Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Evolucija mikrobnih parazita uključuje kontraakciju između prirodne selekcije, koja uzrokuje poboljšanje parazita, i genetskog drifta, koji uzrokuje da paraziti gube gene i akumuliraju štetne mutacije.Ovdje, da bismo razumjeli kako se ova kontraakcija događa na skali jedne makromolekule, opisujemo krio-EM strukturu ribozoma Encephalitozoon cuniculi, eukariotskog organizma s jednim od najmanjih genoma u prirodi.Ekstremno smanjenje rRNA u ribosomima E. cuniculi praćeno je neviđenim strukturnim promjenama, kao što je evolucija prethodno nepoznatih spojenih rRNA linkera i rRNA bez izbočina.Osim toga, ribosom E. cuniculi preživio je gubitak rRNA fragmenata i proteina razvijajući sposobnost korištenja malih molekula kao strukturnih imitacija degradiranih fragmenata i proteina rRNA.Sve u svemu, pokazujemo da molekularne strukture za koje se dugo smatralo da su reducirane, degenerisane i podložne oslabljujućim mutacijama imaju niz kompenzacijskih mehanizama koji ih održavaju aktivnima uprkos ekstremnim molekularnim kontrakcijama.
Budući da većina grupa mikrobnih parazita ima jedinstvene molekularne alate za iskorištavanje svojih domaćina, često moramo razviti različite terapije za različite grupe parazita1,2.Međutim, novi dokazi sugeriraju da su neki aspekti evolucije parazita konvergentni i uglavnom predvidljivi, što ukazuje na potencijalnu osnovu za široke terapijske intervencije kod mikrobnih parazita3,4,5,6,7,8,9.
Prethodni rad je identificirao uobičajeni evolucijski trend kod mikrobnih parazita nazvan redukcija genoma ili propadanje genoma10,11,12,13.Trenutna istraživanja pokazuju da kada mikroorganizmi odustanu od svog slobodnog načina života i postanu intracelularni paraziti (ili endosimbionti), njihovi genomi prolaze kroz spore, ali nevjerojatne metamorfoze tokom miliona godina9,11.U procesu poznatom kao propadanje genoma, mikrobni paraziti akumuliraju štetne mutacije koje pretvaraju mnoge ranije važne gene u pseudogene, što dovodi do postepenog gubitka gena i mutacionog kolapsa14,15.Ovaj kolaps može uništiti do 95% gena u najstarijim intracelularnim organizmima u poređenju sa blisko srodnim slobodnoživućim vrstama.Dakle, evolucija intracelularnih parazita je potezanje konopa između dvije suprotstavljene sile: darvinističke prirodne selekcije, koja dovodi do poboljšanja parazita, i kolapsa genoma, bacajući parazite u zaborav.Ostaje nejasno kako je parazit uspio izaći iz ovog potezanja konopa i zadržati aktivnost svoje molekularne strukture.
Iako mehanizam propadanja genoma nije u potpunosti shvaćen, čini se da se javlja uglavnom zbog čestog genetskog drifta.Budući da paraziti žive u malim, aseksualnim i genetski ograničenim populacijama, oni ne mogu efikasno eliminisati štetne mutacije koje se ponekad javljaju tokom replikacije DNK.To dovodi do nepovratnog nakupljanja štetnih mutacija i smanjenja genoma parazita.Kao rezultat toga, parazit ne samo da gubi gene koji više nisu potrebni za njegov opstanak u unutarćelijskom okruženju.Nesposobnost populacija parazita da efikasno eliminišu sporadične štetne mutacije uzrokuje da se te mutacije akumuliraju u cijelom genomu, uključujući njihove najvažnije gene.
Veliki dio našeg trenutnog razumijevanja redukcije genoma zasniva se isključivo na usporedbi genomskih sekvenci, s manje pažnje na promjene u stvarnim molekulima koji obavljaju kućne funkcije i služe kao potencijalne mete lijekova.Komparativna istraživanja su pokazala da teret štetnih intracelularnih mikrobnih mutacija predisponira proteine ​​i nukleinske kiseline da se pogrešno savijaju i agregiraju, čineći ih više ovisnim o šaperonu i preosjetljivim na toplinu19,20,21,22,23.Osim toga, različiti paraziti – nezavisna evolucija ponekad razdvojena čak 2,5 milijardi godina – doživjeli su sličan gubitak centara kontrole kvaliteta u njihovoj sintezi proteina5,6 i mehanizmima popravke DNK24.Međutim, malo se zna o utjecaju intracelularnog načina života na sva druga svojstva ćelijskih makromolekula, uključujući molekularnu adaptaciju na sve veći teret štetnih mutacija.
U ovom radu, u cilju boljeg razumijevanja evolucije proteina i nukleinskih kiselina intracelularnih mikroorganizama, utvrdili smo strukturu ribozoma intracelularnog parazita Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi je organizam sličan gljivici koji pripada grupi parazitskih mikrosporidija koje imaju neobično male eukariotske genome i stoga se koriste kao modelni organizmi za proučavanje propadanja genoma25,26,27,28,29,30.Nedavno je određena struktura krio-EM ribosoma za umjereno reducirane genome Microsporidia, Paranosema locustae i Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genoma).Ove strukture sugeriraju da se određeni gubitak amplifikacije rRNA kompenzira razvojem novih kontakata između susjednih ribosomalnih proteina ili akvizicijom novih msL131,32 ribosomskih proteina.Vrsta Encephalitozoon (genom ~2,5 miliona bp), zajedno sa svojim najbližim srodnikom Ordospora, pokazuje krajnji stepen redukcije genoma kod eukariota – imaju manje od 2000 gena koji kodiraju proteine, a očekuje se da njihovi ribosomi nisu samo lišeni rRNA ekspanzijskih fragmenata rebrosoma bakterija (rRNA-uk ribosomski fragmenti ribosoma takođe razlikuju fragmente ribosoma rRNAuk omalnih proteina zbog nedostatka homologa u genomu E. cuniculi26,27,28.Stoga smo zaključili da ribosom E. cuniculi može otkriti dosad nepoznate strategije za molekularnu adaptaciju na propadanje genoma.
Naša krio-EM struktura predstavlja najmanji eukariotski citoplazmatski ribozom koji treba okarakterizirati i pruža uvid u to kako krajnji stupanj redukcije genoma utječe na strukturu, sklapanje i evoluciju molekularne mašinerije koja je sastavni dio ćelije.Otkrili smo da ribosom E. cuniculi krši mnoge od široko očuvanih principa savijanja RNK i sastavljanja ribosoma, i otkrili novi, ranije nepoznati ribosomski protein.Sasvim neočekivano, pokazujemo da su ribosomi mikrosporidije razvili sposobnost vezivanja malih molekula i pretpostavljamo da skraćivanja rRNA i proteina pokreću evolucijske inovacije koje na kraju mogu dati korisne kvalitete ribosomu.
Kako bismo poboljšali naše razumijevanje evolucije proteina i nukleinskih kiselina u intracelularnim organizmima, odlučili smo izolirati spore E. cuniculi iz kultura inficiranih stanica sisara kako bismo pročistili njihove ribozome i odredili strukturu ovih ribozoma.Teško je dobiti veliki broj parazitskih mikrosporidija jer se mikrosporidija ne može uzgajati u hranljivom mediju.Umjesto toga, oni rastu i razmnožavaju se samo unutar ćelije domaćina.Stoga, da bismo dobili biomasu E. cuniculi za pročišćavanje ribosoma, inficirali smo ćelijsku liniju bubrega sisara RK13 sa sporama E. cuniculi i uzgajali ove inficirane ćelije nekoliko sedmica kako bismo omogućili E. cuniculi da raste i razmnožava se.Koristeći inficirani stanični monosloj od oko pola kvadratnog metra, uspjeli smo pročistiti oko 300 mg spora Microsporidia i iskoristiti ih za izolaciju ribozoma.Zatim smo razbili pročišćene spore staklenim perlama i izolovali sirove ribozome koristeći postepenu polietilen glikol frakcionaciju lizata.Ovo nam je omogućilo da dobijemo približno 300 µg sirovih ribozoma E. cuniculi za strukturnu analizu.
Zatim smo prikupili cryo-EM slike koristeći rezultirajuće uzorke ribosoma i obrađivali ove slike koristeći maske koje odgovaraju velikoj ribosomalnoj podjedinici, maloj glavi podjedinice i maloj podjedinici.Tokom ovog procesa prikupili smo slike od oko 108.000 ribosomskih čestica i izračunali krio-EM slike rezolucije 2,7 Å (dodatne slike 1-3).Zatim smo koristili cryoEM slike za modeliranje rRNA, ribosomalnog proteina i faktora hibernacije Mdf1 povezanog sa ribozomima E. cuniculi (Slika 1a, b).
a Struktura ribozoma E. cuniculi u kompleksu sa faktorom hibernacije Mdf1 (pdb id 7QEP).b Mapa faktora hibernacije Mdf1 povezanog sa ribozomom E. cuniculi.c Mapa sekundarne strukture koja upoređuje pronađenu rRNA u mikrosporidijskim vrstama sa poznatim ribosomskim strukturama.Paneli pokazuju lokaciju amplificiranih fragmenata rRNA (ES) i aktivnih mjesta ribosoma, uključujući mjesto za dekodiranje (DC), petlju sarcicina (SRL) i centar peptidil transferaze (PTC).d Gustoća elektrona koja odgovara centru peptidil transferaze ribozoma E. cuniculi sugerira da ovo katalitičko mjesto ima istu strukturu kod parazita E. cuniculi i njegovih domaćina, uključujući H. sapiens.e, f Odgovarajuća elektronska gustina centra za dekodiranje (e) i šematska struktura centra za dekodiranje (f) ukazuju da E. cuniculi ima ostatke U1491 umjesto A1491 (E. coli numeracija) u mnogim drugim eukariotima.Ova promjena sugerira da E. cuniculi može biti osjetljiva na antibiotike koji ciljaju ovo aktivno mjesto.
Za razliku od ranije utvrđenih struktura ribozoma V. necatrix i P. locustae (obe strukture predstavljaju istu porodicu mikrosporidija Nosematidae i veoma su slične jedna drugoj), 31,32 E. cuniculi ribozomi prolaze kroz brojne procese fragmentacije rRNA i proteina.Dalja denaturacija (dodatne slike 4-6).U rRNA, najupečatljivije promjene uključivale su potpuni gubitak amplificiranog 25S rRNA fragmenta ES12L i djelomičnu degeneraciju spirala h39, h41 i H18 (slika 1c, dodatna slika 4).Među ribosomskim proteinima, najupečatljivije promjene uključivale su potpuni gubitak proteina eS30 i skraćivanje eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 i ​​eS7 proteina (Slika 4, dopunski proteini eS7).
Dakle, ekstremno smanjenje genoma vrsta Encephalotozoon/Ordospora ogleda se u njihovoj strukturi ribosoma: ribosomi E. cuniculi doživljavaju najdramatičniji gubitak sadržaja proteina u eukariotskim citoplazmatskim ribosomima koji su podložni strukturnoj karakterizaciji, a nemaju čak ni one rRNA i proteinske domene koji čuvaju i fragmente života ne samo u tri široko rasprostranjene fragmente.Struktura ribozoma E. cuniculi pruža prvi molekularni model za ove promjene i otkriva evolucijske događaje koji su zanemareni i komparativnom genomikom i proučavanjem unutarćelijske biomolekularne strukture (dopunska slika 7).U nastavku opisujemo svaki od ovih događaja zajedno s njihovim vjerojatnim evolucijskim porijeklom i njihovim potencijalnim utjecajem na funkciju ribosoma.
Zatim smo otkrili da, pored velikih skraćenja rRNA, ribozomi E. cuniculi imaju varijacije rRNA na jednom od svojih aktivnih mjesta.Iako centar peptidil transferaze ribozoma E. cuniculi ima istu strukturu kao i drugi eukariotski ribozomi (slika 1d), centar za dekodiranje se razlikuje zbog varijacije sekvence na nukleotidu 1491 (numeracija E. coli, slika 1e, f).Ovo zapažanje je važno jer mjesto dekodiranja eukariotskih ribozoma tipično sadrži ostatke G1408 i A1491 u poređenju s ostacima bakterijskog tipa A1408 i G1491.Ova varijacija leži u osnovi različite osjetljivosti bakterijskih i eukariotskih ribozoma na aminoglikozidnu porodicu ribosomalnih antibiotika i drugih malih molekula koji ciljaju mjesto dekodiranja.Na mjestu dekodiranja ribozoma E. cuniculi, ostatak A1491 je zamijenjen sa U1491, potencijalno stvarajući jedinstveno vezujuće sučelje za male molekule koji ciljaju ovo aktivno mjesto.Ista varijanta A14901 je također prisutna u drugim mikrosporidijama kao što su P. locustae i V. necatrix, što sugerira da je široko rasprostranjena među vrstama mikrosporidija (slika 1f).
Budući da su naši uzorci ribosoma E. cuniculi izolovani iz metabolički neaktivnih spora, testirali smo krio-EM mapu E. cuniculi na prethodno opisano vezivanje ribosoma u uslovima stresa ili gladovanja.Faktori hibernacije 31,32,36,37, 38. Usporedili smo prethodno utvrđenu strukturu hibernajućeg ribozoma sa cryo-EM mapom ribozoma E. cuniculi.Za pristajanje su korišteni ribozomi S. cerevisiae u kompleksu sa faktorom hibernacije Stm138, ribozomi skakavca u kompleksu sa faktorom Lso232 i ribozomi V. necatrix u kompleksu sa faktorima Mdf1 i Mdf231.Istovremeno smo pronašli krio-EM gustinu koja odgovara faktoru mirovanja Mdf1.Slično vezivanju Mdf1 za ribozom V. necatrix, Mdf1 se također vezuje za ribozom E. cuniculi, gdje blokira E mjesto ribozoma, možda pomažući da ribozomi budu dostupni kada spore parazita postanu metabolički neaktivne nakon inaktivacije tijela (slika 2).).
Mdf1 blokira E mjesto ribosoma, što izgleda pomaže u inaktivaciji ribozoma kada spore parazita postanu metabolički neaktivne.U strukturi ribozoma E. cuniculi, otkrili smo da Mdf1 formira prethodno nepoznat kontakt sa stablom ribozoma L1, dijelom ribozoma koji olakšava oslobađanje deacilirane tRNA iz ribozoma tokom sinteze proteina.Ovi kontakti sugeriraju da se Mdf1 odvaja od ribozoma koristeći isti mehanizam kao i deacetilirana tRNA, pružajući moguće objašnjenje kako ribosom uklanja Mdf1 da bi reaktivirao sintezu proteina.
Međutim, naša struktura je otkrila nepoznati kontakt između Mdf1 i L1 noge ribosoma (dio ribozoma koji pomaže oslobađanju deacilirane tRNA iz ribozoma tokom sinteze proteina).Posebno, Mdf1 koristi iste kontakte kao i lakat segment deaciliranog tRNA molekula (slika 2).Ovo ranije nepoznato molekularno modeliranje pokazalo je da se Mdf1 odvaja od ribozoma koristeći isti mehanizam kao i deacetilirana tRNA, što objašnjava kako ribosom uklanja ovaj faktor hibernacije kako bi reaktivirao sintezu proteina.
Kada smo konstruisali rRNA model, otkrili smo da ribozom E. cuniculi ima abnormalno presavijene rRNA fragmente, koje smo nazvali fuzionisana rRNA (slika 3).U ribosomima koji obuhvataju tri domena života, rRNA se savija u strukture u kojima se većina baza rRNA ili uparuje i savija jedna s drugom ili u interakciji s ribosomskim proteinima38,39,40.Međutim, u ribosomima E. cuniculi, rRNK izgleda krše ovaj princip savijanja pretvarajući neke od svojih spirala u nesavijene rRNA regije.
Struktura heliksa H18 25S rRNA u S. cerevisiae, V. necatrix i E. cuniculi.Tipično, u ribosomima koji obuhvataju tri životna domena, ovaj linker se uvija u RNA heliks koji sadrži 24 do 34 ostatka.U Microsporidia, nasuprot tome, ovaj rRNA linker se postepeno reducira na dva jednolančana linkera bogata uridinom koji sadrže samo 12 ostataka.Većina ovih ostataka je izložena rastvaračima.Slika pokazuje da se čini da parazitske mikrosporije krše opšte principe savijanja rRNA, gdje su baze rRNA obično povezane s drugim bazama ili uključene u interakcije rRNA-proteina.U mikrosporidiji, neki rRNA fragmenti poprimaju nepovoljan nabor, u kojem bivša spirala rRNA postaje jednolančani fragment izdužen gotovo u pravoj liniji.Prisustvo ovih neobičnih regiona omogućava rRNA mikrosporidije da veže udaljene rRNA fragmente koristeći minimalan broj RNK baza.
Najupečatljiviji primjer ove evolucijske tranzicije može se uočiti u spirali H18 25S rRNA (slika 3).Kod vrsta od E. coli do ljudi, baze ove rRNA heliksa sadrže 24-32 nukleotida, formirajući blago nepravilnu spiralu.U prethodno identifikovanim ribosomskim strukturama iz V. necatrix i P. locustae,31,32, baze H18 heliksa su delimično razmotane, ali je uparivanje nukleotidnih baza očuvano.Međutim, kod E. cuniculi ovaj rRNA fragment postaje najkraći linkeri 228UUUGU232 i 301UUUUUUUUU307.Za razliku od tipičnih fragmenata rRNA, ovi linkeri bogati uridinom se ne motaju niti ostvaruju opsežan kontakt sa ribosomskim proteinima.Umjesto toga, oni usvajaju otapalo otvorene i potpuno nesavijene strukture u kojima su rRNA lanci produženi gotovo ravno.Ova rastegnuta konformacija objašnjava kako E. cuniculi koristi samo 12 RNA baza da popuni prazninu od 33 Å između H16 i H18 rRNA heliksa, dok druge vrste zahtijevaju najmanje dvostruko više rRNA baza da popune prazninu.
Dakle, možemo pokazati da su, energetski nepovoljnim savijanjem, parazitske mikrosporije razvile strategiju kontrakcije čak i onih rRNA segmenata koji ostaju široko očuvani među vrstama u tri domena života.Očigledno, akumulacijom mutacija koje transformišu rRNA spirale u kratke poli-U linkere, E. cuniculi može formirati neobične rRNA fragmente koji sadrže što je manje moguće nukleotida za ligaciju distalnih rRNA fragmenata.Ovo pomaže da se objasni kako je mikrosporidija postigla dramatično smanjenje svoje osnovne molekularne strukture bez gubitka strukturnog i funkcionalnog integriteta.
Još jedna neobična karakteristika rRNK E. cuniculi je pojava rRNK bez zadebljanja (slika 4).Izbočine su nukleotidi bez parova baza koji se izvijaju iz RNA heliksa umjesto da se kriju u njemu.Većina rRNA izbočina djeluje kao molekularni adheziv, pomažući u vezivanju susjednih ribosomskih proteina ili drugih fragmenata rRNA.Neke od izbočina djeluju kao šarke, omogućavajući rRNA heliksu da se optimalno savija i savija za produktivnu sintezu proteina 41 .
a Izbočina rRNA (numeracija S. cerevisiae) je odsutna u strukturi ribozoma E. cuniculi, ali je prisutna u većini drugih eukariota b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens i E. cuniculi unutrašnji ribozomi.parazitima nedostaju mnoge drevne, visoko konzervirane rRNA izbočine.Ova zadebljanja stabilizuju strukturu ribosoma;stoga, njihovo odsustvo u mikrosporidiji ukazuje na smanjenu stabilnost rRNA savijanja kod mikrosporidijskih parazita.Poređenje sa P stablima (L7/L12 stabljike kod bakterija) pokazuje da se gubitak rRNA kvržica ponekad poklapa sa pojavom novih kvržica pored izgubljenih kvržica.Heliks H42 u 23S/28S rRNA ima drevnu izbočinu (U1206 u Saccharomyces cerevisiae) za koju se procjenjuje da je stara najmanje 3,5 milijardi godina zbog svoje zaštite u tri domena života.U mikrosporidiji se ovo izbočenje eliminira.Međutim, uz izgubljeno ispupčenje pojavilo se novo ispupčenje (A1306 kod E. cuniculi).
Zapanjujuće, otkrili smo da ribozomima E. cuniculi nedostaje većina rRNA izbočina pronađenih kod drugih vrsta, uključujući više od 30 izbočina sačuvanih kod drugih eukariota (slika 4a).Ovaj gubitak eliminiše mnoge kontakte između ribosomskih podjedinica i susednih rRNA spirala, ponekad stvarajući velike šuplje šupljine unutar ribozoma, čineći ribosom E. cuniculi poroznijim u poređenju sa tradicionalnijim ribozomima (slika 4b).Značajno, otkrili smo da je većina ovih izbočina također izgubljena u prethodno identificiranim strukturama ribosoma V. necatrix i P. locustae, koje su previđene prethodnim strukturnim analizama31,32.
Ponekad je gubitak rRNA ispupčenja praćen razvojem novih izbočina pored izgubljene izbočine.Na primjer, ribosomsko P-stablo sadrži izbočinu U1208 (u Saccharomyces cerevisiae) koja je preživjela od E. coli do ljudi i stoga se procjenjuje da je stara 3,5 milijardi godina.Tokom sinteze proteina, ovo izbočenje pomaže P stablu da se kreće između otvorenih i zatvorenih konformacija tako da ribosom može regrutovati faktore translacije i dostaviti ih na aktivno mjesto.U ribozomima E. cuniculi ovo zadebljanje je odsutno;međutim, novo zadebljanje (G883) koje se nalazi samo u tri bazna para može doprinijeti vraćanju optimalne fleksibilnosti P stabla (slika 4c).
Naši podaci o rRNA bez izbočina sugeriraju da minimizacija rRNA nije ograničena na gubitak rRNA elemenata na površini ribosoma, već može uključiti i jezgro ribosoma, stvarajući molekularni defekt specifičan za parazite koji nije opisan u slobodnoživućim stanicama.posmatraju se žive vrste.
Nakon modeliranja kanonskih ribosomskih proteina i rRNA, otkrili smo da konvencionalne ribosomske komponente ne mogu objasniti tri dijela krio-EM slike.Dva od ovih fragmenata su male veličine (slika 5, dopunska slika 8).Prvi segment je u sendviču između ribosomalnih proteina uL15 i eL18 na poziciji koju obično zauzima C-terminus eL18, koji je skraćen kod E. cuniculi.Iako ne možemo utvrditi identitet ovog molekula, veličina i oblik ovog ostrva gustoće se dobro objašnjava prisustvom molekula spermidina.Njegovo vezivanje za ribozom stabilizirano je mutacijama specifičnim za mikrosporidiju u uL15 proteinima (Asp51 i Arg56), za koje se čini da povećavaju afinitet ribozoma za ovaj mali molekul, jer omogućavaju uL15 da omota mali molekul u ribosomalnu strukturu.Dodatna slika 2).8, dodatni podaci 1, 2).
Cryo-EM snimak koji pokazuje prisustvo nukleotida izvan riboze vezanih za ribozom E. cuniculi.U ribozomu E. cuniculi, ovaj nukleotid zauzima isto mjesto kao i 25S rRNA A3186 nukleotid (numeracija Saccharomyces cerevisiae) u većini drugih eukariotskih ribozoma.b U ribosomskoj strukturi E. cuniculi, ovaj nukleotid se nalazi između ribosomalnih proteina uL9 i eL20, čime se stabilizuje kontakt između dva proteina.analiza očuvanja sekvence cd eL20 među vrstama mikrosporidija.Filogenetsko stablo vrsta Microsporidia (c) i višestruko poravnanje sekvenci proteina eL20 (d) pokazuju da su ostaci koji se vezuju za nukleotide F170 i K172 sačuvani u većini tipičnih mikrosporidija, sa izuzetkom S. lophii, sa izuzetkom mikrosporidije ranog grananja, koja je zadržala RNA ekstenziju 39L.e Ova slika pokazuje da su ostaci koji se vezuju za nukleotide F170 i K172 prisutni samo u eL20 visoko redukovanog genoma mikrosporidije, ali ne i u drugim eukariotima.Sve u svemu, ovi podaci sugeriraju da su ribozomi Microsporidian razvili mjesto za vezivanje nukleotida za koje se čini da veže AMP molekule i koristi ih za stabilizaciju interakcija protein-protein u ribosomskoj strukturi.Visoka očuvanost ovog mjesta vezivanja kod Microsporidia i njegovo odsustvo kod drugih eukariota sugerira da ovo mjesto može pružiti prednost selektivnog preživljavanja za Microsporidia.Stoga se čini da džep koji se vezuje za nukleotide u ribosomu mikrosporidije nije degenerisana karakteristika ili krajnji oblik degradacije rRNA kao što je prethodno opisano, već je to korisna evoluciona inovacija koja omogućava ribosomu mikrosporidije da direktno veže male molekule, koristeći ih kao molekularne građevne blokove.građevni blokovi za ribozome.Ovo otkriće čini ribosom mikrosporidije jedinim ribosomom za koji se zna da koristi jedan nukleotid kao svoj strukturni gradivni blok.f Hipotetički evolucijski put izveden iz vezivanja nukleotida.
Druga niska molekulska gustina se nalazi na interfejsu između ribosomalnih proteina uL9 i eL30 (slika 5a).Ovo sučelje je prethodno opisano u strukturi ribozoma Saccharomyces cerevisiae kao mjesto vezivanja za 25S nukleotid rRNA A3186 (dio ekstenzije ES39L rRNA)38.Pokazalo se da u degenerisanim ribozomima P. locustae ES39L ovaj interfejs vezuje nepoznati pojedinačni nukleotid 31, a pretpostavlja se da je ovaj nukleotid redukovani konačni oblik rRNA, u kojoj je dužina rRNA ~130-230 baza.ES39L je reduciran na jedan nukleotid 32.43.Naše cryo-EM slike podržavaju ideju da se gustina može objasniti nukleotidima.Međutim, veća rezolucija naše strukture pokazala je da je ovaj nukleotid ekstraribozomalni molekul, vjerovatno AMP (Slika 5a, b).
Zatim smo pitali da li se mesto vezivanja nukleotida pojavilo u ribozomu E. cuniculi ili je postojalo ranije.Budući da je vezivanje nukleotida uglavnom posredovano Phe170 i Lys172 ostacima u eL30 ribosomskom proteinu, procijenili smo očuvanje ovih ostataka u 4396 reprezentativnih eukariota.Kao iu gore navedenom slučaju uL15, otkrili smo da su ostaci Phe170 i Lys172 visoko konzervirani samo u tipičnim Microsporidia, ali ih nema kod drugih eukariota, uključujući atipične Microsporidia Mitosporidium i Amphiamblys, kod kojih ES39L rRNA fragment nije reduciran (slika 454c6, slika 45c).-e).
Uzeti zajedno, ovi podaci podržavaju ideju da su E. cuniculi i moguće druge kanonske mikrosporidija razvile sposobnost da efikasno hvataju veliki broj malih metabolita u strukturi ribosoma kako bi kompenzirali pad nivoa rRNA i proteina.Čineći to, razvili su jedinstvenu sposobnost vezanja nukleotida izvan ribosoma, pokazujući da parazitske molekularne strukture kompenzuju tako što hvataju obilje malih metabolita i koriste ih kao strukturne imitacije degradirane RNK i fragmenata proteina..
Treći nesimulirani dio naše cryo-EM mape, pronađen u velikoj ribosomalnoj podjedinici.Relativno visoka rezolucija (2,6 Å) naše mape sugerira da ova gustoća pripada proteinima s jedinstvenim kombinacijama velikih ostataka bočnih lanaca, što nam je omogućilo da identificiramo ovu gustoću kao ranije nepoznati ribosomski protein koji smo identificirali kao msL2 (protein L2 specifičan za mikrosporidija) (metode, slika 6).Naša pretraga homologije pokazala je da je msL2 očuvan u kladi Microsporidia iz roda Encephaliter i Orosporidium, ali odsutan u drugim vrstama, uključujući druge Microsporidia.U ribosomskoj strukturi, msL2 zauzima prazninu nastalu gubitkom produžene ES31L rRNA.U ovoj praznini, msL2 pomaže u stabilizaciji savijanja rRNA i može nadoknaditi gubitak ES31L (slika 6).
a Elektronska gustina i model ribosomskog proteina msL2 specifičnog za Microsporidia koji se nalazi u ribozomima E. cuniculi.b Većina eukariotskih ribozoma, uključujući 80S ribozom Saccharomyces cerevisiae, ima ES19L rRNA amplifikaciju izgubljenu u većini mikrosporidijskih vrsta.Prethodno utvrđena struktura ribozoma mikrosporidija V. necatrix sugerira da je gubitak ES19L kod ovih parazita nadoknađen evolucijom novog ribosomalnog proteina msL1.U ovoj studiji smo otkrili da je ribosom E. cuniculi također razvio dodatni protein koji oponaša ribosomsku RNK kao očiglednu kompenzaciju za gubitak ES19L.Međutim, msL2 (trenutno označen kao hipotetički protein ECU06_1135) i msL1 imaju različito strukturno i evolucijsko porijeklo.c Ovo otkriće stvaranja evolucijski nepovezanih msL1 i msL2 ribosomskih proteina sugerira da ako ribozomi akumuliraju štetne mutacije u svojoj rRNA, mogu postići neviđene nivoe kompozicione raznolikosti čak i u maloj podskupini blisko povezanih vrsta.Ovo otkriće moglo bi pomoći da se razjasni porijeklo i evolucija mitohondrijalnog ribozoma, koji je poznat po svojoj visoko smanjenoj rRNA i abnormalnoj varijabilnosti u sastavu proteina među vrstama.
Zatim smo uporedili protein msL2 sa prethodno opisanim proteinom msL1, jedinim poznatim ribosomskim proteinom specifičnim za mikrosporidiju koji se nalazi u ribozomu V. necatrix.Željeli smo testirati da li su msL1 i msL2 evolucijski povezani.Naša analiza je pokazala da msL1 i msL2 zauzimaju istu šupljinu u ribosomskoj strukturi, ali imaju različite primarne i tercijarne strukture, što ukazuje na njihovo nezavisno evoluciono poreklo (slika 6).Dakle, naše otkriće msL2 pruža dokaz da grupe kompaktnih eukariotskih vrsta mogu nezavisno evoluirati strukturno različite ribosomske proteine ​​kako bi nadoknadile gubitak fragmenata rRNA.Ovaj nalaz je značajan po tome što većina citoplazmatskih eukariotskih ribozoma sadrži nepromjenjiv protein, uključujući istu porodicu od 81 ribosomskog proteina.Pojava msL1 i msL2 u različitim kladama mikrosporidija kao odgovor na gubitak proširenih segmenata rRNA sugerira da degradacija molekularne arhitekture parazita uzrokuje da paraziti traže kompenzacijske mutacije, što na kraju može dovesti do njihovog sticanja u različitim populacijama parazita.strukture.
Konačno, kada je naš model završen, uporedili smo sastav ribozoma E. cuniculi sa onim predviđenim iz sekvence genoma.Prethodno se smatralo da za nekoliko ribosomskih proteina, uključujući eL14, eL38, eL41 i eS30, nedostaje genom E. cuniculi zbog očiglednog odsustva njihovih homologa iz genoma E. cuniculi.Gubitak mnogih ribosomskih proteina predviđa se i kod većine drugih visoko reduciranih intracelularnih parazita i endosimbionta.Na primjer, iako većina slobodnoživućih bakterija sadrži istu porodicu od 54 ribosomska proteina, samo 11 od ovih proteinskih familija ima detektabilne homologe u svakom analiziranom genomu bakterija ograničenih na domaćina.U prilog ovoj ideji, eksperimentalno je uočen gubitak ribosomskih proteina kod mikrosporidije V. necatrix i P. locustae, kojima nedostaju proteini eL38 i eL4131,32.
Međutim, naše strukture pokazuju da su samo eL38, eL41 i eS30 zapravo izgubljeni u ribosomu E. cuniculi.Protein eL14 je bio konzerviran i naša struktura je pokazala zašto ovaj protein nije mogao biti pronađen u homološkoj pretrazi (slika 7).U ribosomima E. cuniculi, većina mjesta vezivanja eL14 je izgubljena zbog degradacije ES39L pojačanog rRNA.U nedostatku ES39L, eL14 je izgubio većinu svoje sekundarne strukture, a samo 18% eL14 sekvence je bilo identično kod E. cuniculi i S. cerevisiae.Ovo loše očuvanje sekvence je izvanredno jer čak i Saccharomyces cerevisiae i Homo sapiens – organizmi koji su evoluirali u razmaku od 1,5 milijardi godina – dijele više od 51% istih ostataka u eL14.Ovaj anomalni gubitak očuvanja objašnjava zašto je E. cuniculi eL14 trenutno označen kao navodni protein M970_061160, a ne kao ribosomalni protein eL1427.
i Ribozom Microsporidia je izgubio ekstenziju ES39L rRNA, što je djelimično eliminiralo eL14 ribosomsko vezno mjesto za protein.U nedostatku ES39L, protein mikrospore eL14 podliježe gubitku sekundarne strukture, u kojoj se bivša rRNA-vezujuća α-heliks degenerira u petlju minimalne dužine.b Višestruko poravnanje sekvenci pokazuje da je protein eL14 visoko konzerviran u eukariotskim vrstama (57% identičnosti sekvence između kvasca i humanih homologa), ali je loše očuvan i divergentan u mikrosporidijama (u kojima je ne više od 24% ostataka identično homologu eL14).iz S. cerevisiae ili H. sapiens).Ova loša očuvanost sekvence i varijabilnost sekundarne strukture objašnjava zašto homolog eL14 nikada nije pronađen u E. cuniculi i zašto se smatra da je ovaj protein izgubljen u E. cuniculi.Nasuprot tome, E. cuniculi eL14 je prethodno označen kao navodni protein M970_061160.Ovo zapažanje sugerira da je raznolikost genoma mikrosporidije trenutno precijenjena: neki geni za koje se trenutno smatra da su izgubljeni u mikrosporidiji su zapravo očuvani, iako u visoko diferenciranim oblicima;umjesto toga, za neke se smatra da kodiraju gene mikrosporidija za proteine ​​specifične za crve (npr. hipotetički protein M970_061160) zapravo kodira vrlo raznolike proteine ​​pronađene u drugim eukariotima.
Ovaj nalaz sugerira da denaturacija rRNA može dovesti do dramatičnog gubitka očuvanja sekvence u susjednim ribosomskim proteinima, čineći ove proteine ​​neotkrivenim za homološke pretrage.Stoga možemo precijeniti stvarni stepen molekularne degradacije u malim genomskim organizmima, budući da neki proteini za koje se smatra da su izgubljeni zapravo opstaju, iako u veoma izmijenjenim oblicima.
Kako paraziti mogu zadržati funkciju svojih molekularnih mašina u uslovima ekstremne redukcije genoma?Naša studija odgovara na ovo pitanje opisom složene molekularne strukture (ribosoma) E. cuniculi, organizma s jednim od najmanjih eukariotskih genoma.
Gotovo dvije decenije poznato je da se molekule proteina i RNK u mikrobnim parazitima često razlikuju od svojih homolognih molekula kod slobodnoživućih vrsta jer im nedostaju centri za kontrolu kvalitete, smanjeni su na 50% svoje veličine kod slobodnoživućih mikroba itd.mnoge iscrpljujuće mutacije koje narušavaju savijanje i funkciju.Na primjer, očekuje se da će ribosomi malih genomskih organizama, uključujući mnoge intracelularne parazite i endosimbionte, nedostajati nekoliko ribosomskih proteina i do jedne trećine rRNA nukleotida u usporedbi sa slobodnoživućim vrstama 27, 29, 30, 49. Međutim, način na koji ovi molekuli funkcionišu u glavnom genu koji proučavaju veliki paraziti ostaju u glavnom genu parazita.
Naša studija pokazuje da struktura makromolekula može otkriti mnoge aspekte evolucije koje je teško izdvojiti iz tradicionalnih komparativnih genomskih studija intracelularnih parazita i drugih organizama ograničenih domaćinima (dopunska slika 7).Na primjer, primjer proteina eL14 pokazuje da možemo precijeniti stvarni stepen degradacije molekularnog aparata kod parazitskih vrsta.Vjeruje se da encefalitični paraziti imaju stotine gena specifičnih za mikrosporidiju.Međutim, naši rezultati pokazuju da su neki od ovih naizgled specifičnih gena zapravo samo vrlo različite varijante gena koje su uobičajene kod drugih eukariota.Štaviše, primjer proteina msL2 pokazuje kako previđamo nove ribosomske proteine ​​i podcjenjujemo sadržaj parazitskih molekularnih mašina.Primjer malih molekula pokazuje kako možemo previdjeti najgenijalnije inovacije u parazitskim molekularnim strukturama koje im mogu dati novu biološku aktivnost.
Uzeti zajedno, ovi rezultati poboljšavaju naše razumijevanje razlika između molekularnih struktura organizama ograničenih domaćinima i njihovih kolega u slobodnim živim organizmima.Pokazujemo da molekularne mašine, za koje se dugo smatralo da su redukovane, degenerisane i podložne raznim oslabivim mutacijama, umesto toga imaju skup sistematski zanemarenih neobičnih strukturnih karakteristika.
S druge strane, neglomazni rRNA fragmenti i spojeni fragmenti koje smo pronašli u ribosomima E. cuniculi sugeriraju da redukcija genoma može promijeniti čak i one dijelove osnovne molekularne mašinerije koji su sačuvani u tri domena života – nakon skoro 3,5 milijardi godina.nezavisna evolucija vrsta.
Fragmenti rRNA bez ispupčenja i spojeni u ribosomima E. cuniculi su od posebnog interesa u svjetlu prethodnih studija molekula RNK u endosimbiotskim bakterijama.Na primjer, u endosimbiontu lisne uši Buchnera aphidicola, pokazalo se da rRNA i tRNA molekule imaju temperaturno osjetljive strukture zbog pristranosti sastava A+T i visokog udjela nekanonskih parova baza20,50.Smatra se da su ove promjene u RNK, kao i promjene u proteinskim molekulima, odgovorne za preveliku ovisnost endosimbionta o partnerima i nesposobnost endosimbiota da prenesu toplinu 21, 23 .Iako rRNA parazitske mikrosporidije ima strukturno različite promjene, priroda ovih promjena sugerira da smanjena termička stabilnost i veća ovisnost o proteinima šaperona mogu biti uobičajene karakteristike RNA molekula u organizmima sa smanjenim genomima.
S druge strane, naše strukture pokazuju da su mikrosporidija parazita razvila jedinstvenu sposobnost da se odupru široko očuvanim rRNA i fragmentima proteina, razvijajući sposobnost korištenja obilnih i lako dostupnih malih metabolita kao strukturnih imitacija degeneriranih rRNA i fragmenata proteina.Degradacija molekularne strukture..Ovo mišljenje potkrepljuje i činjenica da se mali molekuli koji nadoknađuju gubitak proteinskih fragmenata u rRNA i ribosomima E. cuniculi vezuju za ostatke specifične za mikrosporidiju u proteinima uL15 i eL30.Ovo sugerira da vezivanje malih molekula za ribozome može biti proizvod pozitivne selekcije, u kojoj su mutacije specifične za mikrosporidiju u ribosomskim proteinima odabrane zbog njihove sposobnosti da povećaju afinitet ribozoma za male molekule, što može dovesti do efikasnijih ribosomskih organizama.Otkriće otkriva pametnu inovaciju u molekularnoj strukturi mikrobnih parazita i daje nam bolje razumijevanje kako molekularne strukture parazita održavaju svoju funkciju uprkos reduktivnoj evoluciji.
Trenutno, identifikacija ovih malih molekula ostaje nejasna.Nije jasno zašto se izgled ovih malih molekula u ribosomskoj strukturi razlikuje među vrstama mikrosporidija.Konkretno, nije jasno zašto se vezivanje nukleotida primećuje u ribozomima E. cuniculi i P. locustae, a ne u ribosomima V. necatrix, uprkos prisustvu F170 ostatka u eL20 i K172 proteinima V. necatrix.Ovo brisanje može biti uzrokovano ostatkom 43 uL6 (koji se nalazi pored džepa za vezivanje nukleotida), koji je tirozin u V. necatrix, a ne treonin u E. cuniculi i P. locustae.Glomazni aromatični bočni lanac Tyr43 može ometati vezivanje nukleotida zbog steričkog preklapanja.Alternativno, prividna delecija nukleotida može biti posljedica niske rezolucije krio-EM snimanja, što otežava modeliranje V. necatrix ribosomskih fragmenata.
S druge strane, naš rad sugerira da bi proces propadanja genoma mogao biti inventivna sila.Konkretno, struktura ribozoma E. cuniculi sugerira da gubitak rRNA i fragmenata proteina u ribozomu mikrosporidije stvara evolucijski pritisak koji potiče promjene u strukturi ribosoma.Ove varijante se javljaju daleko od aktivnog mjesta ribosoma i čini se da pomažu u održavanju (ili obnavljanju) optimalnog sklopa ribosoma koji bi inače bio poremećen smanjenom rRNA.Ovo sugerira da se čini da je glavna inovacija ribozoma mikrosporidija evoluirala u potrebu da se ublaži drift gena.
Možda to najbolje ilustruje vezivanje nukleotida, što do sada nikada nije uočeno kod drugih organizama.Činjenica da su ostaci koji se vezuju za nukleotide prisutni u tipičnim mikrosporidijama, ali ne i kod drugih eukariota, sugerira da mjesta vezanja nukleotida nisu samo relikti koji čekaju da nestanu, ili konačno mjesto za rRNA da se vrati u oblik pojedinačnih nukleotida.Umjesto toga, ova stranica izgleda kao korisna funkcija koja je mogla evoluirati u nekoliko krugova pozitivne selekcije.Mjesta vezivanja nukleotida mogu biti nusproizvod prirodne selekcije: jednom kada se ES39L razgradi, mikrosporidije su prisiljene tražiti kompenzaciju za obnavljanje optimalne biogeneze ribosoma u odsustvu ES39L.Budući da ovaj nukleotid može oponašati molekularne kontakte nukleotida A3186 u ES39L, molekula nukleotida postaje građevni blok ribozoma, čije se vezivanje dodatno poboljšava mutacijom sekvence eL30.
S obzirom na molekularnu evoluciju intracelularnih parazita, naše istraživanje pokazuje da sile darvinističke prirodne selekcije i genetski drift propadanja genoma ne djeluju paralelno, već osciliraju.Prvo, genetski drift eliminira važne karakteristike biomolekula, čineći kompenzaciju prijeko potrebnom.Tek kada paraziti zadovolje ovu potrebu darvinovskom prirodnom selekcijom, njihovi će makromolekuli imati priliku razviti svoje najimpresivnije i najinovativnije osobine.Važno je da evolucija nukleotidnih vezivnih mjesta u ribozomu E. cuniculi sugerira da ovaj obrazac molekularne evolucije gubitak-dobitak ne samo da amortizuje štetne mutacije, već ponekad daje potpuno nove funkcije parazitskim makromolekulama.
Ova ideja je u skladu sa teorijom pokretne ravnoteže Sewella Wrighta, koja kaže da strogi sistem prirodne selekcije ograničava sposobnost organizama da inoviraju51,52,53.Međutim, ako genetski drift poremeti prirodnu selekciju, ovi pomaci mogu proizvesti promjene koje same po sebi nisu adaptivne (ili čak štetne), ali dovode do daljnjih promjena koje pružaju veću sposobnost ili novu biološku aktivnost.Naš okvir podržava ovu ideju ilustrirajući da se čini da je isti tip mutacije koja smanjuje nabor i funkciju biomolekula glavni pokretač za njegovo poboljšanje.U skladu sa evolucijskim modelom win-win, naša studija pokazuje da je propadanje genoma, koje se tradicionalno posmatra kao degenerativni proces, također glavni pokretač inovacija, ponekad, a možda čak i često dozvoljavajući makromolekulima da steknu nove parazitske aktivnosti.mogu ih koristiti.