Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Vrtuljak koji prikazuje tri slajda istovremeno. Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće da biste se kretali kroz tri slajda odjednom ili koristite dugmad klizača na kraju da biste se kretali kroz tri slajda odjednom.
Nedavno je razvijena antimikrobna platforma bez hemikalija zasnovana na nanotehnologiji korištenjem vještačkih vodenih nanostruktura (EWNS). EWNS imaju visoko površinsko naelektrisanje i zasićene su reaktivnim vrstama kisika (ROS) koje mogu interagovati i inaktivirati brojne mikroorganizme, uključujući patogene koji se prenose hranom. Ovdje je pokazano da se njihova svojstva tokom sinteze mogu fino podesiti i optimizovati kako bi se dodatno poboljšao njihov antibakterijski potencijal. Laboratorijska platforma EWNS dizajnirana je za fino podešavanje svojstava EWNS promjenom parametara sinteze. Karakterizacija svojstava EWNS (naelektrisanje, veličina i sadržaj ROS) korištenjem modernih analitičkih metoda. Pored toga, procijenjen je njihov potencijal mikrobne inaktivacije protiv mikroorganizama koji se prenose hranom, kao što su Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum i Saccharomyces cerevisiae. Rezultati predstavljeni ovdje pokazuju da se svojstva EWNS mogu fino podesiti tokom sinteze, što rezultira eksponencijalnim povećanjem efikasnosti inaktivacije. Konkretno, površinsko naelektrisanje se povećalo za faktor četiri, a reaktivne vrste kisika su se povećale. Brzina uklanjanja mikroba bila je mikrobno ovisna i kretala se od 1,0 do 3,8 log nakon 45 minuta izlaganja dozi aerosola od 40.000 #/cc EWNS.
Mikrobna kontaminacija je glavni uzrok bolesti koje se prenose hranom uzrokovanih unosom patogena ili njihovih toksina. Samo u Sjedinjenim Američkim Državama, bolesti koje se prenose hranom uzrokuju oko 76 miliona bolesti, 325.000 prijema u bolnicu i 5.000 smrtnih slučajeva svake godine1. Osim toga, Ministarstvo poljoprivrede Sjedinjenih Američkih Država (USDA) procjenjuje da je povećana konzumacija svježih proizvoda odgovorna za 48% svih prijavljenih bolesti koje se prenose hranom u Sjedinjenim Američkim Državama2. Troškovi bolesti i smrti uzrokovanih patogenima koji se prenose hranom u Sjedinjenim Američkim Državama su vrlo visoki, a Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) procjenjuju ih na više od 15,6 milijardi američkih dolara godišnje3.
Trenutno se hemijske4, radijacijske5 i termičke6 antimikrobne intervencije radi osiguranja sigurnosti hrane uglavnom provode na ograničenim kritičnim kontrolnim tačkama (KKT) duž proizvodnog lanca (obično nakon žetve i/ili tokom pakovanja), a ne kontinuirano. Stoga su sklone unakrsnoj kontaminaciji. 7. Bolja kontrola bolesti koje se prenose hranom i kvarenja hrane zahtijeva antimikrobne intervencije koje se potencijalno mogu primijeniti u cijelom kontinuumu od farme do stola, uz smanjenje utjecaja na okoliš i troškova.
Nedavno je razvijena antimikrobna platforma bez hemikalija, zasnovana na nanotehnologiji, koja može inaktivirati površinske i bakterije u zraku korištenjem umjetnih vodenih nanostruktura (EWNS). EWNS je sintetiziran korištenjem dva paralelna procesa, elektrospreja i ionizacije vode (slika 1a). Prethodne studije su pokazale da EWNS imaju jedinstven skup fizičkih i bioloških svojstava8,9,10. EWNS imaju u prosjeku 10 elektrona po strukturi i prosječnu nanoskalnu veličinu od 25 nm (slika 1b,c)8,9,10. Osim toga, elektronska spinska rezonanca (ESR) pokazala je da EWNS sadrži veliku količinu reaktivnih vrsta kisika (ROS), uglavnom hidroksil (OH•) i superoksid (O2-) radikala (slika 1c)8. EVNS je u zraku dugo vremena i može se sudarati s mikroorganizmima suspendiranim u zraku i prisutnim na površini, isporučujući svoj ROS teret i uzrokujući inaktivaciju mikroorganizama (slika 1d). Ove rane studije su također pokazale da EWNS mogu stupiti u interakciju s različitim gram-negativnim i gram-pozitivnim bakterijama, uključujući mikobakterije, na površinama i u zraku i inaktivirati ih. Transmisijska elektronska mikroskopija pokazala je da je inaktivacija uzrokovana poremećajem ćelijske membrane. Osim toga, studije akutne inhalacije pokazale su da visoke doze EWNS-a ne uzrokuju oštećenje pluća ili upalu 8.
(a) Elektroraspršivanje nastaje kada se visoki napon primijeni između kapilarne cijevi koja sadrži tekućinu i kontraelektrode. (b) Primjena visokog pritiska rezultira dva različita fenomena: (i) elektroraspršivanje vode i (ii) stvaranje reaktivnih vrsta kisika (iona) zarobljenih u EWNS-u. (c) Jedinstvena struktura EWNS-a. (d) Zbog svoje nanoskalne prirode, EWNS su vrlo pokretni i mogu stupiti u interakciju s patogenima koji se prenose zrakom.
Nedavno je dokazana i sposobnost EWNS antimikrobne platforme da inaktivira mikroorganizme koji se prenose hranom na površini svježe hrane. Također je pokazano da se površinski naboj EWNS-a u kombinaciji s električnim poljem može koristiti za postizanje ciljane isporuke. Štaviše, preliminarni rezultati za organske rajčice nakon 90-minutnog izlaganja EWNS-u od oko 50.000 #/cm3 bili su ohrabrujući, pri čemu su uočeni različiti mikroorganizmi koji se prenose hranom, poput E. coli i Listeria 11. Osim toga, preliminarni organoleptički testovi nisu pokazali senzorne efekte u poređenju s kontrolnim rajčicama. Iako su ovi početni rezultati inaktivacije ohrabrujući za primjenu u sigurnosti hrane čak i pri vrlo niskim dozama EWNS-a od 50.000#/cm³, jasno je da bi veći potencijal inaktivacije bio korisniji za daljnje smanjenje rizika od infekcije i kvarenja.
Ovdje ćemo fokusirati naša istraživanja na razvoj platforme za generiranje EWNS-a kako bismo omogućili fino podešavanje parametara sinteze i optimizaciju fizičko-hemijskih svojstava EWNS-a radi poboljšanja njihovog antibakterijskog potencijala. Konkretno, optimizacija se fokusirala na povećanje njihovog površinskog naboja (radi poboljšanja ciljane isporuke) i sadržaja ROS-a (radi poboljšanja efikasnosti inaktivacije). Karakterizirati optimizirana fizičko-hemijska svojstva (veličina, naboj i sadržaj ROS-a) korištenjem modernih analitičkih metoda i korištenjem uobičajenih prehrambenih mikroorganizama kao što je E. .
EVNS je sintetiziran istovremenim elektroraspršivanjem i ionizacijom vode visoke čistoće (18 MΩ cm–1). Električni nebulizator 12 se obično koristi za atomizaciju tekućina i sintezu polimernih i keramičkih čestica 13 i vlakana 14 kontrolirane veličine.
Kao što je detaljno opisano u prethodnim publikacijama 8, 9, 10, 11, u tipičnom eksperimentu, visoki napon je primijenjen između metalne kapilare i uzemljene kontraelektrode. Tokom ovog procesa, javljaju se dva različita fenomena: i) elektrosprej i ii) jonizacija vode. Jako električno polje između dvije elektrode uzrokuje nakupljanje negativnih naboja na površini kondenzirane vode, što rezultira formiranjem Taylorovih konusa. Kao rezultat toga, formiraju se visoko nabijene kapljice vode, koje se nastavljaju raspadati na manje čestice, kao u Rayleighovoj teoriji16. Istovremeno, jaka električna polja uzrokuju cijepanje i otpuštanje elektrona od nekih molekula vode (jonizaciju), što dovodi do formiranja velike količine reaktivnih vrsta kisika (ROS)17. Istovremeno generirani ROS18 je enkapsuliran u EWNS (Slika 1c).
Na slici 2a prikazan je sistem za generisanje EWNS-a razvijen i korišten u sintezi EWNS-a u ovoj studiji. Pročišćena voda pohranjena u zatvorenoj boci je dovedena kroz teflonsku cijev (unutrašnji promjer 2 mm) u iglu od nehrđajućeg čelika 30G (metalna kapilara). Protok vode kontroliše pritisak zraka unutar boce, kao što je prikazano na slici 2b. Igla je montirana na teflonsku konzolu i može se ručno podesiti na određenu udaljenost od kontraelektrode. Kontraelektroda je polirani aluminijski disk s rupom u sredini za uzorkovanje. Ispod kontraelektrode nalazi se aluminijski lijevak za uzorkovanje, koji je povezan s ostatkom eksperimentalne postavke putem otvora za uzorkovanje (slika 2b). Da bi se izbjeglo nakupljanje naboja koje bi moglo poremetiti rad uzorkivača, sve komponente uzorkivača su električno uzemljene.
(a) Sistem za generisanje inženjerskih nanostruktura vode (EWNS). (b) Presjek uzorkivača i elektrospreja, s prikazom najvažnijih parametara. (c) Eksperimentalna postavka za inaktivaciju bakterija.
Gore opisani sistem za generisanje EWNS-a sposoban je za promjenu ključnih radnih parametara kako bi se olakšalo fino podešavanje EWNS svojstava. Podesite primijenjeni napon (V), udaljenost između igle i kontraelektrode (L) i protok vode (φ) kroz kapilaru kako biste fino podesili EWNS karakteristike. Simbol koji se koristi za predstavljanje različitih kombinacija: [V (kV), L (cm)]. Podesite protok vode kako biste dobili stabilan Taylorov konus određenog skupa [V, L]. Za potrebe ove studije, promjer otvora kontraelektrode (D) održavan je na 0,5 inča (1,29 cm).
Zbog ograničene geometrije i asimetrije, jačina električnog polja ne može se izračunati iz prvih principa. Umjesto toga, za izračunavanje električnog polja korišten je softver QuickField™ (Svendborg, Danska). Električno polje nije uniformno, pa je vrijednost električnog polja na vrhu kapilare korištena kao referentna vrijednost za različite konfiguracije.
Tokom studije, nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i kontraelektrode procijenjeno je u smislu formiranja Taylorovog konusa, stabilnosti Taylorovog konusa, stabilnosti proizvodnje EWNS-a i ponovljivosti. Različite kombinacije prikazane su u Dodatnoj tabeli S1.
Izlaz sistema za generisanje EWNS-a bio je direktno povezan sa analizatorom veličine čestica skenirajuće mobilnosti (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, MN) za mjerenje koncentracije broja čestica, kao i sa aerosolnim Faraday elektrometrom (TSI, model 3068B, Shoreview, MN). ) za mjerenje struja aerosola kako je opisano u našoj prethodnoj publikaciji. I SMPS i aerosolni elektrometar uzorkovali su pri brzini protoka od 0,5 L/min (ukupni protok uzorka 1 L/min). Koncentracija broja čestica i protok aerosola mjereni su 120 sekundi. Mjerenje se ponavlja 30 puta. Na osnovu mjerenja struje, izračunava se ukupno naelektrisanje aerosola i procjenjuje se prosječno EWNS naelektrisanje za dati ukupan broj odabranih EWNS čestica. Prosječni trošak EWNS-a može se izračunati pomoću jednačine (1):
gdje je IEl izmjerena struja, NSMPS je digitalna koncentracija izmjerena pomoću SMPS-a, a φEl je brzina protoka po elektrometru.
Budući da relativna vlažnost (RH) utiče na površinski naboj, temperatura i (RH) su održavane konstantnim tokom eksperimenta na 21°C i 45%, respektivno.
Za mjerenje veličine i životnog vijeka EWNS-a korišteni su mikroskopija atomskih sila (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornija) i AC260T sonda (Olympus, Tokio, Japan). Frekvencija skeniranja AFM-a bila je 1 Hz, područje skeniranja 5 μm × 5 μm i 256 linija skeniranja. Sve slike su podvrgnute poravnanju slike prvog reda korištenjem Asylum softvera (raspon maske 100 nm, prag 100 pm).
Testni lijevak je uklonjen, a površina tinjca je postavljena na udaljenosti od 2,0 cm od kontraelektrode tokom prosječnog vremena od 120 s kako bi se izbjegla aglomeracija čestica i stvaranje nepravilnih kapljica na površini tinjca. EWNS je direktno prskan na površinu svježe izrezanog tinjca (Ted Pella, Redding, CA). Slika površine tinjca odmah nakon AFM raspršivanja. Kontaktni ugao površine svježe izrezanog nemodificiranog tinjca je blizu 0°, tako da je EVNS raspršen na površini tinjca u obliku kupole. Prečnik (a) i visina (h) difuznih kapljica su izmjereni direktno iz AFM topografije i korišteni za izračunavanje kupolastog difuzijskog volumena EWNS-a korištenjem naše prethodno validirane metode. Pod pretpostavkom da ugrađeni EWNS imaju isti volumen, ekvivalentni prečnik se može izračunati pomoću jednačine (2):
Na osnovu naše prethodno razvijene metode, korištena je spinska zamka elektronske spinske rezonancije (ESR) za detekciju prisustva kratkotrajnih radikalnih međuprodukata u EWNS-u. Aerosoli su propuštani kroz Midget raspršivač od 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) koji je sadržavao 235 mM rastvor DEPMPO(5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksida) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon. Sva ESR mjerenja su izvršena korištenjem Bruker EMX spektrometra (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD) i ćelije sa ravnim panelom. Za prikupljanje i analizu podataka korišten je Acquisit softver (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD). Određivanje karakteristika ROS-a provedeno je samo za skup radnih uslova [-6,5 kV, 4,0 cm]. Koncentracije EWNS-a su mjerene korištenjem SMPS-a nakon što su uzeti u obzir gubici EWNS-a u impaktoru.
Nivoi ozona praćeni su pomoću 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Za sva EWNS svojstva, srednja vrijednost se koristi kao mjerna vrijednost, a standardna devijacija se koristi kao greška mjerenja. T-testovi su provedeni kako bi se vrijednosti optimiziranih EWNS atributa uporedile s odgovarajućim vrijednostima baznog EWNS-a.
Slika 2c prikazuje prethodno razvijen i okarakteriziran sistem "povlačenja" elektrostatičke precipitacije (EPES) koji se može koristiti za ciljanu isporuku EWNS-a na površinu. EPES koristi EVNS naboje koji se mogu "voditi" direktno na površinu mete pod utjecajem jakog električnog polja. Detalji EPES sistema predstavljeni su u nedavnoj publikaciji Pyrgiotakisa i suradnika 11. Dakle, EPES se sastoji od 3D printane PVC komore sa suženim krajevima i sadrži dvije paralelne metalne ploče od nehrđajućeg čelika (nerđajući čelik 304, presvučen ogledalom) u sredini, udaljene 15,24 cm. Ploče su bile povezane na vanjski izvor visokog napona (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), donja ploča je uvijek bila povezana na pozitivni napon, a gornja ploča je uvijek bila povezana na uzemljenje (plutajuće uzemljenje). Zidovi komore su prekriveni aluminijskom folijom, koja je električno uzemljena kako bi se spriječio gubitak čestica. Komora ima zatvorena prednja vrata za punjenje koja omogućavaju postavljanje ispitnih površina na plastične stalke koji ih podižu iznad donje metalne ploče kako bi se izbjegle smetnje visokog napona.
Efikasnost taloženja EWNS-a u EPES-u izračunata je prema prethodno razvijenom protokolu detaljno opisanom u Dodatnoj slici S111.
Kao kontrolna komora, druga cilindrična protočna komora je bila serijski povezana sa EPES sistemom, u kojem je korišten među-HEPA filter za uklanjanje EWNS-a. Kao što je prikazano na slici 2c, EWNS aerosol je pumpan kroz dvije ugrađene komore. Filter između kontrolne sobe i EPES-a uklanja sve preostale EWNS-e, što rezultira istom temperaturom (T), relativnom vlažnošću (RH) i nivoima ozona.
Utvrđeno je da važni mikroorganizmi koji se prenose hranom kontaminiraju svježu hranu, kao što su E. coli (ATCC #27325), indikator fekalija, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen koji se prenosi hranom, Listeria insect (ATCC #33090), surogat za patogenu Listeria monocytogenes, izvedena iz ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), zamjena za kvasac kvarenja, i otpornija inaktivirana bakterija, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kupite nasumične kutije organskih cherry rajčica na lokalnoj pijaci i stavite ih u hladnjak na 4°C do upotrebe (do 3 dana). Eksperimentalne rajčice su bile sve iste veličine, promjera oko 1,2 cm.
Protokoli za kulturu, inokulaciju, ekspoziciju i brojanje kolonija detaljno su opisani u našoj prethodnoj publikaciji i u Dodatnim podacima. Učinkovitost EWNS-a procijenjena je izlaganjem inokuliranih rajčica koncentraciji od 40.000 #/cm3 tokom 45 minuta. Ukratko, tri rajčice su korištene za procjenu preživjelih mikroorganizama u vremenu t = 0 min. Tri rajčice su stavljene u EPES i izložene EWNS-u u koncentraciji od 40.000 #/cc (rajčice izložene EWNS-u), a preostala tri su stavljene u kontrolnu komoru (kontrolne rajčice). Dodatna obrada rajčica u obje grupe nije provedena. Rajčice izložene EWNS-u i kontrolne rajčice uklonjene su nakon 45 minuta kako bi se procijenio učinak EWNS-a.
Svaki eksperiment je proveden u tri ponavljanja. Analiza podataka je izvršena prema protokolu opisanom u Dodatnim podacima.
Mehanizmi inaktivacije procijenjeni su sedimentacijom izloženih uzoraka EWNS-a (45 minuta pri koncentraciji aerosola EWNS-a od 40.000 #/cm3) i neozračenih uzoraka bezopasnih bakterija E. coli, Salmonella enterica i Lactobacillus. Čestice su fiksirane u 2,5% glutaraldehidu, 1,25% paraformaldehidu i 0,03% pikrinskoj kiselini u 0,1 M natrijum kakodilatnom puferu (pH 7,4) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, naknadna fiksacija sa 1% osmijum tetroksida (OsO4)/1,5% kalijum ferocijanida (KFeCN6) tokom 2 sata, isprati 3 puta u vodi i inkubirati u 1% uranil acetatu tokom 1 sata, zatim isprati dva puta u vodi, a zatim dehidrirati 10 minuta u 50%, 70%, 90%, 100% alkoholu. Uzorci su zatim stavljeni u propilen oksid na 1 sat i impregnirani smjesom propilen oksida i TAAP Epona (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) u omjeru 1:1. Uzorci su ugrađeni u TAAB Epon i polimerizirani na 60°C tokom 48 sati. Očvrsla granulirana smola je izrezana i vizualizirana TEM-om korištenjem konvencionalnog transmisionog elektronskog mikroskopa JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan) opremljenog AMT 2k CCD kamerom (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, SAD).
Svi eksperimenti su provedeni u tri ponavljanja. Za svaku vremensku tačku, bakterijski ispirci su zasijani u tri ponavljanja, što je rezultiralo ukupno devet podatkovnih tačaka po tački, čiji je prosjek korišten kao bakterijska koncentracija za taj određeni mikroorganizam. Standardna devijacija je korištena kao greška mjerenja. Sve tačke se računaju.
Logaritam smanjenja koncentracije bakterija u poređenju sa t = 0 min izračunat je pomoću sljedeće formule:
gdje je C0 koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u vremenu 0 (tj. nakon što se površina osušila, ali prije nego što je stavljena u komoru), a Cn je koncentracija bakterija na površini nakon n minuta izlaganja.
Da bi se uzelo u obzir prirodno razgrađivanje bakterija tokom izlaganja od 45 minuta, logaritamsko smanjenje u poređenju sa kontrolnom grupom nakon 45 minuta takođe je izračunato na sledeći način:
gdje je Cn koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u vremenu n, a Cn-Control je koncentracija kontrolnih bakterija u vremenu n. Podaci su prikazani kao logaritam smanjenja u poređenju s kontrolom (bez izloženosti EWNS-u).
Tokom studije, nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i kontraelektrode procijenjeno je u smislu formiranja Taylorovog konusa, stabilnosti Taylorovog konusa, stabilnosti proizvodnje EWNS-a i reproducibilnosti. Različite kombinacije prikazane su u Dodatnoj tabeli S1. Dva slučaja koja pokazuju stabilna i reproducibilna svojstva (Taylorov konus, generiranje EWNS-a i stabilnost tokom vremena) odabrana su za sveobuhvatnu studiju. Na slici 3 prikazani su rezultati za naboj, veličinu i sadržaj ROS-a u oba slučaja. Rezultati su također prikazani u Tabeli 1. Kao referenca, i Slika 3 i Tabela 1 uključuju svojstva prethodno sintetiziranog neoptimiziranog EWNS-a8, 9, 10, 11 (osnovni EWNS). Izračuni statističke značajnosti korištenjem dvostranog t-testa ponovo su objavljeni u Dodatnoj tabeli S2. Pored toga, dodatni podaci uključuju studije utjecaja promjera otvora za uzorkovanje kontraelektrode (D) i udaljenosti između uzemljene elektrode i vrha (L) (Dodatne slike S2 ​​i S3).
(ac) Raspodjela veličine mjerena AFM-om. (df) Karakteristika površinskog naboja. (g) ROS karakterizacija EPR-a.
Također je važno napomenuti da je za sve gore navedene uslove izmjerena struja jonizacije bila između 2 i 6 μA, a napon između -3,8 i -6,5 kV, što je rezultiralo potrošnjom energije manjom od 50 mW za ovaj pojedinačni kontaktni modul za generaciju EWNS-a. Iako je EWNS sintetiziran pod visokim pritiskom, nivoi ozona bili su vrlo niski, nikada ne prelazeći 60 ppb.
Dodatna slika S4 prikazuje simulirana električna polja za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], proračuni polja su 2 × 10⁶ V/m i 4,7 × 10⁶ V/m. Ovo je očekivano, budući da je u drugom slučaju odnos napona i udaljenosti mnogo veći.
Na slikama 3a i 3b prikazan je promjer EWNS-a izmjeren pomoću AFM8. Izračunati prosječni promjeri EWNS-a bili su 27 nm i 19 nm za sheme [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], geometrijske standardne devijacije distribucija su 1,41 i 1,45, respektivno, što ukazuje na usku distribuciju veličine. I srednja veličina i geometrijska standardna devijacija su vrlo blizu osnovnom EWNS-u, na 25 nm i 1,41, respektivno. Na slici 3c prikazana je distribucija veličine osnovnog EWNS-a izmjerena istom metodom pod istim uvjetima.
Na slici 3d,e prikazani su rezultati karakterizacije naboja. Podaci predstavljaju prosječna mjerenja 30 istovremenih mjerenja koncentracije (#/cm3) i struje (I). Analiza pokazuje da je prosječno naboje na EWNS-u 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- za [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], respektivno. Imaju značajno veće površinske naboje u poređenju sa osnovnim EWNS-om (10 ± 2 e-), dva puta veće od scenarija [-6,5 kV, 4,0 cm] i četiri puta veće od scenarija [-3,8 kV, 0,5 cm]. Slika 3f prikazuje podatke o naboju za osnovni EWNS.
Iz mapa koncentracije EWNS broja (Dodatne slike S5 i S6), može se vidjeti da scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] ima znatno više čestica nego scenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Također je vrijedno napomenuti da je koncentracija EWNS broja praćena do 4 sata (Dodatne slike S5 i S6), gdje je stabilnost generacije EWNS pokazala iste nivoe koncentracije broja čestica u oba slučaja.
Na slici 3g prikazan je EPR spektar nakon oduzimanja optimizirane EWNS kontrole (pozadina) na [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektri su također upoređeni sa Baseline-EWNS scenarijem u prethodno objavljenom radu. Broj EWNS-a koji reaguju sa spinskim zamkama izračunat je na 7,5 × 10⁴ EWNS/s, što je slično prethodno objavljenom Baseline-EWNS8. EPR spektri su jasno pokazali prisustvo dvije vrste ROS-a, pri čemu je O2- predominantna vrsta, a OH• manje zastupljen. Pored toga, direktno poređenje intenziteta vrhova pokazalo je da optimizirani EWNS ima značajno veći sadržaj ROS-a u poređenju sa osnovnim EWNS-om.
Na sl. 4 prikazana je efikasnost taloženja EWNS-a u EPES-u. Podaci su također sumirani u Tabeli I i upoređeni s originalnim EWNS podacima. Za oba slučaja EUNS-a, taloženje je blizu 100% čak i pri niskom naponu od 3,0 kV. Tipično, 3,0 kV je dovoljno za 100% taloženje, bez obzira na promjenu površinskog naboja. Pod istim uvjetima, efikasnost taloženja Baseline-EWNS-a bila je samo 56% zbog njihovog nižeg naboja (prosječno 10 elektrona po EWNS-u).
Na sl. 5 i u tabeli 2 sumira se vrijednost inaktivacije mikroorganizama inokuliranih na površini paradajza nakon izlaganja oko 40.000 #/cm3 EWNS-a tokom 45 minuta u optimalnom režimu [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulirani E. coli i Lactobacillus innocuous pokazali su značajno smanjenje od 3,8 log tokom izlaganja od 45 minuta. Pod istim uslovima, S. enterica je imala smanjenje od 2,2 log, dok su S. cerevisiae i M. parafortutum imali smanjenje od 1,0 log.
Elektronske mikrografije (Slika 6) prikazuju fizičke promjene izazvane EWNS-om na bezopasnim ćelijama Escherichia coli, Streptococcus i Lactobacillus, što dovodi do njihove inaktivacije. Kontrolne bakterije su imale neoštećene ćelijske membrane, dok su izložene bakterije imale oštećene vanjske membrane.
Elektronsko-mikroskopsko snimanje kontrolnih i izloženih bakterija otkrilo je oštećenje membrane.
Podaci o fizičko-hemijskim svojstvima optimizovanih EWNS-a zajedno pokazuju da su svojstva (površinski naboj i sadržaj ROS-a) EWNS-a značajno poboljšana u poređenju sa prethodno objavljenim osnovnim podacima EWNS-a8,9,10,11. S druge strane, njihova veličina je ostala u nanometarskom opsegu, što je vrlo slično prethodno objavljenim rezultatima, što im omogućava da ostanu u zraku duži vremenski period. Uočena polidisperznost može se objasniti promjenama površinskog naboja koje određuju veličinu EWNS-a, slučajnošću Rayleighovog efekta i potencijalnom koalescencijom. Međutim, kako su detaljno opisali Nielsen i saradnici22, visoki površinski naboj smanjuje isparavanje efektivnim povećanjem površinske energije/napona kapljice vode. U našoj prethodnoj publikaciji8 ova teorija je eksperimentalno potvrđena za mikrokapljice22 i EWNS. Gubitak naboja tokom vremena također može utjecati na veličinu i doprinijeti uočenoj raspodjeli veličine.