Neke teme rješavanja problema s LC-om nikada nisu zastarjele, jer postoje problemi u LC praksi, čak i kako se tehnologija instrumenata poboljšava tokom vremena. Postoji mnogo načina na koje se problemi mogu pojaviti u LC sistemu i završiti lošim oblikom vrha. Kada se pojave problemi vezani za oblik vrha, kratka lista mogućih uzroka za ove rezultate pomaže u pojednostavljenju našeg iskustva rješavanja problema.
Bilo je zabavno pisati ovu kolumnu „Rješavanje problema s LC-om“ i razmišljati o temama svakog mjeseca, jer neke teme nikada ne izlaze iz mode. Dok u području istraživanja hromatografije određene teme ili ideje postaju zastarjele jer ih zamjenjuju novije i bolje ideje, u području rješavanja problema, od prvog članka o rješavanju problema koji se pojavio u ovom časopisu (u to vrijeme LC Journal) (s obzirom na to da su neke teme i dalje relevantne) 1983. godine (1). Tokom proteklih nekoliko godina, fokusirao sam se na nekoliko odjeljaka o rješavanju problema s LC-om na savremene trendove koji utiču na tečnu hromatografiju (LC) (na primjer, relativno poređenje našeg razumijevanja utjecaja pritiska na zadržavanje [2] Novi napredak), našu interpretaciju LC rezultata i kako rješavati probleme s modernim LC instrumentima. U ovomjesečnom nastavku nastavljam svoju seriju (3), koja je započela u decembru 2021. godine, a koja se fokusirala na neke od „životnih“ tema rješavanja problema s LC-om - elementi koji su odlični za svakog rješavača problema su neophodni, bez obzira na starost sistema koji koristimo. Osnovna tema ove serije je veoma relevantna za LCGC-ov poznati zidni grafikon „Vodič za rješavanje problema s LC-om“ (4) koji visi u... mnoge laboratorije. Za treći dio ove serije, odlučio sam se fokusirati na probleme vezane za oblik ili karakteristike vrha. Nevjerovatno, zidna tabela navodi 44 različita potencijalna uzroka lošeg oblika vrha! Ne možemo detaljno razmotriti sve ove probleme u jednom članku, tako da ću se u ovom prvom nastavku na ovu temu fokusirati na neke od onih koje najčešće viđam. Nadam se da će mladi i stari korisnici LC pronaći neke korisne savjete i podsjetnike o ovoj važnoj temi.
Sve češće na pitanja o rješavanju problema odgovaram sa „sve je moguće“. Ovaj odgovor može izgledati lako kada se razmatraju opažanja koja je teško interpretirati, ali često ga smatram prikladnim. S obzirom na mnoge moguće uzroke lošeg oblika vrha, važno je ostati otvorenog uma kada se razmatra u čemu bi mogao biti problem i biti u mogućnosti odrediti prioritete potencijalnih uzroka kako bismo započeli s našim naporima za rješavanje problema, fokusirajući se na one najčešće mogućnosti, ova tačka je veoma važna.
Ključni korak u svakoj vježbi rješavanja problema - ali onaj koji mislim da je podcijenjen - jeste prepoznavanje da postoji problem koji treba riješiti. Prepoznavanje da postoji problem često znači prepoznavanje da se ono što se dešava sa alatom razlikuje od naših očekivanja, koja su oblikovana teorijom, empirijskim znanjem i iskustvom (5). "Oblik vrha" na koji se ovdje referira zapravo se ne odnosi samo na oblik vrha (simetričan, asimetričan, gladak, pahuljast, na prednjoj ivici, rep itd.), već i na širinu. Naša očekivanja za stvarni oblik vrha su jednostavna. Teorija (6) dobro podržava očekivanje iz udžbenika da bi, u većini slučajeva, hromatografski vrhovi trebali biti simetrični i odgovarati obliku Gaussove distribucije, kao što je prikazano na slici 1a. Ono što očekujemo od širina vrhova je složenije pitanje i o ovoj temi ćemo raspravljati u budućem članku. Ostali oblici vrhova na slici 1 pokazuju neke od drugih mogućnosti koje bi se mogle uočiti - drugim riječima, neke od načina na koje stvari mogu poći po zlu. U ostatku ovog dijela, posvetit ćemo vrijeme raspravi o nekim specifičnim primjerima situacija koje mogu dovesti do ovih tipova oblika.
Ponekad se vrhovi uopće ne uočavaju na hromatogramu tamo gdje se očekuje da će biti eluirani. Gornji zidni grafikon pokazuje da je odsustvo vrha (pod pretpostavkom da uzorak zapravo sadrži ciljani analit u koncentraciji koja bi trebala učiniti odziv detektora dovoljnim da ga vidi iznad šuma) obično povezano s nekim problemom instrumenta ili neispravnim uvjetima mobilne faze (ako se uopće uočavaju). vrhovi, obično previše „slabi“). Kratak popis potencijalnih problema i rješenja u ovoj kategoriji može se naći u Tabeli I.
Kao što je gore spomenuto, pitanje koliko širenja vrha treba tolerirati prije nego što se tome posveti pažnja i pokuša se popraviti složena je tema o kojoj ću raspravljati u budućem članku. Moje iskustvo je da značajno širenje vrha često prati značajna promjena oblika vrha, a "repovanje" vrha je češće nego pre-vrha ili cijepanje. Međutim, nominalno simetrični vrhovi su također prošireni, što može biti uzrokovano nekoliko različitih razloga:
Svaki od ovih problema detaljno je razmatran u prethodnim izdanjima časopisa Troubleshooting LC, a čitaoci zainteresovani za ove teme mogu se pozvati na te prethodne članke za informacije o uzrocima i potencijalnim rješenjima ovih problema. Više detalja.
Rep vrhova, frontalizacija vrhova i cijepanje mogu biti uzrokovani hemijskim ili fizičkim pojavama, a lista potencijalnih rješenja za ove probleme uveliko varira, ovisno o tome da li se radi o hemijskom ili fizičkom problemu. Često, poređenjem različitih vrhova u hromatogramu, možete pronaći važne tragove o tome koji je krivac. Ako svi vrhovi u hromatogramu pokazuju slične oblike, uzrok najvjerovatnije nije fizički. Ako je pogođen samo jedan ili nekoliko vrhova, ali ostali izgledaju dobro, uzrok je najvjerovatnije hemijski.
Hemijski uzroci repova vrhova su previše složeni da bi se ovdje ukratko raspravljali. Zainteresovani čitalac se upućuje na nedavno izdanje "LC Troubleshooting" za detaljniju diskusiju (10). Međutim, lako je pokušati smanjiti masu ubrizganog analita i vidjeti da li se oblik vrha poboljšava. Ako je tako, onda je to dobar znak da je problem "preopterećenje masom". U ovom slučaju, metoda mora biti ograničena na ubrizgavanje malih masa analita ili se hromatografski uslovi moraju promijeniti tako da se dobri oblici vrhova mogu dobiti čak i sa ubrizganim većim masama.
Postoje i mnogi potencijalni fizički razlozi za pojavu repova vrhova. Čitaoci zainteresovani za detaljnu diskusiju o mogućnostima upućuju se na još jedno nedavno izdanje "LC Troubleshooting" (11). Jedan od češćih fizičkih uzroka pojave repova vrhova je loša veza u tački između injektora i detektora (12). Ekstreman primjer prikazan je na slici 1d, dobijenoj u mom laboratoriju prije nekoliko sedmica. U ovom slučaju, izgradili smo sistem sa novim ventilom za ubrizgavanje koji ranije nismo koristili i instalirali smo petlju za ubrizgavanje male zapremine sa ferulom koja je bila oblikovana na kapilaru od nehrđajućeg čelika. Nakon nekoliko početnih eksperimenata za rješavanje problema, shvatili smo da je dubina otvora u statoru ventila za ubrizgavanje mnogo veća nego što smo navikli, što je rezultiralo velikim mrtvim volumenom na dnu otvora. Ovaj problem se lako rješava zamjenom petlje za ubrizgavanje drugom cijevi, a ferulu možemo podesiti u pravilan položaj kako bismo eliminisali mrtvi volumen na dnu otvora.
Frontovi vrhova poput onih prikazanih na slici 1e također mogu biti uzrokovani fizičkim ili hemijskim problemima. Uobičajeni fizički uzrok vodeće ivice je da sloj čestica u koloni nije dobro zbijen ili da su se čestice reorganizovale tokom vremena. Kao i kod repova vrhova uzrokovanih ovim fizičkim fenomenom, najbolji način da se ovo riješi je zamjena kolone i nastavak rada. U osnovi, oblici vrhova vodeće ivice hemijskog porijekla često nastaju iz onoga što nazivamo "nelinearnim" uslovima zadržavanja. Pod idealnim (linearnim) uslovima, količina analita koju zadržava stacionarna faza (dakle, faktor zadržavanja) linearno je povezana sa koncentracijom analita u koloni. Kromatografski, to znači da kako se masa analita ubrizganog u kolonu povećava, vrh postaje viši, ali ne i širi. Ovaj odnos se prekida kada je ponašanje zadržavanja nelinearno, a vrhovi ne samo da postaju viši, već i širi kako se ubrizgava više mase. Osim toga, nelinearni oblici određuju oblik hromatografskih vrhova, što rezultira vodećim ili pratećim ivicama. Kao i kod preopterećenja masom koje uzrokuje repove vrhova (10), vođenje vrhova uzrokovano Nelinearno zadržavanje se također može dijagnosticirati smanjenjem mase ubrizganog analita. Ako se oblik vrha poboljša, metoda se mora modificirati kako ne bi premašila kvalitetu ubrizgavanja koja uzrokuje vodeću ivicu ili se hromatografski uvjeti moraju promijeniti kako bi se ovo ponašanje minimiziralo.
Ponekad primjećujemo ono što izgleda kao "razdvojeni" vrh, kao što je prikazano na slici 1f. Prvi korak u rješavanju ovog problema je utvrditi da li je oblik vrha posljedica djelomične koelucije (tj. prisustva dva različita, ali blisko eluirajuća spoja). Ako zapravo postoje dva različita analita koji eluiraju blizu jedan drugome, onda je stvar u poboljšanju njihove rezolucije (na primjer, povećanjem selektivnosti, retencije ili broja ploča), a prividni "razdvojeni" vrhovi su povezani s fizičkim svojstvima. Performanse nemaju nikakve veze sa samom kolonom. Često je najvažniji trag za ovu odluku da li svi vrhovi u hromatogramu pokazuju razdvojene oblike ili samo jedan ili dva. Ako je samo jedan ili dva, vjerovatno je problem u koeluciji; ako su svi vrhovi razdvojeni, vjerovatno je problem fizički, najvjerovatnije povezan sa samom kolonom.
Razdvojeni vrhovi povezani s fizičkim svojstvima same kolone obično su posljedica djelomično blokiranih ulaznih ili izlaznih fritova ili reorganizacije čestica u koloni, što omogućava mobilnoj fazi da teče brže od mobilne faze u određenim područjima formiranja kanala kolone, a u drugim regijama (11). Djelomično začepljeni frit se ponekad može očistiti preusmjeravanjem toka kroz kolonu; međutim, po mom iskustvu, ovo je obično kratkoročno, a ne dugoročno rješenje. Ovo je često fatalno kod modernih kolona ako se čestice rekombiniraju unutar kolone. U ovom trenutku je najbolje zamijeniti kolonu i nastaviti.
Vrh na slici 1g, također iz nedavnog primjera u mom laboratoriju, obično ukazuje na to da je signal toliko visok da je dostigao gornju granicu raspona odziva. Kod optičkih detektora apsorbancije (u ovom slučaju UV-Vis), kada je koncentracija analita vrlo visoka, analit apsorbira većinu svjetlosti koja prolazi kroz protočnu ćeliju detektora, ostavljajući vrlo malo svjetlosti za detekciju. Pod ovim uvjetima, električni signal iz fotodetektora je pod velikim utjecajem različitih izvora šuma, kao što su zalutala svjetlost i "tamna struja", što signal čini vrlo "mutnim" po izgledu i neovisnim o koncentraciji analita. Kada se to dogodi, problem se često može lako riješiti smanjenjem volumena ubrizgavanja analita - smanjenjem volumena ubrizgavanja, razrjeđivanjem uzorka ili oboje.
U školi hromatografije koristimo signal detektora (tj. y-osu u hromatogramu) kao indikator koncentracije analita u uzorku. Stoga se čini čudnim vidjeti hromatogram sa signalom ispod nule, jer je jednostavno tumačenje da to ukazuje na negativnu koncentraciju analita - što naravno nije fizički moguće. Po mom iskustvu, negativni vrhovi se najčešće opažaju kada se koriste optički detektori apsorbancije (npr. UV-vis).
U ovom slučaju, negativni vrh jednostavno znači da molekuli koji eluiraju iz kolone apsorbiraju manje svjetlosti od same mobilne faze neposredno prije i poslije vrha. To se može dogoditi, na primjer, kada se koriste relativno niske valne duljine detekcije (<230 nm) i aditivi mobilne faze koji apsorbiraju većinu svjetlosti na tim valnim duljinama. Takvi aditivi mogu biti komponente rastvarača mobilne faze poput metanola ili komponente pufera poput acetata ili formata. Negativni vrhovi se zapravo mogu koristiti za pripremu kalibracijske krivulje i dobijanje tačnih kvantitativnih informacija, tako da ne postoji fundamentalni razlog da ih se izbjegava per se (ova metoda se ponekad naziva "indirektna UV detekcija") (13). Međutim, ako zaista želimo u potpunosti izbjeći negativne vrhove, u slučaju detekcije apsorbancije, najbolje rješenje je koristiti drugačiju valnu duljinu detekcije tako da analit apsorbira više od mobilne faze ili promijeniti sastav mobilne faze tako da apsorbiraju manje svjetlosti od analita.
Negativni vrhovi se također mogu pojaviti pri korištenju detekcije indeksa prelamanja (RI) kada se indeks prelamanja komponenti osim analita u uzorku, kao što je matrica rastvarača, razlikuje od indeksa prelamanja mobilne faze. To se također događa kod UV-Vis detekcije, ali ovaj efekat ima tendenciju da bude smanjen u odnosu na RI detekciju. U oba slučaja, negativni vrhovi se mogu minimizirati bližim usklađivanjem sastava matrice uzorka sa sastavom mobilne faze.
U trećem dijelu o osnovnoj temi rješavanja problema s LC-om, raspravljao sam o situacijama u kojima se uočeni oblik vrha razlikuje od očekivanog ili normalnog oblika vrha. Učinkovito rješavanje problema takvih problema počinje poznavanjem očekivanih oblika vrha (na temelju teorije ili prethodnog iskustva s postojećim metodama), tako da su odstupanja od tih očekivanja očigledna. Problemi s oblikom vrha imaju mnogo različitih potencijalnih uzroka (preširok, rep, vodeća ivica itd.). U ovom nastavku detaljno raspravljam o nekim od razloga koje najčešće viđam. Poznavanje ovih detalja pruža dobro mjesto za početak rješavanja problema, ali ne obuhvaća sve mogućnosti. Čitatelji zainteresirani za detaljniji popis uzroka i rješenja mogu se pozvati na LCGC „Vodič za rješavanje problema s LC-om“.
(4) Zidna tabela LCGC „Vodič za rješavanje problema LC-a“. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analiza podataka i obrada signala u hromatografiji (Elsevier, New York, NY, 1998), str. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF i Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.