LC Osnove rješavanja problema, dio III: Vrhovi ne izgledaju kako treba

Neke teme o rješavanju problema s LC nikada nisu zastarjele, jer postoje problemi u LC praksi, čak i kada se tehnologija instrumenta vremenom poboljšava. Postoji mnogo načina na koje problemi mogu nastati u LC sistemu i završiti u lošem obliku vrha. Kada se pojave problemi povezani s oblikom vrha, kratka lista mogućih uzroka za ove rezultate pomaže u pojednostavljenju našeg iskustva.
Bilo je zabavno pisati ovu kolumnu “LC Troubleshooting” i razmišljati o temama svakog mjeseca, jer neke teme nikada ne izlaze iz mode. Dok u području istraživanja hromatografije određene teme ili ideje postaju zastarjele jer ih zamjenjuju novije i bolje ideje, u području rješavanja problema, od kada je prvi put u ovom časopisu za rješavanje problema u trenutku pojavljivanja neke teme u LC-u, još uvijek postoji relevantna tema (9) 83(1). Tokom proteklih nekoliko godina, fokusirao sam nekoliko odjeljaka za rješavanje problema s LC-om na savremene trendove koji utječu na tečnu hromatografiju (LC) (na primjer, relativno poređenje našeg razumijevanja utjecaja pritiska na retenciju [2] New Advances) Naše tumačenje rezultata LC-a i kako riješiti probleme sa modernim LC instrumentima koji su započeli s instalacijom 20 decembra 2012. godine. fokusiran na neke od tema o “životu i smrti” rješavanja LC problema — elementi koji su odlični za bilo koji alat za rješavanje problema su od suštinskog značaja, bez obzira na starost sistema koji koristimo. Osnovna tema ove serije je veoma relevantna za LCGC-ov čuveni zidni dijagram “LC Troubleshooting Guide” (4) koji visi u mnogim laboratorijama. , zidni dijagram navodi 44 različita potencijalna uzroka lošeg oblika vrha! Ne možemo sve ove probleme detaljno razmotriti u jednom članku, pa ću se u ovom prvom dijelu o ovoj temi fokusirati na neke od onih koje najčešće viđam. Nadam se da će mladi i stari LC korisnici pronaći neke korisne savjete i podsjetnike o ovoj važnoj temi.
Sve češće odgovaram na pitanja o rješavanju problema sa "sve je moguće". Ovaj odgovor može izgledati lako kada se razmatraju zapažanja koja je teško protumačiti, ali smatram da je često prikladan. Uz mnoge moguće uzroke lošeg oblika vrha, važno je imati otvoren um kada razmišljate o tome koji bi problem mogao biti, i da biste mogli odrediti prioritete potencijalnih uzroka za početak našeg zajedničkog rješavanja problema.
Ključni korak u bilo kojoj vježbi rješavanja problema – ali onaj za koji mislim da je podcijenjen – je prepoznavanje da postoji problem koji treba riješiti. Prepoznavanje da postoji problem često znači prepoznavanje da je ono što se događa s alatom drugačije od naših očekivanja, koja su oblikovana teorijom, empirijskim znanjem i iskustvom (5). „Ovdje se „vršni oblik zapravo odnosi na metrički oblik, a ne samo na vršni oblik“ koji se odnosi samo na metrički oblik. , glatki, pahuljasti, prednji rub, rep, itd.), ali i na širinu. Naša očekivanja za stvarni oblik vrha su jednostavna. Teorija (6) dobro podržava očekivanja iz udžbenika da, u većini slučajeva, kromatografski vrhovi trebaju biti simetrični i u skladu s oblikom Gausove distribucije, kao što je prikazano na slici 1a, kao što je prikazano na slici 1a. ak oblici na slici 1 pokazuju neke od drugih mogućnosti koje bi se mogle uočiti—drugim riječima, neke od načina na koje bi stvari mogle poći po zlu. U ostatku ovog dijela, posvetit ćemo vrijeme raspravi o nekim konkretnim primjerima situacija koje mogu dovesti do ovih tipova oblika.
Ponekad se pikovi uopće ne primjećuju na hromatogramu gdje se očekuje da će biti eluirani. Gornji zidni dijagram pokazuje da je odsustvo pika (pod pretpostavkom da uzorak zapravo sadrži ciljni analit u koncentraciji koja bi trebala učiniti odgovor detektora dovoljnim da ga se vidi iznad šuma) obično povezan s nekim problemom s instrumentom ili netačnim uvjetima mobilne faze (ako se uopće opaža).vrhovi, obično previše “slabi”). Kratka lista potencijalnih problema i rješenja u ovoj kategoriji može se naći u Tabeli I.
Kao što je gore spomenuto, pitanje koliko proširenja vrha treba tolerirati prije nego što se obrati pažnja i pokuša to popraviti je složena tema o kojoj ću raspravljati u budućem članku. Moje iskustvo je da je značajno proširenje vrha često praćeno značajnom promjenom oblika vrha, a rep vrha je češći od prije vrhunca ili cijepanja. Međutim, nominalno je nekoliko razloga uzrokovano širinama vrhova.
Svako od ovih pitanja je detaljno razmotreno u prethodnim izdanjima Troubleshooting LC, a čitaoci zainteresovani za ove teme mogu se obratiti ovim prethodnim člancima za informacije o osnovnim uzrocima i potencijalnim rešenjima ovih problema.Više detalja.
Zaostajanje vrha, prednja strana vrha i cijepanje mogu biti uzrokovani kemijskim ili fizičkim fenomenima, a lista potencijalnih rješenja za ove probleme uvelike varira, ovisno o tome imamo li posla s kemijskim ili fizičkim problemom. Često, upoređujući različite vrhove na hromatogramu, možete pronaći važne naznake o tome koji je najvjerovatniji uzrok sličnih oblika u svim oblicima. ne fizički. Ako je zahvaćen samo jedan ili nekoliko vrhova, a ostali izgledaju dobro, uzrok je najvjerovatnije hemijski.
Hemijski uzroci zadržavanja vrha su previše složeni da bi se ovdje ukratko raspravljalo. Zainteresirani čitatelj se upućuje na nedavno izdanje “LC Troubleshooting” za detaljniju diskusiju (10). Međutim, lako je pokušati smanjiti masu ubrizganog analita i vidjeti da li se oblik vrha poboljšava. male mase analita ili se hromatografski uslovi moraju promeniti tako da se mogu dobiti dobri oblici pikova čak i sa većim masama koje se ubrizgavaju.
Postoji i mnogo potencijalnih fizičkih razloga za vršno zadržavanje. Čitaoci koji su zainteresirani za detaljnu raspravu o mogućnostima upućuju se na još jedno nedavno izdanje “LC Troubleshooting” (11). Jedan od češćih fizičkih uzroka vršnog repa je loša veza u tački između injektora i detektora (12). injekcioni ventil koji do sada nismo koristili, te smo ugradili injektorsku petlju male zapremine sa ferulom koji je bio oblikovan na kapilaru od nehrđajućeg čelika. Nakon nekih početnih eksperimenata rješavanja problema, shvatili smo da je dubina otvora u statoru ventila za ubrizgavanje bila mnogo dublja nego što smo navikli, što je rezultiralo velikim mrtvim volumenom na dnu otvora, koji se lako može riješiti pomoću ponovnog ubrizgavanja na dnu priključka. ferrula u odgovarajući položaj kako bi se eliminirao mrtvi volumen na dnu otvora.
Prednje vrhove poput onih prikazanih na slici 1e također mogu biti uzrokovane fizičkim ili kemijskim problemima. Uobičajeni fizički uzrok prednje ivice je taj što sloj čestica kolone nije dobro zapakiran ili su se čestice reorganizirale tokom vremena. Kao i kod vršnog repa uzrokovanog ovim fizičkim fenomenom, najbolji način da se to popravi je da zamijenimo kolonu i nastavimo oblikom koji često nazivamo vodećim rubom. linearni” uvjeti retencije. Pod idealnim (linearnim) uvjetima, količina analita zadržana u stacionarnoj fazi (dakle, faktor zadržavanja) je linearno povezana s koncentracijom analita u koloni. Kromatografski, to znači da kako se masa analita ubrizganog u kolonu povećava, pik postaje viši, ali ne i poremećen samo kada se ta relacija ne poništava. ller, ali i širi kako se ubrizgava veća masa. Osim toga, nelinearni oblici određuju oblik kromatografskih vrhova, što rezultira vodećim ili zadnjim rubovima. Kao i kod preopterećenja mase koje uzrokuje vršni rep (10), vodeći vrh uzrokovan nelinearnim zadržavanjem također se može dijagnosticirati smanjenjem mase ubrizganog analita. hromatografski uslovi se moraju promeniti da bi se ovo ponašanje svelo na minimum.
Ponekad posmatramo ono što se čini kao „razdvojeni“ vrh, kao što je prikazano na slici 1f. Prvi korak u rešavanju ovog problema je da se utvrdi da li je oblik vrha posledica delimične koelucije (tj. prisutnost dva različita, ali blisko eluirana jedinjenja). Ako zapravo postoje dva različita analita koji eluiraju blizu jedan drugom, onda je to stvar ponovnog brojanja „poboljšanja“ njihove rezolucije (npr. podijeljeni” vrhovi su povezani s fizičkim Performanse nemaju nikakve veze sa samom kolonom. Često je najvažniji trag za ovu odluku da li svi pikovi na hromatogramu pokazuju podijeljene oblike, ili samo jedan ili dva. Ako je samo jedan ili dva, vjerovatno je problem koeluacije;ako su svi vrhovi podijeljeni, vjerovatno je to fizički problem, najvjerovatnije povezan sa samom kolonom.
Podijeljeni vrhovi povezani s fizičkim svojstvima same kolone obično su posljedica djelomično blokiranih ulaznih ili izlaznih frita, ili reorganizacije čestica u koloni, omogućavajući mobilnoj fazi da teče brže od mobilne faze u određenim područjima formiranja kanala kolone .u drugim regijama (11). Djelomično začepljena frita se ponekad može očistiti obrnutim protokom kroz kolonu;međutim, prema mom iskustvu, ovo je obično kratkoročno, a ne dugoročno rješenje. Ovo je često fatalno za moderne kolone ako se čestice rekombinuju unutar kolone. U ovom trenutku, najbolje je zamijeniti kolonu i nastaviti.
Vrhunac na slici 1g, također iz nedavnog primjera u mojoj vlastitoj laboratoriji, obično ukazuje da je signal toliko visok da je dostigao visoku granicu raspona odziva. Za detektore optičke apsorpcije (UV-vis u ovom slučaju), kada je koncentracija analita vrlo visoka, analit apsorbira većinu svjetlosti koja prolazi kroz ćeliju protoka detektora, ostavljajući vrlo malo foto signala koji se može detektirati. izvori šuma, kao što su zalutala svjetlost i “tamna struja”, čineći signal vrlo “zamućenim” po izgledu i neovisnim o koncentraciji analita.Kada se to dogodi, problem se često može lako riješiti smanjenjem ubrizganog volumena analita – smanjenjem volumena ubrizgavanja, razrjeđivanjem uzorka ili oboje.
U hromatografskoj školi koristimo signal detektora (tj. y-os u kromatogramu) kao indikator koncentracije analita u uzorku. Stoga se čini čudnim vidjeti kromatogram sa signalom ispod nule, jer je jednostavno tumačenje da to ukazuje na negativnu koncentraciju analita – što naravno nije fizički moguće korištenjem fizičke apsorpcije.
U ovom slučaju, negativan vrh jednostavno znači da molekuli koji eluiraju iz kolone apsorbiraju manje svjetla od same mobilne faze neposredno prije i nakon vrha. To se može dogoditi, na primjer, kada se koriste relativno niske valne dužine detekcije (<230 nm) i aditivi mobilne faze koji apsorbiraju većinu svjetlosti na ovim valnim dužinama. Takvi aditivi kao što su komponente za mobilnu fazu ili acetolne komponente mogu biti zapravo kao komponente za mobilnu fazu kao što su aditivi u obliku rastvarača. vrhove za pripremu kalibracione krivulje i dobijanje tačnih kvantitativnih informacija, tako da nema fundamentalnog razloga da ih se izbjegne same po sebi (ova metoda se ponekad naziva “indirektna UV detekcija”) (13). Međutim, ako zaista želimo izbjeći negativne pikove u potpunosti, u slučaju detekcije apsorbancije, najbolje rješenje je da koristimo drugačiju detekciju tako da mobilna faza detekcije ili analna faza apsorbira pokretniju apsorbiraju manje svjetla od analita.
Negativni vrhovi se također mogu pojaviti kada se koristi detekcija indeksa loma (RI) kada se indeks loma komponenti osim analita u uzorku, kao što je matrica rastvarača, razlikuje od indeksa prelamanja mobilne faze. To se također dešava sa UV-vis detekcijom, ali ovaj efekat ima tendenciju da se priguši u odnosu na RI negativnu detekciju peak-a. one mobilne faze.
U trećem dijelu o osnovnoj temi rješavanja problema LC-a, raspravljao sam o situacijama u kojima se uočeni oblik vrha razlikuje od očekivanog ili normalnog oblika vrha. Učinkovito rješavanje takvih problema počinje poznavanjem očekivanih oblika vrhova (na temelju teorije ili prethodnog iskustva s postojećim metodama), tako da su odstupanja od ovih očekivanja očigledna. detaljno opisati neke od razloga koje najčešće vidim. Poznavanje ovih detalja predstavlja dobro mjesto za početak rješavanja problema, ali ne obuhvata sve mogućnosti. Čitaoci koji su zainteresirani za detaljniju listu uzroka i rješenja mogu pogledati zidnu tablicu LCGC “LC Troubleshooting Guide”.
(4) Zidna dijagram LCGC “LC Troubleshooting Guide”.https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiza podataka i obrada signala u hromatografiji (Elsevier, New York, NY, 1998), str. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF i Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.


Vrijeme objave: Jul-04-2022