Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Tečna biopsija (LB) je koncept koji brzo dobija na popularnosti u biomedicinskom polju.Koncept se uglavnom zasniva na detekciji fragmenata cirkulirajuće ekstracelularne DNK (ccfDNA), koji se uglavnom oslobađaju kao mali fragmenti nakon smrti ćelije u različitim tkivima.Mali dio ovih fragmenata potječe iz stranih (stranih) tkiva ili organizama.U trenutnom radu, ovaj koncept smo primijenili na dagnje, vrstu stražara poznatu po velikom kapacitetu filtracije morske vode.Koristimo sposobnost dagnji da djeluju kao prirodni filteri za hvatanje fragmenata DNK okoliša iz različitih izvora kako bismo pružili informacije o biodiverzitetu morskih obalnih ekosistema.Naši rezultati pokazuju da hemolimfa dagnje sadrži fragmente DNK koji se jako razlikuju po veličini, od 1 do 5 kb.Sekvenciranje sačmarica pokazalo je da je veliki broj fragmenata DNK stranog mikrobnog porijekla.Među njima smo pronašli fragmente DNK bakterija, arheja i virusa, uključujući viruse za koje je poznato da inficiraju različite domaćine koji se obično nalaze u obalnim morskim ekosistemima.Zaključno, naša studija pokazuje da koncept LB primijenjen na dagnje predstavlja bogat, ali još neistražen izvor znanja o mikrobnoj raznolikosti u morskim obalnim ekosistemima.
Utjecaj klimatskih promjena (CC) na biodiverzitet morskih ekosistema je područje istraživanja koje se brzo razvija.Globalno zagrijavanje ne samo da uzrokuje važne fiziološke stresove, već i pomjera evolucijske granice termičke stabilnosti morskih organizama, utječući na stanište brojnih vrsta, podstičući ih na potragu za povoljnijim uvjetima [1, 2].Osim što utiče na biodiverzitet metazoa, CC narušava delikatnu ravnotežu interakcija domaćin-mikrob.Ova mikrobna disbakterioza predstavlja ozbiljnu prijetnju morskim ekosistemima jer čini morske organizme osjetljivijima na infektivne patogene [3, 4].Vjeruje se da SS igra važnu ulogu u masovnim smrtnim slučajevima, što je ozbiljan problem za upravljanje globalnim morskim ekosistemima [5, 6].Ovo je važno pitanje s obzirom na ekonomske, ekološke i nutritivne utjecaje mnogih morskih vrsta.Ovo posebno važi za školjke koje žive u polarnim regionima, gde su efekti CK neposredniji i ozbiljniji [6, 7].Zapravo, školjke kao što je Mytilus spp.se široko koriste za praćenje efekata CC na morske ekosisteme.Nije iznenađujuće da je relativno veliki broj biomarkera razvijen za praćenje njihovog zdravlja, često koristeći dvoslojni pristup koji uključuje funkcionalne biomarkere zasnovane na enzimskoj aktivnosti ili ćelijskim funkcijama kao što su vitalnost ćelije i fagocitna aktivnost [8].Ove metode uključuju i mjerenje koncentracije specifičnih indikatora pritiska koji se akumuliraju u mekim tkivima nakon apsorpcije velikih količina morske vode.Međutim, visok kapacitet filtracije i poluotvoreni cirkulatorni sistem školjkaša pružaju priliku za razvoj novih hemolimfnih biomarkera koristeći koncept tečne biopsije (LB), jednostavnog i minimalno invazivnog pristupa liječenju pacijenata.uzorci krvi [9, 10].Iako se u ljudskom LB može naći nekoliko tipova cirkulirajućih molekula, ovaj koncept se prvenstveno temelji na analizi sekvencioniranja DNK fragmenata cirkulirajuće ekstracelularne DNK (ccfDNA) u plazmi.U stvari, prisutnost cirkulirajuće DNK u ljudskoj plazmi poznata je od sredine 20. stoljeća [11], ali je tek posljednjih godina pojava visokopropusnih metoda sekvenciranja dovela do kliničke dijagnoze zasnovane na ccfDNA.Prisustvo ovih fragmenata DNK u cirkulaciji je dijelom posljedica pasivnog oslobađanja genomske DNK (nuklearne i mitohondrijalne) nakon smrti stanice. Kod zdravih osoba, koncentracija ccfDNA je normalno niska (<10 ng/mL), ali se može povećati za 5-10 puta kod pacijenata koji pate od različitih patologija ili su podvrgnuti stresu, što rezultira oštećenjem tkiva. Kod zdravih osoba, koncentracija ccfDNA je normalno niska (<10 ng/mL), ali se može povećati za 5-10 puta kod pacijenata koji pate od različitih patologija ili su podvrgnuti stresu, što rezultira oštećenjem tkiva. Koncentracija vkkDNK kod zdravih ljudi je u normalnoj niskoj količini (<10 ng/ml), ali može biti povećana u 5-10 puta u bolnoj različitoj patologiji ili podložnim stresu, koji dovodi do oštećenja tkiva. Kod zdravih ljudi koncentracija cccDNA je normalno niska (<10 ng/mL), ali se može povećati za 5-10 puta kod pacijenata s različitim patologijama ili pod stresom koji dovodi do oštećenja tkiva.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低 (<10 ng/mL)加5-10 倍,从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （ (<10 ng/ml) 但 在 各 种 病理 戗 病理 戗可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Koncentracije ccfDNA obično su niske (<10 ng/ml) kod zdravih ljudi, ali mogu biti povećane u 5-10 puta kod pacijenata sa različitim patologijama ili stresom, što dovodi do oštećenja tkiva. Koncentracije ccfDNA su obično niske (<10 ng/ml) kod zdravih osoba, ali mogu biti povećane 5-10 puta kod pacijenata s različitim patologijama ili stresom, što rezultira oštećenjem tkiva.Veličina fragmenata ccfDNA uvelike varira, ali se obično kreće od 150 do 200 bp.[12].Analiza samoproizvedene ccfDNA, tj. ccfDNA iz normalnih ili transformiranih ćelija domaćina, može se koristiti za otkrivanje genetskih i epigenetskih promjena prisutnih u nuklearnom i/ili mitohondrijskom genomu, čime se pomaže kliničarima da odaberu specifične molekularno ciljane terapije [13].Međutim, ccfDNK se može dobiti iz stranih izvora kao što je ccfDNA iz fetalnih ćelija tokom trudnoće ili iz transplantiranih organa [14,15,16,17].ccfDNA je također važan izvor informacija za otkrivanje prisustva nukleinskih kiselina infektivnog agensa (stranog), što omogućava neinvazivnu detekciju široko rasprostranjenih infekcija koje nisu identificirane hemokulturom, izbjegavajući invazivnu biopsiju inficiranog tkiva [18].Nedavne studije su zaista pokazale da ljudska krv sadrži bogat izvor informacija koji se mogu koristiti za identifikaciju virusnih i bakterijskih patogena, te da je oko 1% ccfDNA pronađene u ljudskoj plazmi stranog porijekla [19].Ove studije pokazuju da se biodiverzitet cirkulirajućeg mikrobioma organizma može procijeniti korištenjem ccfDNA analize.Međutim, donedavno se ovaj koncept koristio isključivo kod ljudi i, u manjoj mjeri, kod drugih kralježnjaka [20, 21].
U ovom radu koristimo LB potencijal za analizu ccfDNK Aulacomya atra, južne vrste koja se obično nalazi na subantarktičkim otocima Kerguelen, grupi otoka na vrhu velike visoravni koja je nastala prije 35 miliona godina.vulkanska erupcija.Koristeći in vitro eksperimentalni sistem, otkrili smo da dagnje brzo preuzimaju fragmente DNK u morskoj vodi i ulaze u odjeljak hemolimfe.Sekvenciranje sačmarica pokazalo je da ccfDNA hemolimfe dagnje sadrži fragmente DNK vlastitog i ne-samog porijekla, uključujući simbiotske bakterije i fragmente DNK iz bioma tipične za hladne vulkanske morske obalne ekosisteme.ccfDNA hemolimfe također sadrži virusne sekvence izvedene iz virusa s različitim rasponima domaćina.Pronašli smo i fragmente DNK višećelijskih životinja kao što su koštane ribe, morske anemone, alge i insekti.U zaključku, naša studija pokazuje da se LB koncept može uspješno primijeniti na morske beskičmenjake kako bi se stvorio bogat genomski repertoar u morskim ekosistemima.
Odrasle jedinke (55-70 mm dužine) Mytilus platensis (M. platensis) i Aulacomya atra (A. atra) sakupljene su sa međuplimnih kamenih obala Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Ostrva Kerguelen u decembru 2018. Ostale odrasle plave dagnje (Mytilus spp.) nabavljene su od komercijalnog dobavljača (PEI Mussel King Inc., Ostrvo princa Edvarda, Kanada) i stavljene u rezervoar sa ventilacijom sa kontrolisanom temperaturom (4°C) koji sadrži 10-20 L 32‰ veštačke slane vode.(vještačka morska sol Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, SAD).Za svaki eksperiment mjerene su dužina i težina pojedinačnih školjki.
Besplatni protokol otvorenog pristupa za ovaj program dostupan je na mreži (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Ukratko, LB hemolimfa je sakupljena iz mišića abduktora kao što je opisano [22].Hemolimfa je bistrena centrifugiranjem na 1200×g tokom 3 minuta, supernatant je zamrznut (-20°C) do upotrebe.Za izolaciju i pročišćavanje cfDNA, uzorci (1,5-2,0 ml) su odmrznuti i obrađeni pomoću NucleoSnap cfDNA kita (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) prema uputama proizvođača.ccfDNA je pohranjena na -80°C do daljnje analize.U nekim eksperimentima, ccfDNA je izolirana i pročišćena korištenjem QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Pročišćena DNK je kvantificirana korištenjem standardnog PicoGreen testa.Distribucija fragmenata izolovane ccfDNA analizirana je kapilarnom elektroforezom koristeći Agilent 2100 bioanalizator (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, Kalifornija) korištenjem kompleta DNK visoke osjetljivosti.Test je izveden upotrebom 1 µl uzorka ccfDNA prema uputama proizvođača.
Za sekvenciranje fragmenata ccfDNA hemolimfe, Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) pripremio je biblioteke sačmarica koristeći Illumina DNA Mix kit iz Illumina MiSeq PE75 kita.Korišten je standardni adapter (BioO).Datoteke sirovih podataka dostupne su u NCBI arhivi čitanja sekvenci (SRR8924808 i SRR8924809).Osnovni kvalitet čitanja procijenjen je pomoću FastQC [23].Trimmomatic [24] se koristio za kliping adaptere i loše kvalitete očitavanja.Očitavanja sačmarica sa uparenim krajevima su spojena FLASH u duža pojedinačna očitavanja sa minimalnim preklapanjem od 20 bp kako bi se izbjegla neusklađenost [25]. Spojena čitanja su označena sa BLASTN pomoću baze podataka taksonomije dvoljušne NCBI (e vrijednost < 1e−3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti izvedeno je korištenjem DUST-a [26]. Spojena čitanja su označena sa BLASTN pomoću baze podataka taksonomije dvoljušne NCBI (e vrijednost < 1e−3 i 90% homologije), a maskiranje sekvenci niske složenosti izvedeno je korištenjem DUST-a [26]. Objedinjene poruke bile su objavljene uz pomoć BLASTN-a sa korištenjem baze podataka taksonomija dvoslojnih mollûskova NCBI (značenje e < 1e-3 i 90% gomologije), maskiranje posljedičnog niza složenosti koje je izvedeno korištenjem DUST-a [26]. Objedinjena očitanja su označena sa BLASTN koristeći NCBI bazu podataka taksonomije školjkaša (e vrijednost < 1e-3 i 90% homologije), a maskiranje sekvence niske složenosti izvedeno je korištenjem DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库 (e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读数]使用双和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的合并的读数 6D低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 缻茰 Ｖ 6 st.复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Objedinjene čtenije bile su objavljene uz pomoć BLASTN-a sa korištenjem taksonomske baze podataka dvoslojnih mollûskova NCBI (značenje e <1e-3 i 90% gomologije), maskiranje posljedičnih stečevina niske složenosti koje je izvedeno korištenjem DUST-a [26]. Skupljena očitanja su označena sa BLASTN koristeći NCBI taksonomsku bazu podataka o školjkama (e vrijednost <1e-3 i 90% homologije), a maskiranje sekvence niske složenosti je izvedeno korištenjem DUST-a [26].Čitanja su podijeljena u dvije grupe: povezana sa sekvencama školjkaša (ovdje se nazivaju samočitanja) i nepovezana (ne-samočitanja).Dvije grupe su odvojeno sastavljene korištenjem MEGAHIT-a za generiranje kontiga [27].U međuvremenu, taksonomska distribucija čitanja vanzemaljskog mikrobioma je klasifikovana pomoću Kraken2 [28] i grafički predstavljena Krona tortnim grafikonom na Galaksiji [29, 30].Optimalni kmeri su utvrđeni kao kmers-59 iz naših preliminarnih eksperimenata. Samokontigi su zatim identifikovani poravnavanjem sa BLASTN-om (bivalve NCBI baza podataka, e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije) za konačnu anotaciju. Samokontigi su zatim identifikovani poravnavanjem sa BLASTN-om (bivalve NCBI baza podataka, e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije) za konačnu anotaciju. Zatim se sopstveni kontigi identifikuju putem postavljanja sa BLASTN-a (baza danih dvosložnih mollûskov NCBI, vrednost e <1e-10 i gomologija 60%) za krajnje napomene. Samokontigi su zatim identificirani upoređivanjem sa BLASTN-om (NCBI baza podataka o školjkama, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije) za konačnu anotaciju.然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库, e 值< 1e-10 和60% 同源性)最终注释。然后通过与BLASTN (双壳贝类NCBI 数据库, e 值< 1e-10 和60% Zatim su identifikovani sopstveni kontigi za okončanje anotacija putem postavljanja sa BLASTN-a (baza danih NCBI za dvosmerne moljskove, vrednost e <1e-10 i gomologija 60%). Samokontigovi su zatim identificirani za konačnu anotaciju upoređivanjem sa BLASTN (NCBI baza podataka o školjkama, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije). Paralelno, kontigi grupe koji nisu samostalni su označeni sa BLASTN (nt NCBI baza podataka, e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije). Paralelno, kontigi grupe koji nisu samostalni su označeni sa BLASTN (nt NCBI baza podataka, e vrijednost < 1e−10 i 60% homologije). Paralelni tuđi grupni kontigi bili su anotirani pomoću BLASTN-a (baza danih nt NCBI, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%). Paralelno, kontigi stranih grupa su označeni sa BLASTN (NT NCBI baza podataka, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije).平行地,用BLASTN (nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身绾重叠平行地,用BLASTN (nt NCBI 数据库,e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身绾重叠 Paralelni kontigi, koji se ne odnose na vlastitu grupu, bili su objavljeni uz pomoć BLASTN-a (baza podataka nt NCBI, vrijednost e <1e-10 i gomologija 60%). Paralelno, kontigi grupe koji nisu samostalni su označeni sa BLASTN (nt NCBI baza podataka, e vrijednost <1e-10 i 60% homologije). BLASTX je takođe sproveden na nesamostalnim kontigama koristeći nr i RefSeq proteinske NCBI baze podataka (e vrijednost < 1e-10 i 60% homologije). BLASTX je takođe sproveden na nesamostalnim kontigama koristeći nr i RefSeq proteinske NCBI baze podataka (e vrijednost < 1e-10 i 60% homologije). BLASTX je također proveden na nesamostalnim kontigama s korištenjem baze podataka oznaka br i RefSeq NCBI (značenje e <1e-10 i gomologija 60%). BLASTX je takođe izveden na nesamostalnim kontigama koristeći nr i RefSeq NCBI proteinske baze podataka (e vrijednost < 1e-10 i 60% homologije).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX (e 值< 1e-10 咧 60% 咧 60%还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX (e 值< 1e-10 咧 60% 咧 60% BLASTX takodje radi na nesamostalnim kontigama sa upotrebom baze podataka beleke nr i RefSeq NCBI (znacenje e <1e-10 i gomologija 60%). BLASTX je takođe izveden na nesamostalnim kontigama koristeći nr i RefSeq NCBI proteinske baze podataka (e vrijednost <1e-10 i 60% homologije).BLASTN i BLASTX skupovi ne-samokontiga predstavljaju konačne kontige (pogledajte Dodatni fajl).
Prajmeri koji se koriste za PCR su navedeni u tabeli S1.Taq DNK polimeraza (Bio Basic Canada, Markham, ON) je korištena za amplifikaciju ciljnih gena ccfDNA.Korišteni su sljedeći uvjeti reakcije: denaturacija na 95°C 3 minute, 95°C 1 minut, podešena temperatura žarenja 1 minut, elongacija na 72°C 1 minut, 35 ciklusa i konačno 72°C u roku od 10 minuta..PCR proizvodi su razdvojeni elektroforezom u agaroznim gelovima (1,5%) koji sadrže SYBRTM bezbednu DNK gel boju (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) na 95 V.
Dagnje (Mytilus spp.) su aklimatizovane u 500 ml oksigenisane morske vode (32 PSU) tokom 24 sata na 4°C.Plazmidna DNK koja sadrži insert koji kodira sekvencu cDNK humanog galektina-7 (NCBI pristupni broj L07769) dodana je u bočicu u konačnoj koncentraciji od 190 μg/μl.Kontrola su bile dagnje inkubirane u istim uslovima bez dodavanja DNK.Treći kontrolni rezervoar sadržavao je DNK bez dagnji.Za praćenje kvaliteta DNK u morskoj vodi, uzorci morske vode (20 μl; tri ponavljanja) uzeti su iz svakog rezervoara u naznačeno vrijeme.Za sljedivost plazmidne DNK, LB dagnje su ubrane u naznačeno vrijeme i analizirane pomoću qPCR i ddPCR.Zbog visokog sadržaja soli u morskoj vodi, alikvoti su razrijeđeni u vodi kvaliteta PCR (1:10) prije svih PCR testova.
PCR digitalnih kapljica (ddPCR) je izveden korištenjem BioRad QX200 protokola (Misisauga, Ontario, Kanada).Koristite temperaturni profil da odredite optimalnu temperaturu (Tabela S1).Kapi su generisane pomoću generatora kapi QX200 (BioRad).ddPCR je izveden na sljedeći način: 95°C 5 min, 50 ciklusa od 95°C 30 s i zadana temperatura žarenja 1 min i 72°C 30 s, 4°C 5 min i 90°C unutar 5 minuta.Broj kapi i pozitivnih reakcija (broj kopija/µl) mjereni su pomoću QX200 čitača kapi (BioRad).Uzorci sa manje od 10.000 kapljica su odbijeni.Kontrola uzorka nije vršena svaki put kada je pokrenut ddPCR.
qPCR je izveden korištenjem Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australija) i LGALS7 specifičnih prajmera.Svi kvantitativni PCR su izvedeni u 20 µl koristeći QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR je započet inkubacijom od 15 minuta na 95°C nakon čega je uslijedilo 40 ciklusa na 95°C u trajanju od 10 sekundi i na 60°C u trajanju od 60 sekundi sa jednim prikupljanjem podataka.Krive topljenja su generisane korišćenjem uzastopnih merenja na 95°C tokom 5 s, 65°C tokom 60 s i 97°C na kraju qPCR.Svaki qPCR je izveden u tri primjerka, osim kontrolnih uzoraka.
Budući da su dagnje poznate po visokoj brzini filtracije, prvo smo istražili mogu li filtrirati i zadržati fragmente DNK prisutne u morskoj vodi.Zanimalo nas je i da li se ovi fragmenti akumuliraju u njihovom poluotvorenom limfnom sistemu.Eksperimentalno smo riješili ovaj problem praćenjem sudbine topivih fragmenata DNK dodanih u rezervoare plavih dagnji.Da bismo olakšali praćenje fragmenata DNK, koristili smo strani (ne vlastiti) plazmid DNK koji sadrži ljudski gen galektin-7.ddPCR prati fragmente plazmidne DNK u morskoj vodi i školjkama.Naši rezultati pokazuju da ako je količina fragmenata DNK u morskoj vodi ostala relativno konstantna tokom vremena (do 7 dana) u odsustvu dagnji, onda je u prisustvu dagnji ovaj nivo gotovo potpuno nestao u roku od 8 sati (Sl. 1a,b).Fragmenti egzogene DNK lako su detektovani u roku od 15 minuta u intravalvularnoj tečnosti i hemolimfi (slika 1c).Ovi fragmenti se još uvijek mogu otkriti do 4 sata nakon izlaganja.Ova aktivnost filtriranja u odnosu na fragmente DNK je uporediva sa aktivnošću filtriranja bakterija i algi [31].Ovi rezultati sugeriraju da dagnje mogu filtrirati i akumulirati strani DNK u svojim tekućinama.
Relativne koncentracije plazmidne DNK u morskoj vodi u prisustvu (A) ili odsutnosti (B) dagnji, mjerene ddPCR.U A, rezultati su izraženi u procentima, pri čemu granice polja predstavljaju 75. i 25. percentile.Uklopljena logaritamska kriva je prikazana crvenom bojom, a područje osjenčano sivom bojom predstavlja interval pouzdanosti od 95%.U B, crvena linija predstavlja srednju vrijednost, a plava linija predstavlja interval pouzdanosti od 95% za koncentraciju.C Akumulacija plazmidne DNK u hemolimfi i valvularnoj tečnosti dagnji u različito vrijeme nakon dodavanja plazmidne DNK.Rezultati su predstavljeni kao apsolutne otkrivene kopije/mL (±SE).
Zatim smo istražili porijeklo ccfDNA u dagnjama prikupljenim iz ležišta dagnji na otocima Kerguelen, udaljenoj grupi otoka s ograničenim antropogenim utjecajem.U tu svrhu, cccDNA iz hemolimfe dagnji je izolirana i pročišćena metodama koje se obično koriste za pročišćavanje ljudske cccDNA [32, 33].Otkrili smo da su prosječne koncentracije ccfDNA hemolimfe u dagnjama u niskom rasponu mikrograma po ml hemolimfe (vidi Tabelu S2, Dodatne informacije).Ovaj raspon koncentracija je mnogo veći nego kod zdravih ljudi (niski nanogrami po mililitru), ali u rijetkim slučajevima, kod pacijenata s rakom, nivo ccfDNA može doseći nekoliko mikrograma po mililitru [34, 35].Analiza raspodjele veličine hemolimfne ccfDNA pokazala je da ovi fragmenti uvelike variraju u veličini, u rasponu od 1000 bp do 1000 bp.do 5000 bp (slika 2).Slični rezultati su dobijeni korišćenjem QIAamp Investigator Kit-a zasnovanog na silicijum dioksidu, metode koja se obično koristi u forenzičkoj nauci za brzo izolovanje i pročišćavanje genomske DNK iz uzoraka DNK niske koncentracije, uključujući ccfDNA [36].
Reprezentativni ccfDNA elektroforegram hemolimfe dagnje.Ekstrahovan sa NucleoSnap Plasma Kitom (gore) i QIAamp DNA Investigator kompletom.B Violin dijagram koji prikazuje distribuciju hemolimfne ccfDNA koncentracija (±SE) u dagnjama.Crne i crvene linije predstavljaju medijanu i prvi i treći kvartil, respektivno.
Otprilike 1% ccfDNK kod ljudi i primata ima strani izvor [21, 37].S obzirom na poluotvoreni cirkulacijski sistem školjkaša, morsku vodu bogatu mikrobima i distribuciju veličine ccfDNK dagnji, pretpostavili smo da ccfDNA hemolimfe dagnji može sadržavati bogat i raznolik skup mikrobne DNK.Da bismo testirali ovu hipotezu, sekvencionirali smo ccfDNK hemolimfe iz uzoraka Aulacomya atra prikupljenih sa ostrva Kerguelen, što je dalo preko 10 miliona čitanja, od kojih je 97,6% prošlo kontrolu kvaliteta.Očitavanja su zatim klasifikovana prema vlastitim i ne-lasnim izvorima koristeći BLASTN i NCBI baze podataka o školjkama (Slika S1, Dodatne informacije).
Kod ljudi se i nuklearna i mitohondrijska DNK mogu osloboditi u krvotok [38].Međutim, u ovoj studiji nije bilo moguće detaljno opisati nuklearnu genomsku DNK dagnji, s obzirom na to da genom A. atra nije sekvencioniran niti opisan.Međutim, uspjeli smo identificirati određeni broj ccfDNA fragmenata našeg porijekla koristeći biblioteku školjkaša (Slika S2, Dodatne informacije).Takođe smo potvrdili prisustvo fragmenata DNK sopstvenog porekla usmerenom PCR amplifikacijom onih gena A. atra koji su sekvencirani (slika 3).Slično, s obzirom da je mitohondrijski genom A. atra dostupan u javnim bazama podataka, mogu se pronaći dokazi o prisustvu mitohondrijalnih ccfDNA fragmenata u hemolimfi A. atra.Prisustvo mitohondrijalnih fragmenata DNK potvrđeno je PCR amplifikacijom (slika 3).
Različiti mitohondrijski geni bili su prisutni u hemolimfi A. atra (crvene tačke – kataloški broj: SRX5705969) i M. platensis (plave tačke – kataloški broj: SRX5705968) amplificirane PCR-om.Slika prilagođena od Breton et al., 2011 B Amplifikacija supernatanta hemolimfe iz A. atra Pohranjena na FTA papiru.Koristite bušilicu od 3 mm za dodavanje direktno u PCR epruvetu koja sadrži PCR mješavinu.
S obzirom na obilan sadržaj mikroba u morskoj vodi, u početku smo se fokusirali na karakterizaciju mikrobnih DNK sekvenci u hemolimfi.Da bismo to učinili, koristimo dvije različite strategije.Prva strategija koristila je Kraken2, program za klasifikaciju sekvenci baziran na algoritmu koji može identificirati mikrobne sekvence s preciznošću koja je uporediva s BLAST-om i drugim alatima [28].Utvrđeno je da je više od 6719 očitavanja bakterijskog porijekla, dok je 124 i 64 od arheja i virusa (slika 4).Najzastupljeniji fragmenti bakterijske DNK bili su Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) i Bacteroidetes (17%) (slika 4a).Ova distribucija je u skladu s prethodnim studijama mikrobioma morske plave dagnje [39, 40].Gamaproteobakterije su bile glavna klasa Proteobacteria (44%), uključujući mnoge Vibrionales (slika 4b).ddPCR metoda je potvrdila prisustvo Vibrio DNK fragmenata u ccfDNK A. atra hemolymph (slika 4c) [41].Da bi se dobilo više informacija o bakterijskom porijeklu ccfDNA, uzet je dodatni pristup (Slika S2, Dodatne informacije). U ovom slučaju, čitanja koja se preklapaju sastavljena su kao čitanja sa uparenim krajevima i klasifikovana su kao samostalne (školjke) ili nesopstvenog porijekla koristeći BLASTN i e vrijednost od 1e−3 i graničnu vrijednost sa >90% homologije. U ovom slučaju, čitanja koja se preklapaju sastavljena su kao čitanja sa uparenim krajevima i klasifikovana su kao samostalne (školjke) ili nesopstvenog porijekla koristeći BLASTN i e vrijednost od 1e−3 i graničnu vrijednost sa >90% homologije. U ovom slučaju, prekrivajuća čtenija bila je sabrana kao čtenija sa parnim koncima i klasifikovana kao sopstveni (dvostruki mollûski) ili strano poreklo sa korišćenjem BLASTN-a i vrednosti e 1e-3 i otsecanja sa gomologijom> 90%. U ovom slučaju, očitanja koja se preklapaju prikupljena su kao čitanja sa uparenim krajevima i klasificirana su kao nativna (dvoljušne) ili neoriginalna korištenjem BLASTN-a i e vrijednosti 1e-3 i graničnika sa >90% homologije.在这种情况下, 重叠的读数组装为配对末端读数, 并使用BLASTN 和1e-3 的e 90% 匪值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使 用 使甌 1和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。 U ovom slučaju prekrivajuća čtenija su sakupljena kao čtenija sa parnim koncima i klasificirana kao vlastita (dvostruka mollûski) ili neosobna po porijeklu s korištenjem značenja e BLASTN i 1e-3 i poroga gomologije> 90%. U ovom slučaju, očitanja koja se preklapaju prikupljena su kao čitanja sa uparenim krajevima i klasificirana kao vlastita (školjke) ili neoriginalna pomoću vrijednosti e BLASTN i 1e-3 i praga homologije >90%.Pošto genom A. atra još nije sekvencioniran, koristili smo de novo strategiju sastavljanja MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) asemblera.Ukupno 147.188 kontiga je identifikovano kao zavisne (školjke) porekla.Ovi kontigi su zatim eksplodirani sa e-vrijednostima od 1e-10 koristeći BLASTN i BLASTX.Ova strategija nam je omogućila da identifikujemo 482 fragmenta nedvosupnih školjki prisutnih u A. atra ccfDNA.Više od polovine (57%) ovih fragmenata DNK dobijeno je od bakterija, uglavnom od škržnih simbionta, uključujući sulfotrofne simbionte, i od škržnih simbionta Solemya velum (slika 5).
Relativna brojnost na nivou tipa.B Mikrobna raznolikost dva glavna tipa (Firmicutes i Proteobacteria).Reprezentativna amplifikacija ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmenti gena 16S rRNA (plavi) u tri atra hemolimfe.
Analizirana su ukupno 482 prikupljena kontiga.Opšti profil taksonomske distribucije metagenomskih kontiga napomena (prokarioti i eukarioti).B Detaljna distribucija fragmenata bakterijske DNK identifikovane pomoću BLASTN i BLASTX.
Kraken2 analiza je takođe pokazala da ccfDNA dagnji sadrži fragmente DNK arhea, uključujući fragmente DNK Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) i Thaurmarcheota (11%) (Slika 6a).Prisustvo fragmenata DNK izvedenih iz Euryarchaeota i Crenarchaeota, koji su prethodno pronađeni u mikrobnoj zajednici kalifornijskih dagnji, ne bi trebalo da bude iznenađenje [42].Iako se Euryarchaeota često povezuje s ekstremnim uvjetima, sada je poznato da su i Euryarchaeota i Crenarcheota među najčešćim prokariotima u morskom kriogenom okruženju [43, 44].Prisustvo metanogenih mikroorganizama u dagnjama nije iznenađujuće, imajući u vidu nedavne izvještaje o opsežnim curenjima metana iz dna na visoravni Kerguelen [45] i mogućoj proizvodnji metana uočeno uz obalu ostrva Kerguelen [46].
Naša pažnja se zatim prebacila na očitavanja DNK virusa.Koliko nam je poznato, ovo je prva studija o sadržaju virusa u dagnjama izvan cilja.Kao što se i očekivalo, pronašli smo fragmente DNK bakteriofaga (Caudovirales) (slika 6b).Međutim, najčešća virusna DNK dolazi iz tipa nukleocitovirusa, također poznatih kao nuklearni citoplazmatski veliki DNK virus (NCLDV), koji ima najveći genom od svih virusa.Unutar ovog tipa većina DNK sekvenci pripada porodicama Mimimidoviridae (58%) i Poxviridae (21%), čiji su prirodni domaćini kičmenjaci i člankonošci, dok mali dio ovih DNK sekvenci pripada poznatim virološkim algama.Inficira morske eukariotske alge.Sekvence su takođe dobijene od Pandora virusa, džinovskog virusa sa najvećom veličinom genoma od svih poznatih virusnih rodova.Zanimljivo je da je raspon domaćina za koje se zna da su zaraženi virusom, kako je utvrđeno sekvenciranjem ccfDNA hemolimfe, bio relativno velik (Slika S3, Dodatne informacije).Uključuje viruse koji inficiraju insekte kao što su Baculoviridae i Iridoviridae, kao i viruse koji inficiraju amebe, alge i kralježnjake.Također smo pronašli sekvence koje odgovaraju genomu Pithovirus sibericum.Pitovirusi (također poznati kao “zombi virusi”) su prvi put izolovani iz 30.000 godina starog permafrosta u Sibiru [47].Stoga su naši rezultati u skladu s prethodnim izvještajima koji pokazuju da nisu sve moderne vrste ovih virusa izumrle [48] i da ovi virusi mogu biti prisutni u udaljenim subarktičkim morskim ekosistemima.
Konačno, testirali smo da vidimo možemo li pronaći fragmente DNK drugih višećelijskih životinja.BLASTN i BLASTX su identifikovali ukupno 482 strana kontiga sa nt, nr i RefSeq bibliotekama (genomske i proteinske).Naši rezultati pokazuju da među stranim fragmentima ccfDNK višećelijskih životinja dominira DNK koštanih kostiju (Sl. 5).Pronađeni su i fragmenti DNK insekata i drugih vrsta.Relativno veliki dio fragmenata DNK nije identificiran, vjerovatno zbog nedovoljne zastupljenosti velikog broja morskih vrsta u genomskim bazama podataka u odnosu na kopnene vrste [49].
U ovom radu primjenjujemo koncept LB na dagnje, tvrdeći da sekvencioniranje ccfDNA hemolimfe može pružiti uvid u sastav morskih obalnih ekosistema.Konkretno, otkrili smo da 1) hemolimfa dagnje sadrži relativno visoke koncentracije (mikrogramski nivoi) relativno velikih (~1-5 kb) cirkulirajućih DNK fragmenata;2) ovi fragmenti DNK su nezavisni i nezavisni 3) Među stranim izvorima ovih fragmenata DNK pronašli smo DNK bakterija, arheja i virusa, kao i DNK drugih višećelijskih životinja;4) Akumulacija ovih stranih fragmenata ccfDNA u hemolimfi se dešava brzo i doprinosi unutrašnjoj aktivnosti filtriranja dagnji.Zaključno, naša studija pokazuje da koncept LB, koji se do sada uglavnom primjenjivao u području biomedicine, kodira bogat, ali neistražen izvor znanja koji se može koristiti za bolje razumijevanje interakcije između stražarskih vrsta i njihovog okruženja.
Pored primata, izolacija ccfDNA zabilježena je i kod sisara, uključujući miševe, pse, mačke i konje [50, 51, 52].Međutim, prema našim saznanjima, naša studija je prva koja je izvijestila o otkrivanju i sekvenciranju ccfDNA u morskim vrstama s otvorenim cirkulacijskim sistemom.Ova anatomska karakteristika i sposobnost filtriranja dagnji mogu, barem djelomično, objasniti različite karakteristike veličine cirkulirajućih fragmenata DNK u odnosu na druge vrste.Kod ljudi, većina fragmenata DNK koji cirkuliraju u krvi su mali fragmenti veličine od 150 do 200 bp.sa maksimalnim vrhom od 167 bp [34, 53].Mali, ali značajan dio fragmenata DNK veličine je između 300 i 500 bp, a oko 5% je duži od 900 bp.[54].Razlog za ovu distribuciju veličine je taj što se glavni izvor ccfDNA u plazmi javlja kao rezultat ćelijske smrti, bilo zbog ćelijske smrti ili zbog nekroze cirkulirajućih hematopoetskih stanica kod zdravih osoba ili zbog apoptoze tumorskih stanica kod pacijenata s rakom (poznato kao cirkulirajuća tumorska DNK)., ctDNA).Distribucija veličine ccfDNK hemolimfe koju smo pronašli u dagnjama kretala se od 1000 do 5000 bp, što sugerira da ccfDNA dagnji ima drugačije porijeklo.Ovo je logična hipoteza, budući da dagnje imaju poluotvoreni vaskularni sistem i žive u morskim vodenim sredinama koje sadrže visoke koncentracije mikrobne genomske DNK.Zapravo, naši laboratorijski eksperimenti korištenjem egzogene DNK pokazali su da dagnje akumuliraju fragmente DNK u morskoj vodi, barem nakon nekoliko sati se razgrađuju nakon staničnog unosa i/ili oslobađaju i/ili pohranjuju u različitim organizacijama.S obzirom na rijetkost ćelija (i prokariotskih i eukariotskih), upotreba intravalvularnih odjeljaka će smanjiti količinu ccfDNA iz vlastitih izvora kao i iz stranih izvora.Uzimajući u obzir važnost urođenog imuniteta školjkaša i veliki broj cirkulirajućih fagocita, dalje smo pretpostavili da je čak i strana ccfDNA obogaćena cirkulirajućim fagocitima koji akumuliraju stranu DNK nakon gutanja mikroorganizama i/ili ćelijskih ostataka.Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da je ccfDNA hemolimfe školjkaša jedinstveno skladište molekularnih informacija i jača njihov status stražarske vrste.
Naši podaci pokazuju da sekvencioniranje i analiza fragmenata ccfDNA hemolimfe dobijenih iz bakterija mogu pružiti ključne informacije o bakterijskoj flori domaćina i bakterijama prisutnim u okolnom morskom ekosustavu.Tehnike sekvenciranja snimaka otkrile su sekvence komenzalne bakterije A. atra škrge koje bi bile promašene da su korištene konvencionalne metode identifikacije 16S rRNA, dijelom zbog pristranosti referentne biblioteke.Zapravo, naša upotreba LB podataka prikupljenih od M. platensis u istom sloju dagnji u Kerguelenu pokazala je da je sastav bakterijskih simbionta povezanih sa škrgama bio isti za obje vrste dagnji (Slika S4, Dodatne informacije).Ova sličnost dvije genetski različite dagnje može odražavati sastav bakterijskih zajednica u hladnim, sumpornim i vulkanskim naslagama Kerguelena [55, 56, 57, 58].Viši nivoi mikroorganizama koji smanjuju sumpor dobro su opisani prilikom sakupljanja dagnji iz bioturbiranih obalnih područja [59], kao što je obala Port-au-France.Druga mogućnost je da flora komenzalnih dagnji može biti pogođena horizontalnim prijenosom [60, 61].Potrebno je više istraživanja kako bi se utvrdila korelacija između morskog okoliša, površine morskog dna i sastava simbiotskih bakterija u dagnjama.Ove studije su trenutno u toku.
Dužina i koncentracija ccfDNA hemolimfe, njena lakoća pročišćavanja i visok kvalitet koji omogućava brzo sekvenciranje pušaka su neke od mnogih prednosti korištenja ccfDNA dagnji za procjenu biodiverziteta u morskim obalnim ekosistemima.Ovaj pristup je posebno efikasan za karakterizaciju virusnih zajednica (viroma) u datom ekosistemu [62, 63].Za razliku od bakterija, arheja i eukariota, virusni genomi ne sadrže filogenetski konzervirane gene kao što su 16S sekvence.Naši rezultati pokazuju da se tečne biopsije indikatorskih vrsta kao što su dagnje mogu koristiti za identifikaciju relativno velikog broja fragmenata ccfDNA virusa za koje je poznato da inficiraju domaćine koji tipično naseljavaju obalne morske ekosisteme.Ovo uključuje viruse za koje je poznato da inficiraju protozoe, člankonošce, insekte, biljke i bakterijske viruse (npr. bakteriofage).Slična raspodjela je pronađena kada smo ispitali hemolimfni ccfDNA virom plavih dagnji (M. platensis) sakupljen u istom sloju dagnji u Kerguelenu (Tablica S2, Dodatne informacije).Sekvencioniranje ccfDNA je zaista novi pristup koji uzima zamah u proučavanju viroma ljudi ili drugih vrsta [21, 37, 64].Ovaj pristup je posebno koristan za proučavanje dvolančanih DNK virusa, budući da nijedan gen nije sačuvan među svim dvolančanim DNK virusima, što predstavlja najraznovrsniju i najširu klasu virusa u Baltimoru [65].Iako većina ovih virusa ostaje neklasificirana i mogu uključivati ​​viruse iz potpuno nepoznatog dijela virusnog svijeta [66], otkrili smo da viromi i rasponi domaćina dagnji A. atra i M. platensis spadaju između ove dvije vrste.slično (vidi sliku S3, dodatne informacije).Ova sličnost nije iznenađujuća, jer može odražavati nedostatak selektivnosti u preuzimanju DNK prisutne u okolini.Trenutno su potrebne buduće studije koje koriste pročišćenu RNK za karakterizaciju RNA viroma.
U našoj studiji koristili smo vrlo rigorozni pipeline adaptiran iz rada Kowarskog i kolega [37], koji su koristili brisanje u dva koraka skupnih čitanja i kontiga prije i nakon sastavljanja nativne ccfDNA, što je rezultiralo visokim udjelom nemapiranih čitanja.Stoga ne možemo isključiti da neki od ovih nemapiranih očitavanja još uvijek mogu imati vlastito porijeklo, prvenstveno zato što nemamo referentni genom za ovu vrstu dagnji.Takođe smo koristili ovaj cevovod jer smo bili zabrinuti za himere između sopstvenog i ne-samog čitanja i dužine čitanja koje generiše Illumina MiSeq PE75.Drugi razlog za većinu neucrtanih očitanja je taj što veći dio morskih mikroba, posebno u udaljenim područjima kao što je Kerguelen, nije označen.Koristili smo Illumina MiSeq PE75, uz pretpostavku da su ccfDNA fragmenti slična dužini ljudske ccfDNA.Za buduća istraživanja, s obzirom na naše rezultate koji pokazuju da ccfDNA hemolimfe ima duže očitavanje od ljudi i/ili sisara, preporučujemo korištenje platforme za sekvenciranje prikladnije za duže ccfDNA fragmente.Ova praksa će znatno olakšati identifikaciju više indikacija za dublju analizu.Dobivanje trenutno nedostupne kompletne sekvence nuklearnog genoma A. atra bi također uvelike olakšalo diskriminaciju ccfDNA iz vlastitih i ne-ličnih izvora.S obzirom da se naše istraživanje fokusiralo na mogućnost primjene koncepta tekuće biopsije na dagnje, nadamo se da će se, kako se ovaj koncept koristi u budućim istraživanjima, razvijati novi alati i kanali kako bi se povećao potencijal ove metode za proučavanje mikrobne raznolikosti dagnji.morski ekosistem.
Kao neinvazivni klinički biomarker, povišeni nivoi ccfDNA u ljudskoj plazmi su povezani sa različitim bolestima, oštećenjem tkiva i stresnim stanjima [67,68,69].Ovo povećanje je povezano s oslobađanjem fragmenata DNK vlastitog porijekla nakon oštećenja tkiva.Ovaj problem smo riješili korištenjem akutnog toplotnog stresa, u kojem su dagnje kratko bile izložene temperaturi od 30 °C.Ovu analizu smo izvršili na tri različite vrste dagnji u tri nezavisna eksperimenta.Međutim, nismo pronašli nikakvu promjenu u nivoima ccfDNA nakon akutnog toplotnog stresa (vidi sliku S5, dodatne informacije).Ovo otkriće može objasniti, barem djelomično, činjenicu da dagnje imaju poluotvoreni cirkulatorni sistem i akumuliraju velike količine stranog DNK zbog svoje visoke aktivnosti filtriranja.S druge strane, dagnje, kao i mnogi beskičmenjaci, mogu biti otpornije na oštećenje tkiva izazvano stresom, čime se ograničava oslobađanje ccfDNA u njihovoj hemolimfi [70, 71].
Do danas se DNK analiza biodiverziteta u vodenim ekosistemima uglavnom fokusirala na metabarkodiranje DNK (eDNK) životne sredine.Međutim, ova metoda je obično ograničena u analizi biodiverziteta kada se koriste prajmeri.Upotreba sekvencioniranja sačmarica zaobilazi ograničenja PCR-a i pristrasnog odabira setova prajmera.Dakle, u određenom smislu, naša metoda je bliža nedavno korištenoj visokopropusnoj metodi sekvenciranja eDNA Shotgun, koja je u stanju direktno sekvencirati fragmentiranu DNK i analizirati gotovo sve organizme [72, 73].Međutim, postoji niz fundamentalnih pitanja koja razlikuju LB od standardnih eDNK metoda.Naravno, glavna razlika između eDNA i LB je upotreba prirodnih filtera.Prijavljena je upotreba morskih vrsta kao što su spužve i školjke (Dresseina spp.) kao prirodni filter za proučavanje eDNK [74, 75].Međutim, Dreissenina studija je koristila biopsije tkiva iz kojih je ekstrahovan DNK.Analiza ccfDNA iz LB ne zahtijeva biopsiju tkiva, specijaliziranu i ponekad skupu opremu i logistiku povezanu s eDNK ili biopsijom tkiva.U stvari, nedavno smo izvijestili da se ccfDNA iz LB može pohraniti i analizirati uz podršku FTA bez održavanja hladnog lanca, što je veliki izazov za istraživanja u udaljenim područjima [76].Ekstrakcija ccfDNA iz tečnih biopsija je takođe jednostavna i obezbeđuje DNK visokog kvaliteta za sekvencioniranje sačmarica i PCR analizu.Ovo je velika prednost s obzirom na neka od tehničkih ograničenja vezanih za analizu eDNK [77].Jednostavnost i niska cijena metode uzorkovanja je također posebno pogodna za dugoročne programe praćenja.Pored njihove visoke sposobnosti filtriranja, još jedna dobro poznata karakteristika školjkaša je hemijski mukopolisaharidni sastav njihove sluzi, koji potiče apsorpciju virusa [78, 79].Ovo čini školjke idealnim prirodnim filterom za karakterizaciju biodiverziteta i uticaja klimatskih promjena u datom vodenom ekosistemu.Iako se prisustvo fragmenata DNK izvedenih iz domaćina može posmatrati kao ograničenje metode u poređenju sa eDNK, troškovi povezani sa posedovanjem takve prirodne ccfDNK u poređenju sa eDNK su istovremeno razumljivi za ogromnu količinu informacija dostupnih za zdravstvene studije.offset host.Ovo uključuje prisustvo virusnih sekvenci integrisanih u genom domaćina domaćina.Ovo je posebno važno za dagnje, s obzirom na prisutnost horizontalno prenosivih leukemijskih retrovirusa kod školjkaša [80, 81].Još jedna prednost LB-a u odnosu na eDNK je da iskorištava fagocitnu aktivnost cirkulirajućih krvnih stanica u hemolimfi, koja proguta mikroorganizme (i njihove genome).Fagocitoza je glavna funkcija krvnih stanica kod školjkaša [82].Konačno, metoda koristi prednost visokog kapaciteta filtriranja dagnji (prosječno 1,5 l/h morske vode) i dvodnevne cirkulacije, što povećava miješanje različitih slojeva morske vode, omogućavajući hvatanje heterologne eDNK.[83, 84].Stoga je ccfDNA analiza dagnji zanimljiv način s obzirom na nutritivne, ekonomske i ekološke utjecaje dagnji.Slično analizi LB prikupljenih od ljudi, ova metoda također otvara mogućnost mjerenja genetskih i epigenetskih promjena u DNK domaćina kao odgovor na egzogene supstance.Na primjer, tehnologije sekvenciranja treće generacije mogu se predvidjeti za izvođenje analize metilacije u cijelom genomu u nativnoj ccfDNA korištenjem sekvenciranja nanopora.Ovaj proces bi trebao biti olakšan činjenicom da je dužina ccfDNA fragmenata dagnje idealno kompatibilna sa platformama za sekvencioniranje dugog čitanja koje omogućavaju analizu metilacije DNK u cijelom genomu iz jednog ciklusa sekvenciranja bez potrebe za kemijskim transformacijama.85,86] Ovo je zanimljiva mogućnost, jer je pokazano da DNK odražava reakciju metilacije na mnoge obrasce metilacije u okolini.Stoga, može pružiti vrijedan uvid u osnovne mehanizme koji upravljaju odgovorom nakon izlaganja klimatskim promjenama ili zagađivačima [87].Međutim, upotreba LB-a nije bez ograničenja.Nepotrebno je reći da je za to potrebno prisustvo indikatorskih vrsta u ekosistemu.Kao što je gore spomenuto, korištenje LB-a za procjenu biodiverziteta datog ekosistema također zahtijeva rigoroznu bioinformatičku liniju koja uzima u obzir prisustvo fragmenata DNK iz izvora.Drugi veliki problem je dostupnost referentnih genoma za morske vrste.Nadamo se da će inicijative poput Projekta genoma morskih sisara i nedavno uspostavljenog projekta Fish10k [88] olakšati takvu analizu u budućnosti.Primjena LB koncepta na organizme koji se hrane morskim filterima također je kompatibilna s najnovijim dostignućima u tehnologiji sekvenciranja, što ga čini vrlo pogodnim za razvoj biomarkera s više oma kako bi se pružile važne informacije o zdravlju morskih staništa kao odgovor na ekološki stres.
Podaci o sekvenciranju genoma pohranjeni su u NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pod Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Utjecaj klimatskih promjena na morski život i ekosisteme.Cole Biology.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Razmotrite kombinovane utjecaje klimatskih promjena i drugih lokalnih stresora na morski okoliš.opšte naučno okruženje.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Nauka prvog marta.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Smanjena tolerancija na toplotu u uslovima ponavljajućeg toplotnog stresa objašnjava visoku letnju smrtnost plavih dagnji.Naučni izvještaj 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Nedavne promjene u učestalosti, uzrocima i obimu uginuća životinja.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Višestruki nespecifični patogeni mogli su uzrokovati masovnu smrtnost Pinna nobilis.Život.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potencijalni uticaj klimatskih promjena na arktičke zoonoza.Int J Cirkumpolarno zdravlje.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Plave dagnje (Mytilus edulis spp.) kao signalni organizmi u monitoringu obalnog zagađenja: pregled.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integracija tečne biopsije u liječenju raka.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Sazrijevanje tečne biopsije: Omogućuje cirkulaciju DNK tumora.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleinske kiseline u ljudskoj plazmi.Zapisnici sa sastanaka podružnica Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nova uloga DNK bez ćelija kao molekularnog markera za liječenje raka.Kvantifikacija biomolarne analize.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Tečna biopsija ulazi u kliniku – problemi implementacije i budući izazovi.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW i drugi.Fetalna DNK je prisutna u majčinoj plazmi i serumu.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studija toka trudnoće i njenih komplikacija korištenjem cirkulirajuće ekstracelularne RNK u krvi žena tokom trudnoće.Dopediatrics.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Tekuća biopsija: DNK bez ćelija donora se koristi za otkrivanje alogenih lezija u transplantatu bubrega.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovacije u prenatalnoj dijagnostici: sekvenciranje genoma u plazmi majke.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Brzo otkrivanje patogena uz metagenomsko sekvenciranje zaraženih tjelesnih tekućina sljedeće generacije.Nat Medicine.2021;27:115-24.