Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju pretraživača sa ograničenom podrškom za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak od tri slajda odjednom.Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće da se krećete kroz tri slajda odjednom ili koristite dugmad klizača na kraju da se krećete kroz tri slajda odjednom.
Krvno-moždana barijera i krvno-moždana barijera sprečavaju bioterapeutskim agensima da dođu do svojih ciljeva u centralnom nervnom sistemu, čime ometaju efikasno lečenje neuroloških bolesti.Da bismo otkrili nove moždane transportere in vivo, uveli smo biblioteku peptida faga T7 i serijski prikupljali krv i cerebrospinalnu tekućinu (CSF) koristeći kanuliran svjesni model velikog bazena pacova.Specifični klonovi faga su visoko obogaćeni CSF nakon četiri kruga selekcije.Testiranje pojedinačnih kandidata za peptide otkrilo je više od 1000 puta obogaćivanje likvora.Bioaktivnost peptidom posredovane isporuke u mozak potvrđena je smanjenjem od 40% nivoa amiloida-β u cerebrospinalnoj tečnosti upotrebom BACE1 peptidnog inhibitora povezanog sa identifikovanim novim tranzitnim peptidom.Ovi rezultati sugeriraju da peptidi identificirani in vivo metodama selekcije faga mogu biti korisna sredstva za sistemsku dostavu makromolekula u mozak s terapijskim efektom.
Istraživanja ciljane terapije centralnog nervnog sistema (CNS) uglavnom su se fokusirala na identifikaciju optimiziranih lijekova i agenasa koji pokazuju svojstva ciljanja na CNS, uz manje napora na otkrivanju mehanizama koji pokreću aktivnu isporuku lijekova u mozak.Ovo se sada počinje mijenjati jer je isporuka lijekova, posebno velikih molekula, sastavni dio razvoja modernih neuronaučnih lijekova.Okruženje centralnog nervnog sistema je dobro zaštićeno sistemom cerebrovaskularne barijere, koji se sastoji od krvno-moždane barijere (BBB) ​​i krvno-moždane barijere (BCBB)1, što čini izazovom dopremanje lekova u mozak1,2.Procjenjuje se da se gotovo svi lijekovi s velikim molekulama i više od 98% lijekova s ​​malim molekulama eliminiraju iz mozga3.Zbog toga je veoma važno identifikovati nove transportne sisteme mozga koji obezbeđuju efikasnu i specifičnu isporuku terapijskih lekova u CNS 4,5.Međutim, BBB i BCSFB također predstavljaju odličnu priliku za isporuku lijekova jer prodiru i ulaze u sve strukture mozga kroz njegovu ekstenzivnu vaskulaturu.Stoga su trenutni napori da se koriste neinvazivne metode isporuke u mozak u velikoj mjeri zasnovani na mehanizmu receptora posredovanog transporta (PMT) koristeći endogeni BBB6 receptor.Uprkos nedavnim ključnim napretcima u korišćenju puta transferina receptora7,8, potreban je dalji razvoj novih sistema isporuke sa poboljšanim svojstvima.U tom cilju, naš cilj je bio da identifikujemo peptide koji su sposobni da posreduju u transportu likvora, jer bi se u principu mogli koristiti za isporuku makromolekula u CNS ili za otvaranje novih puteva receptora.Konkretno, specifični receptori i transporteri cerebrovaskularnog sistema (BBB i BSCFB) mogu poslužiti kao potencijalne mete za aktivnu i specifičnu isporuku bioterapeutskih lijekova.Cerebrospinalna tekućina (CSF) je sekretorni produkt horoidnog pleksusa (CS) i u direktnom je kontaktu sa intersticijskom tekućinom mozga kroz subarahnoidalni i ventrikularni prostor4.Nedavno je pokazano da subarahnoidna cerebrospinalna tečnost prekomerno difunduje u intersticij mozga9.Nadamo se da ćemo pristupiti parenhimskom prostoru koristeći ovaj subarahnoidalni ulazni trakt ili direktno kroz BBB.Da bismo to postigli, implementirali smo robusnu in vivo strategiju selekcije faga koja idealno identifikuje peptide koji se transportuju bilo kojim od ova dva različita puta.
Sada opisujemo sekvencijalni in vivo metod skrininga fagnog prikaza sa uzorkovanjem CSF u kombinaciji sa sekvenciranjem visoke propusnosti (HTS) za praćenje početnih krugova selekcije sa najvećom raznovrsnošću biblioteke.Skrining je obavljen na pacovima pri svijesti sa trajno ugrađenom velikom cisternom (CM) kanilom kako bi se izbjegla kontaminacija krvi.Važno je da ovaj pristup odabire i ciljanje na mozak i peptide s transportnom aktivnošću kroz cerebrovaskularnu barijeru.Koristili smo T7 fage zbog njihove male veličine (~60 nm)10 i sugerisali da su pogodni za transport vezikula koji omogućavaju transcelularno prelaženje endotelne i/ili epitelno-medulne barijere.Nakon četiri kruga pomicanja, izolovane su populacije faga pokazujući snažno in vivo obogaćivanje likvora i povezanost cerebralnih mikrožila.Važno je da smo bili u mogućnosti da potvrdimo naše nalaze pokazujući da su preferirani i hemijski sintetisani najbolji kandidati peptidi sposobni da transportuju proteinski teret u cerebrospinalnu tečnost.Prvo, farmakodinamički efekti CNS-a su uspostavljeni kombinacijom vodećeg tranzitnog peptida sa inhibitorom BACE1 peptida.Pored demonstracije da strategije funkcionalnog skrininga in vivo mogu identificirati nove peptide za transport mozga kao učinkovite nosače proteinskog tereta, očekujemo da će slični pristupi funkcionalne selekcije također postati važni u identifikaciji novih puteva transporta mozga.
Na osnovu jedinica koje formiraju plak (PFU), nakon koraka pakovanja faga, dizajnirana je i kreirana biblioteka nasumičnih 12-mernih linearnih T7 fagnih peptida sa raznovrsnošću od približno 109 (videti Materijali i metode).Važno je napomenuti da smo pažljivo analizirali ovu biblioteku prije in vivo pomicanja.PCR amplifikacija uzoraka biblioteke faga korištenjem modificiranih prajmera generirala je amplikone koji su bili direktno primjenjivi na HTS (dodatna slika 1a).Zbog a) grešaka sekvencioniranja HTS11, b) uticaja na kvalitet prajmera (NNK)1-12, i c) prisustva divljeg tipa (wt) faga (skeletnih umetaka) u rezervnoj biblioteci, implementirana je procedura filtriranja sekvence kako bi se izdvojile samo verifikovane informacije o sekvenci (dopunska slika 1b).Ovi koraci filtriranja primjenjuju se na sve biblioteke HTS sekvenciranja.Za standardnu ​​biblioteku dobijeno je ukupno 233.868 čitanja, od kojih je 39% prošlo kriterije filtriranja i korišteno za analizu biblioteke i odabir za sljedeće runde (dodatna slika 1c–e).Očitavanja su bila pretežno višestruka od 3 para baza u dužini sa vrhom od 36 nukleotida (dopunska slika 1c), što potvrđuje dizajn biblioteke (NNK) 1-12.Primjetno je da je otprilike 11% članova biblioteke sadržavalo 12-dimenzionalni divlji tip (wt) kičme PAGISRELVDKL insert, a skoro polovina sekvenci (49%) je sadržavala insercije ili delecije.HTS biblioteke biblioteke potvrdio je visoku raznolikost peptida u biblioteci: više od 81% peptidnih sekvenci pronađeno je samo jednom, a samo 1,5% se pojavilo u ≥4 kopije (dopunska slika 2a).Učestalosti aminokiselina (aa) na svih 12 pozicija u repertoaru dobro su korelirale s očekivanim učestalostima za broj kodona generiranih degeneriranim NKK repertoarom (dopunska slika 2b).Uočena frekvencija aa ostataka kodiranih ovim umetcima dobro je korelirala sa izračunatom frekvencijom (r = 0,893) (dodatna slika 2c).Priprema fagnih biblioteka za injekciju uključuje korake amplifikacije i uklanjanja endotoksina.Ranije se pokazalo da ovo potencijalno smanjuje raznolikost biblioteka faga12,13.Stoga smo sekvencirali biblioteku faga amplificiranu na ploči koja je bila podvrgnuta uklanjanju endotoksina i uporedili je s originalnom bibliotekom kako bismo procijenili učestalost AA.Uočena je jaka korelacija (r = 0,995) između originalnog i amplificiranog i pročišćenog bazena (dopunska slika 2d), što ukazuje da konkurencija između klonova amplificiranih na pločama pomoću T7 faga nije uzrokovala veliku pristrasnost.Ovo poređenje se zasniva na učestalosti tripeptidnih motiva u svakoj biblioteci, budući da se raznolikost biblioteka (~109) ne može u potpunosti obuhvatiti čak ni sa HTS.Analiza frekvencije aa na svakoj poziciji otkrila je malu pristrasnost ovisno o poziciji na posljednje tri pozicije unesenog repertoara (dopunska slika 2e).U zaključku smo zaključili da su kvalitet i raznovrsnost biblioteke prihvatljivi i da su uočene samo manje promjene u diverzitetu zbog amplifikacije i pripreme fagnih biblioteka između nekoliko krugova selekcije.
Serijsko uzorkovanje cerebrospinalne tečnosti može se izvesti hirurškim implantiranjem kanile u CM pacova pri svesti da bi se olakšala identifikacija faga T7 ubrizganog intravenozno (iv) preko BBB i/ili BCSFB (slika 1a-b).Koristili smo dva nezavisna selekcijska kraka (krake A i B) u prva tri kruga in vivo selekcije (slika 1c).Postepeno smo povećavali strogost selekcije smanjenjem ukupne količine faga uvedenog u prva tri kruga selekcije.Za četvrti krug panovanja kombinovali smo uzorke iz grana A i B i izvršili tri dodatne nezavisne selekcije.Za proučavanje in vivo osobina T7 fagnih čestica u ovom modelu, divlji tip faga (PAGISRELVDKL master insert) je ubrizgan pacovima preko repne vene.Oporavak faga iz cerebrospinalne tekućine i krvi u različitim vremenskim točkama pokazao je da su relativno mali T7 ikosaedarski fagi imali brzu početnu fazu uklanjanja iz odjeljka krvi (dopunska slika 3).Na osnovu primijenjenih titara i volumena krvi pacova, izračunali smo da je samo približno 1% tež.fag iz primijenjene doze otkriven je u krvi 10 minuta nakon intravenske injekcije.Nakon ovog početnog brzog pada, mjeren je sporiji primarni klirens sa poluživotom od 27,7 minuta.Važno je da je samo nekoliko faga izvučeno iz odjeljka CSF, što ukazuje na nisku pozadinu za migraciju divljeg tipa faga u odjeljak CSF (dodatna slika 3).U prosjeku, samo oko 1 x 10-3% titara T7 faga u krvi i 4 x 10-8% inicijalno infundiranih faga otkriveno je u cerebrospinalnoj tekućini tokom cijelog perioda uzorkovanja (0-250 min).Značajno je da je poluživot (25,7 min) divljeg tipa faga u likvoru bio sličan onom uočenom u krvi.Ovi podaci pokazuju da je barijera koja odvaja CSF odjeljak od krvi netaknuta kod CM-kanuliranih pacova, omogućavajući in vivo selekciju fagnih biblioteka za identifikaciju klonova koji se lako transportuju iz krvi u odjeljak CSF.
(a) Postavljanje metode za ponovno uzimanje uzoraka cerebrospinalne tekućine (CSF) iz velikog bazena.(b) Dijagram koji prikazuje ćelijsku lokaciju barijere centralnog nervnog sistema (CNS) i strategiju selekcije koja se koristi za identifikaciju peptida koji prolaze krvno-moždanu barijeru (BBB) ​​i krvno-moždanu barijeru.(c) Dijagram toka skrininga prikaza faga in vivo.U svakom krugu selekcije, fagi (identifikatori životinja unutar strelica) su ubrizgani intravenozno.Dvije nezavisne alternativne grane (A, B) se drže odvojeno do 4. kruga selekcije.Za krugove selekcije 3 i 4, svaki klon faga ekstrahovan iz CSF-a je ručno sekvencioniran.(d) Kinetika faga izolovanog iz krvi (crveni krugovi) i cerebrospinalne tečnosti (zeleni trouglovi) tokom prvog kruga selekcije kod dva pacova sa kanulom nakon intravenske injekcije T7 peptidne biblioteke (2 x 1012 faga/životinja).Plavi kvadrati označavaju prosječnu početnu koncentraciju faga u krvi, izračunatu iz količine ubrizganog faga, uzimajući u obzir ukupni volumen krvi.Crni kvadrati označavaju točku presjeka y linije ekstrapolirano iz koncentracija faga u krvi.(e,f) Predstavite relativnu učestalost i distribuciju svih mogućih preklapajućih tripeptidnih motiva koji se nalaze u peptidu.Prikazan je broj motiva pronađenih u 1000 čitanja.Značajno (p < 0,001) obogaćeni motivi su označeni crvenim tačkama.(e) Korelaciona dijagrama raspršenja koja upoređuje relativnu učestalost tripeptidnog motiva ubrizgane biblioteke sa fagom dobijenim iz krvi životinja #1.1 i #1.2.(f) Korelaciona dijagrama raspršenja koja upoređuje relativne frekvencije životinjskih fagnih tripeptidnih motiva #1.1 i #1.2 izolovanih u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti.(g, h) Reprezentacija ID sekvence faga obogaćenog krvlju (g) ​​naspram ubrizganih biblioteka i faga obogaćenog likvorom (h) u odnosu na krv nakon runde in vivo selekcije u obje životinje.Veličina koda od jednog slova pokazuje koliko se često ta aminokiselina pojavljuje na toj poziciji.Zelena = polarna, ljubičasta = neutralna, plava = bazična, crvena = kisela i crna = hidrofobne aminokiseline.Sliku 1a, b dizajnirao je i proizveo Eduard Urich.
Ubrizgali smo biblioteku peptida faga u dva CM štakora (klase A i B) i izolovali fag iz cerebrospinalne tekućine i krvi (slika 1d).Početni brzi klirens iz biblioteke bio je manje izražen u poređenju sa divljim tipom faga.Prosječni poluživot ubrizgane biblioteke u obje životinje bio je 24,8 minuta u krvi, slično kao kod divljeg tipa faga, i 38,5 minuta u CSF.Uzorci faga krvi i cerebrospinalne tekućine svake životinje podvrgnuti su HTS-u i svi identificirani peptidi su analizirani na prisustvo kratkog tripeptidnog motiva.Tripeptidni motivi su odabrani jer pružaju minimalnu osnovu za formiranje strukture i interakcije peptid-protein14,15.Pronašli smo dobru korelaciju u distribuciji motiva između ubrizgane biblioteke faga i klonova ekstrahiranih iz krvi obje životinje (slika 1e).Podaci ukazuju da je sastav biblioteke samo neznatno obogaćen u pretincu krvi.Učestalosti aminokiselina i konsenzus sekvence su dalje analizirane na svakoj poziciji korištenjem adaptacije softvera Weblogo16.Zanimljivo je da smo otkrili snažno obogaćivanje u ostacima glicina u krvi (slika 1g).Kada je krv upoređena sa klonovima odabranim iz CSF-a, uočena je jaka selekcija i određena deselekcija motiva (slika 1f), a određene aminokiseline su bile prvenstveno prisutne na unaprijed određenim pozicijama u 12-članom (slika 1h).Značajno je da su se pojedine životinje značajno razlikovale u cerebrospinalnoj tekućini, dok je obogaćivanje krvi glicinom uočeno kod obje životinje (dodatna slika 4a-j).Nakon strogog filtriranja podataka o sekvenci u cerebrospinalnoj tekućini životinja #1.1 i #1.2, dobiveno je ukupno 964 i 420 jedinstvenih 12-mer peptida (dopunska slika 1d-e).Izolovani klonovi faga su amplificirani i podvrgnuti drugom krugu in vivo selekcije.Fag ekstrahovan iz drugog kruga selekcije podvrgnut je HTS-u u svakoj životinji i svi identifikovani peptidi su korišćeni kao ulaz u program za prepoznavanje motiva za analizu pojave tripeptidnih motiva (sl. 2a, b, ef).U poređenju sa prvim ciklusom faga oporavljenog iz CSF, uočili smo dalju selekciju i deselekciju mnogih motiva u CSF u granama A i B (slika 2).Algoritam identifikacije mreže primijenjen je da se utvrdi da li predstavljaju različite obrasce konzistentnog niza.Uočena je jasna sličnost između 12-dimenzionalnih sekvenci otkrivenih CSF-om u alternativnoj kladi A (sl. 2c, d) i kladi B (sl. 2g, h).Objedinjena analiza u svakoj grani otkrila je različite profile selekcije za 12-mer peptide (dodatna slika 5c,d) i povećanje omjera CSF/titra krvi tokom vremena za objedinjene klonove nakon drugog kruga selekcije u poređenju s prvim krugom selekcije (dopunska slika 5e).).
Obogaćivanje motiva i peptida u cerebrospinalnoj tekućini pomoću dva uzastopna kruga in vivo funkcionalne selekcije faga.
Svi fagi cerebrospinalne tekućine dobijeni iz prvog kruga svake životinje (životinje #1.1 i #1.2) su spojeni, amplificirani, HT-sekvencirani i ponovno ubrizgani zajedno (2 x 1010 faga/životinja) 2 SM kanulirani štakori (#1.1 → #).2.1 i 2.2, 1.2 → 2.3 i 2.4).(a,b,e,f) Korelacijske dijagrame raspršivanja koje upoređuju relativnu učestalost tripeptidnih motiva svih faga izvedenih iz CSF-a u prvom i drugom krugu selekcije.Relativna učestalost i distribucija motiva koji predstavljaju sve moguće preklapajuće tripeptide koji se nalaze u peptidima u obje orijentacije.Prikazan je broj motiva pronađenih u 1000 čitanja.Crvenim tačkama su istaknuti motivi koji su značajno (p < 0,001) odabrani ili isključeni u nekoj od upoređenih biblioteka.(c, d, g, h) Reprezentacija logotipa sekvence svih sekvenci dugih 12 aminokiselina bogatih CSF na osnovu 2. i 1. kruga in vivo selekcije.Veličina koda od jednog slova pokazuje koliko se često ta aminokiselina pojavljuje na toj poziciji.Za predstavljanje logotipa, upoređuje se učestalost sekvenci CSF ekstrahovanih iz pojedinačnih životinja između dva kruga selekcije i prikazane su obogaćene sekvence u drugom krugu: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 i (h) #1.2–#2.4.Najbogatije aminokiseline na datoj poziciji u (c, d) životinja br.2.1 i br.2.2 ili (g, h) kod životinja br.2.3 i br.2.4 su prikazane u boji.Zelena = polarna, ljubičasta = neutralna, plava = bazična, crvena = kisela i crna = hidrofobne aminokiseline.
Nakon trećeg kruga selekcije, identificirali smo 124 jedinstvene peptidne sekvence (#3.1 i #3.2) iz 332 CSF-rekonstituirana klona faga izoliranih od dvije životinje (dopunska slika 6a).Najveći relativni udio imala je sekvenca LGSVS (18,7%), a zatim umetci divljeg tipa PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) i SARGSWREIVSLS (2,2%).U posljednjoj četvrtoj rundi spojili smo dvije nezavisno odabrane grane od tri odvojene životinje (slika 1c).Od 925 sekvenciranih klonova faga dobijenih iz CSF-a, u četvrtom krugu smo pronašli 64 jedinstvene peptidne sekvence (dopunska slika 6b), među kojima je relativni udio divljeg tipa faga pao na 0,8%.Najčešći klonovi CSF u četvrtoj rundi bili su LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) i RLSSVDSDLSGC.%)).Opseg dužine odabranih peptida je zbog umetanja/delecije nukleotida ili preranog zaustavljanja kodona u prajmerima biblioteke kada se koriste degenerisani kodoni za dizajn NNK biblioteke.Prevremeni stop kodoni stvaraju kraće peptide i odabrani su zato što sadrže povoljan aa motiv.Duži peptidi mogu biti rezultat umetanja/delecije u prajmerima sintetičkih biblioteka.Ovo pozicionira dizajnirani stop kodon izvan okvira i čita ga dok se novi stop kodon ne pojavi nizvodno.Općenito, izračunali smo faktore obogaćivanja za sva četiri kruga selekcije upoređujući ulazne podatke sa izlaznim podacima uzorka.Za prvi krug skrininga koristili smo titar divljeg tipa faga kao nespecifičnu pozadinu.Zanimljivo je da je negativna selekcija faga bila vrlo jaka u prvom ciklusu likvora, ali ne i u krvi (slika 3a), što može biti posljedica male vjerovatnoće pasivne difuzije većine članova peptidne biblioteke u odjeljak CSF ili relativni fagi imaju tendenciju da se efikasnije zadržavaju ili uklanjaju iz krvotoka od bakteriofaga.Međutim, u drugom krugu panninga, uočena je jaka selekcija faga u CSF u oba klada, što sugerira da je prethodni krug bio obogaćen fagima koji pokazuju peptide koji promovišu unos CSF (Slika 3a).Opet, bez značajnog obogaćivanja krvi.Takođe u trećem i četvrtom krugu, klonovi faga su značajno obogaćeni CSF.Upoređujući relativnu frekvenciju svake jedinstvene peptidne sekvence između posljednja dva kruga selekcije, otkrili smo da su sekvence još više obogaćene u četvrtom krugu selekcije (slika 3b).Ukupno 931 tripeptidni motiv je ekstrahovan iz sve 64 jedinstvene peptidne sekvence koristeći obe orijentacije peptida.Najviše obogaćeni motivi u četvrtoj rundi su pobliže ispitani zbog njihovih profila obogaćivanja u svim krugovima u odnosu na ubrizganu biblioteku (granična vrijednost: 10% obogaćivanja) (dopunska slika 6c).Opšti obrasci selekcije pokazali su da je većina proučavanih motiva obogaćena u svim prethodnim krugovima obe selekcijske grane.Međutim, neki motivi (npr. SGL, VSG, LGS GSV) su bili pretežno iz alternativne klade A, dok su drugi (npr. FGW, RTN, WGF, NTR) obogaćeni alternativnim kladom B.
Validacija transporta CSF-a peptida obogaćenih fagom i biotiniliranih vodećih peptida konjugiranih sa streptavidinom.
(a) Odnosi obogaćivanja izračunati u sve četiri runde (R1-R4) na osnovu ubrizganih (ulaz = I) titara faga (PFU) i utvrđenih titara faga CSF (izlaz = O).Faktori obogaćivanja za posljednje tri runde (R2-R4) izračunati su poređenjem sa prethodnom rundom i prvom rundom (R1) sa podacima o težini.Otvorene trake su cerebrospinalna tečnost, zasjenjene trake su plazma.(***p<0,001, na osnovu Studentovog t-testa).(b) Lista najzastupljenijih fagnih peptida, rangiranih prema njihovoj relativnoj proporciji u odnosu na sve fage prikupljene u CSF nakon 4. kruga selekcije.Šest najčešćih klonova faga istaknuto je bojom, numerirano i njihovim faktorima obogaćivanja između 3. i 4. kruga selekcije (insetovi).(c,d) Šest najbogatijih fagnih klonova, praznih fagnih i roditeljskih fagnih peptidnih biblioteka iz 4. kruga analizirano je pojedinačno u modelu uzorkovanja CSF.CSF i uzorci krvi su prikupljeni u naznačenim vremenskim tačkama.(c) Jednake količine od 6 kandidata fagnih klonova (2 x 1010 faga/životinje), praznih faga (#1779) (2 x 1010 faga/životinje) i biblioteke peptida zaliha faga (2 x 1012 faga/životinje) Injektirajte najmanje 3 životinjska repa u odvojene kante u CM.Prikazana je farmakokinetika CSF svakog ubrizganog klona faga i biblioteke fagnih peptida tokom vremena.(d) pokazuje prosječan odnos CSF/krv za sve pronađene fage/mL tokom vremena uzorkovanja.(e) Četiri sintetička vodeća peptida i jedna kodirana kontrola su povezani sa biotinom i streptavidinom preko njihovog N-kraja (tetramerni prikaz) nakon čega je uslijedila injekcija (repna vena iv, 10 mg streptavidina/kg).Najmanje tri intubirana pacova (N = 3).).Uzorci CSF su sakupljeni u naznačenim vremenskim tačkama, a koncentracije streptavidina su izmjerene pomoću CSF anti-streptavidin ELISA (nd = nije otkriveno).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na osnovu ANOVA testa).(f) Poređenje aminokiselinske sekvence najbogatijeg fagnog peptidnog klona #2002 (ljubičasta) sa drugim odabranim klonovima fagnih peptida iz 4. kruga selekcije.Identični i slični fragmenti aminokiselina označeni su bojama.
Od svih obogaćenih faga u četvrtom krugu (slika 3b), odabrano je šest klonova kandidata za dalju individualnu analizu u modelu uzorkovanja CSF.Jednake količine od šest kandidata faga, praznih faga (bez umetaka) i profagnih peptidnih biblioteka ubrizgane su u tri kanulirane CM životinje, a farmakokinetika je određena u testovima CSF (slika 3c) i krvi (dopunska slika 7).Svi testirani klonovi faga ciljali su na CSF odjeljak na nivou 10-1000 puta većem od nivoa praznog kontrolnog faga (#1779).Na primjer, klonovi #2020 i #2077 imali su oko 1000 puta veći titar CSF-a od kontrolnog faga.Farmakokinetički profil svakog odabranog peptida je različit, ali svi imaju visoku sposobnost likvora.Uočili smo konstantno smanjenje tokom vremena za klonove #1903 i #2011, dok za klonove #2077, #2002 i #2009 povećanje tokom prvih 10 minuta može ukazivati ​​na aktivan transport, ali ga treba provjeriti.Klonovi #2020, #2002 i #2077 stabilizirali su se na visokim razinama, dok se koncentracija CSF-a klona #2009 polako smanjivala nakon početnog povećanja.Zatim smo uporedili relativnu učestalost svakog kandidata za CSF sa njegovom koncentracijom u krvi (slika 3d).Korelacija srednjeg titra svakog kandidata za likvor sa titrom krvi u svim vremenima uzorkovanja pokazala je da su tri od šest kandidata značajno obogaćena krvnom likvorom.Zanimljivo je da je klon #2077 pokazao veću stabilnost krvi (dopunska slika 7).Da bismo potvrdili da su sami peptidi sposobni za aktivan transport tereta osim čestica faga u odjeljak CSF, sintetizirali smo četiri vodeća peptida derivatizirana biotinom na N-terminusu gdje se peptidi vežu za česticu faga.Biotinilirani peptidi (br. 2002, 2009, 2020 i 2077) konjugirani su sa streptavidinom (SA) da bi se dobili multimerni oblici koji donekle oponašaju geometriju faga.Ovaj format nam je takođe omogućio da izmerimo izloženost SA u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti kao proteinskim peptidima koji transportuju teret.Važno je da se podaci o fagu često mogu reproducirati kada se sintetički peptidi daju u ovom SA-konjugiranom formatu (slika 3e).Kodirani peptidi imali su manju početnu izloženost i brži klirens iz CSF-a sa nedetektljivim nivoima u roku od 48 sati.Da bismo stekli uvid u puteve isporuke ovih klonova peptidnih faga u CSF prostor, analizirali smo lokalizaciju pojedinačnih pogodaka peptida faga koristeći imunohistohemiju (IHC) za direktno detekciju čestica faga 1 sat nakon intravenske injekcije in vivo.Primjetno, klonovi #2002, #2077 i #2009 mogu se otkriti jakim bojenjem u moždanim kapilarama, dok kontrolni fag (#1779) i klon #2020 nisu otkriveni (dodatna slika 8).To sugerira da ovi peptidi doprinose efektu na mozak upravo ukrštanjem BBB-a.Potrebna je dalja detaljna analiza da bi se testirala ova hipoteza, jer BSCFB ruta također može biti uključena.Prilikom poređenja aminokiselinske sekvence najbogatijeg klona (#2002) sa drugim odabranim peptidima, uočeno je da neki od njih imaju slične aminokiselinske ekstenzije, što može ukazivati ​​na sličan transportni mehanizam (slika 3f).
Zbog svog jedinstvenog profila u plazmi i značajnog povećanja CSF-a tokom vremena, klon sa prikazom faga #2077 je dalje istražen tokom dužeg perioda od 48 sati i bio je u stanju da reprodukuje brzo povećanje CSF-a uočeno u vezi sa stalnim nivoima SA (Slika 4a).Što se tiče drugih identificiranih klonova faga, #2077 je snažno obojen na moždane kapilare i pokazao je značajnu kolokalizaciju s lektinom kapilarnog markera kada se gleda u višoj rezoluciji i moguće malo bojenja u parenhimskom prostoru (Slika 4b).Da bismo istražili da li se farmakološki efekti posredovani peptidima mogu postići u CNS-u, izveli smo eksperiment u kojem su biotinilirane verzije i) #2077 tranzitnog peptida i ii) peptida inhibitora BACE1 pomiješane sa SA u dva različita omjera.Za jednu kombinaciju koristili smo samo inhibitor BACE1 peptida, a za drugu smo koristili omjer 1:3 peptidnog inhibitora BACE1 prema #2077 peptidu.Oba uzorka su davana intravenozno i ​​tokom vremena su mjereni nivoi beta-amiloidnog peptida 40 (Abeta40) u krvi i likvoru.Abeta40 je izmjeren u likvoru jer odražava inhibiciju BACE1 u moždanom parenhimu.Kao što se i očekivalo, oba kompleksa su značajno smanjila nivoe Abeta40 u krvi (slika 4c, d).Međutim, samo uzorci koji sadrže mješavinu peptida br.2077 i inhibitor BACE1 peptida konjugiranog sa SA izazvali su značajno smanjenje Abeta40 u cerebrospinalnoj tekućini (slika 4c).Podaci pokazuju da je peptid br.2077 je u stanju da transportuje 60 kDa SA protein u CNS i takođe izaziva farmakološke efekte sa SA-konjugovanim inhibitorima BACE1 peptida.
(a) Klonska injekcija (2 × 10 faga/životinja) T7 faga koja pokazuje dugoročne farmakokinetičke profile CSF peptida #2077 (RLSSVDSDLSGC) i neinjektiranog kontrolnog faga (#1779) u najmanje tri CM intubirana štakora.(b) Konfokalna mikroskopska slika reprezentativnih kortikalnih mikrožila kod pacova ubrizganih fagom (2 × 10 10 faga/životinja) koja pokazuje suprotno bojenje peptida #2077 i krvnih sudova (lektina).Ovi klonovi faga su davani na 3 štakora i ostavljeni da cirkulišu 1 sat prije perfuzije.Mozak je isječen i obojen poliklonskim FITC-obilježenim antitijelima protiv kapsida faga T7.Deset minuta prije perfuzije i naknadne fiksacije, lektin označen DyLight594 je davan intravenozno.Fluorescentne slike koje pokazuju bojenje lektina (crveno) na luminalnoj strani mikrožila i faga (zeleno) u lumenu kapilara i perivaskularnog moždanog tkiva.Linija skale odgovara 10 µm.(c, d) Biotinilovani BACE1 inhibitorni peptid sam ili u kombinaciji sa biotiniliranim tranzitnim peptidom #2077 je spojen sa streptavidinom nakon čega je uslijedila intravenska injekcija najmanje tri CM pacova kanulirana (10 mg streptavidina/kg).Smanjenje Aβ40 posredovano inhibitorom BACE1 peptida izmjereno je Aβ1-40 ELISA u krvi (crveno) i cerebrospinalnoj tekućini (narandžasto) u naznačenim vremenskim tačkama.Radi bolje jasnoće, isprekidana linija je nacrtana na grafikonu u skali od 100%.(c) Procentualno smanjenje Aβ40 u krvi (crveni trouglovi) i cerebrospinalnoj tečnosti (narandžasti trouglovi) kod pacova tretiranih streptavidinom konjugovanim na tranzitni peptid #2077 i BACE1 inhibitorni peptid u omjeru 3:1.(d) Procentualno smanjenje Aβ40 u krvi (crveni krugovi) i cerebrospinalne tečnosti (narandžasti krugovi) pacova tretiranih streptavidinom spojenim samo sa BACE1 inhibitornim peptidom.Koncentracija Aβ u kontroli bila je 420 pg/ml (standardna devijacija = 101 pg/ml).
Fagi displej je uspešno primenjen u nekoliko oblasti biomedicinskih istraživanja17.Ova metoda je korištena za in vivo studije vaskularne raznolikosti18,19 kao i studije usmjerene na cerebralne sudove20,21,22,23,24,25,26.U ovoj studiji smo proširili primjenu ove selekcijske metode ne samo na direktnu identifikaciju peptida koji ciljaju na cerebralne žile, već i na otkrivanje kandidata s aktivnim transportnim svojstvima da pređu krvno-moždanu barijeru.Sada opisujemo razvoj in vivo selekcijskog postupka kod CM intubiranih pacova i demonstriramo njegov potencijal da identifikuje peptide sa svojstvima likvora.Koristeći T7 fag koji prikazuje biblioteku 12-mernih nasumičnih peptida, uspjeli smo pokazati da je T7 fag dovoljno mali (otprilike 60 nm u promjeru)10 da se prilagodi krvno-moždanoj barijeri, čime direktno prelazi krvno-moždanu barijeru ili horoidni pleksus.Primijetili smo da je sakupljanje CSF-a od kanuliranih CM pacova bila dobro kontrolirana in vivo funkcionalna metoda skrininga, i da se ekstrahirani fag ne samo vezao za vaskulaturu, već je funkcionirao i kao transporter kroz krvno-moždanu barijeru.Nadalje, simultanim prikupljanjem krvi i primjenom HTS-a na CSF i fage izvedene iz krvi, potvrdili smo da na naš izbor CSF-a nije utjecalo obogaćivanje krvi ili sposobnost za proširenje između krugova selekcije.Međutim, odjeljak za krv je dio postupka selekcije, budući da fagi koji mogu doći do CSF ​​odjeljka moraju preživjeti i cirkulirati u krvotoku dovoljno dugo da se obogate u mozgu.Kako bismo izdvojili pouzdane informacije o sekvenci iz neobrađenih HTS podataka, implementirali smo filtere prilagođene greškama sekvencioniranja specifičnih za platformu u toku rada analize.Uključujući kinetičke parametre u metodu skrininga, potvrdili smo brzu farmakokinetiku T7 faga divljeg tipa (t½ ~ 28 min) u krvi24, 27, 28 i također odredili njihov poluživot u cerebrospinalnoj tekućini (t½ ~ 26 min) u minuti).Uprkos sličnim farmakokinetičkim profilima u krvi i likvoru, samo 0,001% koncentracije faga u krvi može se otkriti u likvoru, što ukazuje na nisku pozadinu pokretljivosti divljeg tipa T7 faga preko krvno-moždane barijere.Ovaj rad naglašava važnost prvog kruga selekcije kada se koriste strategije in vivo panning, posebno za fagne sisteme koji se brzo uklanjaju iz cirkulacije, jer je nekoliko klonova u stanju da dopre do CNS odjeljka.Stoga je u prvom krugu smanjenje raznolikosti biblioteka bilo veoma veliko, jer je samo ograničen broj klonova na kraju sakupljen u ovom vrlo strogom CSF modelu.Ova strategija in vivo panning je uključivala nekoliko koraka selekcije kao što su aktivna akumulacija u CSF odjeljku, preživljavanje klonova u odjeljku krvi i brzo uklanjanje klonova T7 faga iz krvi u prvih 10 minuta (Slika 1d i Dodatna slika 4M).).Dakle, nakon prvog kruga, različiti klonovi faga su identificirani u CSF, iako je isti početni skup korišten za pojedinačne životinje.Ovo sugerira da višestruki strogi koraci selekcije za izvorne biblioteke sa velikim brojem članova biblioteke rezultiraju značajnim smanjenjem raznolikosti.Stoga će slučajni događaji postati sastavni dio procesa inicijalne selekcije, koji će u velikoj mjeri utjecati na rezultat.Vjerovatno je da su mnogi klonovi u originalnoj biblioteci imali vrlo sličnu sklonost obogaćivanju likvora.Međutim, čak i pod istim eksperimentalnim uvjetima, rezultati selekcije mogu se razlikovati zbog malog broja svakog pojedinog klona u početnom skupu.
Motivi obogaćeni likvorom razlikuju se od onih u krvi.Zanimljivo je da smo uočili prvi pomak ka peptidima bogatim glicinom u krvi pojedinih životinja.(Sl. 1g, Dopunske slike 4e, 4f).Peptidi glicina koji sadrže fag mogu biti stabilniji i manje je vjerovatno da će biti izvučeni iz cirkulacije.Međutim, ovi peptidi bogati glicinom nisu otkriveni u uzorcima cerebrospinalne tekućine, što sugerira da su odabrane biblioteke prošle kroz dva različita koraka selekcije: jedan u krvi, a drugi je dozvoljen da se akumulira u cerebrospinalnoj tekućini.Klonovi obogaćeni likvorom koji su rezultat četvrtog kruga selekcije su opsežno testirani.Potvrđeno je da su skoro svi pojedinačno testirani klonovi obogaćeni likvorom u poređenju sa slijepim kontrolnim fagom.Jedan peptidni pogodak (#2077) je detaljnije ispitan.Pokazao je duži poluživot u plazmi u odnosu na druge pogotke (slika 3d i dodatna slika 7), a zanimljivo je da je ovaj peptid sadržavao cisteinski ostatak na C-terminusu.Nedavno je pokazano da dodavanje cisteina peptidima može poboljšati njihova farmakokinetička svojstva vezivanjem za albumin 29 .Ovo je trenutno nepoznato za peptid #2077 i zahtijeva dalje istraživanje.Neki peptidi su pokazali valentnu zavisnost u obogaćivanju likvora (podaci nisu prikazani), što može biti povezano sa prikazanom geometrijom površine T7 kapside.T7 sistem koji smo koristili pokazao je 5-15 kopija svakog peptida po čestici faga.IHC je izveden na kandidatskim klonovima olovnih faga ubrizganih intravenozno u cerebralni korteks pacova (dopunska slika 8).Podaci su pokazali da su najmanje tri klona (br. 2002, br. 2009 i br. 2077) u interakciji sa BBB-om.Ostaje da se utvrdi da li ova interakcija BBB dovodi do akumulacije CSF ili premeštanja ovih klonova direktno u BCSFB.Važno je da pokazujemo da odabrani peptidi zadržavaju svoj transportni kapacitet CSF kada se sintetiziraju i vežu za proteinski teret.Vezivanje N-terminalnih biotiniliranih peptida za SA u suštini ponavlja rezultate dobijene sa njihovim odgovarajućim klonovima faga u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti (slika 3e).Konačno, pokazali smo da je olovni peptid #2077 u stanju da promoviše moždano djelovanje biotiniliranog peptidnog inhibitora BACE1 konjugiranog sa SA, uzrokujući izražene farmakodinamičke efekte u CNS-u značajnim smanjenjem nivoa Abeta40 u CSF (slika 4).Nismo bili u mogućnosti da identifikujemo homologe u bazi podataka tako što smo izvršili pretragu homologije peptidne sekvence svih pogodaka.Važno je napomenuti da je veličina T7 biblioteke približno 109, dok je teoretska veličina biblioteke za 12-mere 4 x 1015. Stoga smo odabrali samo mali dio prostora raznolikosti biblioteke 12-mernih peptida, što može značiti da se optimiziraniji peptidi mogu identificirati procjenom susjednog prostora sekvence ovih identificiranih pogodaka.Hipotetički, jedan od razloga zašto nismo pronašli prirodne homologe ovih peptida može biti poništavanje selekcije tokom evolucije kako bi se spriječio nekontrolirani ulazak određenih peptidnih motiva u mozak.
Uzeti zajedno, naši rezultati pružaju osnovu za budući rad na identifikaciji i detaljnijoj karakterizaciji transportnih sistema cerebrovaskularne barijere in vivo.Osnovna postavka ove metode zasniva se na strategiji funkcionalne selekcije koja ne samo da identifikuje klonove sa svojstvima vezivanja cerebralnih vaskularnih sistema, već uključuje i kritični korak u kojem uspješni klonovi imaju intrinzičnu aktivnost da prelaze biološke barijere in vivo u CNS odjeljak.je razjasniti mehanizam transporta ovih peptida i njihovu preferenciju za vezivanje za mikrovaskulaturu specifičnu za regiju mozga.Ovo može dovesti do otkrića novih puteva za transport BBB i receptora.Očekujemo da se identifikovani peptidi mogu direktno vezati za cerebrovaskularne receptore ili za cirkulišuće ​​ligande koji se transportuju kroz BBB ili BCSFB.Peptidni vektori sa transportnom aktivnošću CSF otkriveni u ovom radu biće dalje istraženi.Trenutno istražujemo moždanu specifičnost ovih peptida zbog njihove sposobnosti da prelaze BBB i/ili BCSFB.Ovi novi peptidi bit će izuzetno vrijedni alati za potencijalno otkrivanje novih receptora ili puteva i za razvoj novih visoko efikasnih platformi za isporuku makromolekula, kao što su biološki lijekovi, u mozak.
Kanulirajte veliku cisternu (CM) koristeći modifikaciju prethodno opisane metode.Anestezirani Wistar pacovi (200-350 g) su postavljeni na stereotaksički aparat i napravljen je srednji rez preko obrijanog i aseptički pripremljenog vlasišta kako bi se otkrila lobanja.Izbušite dvije rupe u području gornjeg krila i pričvrstite vijke za pričvršćivanje u rupe.Dodatna rupa je izbušena u bočnom okcipitalnom grebenu za stereotaktično vođenje kanile od nerđajućeg čelika u CM.Nanesite zubni cement oko kanile i pričvrstite vijcima.Nakon fotostvrdnjavanja i stvrdnjavanja cementa, kožna rana je zatvorena supramidnim šavom 4/0.Pravilno postavljanje kanile potvrđuje spontano curenje cerebrospinalne tečnosti (CSF).Uklonite štakora iz stereotaksijskog aparata, primite odgovarajuću postoperativnu njegu i zbrinjavanje boli i ostavite mu da se oporavi najmanje jednu sedmicu dok se u cerebrospinalnoj tekućini ne uoče znaci krvi.Wistar pacovi (Crl:WI/Han) su dobijeni iz Charles Rivera (Francuska).Svi pacovi su držani u specifičnim uslovima bez patogena.Svi eksperimenti na životinjama odobreni su od strane Kancelarije za veterinarstvo grada Bazela, Švajcarska, i izvedeni su u skladu sa licencom za životinje br. 2474 (Procena aktivnog moždanog transporta merenjem nivoa terapeutskih kandidata u cerebrospinalnoj tečnosti i mozgu pacova).
Nežno držite štakora pri svijesti sa CM kanilom u ruci.Uklonite Datura iz kanile i sakupite 10 µl spontano teče cerebrospinalne tečnosti.Budući da je prohodnost kanile na kraju bila ugrožena, u ovu studiju su uključeni samo bistri uzorci cerebrospinalne tekućine bez dokaza o kontaminaciji krvi ili promjene boje.Paralelno, približno 10-20 μl krvi je uzeto iz malog reza na vrhu repa u epruvete sa heparinom (Sigma-Aldrich).CSF i krv su prikupljeni u različitim vremenskim tačkama nakon intravenske injekcije T7 faga.Otprilike 5-10 μl tečnosti je odbačeno prije nego što je sakupljen svaki uzorak CSF, što odgovara mrtvom volumenu katetera.
Biblioteke su generisane korišćenjem T7Select 10-3b vektora kako je opisano u T7Select sistemskom priručniku (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Ukratko, nasumični 12-mer DNK insert sintetiziran je u sljedećem formatu:
NNK kodon je korišten da bi se izbjegli dvostruki stop kodoni i prekomjerna ekspresija aminokiselina u insertu.N je ručno miješani ekvimolarni omjer svakog nukleotida, a K je ručno miješani ekvimolarni omjer nukleotida adenina i citozina.Jednolančani regioni su konvertovani u dvolančanu DNK daljom inkubacijom sa dNTP (Novagen) i Klenow enzimom (New England Biolabs) u Klenow puferu (New England Biolabs) tokom 3 sata na 37°C.Nakon reakcije, dvolančana DNK je obnovljena precipitacijom EtOH.Rezultirajuća DNK je digestirana sa restrikcijskim enzimima EcoRI i HindIII (oboje iz Rochea).Odcijepljeni i pročišćeni (QIAquick, Qiagen) umetak (T4 ligaza, New England Biolabs) je zatim ligiran u okviru u prethodno cijepani T7 vektor nakon aminokiseline 348 10B kapsidnog gena.Reakcije vezivanja su inkubirane na 16°C 18 sati prije in vitro pakovanja.Pakovanje faga in vitro izvedeno je prema uputstvima priloženim uz komplet za kloniranje T7Select 10-3b (Novagen) i otopina za pakovanje je jednom amplificirana do lize korištenjem Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lizati su centrifugirani, titrirani i zamrznuti na -80°C kao osnovni rastvor glicerola.
Direktna PCR amplifikacija fagnih varijabilnih regiona amplificiranih u bujonu ili ploči koristeći vlasničke 454/Roche-amplicon fuzione prajmere.Prajmer za prednju fuziju sadrži sekvence koje okružuju varijabilnu regiju (NNK) 12 (specifičan za šablon), GS FLX Titanium Adapter A i sekvencu ključeva biblioteke sa četiri baze (TCAG) (dodatna slika 1a):
Prajmer za reverznu fuziju takođe sadrži biotin vezan za hvatajuće perle i GS FLX Titanium Adapter B potreban za klonalnu amplfikaciju tokom emulzione PCR:
Amplikoni su zatim podvrgnuti 454/Roche pirosekvenciji prema 454 GS-FLX Titanium protokolu.Za ručno Sanger sekvenciranje (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNK Analyzer), T7 fagna DNK je amplificirana PCR-om i sekvencirana sa sljedećim parovima prajmera:
Inserti iz pojedinačnih plakova podvrgnuti su PCR amplifikaciji koristeći Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (prema uputstvima proizvođača).Izvršite vrući start (10 min na 95 °C) i 35 ciklusa pojačanja (50 s na 95 °C, 1 min na 50 °C i 1 min na 72 °C).
Fag iz biblioteka, fag divljeg tipa, fag spašen iz likvora i krvi ili pojedinačni klonovi su amplificirani u Escherichia coli BL5615 u TB bujonu (Sigma Aldrich) ili u posudama od 500 cm2 (Thermo Scientific) 4 h na 37°C.Fag je ekstrahovan iz ploča ispiranjem ploča Tris-EDTA puferom (Fluka Analytical) ili prikupljanjem plakova sterilnim vrhovima pipete.Fag je izolovan iz supernatanta kulture ili pufera za ekstrakciju sa jednom rundom precipitacije polietilen glikola (PEG 8000) (Promega) i resuspendovan u Tris-EDTA puferu.
Amplificirani fag je podvrgnut 2-3 kruga uklanjanja endotoksina korištenjem kuglica za uklanjanje endotoksina (Miltenyi Biotec) prije intravenske (IV) injekcije (500 μl/životinji).U prvom krugu uvedeno je 2×1012 faga;u drugom, 2×1010 faga;u trećem i četvrtom krugu selekcije, 2×109 faga po životinji.Sadržaj faga u CSF i uzorcima krvi prikupljenim u naznačenim vremenskim tačkama određen je brojanjem plaka prema uputstvima proizvođača (T7Select sistemski priručnik).Selekcija faga je izvršena intravenskom injekcijom pročišćenih biblioteka u repnu venu ili ponovnim ubrizgavanjem faga ekstrahovanog iz CSF-a iz prethodnog kruga selekcije, a naknadno uzimanje uzoraka krvi je 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, odnosno 240 min CSF.Provedena su ukupno četiri kruga in vivo paninga u kojima su dvije odabrane grane odvojeno pohranjene i analizirane tokom prva tri kruga selekcije.Svi umetci faga ekstrahovani iz CSF iz prva dva kruga selekcije podvrgnuti su 454/Roche pirosekvenciji, dok su svi klonovi ekstrahovani iz CSF iz poslednja dva kruga selekcije ručno sekvencionirani.Svi krvni fagi iz prvog kruga selekcije su također podvrgnuti 454/Roche pirosekvenciji.Za injekciju klonova faga, odabrani fagi su amplificirani u E. coli (BL5615) na pločama od 500 cm2 na 37°C tokom 4 sata.Individualno odabrani i ručno sekvencirani klonovi su razmnoženi u TB mediju.Nakon ekstrakcije faga, pročišćavanja i uklanjanja endotoksina (kao što je gore opisano), 2×1010 faga/životinji u 300 μl ubrizgano je intravenozno u jednu repnu venu.
Predprocesiranje i kvalitativno filtriranje sekvencijskih podataka.Sirovi 454/Roche podaci su konvertovani iz binarnog standardnog formata mape toka (sff) u Pearson format koji je čitljiv za ljude (fasta) korišćenjem softvera proizvođača.Dalja obrada nukleotidne sekvence izvedena je korištenjem vlasničkih C programa i skripti (neobjavljeni softverski paket) kako je dolje opisano.Analiza primarnih podataka uključuje stroge višestepene procedure filtriranja.Da bi se filtrirala očitanja koja nisu sadržavala važeći 12-merni umetnuti DNK sekvencu, očitavanja su sekvencijalno poravnata prema početnoj naljepnici (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop naljepnici (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) i pozadinskom umetku (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGACleman) pomoću testa globalnog Net-WW.poravnanje koje dozvoljava do 2 nedosljednosti po poravnanju31.Stoga su iz biblioteke uklonjena čitanja bez oznaka početka i zaustavljanja i čitanja koja sadrže pozadinske umetke, tj. poravnanja koja prelaze dozvoljeni broj nepodudaranja.Što se tiče preostalih očitavanja, N-mer DNK sekvenca koja se proteže od početne oznake i završava prije oznake zaustavljanja je izrezana iz originalne sekvence očitavanja i dalje obrađena (u daljem tekstu „umetnuti“).Nakon translacije umetka, dio nakon prvog stop kodona na 5′ kraju prajmera se uklanja iz inserta.Osim toga, uklonjeni su i nukleotidi koji su doveli do nepotpunih kodona na 3′ kraju prajmera.Da bi se isključili umetci koji sadrže samo pozadinske sekvence, prevedeni umetci koji počinju sa uzorkom aminokiselina “PAG” su također uklonjeni.Peptidi sa posttranslacionom dužinom manjom od 3 aminokiseline uklonjeni su iz biblioteke.Konačno, uklonite redundantnost u grupi umetanja i odredite učestalost svakog jedinstvenog umetanja.Rezultati ove analize uključivali su listu nukleotidnih sekvenci (umetaka) i njihovih (čitanja) frekvencija (dodatne slike 1c i 2).
Grupirajte N-mer DNK umetke prema sličnosti sekvence: Da bi se eliminisale greške sekvencioniranja specifične za 454/Roche (kao što su problemi sa sekvencioniranjem ekstenzija homopolimera) i uklonili manje važne redundanse, prethodno filtrirani umetci N-mer DNK sekvenci (inserti) se sortiraju prema sličnosti.umetanja (dozvoljene su do 2 nepodudarne baze) pomoću iterativnog algoritma definiranog na sljedeći način: umetanja se prvo sortiraju po učestalosti (od najveće do najniže), a ako su iste, po sekundarnom sortiranju po dužini (od najduže do najkraće) ).Dakle, najčešća i najduža umetanja definišu prvu „grupu“.Grupna frekvencija je podešena na ključnu frekvenciju.Zatim, svako umetanje preostalo na sortiranoj listi je pokušano da se doda grupi po paru Needleman-Wunsch poravnanja.Ako broj nepodudaranja, umetanja ili brisanja u poravnanju ne prelazi prag od 2, umetanje se dodaje grupi, a ukupna učestalost grupe se povećava za koliko često je umetanje dodano.Umetci dodani u grupu su označeni kao korišćeni i isključeni iz dalje obrade.Ako se sekvenca umetanja ne može dodati u već postojeću grupu, sekvenca umetanja se koristi za kreiranje nove grupe sa odgovarajućom frekvencijom umetanja i označena kao korišćena.Iteracija se završava kada se svaka sekvenca umetanja ili koristi za formiranje nove grupe ili može biti uključena u već postojeću grupu.Na kraju krajeva, grupirani umetci koji se sastoje od nukleotida se na kraju prevode u peptidne sekvence (peptidne biblioteke).Rezultat ove analize je skup umetanja i njihovih odgovarajućih frekvencija koje čine broj uzastopnih čitanja (dopunska slika 2).
Generisanje motiva: Na osnovu liste jedinstvenih peptida, kreirana je biblioteka koja sadrži sve moguće obrasce aminokiselina (aa) kao što je prikazano ispod.Svaki mogući uzorak dužine 3 je ekstrahovan iz peptida i njegov inverzni uzorak je dodat zajedno sa zajedničkom bibliotekom motiva koja sadrži sve obrasce (tripeptide).Biblioteke motiva koji se jako ponavljaju su sekvencionirane i uklonjena suvišnost.Zatim smo za svaki tripeptid u biblioteci motiva provjerili njegovo prisustvo u biblioteci pomoću računalnih alata.U ovom slučaju, frekvencija peptida koji sadrži pronađeni motivni tripeptid se dodaje i dodjeljuje motivu u biblioteci motiva („broj motiva“).Rezultat generisanja motiva je dvodimenzionalni niz koji sadrži sva pojavljivanja tripeptida (motiva) i njihove odgovarajuće vrijednosti, a to su broj sekvencijalnih čitanja koja rezultiraju odgovarajućim motivom kada se čitanja filtriraju, grupišu i prevode.metrika kao što je gore detaljno opisano.
Normalizacija broja motiva i odgovarajućih dijagrama raspršenja: Broj motiva za svaki uzorak je normaliziran pomoću
gdje je ni broj čitanja koja sadrže temu i.Dakle, vi predstavlja procenat učestalosti čitanja (ili peptida) koji sadrže motiv i u uzorku.P-vrijednosti za nenormalizirani broj motiva izračunate su korištenjem Fisherovog egzaktnog testa.Što se tiče korelograma broja motiva, Spearmanove korelacije su izračunate korištenjem normaliziranog broja motiva sa R.
Za vizualizaciju sadržaja aminokiselina na svakoj poziciji u biblioteci peptida, kreirani su web logogrami 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Prvo, sadržaj aminokiselina na svakoj poziciji 12-mernog peptida je pohranjen u matrici 20×12.Zatim, skup od 1000 peptida koji sadrže isti relativni sadržaj aminokiselina na svakoj poziciji se generiše u formatu brze sekvence i daje se kao ulaz za web-logo 3, koji generiše grafički prikaz relativnog sadržaja aminokiselina na svakoj poziciji.za datu biblioteku peptida.Za vizualizaciju višedimenzionalnih skupova podataka, toplotne karte su kreirane pomoću interno razvijenog alata u R (biosHeatmap, R paket koji tek treba da bude objavljen).Dendrogrami predstavljeni u toplotnim kartama izračunati su korištenjem Wardove hijerarhijske metode grupiranja s metrikom Euklidske udaljenosti.Za statističku analizu podataka o bodovanju motiva, P vrijednosti za nenormalizirano bodovanje su izračunate korištenjem Fisherovog egzaktnog testa.P-vrijednosti za druge skupove podataka izračunate su u R koristeći Studentov t-test ili ANOVA.
Odabrani klonovi faga i fagi bez umetaka ubrizgani su intravenozno preko repne vene (2×1010 faga/životinji u 300 μl PBS).Deset minuta prije perfuzije i naknadne fiksacije, iste životinje su intravenozno ubrizgane sa 100 μl lektina označenog DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuta nakon injekcije faga, pacovima je perfuzirano srce sa 50 ml PBS, a zatim sa 50 ml 4% PFA/PBS.Uzorci mozga su dodatno fiksirani preko noći u 4% PFA/PBS i natopljeni u 30% saharoze preko noći na 4°C.Uzorci se brzo zamrzavaju u OCT mješavini.Imunohistohemijska analiza smrznutih uzoraka izvedena je na sobnoj temperaturi na kriorezcima od 30 µm blokiranim sa 1% BSA i inkubiranim s poliklonskim FITC-obilježenim antitijelima protiv T7 faga (Novus NB 600-376A) na 4 °C.Inkubirajte preko noći.Konačno, preseci su isprani 3 puta sa PBS i pregledani konfokalnim laserskim mikroskopom (Leica TCS SP5).
Svi peptidi sa minimalnom čistoćom od 98% sintetizovani su od strane GenScript USA, biotinilovani i liofilizovani.Biotin je vezan preko dodatnog trostrukog glicinskog odstojnika na N-kraju.Provjerite sve peptide pomoću masene spektrometrije.
Streptavidin (Sigma S0677) je pomiješan sa 5-strukim ekvimolarnim viškom biotiniliranog peptida, biotiniliranog BACE1 inhibitornog peptida ili kombinacijom (omjer 3:1) biotiniliranog BACE1 inhibitornog peptida i BACE1 inhibitornog peptida u 5-10% DMSO/incuba.1 sat na sobnoj temperaturi prije ubrizgavanja.Streptavidin-konjugirani peptidi su ubrizgani intravenozno u dozi od 10 mg/kg u jednu od repnih vena pacova sa cerebralnom šupljinom.
Koncentracija streptavidin-peptidnih kompleksa procijenjena je ELISA testom.Nunc Maxisorp mikrotitarske ploče (Sigma) su obložene preko noći na 4°C sa 1,5 μg/ml mišjim anti-streptavidin antitelom (Thermo, MA1-20011).Nakon blokiranja (pufer za blokiranje: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% želatina, 1% BSA) na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 sata, isprati ploču sa 0,05% Tween-20/PBS (pufer za ispiranje) i 3 sekunde dodati plazma blok sa puferom za punjenje (Plama dilu buferu 1). :10,000, CSF 1:115).Ploča je zatim inkubirana preko noći na 4°C sa detekcijskim antitelom (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Nakon tri koraka ispiranja, streptavidin je detektovan inkubacijom u rastvoru TMB supstrata (Roche) do 20 minuta.Nakon zaustavljanja razvoja boje sa 1M H2SO4, izmjerite apsorbanciju na 450 nm.
Funkcija kompleksa streptavidin-peptid-BACE1 inhibitor procijenjena je pomoću Aβ(1-40) ELISA-e prema protokolu proizvođača (Wako, 294-64701).Ukratko, uzorci CSF su razrijeđeni u standardnom razblaživaču (1:23) i inkubirani preko noći na 4°C u pločama sa 96 jažica obloženim BNT77 antitijelom za hvatanje.Nakon pet koraka ispiranja, dodano je HRP-konjugirano BA27 antitijelo i inkubirano 2 sata na 4°C, nakon čega je uslijedilo pet koraka ispiranja.Aβ(1–40) je detektovan inkubacijom u rastvoru TMB tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi.Nakon što se razvoj boje zaustavi otopinom za zaustavljanje, izmjerite apsorbanciju na 450 nm.Uzorci plazme su podvrgnuti ekstrakciji čvrste faze prije Aβ(1–40) ELISA.Plazma je dodata u 0,2% DEA (Sigma) u ploče sa 96 jažica i inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta.Nakon sukcesivnog pranja SPE ploča (Oasis, 186000679) vodom i 100% metanolom, na SPE ploče su dodani uzorci plazme i sva tečnost je uklonjena.Uzorci su isprani (prvo sa 5% metanola, zatim 30% metanola) i eluirani sa 2% NH4OH/90% metanola.Nakon sušenja eluata na 55°C tokom 99 minuta uz konstantnu struju N2, uzorci su redukovani u standardnim razblaživačima i Aβ(1–40) je mjeren kao što je gore opisano.
Kako citirati ovaj članak: Urich, E. et al.Dostava tereta u mozak pomoću tranzitnih peptida identificiranih in vivo.nauku.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB i Moos T. Dostava makromolekularnih lijekova u mozak korištenjem ciljane terapije.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brašnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., i Martinez-Martinez, P. Dostava peptidnih i proteinskih lijekova kroz krvno-moždanu barijeru.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Krvno-moždana barijera: usko grlo u razvoju lijekova za mozak.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, i Byrd, A. Izgledi za poboljšanu isporuku lijekova i ciljanje na mozak putem horoidnog pleksusa-CSF puta.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizacija biofarmaceutika sa molekularnim trojanskim konjima za isporuku mozga.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, peptidni transport posredovan WM receptorom kroz krvno-moždanu barijeru.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Povećajte penetraciju u mozak i efikasnost terapijskih antitijela koristeći monovalentne molekularne šatlove.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transport receptora za transferin (TfR) određuje mozgom preuzimanje afinitetnih varijanti TfR antitijela.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).