Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Morfogeneza ljudskog crijeva uspostavlja karakteristike kripto-vilusa 3D epitelne mikroarhitekture i prostorne organizacije. Ova jedinstvena struktura je potrebna za održavanje homeostaze crijeva tako što štiti nišu matičnih stanica u bazalnoj kripti od egzogenih mikrobnih antigena i njihovih metabolita. Osim toga, crijevne resice i izlučujuća stanica sluzi koja se izlučuje u funkcionalnoj sluzi štite funkcionalnu mukoznu traku crijeva. Zbog toga je rekreacija 3D epitelnih struktura ključna za izgradnju in vitro modela crijeva. Posebno, organsko mimetičko crijevo na čipu može inducirati spontanu 3D morfogenezu crijevnog epitela s poboljšanim fiziološkim funkcijama i biomehanikom. crijeva na mikrofluidnom čipu, kao i u hibridnom čipu ugrađenom u Transwell. Opisujemo detaljne metode za proizvodnju uređaja, kultiviranje Caco-2 ili crijevnih organoidnih epitelnih stanica u konvencionalnim okruženjima kao i na mikrofluidnoj platformi, indukciju 3D morfogeneze pomoću uspostavljene morfogeneze i višestruku karakterizaciju slike. stvaranje funkcionalne mikroarhitekture crijeva kontroliranjem bazolateralnog protoka tekućine za 5 d. Naša in vitro metoda morfogeneze koristi fiziološki relevantan napon smicanja i mehaničko kretanje i ne zahtijeva složeni ćelijski inženjering ili manipulaciju, što može nadmašiti druge postojeće tehnike. Predviđamo da bi naš predloženi protokol mogao imati uticaja na epimedicinsku istraživačku zajednicu za regeneraciju epimedicinske istraživačke zajednice u3. in vitro za biomedicinsku, kliničku i farmaceutsku primjenu.
Eksperimenti pokazuju da crijevne epitelne Caco-2 ćelije uzgajane u crijevima na čipu1,2,3,4,5 ili dvoslojnim mikrofluidnim uređajima6,7 mogu se podvrgnuti spontanoj 3D morfogenezi in vitro bez jasnog razumijevanja osnovnog mehanizma. morfogeneza in vitro, što je dokazano Caco-2 i crijevnim organoidima dobivenim od pacijenata.Epitelne ćelije su validirane. U ovoj studiji smo se posebno fokusirali na proizvodnju ćelija i distribuciju koncentracije snažnog Wnt antagonista, Dickkopf-1 (DKK-1), u gut-on-a-chip i modifikovanim mikrofluidnim uređajima koji sadrže Transwell umetke, nazvane "Hibridni čip". D-povezan protein 1, ili Soggy-1) u crijevima na čipu inhibira morfogenezu ili remeti prestrukturirani 3D epitelni sloj, sugerirajući da je antagonistički stres tokom kulture odgovoran za intestinalnu morfogenezu in vitro. Stoga je praktičan pristup za postizanje čvrste epiteliogeneze minimalne razine W-a da se održi minimalna razina morfogeneze W-a na minimalnom nivou morfogeneze W na minimalnom nivou uklanjanja morfogeneze W na minimalnom nivou. odjeljak aktivnim ispiranjem (npr. u platformama crijeva na čipu ili hibridu na čipu) ili difuzijom. Bazolateralni medij (npr. iz Transwell umetanja u velike bazolateralne rezervoare u bunarima).
U ovom protokolu pružamo detaljnu metodu za proizvodnju mikrouređaja gut-on-a-chip i hibridnih čipova koji se mogu umetnuti u Transwell (koraci 1-5) za kulturu crijevnih epitelnih stanica na poroznim membranama baziranim na polidimetilsiloksanu (PDMS) (koraci 6A, 7B umetak membrane od membrane 6A, 7B6A) , 7B, 8, 9) i inducirana 3D morfogeneza in vitro (korak 10). Također smo identificirali ćelijske i molekularne karakteristike koje ukazuju na histogenezu specifičnu za tkivo i ćelijsku diferencijaciju zavisnu od loze primjenom višestrukih modaliteta snimanja (koraci 11-24). , u dva formata kulture sa tehničkim detaljima uključujući modifikaciju površine poroznih membrana, stvaranje 2D monoslojeva i intestinalne biohemijske i Reprodukcija biomehaničkog mikrookruženja.in vitro. Da bismo inducirali 3D morfogenezu iz 2D epitelnih monoslojeva, uklonili smo antagoniste morfogena u oba sloja morfogena u umjetničkoj bazi kultivisane forme. korištenje regenerabilnog 3D epitelnog sloja koji se može koristiti za modeliranje rasta epitela ovisnog o morfogenu, longitudinalnih kokultura domaćin-mikrobiom, infekcije patogenom, upalnih ozljeda, disfunkcije epitelne barijere i terapija zasnovanih na probioticima Primjer.utjecaji.
Naš protokol može biti koristan širokom spektru naučnika u osnovnom (npr. biologija crijevne sluznice, biologija matičnih stanica i razvojna biologija) i primijenjenim istraživanjima (npr. pretkliničko testiranje lijekova, modeliranje bolesti, tkivni inženjering i gastroenterologija) širokog utjecaja. predviđaju da se naša tehnička strategija može distribuirati publici koja proučava dinamiku ćelijske signalizacije tokom crijevnog razvoja, regeneracije ili homeostaze. Osim toga, naš protokol je koristan za ispitivanje infekcije pod različitim infektivnim agensima kao što su Norovirus 8, Teški akutni respiratorni sindrom Coronavirus 2 (SARS-lostridio dimonium-2), ili CRS-lostridio dimoncho9. lerae.Publika patologije i patogeneze bolesti je također korisna. Upotreba mikrofiziološkog sistema crijeva na čipu može omogućiti longitudinalnu ko-kulturu 10 i naknadnu procjenu odbrane domaćina, imunoloških odgovora i popravka ozljeda povezanih s patogenom u gastrointestinalnom (GI) traktu 11 .Drugi GI poremećaji povezani s gastrointestinalnim (GI) poremećajima, sindromom propuštanja crijeva, sindromom propuštanja crijeva i sindromom propuštanja crijeva ili sindrom iritabilnog crijeva može se simulirati kada se 3D crijevni epitelni slojevi pripremaju korištenjem pacijentovih 3D crijevnih epitelnih slojeva, ove bolesti uključuju atrofiju resica, skraćivanje kripte, oštećenje sluznice ili oštećenu epitelnu barijeru. čitaoci mogu razmotriti dodavanje tipova ćelija relevantnih za bolest, kao što su mononuklearne ćelije periferne krvi pacijenata (PBMC), modelima koji sadrže 3D mikroarhitekture crijevnih resica-kripta.tkivno specifične imune ćelije, 5.
Budući da se 3D mikrostruktura epitela može fiksirati i vizualizirati bez procesa sekcije, gledaoci koji rade na prostornoj transkriptomiji i slikama visoke rezolucije ili super-rezolucije mogu biti zainteresirani za naše mapiranje prostorno-vremenske dinamike gena i proteina na epitelnim nišama.Zainteresovan za tehnologiju. Odgovor na mikrobne ili imunološke stimuluse. Nadalje, uzdužno preslušavanje domaćin-mikrobiom 10, 14 koje koordinira homeostazu crijeva može se uspostaviti u 3D sloju crijevne sluznice ko-kulturom različitih mikrobnih vrsta, mikrobnih zajednica, posebno u fekalnoj mikrobiotici.na platformi.Ovaj pristup je posebno atraktivan za publiku koja proučava mukoznu imunologiju, gastroenterologiju, ljudski mikrobiom, kulturomiku i kliničku mikrobiologiju koja želi kultivirati prethodno nekulturnu crijevnu mikrobiotu u laboratoriju. Ako se naš protokol morfogeneze in vitro može prilagoditi skalabilnim formatima za umetanje kulture s više jažica, kao što su 62 ili 62 kontinualni formati za umetanje kulture3, kao što su 62 ili 62,4 ili 8 bazolateralnim odjeljcima, protokol se također može distribuirati onima koji razvijaju farmaceutske, biomedicinske ili platforme za skrining ili validaciju visoke propusnosti za prehrambenu industriju. Kao dokaz principa, nedavno smo demonstrirali izvodljivost multipleksnog sistema za morfogenezu visoke propusnosti koji je skalabilan na komercijalnu ploču s višestrukim organskim formatom. 18. Stoga se validacija naše in vitro metode morfogeneze može ubrzati i potencijalno usvojiti od strane mnogih istraživačkih laboratorija, industrije ili vladinih i regulatornih agencija kako bi se razumjelo ćelijsko reprogramiranje in vitro morfogeneze crijeva na transkriptomskom nivou radi testiranja lijekova ili bioterapeutike. procijeniti reproduktivnost procesa morfogeneze crijeva.
Ograničeni broj eksperimentalnih modela relevantnih za ljude korišten je za proučavanje morfogeneze crijevnog epitela, uglavnom zbog nedostatka primjenjivih protokola za induciranje 3D morfogeneze in vitro. Zapravo, veliki dio sadašnjeg znanja o morfogenezi crijeva zasniva se na studijama na životinjama (npr. zebrafish ili20, miševi mogu koštati trudnoću2). biti etički upitni, i što je najvažnije, ne određuju precizno ljudske razvojne procese. Ovi modeli su također vrlo ograničeni u svojoj sposobnosti testiranja na višesmjerni skalabilan način. Stoga je naš protokol za regeneraciju 3D struktura tkiva in vitro nadmašuje in vivo životinjske modele, kao i druge tradicionalne statičke 2D ćelijske modele opisane od nas, kao i druge tradicionalne statičke 2D ćelijske strukture koje su nam opisane u prethodnim modelima 3D, omogućili su u prethodnim modelima statičke 2D ćelijske kulture. prostorna lokalizacija diferenciranih ćelija u osi kripta-vilus kao odgovor na različite mukozne ili imunološke podražaje. 3D epitelni slojevi mogu pružiti prostor za proučavanje načina na koji se mikrobne stanice nadmeću da formiraju prostorne niše i ekološku evoluciju kao odgovor na faktore domaćina (npr. unutrašnji naspram vanjskih slojeva sluzi, morsko-mrobna sekrecija IgA i više antipeptidnih 3D-peptida omogućavaju više antipeptidnih IgA i F). razumjeti kako crijevna mikrobiota strukturira svoje zajednice i sinergijski proizvodi mikrobne metabolite (npr. kratkolančane masne kiseline) koji oblikuju staničnu organizaciju i niše matičnih stanica u bazalnim kriptama. Ove karakteristike se mogu pokazati samo kada se in vitro uspostave 3D epitelni slojevi.
Uz našu metodu stvaranja 3D intestinalnih epitelnih struktura, postoji nekoliko in vitro metoda. Intestinalna organoidna kultura je najmodernija tehnika tkivnog inženjeringa zasnovana na uzgoju crijevnih matičnih stanica u specifičnim uslovima morfogena23,24,25. Međutim, upotreba 3D organoidnih modela za analizu transporta lubioze domaćina je često je zatvoren unutar organoida i stoga je uvođenje luminalnih komponenti kao što su mikrobne ćelije ili egzogeni antigeni ograničeno.Pristup lumenima organoida može se poboljšati korištenjem mikroinjektora,26,27, ali ova metoda je invazivna i radno intenzivna i zahtijeva specijalizirano znanje za izvođenje. Nadalje, tradicionalne organoidne kulture koje se održavaju u hidrogelnim skelama u statičkim uvjetima ne odražavaju precizno aktivnu in vivo biomehaniku.
Drugi pristupi koje koristi nekoliko istraživačkih grupa koriste unaprijed strukturirane 3D hidrogelne skele da oponašaju epitelnu strukturu crijeva kultiviranjem izolovanih ljudskih crijevnih stanica na površini gela. Izradite hidrogelske skele koristeći 3D štampane, mikro mljevene ili litografski izrađene kalupe. epitelnu strukturu visokog aspekta i preslušavanje stroma-epitela uključivanjem stromalnih ćelija u skelu. Međutim, priroda prestrukturiranih skela može spriječiti prikaz samog spontanog morfogenetskog procesa. Ovi modeli također ne pružaju dinamički luminalni ili intersticijski tok, nedostaje im da u tekućoj fiziološkoj funkciji i nedavnim smicanjem stanica ne dobiju fizičku funkciju. studija je koristila hidrogelne skele na mikrofluidnoj platformi i uzorkovane intestinalne epitelne strukture koristeći tehnike laserskog jetkanja. Intestinalni organoidi miša prate urezane uzorke kako bi formirali crijevne tubularne strukture, a intraluminalni protok tekućine može se rekapitulirati korištenjem mikrofluidnog modula. Međutim, ovaj morhibitni model ne uključuje spontano kretanje gube3. Tehnike D štampanja iz iste grupe su bile u stanju da stvore minijaturne crevne cevi sa spontanim morfogenetskim procesima. Uprkos složenoj proizvodnji različitih segmenata creva unutar cevi, ovom modelu takođe nedostaje protok luminalnog fluida i mehanička deformacija. Osim toga, operabilnost modela može biti ograničena, posebno nakon što je proces bioštampa završen, što dovodi do poremećaja u uslovima spontane interakcije između ćelije i eksperimentalne ćelije. fogeneza, fiziološki relevantan smičući stres, biomehanika koja oponaša pokretljivost crijeva, dostupnost neovisnih apikalnih i bazolateralnih odjeljaka, i ponovno stvaranje složenih bioloških mikrookruženja modularnosti. Stoga, naš in vitro 3D protokol morfogeneze može pružiti komplementaran pristup postojećim metodama za prevazilaženje izazova.
Naš protokol je u potpunosti fokusiran na 3D epitelnu morfogenezu, sa samo epitelnim ćelijama u kulturi i bez drugih tipova okolnih ćelija kao što su mezenhimalne ćelije, endotelne ćelije i imune ćelije. Kao što je prethodno opisano, srž našeg protokola je indukcija epitelne morfogeneze. Jednost našeg crijeva-na-čipu i hibrida-na-čipu omogućava nam da rekreiramo valoviti 3D epitelni sloj, dodatne biološke složenosti kao što su epitelno-mezenhimske interakcije33,34, depozicija ekstracelularnog matriksa (ECM) 35 i, u našem modelu, ćelije kripto-vilusa koje se dalje smatraju kripto-vilusnim elementima npr. fibroblasti) u mezenhimu igraju ključnu ulogu u proizvodnji ECM proteina i regulaciji intestinalne morfogeneze in vivo35,37,38.Dodavanje mezenhimskih ćelija našem modelu poboljšalo je morfogenetski proces i efikasnost vezivanja ćelija. Endotelni sloj (tj. kapilare) ili regulaciju ćelijske imukularne imuke35,37,38. 40 u mikrookruženju crijeva. Nadalje, komponente vaskulature koje se mogu povezati između modela tkiva su preduvjet kada su modeli tkiva dizajnirani da pokažu interakcije više organa. Stoga će endotelne ćelije možda morati biti uključene da bi modelirali preciznije fiziološke karakteristike s rezolucijom na nivou organa. i tkivno-specifični imunitet u kontekstu oponašanja crijevne bolesti.
Upotreba hibridnih čipova je jednostavnija od gut-on-a-chip jer je postavljanje uređaja jednostavnije, a upotreba Transwell umetaka omogućava skalabilnu kulturu crijevnog epitela. Međutim, komercijalno dostupni Transwell umetci s poliesterskim membranama nisu elastični i ne mogu simulirati peristaltičke pokrete. nema smičnog naprezanja na apikalnoj strani. Jasno je da statička svojstva u apikalnom odjeljku rijetko omogućavaju dugotrajnu kokulturu bakterija u hibridnim čipovima. Iako možemo snažno inducirati 3D morfogenezu u Transwell umetcima kada koristimo hibridne čipove, nedostatak fiziološki relevantne biomehanike tečnosti može ograničiti apikalni potencijal biomehanike tečnosti.
Rekonstrukcije pune razmjere ljudske ose kripta-vilus u kulturama crijeva na čipu i hibrida na čipu nisu u potpunosti uspostavljene. Budući da morfogeneza počinje od epitelnog monosloja, 3D mikroarhitekture ne moraju nužno osigurati morfološku sličnost s kriptoćelijskom populacijom koja je u blizini kriptoćelije u populaciji koja je u blizini kripto-ćelije in vivo. mikroproizvedeni 3D epitel, kripta i vilozni regioni nisu bili jasno razgraničeni. Iako viši gornji kanali na čipu dovode do povećanja visine mikroinžinjernog epitela, maksimalna visina je i dalje ograničena na ~300–400 µm. Stvarna dubina crevnih i velikih kripta čoveka je oko 0 m3,5 u malom i manjem od oko 3µm5. ively, a visina resica tankog crijeva je ~600 µm41.
Sa stajališta snimanja, in situ snimanje 3D mikroarhitektura u superrezoluciji može biti ograničeno na crijevo na čipu, budući da je potrebna radna udaljenost od sočiva objektiva do epitelnog sloja reda veličine nekoliko milimetara. Da bi se ovaj problem prevazišao, može biti potreban udaljeni objektiv. Nadalje, izrada tankih preseka za izradu PD-a je potrebna za izradu slika visoke kvalitete. , budući da mikrofabrikacija crijeva sloj po sloj na čipu uključuje trajnu adheziju između svakog sloja, izuzetno je izazovno otvoriti ili ukloniti gornji sloj kako bi se ispitala površinska struktura epitelnog sloja. Na primjer, korištenjem skenirajućeg elektronskog mikroskopa (SEM).
Hidrofobnost PDMS-a bila je ograničavajući faktor u studijama zasnovanim na mikrofluidima koje se bave hidrofobnim malim molekulima, budući da PDMS može nespecifično adsorbirati takve hidrofobne molekule. Alternative PDMS-u se mogu razmotriti s drugim polimernim materijalima. adsorpciju hidrofobnih molekula.
Konačno, naša metoda nije dobro okarakterizirana u smislu pružanja skrininga visoke propusnosti ili eksperimentalne platforme „jedna veličina za sve“. Trenutni protokol zahtijeva pumpu za špric po mikrouređaju, koja zauzima prostor u CO2 inkubatoru i sprječava eksperimente velikih razmjera. Ovo ograničenje može se značajno poboljšati, npr. Porozni umetci sa 4 jažice koji omogućavaju kontinuirano dopunjavanje i uklanjanje bazolateralnog medija).
Da bismo inducirali 3D morfogenezu ljudskog crijevnog epitela in vitro, koristili smo intestinalni uređaj s mikrofluidnim čipom koji sadrži dva paralelna mikrokanala i elastičnu poroznu membranu između njih kako bismo stvorili sučelje lumen-kapilar. Također demonstriramo upotrebu jednokanalnog mikrofluidnog uređaja (bezkontinualni basno-hibridni sloj) koji pruža kontinuirani epi-bazo-hibridni sloj uzgajaju se na Transwell umetcima. Na obje platforme, morfogeneza različitih ljudskih intestinalnih epitelnih ćelija može se demonstrirati primjenom usmjerene manipulacije protoka kako bi se uklonili antagonisti morfogena iz bazolateralnog odjeljka. Cijeli eksperimentalni postupak (slika 1) sastoji se od pet dijelova: (i) mikrofabrikacija ili mikrofabrikacija crijevne jažice ili uložak za crijevo1brchip5 (Boks 1br chip chip, koji se može umetnuti). ii) priprema intestinalnih epitelnih ćelija (Caco-2 ćelije) ili ljudskih crevnih organoida;kutije 2-5), (iii) kultura intestinalnih epitelnih ćelija na intestinalnim čipovima ili hibridnim čipovima (koraci 6-9), (iv) indukcija 3D morfogeneze in vitro (korak 10) i (v) ) za karakterizaciju 3D mikrostrukture epitela dizajnirana je za karakterizaciju 3D mikrostrukture epitela (koraci za daljnju kontrolu F1 u nastavku) (koraci F1 u nastavku) su dizajnirani (4. kontrolna grupa). efikasnost in vitro morfogeneze poređenjem epitelne morfogeneze sa prostornim, vremenskim, uslovnim ili proceduralnim kontrolama.
Koristili smo dvije različite platforme kulture: gut-on-a-chip s ravnim kanalima ili nelinearnim zavijenim kanalima, ili hibridne čipove koji sadrže Transwell (TW) umetke u mikrofluidnom uređaju, proizvedenom kako je opisano u Okviru 1, a korak 1-5. "Izrada uređaja" pokazuje glavne korake u pravljenju jednog čipa ili izvora HiphelCstinulture od Humane hybridne ćelije. (Caco-2 ili ljudski intestinalni organoidi) i postupak kulture koji se koristi u ovom protokolu. "In vitro morfogeneza" pokazuje ukupne korake u kojima se Caco-2 ili epitelne ćelije izvedene iz organoida uzgajaju na intestinalnom čipu ili na Transwell umetcima hibridnog čipa, nakon čega slijedi indukcija broja morfogena morfogene strukture ili 3D okvira za formiranje programa. ed ispod svake strelice. Aplikacija pruža primjere kako se uspostavljeni slojevi crijevnog epitela mogu koristiti, na primjer, u karakterizaciji diferencijacije ćelija, studijama fiziologije crijeva, uspostavljanju ekosistema domaćin-mikrobioma i modeliranju bolesti. Imunofluorescentne slike u "Cell Differentiation" koje prikazuju jezgre i F-C2d ekspresiju epitela Calico2 na sloju Calico2. čip. MUC2 signalizacija je prisutna u peharastim ćelijama i sluzi koja se izlučuje sa površina sluzokože. Fluorescentne slike u fiziologiji crijeva pokazuju sluz proizvedenu bojenjem za ostatke sijalične kiseline i N-acetilglukozamina korištenjem fluorescentnog aglutinina pšeničnih klica. Dvije slike koje se preklapaju u "Host-C-Microbe co-culture" predstavljaju reprezentativne slike domaćina-C-Microbe t na čipu. Lijevi panel prikazuje ko-kulturu E. coli koja eksprimira zeleni fluorescentni protein (GFP) sa mikroinžinjeringom 3D Caco-2 epitelnim ćelijama. Desni panel prikazuje lokalizaciju GFP E. coli ko-kulture sa 3D Caco-2 epitelnim ćelijama, nakon čega slijedi imunofluorescencija i fluorescencija imunofluorescencije (stainuulisered-bluescencija) iD). određuje zdravu u odnosu na crijeva koja propuštaju u čipovima za upalu crijeva pod fiziološkim izazovom s bakterijskim antigenima (npr. lipopolisaharid, LPS) i imunim stanicama (npr. PBMC);zeleno). Caco-2 ćelije su kultivisane da bi se uspostavio 3D epitelni sloj. Skala traka, 50 µm. Slike u donjem redu: “Diferencijacija ćelija” prilagođena uz dozvolu reference.2.Oxford University Press;Reproducirano uz dozvolu iz Ref.5.NAS;“Kokultura domaćin-mikrob” prilagođena uz dozvolu iz ref.3.NAS;“Modeliranje bolesti” prilagođeno uz dozvolu reference.5.NAS.
I gut-on-chip i hibridni čipovi su proizvedeni korišćenjem PDMS replika koje su izvađene iz silicijumskih kalupa mekom litografijom1,44 i uzorkovane pomoću SU-8. Dizajn mikrokanala u svakom čipu je određen uzimanjem u obzir hidrodinamike kao što su napon smicanja i hidrodinamički pritisak), koji se sastoji od originalnog dizajna guchit-on. od dva paralelna paralelna ravna mikrokanala, evoluirao je u složeno crijevo-na-čipu (Prošireni podaci, slika 1b) koji uključuje par zakrivljenih mikrokanala da izazove produženo vrijeme zadržavanja tečnosti, nelinearne obrasce toka i multiaksijalnu deformaciju kultiviranih ćelija (slika 2a, 2a) da bi se kompleksniji gut–regenerirao više kompleksa gut–W. -on-a-chips se može izabrati. Pokazali smo da uvijeni Gut-Chip također snažno inducira 3D morfogenezu u sličnom vremenskom okviru sa sličnim stepenom rasta epitela u poređenju sa originalnim Gut-Chip-om, bez obzira na tip kultivirane ćelije. Stoga, da bi se inducirala 3D morfogeneza morfogeneze, linearna morfogeneza MS-chipge-a i MS gulikon se mogu reproducirati na kompleksu mol-chipge-a. ds sa uzorcima SU-8 dali su negativne karakteristike nakon demoliranja (sl.2a). Za proizvodnju crijeva na čipu, pripremljeni gornji PDMS sloj je sekvencijalno vezan za porozni PDMS film, a zatim poravnat sa donjim PDMS slojem ireverzibilnim spajanjem pomoću korona tretmana (Slika 2b–f). Da bi se proizveli hibridni čipovi, izliječeni su PDMS uređaji koji su mogli da sliježu na mikrokanalnu repliku na staklo. datum Transwell umetci (sl. 2h i prošireni podaci sl. 2). Proces vezivanja se izvodi tretiranjem površina PDMS replike i stakla tretmanom kisikom plazmom ili koronom. Nakon sterilizacije mikrofabrikovanog uređaja pričvršćenog na silikonsku cijev, postavka uređaja je bila spremna za izvođenje 3D morfogeneze morfogeneze2 u sliguumstinuru2.
a, Šematska ilustracija pripreme PDMS dijelova iz SU-8 uzorkovanih silikonskih kalupa. Nestvrdnuta otopina PDMS je izlivena u silikonski kalup (lijevo), osušena na 60 °C (sredina) i izvađena (desno). Izvađeni PDMS je isječen na komade i očišćen za dalju upotrebu.b, Fotografija silikonskog silikona upotrijebljena je za pripremu silikonovog sloja. koristi se za proizvodnju PDMS porozne membrane.d, Serija fotografija gornje i donje PDMS komponente i sastavljenog intestinalnog uređaja na čipu.e, Šema poravnanja gornje, membranske i donje PDMS komponente. Svaki sloj je nepovratno vezan plazmom ili korona mikrospremnom obradom od tkanine.f. s i vakuumske komore.g, Postavljanje gut-on-a-chip za mikrofluidnu ćelijsku kulturu. Proizvedeno crijevo na čipu sastavljeno silikonskom cijevi i špricem je stavljeno na pokrovno staklo. Uređaj za čip je postavljen na poklopac Petrijeve posude od 150 mm za obradu. Vezivno sredstvo se koristi za zatvaranje silikonskog silikona za preradu. i 3D morfogeneza pomoću hibridnih čipova. Transwell umetci pripremljeni nezavisno za kultivaciju 2D monoslojevi intestinalnih epitelnih ćelija umetnuti su u hibridni čip kako bi se inducirala intestinalna 3D morfogeneza. Medijum se perfundira kroz mikrokanale ispod ćelijskog sloja. 4 uspostavljen na referentnom sloju Transmission bar cm.Elsevier.
U ovom protokolu, Caco-2 ćelijska linija i crijevni organoidi korišteni su kao epitelni izvori (slika 3a). Obje vrste ćelija su kultivisane nezavisno (kutija 2 i kutija 5) i korištene za zasijavanje mikrokanala obloženih ECM-om crijeva na čipu ili transwell umetaka. starosti 10 i 50 godina) u T-bocama se sakupljaju da bi se pripremile disocirane ćelijske suspenzije pomoću tečnosti za tripsinizaciju (kutija 2). Ljudski crevni organoidi iz crevnih biopsija ili hirurških resekcija kultivisani su u kupolama Matrigel skele u pločama sa 24 jažice da bi se podržao strukturni morfijum koji sadrži esencijalni morfijum. i Noggin) i faktori rasta pripremljeni kako je opisano u Okviru 3 dopunjavali su se svaki drugi dan sve dok organoidi ne narastu do ~500 µm u prečniku. Potpuno izrasli organoidi se sakupe i razdvoje u pojedinačne ćelije za sijanje na crijeva ili Transwell umetke na čip (Okvir 5). bolest, kolorektalni karcinom ili normalni donor), mjesto lezije (npr. lezija naspram područja bez lezije) i gastrointestinalna lokacija u traktu (npr. duodenum, jejunum, ileum, cekum, debelo crijevo ili rektum). Pružamo optimizirani protokol u okviru 5 za uzgoj organoida debelog crijeva koji obično zahtijevaju veću koncentraciju organoida u debelom crijevu (kolofostin).
a, Radni tok za indukciju morfogeneze crijeva u crijevnom čipu. Caco-2 humani crijevni epitel i crijevni organoidi se koriste u ovom protokolu za demonstriranje 3D morfogeneze. Izolirane epitelne ćelije su zasijane u pripremljenom uređaju gut-on-a-chip (ćelije su spojene na PD sa čipom i spojene na MS preparat). porozna membrana 0. dana (D0), apikalni (AP) tok se pokreće i održava prva 2 dana (tok, AP, D0-D2). Bazolateralni (BL) tok se takođe pokreće zajedno sa cikličnim pokretima istezanja (istezanje, protok, AP i BL) kada se potpuni 2D tok, AP i BL formira nakon spontanog formiranja 2D monosloja mikrosloja 35 dana (D. fogeneza, D5).Fazne kontrastne slike pokazuju reprezentativnu morfologiju Caco-2 ćelija u svakom eksperimentalnom koraku ili vremenskoj tački (bar graf, 100 µm). Četiri šematska dijagrama koji ilustruju odgovarajuće kaskade morfogeneze crijeva (gore desno). Isprekidane strelice na šemi predstavljaju smjer epilogije Caco-2 na vrhu, prikazanu površinsku epilogiju D3 pokazuju smjer protoka tekućine na vrhu. ft). Umetak koji ističe uvećano područje (bijela isprekidana kutija) prikazuje regenerisane mikroresice na 3D Caco-2 sloju (desno).c, Horizontalni frontalni pogled na uspostavljeni Caco-2 3D, klaudin (ZO-1, crvena) i kontinuirane membrane četkice označene F-actin (zeleno) i nukleusne imunofluoroscentne epifluoroscene na vizuelnim ćelijama nukleusa (zelena) čips. Strelice koje pokazuju na srednju šemu ukazuju na lokaciju fokalne ravni za svaki konfokalni prikaz.d, Vremenski tok morfoloških promjena u organoidima uzgojenim na čipu dobijenom faznokontrastnom mikroskopijom 3., 7., 9., 11. i 13. dana. Umetak (gore desno) pokazuje veliko uvećanje, snimljeno datog epigrafskog snimka IC-a organa na slici 3D. dana 7.f, prekrivene imunofluorescentne slike koje pokazuju markere za matične ćelije (LGR5;magenta), peharaste ćelije (MUC2; zelena), F-aktin (siva) i jezgra (cijan) uzgajane na čipovima crijeva 3 dana, odnosno (lijevo) i 13-dnevne (srednje) organoide na epitelnom sloju. Vidite i proširene podatke sliku 3, koja naglašava LGR5 signalizaciju signala mikroscene desno (snimci mikroscene MUC2 pokazuju signalizaciju mikroscene s desne strane). 3D organoidni epitel uspostavljen u crijevima na čipu bojenjem plazma membrane bojom CellMask (desno) 13. dana kulture. Bar na skali je 50 μm osim ako nije drugačije navedeno.b Ponovno štampano uz dozvolu reference.2.Oxford University Press;c Prilagođeno uz dozvolu Reference.2.Oxford University Press;e i f prilagođeno uz dozvolu putem reference.12 Pod Creative Commons licencom CC BY 4.0.
U crijevima na čipu, potrebno je modificirati hidrofobnu površinu PDMS porozne membrane za uspješno ECM premaz. U ovom protokolu primjenjujemo dvije različite metode za modifikaciju hidrofobnosti PDMS membrana. Za kultivaciju Caco-2 ćelija, površinska aktivacija UV/ozonskim tretmanom, i samo obrada površine EPD-MS MS-a bili su dovoljni da se smanji EPD hidrofobna površina Caco-MS MS ćelije. membrana.Međutim, mikrofluidna kultura organoidnog epitela zahtijeva funkcionalizaciju površine zasnovanu na hemijskoj osnovi kako bi se postiglo efikasno taloženje ECM proteina uzastopnim nanošenjem polietilenimina (PEI) i glutaraldehida na PDMS mikrokanale. Nakon modifikacije površine, ECM proteini su deponovani da pokriju izolovane ćelije epitela, a zatim funkcionalizirane ćelije izolovanog organa PDMS se pričvršćuju. idic ćelijska kultura počinje perfuzijom samo medijuma u gornji mikrokanal sve dok ćelije ne formiraju potpuni monosloj, dok donji mikrokanal održava statičke uslove. Ova optimizovana metoda za površinsku aktivaciju i ECM prevlaku omogućava pričvršćivanje organoidnog epitela da izazove 3D morfogenezu na površini PDMS.
Transwell kulture takođe zahtevaju ECM premaz pre setve ćelija;međutim, Transwell kulture ne zahtijevaju složene korake prethodnog tretmana za aktiviranje površine poroznih umetaka. Za uzgoj Caco-2 ćelija na Transwell umetcima, ECM premaz na poroznim umetcima ubrzava pričvršćivanje disociranih Caco-2 ćelija (<1 sat) i formiranje barijere uske spojnice (<1-2 dana). površine (<3 h) i održava se dok organoidi ne formiraju potpuni monosloj sa integritetom barijere. Transwell kulture se izvode u pločama sa 24 jažice bez upotrebe hibridnih čipova.
In vitro 3D morfogeneza se može pokrenuti primjenom protoka tekućine na bazolateralni aspekt uspostavljenog epitelnog sloja. U crijevima na čipu, epitelna morfogeneza je započela kada je medij perfundiran u gornji i donji mikrokanale (slika 3a). Kao što je prethodno opisano, ključno je uvesti kontinuirani tok tečnosti ili morfogeneze u smjeru ferolateralnog uklanjanja. s. Da bismo osigurali dovoljno nutrijenata i seruma ćelijama vezanim za porozne membrane i stvorile luminalni smični stres, obično primjenjujemo dvostruki tok u crijevima na čipu. U hibridnim čipovima, Transwell umetci koji sadrže epitelne monoslojeve umetnuti su u hibridne čipove. Zatim je podloga primijenjena ispod mikrobočne strane porerogene jame. crveno 3-5 dana nakon početka bazolateralnog protoka u obje platforme kulture.
Morfološke karakteristike mikroinženjerskih 3D epitelnih slojeva mogu se analizirati primjenom različitih modaliteta snimanja, uključujući fazno-kontrastnu mikroskopiju, mikroskopiju diferencijalnog interferencijalnog kontrasta (DIC), SEM ili imunofluorescentnu konfokalnu mikroskopiju (slike 3 i 4). Fazni kontrast ili DIC slikanje mogu se lako izvesti za praćenje epitelnog sloja u bilo kojem trenutku i 3D za praćenje oblika. optičku transparentnost PDMS-a i poliesterskih filmova, i platforme crijeva na čipu i hibridni čip mogu obezbijediti in situ snimanje u realnom vremenu bez potrebe za sečenjem ili rastavljanjem uređaja. Prilikom izvođenja imunofluorescentnog snimanja (slike 1, 3c, f i 4b su tipično fiksne ćelije sa 4-volumenom FA), zatim Triton X-100 i 2% (mas./vol)) goveđeg serumskog albumina (BSA), po redu. U zavisnosti od tipa ćelije, mogu se koristiti različiti fiksatori, permeabilizatori i blokirajući agensi. cleus (npr. 4′,6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) ili F-aktin (npr. fluorescentno označeni faloidin). Živo snimanje zasnovano na fluorescenciji se takođe može izvesti in situ da bi se otkrila proizvodnja sluzi (Sl.1, “Diferencijacija ćelija” i “Fiziologija crijeva”), nasumična kolonizacija mikrobnih ćelija (Slika 1, “Kokultura domaćin-mikrob”), regrutovanje imunoloških ćelija (Slika 1, 'Modeliranje bolesti') ili konture 3D epitelne morfologije (sl. odvojite gornji sloj od donjeg sloja mikrokanala, kao što je opisano u ref. Kao što je prikazano na slici 2, 3D epitelna morfologija kao i mikrovili na ivici apikalne četkice mogu se vizualizirati SEM-om (slika 3b). Ekspresija markera diferencijacije može se procijeniti izvođenjem kvantitativnog PCR5 ili epitelnog rasta ćelija u jednom ćelijskom slučaju3D. čips ili hibridni čips sakupljaju se tripsinizacijom, a zatim se koriste za molekularnu ili genetsku analizu.
a, Radni tok za indukciju intestinalne morfogeneze u hibridnom čipu. Caco-2 i crijevni organoidi se koriste u ovom protokolu za demonstriranje 3D morfogeneze na platformi hibridnog čipa. Disocirane epitelne ćelije su posađene u pripremljene Transwell umetke i priložene su slike u nastavku (TW u nastavku). membrane u Transwell umetcima, sve ćelije su kultivisane u statičkim uslovima (TW kultura). Nakon 7 dana, jedan Transwell umetak koji je sadržavao 2D monosloj epitelnih ćelija je integrisan u hibridni čip da bi se uveo bazolateralni tok (Flow, BL), što je na kraju dovelo do stvaranja 3D morfološkog epitelnog sloja epitelnog epitela u 3D organu (Pha). izvučeni iz uzlaznog debelog crijeva normalnog donora (linija C103) u svakom eksperimentalnom koraku ili vremenskoj tački. Šeme u gornjim slojevima ilustriraju eksperimentalnu konfiguraciju za svaki korak.b, Hibridni čipovi (lijeva shema) mogu dovesti do 3D morfogeneze organoidnih epitelnih stanica sa odozgo prema dolje u konfokalnom Z-položaju;vidi desnu šemu i odgovarajuće isprekidane linije).pokazao očigledne morfološke karakteristike. F-aktin (cijan), jezgro (sivo).c, fluorescentne konfokalne mikrografije (3D pogled pod uglom) epitelnih ćelija dobijenih iz organoida kultivisanih u statičkom Transwellu (TW; umetak u belu isprekidanu kutiju) naspram hibridnog čipa (najveća puna slika) u odnosu na ukrštanje 3D u odnosu na 3D u odnosu na 2D. Izrezani prikazi (umetnuti u gornjem desnom uglu; “XZ”) takođe pokazuju 2D i 3D karakteristike. Skalirana traka, 100 µm.c Ponovo štampano uz dozvolu reference.4.Elsevier.
Kontrole se mogu pripremiti kultivisanjem istih ćelija (Caco-2 ili epitelne ćelije crevnog organoida) u dvodimenzionalne monoslojeve pod konvencionalnim uslovima statičke kulture. Naročito, iscrpljivanje nutrijenata može rezultirati zbog ograničenog zapreminskog kapaciteta mikrokanala (tj. ~4 µL u gornjem kanalu na originalnom dizajnu creva-oref i epitela). uporediti.
Proces meke litografije treba izvoditi u čistoj prostoriji. Za svaki sloj na čipu (gornji i donji slojevi i membrane) i hibridne čipove korištene su različite fotomaske koje su proizvedene na zasebnim silikonskim pločicama jer su visine mikrokanala bile različite. Ciljane visine gornjih i donjih mikrokanala crijeva su 50 mm i 0µ0 mm u odnosu na membranu crijeva. Visina cilja kanala hibridnog čipa je 200 µm.
Stavite silikonsku oblatnu od 3 inča u posudu sa acetonom. Lagano vrtite ploču 30 sekundi, a zatim je osušite na vazduhu. Prebacite oblatnu na tanjir sa IPA, a zatim okrenite ploču 30 s da se očisti.
Otopina pirane (mješavina vodikovog peroksida i koncentrirane sumporne kiseline, 1:3 (vol/vol)) može se opcionalno koristiti za maksimiziranje uklanjanja organskih ostataka sa površine silicijumske pločice.
Piranha otopina je izuzetno korozivna i stvara toplinu. Potrebne su dodatne sigurnosne mjere. Za odlaganje otpada, ostavite otopinu da se ohladi i prebacite u čist, suh kontejner za otpad. Koristite sekundarne kontejnere i pravilno označite kontejnere za otpad. Molimo slijedite sigurnosne smjernice ustanove za detaljnije postupke.
Oblatne dehidrirajte tako što ćete ih staviti na ringlu na 200 °C na 10 min. Nakon dehidracije, vafla je protresena pet puta na zraku da se ohladi.
Sipajte ~10 g fotorezista SU-8 2100 na sredinu očišćene silikonske vafle. Koristite pincetu da ravnomjerno rasporedite fotorezist po oblandi. Povremeno stavite oblatnu na ringlu na 65°C kako bi fotorezist bio manje ljepljiv i lakši za razmazivanje. Ne stavljajte oblatnu za vruću ploču direktno na vaflu.
SU-8 je ravnomjerno raspoređen na pločicu pokretanjem centrifugiranja. Programirajte ulaznu rotaciju SU-8 za 5–10 s da se širi na 500 o/min pri ubrzanju od 100 o/min. gornji sloj crijeva na čipu; pogledajte “Kritični koraci” ispod) postavljen na ubrzanje od 300 o/min 30 sekundi na 1200 o/min.
Glavna brzina centrifuge može se podesiti prema željenoj debljini uzorka SU-8 na silikonskoj pločici.
Za izradu SU-8 uzoraka visine 500 µm za gornji sloj crijeva na čipu, centrifugiranje i koraci mekog pečenja ove kutije (korak 7 i 8) su uzastopno ponovljeni (pogledajte korak 9) kako bi se proizvela dva sloja od 250 µm. Debeo sloj SU-8, koji se može spojiti slojem od UV-a, slojem od 5 sloja, koji se može spojiti slojem od UV0, slojem expos1. µm visoko.
Oblatne obložene SU-8 mekano ispecite tako što ćete ih pažljivo staviti na grijaću ploču na 65 °C 5 min, zatim prebaciti postavku na 95 °C i inkubirati dodatnih 40 min.
Da biste postigli visinu SU-8 uzorka od 500 μm u gornjem mikrokanalu, ponovite korake 7 i 8 da biste stvorili dva sloja SU-8 debljine 250 μm.
Koristeći UV masku za poravnavanje, izvršite testiranje lampe prema uputstvima proizvođača da biste izračunali vrijeme izlaganja pločice. (vrijeme ekspozicije, ms) = (doza izlaganja, mJ/cm2)/(snaga lampe, mW/cm2).
Nakon određivanja vremena ekspozicije, postavite fotomasku na držač maske UV maske za poravnavanje i postavite fotomasku na pločicu obloženu SU-8.
Postavite štampanu površinu fotomaske direktno na SU-8 obloženu stranu silikonske pločice kako biste minimizirali UV disperziju.
Izložite SU-8 obloženu pločicu i fotomasku vertikalno na 260 mJ/cm2 UV svjetlosti tokom unaprijed određenog vremena ekspozicije (pogledajte korak 10 ovog okvira).
Nakon izlaganja UV zračenju, SU-8 obložene silikonske pločice su pečene na 65°C 5 minuta i 95°C 15 minuta na svakoj vrućoj ploči da bi se izradili uzorci visine 200 μm. Produžite vrijeme nakon pečenja na 95 °C na 30 minuta da biste izradili uzorke visine 500 µm.
Razvijač se sipa u staklenu posudu, a pečena oblanda se stavlja u posudu. Količina razvijača SU-8 može varirati u zavisnosti od veličine staklene ploče. Obavezno koristite dovoljno razvijača SU-8 da potpuno uklonite neosvetljeni SU-8. Na primer, kada koristite staklenu posudu prečnika 150 mm sa kapacitetom od 1 L, koristite razvitak od ~300 mola za razvitak od ~300 mola povremeno. tation.
Isperite razvijeni kalup sa ~10 mL svježeg razvijača, a zatim IPA prskanjem otopine pomoću pipete.
Stavite pločicu u čistač za plazmu i izložite plazmi kiseonika (atmosferski gas, ciljni pritisak 1 × 10-5 Torr, snaga 125 W) na 1,5 min.
Stavite oblatnu u vakuum eksikator sa staklenim toboganom unutra. Oblatne i stakalca se mogu postaviti jedan pored drugog. Ako je vakuum eksikator pločom podijeljen na nekoliko slojeva, stavite stakla u donju komoru, a oblatne u gornju komoru. Nakapajte 100 μL rastvora trikloro(1H2oil) fluoro(1H2) fluoro(1H2) staklo i primijeniti vakuum za silanizaciju.
Odmrznite bočicu sa smrznutim Caco-2 ćelijama u vodenom kupatilu na 37°C, a zatim prenesite odmrznute ćelije u bocu T75 koja sadrži 15 mL prethodno zagrejanog Caco-2 medijuma na 37°C.
Za propuštanje Caco-2 ćelija pri ~90% konfluentnosti, prvo zagrejte Caco-2 medijum, PBS i 0,25% tripsina/1 mM EDTA u vodenom kupatilu na 37°C.
Aspirirajte medijum vakuumskom aspiracijom. Isperite ćelije dva puta sa 5 mL toplog PBS-a ponavljanjem vakuum aspiracije i dodavanjem svežeg PBS-a.