থাকার দ্বারা সংস্কৃত হৃদয় বিভাগের ব্যবহার সীমিত ছিল।এটি শারীরিক-যান্ত্রিক স্ট্রেচের অভাব, বায়ু-তরল ইন্টারফেস এবং কার্ডিয়াক টিস্যুর প্রয়োজনীয়তা সমর্থন করে না এমন সাধারণ মিডিয়ার ব্যবহার সহ বেশ কয়েকটি কারণের কারণে।2019 সালে, বেশ কয়েকটি গবেষণা গোষ্ঠী দেখিয়েছে যে কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার সিস্টেমে যান্ত্রিক কারণগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করা সংস্কৃতির জীবনকে প্রসারিত করতে পারে, কার্ডিয়াক এক্সপ্রেশন উন্নত করতে পারে এবং কার্ডিয়াক প্যাথলজি অনুকরণ করতে পারে।দুটি মার্জিত গবেষণা 17 এবং 18 দেখায় যে অক্ষীয় যান্ত্রিক লোডিং সংস্কৃতির সময় কার্ডিয়াক ফেনোটাইপের উপর ইতিবাচক প্রভাব ফেলে।যাইহোক, এই অধ্যয়নগুলি কার্ডিয়াক চক্রের গতিশীল ত্রি-মাত্রিক ফিজিকো-মেকানিকাল লোডিং ব্যবহার করেনি, যেহেতু হার্টের বিভাগগুলি আইসোমেট্রিক টেনসিল ফোর্স 17 বা লিনিয়ার অক্সোটোনিক লোডিং 18 দিয়ে লোড করা হয়েছিল।টিস্যু প্রসারিত করার এই পদ্ধতিগুলির ফলে অনেক কার্ডিয়াক জিন দমন করা হয়েছে বা অস্বাভাবিক প্রসারিত প্রতিক্রিয়াগুলির সাথে যুক্ত জিনের অতিরিক্ত এক্সপ্রেশন।উল্লেখযোগ্যভাবে, পিটুলিস এট আল।19 ফোর্স ট্রান্সডুসার ফিডব্যাক এবং টেনশন ড্রাইভ ব্যবহার করে কার্ডিয়াক চক্র পুনর্গঠনের জন্য একটি গতিশীল হার্ট স্লাইস কালচার বাথ তৈরি করেছে।যদিও এই সিস্টেমটি ভিট্রো কার্ডিয়াক সাইকেল মডেলিং-এ আরও নির্ভুলতার অনুমতি দেয়, তবে পদ্ধতির জটিলতা এবং কম থ্রুপুট এই সিস্টেমের প্রয়োগকে সীমিত করে।আমাদের পরীক্ষাগার সম্প্রতি বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা এবং একটি অপ্টিমাইজড মাধ্যম ব্যবহার করে একটি সরলীকৃত সংস্কৃতি ব্যবস্থা তৈরি করেছে যাতে পোর্সিন এবং মানব হৃদপিণ্ডের টিস্যুর অংশগুলি 6 দিন পর্যন্ত 20,21 পর্যন্ত কার্যকরতা বজায় রাখা যায়।
বর্তমান পাণ্ডুলিপিতে, আমরা কার্ডিয়াক হার্টের অংশগুলি ব্যবহার করে একটি কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার মডেল (CTCM) বর্ণনা করি যা কার্ডিয়াক চক্রের সময় ত্রি-মাত্রিক কার্ডিয়াক ফিজিওলজি এবং প্যাথোফিজিওলজিকাল বিস্তৃতি পুনরুদ্ধার করতে হাস্যকর সংকেতগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করে।এই CTCM প্রাক-ক্লিনিকাল ওষুধের ভবিষ্যদ্বাণীর নির্ভুলতাকে এমন একটি স্তরে বৃদ্ধি করতে পারে যা আগে কখনও অর্জন করা হয়নি একটি ব্যয়-কার্যকর, মধ্য-থ্রুপুট কার্ডিয়াক সিস্টেম প্রদান করে যা প্রাক-ক্লিনিক্যাল ড্রাগ পরীক্ষার জন্য স্তন্যপায়ী হার্টের ফিজিওলজি/প্যাথোফিজিওলজির অনুকরণ করে।
হেমোডাইনামিক যান্ত্রিক সংকেতগুলি ভিট্রো 22,23,24-এ কার্ডিওমায়োসাইট ফাংশন বজায় রাখতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে।বর্তমান পাণ্ডুলিপিতে, আমরা একটি CTCM (চিত্র 1a) তৈরি করেছি যা শারীরবৃত্তীয় ফ্রিকোয়েন্সিতে (1.2 Hz, 72 বীট প্রতি মিনিটে) বৈদ্যুতিক এবং যান্ত্রিক উদ্দীপনাকে প্ররোচিত করে প্রাপ্তবয়স্ক কার্ডিয়াক পরিবেশকে অনুকরণ করতে পারে।ডায়াস্টোলের সময় অত্যধিক টিস্যু প্রসারিত এড়াতে, টিস্যুর আকার 25% বৃদ্ধি করতে একটি 3D প্রিন্টিং ডিভাইস ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র 1b)।C-PACE সিস্টেম দ্বারা প্ররোচিত বৈদ্যুতিক পেসিং কার্ডিয়াক চক্রকে সম্পূর্ণরূপে পুনরুত্পাদন করার জন্য একটি ডেটা অধিগ্রহণ সিস্টেম ব্যবহার করে সিস্টোলের 100 ms আগে শুরু করার সময় ছিল।টিস্যু কালচার সিস্টেম একটি প্রোগ্রামেবল নিউম্যাটিক অ্যাকচুয়েটর (এলবি ইঞ্জিনিয়ারিং, জার্মানি) ব্যবহার করে চক্রাকারে একটি নমনীয় সিলিকন ঝিল্লি প্রসারিত করে যা উপরের চেম্বারে হৃদপিন্ডের স্লাইসগুলির প্রসারণ ঘটায়।সিস্টেমটি একটি চাপ ট্রান্সডুসারের মাধ্যমে একটি বাহ্যিক এয়ার লাইনের সাথে সংযুক্ত ছিল, যার ফলে চাপ (± 1 mmHg) এবং সময় (± 1 ms) (চিত্র 1c) সঠিকভাবে সামঞ্জস্য করা সম্ভব হয়েছিল।
একটি যন্ত্রের কালচার চেম্বারের ভিতরে নীল রঙে দেখানো 7 মিমি সাপোর্ট রিং-এর সাথে টিস্যু বিভাগটি সংযুক্ত করুন।সংস্কৃতি চেম্বার একটি পাতলা নমনীয় সিলিকন ঝিল্লি দ্বারা বায়ু চেম্বার থেকে পৃথক করা হয়।ফুটো প্রতিরোধ করতে প্রতিটি চেম্বারের মধ্যে একটি গ্যাসকেট রাখুন।ডিভাইসের ঢাকনাটিতে গ্রাফাইট ইলেক্ট্রোড রয়েছে যা বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রদান করে।b বড় টিস্যু ডিভাইস, গাইড রিং এবং সমর্থন রিং এর পরিকল্পিত উপস্থাপনা।টিস্যু বিভাগগুলি (বাদামী) বড় আকারের ডিভাইসে যন্ত্রের বাইরের প্রান্তে খাঁজে রাখা গাইড রিং দিয়ে স্থাপন করা হয়।গাইড ব্যবহার করে, কার্ডিয়াক টিস্যুর অংশে টিস্যু এক্রাইলিক আঠালো দিয়ে প্রলিপ্ত সমর্থন রিংটি সাবধানে রাখুন।c একটি প্রোগ্রামেবল নিউমেটিক অ্যাকচুয়েটর (PPD) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত বায়ু চেম্বারের চাপের একটি ফাংশন হিসাবে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার সময় দেখানো গ্রাফ।চাপ সেন্সর ব্যবহার করে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা সিঙ্ক্রোনাইজ করতে একটি ডেটা অধিগ্রহণ ডিভাইস ব্যবহার করা হয়েছিল।যখন কালচার চেম্বারে চাপ সেট থ্রেশহোল্ডে পৌঁছায়, তখন বৈদ্যুতিক উদ্দীপনাকে ট্রিগার করার জন্য একটি পালস সংকেত C-PACE-EM-তে পাঠানো হয়।d একটি ইনকিউবেটর শেলফে রাখা চারটি CTCM-এর ছবি।চারটি ডিভাইস একটি বায়ুসংক্রান্ত সার্কিটের মাধ্যমে একটি পিপিডির সাথে সংযুক্ত থাকে এবং বায়ুসংক্রান্ত সার্কিটে চাপ নিরীক্ষণের জন্য হিমোস্ট্যাটিক ভালভের মধ্যে চাপ সেন্সর ঢোকানো হয়।প্রতিটি ডিভাইসে ছয়টি টিস্যু বিভাগ রয়েছে।
একটি একক বায়ুসংক্রান্ত অ্যাকুয়েটর ব্যবহার করে, আমরা 4টি CTCM ডিভাইস নিয়ন্ত্রণ করতে সক্ষম হয়েছি, যার প্রতিটিতে 6 টি টিস্যু বিভাগ থাকতে পারে (চিত্র 1d)।সিটিসিএম-এ, বায়ু চেম্বারের বায়ুচাপ তরল চেম্বারে সিঙ্ক্রোনাস চাপে রূপান্তরিত হয় এবং হার্ট স্লাইসের শারীরবৃত্তীয় প্রসারণকে প্ররোচিত করে (চিত্র 2a এবং পরিপূরক মুভি 1)।80 মিমি Hg এ টিস্যু প্রসারিত মূল্যায়ন।শিল্প.25% দ্বারা টিস্যু বিভাগের প্রসারিত দেখায় (চিত্র 2b)।এই শতাংশ প্রসারিত 2.2-2.3 µm একটি শারীরবৃত্তীয় সারকোমেরের দৈর্ঘ্যের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ দেখানো হয়েছে স্বাভাবিক কার্ডিয়াক বিভাগের সংকোচনের জন্য 17,19,25।টিস্যু আন্দোলন কাস্টম ক্যামেরা সেটিংস ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 1)।টিস্যু আন্দোলনের প্রশস্ততা এবং বেগ (চিত্র 2c, d) কার্ডিয়াক চক্রের সময় এবং সিস্টোল এবং ডায়াস্টোল (চিত্র 2b) এর সময় প্রসারিত হওয়ার সাথে মিলে যায়।সংকোচন এবং শিথিলকরণের সময় কার্ডিয়াক টিস্যুর প্রসারিত এবং বেগ সংস্কৃতিতে 12 দিন ধরে স্থির থাকে (চিত্র 2f)।সংস্কৃতির সময় সংকোচনশীলতার উপর বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার প্রভাব মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা একটি শেডিং অ্যালগরিদম (পরিপূরক চিত্র 2a,b) ব্যবহার করে সক্রিয় বিকৃতি নির্ধারণের জন্য একটি পদ্ধতি তৈরি করেছি এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার সাথে এবং ছাড়া বিকৃতির মধ্যে পার্থক্য করতে সক্ষম হয়েছি।হৃদপিণ্ডের একই অংশ (চিত্র 2f)।কাটার চলমান অঞ্চলে (R6-9), বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার অনুপস্থিতির তুলনায় বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার সময় ভোল্টেজ 20% বেশি ছিল, যা সংকোচনমূলক ফাংশনে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার অবদানকে নির্দেশ করে।
বায়ু চেম্বারের চাপ, তরল চেম্বারের চাপ এবং টিস্যু আন্দোলনের পরিমাপের প্রতিনিধি ট্রেসগুলি নিশ্চিত করে যে চেম্বারের চাপ তরল চেম্বারের চাপকে পরিবর্তন করে, যার ফলে টিস্যু স্লাইসের একটি অনুরূপ আন্দোলন হয়।b শতাংশ প্রসারিত (কমলা) এর সাথে সম্পর্কিত টিস্যু বিভাগের শতাংশ প্রসারিত (নীল) এর প্রতিনিধি ট্রেস।c কার্ডিয়াক স্লাইসের পরিমাপ করা গতি গতির পরিমাপিত গতির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ।(d) হৃৎপিণ্ডের একটি স্লাইসে চক্রাকার গতি (নীল রেখা) এবং বেগ (কমলা ডটেড লাইন) এর প্রতিনিধিত্বমূলক ট্রাজেক্টোরি।e চক্র সময়ের পরিমাপ (এন = 19 স্লাইস প্রতি গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে), সংকোচন সময় (n = 19 স্লাইস প্রতি গ্রুপ), শিথিল সময় (n = 19 স্লাইস প্রতি গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে), টিস্যু আন্দোলন (n = 25)।বিভিন্ন শূকর থেকে স্লাইস)/গ্রুপ), পিক সিস্টোলিক বেগ (n = 24(D0), 25(D12) স্লাইস/বিভিন্ন শূকর থেকে গ্রুপ) এবং পিক রিলাক্সেশন রেট (n=24(D0), 25(D12) স্লাইস/গ্রুপ বিভিন্ন শূকর থেকে)।টু-টেইল্ড স্টুডেন্টের টি-টেস্ট কোনো প্যারামিটারে কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখায়নি।f (লাল) এবং (নীল) বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা ছাড়া টিস্যু বিভাগগুলির প্রতিনিধি স্ট্রেন বিশ্লেষণ ট্রেস, একই বিভাগ থেকে টিস্যু বিভাগের দশটি আঞ্চলিক অঞ্চল।নীচের প্যানেলগুলি বিভিন্ন বিভাগ থেকে দশটি অঞ্চলে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা সহ এবং ছাড়া টিস্যু বিভাগে স্ট্রেনের শতাংশের পার্থক্যের পরিমাণ দেখায়। (বিভিন্ন শূকর থেকে n = 8 টি স্লাইস/গ্রুপ, টু-টেইলড স্টুডেন্ট টি-টেস্ট করা হয়; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05)। (বিভিন্ন শূকর থেকে n = 8 টি স্লাইস/গ্রুপ, টু-টেইলড স্টুডেন্ট টি-টেস্ট করা হয়; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05)। (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,01, *p<00,5)। (n = বিভিন্ন শূকর থেকে 8টি বিভাগ/গ্রুপ, দুই-লেজযুক্ত ছাত্রের টি-টেস্ট; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)। （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）। （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）। (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05)। (n = 8 বিভাগ/গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে, দুই-লেজযুক্ত ছাত্রের টি-টেস্ট; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)।ত্রুটি বারগুলি গড় ± আদর্শ বিচ্যুতিকে উপস্থাপন করে।
আমাদের পূর্ববর্তী স্ট্যাটিক বায়োমিমেটিক হার্ট স্লাইস কালচার সিস্টেমে [20, 21], আমরা বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রয়োগ করে এবং মাঝারি সংমিশ্রণকে অপ্টিমাইজ করে 6 দিনের জন্য হার্টের টুকরোগুলির কার্যকারিতা, কার্যকারিতা এবং কাঠামোগত অখণ্ডতা বজায় রেখেছিলাম।যাইহোক, 10 দিন পরে, এই পরিসংখ্যানগুলি দ্রুত হ্রাস পেয়েছে।আমরা আমাদের পূর্ববর্তী স্ট্যাটিক বায়োমিমেটিক কালচার সিস্টেম 20, 21 কন্ট্রোল কন্ডিশনে (Ctrl) সংস্কৃত বিভাগগুলিকে উল্লেখ করব এবং আমরা আমাদের পূর্বে অপ্টিমাইজ করা মাধ্যমটিকে MC শর্ত এবং যুগপত যান্ত্রিক এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার (CTCM) অধীনে সংস্কৃতি হিসাবে ব্যবহার করব।ডাকাপ্রথমত, আমরা নির্ধারণ করেছি যে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা ছাড়া যান্ত্রিক উদ্দীপনা 6 দিনের জন্য টিস্যুর কার্যকারিতা বজায় রাখার জন্য অপর্যাপ্ত ছিল (পরিপূরক চিত্র 3a,b)।মজার বিষয় হল, STCM ব্যবহার করে ফিজিও-মেকানিক্যাল এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রবর্তনের সাথে, 12-দিনের হার্টের অংশগুলির কার্যকারিতা MS অবস্থার অধীনে তাজা হার্ট বিভাগের মতোই ছিল, কিন্তু Ctrl অবস্থার অধীনে নয়, MTT বিশ্লেষণ (চিত্র 1) দ্বারা দেখানো হয়েছে।3a)।এটি পরামর্শ দেয় যে কার্ডিয়াক চক্রের যান্ত্রিক উদ্দীপনা এবং সিমুলেশন টিস্যু বিভাগগুলিকে আমাদের আগের স্ট্যাটিক কালচার সিস্টেমে রিপোর্টের চেয়ে দ্বিগুণ সময়ের জন্য কার্যকর রাখতে পারে।যাইহোক, কার্ডিয়াক ট্রপোনিন টি এবং কনেক্সিন 43 এর ইমিউনোলেবেলিং দ্বারা টিস্যু বিভাগের কাঠামোগত অখণ্ডতার মূল্যায়ন দেখায় যে একই দিনে নিয়ন্ত্রণের তুলনায় 12 তম দিনে এমসি টিস্যুতে কনেক্সিন 43 এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল।যাইহোক, ইউনিফর্ম কননেক্সিন 43 এক্সপ্রেশন এবং জেড-ডিস্ক গঠন সম্পূর্ণরূপে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়নি (চিত্র 3বি)।আমরা একটি কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা (AI) ফ্রেমওয়ার্ক ব্যবহার করি টিস্যু স্ট্রাকচারাল ইন্টিগ্রিটি 26, একটি ইমেজ-ভিত্তিক ডিপ লার্নিং পাইপলাইন যা ট্রোপোনিন-টি এবং কননেক্সিন স্টেনিং 43 এর উপর ভিত্তি করে স্বয়ংক্রিয়ভাবে স্থানীয়করণের শক্তির পরিপ্রেক্ষিতে হার্টের স্লাইসের কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং ফ্লুরোসেন্স পরিমাপ করতে।এই পদ্ধতিটি একটি কনভোল্যুশনাল নিউরাল নেটওয়ার্ক (CNN) এবং একটি গভীর শিক্ষার কাঠামো ব্যবহার করে একটি স্বয়ংক্রিয় এবং নিরপেক্ষ পদ্ধতিতে কার্ডিয়াক টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতাকে নির্ভরযোগ্যভাবে পরিমাপ করতে, যেমনটি রেফারেন্সে বর্ণিত হয়েছে।26. স্ট্যাটিক কন্ট্রোল বিভাগের তুলনায় MC টিস্যু 0 দিনের তুলনায় উন্নত কাঠামোগত মিল দেখিয়েছে।উপরন্তু, ম্যাসনের ট্রাইক্রোম স্টেনিং সংস্কৃতির 12 তম দিনে (চিত্র 3c) নিয়ন্ত্রণ অবস্থার তুলনায় এমএস অবস্থার অধীনে ফাইব্রোসিসের একটি উল্লেখযোগ্যভাবে কম শতাংশ প্রকাশ করেছে।যদিও সিটিসিএম 12 তম দিনে হার্টের টিস্যু বিভাগের কার্যকারিতাকে তাজা হার্টের টিস্যুর মতো একটি স্তরে বাড়িয়েছিল, এটি হৃৎপিণ্ডের বিভাগগুলির কাঠামোগত অখণ্ডতা উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করেনি।
একটি বার গ্রাফটি স্ট্যাটিক কালচার (D12 Ctrl) বা CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 পিসি, এনওএমসি থেকে ভিন্ন উপায়ে পারফর্ম করা হয়েছে) 12 দিনের জন্য তাজা হার্ট স্লাইস (D0) বা হার্ট স্লাইস কালচারের MTT কার্যকারিতার পরিমাণ দেখায়। ##p <0.0001 D0 এর তুলনায় এবং **p <0.01 D12 Ctrl এর তুলনায়)। একটি বার গ্রাফটি স্ট্যাটিক কালচার (D12 Ctrl) অথবা CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl) , 12 (D12) পরীক্ষার বিভিন্ন উপায়ে 12 দিনের জন্য তাজা হার্ট স্লাইস (D0) বা হার্ট স্লাইস কালচারের MTT কার্যক্ষমতার পরিমাপ দেখায়; ###p <0.0001 D0 এর তুলনায় এবং **p <0.01 D12 Ctrl এর তুলনায়)।হিস্টোগ্রামটি স্ট্যাটিক কালচার (D12 কন্ট্রোল) বা CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 কন্ট্রোল) , 12 (D12 MC) বিভিন্ন বিভাগ থেকে একটি পরীক্ষা করা হয়, Agroup/NO-এ পরীক্ষা করা হয়।####p < 0,0001 по сравнению с D0 এবং **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। ####p <0.0001 D0 এর তুলনায় এবং **p <0.01 D12 Ctrl এর তুলনায়)। একটি 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(或新鲜心脏切片) 12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA，进行单向ANOVA，CD0p#01#00p#测试；与D0 l 相比,**p <0.01)। a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心的 中新鲜心的 切片12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p.)হিস্টোগ্রাম তাজা হার্ট সেকশন (D0) বা 12 দিনের জন্য স্ট্যাটিক কালচার (D12 কন্ট্রোল) বা CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 কন্ট্রোল) , 12 (D12 MC) বিভাগ/গ্রুপ থেকে বিভিন্ন এনও-ভিএ টেস্ট, ওয়ানওয়ে টেস্ট;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। ####p <0.0001 D0-এর তুলনায়, **p <0.01 D12 Ctrl-এর তুলনায়)।b Troponin-T (সবুজ), connexin 43 (লাল) এবং DAPI (নীল) সদ্য বিচ্ছিন্ন হৃদয় বিভাগে (D0) বা স্থির অবস্থা (Ctrl) বা CTCM অবস্থার (MC) অধীনে 12 দিনের জন্য সংস্কৃতির প্রতিনিধি ইমিউনোফ্লোরোসেন্স ইমেজ (ব্রাঙ্ক স্কেল = 100 µm)। হার্টের টিস্যু স্ট্রাকচারাল ইন্টিগ্রিটি (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) স্লাইস/গ্রুপের কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা পরিমাপ বিভিন্ন শূকর থেকে প্রতিটি, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p <0.0001 D0 এবং C. ***01 এর তুলনায় D0 এবং ***01 এর তুলনায়। হার্টের টিস্যু স্ট্রাকচারাল ইন্টিগ্রিটি (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) স্লাইস/গ্রুপের কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা পরিমাপ বিভিন্ন শূকর থেকে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p <0.0001 D0 এবং C. ***01 এর তুলনায় D0 এবং ***01 এর তুলনায়। Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5/MCZRP2/MC х свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 এবং ****p < 0,0001 по сравнению Crl D12)। বিভিন্ন শূকর থেকে কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) বিভাগ/গোষ্ঠী দ্বারা কার্ডিয়াক টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা সম্পাদিত; ####p < 0.0001 বনাম D0t.0 এর সাথে D01 এবং D0r01 এর সাথে তুলনা করা হয়েছে।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) বিভিন্ন শূকরের প্রতিটি স্লাইস/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা।比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) স্লাইস/গ্রুপ প্রতিটি বিভিন্ন শূকর, একমুখী ANOVA পরীক্ষা।比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D12MC), й из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 বনাম D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা কার্ডিয়াক টিস্যু (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) সেকশন/গ্রুপ প্রতিটি বিভিন্ন শূকরের কাঠামোগত অখণ্ডতা পরিমাপ করার জন্য, একমুখী ANOVA পরীক্ষা; ####p<0.0001 বনাম .D0 .*d0p <0r01 এর তুলনায় C *** c ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ (স্কেল বেয়ার = 500 µm) (স্কেল বেয়ার = 500 µm) দিয়ে দাগযুক্ত হার্টের টুকরোগুলির জন্য প্রতিনিধি চিত্র (বাম) এবং পরিমাপ (ডান) (n = 10 স্লাইস/বিভিন্ন শূকর থেকে প্রতিটি গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p. ***1 <1 0 এর সাথে তুলনা করা হয়। rl)। c প্রতিনিধি চিত্র (বাম) এবং ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ (স্কেল বেয়ার = 500 µm) (স্কেল বেয়ার = 500 µm) দিয়ে দাগযুক্ত হার্টের টুকরোগুলির জন্য পরিমাণ নির্ধারণ (ডান) (n = 10 টি স্লাইস/বিভিন্ন শূকর থেকে প্রতিটি গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; #### p. ***1 <1 0 এর সাথে তুলনা করা হয়। rl)। গ Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибатебаслева тия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 Dp0,0001 D12 Ctrl с равнению)। c ম্যাসনের ট্রাইক্রোম স্টেন (আনকোটেড স্কেল = 500 µm) দিয়ে দাগযুক্ত হৃদয়ের অংশগুলির প্রতিনিধি চিত্র (বাম) এবং পরিমাণ নির্ধারণ (ডান) (বিভিন্ন শূকর থেকে n = 10 বিভাগ/গ্রুপ, একমুখী আনোভা পরীক্ষা করা হয়েছে; #### p < 0 .0001 এর তুলনায় D001 D. ***01 এর তুলনায় D001)। গ 用ম্যাসন 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度=0m0µm0片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 丛1 C.D. সি 用 ম্যাসন 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 量化 （右） 裸尺度度度度 裸带500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 আনোভা 测试） 0# 0# 縔 0# 0#। ***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）। c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) км) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного дисперсионного #1; нию с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। c ম্যাসনের ট্রাইক্রোম স্টেন (ফাঁকা = 500 µm) (খালি = 500 µm) (n = 10 বিভাগ/গ্রুপ, প্রতিটি আলাদা শূকর থেকে, বৈচিত্র্যের একমুখী বিশ্লেষণ দ্বারা পরীক্ষিত ;### # p <1 0 এর সাথে তুলনা করে ;### # p <1 0. ***1 p <1 0 এর তুলনায় D0. rl)।ত্রুটি বারগুলি গড় ± আদর্শ বিচ্যুতিকে উপস্থাপন করে।
আমরা অনুমান করেছি যে সংস্কৃতির মাধ্যমে ছোট অণু যুক্ত করে, কার্ডিওমায়োসাইট অখণ্ডতা উন্নত করা যেতে পারে এবং সিটিসিএম সংস্কৃতির সময় ফাইব্রোসিস বিকাশ হ্রাস করা যেতে পারে।তাই অল্প সংখ্যক বিভ্রান্তিকর কারণের কারণে আমরা আমাদের স্ট্যাটিক কন্ট্রোল কালচার 20,21 ব্যবহার করে ছোট অণুর জন্য স্ক্রীন করেছি।এই পর্দার জন্য Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), এবং SB431542 (SB) বেছে নেওয়া হয়েছিল।এই ছোট অণুগুলি পূর্বে হাইপিএসসি-সিএম সংস্কৃতিতে সারকোমেরের দৈর্ঘ্য, টি-টিউবুলস এবং পরিবাহী বেগ বাড়িয়ে কার্ডিওমায়োসাইটের পরিপক্কতা প্ররোচিত করতে ব্যবহৃত হয়েছে।উপরন্তু, ডেক্স (একটি গ্লুকোকোর্টিকয়েড) এবং এসবি উভয়ই প্রদাহ 29,30 দমন করতে পরিচিত।অতএব, আমরা পরীক্ষা করেছি যে এই ছোট অণুগুলির একটি বা সংমিশ্রণ হৃৎপিণ্ডের বিভাগগুলির কাঠামোগত অখণ্ডতাকে উন্নত করবে কিনা।প্রাথমিক স্ক্রীনিংয়ের জন্য, প্রতিটি যৌগের ডোজ সাধারণত সেল কালচার মডেলগুলিতে ব্যবহৃত ঘনত্বের উপর ভিত্তি করে নির্বাচন করা হয়েছিল (1 μM Dex27, 100 nM T327, এবং 2.5 μM SB31)।12 দিনের সংস্কৃতির পরে, T3 এবং Dex এর সংমিশ্রণের ফলে সর্বোত্তম কার্ডিওমায়োসাইট কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং ন্যূনতম তন্তুযুক্ত পুনর্নির্মাণ (পরিপূরক চিত্র 4 এবং 5)।উপরন্তু, T3 এবং Dex-এর এই ঘনত্বের দ্বিগুণ বা দ্বিগুণ ব্যবহার স্বাভাবিক ঘনত্বের তুলনায় ক্ষতিকারক প্রভাব তৈরি করে (পরিপূরক চিত্র 6a,b)।
প্রাথমিক স্ক্রীনিংয়ের পরে, আমরা 4টি সংস্কৃতির অবস্থার (চিত্র 4a) একটি মাথা থেকে মাথার তুলনা করেছি: Ctrl: আমাদের অপ্টিমাইজ করা মাধ্যম ব্যবহার করে আমাদের পূর্বে বর্ণিত স্ট্যাটিক সংস্কৃতিতে সংষ্কৃত হার্ট বিভাগগুলি;20.21 TD: T3 এবং Ctrl s যুক্ত ডেক্স বুধবার;MC: আমাদের পূর্বে অপ্টিমাইজ করা মাধ্যম ব্যবহার করে CTCM-এ হৃদপিণ্ডের বিভাগগুলিকে সংস্কৃত করা হয়েছে;এবং MT: T3 এবং Dex সহ CTCM মিডিয়ামে যোগ করা হয়েছে।চাষের 12 দিন পরে, এমএস এবং এমটি টিস্যুগুলির কার্যকারিতা এমটিটি অ্যাসে (চিত্র 4বি) দ্বারা মূল্যায়ন করা তাজা টিস্যুগুলির মতোই ছিল।মজার বিষয় হল, ট্রান্সওয়েল কালচারে (টিডি) T3 এবং ডেক্স যুক্ত করার ফলে Ctrl অবস্থার তুলনায় কার্যকারিতার উল্লেখযোগ্য উন্নতি হয়নি, যা হার্টের অংশগুলির কার্যকারিতা বজায় রাখার ক্ষেত্রে যান্ত্রিক উদ্দীপনার একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা নির্দেশ করে।
12 দিনের জন্য যান্ত্রিক উদ্দীপনা এবং T3/Dex সাপ্লিমেন্টেশনের প্রভাবগুলি মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত চারটি সংস্কৃতির অবস্থার চিত্রিত একটি পরীক্ষামূলক নকশা চিত্র। b বার গ্রাফটি তাজা হার্টের টুকরো (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), 12 (D12 pigs, MC, 12, 12, 12, 12, 12, 12, 12 পিস-ভিএ-এমসি-ভিএ পরীক্ষা করা হয়েছে। ##p <0.0001, ###p <0.001 D0 এর তুলনায় এবং **p <0.01 D12 Ctrl এর তুলনায়)। b বার গ্রাফটি তাজা হার্টের টুকরো (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), 12 (D12 pigs, MC, 12, 12, 12, 12, 12, 12, 12 পিস-ভিএ-এমসি-ভিএ পরীক্ষা করা হয়েছে। ##p <0.0001, ###p <0.001 D0 এর তুলনায় এবং **p <0.01 D12 ctrl এর তুলনায়)। b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 , TD, MC এবং MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), 12 (D12 MC срезами сеrdца) й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению сr2l1)। b বার গ্রাফটি তাজা হার্ট সেকশন (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, এবং D12 MT), 12 (D12 Ctrl, D12 TD, এবং D12 MT), 12 (D12, <#pgs, <#pgs, <#p, 12-এমসি, <#pgs, <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<< 0.0001, ###p < 0.001 বনাম D0 এবং **p < 0.01 D12 Ctrl-এর তুলনায়)। b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、D0) (n = 18 (D0r1) (D1l)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0.0D12 <0.0D01，###p <0.0D0** 2控制)।b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (কোনট্রোল, টিডি, এমসি এবং এমটি) 2 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,0,01** по сравнению с контролем D12)। b হিস্টোগ্রাম 4টি সংস্কৃতির অবস্থা (নিয়ন্ত্রণ, TD, MC এবং MT) দেখাচ্ছে তাজা হার্ট সেকশন (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), বিভিন্ন শূকর থেকে 12 (D12 MC) বিভাগ/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা, #0p<#0p<#0p.<#0p<#0p. 0, **p<0.01 বনাম নিয়ন্ত্রণ D12)। c বার গ্রাফটি 4টি সংস্কৃতির অবস্থার (Ctrl, TD, MC, এবং MT) কালচারের পরে 12 দিনের মধ্যে গ্লুকোজ ফ্লাক্সের পরিমাপ দেখায় তাজা হার্ট স্লাইস (D0) (n = 6 স্লাইস/বিভিন্ন শূকর থেকে গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ###p <0.01 এর সাথে তুলনা করা হয়। ) c বার গ্রাফটি 4টি সংস্কৃতির অবস্থার (Ctrl, TD, MC, এবং MT) কালচারের পরে 12 দিনের মধ্যে গ্লুকোজ ফ্লাক্সের পরিমাপ দেখায় তাজা হার্ট স্লাইস (D0) (n = 6 স্লাইস/বিভিন্ন শূকর থেকে গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ###p <0.01 এর সাথে তুলনা করা হয়। ) c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усех , усех 4 усенкульвает MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний свиней, односторонний со свежими срезами сердца (D0) по сравнению с D0 এবং ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। c হিস্টোগ্রাম 4টি সংস্কৃতির অবস্থার (নিয়ন্ত্রণ, TD, MC এবং MT) সমস্ত 4টি সংস্কৃতির অবস্থার (নিয়ন্ত্রণ, TD, MC এবং MT) অধীনে 12 দিনের পরে গ্লুকোজ ফ্লাক্সের পরিমাণ দেখায় (D0) (n = 6 বিভাগ/বিভিন্ন শূকর থেকে গোষ্ঠী, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে ; ###p <0.001 D0 এবং D0r এর তুলনায় C ***1 l <0.001)। c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片的(D0) 相比养切 片通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比 ，与D0 相比 0.001,D0 0. )। সি 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 心脏 切片 切片 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 猪 猪单 ， ， 猪 猪单向执 踯0 相比, ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）। c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всеховирования , 4 TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонный свежими срезами сердца (D0) 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль)। c হিস্টোগ্রাম 12 দিনের জন্য কালচার-পরবর্তী সময়ে 4টি সংস্কৃতির অবস্থার (নিয়ন্ত্রণ, TD, MC, এবং MT) জন্য তাজা হার্ট সেকশন (D0) (n = 6 বিভাগ/গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে একতরফা ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছিল, D00, ***1 p <0.0, 0.01 এর তুলনায় D00, ***1) এর তুলনায়।d টাটকা (নীল), দিন 12 MC (সবুজ), এবং দিন 12 MT (লাল) টিস্যুগুলির দশটি আঞ্চলিক টিস্যু সেকশন পয়েন্টে স্ট্রেন বিশ্লেষণ প্লট (n = 4 স্লাইস/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা; গ্রুপগুলির মধ্যে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না)।e আগ্নেয়গিরির প্লট 10-12 দিনের জন্য স্থির অবস্থা (Ctrl) বা MT অবস্থার (MT) অধীনে সংষ্কৃত হৃদযন্ত্রের অংশগুলির তুলনায় তাজা হার্ট বিভাগে (D0) ভিন্নভাবে প্রকাশিত জিন দেখাচ্ছে।f হৃদপিণ্ডের অংশগুলির জন্য সারকোমের জিনের হিটম্যাপ প্রতিটি সংস্কৃতির অবস্থার অধীনে সংস্কৃত।ত্রুটি বারগুলি গড় ± আদর্শ বিচ্যুতিকে উপস্থাপন করে।
ফ্যাটি অ্যাসিড অক্সিডেশন থেকে গ্লাইকোলাইসিসে পরিবর্তনের উপর বিপাক নির্ভরতা কার্ডিওমায়োসাইট ডিফারেনশিয়ানের একটি বৈশিষ্ট্য।অপরিণত কার্ডিওমায়োসাইটগুলি প্রাথমিকভাবে এটিপি উৎপাদনের জন্য গ্লুকোজ ব্যবহার করে এবং তাদের হাইপোপ্লাস্টিক মাইটোকন্ড্রিয়া থাকে যার কয়েকটি ক্রিস্টা 5,32 থাকে।গ্লুকোজ ব্যবহার বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে MC এবং MT অবস্থার অধীনে, গ্লুকোজ ব্যবহার 0 টিস্যুতে (চিত্র 4c) দিনের মতো ছিল।যাইহোক, Ctrl নমুনাগুলি তাজা টিস্যুর তুলনায় গ্লুকোজ ব্যবহারে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি দেখিয়েছে।এটি ইঙ্গিত দেয় যে CTCM এবং T3/Dex এর সংমিশ্রণ টিস্যুর কার্যকারিতা বাড়ায় এবং 12-দিনের সংস্কৃত হার্ট বিভাগের বিপাকীয় ফেনোটাইপ সংরক্ষণ করে।উপরন্তু, স্ট্রেন বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে এমটি এবং এমএস অবস্থার অধীনে 12 দিনের জন্য তাজা হার্ট টিস্যুতে স্ট্রেনের মাত্রা একই ছিল (চিত্র 4d)।
কার্ডিয়াক স্লাইস টিস্যুর গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপশনাল ল্যান্ডস্কেপে সিটিসিএম এবং টি 3/ডেক্সের সামগ্রিক প্রভাব বিশ্লেষণ করতে, আমরা চারটি ভিন্ন সংস্কৃতির অবস্থা থেকে কার্ডিয়াক স্লাইসে RNAseq সম্পাদন করেছি (পরিপূরক ডেটা 1)।মজার বিষয় হল, MT বিভাগগুলি 13,642 টি জিনের মধ্যে শুধুমাত্র 16টি ভিন্নভাবে প্রকাশ করে তাজা হার্ট টিস্যুর সাথে উচ্চ ট্রান্সক্রিপশনাল মিল দেখায়।যাইহোক, যেমন আমরা আগে দেখিয়েছি, Ctrl স্লাইসগুলি 10-12 দিন সংস্কৃতিতে (চিত্র 4e) পরে 1229টি ভিন্নভাবে প্রকাশিত জিন প্রদর্শন করে।এই তথ্যগুলি হার্ট এবং ফাইব্রোব্লাস্ট জিনের qRT-PCR দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 7a-c)।মজার বিষয় হল, Ctrl বিভাগগুলি কার্ডিয়াক এবং কোষ চক্রের জিনগুলির হ্রাস এবং প্রদাহজনক জিন প্রোগ্রামগুলির সক্রিয়করণ দেখিয়েছে।এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে বিভেদ, যা সাধারণত দীর্ঘমেয়াদী সংস্কৃতির পরে ঘটে, সম্পূর্ণরূপে MT অবস্থার অধীনে হ্রাস পায় (পরিপূরক চিত্র 8a,b)।সারকোমের জিনগুলির যত্ন সহকারে অধ্যয়ন দেখায় যে শুধুমাত্র এমটি অবস্থার অধীনেই সারকোমেরে (চিত্র 4f) এবং আয়ন চ্যানেল (পরিপূরক চিত্র 9) এনকোড করা জিনগুলি সংরক্ষণ করা হয়, Ctrl, TD, এবং MC অবস্থার অধীনে তাদের দমন থেকে রক্ষা করে।এই তথ্যগুলি দেখায় যে যান্ত্রিক এবং হিউমোরাল স্টিমুলেশন (T3/Dex) এর সংমিশ্রণে, হার্ট স্লাইস ট্রান্সক্রিপ্টোম সংস্কৃতির 12 দিন পরে তাজা হার্টের টুকরোগুলির মতো থাকতে পারে।
এই ট্রান্সক্রিপশনাল ফলাফলগুলি এই সত্য দ্বারা সমর্থিত যে হৃদয় বিভাগে কার্ডিওমায়োসাইটের কাঠামোগত অখণ্ডতা এমটি অবস্থার অধীনে 12 দিনের জন্য সর্বোত্তমভাবে সংরক্ষিত হয়, যেমনটি অক্ষত এবং স্থানীয়করণ 43 (চিত্র 5a) দ্বারা দেখানো হয়েছে।উপরন্তু, MT অবস্থার অধীনে হৃদযন্ত্রের ফাইব্রোসিস Ctrl এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে এবং তাজা হার্ট বিভাগের অনুরূপ (চিত্র 5b)।এই তথ্যগুলি দেখায় যে যান্ত্রিক উদ্দীপনা এবং T3/Dex চিকিত্সার সংমিশ্রণ সংস্কৃতিতে হৃদযন্ত্রের অংশগুলিতে কার্যকরভাবে কার্ডিয়াক কাঠামো সংরক্ষণ করে।
ট্রপোনিন-টি (সবুজ), কননেক্সিন 43 (লাল) এবং ডিএপিআই (নীল) এর একটি প্রতিনিধিত্বমূলক ইমিউনোফ্লোরোসেন্স চিত্রগুলি সদ্য বিচ্ছিন্ন হার্ট সেকশনে (D0) বা 12 দিনের জন্য চারটি হার্ট সেকশন কালচার অবস্থায় (স্কেল বার = 100 μm)।) হার্ট টিস্যু স্ট্রাকচারাল ইন্টিগ্রিটি (n = 7 (D0 এবং D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) স্লাইস/গ্রুপের কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা পরিমাপ বিভিন্ন শূকর থেকে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; ####p <0.00 এবং ***1 এর তুলনায় <*000 এবং ***1। D12 Ctrl-এর তুলনায় 01)। হার্টের টিস্যু স্ট্রাকচারাল ইন্টিগ্রিটির কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা পরিমাপ (n = 7 (D0 এবং D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) স্লাইস/গ্রুপ বিভিন্ন শূকর থেকে, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়; #### p < 0.00 p <*00 এবং ***1 এর তুলনায় <*000 এবং ***1 D12 Ctrl-এর তুলনায় 01)। Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 এবং D12) DMCTD12 , DMCTD12 , DMC22MT , резов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,01, 0,01 2 Ctrl)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা (n = 7 (D0 এবং D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) বিভাগ/গ্রুপ ব্যবহার করে হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর গঠনগত অখণ্ডতার পরিমাপ, বিভিন্ন শূকর থেকে একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; #### p < 0.0001 এবং ***0p <0.001 এর সাথে তুলনা করা হয়েছে। D12 Ctrl এর তুলনায়)।对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 C.0001C对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td （5 （d12 td 、 d12 mc 12 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比 和*p < 0.05 相比**相比)।একমুখী ANOVA পরীক্ষার মাধ্যমে বিভিন্ন শূকর (n = 7 (D0 এবং D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) বিভাগ/গ্রুপ) কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা ব্যবহার করে কার্ডিয়াক টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাপ করা;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 এবং *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। #### p <0.0001 D0 এর তুলনায় এবং *p <0.05 বা ****p <0.0001 D12 Ctrl এর তুলনায়)। b ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ (স্কেল বার = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, এবং D12 MC), 9 (D12 MT) স্লাইসগুলি দ্বারা দাগযুক্ত হার্টের টুকরোগুলির জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছে, 9 (D12 MT) স্লাইসগুলি সম্পাদন করা হয়েছে <#pgs/group থেকে <#pgs/group আলাদা আলাদাভাবে করা হয়েছে। 0001 D0 এবং ***p < 0.001, অথবা ****p < 0.0001 D12 Ctrl-এর তুলনায়)। b ম্যাসনের ট্রাইক্রোম দাগ (স্কেল বার = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, এবং D12 MC), 9 (D12 MT) স্লাইসগুলি দ্বারা দাগযুক্ত হার্টের টুকরোগুলির জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছে, 9 (D12 MT) স্লাইসগুলি সম্পাদন করা হয়েছে <#pgs/group থেকে <#pgs/group আলাদা আলাদাভাবে করা হয়েছে। 0001 D0 এবং ***p < 0.001, অথবা ****p < 0.0001 D12 Ctrl-এর তুলনায়)। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (=0масбаня( 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест #0019; D0 এবং ***p < 0,001 বা ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। b ম্যাসনের ট্রাইক্রোম স্টেন (স্কেল বার = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MC), 9 (D12 MT) বিভাগ/গ্রুপ বিভিন্ন শূকর থেকে দাগযুক্ত হৃদয়ের অংশগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাপ। < 0 এবং ***p < 0.001 বা ****p < 0.0001 বনাম D12 Ctrl)। b 用ম্যাসন 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10D1D2和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.00*1**或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। b 用 ম্যাসন 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） 1d0d0c 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片" 001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная =10Dn) Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по <сравней, ***p <сравней*** 0001 по сравнению с D12 Ctrl)। b ম্যাসনের ট্রাইক্রোম (স্কেল বার = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MC), 9 (D12 MT) বিভিন্ন শূকর/গ্রুপ থেকে কৃত্রিম হৃদযন্ত্রের অংশগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাপ। .001 বা ****p <0.0001 D12 Ctrl এর তুলনায়)।ত্রুটি বারগুলি গড় ± আদর্শ বিচ্যুতিকে উপস্থাপন করে।
অবশেষে, কার্ডিয়াক টিস্যু প্রসারিত করে কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি অনুকরণ করার জন্য সিটিসিএম-এর ক্ষমতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল।CTCM-এ, পিক এয়ার চেম্বারের চাপ 80 mmHg থেকে 80 mmHg পর্যন্ত বেড়েছে।শিল্প.(সাধারণ প্রসারিত) 140 mmHg আর্ট পর্যন্ত।(চিত্র 6a)।এটি স্ট্রেচের 32% বৃদ্ধির সাথে মিলে যায় (চিত্র 6বি), যা পূর্বে হাইপারট্রফিতে দেখা যায় এমন একটি সারকোমের দৈর্ঘ্য অর্জনের জন্য হার্টের অংশগুলির জন্য প্রয়োজনীয় সংশ্লিষ্ট শতাংশ প্রসারিত হিসাবে দেখানো হয়েছিল।সংকোচন এবং শিথিলকরণের সময় কার্ডিয়াক টিস্যুর প্রসারিত এবং বেগ সংস্কৃতির ছয় দিনের সময় স্থির থাকে (চিত্র 6c)।এমটি অবস্থা থেকে কার্ডিয়াক টিস্যু ছয় দিনের জন্য স্বাভাবিক প্রসারিত (এমটি (সাধারণ)) বা ওভারস্ট্রেচ অবস্থার (এমটি (ওএস)) অধীন ছিল।ইতিমধ্যে চার দিন সংস্কৃতির পরে, হাইপারট্রফিক বায়োমার্কার NT-ProBNP MT (ওএস) অবস্থার অধীনে MT (সাধারণ) অবস্থার (চিত্র 7a) তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত হয়েছে।উপরন্তু, ছয় দিন চাষ করার পর, MT (OS) (চিত্র 7b) এ কোষের আকার MT হৃদযন্ত্রের (স্বাভাবিক) অংশের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পায়।উপরন্তু, NFATC4 পারমাণবিক ট্রান্সলোকেশন ওভারস্ট্রেচড টিস্যুতে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 7c)।এই ফলাফলগুলি হাইপারডিসটেনশনের পরে প্যাথলজিকাল রিমডেলিংয়ের প্রগতিশীল বিকাশ দেখায় এবং এই ধারণাটিকে সমর্থন করে যে সিটিসিএম ডিভাইসটি প্রসারিত-প্ররোচিত কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি সিগন্যালিং অধ্যয়নের জন্য একটি প্ল্যাটফর্ম হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে।
বায়ু চেম্বারের চাপ, তরল চেম্বারের চাপ এবং টিস্যু আন্দোলনের পরিমাপের প্রতিনিধি ট্রেসগুলি নিশ্চিত করে যে চেম্বারের চাপ তরল চেম্বারের চাপকে পরিবর্তন করে, যার ফলে টিস্যু স্লাইসের একটি অনুরূপ আন্দোলন হয়।b সাধারণত প্রসারিত (কমলা) এবং অতিরিক্ত প্রসারিত (নীল) টিস্যু বিভাগগুলির জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক প্রসারিত শতাংশ এবং প্রসারিত হার বক্ররেখা।c বার গ্রাফটি চক্রের সময় দেখাচ্ছে (n = 19 স্লাইস প্রতি গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে), সংকোচনের সময় (n = 18-19 স্লাইস প্রতি গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে), শিথিল করার সময় (n = 19 স্লাইস প্রতি গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে) ), টিস্যু চলাচলের প্রশস্ততা (n = 14 স্লাইস, বিভিন্ন পিগস্টোক 14 স্লাইস, বিভিন্ন পিগ থেকে 19 টি স্লাইস), es/গ্রুপ, বিভিন্ন শূকর থেকে) এবং পিক রিলাক্সেশন রেট (n = 14 (D0), 15 (D6) ) বিভাগ/গ্রুপ) বিভিন্ন শূকর থেকে), টু-টেইল্ড স্টুডেন্টের টি-টেস্ট কোনো প্যারামিটারে কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখায়নি, ইঙ্গিত করে যে ওভারভোল্টেজ সহ সংস্কৃতির 6 দিনের সময় এই প্যারামিটারগুলি স্থির ছিল।ত্রুটি বারগুলি গড় ± আদর্শ বিচ্যুতিকে উপস্থাপন করে।
MT নরমাল স্ট্রেচ (নর্ম) বা ওভার স্ট্রেচিং (OS) অবস্থার অধীনে কালচার করা হার্ট স্লাইস থেকে কালচার মিডিয়াতে NT-ProBNP ঘনত্বের একটি বার গ্রাফ পরিমাপ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, এবং D4 MTOS) স্লাইসগুলি থেকে আলাদা আলাদা পিস/গ্রুপের তুলনা করা হয়। স্বাভাবিক প্রসারিত পর্যন্ত)। MT নরমাল স্ট্রেচ (নর্ম) বা ওভারস্ট্রেচিং (OS) অবস্থার (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, এবং D4 MTOS) স্লাইস থেকে পারফর্ম করা হার্ট স্লাইস থেকে কালচার মিডিয়াতে NT-ProBNP ঘনত্বের একটি বার গ্রাফ পরিমাপ করা হয়েছে। স্বাভাবিক প্রসারিত তুলনায়)।স্বাভাবিক MT স্ট্রেচ (নর্ম) বা ওভারস্ট্রেচ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, এবং D4) এর শর্তে সংস্কৃতির হার্ট স্লাইস থেকে সংস্কৃতি মাধ্যমে NT-ProBNP ঘনত্বের পরিমাণগত হিস্টোগ্রাম।**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)। **p <0.01 স্বাভাবিক প্রসারণের তুলনায়)। একটি 在MT 正常拉伸(নর্ম) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度離坡離MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析＋減減中0p0। )। MT নরমাল স্ট্রেচ (নর্ম) বা ওভার স্ট্রেচ (ওএস) অবস্থার (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) বিভিন্ন 猪的切片猪的切片湄滥以乇片 থেকে হার্টের স্লাইসে NT-ProBNP ঘনত্বের পরিমাণ।发发动; **স্বাভাবিক স্ট্রেচিংয়ের সাথে তুলনা, p <0.01)।হিস্টোগ্রাম স্বাভাবিক MT প্রসারিত (আদর্শ) বা ওভারস্ট্রেচ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) এবং D4 MTOS) স্লাইস/গ্রুপের ভিন্ন ভিন্ন শূকরের দুটি উপায়ে, হৃদপিণ্ডের স্লাইসগুলিতে NT-ProBNP ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)। **p <0.01 স্বাভাবিক প্রসারণের তুলনায়)। b ট্রপোনিন-টি এবং WGA (বাম) দিয়ে দাগযুক্ত হার্টের টুকরোগুলির জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং কোষের আকার পরিমাপ (ডান) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) কোষ/গ্রুপ থেকে বিভিন্ন শূকর থেকে 10টি আলাদা স্লাইস, টু-টেইল্ড স্টুডেন্টের সাথে তুলনা করা হয়। b ট্রপোনিন-টি এবং WGA (বাম) দিয়ে দাগযুক্ত হার্টের স্লাইস এবং কোষের আকার পরিমাপ (ডান) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) কোষ/গ্রুপের বিভিন্ন শূকর থেকে 10টি আলাদা স্লাইসের জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র, টু-টেইল্ড স্টুডেন্টের সাথে তুলনা করা হয়। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения (разображения срезов сердца) MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий, два- проводится хвостовой t-критерий; ению с нормальным растяжением)। b ট্রপোনিন-টি এবং AZP (বাম) এবং কোষের আকারের পরিমাপ (ডান) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) কোষ/গোষ্ঠীর 10টি বিভিন্ন অংশ থেকে বিভিন্ন শূকর, দুই-লেজযুক্ত শিক্ষার্থীর টি-টেইলড স্টুডেন্টের টি-টি-এর সাথে তুলনা করা হয়েছে। b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的心脏切片的代表性图 3MT来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t**检验切片生t 01)। b ক্যালকেয়ারিন-টি এবং ডব্লিউজিএ (বাম) এবং কোষের আকার (ডানে) (n = 330 (D6 MTOS), 10টি ভিন্ন স্লাইস (D6 MTNorm) থেকে 369) কোষের / 组，两方法有 স্বাভাবিক পরীক্ষা ， 组，两方法有 ** পরীক্ষা করা স্বাভাবিক p < 0.0001)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размева (36MT), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0, 0,0,0,00 стяжением)। b ট্রপোনিন-টি এবং AZP (বাম) দিয়ে দাগযুক্ত হৃদপিণ্ডের অংশগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং কোষের আকারের পরিমাপ (ডান) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) বিভিন্ন শূকর থেকে 10টি ভিন্ন বিভাগ থেকে) কোষ/গোষ্ঠী, দুই-টেইলড স্টুডেন্ট মানদণ্ড;****p <0.0001 স্বাভাবিক স্ট্রেনের তুলনায়)। c দিন 0 এবং দিনের 6 MTOS হার্টের স্লাইসগুলির জন্য ট্রপোনিন-টি এবং NFATC4 এর জন্য ইমিউনোলেবেলযুক্ত চিত্র এবং NFATC4-এর CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) স্লাইস/গ্রুপের নিউক্লিয়াতে স্থানান্তরের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছে। c দিন 0 এবং দিনের 6 MTOS হার্ট স্লাইসগুলির জন্য ট্রপোনিন-টি এবং NFATC4 এর জন্য ইমিউনোলেবেলযুক্ত চিত্র এবং NFATC4 এর CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) স্লাইস/গ্রুপের নিউক্লিয়াতে স্থানান্তরের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছে। c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-T এবং NFATC4, инконестина срезов сердца FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний , Свиполняется двусторонний; c 0 এবং 6 দিনের MTOS-এ হৃদযন্ত্রের অংশগুলির জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র, ট্রপোনিন-টি এবং NFATC4-এর জন্য ইমিউনোলেবেলযুক্ত, এবং গুহা কোষের নিউক্লিয়াসে NFATC4 ট্রান্সলোকেশনের পরিমাপ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) স্লাইস/গ্রুপ থেকে দুটি ভিন্ন শূকর-পুচ্ছ করা ছাত্রদের দ্বারা সঞ্চালিত;*p <0.05)। c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表的代表的片的代表性图像茻代表性图像茻代表性图像，代表的代表的片的代表性图像，代表性图像。易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <.0. বিভিন্ন NFATC4 易位至CM কোষের নিউক্লিয়াসের পরিমাণ 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0)) 化 (n = 4 (D0) 第0天和第6天MTOS হৃদপিণ্ডের টুকরো এবং NFATC4 ইমিউনোলেবেলিং 第0天和第6天MTOS হার্টের টুকরাগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র间双尾学生et 电影；*p < ০.০৫)। c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 এবং NFATC4 এবং конличацов сердца MTOS в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05)। c বিভিন্ন শূকর (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) স্লাইস/গ্রুপ/গ্রুপ, 3 (D6 MTOS) স্লাইস/গ্রুপ, ট্রপোনিন-টি এবং NFATC4 ইমিউনোলেবেলিং এবং CM এর নিউক্লিয়াসে NFATC4 ট্রান্সলোকেশনের পরিমাণ নির্ধারণের জন্য 0 এবং 6 তম দিনে MTOS হার্টের স্লাইসগুলির প্রতিনিধিত্বমূলক ছবি।ত্রুটি বারগুলি গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি উপস্থাপন করে।
অনুবাদমূলক কার্ডিওভাসকুলার গবেষণার জন্য সেলুলার মডেল প্রয়োজন যা কার্ডিয়াক পরিবেশকে সঠিকভাবে পুনরুত্পাদন করে।এই গবেষণায়, একটি CTCM ডিভাইস তৈরি করা হয়েছে এবং বৈশিষ্ট্যযুক্ত যা হৃৎপিণ্ডের আল্ট্রাথিন অংশগুলিকে উদ্দীপিত করতে পারে।CTCM সিস্টেমে শারীরবৃত্তীয়ভাবে সিঙ্ক্রোনাইজড ইলেক্ট্রোমেকানিকাল উদ্দীপনা এবং T3 এবং ডেক্স ফ্লুইড সমৃদ্ধকরণ অন্তর্ভুক্ত রয়েছে।যখন পোর্সিন হার্টের অংশগুলি এই কারণগুলির সংস্পর্শে আসে, তখন তাদের কার্যক্ষমতা, কাঠামোগত অখণ্ডতা, বিপাকীয় কার্যকলাপ এবং ট্রান্সক্রিপশনাল এক্সপ্রেশন 12 দিনের সংস্কৃতির পরে তাজা হার্টের টিস্যুর মতোই ছিল।উপরন্তু, কার্ডিয়াক টিস্যু অত্যধিক প্রসারিত hyperextension দ্বারা সৃষ্ট হৃদপিণ্ডের হাইপারট্রফি হতে পারে।সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি একটি স্বাভাবিক কার্ডিয়াক ফেনোটাইপ বজায় রাখতে শারীরবৃত্তীয় সংস্কৃতির অবস্থার গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকাকে সমর্থন করে এবং ড্রাগ স্ক্রীনিংয়ের জন্য একটি প্ল্যাটফর্ম সরবরাহ করে।
কার্ডিওমায়োসাইটের কার্যকারিতা এবং বেঁচে থাকার জন্য একটি সর্বোত্তম পরিবেশ তৈরিতে অনেক কারণ অবদান রাখে।এই কারণগুলির মধ্যে সবচেয়ে সুস্পষ্ট হল (1) আন্তঃকোষীয় মিথস্ক্রিয়া, (2) ইলেক্ট্রোমেকানিকাল উদ্দীপনা, (3) হিউমারাল ফ্যাক্টর এবং (4) বিপাকীয় স্তরগুলির সাথে সম্পর্কিত।শারীরবৃত্তীয় কোষ থেকে কোষের মিথস্ক্রিয়াগুলির জন্য একটি বহিরাগত ম্যাট্রিক্স দ্বারা সমর্থিত একাধিক কোষের জটিল ত্রিমাত্রিক নেটওয়ার্কের প্রয়োজন হয়।এই ধরনের জটিল সেলুলার মিথস্ক্রিয়াগুলি পৃথক কোষের প্রকারের সহ-সংস্কৃতি দ্বারা ভিট্রোতে পুনর্গঠন করা কঠিন, তবে হৃদয় বিভাগের অর্গানোটাইপিক প্রকৃতি ব্যবহার করে সহজেই অর্জন করা যেতে পারে।
কার্ডিয়াক ফেনোটাইপ 33,34,35 বজায় রাখার জন্য কার্ডিওমায়োসাইটের যান্ত্রিক প্রসারিত এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা গুরুত্বপূর্ণ।যদিও হাইপিএসসি-সিএম কন্ডিশনার এবং পরিপক্কতার জন্য যান্ত্রিক উদ্দীপনা ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়েছে, বেশ কয়েকটি মার্জিত গবেষণা সম্প্রতি ইউনিঅ্যাক্সিয়াল লোডিং ব্যবহার করে সংস্কৃতিতে হার্টের টুকরোগুলির যান্ত্রিক উদ্দীপনার চেষ্টা করেছে।এই গবেষণাগুলি দেখায় যে 2D অক্ষীয় যান্ত্রিক লোডিং সংস্কৃতির সময় হৃদয়ের ফিনোটাইপের উপর ইতিবাচক প্রভাব ফেলে।এই গবেষণায়, হার্টের অংশগুলি হয় আইসোমেট্রিক টেনসিল ফোর্স17, লিনিয়ার অক্সোটোনিক লোডিং18 দিয়ে লোড করা হয়েছিল, অথবা ফোর্স ট্রান্সডুসার ফিডব্যাক এবং টেনশন ড্রাইভ ব্যবহার করে কার্ডিয়াক চক্র পুনরায় তৈরি করা হয়েছিল।যাইহোক, এই পদ্ধতিগুলি পরিবেশগত অপ্টিমাইজেশন ছাড়াই অক্ষীয় টিস্যু স্ট্রেচ ব্যবহার করে, যার ফলে অনেক কার্ডিয়াক জিন দমন হয় বা অস্বাভাবিক প্রসারিত প্রতিক্রিয়াগুলির সাথে যুক্ত জিনের অতিরিক্ত এক্সপ্রেশন হয়।এখানে বর্ণিত CTCM একটি 3D ইলেক্ট্রোমেকানিকাল উদ্দীপনা প্রদান করে যা চক্রের সময় এবং শারীরবৃত্তীয় প্রসারণের পরিপ্রেক্ষিতে প্রাকৃতিক কার্ডিয়াক চক্রকে অনুকরণ করে (25% প্রসারিত, 40% সিস্টোল, 60% ডায়াস্টোল এবং প্রতি মিনিটে 72 বীট)।যদিও এই ত্রিমাত্রিক যান্ত্রিক উদ্দীপনা একা টিস্যুর অখণ্ডতা বজায় রাখার জন্য যথেষ্ট নয়, টিস্যুর কার্যকারিতা, কার্যকারিতা এবং অখণ্ডতা পর্যাপ্তভাবে বজায় রাখার জন্য T3/Dex ব্যবহার করে হিউমারাল এবং যান্ত্রিক উদ্দীপনার সংমিশ্রণ প্রয়োজন।
প্রাপ্তবয়স্কদের হার্টের ফিনোটাইপকে সংশোধন করার ক্ষেত্রে হাস্যকর উপাদানগুলি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে।এটি হাইপিএস-সিএম স্টাডিতে হাইলাইট করা হয়েছিল যেখানে কোষের পরিপক্কতা ত্বরান্বিত করার জন্য সংস্কৃতি মিডিয়াতে টি 3 এবং ডেক্স যুক্ত করা হয়েছিল।T3 কোষের ঝিল্লি জুড়ে অ্যামিনো অ্যাসিড, শর্করা এবং ক্যালসিয়াম পরিবহনকে প্রভাবিত করতে পারে36।এছাড়াও, T3 MHC-α এক্সপ্রেশন এবং MHC-β ডাউনরেগুলেশনকে উৎসাহিত করে, ভ্রূণের সিএম-এ ধীরগতির টুইচ মায়োফাইব্রিলের তুলনায় পরিণত কার্ডিওমায়োসাইটগুলিতে দ্রুত টুইচ মায়োফাইব্রিল গঠনের প্রচার করে।হাইপোথাইরয়েড রোগীদের মধ্যে T3 এর ঘাটতির ফলে মায়োফাইব্রিলার ব্যান্ড নষ্ট হয়ে যায় এবং স্বর বিকাশের হার কমে যায়37।ডেক্স গ্লুকোকোর্টিকয়েড রিসেপ্টরগুলির উপর কাজ করে এবং বিচ্ছিন্ন পারফিউজড হার্টে মায়োকার্ডিয়াল সংকোচন বৃদ্ধি করতে দেখা গেছে;38 এই উন্নতি ক্যালসিয়াম ডিপোজিট-চালিত এন্ট্রি (SOCE) 39,40 এর উপর প্রভাবের সাথে সম্পর্কিত বলে মনে করা হয়।এছাড়াও, ডেক্স এর রিসেপ্টরগুলির সাথে আবদ্ধ হয়, যার ফলে একটি বিস্তৃত অন্তঃকোষীয় প্রতিক্রিয়া হয় যা প্রতিরোধ ক্ষমতা এবং প্রদাহকে দমন করে30।
আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে শারীরিক যান্ত্রিক উদ্দীপনা (MS) Ctrl-এর তুলনায় সামগ্রিক সংস্কৃতি কর্মক্ষমতা উন্নত করেছে, কিন্তু সংস্কৃতিতে 12 দিনের মধ্যে কার্যক্ষমতা, কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং কার্ডিয়াক এক্সপ্রেশন বজায় রাখতে ব্যর্থ হয়েছে।Ctrl-এর তুলনায়, CTCM (MT) সংস্কৃতিতে T3 এবং Dex যোগ করার ফলে কার্যক্ষমতার উন্নতি হয়েছে এবং একই রকম ট্রান্সক্রিপশন প্রোফাইল, কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং 12 দিনের জন্য তাজা হার্ট টিস্যু সহ বিপাকীয় কার্যকলাপ বজায় রাখা হয়েছে।এছাড়াও, টিস্যু স্ট্রেচের মাত্রা নিয়ন্ত্রণ করে, STCM ব্যবহার করে একটি হাইপারএক্সটেনশন-প্ররোচিত কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি মডেল তৈরি করা হয়েছিল, যা STCM সিস্টেমের বহুমুখিতাকে চিত্রিত করে।এটি উল্লেখ করা উচিত যে যদিও কার্ডিয়াক রিমডেলিং এবং ফাইব্রোসিস সাধারণত অক্ষত অঙ্গগুলিকে জড়িত করে যার সঞ্চালনকারী কোষগুলি উপযুক্ত সাইটোকাইনগুলির পাশাপাশি ফ্যাগোসাইটোসিস এবং অন্যান্য পুনর্নির্মাণ কারণগুলি প্রদান করতে পারে, তবুও হৃদপিণ্ডের অংশগুলি চাপ এবং আঘাতের প্রতিক্রিয়া হিসাবে ফাইব্রোটিক প্রক্রিয়াটিকে অনুকরণ করতে পারে।মায়োফাইব্রোব্লাস্টে।এটি আগে এই কার্ডিয়াক স্লাইস মডেলে মূল্যায়ন করা হয়েছে।এটা লক্ষ করা উচিত যে টাকাইকার্ডিয়া, ব্র্যাডিকার্ডিয়া, এবং যান্ত্রিক সংবহন সমর্থন (যান্ত্রিক আনলোডেড হার্ট) এর মতো অনেক অবস্থার অনুকরণ করার জন্য চাপ/বৈদ্যুতিক প্রশস্ততা এবং ফ্রিকোয়েন্সি পরিবর্তন করে CTCM প্যারামিটারগুলি পরিবর্তন করা যেতে পারে।এটি ড্রাগ পরীক্ষার জন্য সিস্টেমটিকে একটি মাঝারি থ্রুপুট করে তোলে।অতিরিক্ত পরিশ্রম-প্ররোচিত কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি মডেল করার জন্য CTCM এর ক্ষমতা ব্যক্তিগতকৃত থেরাপির জন্য এই সিস্টেমটি পরীক্ষা করার পথ প্রশস্ত করে।উপসংহারে, বর্তমান গবেষণাটি দেখায় যে যান্ত্রিক প্রসারিত এবং হাস্যকর উদ্দীপনা কার্ডিয়াক টিস্যু বিভাগের সংস্কৃতি বজায় রাখার জন্য গুরুত্বপূর্ণ।
যদিও এখানে উপস্থাপিত ডেটা প্রস্তাব করে যে সিটিসিএম অক্ষত মায়োকার্ডিয়াম মডেলিংয়ের জন্য একটি খুব প্রতিশ্রুতিশীল প্ল্যাটফর্ম, এই সংস্কৃতি পদ্ধতির কিছু সীমাবদ্ধতা রয়েছে।CTCM সংস্কৃতির প্রধান সীমাবদ্ধতা হল এটি স্লাইসগুলিতে ক্রমাগত গতিশীল যান্ত্রিক চাপ আরোপ করে, যা প্রতিটি চক্রের সময় কার্ডিয়াক স্লাইস সংকোচন সক্রিয়ভাবে নিরীক্ষণ করার ক্ষমতাকে বাধা দেয়।উপরন্তু, কার্ডিয়াক বিভাগের ছোট আকারের কারণে (7 মিমি), ঐতিহ্যগত বল সেন্সর ব্যবহার করে সংস্কৃতি সিস্টেমের বাইরে সিস্টোলিক ফাংশন মূল্যায়ন করার ক্ষমতা সীমিত।বর্তমান পাণ্ডুলিপিতে, আমরা সংকোচনশীল ফাংশনের একটি সূচক হিসাবে অপটিক্যাল ভোল্টেজ মূল্যায়ন করে এই সীমাবদ্ধতাকে আংশিকভাবে অতিক্রম করি।যাইহোক, এই সীমাবদ্ধতার জন্য আরও কাজের প্রয়োজন হবে এবং ভবিষ্যতে সংস্কৃতিতে হৃদপিণ্ডের স্লাইসের কার্যকারিতার অপটিক্যাল নিরীক্ষণের পদ্ধতি প্রবর্তনের মাধ্যমে সমাধান করা যেতে পারে, যেমন ক্যালসিয়াম এবং ভোল্টেজ-সংবেদনশীল রং ব্যবহার করে অপটিক্যাল ম্যাপিং।CTCM এর আরেকটি সীমাবদ্ধতা হল যে কাজের মডেলটি শারীরবৃত্তীয় চাপ (প্রিলোড এবং আফটারলোড) ম্যানিপুলেট করে না।সিটিসিএম-এ, খুব বড় টিস্যুতে ডায়াস্টোল (সম্পূর্ণ প্রসারিত) এবং সিস্টোল (বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার সময় সংকোচনের দৈর্ঘ্য) 25% শারীরবৃত্তীয় প্রসারণ পুনরুত্পাদনের জন্য বিপরীত দিকে চাপ প্ররোচিত হয়েছিল।উভয় দিক থেকে কার্ডিয়াক টিস্যুতে পর্যাপ্ত চাপ দিয়ে এবং হৃৎপিণ্ডের চেম্বারে ঘটে যাওয়া সঠিক চাপ-ভলিউম সম্পর্ক প্রয়োগ করে ভবিষ্যতের সিটিসিএম ডিজাইনে এই সীমাবদ্ধতা দূর করা উচিত।
এই পাণ্ডুলিপিতে রিপোর্ট করা ওভারস্ট্রেচ-ইনডিউসড রিমডেলিং হাইপারট্রফিক হাইপারস্ট্রেচ সিগন্যাল নকল করার মধ্যে সীমাবদ্ধ।সুতরাং, এই মডেলটি হিউমারাল বা নিউরাল ফ্যাক্টরগুলির প্রয়োজন ছাড়াই প্রসারিত-প্ররোচিত হাইপারট্রফিক সিগন্যালিং অধ্যয়নে সাহায্য করতে পারে (যা এই সিস্টেমে বিদ্যমান নেই)।CTCM-এর বহুগুণ বাড়ানোর জন্য আরও অধ্যয়নের প্রয়োজন, উদাহরণস্বরূপ, ইমিউন কোষের সাথে সহ-সংস্কৃতি, রক্তরস হিউমোরাল ফ্যাক্টরগুলি সঞ্চালন করা, এবং নিউরোনাল কোষের সাথে সহ-সংস্কৃতির সময় উদ্ভাবন CTCM-এর সাথে রোগের মডেলিংয়ের সম্ভাবনাকে উন্নত করবে।
এই গবেষণায় তেরটি শূকর ব্যবহার করা হয়েছিল।সমস্ত প্রাণী পদ্ধতি প্রাতিষ্ঠানিক নির্দেশিকা অনুসারে সঞ্চালিত হয়েছিল এবং লুইসভিল ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমাল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল।মহাধমনী খিলান আটকানো ছিল এবং হৃদপিণ্ডটি 1 L জীবাণুমুক্ত কার্ডিওপ্লিজিয়া (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL হেপারিন, pH 4 পর্যন্ত) দিয়ে পারফিউজ করা হয়েছিল; হৃৎপিণ্ডগুলিকে বরফ-ঠাণ্ডা কার্ডিওপ্লেজিক দ্রবণে সংরক্ষণ করা হয় যতক্ষণ না বরফের উপর ল্যাবে পরিবহন করা হয় যা সাধারণত <10 মিনিট। হৃৎপিণ্ডগুলিকে বরফ-ঠাণ্ডা কার্ডিওপ্লেজিক দ্রবণে সংরক্ষণ করা হয় যতক্ষণ না বরফের উপর ল্যাবে পরিবহন করা হয় যা সাধারণত <10 মিনিট। сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. বরফের উপর পরীক্ষাগারে পরিবহন না করা পর্যন্ত হার্ট বরফ-ঠান্ডা কার্ডিওপ্লেজিক দ্রবণে সংরক্ষণ করা হয়, যা সাধারণত <10 মিনিট সময় নেয়।将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. বরফের উপর পরীক্ষাগারে পরিবহন না করা পর্যন্ত হৃদপিন্ডকে বরফ কার্ডিওপ্লেজিয়ায় রাখুন, সাধারণত <10 মিনিট।
CTCM ডিভাইসটি সলিডওয়ার্কস কম্পিউটার-এডেড ডিজাইন (CAD) সফ্টওয়্যারে তৈরি করা হয়েছিল।সংস্কৃতি চেম্বার, ডিভাইডার এবং এয়ার চেম্বারগুলি সিএনসি পরিষ্কার এক্রাইলিক প্লাস্টিকের তৈরি।7 মিমি ব্যাস ব্যাক-আপ রিংটি কেন্দ্রে উচ্চ ঘনত্বের পলিথিন (HDPE) দিয়ে তৈরি এবং নীচে মিডিয়া সিল করার জন্য ব্যবহৃত সিলিকন ও-রিং মিটমাট করার জন্য একটি ও-রিং খাঁজ রয়েছে।একটি পাতলা সিলিকা ঝিল্লি বিচ্ছেদ প্লেট থেকে সংস্কৃতি চেম্বারকে আলাদা করে।সিলিকন ঝিল্লিটি 0.02″ পুরু সিলিকন শীট থেকে লেজার কাটা এবং এর কঠোরতা 35A।নীচে এবং উপরের সিলিকন গ্যাসকেটগুলি 1/16″ পুরু সিলিকন শীট থেকে লেজার কাটা এবং 50A এর কঠোরতা রয়েছে।316L স্টেইনলেস স্টীল স্ক্রু এবং উইং নাট ব্লক বেঁধে এবং একটি বায়ুরোধী সীল তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়।
একটি ডেডিকেটেড প্রিন্টেড সার্কিট বোর্ড (PCB) C-PACE-EM সিস্টেমের সাথে একীভূত করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে।পিসিবি-তে সুইস মেশিনের সংযোগকারী সকেটগুলি গ্রাফাইট ইলেক্ট্রোডের সাথে সিলভার-প্লেটেড কপার তার এবং ব্রোঞ্জ 0-60 স্ক্রু দিয়ে ইলেক্ট্রোডের সাথে সংযুক্ত থাকে।মুদ্রিত সার্কিট বোর্ড 3D প্রিন্টারের কভারে স্থাপন করা হয়।
CTCM ডিভাইসটি একটি প্রোগ্রামেবল নিউম্যাটিক অ্যাকচুয়েটর (PPD) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয় যা কার্ডিয়াক চক্রের মতো একটি নিয়ন্ত্রিত সংবহন চাপ তৈরি করে।বায়ু চেম্বারের অভ্যন্তরে চাপ বাড়ার সাথে সাথে নমনীয় সিলিকন ঝিল্লি উপরের দিকে প্রসারিত হয়, টিস্যু সাইটের নীচে মাধ্যমটিকে জোর করে।ডায়াস্টোলের সময় হৃৎপিণ্ডের শারীরবৃত্তীয় প্রসারণের অনুকরণ করে তরলের এই বহিষ্কারের মাধ্যমে টিস্যুর ক্ষেত্রটি প্রসারিত হবে।শিথিলতার শীর্ষে, গ্রাফাইট ইলেক্ট্রোডের মাধ্যমে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রয়োগ করা হয়েছিল, যা বায়ু চেম্বারে চাপ কমিয়ে দেয় এবং টিস্যু বিভাগগুলির সংকোচন ঘটায়।পাইপের অভ্যন্তরে একটি হিমোস্ট্যাটিক ভালভ থাকে যার একটি চাপ সেন্সর বায়ু সিস্টেমে চাপ সনাক্ত করতে পারে।চাপ সেন্সর দ্বারা অনুভূত চাপ ল্যাপটপের সাথে সংযুক্ত একটি ডেটা সংগ্রহকারীতে প্রয়োগ করা হয়।এটি গ্যাস চেম্বারের ভিতরে চাপের ক্রমাগত পর্যবেক্ষণের অনুমতি দেয়।যখন সর্বোচ্চ চেম্বারের চাপ পৌঁছে যায় (স্ট্যান্ডার্ড 80 mmHg, 140 mmHg OS), ডেটা অধিগ্রহণ ডিভাইসটিকে C-PACE-EM সিস্টেমে একটি সংকেত পাঠাতে নির্দেশ দেওয়া হয়েছিল 2 ms-এর জন্য একটি biphasic ভোল্টেজ সংকেত তৈরি করতে, 4 V এ সেট করা হয়েছে।
হৃৎপিণ্ডের বিভাগগুলি প্রাপ্ত করা হয়েছিল এবং 6টি কূপের সংস্কৃতির অবস্থা নিম্নরূপ সঞ্চালিত হয়েছিল: স্থানান্তর পাত্র থেকে কাটা হৃৎপিণ্ডগুলিকে ঠান্ডা (4° সে.) কার্ডিওপ্লেজিয়া ধারণকারী ট্রেতে স্থানান্তর করুন।বাম ভেন্ট্রিকল একটি জীবাণুমুক্ত ব্লেড দিয়ে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং 1-2 সেমি 3 টুকরো টুকরো করা হয়েছিল।এই টিস্যু ব্লকগুলি টিস্যু আঠালো দিয়ে টিস্যু সমর্থনের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল এবং টাইরোডের দ্রবণযুক্ত একটি কম্পনশীল মাইক্রোটোম টিস্যু স্নানের মধ্যে স্থাপন করা হয়েছিল এবং ক্রমাগত অক্সিজেনযুক্ত (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), m.6M-4g (m.4g) লুকোজ (1.86 গ্রাম), 10 মিমি HEPES (2.38 গ্রাম), 1 মিমি এমজিসিএল 2 (1 মিলি 1 এম দ্রবণ), 1.8 এমএম CaCl2 (1.8 মিলি 1 এম দ্রবণ), 1 এল ddH2O পর্যন্ত)।কম্পনকারী মাইক্রোটোমটি 80 Hz ফ্রিকোয়েন্সিতে 300 µm পুরু টুকরা কাটার জন্য সেট করা হয়েছিল, একটি অনুভূমিক কম্পনের প্রশস্ততা 2 মিমি, এবং অগ্রিম হার 0.03 মিমি/সেকেন্ড।দ্রবণটি ঠান্ডা রাখতে টিস্যু স্নানটি বরফ দ্বারা বেষ্টিত ছিল এবং তাপমাত্রা 4 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে বজায় রাখা হয়েছিল।মাইক্রোটোম স্নান থেকে টিস্যু বিভাগগুলিকে একটি ইনকিউবেশন স্নানে স্থানান্তর করুন যাতে একটি কালচার প্লেটের জন্য পর্যাপ্ত অংশ না পাওয়া পর্যন্ত বরফের উপর অবিচ্ছিন্ন অক্সিজেনযুক্ত টাইরোড দ্রবণ থাকে।ট্রান্সওয়েল কালচারের জন্য, টিস্যু বিভাগগুলি জীবাণুমুক্ত 6 মিমি চওড়া পলিউরেথেন সমর্থনের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল এবং 6 মিলি অপ্টিমাইজড মিডিয়ামে স্থাপন করা হয়েছিল (199 মাঝারি, 1x আইটিএস সাপ্লিমেন্ট, 10% এফবিএস, 5 এনজি/মিলি ভিইজিএফ, 10 এনজি/মিলি এফজিএফ-অ্যালকালাইন এবং-2)।সি-পেসের মাধ্যমে টিস্যু বিভাগে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা (10 V, ফ্রিকোয়েন্সি 1.2 Hz) প্রয়োগ করা হয়েছিল।টিডি অবস্থার জন্য, প্রতিটি মাঝারি পরিবর্তনে 100 nM এবং 1 μM এ তাজা T3 এবং Dex যোগ করা হয়েছিল।দিনে 3 বার প্রতিস্থাপনের আগে মাধ্যমটি অক্সিজেন দিয়ে পরিপূর্ণ হয়।টিস্যু বিভাগগুলি একটি ইনকিউবেটরে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস এবং 5% CO2 এ সংষ্কৃত করা হয়েছিল।
CTCM সংস্কৃতির জন্য, টিস্যু বিভাগগুলি একটি কাস্টম-তৈরি 3D প্রিন্টারে একটি পেট্রি ডিশে সংশোধিত টাইরোডের দ্রবণ সহ স্থাপন করা হয়েছিল।ডিভাইসটি হার্টের স্লাইসের আকার সাপোর্ট রিং এর 25% দ্বারা বাড়ানোর জন্য ডিজাইন করা হয়েছে।এটি করা হয় যাতে টাইরোডের দ্রবণ থেকে মিডিয়ামে স্থানান্তরিত হওয়ার পরে এবং ডায়াস্টোলের সময় হৃৎপিণ্ডের অংশগুলি প্রসারিত না হয়।হিস্টোঅ্যাক্রিলিক আঠা ব্যবহার করে, 300 µm পুরু বিভাগগুলি 7 মিমি ব্যাসের একটি সমর্থন রিংয়ের উপর স্থির করা হয়েছিল।টিস্যু বিভাগগুলিকে সাপোর্ট রিংয়ের সাথে সংযুক্ত করার পরে, অতিরিক্ত টিস্যু বিভাগগুলি কেটে ফেলুন এবং সংযুক্ত টিস্যু বিভাগগুলিকে বরফের (4°C) উপর টাইরোড দ্রবণের স্নানের মধ্যে রাখুন যতক্ষণ না একটি ডিভাইসের জন্য পর্যাপ্ত অংশ প্রস্তুত করা হয়।সমস্ত ডিভাইসের জন্য মোট প্রক্রিয়াকরণের সময় 2 ঘন্টার বেশি হওয়া উচিত নয়।6 টি টিস্যু বিভাগগুলি তাদের সমর্থন রিংগুলির সাথে সংযুক্ত করার পরে, CTCM ডিভাইসটি একত্রিত হয়েছিল।CTCM কালচার চেম্বারটি 21 মিলি প্রাক-অক্সিজেনযুক্ত মাধ্যম দিয়ে পূর্ণ।টিস্যু বিভাগগুলিকে কালচার চেম্বারে স্থানান্তর করুন এবং সাবধানে একটি পাইপেট দিয়ে বায়ু বুদবুদগুলি সরিয়ে ফেলুন।টিস্যু বিভাগটি তারপর গর্তে নির্দেশিত হয় এবং আলতো করে জায়গায় চাপানো হয়।অবশেষে, ডিভাইসে ইলেক্ট্রোড ক্যাপ রাখুন এবং ডিভাইসটিকে ইনকিউবেটরে স্থানান্তর করুন।তারপরে CTCM কে এয়ার টিউব এবং C-PACE-EM সিস্টেমের সাথে সংযুক্ত করুন।বায়ুসংক্রান্ত অ্যাকুয়েটর খোলে এবং এয়ার ভালভ CTCM খোলে।C-PACE-EM সিস্টেমটি 2 ms এর জন্য biphasic পেসিং এর সময় 1.2 Hz এ 4 V প্রদানের জন্য কনফিগার করা হয়েছিল।ইলেক্ট্রোডগুলিতে গ্রাফাইট জমা হওয়া এড়াতে মাধ্যমটি দিনে দুবার এবং ইলেক্ট্রোডগুলি দিনে একবার পরিবর্তন করা হয়েছিল।প্রয়োজনে, টিস্যু বিভাগগুলি তাদের সংস্কৃতির কূপ থেকে সরিয়ে ফেলা যেতে পারে যাতে তাদের নীচে পড়ে থাকা যে কোনও বায়ু বুদবুদ বের করে দেওয়া যায়।MT চিকিত্সার অবস্থার জন্য, T3/Dex 100 nM T3 এবং 1 μM ডেক্স সহ প্রতিটি মাঝারি পরিবর্তনের সাথে তাজা যোগ করা হয়েছিল।CTCM ডিভাইসগুলি একটি ইনকিউবেটরে 37°C এবং 5% CO2-তে সংষ্কৃত করা হয়েছিল।
হার্টের টুকরোগুলির প্রসারিত ট্র্যাজেক্টোরিগুলি পেতে, একটি বিশেষ ক্যামেরা সিস্টেম তৈরি করা হয়েছিল।একটি SLR ক্যামেরা (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) একটি Navitar Zoom 7000 18-108mm ম্যাক্রো লেন্স (Navitar, San Francisco, CA) এর সাথে ব্যবহার করা হয়েছিল।মাধ্যমটিকে তাজা মাধ্যম দিয়ে প্রতিস্থাপন করার পরে ঘরের তাপমাত্রায় ভিজ্যুয়ালাইজেশন করা হয়েছিল।ক্যামেরাটি 51° কোণে অবস্থান করে এবং প্রতি সেকেন্ডে 30 ফ্রেমে ভিডিও রেকর্ড করা হয়।প্রথমত, ওপেন সোর্স সফ্টওয়্যার (MUSCLEMOTION43) হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের গতি পরিমাপ করতে Image-J এর সাথে ব্যবহার করা হয়েছিল।মুখোশটি MATLAB ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল (MathWorks, Natick, MA, USA) গোলমাল এড়াতে হৃদয়ের টুকরো মারতে আগ্রহের অঞ্চলগুলিকে সংজ্ঞায়িত করতে।ম্যানুয়ালি বিভক্ত মুখোশগুলি একটি ফ্রেমের ক্রম অনুসারে সমস্ত ছবিতে প্রয়োগ করা হয় এবং তারপরে MUSCLEMOTION প্লাগ-ইন-এ পাঠানো হয়।পেশী গতি প্রতিটি ফ্রেমে পিক্সেলের গড় তীব্রতা ব্যবহার করে রেফারেন্স ফ্রেমের তুলনায় এর গতিবিধি পরিমাপ করতে।ডেটা রেকর্ড করা হয়েছিল, ফিল্টার করা হয়েছিল এবং কার্ডিয়াক চক্রের সময় চক্রের সময় পরিমাপ করতে এবং টিস্যু প্রসারিত মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।রেকর্ড করা ভিডিওটি প্রথম-ক্রম শূন্য-ফেজ ডিজিটাল ফিল্টার ব্যবহার করে পোস্ট-প্রসেস করা হয়েছিল।টিস্যু স্ট্রেচ (পিক-টু-পিক) পরিমাপ করতে, রেকর্ড করা সংকেতে শিখর এবং খাদের মধ্যে পার্থক্য করার জন্য পিক-টু-পিক বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।উপরন্তু, সংকেত ড্রিফ্ট দূর করতে 6 তম ক্রম বহুপদী ব্যবহার করে ডিট্রেন্ডিং সঞ্চালিত হয়।গ্লোবাল টিস্যু গতি, চক্রের সময়, শিথিলকরণের সময় এবং সংকোচনের সময় (পরিপূরক প্রোগ্রাম কোড 44) নির্ধারণ করতে MATLAB-এ প্রোগ্রাম কোড তৈরি করা হয়েছিল।
স্ট্রেন বিশ্লেষণের জন্য, যান্ত্রিক প্রসারিত মূল্যায়নের জন্য তৈরি একই ভিডিওগুলি ব্যবহার করে, আমরা প্রথমে MUSCLEMOTION সফ্টওয়্যার অনুসারে গতির শিখর (সর্বোচ্চ (উপরের) এবং সর্বনিম্ন (নিম্ন) গতির বিন্দুগুলিকে প্রতিনিধিত্ব করে এমন দুটি চিত্র সনাক্ত করেছি৷তারপরে আমরা টিস্যু অঞ্চলগুলিকে বিভক্ত করেছি এবং সেগমেন্টেড টিস্যুতে শেডিং অ্যালগরিদমের একটি ফর্ম প্রয়োগ করেছি (পরিপূরক চিত্র 2a)।তারপরে বিভক্ত টিস্যুকে দশটি সাবসারফেসে বিভক্ত করা হয়েছিল, এবং নিম্নলিখিত সমীকরণ ব্যবহার করে প্রতিটি পৃষ্ঠের চাপ গণনা করা হয়েছিল: স্ট্রেন = (Sup-Sdown)/Sdown, যেখানে Sup এবং Sdown হল ফ্যাব্রিকের উপরের এবং নীচের ছায়া থেকে আকৃতির দূরত্ব, যথাক্রমে (পরিপূরক চিত্র। .2b)।
হার্টের বিভাগগুলি 48 ঘন্টার জন্য 4% প্যারাফর্মালডিহাইডে স্থির করা হয়েছিল।স্থির টিস্যুগুলি 1 ঘন্টার জন্য 10% এবং 20% সুক্রোজে, তারপর রাতারাতি 30% সুক্রোজে পানিশূন্য করা হয়েছিল।তারপর বিভাগগুলি সর্বোত্তম কাটিং তাপমাত্রা যৌগ (OCT যৌগ) এ এমবেড করা হয়েছিল এবং ধীরে ধীরে একটি আইসোপেন্টেন/শুকনো বরফের স্নানে হিমায়িত করা হয়েছিল।আলাদা না হওয়া পর্যন্ত OCT এম্বেডিং ব্লক -80 °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন।স্লাইডগুলি 8 μm বেধ সহ বিভাগ হিসাবে প্রস্তুত করা হয়েছিল।
হার্টের অংশ থেকে OCT অপসারণ করতে, একটি হিটিং ব্লকে স্লাইডগুলিকে 95 °C তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য গরম করুন।প্রতিটি স্লাইডে 1 মিলি পিবিএস যোগ করুন এবং ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন, তারপর ঘরের তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য পিবিএস-এ 0.1% ট্রাইটন-এক্স সেট করে বিভাগগুলিকে প্রবেশ করুন।অ-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলিকে নমুনায় বাঁধা থেকে রোধ করতে, স্লাইডে 3% বিএসএ দ্রবণের 1 মিলি যোগ করুন এবং ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করুন।BSA তারপর সরানো হয়েছিল এবং স্লাইডগুলি PBS দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল।প্রতিটি নমুনা একটি পেন্সিল দিয়ে চিহ্নিত করুন।প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি (1% BSA-তে 1:200 মিশ্রিত) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) এবং ট্রোপোনিন-টি (থার্মো সায়েন্টিফিক; #MA5-12960) 90 মিনিটের বেশি সময়ে যোগ করা হয়েছিল, তারপরে অ্যালেক্সা-এর বিরুদ্ধে 1% অ্যান্টিবডি ব্যবহার করা হয়েছিল। Fluor 488 (থার্মো সায়েন্টিফিক; #A16079), খরগোশের বিরুদ্ধে আলেক্সা ফ্লুর 594 (থার্মো সায়েন্টিফিক; #T6391) অতিরিক্ত 90 মিনিটের জন্য পিবিএস দিয়ে 3 বার ধোয়া হয়েছে, ব্যাকগ্রাউন্ড থেকে টার্গেট স্টেনিং আলাদা করতে, আমরা নিয়ন্ত্রণ হিসাবে শুধুমাত্র সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করেছি। অবশেষে, নিউক্লিয়ার ভিডিএ-এ ভিডিএভিডিএ যোগ করা হয়েছিল। ল্যাবরেটরি) এবং নেইল পলিশ দিয়ে সিল করা। -x ম্যাগনিফিকেশন) এবং 40x ম্যাগনিফিকেশন সহ কীয়েন্স মাইক্রোস্কোপ।
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) PBS-এ 5 μg/ml-এ WGA দাগের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য নির্দিষ্ট বিভাগে প্রয়োগ করা হয়েছিল।তারপরে স্লাইডগুলি পিবিএস দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং প্রতিটি স্লাইডে সুদান কালো যুক্ত করা হয়েছিল এবং 30 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল।তারপরে স্লাইডগুলি পিবিএস দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং ভেকটাশিল্ড এম্বেডিং মাধ্যম যুক্ত করা হয়েছিল।স্লাইডগুলি 40x ম্যাগনিফিকেশনে একটি কীয়েন্স মাইক্রোস্কোপে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল।
উপরে বর্ণিত নমুনা থেকে OCT সরানো হয়েছিল।OCT অপসারণের পরে, স্লাইডগুলিকে রাতারাতি বোইনের দ্রবণে ডুবিয়ে রাখুন।তারপর স্লাইডগুলি 1 ঘন্টার জন্য পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয় এবং তারপরে 10 মিনিটের জন্য বিব্রিচ অ্যালো অ্যাসিড ফুচসিন দ্রবণে রাখা হয়।তারপর স্লাইডগুলিকে পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে 5% ফসফোমোলিবডেনাম/5% ফসফোটাংস্টিক অ্যাসিডের দ্রবণে 10 মিনিটের জন্য রাখা হয়।ধুয়ে না ফেলে, স্লাইডগুলিকে সরাসরি অ্যানিলিন নীল দ্রবণে 15 মিনিটের জন্য স্থানান্তর করুন।তারপর স্লাইডগুলি পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে 1% অ্যাসিটিক অ্যাসিড দ্রবণে 2 মিনিটের জন্য রাখা হয়েছিল।স্লাইডগুলি 200 N ইথানলে শুকানো হয়েছিল এবং জাইলিনে স্থানান্তরিত হয়েছিল।দাগযুক্ত স্লাইডগুলি 10x উদ্দেশ্য সহ একটি কীয়েন্স মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে কল্পনা করা হয়েছিল।কীয়েন্স বিশ্লেষক সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ফাইব্রোসিস এলাকার শতাংশের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল।
কিছু পরিবর্তন সহ প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে CyQUANT™ MTT সেল কার্যকারিতা পরীক্ষা (ইনভিট্রোজেন, কার্লসব্যাড, CA), ক্যাটালগ নম্বর V13154।বিশেষ করে, এমটিটি বিশ্লেষণের সময় অভিন্ন টিস্যুর আকার নিশ্চিত করতে 6 মিমি ব্যাসের একটি অস্ত্রোপচারের পাঞ্চ ব্যবহার করা হয়েছিল।টিস্যুগুলি প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে এমটিটি সাবস্ট্রেট ধারণকারী 12-ওয়েল প্লেটের কূপে পৃথকভাবে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল।অংশগুলিকে 37° C. তাপমাত্রায় 3 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয় এবং জীবন্ত টিস্যু MTT সাবস্ট্রেটকে বিপাক করে একটি বেগুনি ফর্মাজান যৌগ তৈরি করে।MTT দ্রবণটি 1 মিলি DMSO দিয়ে প্রতিস্থাপন করুন এবং 15 মিনিটের জন্য 37 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায় হৃদপিণ্ডের অংশ থেকে বেগুনি ফর্মাজান বের করুন।নমুনাগুলি 1:10 DMSO-তে 96-ওয়েল পরিষ্কার নীচের প্লেটে এবং বেগুনি রঙের তীব্রতা একটি সাইটেশন প্লেট রিডার (বায়োটেক) ব্যবহার করে 570 এনএম পরিমাপ করা হয়েছিল।হৃৎপিণ্ডের প্রতিটি স্লাইসের ওজনে রিডিং স্বাভাবিক করা হয়েছিল।
হার্ট স্লাইস মিডিয়াকে 1 μCi/ml [5-3H]-গ্লুকোজ (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) সম্বলিত মিডিয়া দিয়ে প্রতিস্থাপিত করা হয়েছিল যেমনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে।ইনকিউবেশনের 4 ঘন্টা পর, একটি খোলা মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে 100 μl মাঝারি যোগ করুন যাতে 0.2 N HCl এর 100 μl থাকে।তারপর টিউবটিকে একটি সিন্টিলেশন টিউবে স্থাপন করা হয়েছিল যাতে 500 μl dH2O থাকে [3H]2O 37°C তাপমাত্রায় 72 ঘন্টার জন্য বাষ্পীভূত করার জন্য।তারপরে সিন্টিলেশন টিউব থেকে মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবটি সরিয়ে ফেলুন এবং 10 মিলি সিন্টিলেশন ফ্লুইড যোগ করুন।ট্রাই-কার্ব 2900TR লিকুইড সিন্টিলেশন বিশ্লেষক (প্যাকার্ড বায়োসায়েন্স কোম্পানি, মেরিডেন, সিটি, ইউএসএ) ব্যবহার করে সিন্টিলেশন গণনা করা হয়েছিল।তারপরে [5-3H]-গ্লুকোজ নির্দিষ্ট কার্যকলাপ, অসম্পূর্ণ ভারসাম্য এবং পটভূমি, [5-3H]-এর লেবেলবিহীন গ্লুকোজের তরলতা, এবং সিন্টিলেশন কাউন্টার দক্ষতা বিবেচনা করে গ্লুকোজ ব্যবহার গণনা করা হয়েছিল।হৃদপিন্ডের অংশগুলির ভরের জন্য ডেটা স্বাভাবিক করা হয়।
Trizol-এ টিস্যু সমজাতকরণের পর, নির্মাতার প্রোটোকল অনুযায়ী Qiagen miRNeasy মাইক্রো কিট #210874 ব্যবহার করে RNA কে হার্টের অংশ থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল।RNAsec লাইব্রেরি প্রস্তুতি, সিকোয়েন্সিং এবং ডেটা বিশ্লেষণ নিম্নরূপ সঞ্চালিত হয়েছিল:
RNA লাইব্রেরির প্রস্তুতির জন্য নমুনা প্রতি 1 μg RNA সূচনা উপাদান হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।নির্মাতার সুপারিশ অনুসরণ করে NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) ব্যবহার করে সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরি তৈরি করা হয়েছিল এবং প্রতিটি নমুনার জন্য অ্যাট্রিবিউট সিকোয়েন্সে সূচক কোড যোগ করা হয়েছিল।সংক্ষেপে, পলি-টি অলিগোনিউক্লিওটাইডের সাথে সংযুক্ত চৌম্বকীয় পুঁতি ব্যবহার করে মোট RNA থেকে mRNA শুদ্ধ করা হয়েছিল।NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) এ উচ্চ তাপমাত্রায় দ্বিভাজন ক্যাটেশন ব্যবহার করে ফ্র্যাগমেন্টেশন করা হয়।প্রথম স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ র্যান্ডম হেক্সামার প্রাইমার এবং M-MuLV রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেস (RNase H-) ব্যবহার করে সংশ্লেষিত হয়েছিল।দ্বিতীয় স্ট্র্যান্ড cDNA তারপর DNA পলিমারেজ I এবং RNase H ব্যবহার করে সংশ্লেষিত হয়। অবশিষ্ট ওভারহ্যাংগুলি এক্সোনুক্লিজ/পলিমারেজ কার্যকলাপের মাধ্যমে ভোঁতা প্রান্তে রূপান্তরিত হয়।ডিএনএ ফ্র্যাগমেন্টের 3′ প্রান্তের এডিনিলেশনের পরে, হাইব্রিডাইজেশনের জন্য এটি প্রস্তুত করার জন্য একটি হেয়ারপিন লুপ কাঠামো সহ একটি NEBNext অ্যাডাপ্টার সংযুক্ত করা হয়।পছন্দের দৈর্ঘ্য 150-200 bp cDNA খণ্ড নির্বাচনের জন্য।AMPure XP সিস্টেম (বেকম্যান কুল্টার, বেভারলি, ইউএসএ) ব্যবহার করে লাইব্রেরির টুকরো শুদ্ধ করা হয়েছিল।তারপরে, 3 μl USER এনজাইম (NEB, USA) একটি অ্যাডাপ্টারের সাথে লিগেটেড আকার-নির্বাচিত সিডিএনএ সহ 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 15 মিনিটের জন্য এবং তারপরে পিসিআরের আগে 95 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে 5 মিনিটের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।পিসিআর তখন ফিউশন হাই-ফিডেলিটি ডিএনএ পলিমারেজ, ইউনিভার্সাল পিসিআর প্রাইমার এবং ইনডেক্স (এক্স) প্রাইমার ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।অবশেষে, পিসিআর পণ্যগুলিকে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল (AMPure XP সিস্টেম) এবং লাইব্রেরির গুণমান একটি Agilent Bioanalyzer 2100 সিস্টেমে মূল্যায়ন করা হয়েছিল।সিডিএনএ লাইব্রেরিটি তখন একটি নোভাসেক সিকোয়েন্সার ব্যবহার করে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল।CASAVA বেস কলিং ব্যবহার করে ইলুমিনার কাঁচা চিত্র ফাইলগুলিকে কাঁচা পাঠে রূপান্তরিত করা হয়েছিল।কাঁচা ডেটা FASTQ(fq) ফরম্যাট ফাইলগুলিতে সংরক্ষণ করা হয় যাতে রিড সিকোয়েন্স এবং সংশ্লিষ্ট বেস গুণাবলী থাকে।Sscrofa11.1 রেফারেন্স জিনোমের সাথে ফিল্টার করা সিকোয়েন্সিং রিডের সাথে মেলাতে HISAT2 নির্বাচন করুন।সাধারণভাবে, HISAT2 যেকোন আকারের জিনোমকে সমর্থন করে, যার মধ্যে 4 বিলিয়ন বেসের চেয়ে বড় জিনোম রয়েছে এবং বেশিরভাগ প্যারামিটারের জন্য ডিফল্ট মান সেট করা হয়।RNA Seq ডেটা থেকে স্প্লিসিং রিডগুলি HISAT2 ব্যবহার করে দক্ষতার সাথে সারিবদ্ধ করা যেতে পারে, বর্তমানে উপলব্ধ দ্রুততম সিস্টেম, অন্য যেকোনো পদ্ধতির তুলনায় একই বা ভাল নির্ভুলতার সাথে।
ট্রান্সক্রিপ্টের প্রাচুর্য সরাসরি জিনের অভিব্যক্তির স্তরকে প্রতিফলিত করে।জিনোম বা এক্সন এর সাথে যুক্ত ট্রান্সক্রিপ্টের প্রাচুর্য (সিকোয়েন্সিং কাউন্ট) দ্বারা জিনের এক্সপ্রেশনের মাত্রা মূল্যায়ন করা হয়।পাঠের সংখ্যা জিনের প্রকাশের মাত্রা, জিনের দৈর্ঘ্য এবং সিকোয়েন্সিং গভীরতার সমানুপাতিক।FPKM (প্রতি মিলিয়ন বেস জোড়ায় প্রতি হাজার হাজার বেস জোড়া প্রতিলিপির ক্রমানুসারে টুকরা) গণনা করা হয়েছিল এবং ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশনের P-মানগুলি DESeq2 প্যাকেজ ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল।তারপরে আমরা বিল্ট-ইন R-ফাংশন "p.adjust" এর উপর ভিত্তি করে বেঞ্জামিনি-হচবার্গ মেথড9 ব্যবহার করে প্রতিটি P মানের জন্য মিথ্যা আবিষ্কারের হার (FDR) গণনা করেছি।
থার্মো (থার্মো, বিড়াল নং 11756050) থেকে সুপারস্ক্রিপ্ট IV ভিলো মাস্টার মিশ্রণ ব্যবহার করে হৃদপিন্ডের অংশ থেকে বিচ্ছিন্ন RNA 200 ng/μl ঘনত্বে cDNA তে রূপান্তরিত হয়েছিল।পরিমাণগত RT-PCR একটি ফলিত বায়োসিস্টেম এন্ডুরা প্লেট মাইক্রোঅ্যাম্প 384-ওয়েল স্বচ্ছ প্রতিক্রিয়া প্লেট (থার্মো, বিড়াল নং 4483319) এবং মাইক্রোঅ্যাম্প অপটিক্যাল আঠালো (থার্মো, বিড়াল নং 4311971) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল।প্রতিক্রিয়া মিশ্রণে 5 µl তাকমান ফাস্ট অ্যাডভান্সড মাস্টার মিক্স (থার্মো, বিড়াল # 4444557), 0.5 µl তাকমান প্রাইমার এবং 3.5 µl H2O প্রতি ভালভাবে মিশ্রিত ছিল।স্ট্যান্ডার্ড qPCR চক্রগুলি চালানো হয়েছিল এবং CT মানগুলি একটি ফলিত বায়োসিস্টেমস কোয়ান্টস্টুডিও 5 রিয়েল-টাইম পিসিআর যন্ত্র (384-ওয়েল মডিউল; পণ্য # A28135) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল।তাকমান প্রাইমারগুলি থার্মো (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss0810188_m1), RGL1 (Ss08108_ACT), 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss042415) ঘরের নমুনা স্বাভাবিক করা হয়েছে। e GAPDH.
নির্মাতার প্রোটোকল অনুযায়ী NT-ProBNP-এর মিডিয়া রিলিজ NT-ProBNP কিট (পিগ) (বিড়াল নং MBS2086979, MyBioSource) ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল।সংক্ষেপে, প্রতিটি নমুনা এবং স্ট্যান্ডার্ডের 250 μl প্রতিটি কূপে সদৃশভাবে যোগ করা হয়েছিল।নমুনা যোগ করার পরপরই, প্রতিটি কূপে 50 µl অ্যাসে রিজেন্ট A যোগ করুন।আলতো করে প্লেট ঝাঁকান এবং সিল্যান্ট দিয়ে সিল করুন।তারপরে ট্যাবলেটগুলি 1 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে ইনকিউব করা হয়েছিল।তারপরে দ্রবণটি অ্যাসপিরেট করুন এবং 350 μl 1X ওয়াশ দ্রবণ দিয়ে কূপগুলিকে 4 বার ধুয়ে ফেলুন, প্রতিবার 1-2 মিনিটের জন্য ধোয়ার দ্রবণটি ইনকিউবেট করুন৷তারপর প্রতি কূপে 100 μl অ্যাসে রিএজেন্ট বি যোগ করুন এবং প্লেট সিলান্ট দিয়ে সীল করুন।ট্যাবলেটটি 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 30 মিনিটের জন্য মৃদুভাবে ঝাঁকিয়ে রাখা হয়েছিল।দ্রবণটি অ্যাসপিরেট করুন এবং 1X ওয়াশ দ্রবণের 350 μl দিয়ে 5 বার কূপ ধুয়ে ফেলুন।প্রতিটি কূপে 90 μl সাবস্ট্রেট দ্রবণ যোগ করুন এবং প্লেটটি সিল করুন।প্লেটটি 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 10-20 মিনিটের জন্য সেঁকুন।প্রতিটি কূপে 50 μl স্টপ সলিউশন যোগ করুন।প্লেটটি অবিলম্বে একটি সাইটেশন (বায়োটেক) প্লেট রিডার সেট 450 এনএম ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল।
গোষ্ঠীর মাপ বেছে নেওয়ার জন্য শক্তি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল যা 5% টাইপ I ত্রুটির হার সহ পরামিতিতে 10% পরম পরিবর্তন সনাক্ত করতে >80% শক্তি প্রদান করবে। গোষ্ঠীর মাপ বেছে নেওয়ার জন্য শক্তি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল যা 5% টাইপ I ত্রুটির হার সহ পরামিতিতে 10% পরম পরিবর্তন সনাক্ত করতে >80% শক্তি প্রদান করবে। অ্যানালিজ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абнаружения с 5% частотой ошибок TIPA I. গোষ্ঠীর আকার নির্বাচন করার জন্য শক্তি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল যা 5% টাইপ I ত্রুটি হারের সাথে 10% পরম পরামিতি পরিবর্তন সনাক্ত করতে 80% শক্তি প্রদান করবে।进行功效分析以选择将提供 > 80％功效以检测参数中10进行功效分析以选择将提供 > 80％功效以检测参数中10 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > ৮০% мощности для обнаружения 10% етров и 5% частоты ошибок типа I. একটি গোষ্ঠীর আকার নির্বাচন করার জন্য একটি শক্তি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল যা 10% পরম পরামিতি পরিবর্তন এবং 5% টাইপ I ত্রুটির হার সনাক্ত করতে 80% শক্তি প্রদান করবে।পরীক্ষার আগে টিস্যু বিভাগগুলি এলোমেলোভাবে নির্বাচন করা হয়েছিল।সমস্ত বিশ্লেষণগুলি অবস্থার অন্ধ ছিল এবং সমস্ত ডেটা বিশ্লেষণ করার পরেই নমুনাগুলি ডিকোড করা হয়েছিল।গ্রাফপ্যাড প্রিজম সফ্টওয়্যার (সান দিয়েগো, সিএ) সমস্ত পরিসংখ্যান বিশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। সমস্ত পরিসংখ্যানের জন্য, p-মানগুলি <0.05 মানগুলিতে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল৷ সমস্ত পরিসংখ্যানের জন্য, p-মানগুলি <0.05 মানগুলিতে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. সমস্ত পরিসংখ্যানের জন্য, p-মানগুলি <0.05 মানগুলিতে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল।对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. সমস্ত পরিসংখ্যানের জন্য, p-মানগুলি <0.05 মানগুলিতে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল।টু-টেইলড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট শুধুমাত্র 2টি তুলনা সহ ডেটাতে সঞ্চালিত হয়েছিল।একাধিক গোষ্ঠীর মধ্যে তাৎপর্য নির্ধারণ করতে একমুখী বা দ্বিমুখী আনোভা ব্যবহার করা হয়েছিল।পোস্ট-হক পরীক্ষা করার সময়, টুকির সংশোধন একাধিক তুলনার জন্য অ্যাকাউন্টে প্রয়োগ করা হয়েছিল।পদ্ধতি বিভাগে বর্ণিত হিসাবে FDR এবং p.adjust গণনা করার সময় RNAsec ডেটাতে বিশেষ পরিসংখ্যানগত বিবেচনা রয়েছে।
অধ্যয়নের নকশা সম্পর্কে আরও তথ্যের জন্য, এই নিবন্ধের সাথে লিঙ্ক করা প্রকৃতি গবেষণা প্রতিবেদন বিমূর্ত দেখুন।