Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Tečna biopsija (LB) je koncept koji brzo dobija na popularnosti u biomedicinskom polju. Koncept se uglavnom zasniva na detekciji fragmenata cirkulirajuće ekstracelularne DNK (ccfDNA), koji se uglavnom oslobađaju kao mali fragmenti nakon ćelijske smrti u različitim tkivima. Mali dio ovih fragmenata potiče iz stranih (stranih) tkiva ili organizama. U trenutnom radu, primijenili smo ovaj koncept na dagnje, vrstu čuvarku poznatu po svom visokom kapacitetu filtracije morske vode. Koristimo sposobnost dagnji da djeluju kao prirodni filteri za hvatanje fragmenata DNK iz okoliša iz različitih izvora kako bismo pružili informacije o biodiverzitetu morskih obalnih ekosistema. Naši rezultati pokazuju da hemolimfa dagnji sadrži fragmente DNK koji se uveliko razlikuju po veličini, od 1 do 5 kb. Sekvenciranje sačmaricom pokazalo je da je veliki broj fragmenata DNK stranog mikrobnog porijekla. Među njima smo pronašli fragmente DNK od bakterija, arheja i virusa, uključujući viruse za koje se zna da inficiraju različite domaćine koji se obično nalaze u obalnim morskim ekosistemima. Zaključno, naša studija pokazuje da koncept LB primijenjen na dagnje predstavlja bogat, ali još uvijek neistražen izvor znanja o mikrobnoj raznolikosti u morskim obalnim ekosistemima.
Utjecaj klimatskih promjena (CC) na biodiverzitet morskih ekosistema je brzorastuće područje istraživanja. Globalno zagrijavanje ne samo da uzrokuje važne fiziološke stresove, već i pomiče evolucijske granice termičke stabilnosti morskih organizama, utičući na stanište brojnih vrsta, potičući ih da traže povoljnije uslove [1, 2]. Pored uticaja na biodiverzitet metazoa, CC narušava delikatnu ravnotežu interakcija domaćina i mikroba. Ova mikrobna disbakterioza predstavlja ozbiljnu prijetnju morskim ekosistemima jer čini morske organizme podložnijim zaraznim patogenima [3, 4]. Vjeruje se da školjke i školjkaši igraju važnu ulogu u masovnim uginuljima, što je ozbiljan problem za upravljanje globalnim morskim ekosistemima [5, 6]. Ovo je važno pitanje s obzirom na ekonomske, ekološke i nutritivne utjecaje mnogih morskih vrsta. To se posebno odnosi na školjke koje žive u polarnim regijama, gdje su učinci CK neposredniji i teži [6, 7]. U stvari, školjke poput Mytilus spp. se široko koriste za praćenje učinaka CC na morske ekosisteme. Nije iznenađujuće da je razvijen relativno veliki broj biomarkera za praćenje njihovog zdravlja, često koristeći dvoslojni pristup koji uključuje funkcionalne biomarkere zasnovane na enzimskoj aktivnosti ili ćelijskim funkcijama kao što su održivost ćelija i fagocitna aktivnost [8]. Ove metode također uključuju mjerenje koncentracije specifičnih indikatora pritiska koji se akumuliraju u mekim tkivima nakon apsorpcije velikih količina morske vode. Međutim, visoki kapacitet filtracije i poluotvoreni cirkulatorni sistem školjki pružaju priliku za razvoj novih biomarkera hemolimfe korištenjem koncepta tečne biopsije (LB), jednostavnog i minimalno invazivnog pristupa upravljanju uzorcima krvi [9, 10]. Iako se u ljudskoj LB može naći nekoliko vrsta cirkulirajućih molekula, ovaj koncept se prvenstveno zasniva na analizi sekvenciranja DNK fragmenata cirkulirajuće ekstracelularne DNK (ccfDNA) u plazmi. U stvari, prisustvo cirkulirajuće DNK u ljudskoj plazmi poznato je od sredine 20. stoljeća [11], ali tek je posljednjih godina pojava metoda sekvenciranja visokog protoka dovela do kliničke dijagnoze zasnovane na ccfDNA. Prisustvo ovih cirkulirajućih fragmenata DNK dijelom je posljedica pasivnog oslobađanja genomske DNK (nuklearne i mitohondrijske) nakon ćelijske smrti. Kod zdravih osoba, koncentracija ccfDNK je normalno niska (<10 ng/mL), ali se može povećati 5-10 puta kod pacijenata koji pate od različitih patologija ili su izloženi stresu, što rezultira oštećenjem tkiva. Kod zdravih osoba, koncentracija ccfDNK je normalno niska (<10 ng/mL), ali se može povećati 5-10 puta kod pacijenata koji pate od različitih patologija ili su izloženi stresu, što rezultira oštećenjem tkiva. Koncentracija vkkDNK kod zdravih ljudi je u normalnoj niskoj količini (<10 ng/ml), ali može biti povećana u 5-10 puta u bolnoj različitoj patologiji ili podložnim stresu, koji dovodi do oštećenja tkiva. Kod zdravih osoba, koncentracija cccDNK je normalno niska (<10 ng/mL), ali se može povećati 5-10 puta kod pacijenata s različitim patologijama ili pod stresom koji dovodi do oštećenja tkiva.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低 (<10 ng/mL) 5-10 倍, 从而导致在 健康 个体 中 , ccfdna 的 浓度 较 低 （ (<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 或華中 可 增加 5-10 倍, 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损损伤Koncentracije ccfDNA obično su niske (<10 ng/ml) kod zdravih ljudi, ali mogu biti povećane u 5-10 puta kod pacijenata sa različitim patologijama ili stresom, što dovodi do oštećenja tkiva. Koncentracije ccfDNA su obično niske (<10 ng/ml) kod zdravih osoba, ali se mogu povećati 5-10 puta kod pacijenata s različitim patologijama ili stresom, što rezultira oštećenjem tkiva.Veličina fragmenata ccfDNK uveliko varira, ali obično se kreće od 150 do 200 bp. [12]. Analiza vlastite ccfDNK, tj. ccfDNK iz normalnih ili transformiranih ćelija domaćina, može se koristiti za otkrivanje genetskih i epigenetskih promjena prisutnih u nuklearnom i/ili mitohondrijalnom genomu, čime se pomaže kliničarima u odabiru specifičnih molekularno usmjerenih terapija [13]. Međutim, ccfDNK se može dobiti iz stranih izvora kao što je ccfDNK iz fetalnih ćelija tokom trudnoće ili iz transplantiranih organa [14,15,16,17]. ccfDNK je također važan izvor informacija za otkrivanje prisutnosti nukleinskih kiselina infektivnog agensa (stranog), što omogućava neinvazivno otkrivanje široko rasprostranjenih infekcija koje nisu identificirane hemokulturama, izbjegavajući invazivnu biopsiju zaraženog tkiva [18]. Nedavne studije su zaista pokazale da ljudska krv sadrži bogat izvor informacija koje se mogu koristiti za identifikaciju virusnih i bakterijskih patogena, te da je oko 1% ccfDNK pronađene u ljudskoj plazmi stranog porijekla [19]. Ove studije pokazuju da se biodiverzitet cirkulirajućeg mikrobioma organizma može procijeniti pomoću ccfDNK analize. Međutim, do nedavno se ovaj koncept koristio isključivo kod ljudi i, u manjoj mjeri, kod drugih kičmenjaka [20, 21].
U ovom radu koristimo LB potencijal za analizu ccfDNK Aulacomya atra, južne vrste koja se obično nalazi na subantarktičkim Kerguelen ostrvima, grupi ostrva na vrhu velike visoravni koja je formirana prije 35 miliona godina nakon vulkanske erupcije. Koristeći in vitro eksperimentalni sistem, otkrili smo da dagnje brzo apsorbuju fragmente DNK u morskoj vodi i ulaze u odjeljak hemolimfe. Sekvenciranje sačmaricom pokazalo je da ccfDNK hemolimfe dagnji sadrži fragmente DNK vlastitog i nesopstvenog porijekla, uključujući simbiotske bakterije i fragmente DNK iz bioma tipičnih za hladne vulkanske morske obalne ekosisteme. CcfDNK hemolimfe također sadrži virusne sekvence izvedene iz virusa s različitim rasponima domaćina. Također smo pronašli fragmente DNK iz višećelijskih životinja kao što su koštane ribe, morske anemone, alge i insekti. Zaključno, naša studija pokazuje da se LB koncept može uspješno primijeniti na morske beskičmenjake kako bi se generirao bogat genomski repertoar u morskim ekosistemima.
Odrasle jedinke (duge 55-70 mm) Mytilus platensis (M. platensis) i Aulacomya atra (A. atra) prikupljene su sa međuplimnih stjenovitih obala Port-au-Francea (049°21.235 J, 070°13.490 I) na ostrvima Kerguelen u decembru 2018. godine. Ostale odrasle plave dagnje (Mytilus spp.) nabavljene su od komercijalnog dobavljača (PEI Mussel King Inc., Ostrvo Princa Edwarda, Kanada) i smještene u temperaturno kontrolirani (4°C) prozračeni rezervoar koji je sadržavao 10-20 L vještačke salamure od 32‰ (vještačka morska sol Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, SAD). Za svaki eksperiment izmjerene su dužina i težina pojedinačnih školjki.
Besplatni protokol otvorenog pristupa za ovaj program dostupan je online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Ukratko, LB hemolimfa je prikupljena iz abduktornih mišića kao što je opisano [22]. Hemolimfa je pročišćena centrifugiranjem na 1200×g tokom 3 minute, supernatant je zamrznut (-20°C) do upotrebe. Za izolaciju i pročišćavanje cfDNK, uzorci (1,5-2,0 ml) su odmrznuti i obrađeni korištenjem NucleoSnap cfDNA kita (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) prema uputama proizvođača. ccfDNK je pohranjena na -80°C do daljnje analize. U nekim eksperimentima, ccfDNK je izolirana i pročišćena korištenjem QIAamp DNA Investigator Kita (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Pročišćena DNK je kvantificirana korištenjem standardnog PicoGreen testa. Distribucija fragmenata izolovane ccfDNK analizirana je kapilarnom elektroforezom pomoću Agilent 2100 bioanalizatora (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) i High Sensitivity DNA Kit-a. Test je proveden korištenjem 1 µl uzorka ccfDNK prema uputstvima proizvođača.
Za sekvenciranje fragmenata ccfDNK hemolimfe, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) je pripremio "shotgun" biblioteke koristeći Illumina DNA Mix kit iz Illumina MiSeq PE75 kita. Korišten je standardni adapter (BioO). Datoteke sirovih podataka dostupne su iz NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 i SRR8924809). Osnovni kvalitet očitavanja procijenjen je pomoću FastQC [23]. Trimmomatic [24] je korišten za adaptere za izrezivanje i očitavanja lošeg kvaliteta. "shotgun" očitavanja sa uparenim krajevima su FLASH spojena u duža pojedinačna očitavanja sa minimalnim preklapanjem od 20 bp kako bi se izbjegla neusklađenost [25]. Spojeni očitanja su označena pomoću BLASTN-a korištenjem NCBI baze podataka taksonomije školjkaša (e vrijednost < 1e−3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti je izvršeno pomoću DUST-a [26]. Spojeni očitanja su označena pomoću BLASTN-a korištenjem NCBI baze podataka taksonomije školjkaša (e vrijednost < 1e−3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti je izvršeno pomoću DUST-a [26]. Objedinjene poruke bile su objavljene uz pomoć BLASTN-a sa korištenjem baze podataka taksonomija dvoslojnih molûskova NCBI (značenje e < 1e-3 i 90% gomologije), maskiranje posljedičnih stečevina niske složenosti koje je izvedeno korištenjem DUST-a [26]. Združeni očitanja su označena pomoću BLASTN-a korištenjem NCBI baze podataka o taksonomiji školjki (e vrijednost < 1e-3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti izvršeno je pomoću DUST-a [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的合并的读数 [6D]进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 缻数 （并 缻数 Ｖ进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Objedinjene čtenije bile su objavljene uz pomoć BLASTN-a sa korištenjem taksonomske baze podataka dvoslojnih mollûskov NCBI (značenje e <1e-3 i 90% gomologije), maskiranje posljedičnih stečevina niske složenosti izvedeno je korištenjem DUST-a [26]. Združeni očitanja su označena pomoću BLASTN-a korištenjem NCBI baze podataka o taksonomiji školjki (e-vrijednost <1e-3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti izvršeno je pomoću DUST-a [26].Očitavanja su podijeljena u dvije grupe: povezana sa sekvencama školjki (ovdje nazvana samoočitavanja) i nepovezana (ne-samoočitavanja). Dvije grupe su odvojeno sastavljene korištenjem MEGAHIT-a za generiranje kontiga [27]. U međuvremenu, taksonomska distribucija očitavanja stranih mikrobioma klasificirana je korištenjem Kraken2 [28] i grafički predstavljena Krona tortnim grafikonom na Galaxyju [29, 30]. Optimalni kmeri su određeni kao kmeri-59 na osnovu naših preliminarnih eksperimenata. Samokontigi su zatim identificirani poravnanjem s BLASTN-om (baza podataka NCBI za školjkaše, e-vrijednost < 1e−10 i 60% homologije) za konačnu anotaciju. Samokontigi su zatim identificirani poravnanjem s BLASTN-om (baza podataka NCBI za školjkaše, e-vrijednost < 1e−10 i 60% homologije) za konačnu anotaciju. Zatim se sopstveni kontigi identifikuju putem postavljanja sa BLASTN-a (baza danih dvosložnih mollûskov NCBI, vrednost e <1e-10 i gomologija 60%) za krajnje napomene. Samokontigirajući spojevi su zatim identificirani usporedbom s BLASTN-om (NCBI baza podataka školjki, e-vrijednost <1e-10 i 60% homologije) za konačnu anotaciju.然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库, e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库, e 值< 1e-10 和60% Zatim su identifikovani sopstveni kontigi za okončanje anotacija putem postavljanja sa BLASTN-a (baza danih NCBI za dvosmerne moljskove, vrednost e <1e-10 i gomologija 60%). Samokontigirajući spojevi su zatim identificirani za konačnu anotaciju usporedbom s BLASTN-om (NCBI baza podataka o školjkašima, e-vrijednost <1e-10 i 60% homologije). Paralelno, kontigi koji nisu dio vlastitih grupa označeni su pomoću BLASTN-a (nt NCBI baza podataka, e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije). Paralelno, kontigi koji nisu dio vlastitih grupa označeni su pomoću BLASTN-a (nt NCBI baza podataka, e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije). Paralelni tuđi grupni kontigi bili su anotirani pomoću BLASTN-a (baza danih nt NCBI, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%). Paralelno, kontigi stranih grupa su označeni pomoću BLASTN-a (NT NCBI baza podataka, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije).平行地,用BLASTN (nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身绾重叠平行地,用BLASTN (nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身绾重叠 Paralelni kontigi, koji se ne odnose na vlastitu grupu, bili su objavljeni uz pomoć BLASTN-a (baza podataka nt NCBI, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%). Paralelno, kontigi koji nisu samostalne grupe su označeni pomoću BLASTN-a (nt NCBI baza podataka, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije). BLASTX je također proveden na nesopstvenim kontigima korištenjem nr i RefSeq protein NCBI baza podataka (e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije). BLASTX je također proveden na nesopstvenim kontigima korištenjem nr i RefSeq protein NCBI baza podataka (e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije). BLASTX je također proveden na nesamostalnim kontigama s korištenjem baze podataka oznaka br i RefSeq NCBI (značenje e <1e-10 i gomologija 60%). BLASTX je također proveden na ne-sopstvenim kontigima korištenjem nr i RefSeq NCBI baza podataka proteina (e vrijednost < 1e-10 i 60% homologije).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX (e 值< 1e-10 咧 60% 咧 60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX (e 值< 1e-10 咧 60% 咧 60% BLASTX takodje radi na nesamostalnim kontigama sa upotrebom baze podataka beleke nr i RefSeq NCBI (znacenje e <1e-10 i gomologija 60%). BLASTX je također proveden na ne-sopstvenim kontigima korištenjem nr i RefSeq NCBI baza podataka proteina (e vrijednost <1e-10 i 60% homologije).BLASTN i BLASTX skupovi ne-samostalnih kontiga predstavljaju konačne kontige (vidi Dodatnu datoteku).
Prajmeri korišteni za PCR navedeni su u Tabeli S1. Taq DNA polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON) korištena je za amplifikaciju ciljnih gena ccfDNA. Korišteni su sljedeći reakcijski uvjeti: denaturacija na 95°C tokom 3 minute, 95°C tokom 1 minute, postavljena temperatura žarenja tokom 1 minute, elongacija na 72°C tokom 1 minute, 35 ciklusa i konačno 72°C unutar 10 minuta. PCR produkti su odvojeni elektroforezom u agaroznim gelovima (1,5%) koji sadrže SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) na 95 V.
Dagnje (Mytilus spp.) su aklimatizirane u 500 ml oksigenirane morske vode (32 PSU) tokom 24 sata na 4°C. Plazmidska DNK koja sadrži umetak koji kodira sekvencu cDNA ljudskog galektina-7 (NCBI pristupni broj L07769) dodana je u bočicu u konačnoj koncentraciji od 190 μg/μl. Dagnje inkubirane pod istim uvjetima bez dodavanja DNK služile su kao kontrola. Treći kontrolni spremnik sadržavao je DNK bez dagnji. Kako bi se pratio kvalitet DNK u morskoj vodi, uzorci morske vode (20 μl; tri ponavljanja) uzeti su iz svakog spremnika u naznačeno vrijeme. Radi sljedivosti plazmidne DNK, LB dagnje su ubrane u naznačeno vrijeme i analizirane qPCR-om i ddPCR-om. Zbog visokog sadržaja soli u morskoj vodi, alikvoti su razrijeđeni u vodi PCR kvalitete (1:10) prije svih PCR testova.
Digitalna PCR kapljica (ddPCR) provedena je korištenjem BioRad QX200 protokola (Mississauga, Ontario, Kanada). Koristite temperaturni profil za određivanje optimalne temperature (Tabela S1). Kapi su generirane korištenjem generatora kapljica QX200 (BioRad). ddPCR je proveden na sljedeći način: 95°C tokom 5 minuta, 50 ciklusa od 95°C tokom 30 sekundi i data temperatura zagrijavanja tokom 1 minute i 72°C tokom 30 sekundi, 4°C tokom 5 minuta i 90°C unutar 5 minuta. Broj kapljica i pozitivnih reakcija (broj kopija/µl) mjereni su korištenjem QX200 čitača kapljica (BioRad). Uzorci s manje od 10.000 kapljica su odbačeni. Kontrola uzorka nije provedena svaki put kada je ddPCR pokrenut.
qPCR je proveden korištenjem Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australija) i LGALS7 specifičnih primera. Svi kvantitativni PCR-ovi su provedeni u 20 µl korištenjem QuantiFast SYBR Green PCR Kit-a (QIAGEN). qPCR je započet sa 15 minuta inkubacije na 95°C, nakon čega je uslijedilo 40 ciklusa na 95°C tokom 10 sekundi i na 60°C tokom 60 sekundi sa jednim prikupljanjem podataka. Krive topljenja su generirane korištenjem uzastopnih mjerenja na 95°C tokom 5 sekundi, 65°C tokom 60 sekundi i 97°C na kraju qPCR-a. Svaki qPCR je proveden u tri primjerka, osim za kontrolne uzorke.
Budući da su dagnje poznate po svojoj visokoj brzini filtracije, prvo smo istražili da li mogu filtrirati i zadržati fragmente DNK prisutne u morskoj vodi. Također nas je zanimalo da li se ovi fragmenti akumuliraju u njihovom poluotvorenom limfnom sistemu. Ovaj problem smo eksperimentalno riješili praćenjem sudbine rastvorljivih fragmenata DNK dodanih u akvarijume s plavim dagnjama. Kako bismo olakšali praćenje fragmenata DNK, koristili smo stranu (ne vlastitu) plazmidnu DNK koja sadrži ljudski gen galektin-7. ddPCR prati fragmente plazmidne DNK u morskoj vodi i dagnjama. Naši rezultati pokazuju da ako je količina fragmenata DNK u morskoj vodi ostala relativno konstantna tokom vremena (do 7 dana) u odsustvu dagnji, onda je u prisustvu dagnji ovaj nivo gotovo potpuno nestao u roku od 8 sati (Slika 1a,b). Fragmenti egzogene DNK su lako detektovani u roku od 15 minuta u intravalvularnoj tečnosti i hemolimfi (Slika 1c). Ovi fragmenti su se i dalje mogli detektovati do 4 sata nakon izlaganja. Ova aktivnost filtriranja u odnosu na fragmente DNK je uporediva sa aktivnošću filtriranja bakterija i algi [31]. Ovi rezultati ukazuju na to da dagnje mogu filtrirati i akumulirati stranu DNK u svojim tečnim odjeljcima.
Relativne koncentracije plazmidne DNK u morskoj vodi u prisustvu (A) ili odsustvu (B) dagnji, mjerene ddPCR-om. U A, rezultati su izraženi u procentima, pri čemu granice okvira predstavljaju 75. i 25. percentil. Prilagođena logaritamska krivulja je prikazana crvenom bojom, a sivo obojena površina predstavlja 95% interval pouzdanosti. U B, crvena linija predstavlja srednju vrijednost, a plava linija predstavlja 95% interval pouzdanosti za koncentraciju. C Akumulacija plazmidne DNK u hemolimfi i valvularnoj tečnosti dagnji u različitim vremenima nakon dodavanja plazmidne DNK. Rezultati su prikazani kao apsolutni broj detektovanih kopija/mL (±SE).
Zatim smo istražili porijeklo ccfDNK u dagnjama prikupljenim iz ležišta dagnji na ostrvima Kerguelen, udaljenoj grupi ostrva sa ograničenim antropogenim uticajem. U tu svrhu, cccDNK iz hemolimfe dagnji je izolovana i pročišćena metodama koje se obično koriste za pročišćavanje ljudske cccDNK [32, 33]. Otkrili smo da su prosječne koncentracije ccfDNK hemolimfe u dagnjama u niskom rasponu mikrograma po ml hemolimfe (vidi Tabelu S2, Dodatne informacije). Ovaj raspon koncentracija je mnogo veći nego kod zdravih ljudi (niski nanogrami po mililitru), ali u rijetkim slučajevima, kod pacijenata oboljelih od raka, nivo ccfDNK može doseći nekoliko mikrograma po mililitru [34, 35]. Analiza raspodjele veličine ccfDNK hemolimfe pokazala je da se ovi fragmenti uveliko razlikuju po veličini, u rasponu od 1000 bp do 1000 bp, pa sve do 5000 bp (Slika 2). Slični rezultati su dobijeni korištenjem QIAamp Investigator Kit-a na bazi silicijevog dioksida, metode koja se često koristi u forenzičkoj nauci za brzu izolaciju i pročišćavanje genomske DNK iz uzoraka DNK niske koncentracije, uključujući ccfDNK [36].
Reprezentativni ccfDNK elektroforegram hemolimfe dagnji. Ekstrahovano pomoću NucleoSnap Plasma Kit-a (gore) i QIAamp DNA Investigator Kit-a. B Violin dijagram koji prikazuje distribuciju koncentracija ccfDNK hemolimfe (±SE) u dagnjama. Crne i crvene linije predstavljaju medijanu, odnosno prvi i treći kvartil.
Približno 1% ccfDNK kod ljudi i primata ima strani izvor [21, 37]. S obzirom na poluotvoreni cirkulatorni sistem školjki, morsku vodu bogatu mikrobima i distribuciju veličine ccfDNK dagnji, pretpostavili smo da ccfDNK hemolimfe školjki može sadržavati bogat i raznolik skup mikrobne DNK. Da bismo testirali ovu hipotezu, sekvencirali smo ccfDNK hemolimfe iz uzoraka Aulacomya atra prikupljenih sa ostrva Kerguelen, što je dalo preko 10 miliona očitavanja, od kojih je 97,6% prošlo kontrolu kvaliteta. Očitavanja su zatim klasifikovana prema sopstvenim i tuđim izvorima koristeći BLASTN i NCBI baze podataka o školjkama (Sl. S1, Dodatne informacije).
Kod ljudi, i nuklearna i mitohondrijska DNK mogu se osloboditi u krvotok [38]. Međutim, u ovoj studiji nije bilo moguće detaljno opisati nuklearnu genomsku DNK dagnji, s obzirom na to da genom A. atra nije sekvenciran niti opisan. Međutim, uspjeli smo identificirati brojne ccfDNA fragmente vlastitog porijekla koristeći biblioteku školjki (Sl. S2, Dodatne informacije). Također smo potvrdili prisustvo DNK fragmenata vlastitog porijekla usmjerenom PCR amplifikacijom onih gena A. atra koji su sekvencirani (Sl. 3). Slično tome, s obzirom na to da je mitohondrijski genom A. atra dostupan u javnim bazama podataka, mogu se pronaći dokazi o prisustvu mitohondrijskih ccfDNA fragmenata u hemolimfi A. atra. Prisustvo mitohondrijskih DNK fragmenata potvrđeno je PCR amplifikacijom (Sl. 3).
Različiti mitohondrijski geni bili su prisutni u hemolimfi A. atra (crvene tačke – broj zaliha: SRX5705969) i M. platensis (plave tačke – broj zaliha: SRX5705968) amplifikovanim PCR-om. Slika adaptirana od Breton et al., 2011 B Amplifikacija supernatanta hemolimfe iz A. atra Čuvano na FTA papiru. Koristite bušilicu od 3 mm za direktno dodavanje u PCR epruvetu koja sadrži PCR smjesu.
S obzirom na obilan sadržaj mikroba u morskoj vodi, u početku smo se fokusirali na karakterizaciju sekvenci mikrobne DNK u hemolimfi. Da bismo to uradili, koristili smo dvije različite strategije. Prva strategija je koristila Kraken2, program za klasifikaciju sekvenci zasnovan na algoritmu koji može identificirati mikrobne sekvence s tačnošću uporedivom s BLAST-om i drugim alatima [28]. Utvrđeno je da je više od 6719 očitavanja bakterijskog porijekla, dok je 124 i 64 bilo od arheja i virusa, respektivno (Slika 4). Najzastupljeniji fragmenti bakterijske DNK bili su Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) i Bacteroidetes (17%) (Slika 4a). Ova distribucija je u skladu s prethodnim studijama mikrobioma morske plave školjke [39, 40]. Gammaproteobakterije su bile glavna klasa Proteobacteria (44%), uključujući mnoge Vibrionale (Slika 4b). ddPCR metoda potvrdila je prisustvo fragmenata Vibrio DNK u ccfDNK hemolimfe A. atra (Slika 4c) [41]. Da bi se dobilo više informacija o bakterijskom porijeklu ccfDNK, korišten je dodatni pristup (Sl. S2, Dodatne informacije). U ovom slučaju, očitanja koja su se preklapala su sastavljena kao očitanja sparenih krajeva i klasifikovana su kao vlastitog (školjke) ili nesopstvenog porijekla korištenjem BLASTN-a i e vrijednosti od 1e−3 i granične vrijednosti sa >90% homologije. U ovom slučaju, očitanja koja su se preklapala su sastavljena kao očitanja sparenih krajeva i klasifikovana su kao vlastitog (školjke) ili nesopstvenog porijekla korištenjem BLASTN-a i e vrijednosti od 1e−3 i granične vrijednosti sa >90% homologije. U ovom slučaju, prekrivajuća čtenija bila je sabrana kao čtenija sa parnim koncima i klasifikovana kao sopstveni (dvostruki mollûski) ili strano poreklo sa korišćenjem BLASTN-a i vrednosti e 1e-3 i otsecanja sa gomologijom> 90%. U ovom slučaju, preklapajući očitanja su prikupljena kao očitanja sa sparenim krajevima i klasifikovana su kao nativna (školjke) ili neoriginalna korištenjem BLASTN-a i e vrijednosti od 1e-3 i granične vrijednosti sa >90% homologije.在这种情况下,重叠的读数组装为配对末端读数, 并使用BLASTN 和1e-3 的e 90%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使甌值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 U ovom slučaju prekrivajuća čtenija su sakupljena kao čtenija sa parnim koncima i klasificirana kao vlastita (dvostruka mollûski) ili neosobna po porijeklu s korištenjem značenja e BLASTN i 1e-3 i poroga gomologije> 90%. U ovom slučaju, preklapajući očitanja su prikupljena kao očitanja sa sparenim krajevima i klasifikovana kao vlastita (školjke) ili neoriginalna korištenjem e BLASTN i 1e-3 vrijednosti ​​i praga homologije >90%.Budući da genom A. atra još nije sekvenciran, koristili smo de novo strategiju sastavljanja MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) asemblera. Ukupno 147.188 kontiga identificirano je kao zavisno (školjke) porijeklo. Ovi kontigi su zatim razloženi s e-vrijednostima od 1e-10 korištenjem BLASTN-a i BLASTX-a. Ova strategija nam je omogućila da identificiramo 482 fragmenta koji nisu školjkaši prisutni u ccfDNK A. atra. Više od polovine (57%) ovih DNK fragmenata dobiveno je iz bakterija, uglavnom iz simbionta škrga, uključujući sulfotrofne simbionte, i iz simbionta škrga Solemya velum (Slika 5).
Relativna abundancija na nivou tipa. B Mikrobna raznolikost dva glavna koljena (Firmicutes i Proteobacteria). Reprezentativna amplifikacija ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmenti gena 16S rRNA (plavo) u tri atra hemolimfe.
Ukupno je analizirano 482 prikupljena kontiga. Opći profil taksonomske distribucije metagenomskih kontig anotacija (prokarioti i eukarioti). B Detaljna distribucija bakterijskih DNK fragmenata identificiranih pomoću BLASTN-a i BLASTX-a.
Analiza Kraken2 je također pokazala da ccfDNK dagnji sadrži fragmente arhealne DNK, uključujući fragmente DNK Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) i Thaurmarcheota (11%) (Sl. 6a). Prisustvo fragmenata DNK izvedenih iz Euryarchaeota i Crenarchaeota, koji su prethodno pronađeni u mikrobnoj zajednici kalifornijskih dagnji, ne bi trebalo biti iznenađenje [42]. Iako se Euryarchaeota često povezuje s ekstremnim uvjetima, sada je prepoznato da su i Euryarchaeota i Crenarcheota među najčešćim prokariotima u morskom kriogenom okruženju [43, 44]. Prisustvo metanogenih mikroorganizama u dagnjama nije iznenađujuće, s obzirom na nedavne izvještaje o opsežnom curenju metana s dna na visoravni Kerguelen [45] i mogućoj mikrobnoj proizvodnji metana uočenoj uz obalu ostrva Kerguelen [46].
Naša pažnja se zatim prebacila na očitavanja DNK virusa. Koliko nam je poznato, ovo je prva vanciljna studija sadržaja virusa u školjkama. Kao što se i očekivalo, pronašli smo fragmente DNK bakteriofaga (Caudovirales) (Slika 6b). Međutim, najčešća virusna DNK potiče iz koljena nukleocitovirusa, poznatih i kao nuklearni citoplazmatski veliki DNK virus (NCLDV), koji ima najveći genom od bilo kojeg virusa. Unutar ovog koljena, većina DNK sekvenci pripada porodicama Mimimidoviridae (58%) i Poxviridae (21%), čiji prirodni domaćini uključuju kičmenjake i člankonošce, dok mali dio ovih DNK sekvenci pripada poznatim virološkim algama. Inficira morske eukariotske alge. Sekvence su također dobivene iz Pandora virusa, gigantskog virusa s najvećom veličinom genoma od svih poznatih virusnih rodova. Zanimljivo je da je raspon domaćina za koje se zna da su zaraženi virusom, utvrđen sekvenciranjem ccfDNK hemolimfe, bio relativno velik (Slika S3, Dodatne informacije). Uključuje viruse koji inficiraju insekte poput Baculoviridae i Iridoviridae, kao i viruse koji inficiraju amebe, alge i kičmenjake. Također smo pronašli sekvence koje odgovaraju genomu Pithovirus sibericum. Pitovirusi (poznati i kao "zombi virusi") prvi put su izolirani iz 30.000 godina starog permafrosta u Sibiru [47]. Dakle, naši rezultati su u skladu s prethodnim izvještajima koji pokazuju da nisu sve moderne vrste ovih virusa izumrle [48] i da ovi virusi mogu biti prisutni u udaljenim subarktičkim morskim ekosistemima.
Konačno, testirali smo da li možemo pronaći fragmente DNK iz drugih višećelijskih životinja. Ukupno 482 strana kontiga identificirana su pomoću BLASTN-a i BLASTX-a s nt, nr i RefSeq bibliotekama (genomskim i proteinskim). Naši rezultati pokazuju da među stranim fragmentima ccfDNK višećelijskih životinja prevladava DNK koštanih kostiju (Sl. 5). Pronađeni su i fragmenti DNK insekata i drugih vrsta. Relativno veliki dio fragmenata DNK nije identificiran, moguće zbog nedovoljne zastupljenosti velikog broja morskih vrsta u genomskim bazama podataka u poređenju s kopnenim vrstama [49].
U ovom radu primjenjujemo koncept LB na dagnje, tvrdeći da sekvenciranje ccfDNK hemolimfe može pružiti uvid u sastav morskih obalnih ekosistema. Konkretno, otkrili smo da 1) hemolimfa dagnji sadrži relativno visoke koncentracije (mikrogramske nivoe) relativno velikih (~1-5 kb) cirkulirajućih fragmenata DNK; 2) ovi fragmenti DNK su i nezavisni i ne-nezavisni 3) Među stranim izvorima ovih fragmenata DNK pronašli smo bakterijsku, arhealnu i virusnu DNK, kao i DNK drugih višećelijskih životinja; 4) Akumulacija ovih stranih fragmenata ccfDNK u hemolimfi odvija se brzo i doprinosi unutrašnjoj aktivnosti filtriranja dagnji. Zaključno, naša studija pokazuje da koncept LB, koji se do sada uglavnom primjenjivao u oblasti biomedicine, kodira bogat, ali neistražen izvor znanja koji se može koristiti za bolje razumijevanje interakcije između sentinel vrsta i njihovog okruženja.
Pored primata, izolacija ccfDNK je zabilježena i kod sisara, uključujući miševe, pse, mačke i konje [50, 51, 52]. Međutim, koliko znamo, naša studija je prva koja izvještava o detekciji i sekvenciranju ccfDNK kod morskih vrsta sa otvorenim sistemom cirkulacije. Ova anatomska karakteristika i sposobnost filtriranja dagnji mogu, barem djelimično, objasniti različite karakteristike veličine cirkulirajućih DNK fragmenata u poređenju sa drugim vrstama. Kod ljudi, većina DNK fragmenata koji cirkulišu u krvi su mali fragmenti veličine od 150 do 200 bp sa maksimalnim vrhom od 167 bp [34, 53]. Mali, ali značajan dio DNK fragmenata je veličine između 300 i 500 bp, a oko 5% je duže od 900 bp. [54]. Razlog za ovu distribuciju veličine je taj što se glavni izvor ccfDNK u plazmi javlja kao rezultat ćelijske smrti, bilo zbog ćelijske smrti ili zbog nekroze cirkulirajućih hematopoetskih ćelija kod zdravih osoba ili zbog apoptoze tumorskih ćelija kod pacijenata oboljelih od raka (poznato kao cirkulirajuća tumorska DNK). , ctDNK). Distribucija veličine ccfDNK hemolimfe koju smo pronašli u dagnjama kretala se od 1000 do 5000 bp, što sugerira da ccfDNK dagnji ima drugačije porijeklo. Ovo je logična hipoteza, budući da dagnje imaju poluotvoreni vaskularni sistem i žive u morskim vodenim okruženjima koja sadrže visoke koncentracije mikrobne genomske DNK. U stvari, naši laboratorijski eksperimenti koji koriste egzogenu DNK pokazali su da dagnje akumuliraju fragmente DNK u morskoj vodi, barem nakon nekoliko sati kada se oni degradiraju nakon ćelijskog unosa i/ili oslobađaju i/ili skladište u različitim organizacijama. S obzirom na rijetkost ćelija (i prokariotskih i eukariotskih), upotreba intravalvularnih odjeljaka smanjit će količinu ccfDNK iz vlastitih izvora, kao i iz stranih izvora. Uzimajući u obzir važnost urođenog imuniteta školjki i veliki broj fagocita u cirkulaciji, dalje smo postavili hipotezu da je čak i strana ccfDNK obogaćena cirkulirajućim fagocitima koji akumuliraju stranu DNK nakon ingestije mikroorganizama i/ili ćelijskih ostataka. Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da je ccfDNK hemolimfe školjki jedinstveno spremište molekularnih informacija i jača njihov status sentinel vrste.
Naši podaci ukazuju na to da sekvenciranje i analiza fragmenata ccfDNK hemolimfe izvedenih iz bakterija može pružiti ključne informacije o bakterijskoj flori domaćina i bakterijama prisutnim u okolnom morskom ekosistemu. Tehnike sekvenciranja shot-om otkrile su sekvence komenzalne bakterije A. atra škrge koje bi bile propuštene da su korištene konvencionalne metode identifikacije 16S rRNA, dijelom zbog pristranosti referentne biblioteke. U stvari, naša upotreba LB podataka prikupljenih od M. platensis u istom sloju dagnji u Kerguelenu pokazala je da je sastav bakterijskih simbionta povezanih sa škrgama bio isti za obje vrste dagnji (Sl. S4, Dodatne informacije). Ova sličnost dvije genetski različite dagnje može odražavati sastav bakterijskih zajednica u hladnim, sumpornim i vulkanskim naslagama Kerguelena [55, 56, 57, 58]. Viši nivoi mikroorganizama koji smanjuju sumpor dobro su opisani prilikom sakupljanja dagnji iz bioturbiranih obalnih područja [59], kao što je obala Port-au-Francea. Druga mogućnost je da je flora komenzalnih školjki pogođena horizontalnim prijenosom [60, 61]. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se utvrdila korelacija između morskog okoliša, površine morskog dna i sastava simbiotskih bakterija u školjkama. Ova istraživanja su trenutno u toku.
Dužina i koncentracija ccfDNK hemolimfe, jednostavnost prečišćavanja i visok kvalitet koji omogućava brzo sekvenciranje metodom "sagma" su neke od mnogih prednosti korištenja ccfDNK dagnji za procjenu biodiverziteta u morskim obalnim ekosistemima. Ovaj pristup je posebno efikasan za karakterizaciju virusnih zajednica (viroma) u datom ekosistemu [62, 63]. Za razliku od bakterija, arheja i eukariota, virusni genomi ne sadrže filogenetski konzervirane gene kao što su 16S sekvence. Naši rezultati pokazuju da se tečni biopsije iz indikatorskih vrsta kao što su dagnje mogu koristiti za identifikaciju relativno velikog broja fragmenata virusa ccfDNK za koje se zna da inficiraju domaćine koji obično nastanjuju obalne morske ekosisteme. To uključuje viruse za koje se zna da inficiraju protozoe, člankonošce, insekte, biljke i bakterijske viruse (npr. bakteriofage). Slična distribucija je pronađena kada smo ispitivali virom ccfDNK hemolimfe plavih dagnji (M. platensis) prikupljenih u istom sloju dagnji u Kerguelenu (Tabela S2, Dodatne informacije). Sekvenciranje ccfDNK metodom sačmarice je zaista novi pristup koji dobija na zamahu u proučavanju viroma ljudi ili drugih vrsta [21, 37, 64]. Ovaj pristup je posebno koristan za proučavanje dvolančanih DNK virusa, budući da nijedan gen nije konzerviran među svim dvolančanim DNK virusima, što predstavlja najraznolikiju i najširu klasu virusa u Baltimoreu [65]. Iako većina ovih virusa ostaje neklasificirana i može uključivati ​​viruse iz potpuno nepoznatog dijela virusnog svijeta [66], otkrili smo da se viromi i rasponi domaćina dagnji A. atra i M. platensis slično nalaze između ove dvije vrste (vidi sliku S3, dodatne informacije). Ova sličnost nije iznenađujuća, jer može odražavati nedostatak selektivnosti u unosu DNK prisutne u okruženju. Trenutno su potrebne buduće studije korištenjem pročišćene RNK kako bi se karakterizirao RNK virom.
U našoj studiji koristili smo vrlo rigorozan cjevovod prilagođen iz rada Kowarskog i kolega [37], koji su koristili dvostepeno brisanje združenih očitavanja i kontiga prije i nakon sastavljanja nativne ccfDNK, što je rezultiralo visokim udjelom nemapiranih očitavanja. Stoga ne možemo isključiti da neka od ovih nemapiranih očitavanja možda ipak imaju vlastito porijeklo, prvenstveno zato što nemamo referentni genom za ovu vrstu dagnji. Također smo koristili ovaj cjevovod jer smo bili zabrinuti zbog himera između vlastitih i nesopstvenih očitavanja i dužina očitavanja koje generira Illumina MiSeq PE75. Drugi razlog za većinu neistraženih očitavanja je taj što veliki dio morskih mikroba, posebno u udaljenim područjima kao što je Kerguelen, nije označen. Koristili smo Illumina MiSeq PE75, pretpostavljajući da su dužine fragmenata ccfDNK slične ljudskoj ccfDNK. Za buduće studije, s obzirom na naše rezultate koji pokazuju da ccfDNK hemolimfe ima duža očitavanja od ljudi i/ili sisara, preporučujemo korištenje platforme za sekvenciranje koja je pogodnija za duže fragmente ccfDNK. Ova praksa će znatno olakšati identifikaciju više indikacija za dublju analizu. Dobijanje trenutno nedostupne kompletne sekvence nuklearnog genoma A. atra također bi uveliko olakšalo razlikovanje ccfDNK od vlastitih i tuđih izvora. S obzirom na to da se naše istraživanje fokusiralo na mogućnost primjene koncepta tečne biopsije na dagnje, nadamo se da će se, kako se ovaj koncept bude koristio u budućim istraživanjima, razviti novi alati i cjevovodi kako bi se povećao potencijal ove metode za proučavanje mikrobne raznolikosti dagnji. morski ekosistem.
Kao neinvazivni klinički biomarker, povišeni nivoi ccfDNK u ljudskoj plazmi povezani su s raznim bolestima, oštećenjem tkiva i stresnim stanjima [67,68,69]. Ovo povećanje povezano je s oslobađanjem fragmenata DNK vlastitog porijekla nakon oštećenja tkiva. Ovaj problem smo riješili korištenjem akutnog toplotnog stresa, u kojem su dagnje nakratko bile izložene temperaturi od 30 °C. Ovu analizu smo proveli na tri različite vrste dagnji u tri nezavisna eksperimenta. Međutim, nismo pronašli nikakvu promjenu u nivoima ccfDNK nakon akutnog toplotnog stresa (vidi Sliku S5, dodatne informacije). Ovo otkriće može objasniti, barem djelimično, činjenicu da dagnje imaju poluotvoreni cirkulatorni sistem i akumuliraju velike količine strane DNK zbog svoje visoke aktivnosti filtriranja. S druge strane, dagnje, kao i mnogi beskičmenjaci, mogu biti otpornije na oštećenje tkiva izazvano stresom, čime se ograničava oslobađanje ccfDNK u njihovoj hemolimfi [70, 71].
Do danas se DNK analiza biodiverziteta u vodenim ekosistemima uglavnom fokusirala na metabarkodiranje okolišne DNK (eDNK). Međutim, ova metoda je obično ograničena u analizi biodiverziteta kada se koriste prajmeri. Upotreba "shotgun" sekvenciranja zaobilazi ograničenja PCR-a i pristrasan odabir setova prajmera. Dakle, u određenom smislu, naša metoda je bliža nedavno korištenoj metodi visokopropusnog eDNK "shotgun", koja je u stanju direktno sekvencirati fragmentiranu DNK i analizirati gotovo sve organizme [72, 73]. Međutim, postoji niz fundamentalnih problema koji razlikuju LB od standardnih eDNK metoda. Naravno, glavna razlika između eDNK i LB je korištenje prirodnih filtera domaćina. Prijavljena je upotreba morskih vrsta kao što su spužve i školjke (Dresseina spp.) kao prirodnog filtera za proučavanje eDNK [74, 75]. Međutim, Dreissenina studija koristila je biopsije tkiva iz kojih je DNK ekstrahirana. Analiza ccfDNK iz LB ne zahtijeva biopsiju tkiva, specijaliziranu i ponekad skupu opremu i logistiku povezanu s eDNK ili biopsijom tkiva. U stvari, nedavno smo izvijestili da se ccfDNK iz LB može pohraniti i analizirati uz FTA podršku bez održavanja hladnog lanca, što je veliki izazov za istraživanja u udaljenim područjima [76]. Ekstrakcija ccfDNK iz tečnih biopsija je također jednostavna i pruža visokokvalitetnu DNK za sekvenciranje "sagma" i PCR analizu. Ovo je velika prednost s obzirom na neka tehnička ograničenja povezana s eDNK analizom [77]. Jednostavnost i niska cijena metode uzorkovanja su također posebno pogodne za dugoročne programe praćenja. Pored njihove visoke sposobnosti filtriranja, još jedna dobro poznata karakteristika školjki je hemijski mukopolisaharidni sastav njihove sluzi, koji potiče apsorpciju virusa [78, 79]. Ovo čini školjke idealnim prirodnim filterom za karakterizaciju biodiverziteta i utjecaja klimatskih promjena u datom vodenom ekosistemu. Iako se prisustvo fragmenata DNK izvedenih iz domaćina može smatrati ograničenjem metode u poređenju s eDNK, troškovi povezani s posjedovanjem takve nativne ccfDNK u poređenju s eDNK su istovremeno razumljivi zbog ogromne količine informacija dostupnih za zdravstvene studije. offset domaćin. Ovo uključuje prisustvo virusnih sekvenci integriranih u genom domaćina. Ovo je posebno važno za dagnje, s obzirom na prisustvo horizontalno prenesenih leukemijskih retrovirusa u školjkama [80, 81]. Još jedna prednost LB u odnosu na eDNK je ta što iskorištava fagocitnu aktivnost cirkulirajućih krvnih ćelija u hemolimfi, koje gutaju mikroorganizme (i njihove genome). Fagocitoza je glavna funkcija krvnih ćelija u školjkama [82]. Konačno, metoda koristi visoki kapacitet filtriranja dagnji (prosječno 1,5 l/h morske vode) i dvodnevnu cirkulaciju, što povećava miješanje različitih slojeva morske vode, omogućavajući hvatanje heterologne eDNK. [83, 84]. Dakle, analiza ccfDNK dagnji je zanimljiv put s obzirom na nutritivni, ekonomski i ekološki utjecaj dagnji. Slično analizi LB prikupljene od ljudi, ova metoda također otvara mogućnost mjerenja genetskih i epigenetičkih promjena u DNK domaćina kao odgovor na egzogene supstance. Na primjer, tehnologije sekvenciranja treće generacije mogu se predvidjeti za izvođenje analize metilacije cijelog genoma u nativnoj ccfDNK korištenjem sekvenciranja nanopora. Ovaj proces trebao bi biti olakšan činjenicom da je dužina fragmenata ccfDNK dagnji idealno kompatibilna s platformama za sekvenciranje dugog čitanja koje omogućavaju analizu metilacije DNK cijelog genoma iz jednog sekvenciranja bez potrebe za hemijskim transformacijama.85,86] Ovo je zanimljiva mogućnost, jer je pokazano da obrasci metilacije DNK odražavaju odgovor na stres u okolišu i traju tokom mnogih generacija. Stoga može pružiti vrijedan uvid u osnovne mehanizme koji upravljaju odgovorom nakon izlaganja klimatskim promjenama ili zagađivačima [87]. Međutim, upotreba LB nije bez ograničenja. Nepotrebno je reći da ovo zahtijeva prisustvo indikatorskih vrsta u ekosistemu. Kao što je gore spomenuto, korištenje LB za procjenu biodiverziteta datog ekosistema također zahtijeva rigorozan bioinformatički cjevovod koji uzima u obzir prisustvo fragmenata DNK iz izvora. Drugi veliki problem je dostupnost referentnih genoma za morske vrste. Nadamo se da će inicijative poput Projekta genoma morskih sisavaca i nedavno uspostavljenog projekta Fish10k [88] olakšati takvu analizu u budućnosti. Primjena LB koncepta na organizme koji se hrane filtriranjem vode također je kompatibilna s najnovijim dostignućima u tehnologiji sekvenciranja, što ga čini vrlo pogodnim za razvoj višeohmskih biomarkera koji pružaju važne informacije o zdravlju morskih staništa kao odgovor na stres iz okoliša.
Podaci o sekvenciranju genoma pohranjeni su u NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pod Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Utjecaj klimatskih promjena na morski svijet i ekosisteme. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Alppanidou V, Bevilacqua S, et al. Razmotrite kombinovane uticaje klimatskih promjena i drugih lokalnih stresora na morski okoliš. Opšta naučna sredina. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al. ). Nauka prvog marta. 2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Smanjena tolerancija na toplotu pod ponovljenim uslovima toplotnog stresa objašnjava visoku ljetnu smrtnost plavih dagnji. Naučni izvještaj 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al. Nedavne promjene u učestalosti, uzrocima i obimu uginuća životinja. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Višestruki nespecifični patogeni mogli su uzrokovati masovnu smrtnost Pinna nobilis. Život. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potencijalni utjecaj klimatskih promjena na arktičke zoonoze. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. i dr. Plave dagnje (Mytilus edulis spp.) kao signalni organizmi u praćenju zagađenja obale: pregled. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integracija tečne biopsije u liječenju raka. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al. Sazrijevanje tečne biopsije: Omogućava cirkulaciju tumorske DNK. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinske kiseline u ljudskoj plazmi. Zapisnici sa sastanaka podružnica Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nova uloga slobodne DNK kao molekularnog markera za liječenje raka. Kvantifikacija biomolarne analize. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Tečna biopsija ulazi u kliniku – problemi implementacije i budući izazovi. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW i drugi. Fetalna DNK je prisutna u majčinoj plazmi i serumu. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studija toka trudnoće i njenih komplikacija korištenjem cirkulirajuće ekstracelularne RNK u krvi žena tokom trudnoće. Dopediatrija. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al. Tečna biopsija: DNK bez ćelija donora se koristi za otkrivanje alogenih lezija u transplantatu bubrega. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovacije u prenatalnoj dijagnostici: sekvenciranje genoma majčine plazme. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Brza detekcija patogena metagenomskim sekvenciranjem zaraženih tjelesnih tekućina sljedeće generacije. Nat Medicine. 2021;27:115-24.