Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nekontrolirano krvarenje jedan je od vodećih uzroka smrti.Postizanjem brze hemostaze osigurava se opstanak subjekta kao prva pomoć u borbi, saobraćajnim nesrećama i operacijama smanjenja smrti.Kompozitna skela ojačana nanoporoznim vlaknima (NFRCS) izvedena iz jednostavne hemostatske kompozicije za formiranje filma (HFFC) kao kontinuirana faza može pokrenuti i poboljšati hemostazu.Razvoj NFRCS-a zasniva se na dizajnu krila vilinog konjica.Struktura krila vretenca sastoji se od poprečnih i uzdužnih krila, a membrane krila su međusobno povezane kako bi se održao integritet mikrostrukture.HFFC ravnomjerno oblaže površinu vlakna filmom nanometarske debljine i povezuje nasumično raspoređenu debljinu pamuka (Ct) (disperznu fazu) kako bi se formirala nanoporozna struktura.Kombinacija kontinuiranih i dispergiranih faza smanjuje cijenu proizvoda deset puta u odnosu na komercijalno dostupne proizvode.Modifikovani NFRCS (tamponi ili narukvice) mogu se koristiti u raznim biomedicinskim aplikacijama.In vivo studije su zaključile da razvijeni Cp NFRCS pokreće i poboljšava proces koagulacije na mjestu primjene.NFRCS može modulirati mikrookruženje i djelovati na ćelijskom nivou zbog svoje nanoporozne strukture što rezultira boljim zacjeljivanjem rana u modelu ekscizijske rane.
Nekontrolisano krvarenje tokom borbenih, intraoperativnih i hitnih situacija može predstavljati ozbiljnu opasnost po život ranjenika1.Ova stanja dalje dovode do ukupnog povećanja perifernog vaskularnog otpora, što dovodi do hemoragičnog šoka.Odgovarajuće mjere za kontrolu krvarenja tokom i nakon operacije smatraju se potencijalno opasnim po život2,3.Oštećenje velikih krvnih sudova dovodi do velikog gubitka krvi, što rezultira stopom smrtnosti od ≤ 50% u borbi i 31% tokom operacije1.Ogroman gubitak krvi dovodi do smanjenja volumena tijela, što smanjuje minutni volumen srca.Povećanje ukupnog perifernog vaskularnog otpora i progresivno oštećenje mikrocirkulacije dovode do hipoksije u organima za održavanje života.Hemoragični šok može nastati ako se stanje nastavi bez efikasne intervencije1,4,5.Ostale komplikacije uključuju progresiju hipotermije i metaboličke acidoze, kao i poremećaj koagulacije koji ometa proces koagulacije.Teški hemoragijski šok povezan je s većim rizikom od smrti6,7,8.Kod III (progresivnog) šoka, transfuzija krvi je neophodna za preživljavanje pacijenata tokom intraoperativnog i postoperativnog morbiditeta i mortaliteta.Kako bismo prevladali sve gore navedene situacije opasne po život, razvili smo kompozitnu skelu ojačanu nanoporoznim vlaknima (NFRCS) koja koristi minimalnu koncentraciju polimera (0,5%) koristeći kombinaciju hemostatskih polimera topljivih u vodi.
Uz upotrebu ojačanja vlaknima, mogu se razviti isplativi proizvodi.Nasumično raspoređena vlakna podsjećaju na strukturu krila vilinog konjica, uravnotežena horizontalnim i vertikalnim prugama na krilima.Poprečne i uzdužne vene krila komuniciraju sa membranom krila (sl. 1).NFRCS se sastoji od ojačanog Ct-a kao sistema skele bolje fizičke i mehaničke čvrstoće (slika 1.).Zbog pristupačnosti i umijeća izrade, hirurzi radije koriste mjerače pamučnih niti (Ct) tokom operacija i zavoja. Stoga, imajući u vidu njegove višestruke prednosti, uključujući > 90% kristalne celuloze (koja doprinosi poboljšanju hemostatske aktivnosti), Ct je korišten kao skeletni sistem NFRCS9,10. Stoga, imajući u vidu njegove višestruke prednosti, uključujući > 90% kristalne celuloze (koja doprinosi poboljšanju hemostatske aktivnosti), Ct je korišten kao skeletni sistem NFRCS9,10. Slijedom toga, uzimajući u obzir njegovu brojnu prednost, u tom broju > 90% kristalne celuloze (učestvuje u povećanju hemostatičke aktivnosti), Ct je koristio kvalitetnu skeletnu sistem NFRCS9,10. Stoga, s obzirom na mnoge prednosti, uključujući >90% kristalne celuloze (uključene u povećanu hemostatsku aktivnost), Ct je korišten kao NFRCS skeletni sistem9,10.因此, 考虑到它的多重益处, 包括> 90% 的结晶纤维素 (有助于增强止血)（CS 90% ,10 的骨架系统。因此,考虑到它的多重益处,包括> 90%Stoga, s obzirom na mnoge prednosti, uključujući preko 90% kristalne celuloze (pomaže u poboljšanju hemostatske aktivnosti), Ct je korišten kao skela za NFRCS9,10.Ct je bio površinski obložen (opaženo je formiranje nano-debelog filma) i međusobno povezan sa hemostatskom kompozicijom za formiranje filma (HFFC).HFFC djeluje kao matrigel, držeći nasumično postavljeni Ct zajedno.Razvijeni dizajn prenosi napon unutar dispergirane faze (ojačavajuća vlakna).Teško je dobiti nanoporozne strukture dobre mehaničke čvrstoće koristeći minimalne koncentracije polimera.Osim toga, nije lako prilagoditi različite kalupe za različite biomedicinske primjene.
Na slici je prikazan dijagram NFRCS dizajna na osnovu strukture krila vretenca (A).Ova slika prikazuje komparativnu analogiju strukture krila vretenca (presječne i uzdužne vene krila su međusobno povezane) i fotomikrografiju poprečnog presjeka Cp NFRCS (B).Šematski prikaz NFRCS.
NFRC su razvijeni koristeći HFFC kao kontinuiranu fazu kako bi se odgovorilo na gore navedena ograničenja.HFFC se sastoji od različitih hemostatskih polimera koji stvaraju film uključujući hitozan (kao glavni hemostatski polimer) s metilcelulozom (MC), hidroksipropil metilcelulozom (HPMC 50 cp) i polivinil alkoholom (PVA)) (125 kDa) kao potpornim polimerom koji potiče stvaranje tromba.formiranje.Dodatak polivinilpirolidina K30 (PVP K30) poboljšao je kapacitet NFRCS upijanja vlage.Polietilen glikol 400 (PEG 400) je dodat da bi se poboljšalo umrežavanje polimera u mešavinama vezanih polimera.Tri različite HFFC hemostatske kompozicije (Cm HFFC, Ch HFFC i Cp HFFC), odnosno hitozan sa MC (Cm), hitozan sa HPMC (Ch) i hitozan sa PVA (Cp), primenjene su na Ct.Različite in vitro i in vivo studije karakterizacije potvrdile su hemostatsku aktivnost i zacjeljivanje rana NFRCS.Kompozitni materijali koje nudi NFRCS mogu se koristiti za prilagođavanje različitih oblika skela u skladu sa specifičnim potrebama.
Osim toga, NFRCS se može modificirati kao zavoj ili rolna da pokrije cijelo područje ozljede donjih ekstremiteta i drugih dijelova tijela.Konkretno za borbene ozljede ekstremiteta, dizajnirani NFRCS dizajn može se promijeniti na pola ruke ili punu nogu (dodatna slika S11).NFRCS se može napraviti u narukvicu sa ljepilom za tkivo, koji se može koristiti za zaustavljanje krvarenja od teških samoubilačkih ozljeda ručnog zgloba.Naš glavni cilj je razviti NFRCS sa što manje polimera koji se može isporučiti velikoj populaciji (ispod granice siromaštva) i koji se može staviti u kutiju prve pomoći.Jednostavan, efikasan i ekonomičan u dizajnu, NFRCS koristi lokalnim zajednicama i može imati globalni uticaj.
Hitozan (molekulske težine 80 kDa) i amarant su nabavljeni od Mercka, Indija.Hidroksipropil metilceluloza 50 Cp, polietilen glikol 400 i metilceluloza kupljeni su od Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.Polivinil alkohol (molekulska težina 125 kDa) (87-90% hidrolizovan) je nabavljen od National Chemicals, Gujarat.Polivinilpirolidin K30 je kupljen od Molychema, Mumbai, sterilni brisevi su kupljeni od Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, sa Milli Q vodom (Direct-Q3 sistem za prečišćavanje vode, Merck, Indija) kao nosač.
NFRCS je razvijen metodom liofilizacije11,12.Sve HFFC kompozicije (Tabela 1) pripremljene su upotrebom mehaničke mešalice.Pripremite 0,5% rastvor hitozana koristeći 1% sirćetne kiseline u vodi kontinuiranim mešanjem na 800 rpm na mehaničkoj mešalici.Tačna težina napunjenog polimera navedena u tabeli 1 dodana je u rastvor hitozana i mešana dok se ne dobije bistri rastvor polimera.U nastalu smjesu dodani su PVP K30 i PEG 400 u količinama navedenim u Tabeli 1, a miješanje je nastavljeno dok se ne dobije bistri viskozni rastvor polimera.Dobivena kupka otopine polimera je sonicirana 60 minuta da bi se uklonili zarobljeni mjehurići zraka iz polimerne smjese.Kao što je prikazano na dodatnoj slici S1(b), Ct je ravnomjerno raspoređen u svaku jažicu ploče sa 6 jažica (kalup) dopunjenu sa 5 ml HFFC-a.
Ploča sa šest jažica je ultrazvučna 60 minuta kako bi se postiglo jednolično vlaženje i raspodjela HFFC-a u Ct mreži.Zatim zamrznite ploču sa šest jažica na -20°C 8-12 sati.Ploče za zamrzavanje su liofilizirane 48 sati da bi se dobile različite formulacije NFRCS.Isti postupak se koristi za proizvodnju različitih oblika i struktura, kao što su tamponi ili cilindrični tamponi, ili bilo koji drugi oblik za različite primjene.
Precizno izvagani hitozan (80 kDa) (3%) je rastvoren u 1% sirćetnoj kiselini pomoću magnetne mešalice.Dobijenom rastvoru hitozana dodat je 1% PEG 400 i mešan 30 minuta.Dobivenu otopinu sipajte u kvadratnu ili pravokutnu posudu i zamrznite na -80°C 12 sati.Zamrznuti uzorci su liofilizirani 48 sati da bi se dobio porozni Cs13.
Razvijeni NFRCS je podvrgnut eksperimentima korištenjem Fourier transformacijske infracrvene spektroskopije (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japan) kako bi se potvrdila kemijska kompatibilnost hitozana sa drugim polimerima14,15.FTIR spektri (širina spektralnog opsega od 400 do 4000 cm-1) svih testiranih uzoraka dobijeni su izvođenjem 32 skeniranja.
Stopa apsorpcije krvi (BAR) za sve formulacije procijenjena je metodom koju su opisali Chen et al.16 sa malim modifikacijama.Razvijeni NFRK svih sastava su sušeni u vakuum pećnici na 105°C preko noći da bi se uklonio zaostali rastvarač.30 mg NFRCS (početna težina uzorka – W0) i 30 mg Ct (pozitivna kontrola) stavljeno je u odvojene posude koje su sadržavale premiks od 3,8% natrijum citrata.U unaprijed određenim vremenskim intervalima, odnosno 5, 10, 20, 30, 40 i 60 sekundi, NFRCS su uklonjeni i njihove površine očišćene od neapsorbirane krvi stavljanjem uzoraka na Ct u trajanju od 30 sekundi.Konačna težina krvi koju je apsorbirao NFRCS 16 razmatrana je (W1) u svakoj vremenskoj tački.Izračunajte BAR postotak koristeći sljedeću formulu:
Vrijeme zgrušavanja krvi (BCT) je određeno kako su objavili Wang et al.17 .Vrijeme potrebno da se puna krv (krv pacova pomiješana sa 3,8% natrijum citrata) zgruša u prisustvu NFRCS izračunato je kao BCT uzorka za testiranje.Različite komponente NFRCS (30 mg) stavljene su u bočice sa zatvaračem od 10 ml i inkubirane na 37°C.Krv (0,5 ml) je dodana u bočicu i 0,3 ml 0,2 M CaCl2 da bi se aktivirala koagulacija krvi.Na kraju, okrenite bočicu svakih 15 sekundi (do 180°) dok se ne formira čvrst ugrušak.BCT uzorka procjenjuje se brojem preokreta17,18.Na osnovu BCT, dva optimalna sastava iz NFRCS Cm, Ch i Cp su odabrana za dalja ispitivanja karakterizacije.
BCT sastava Ch NFRCS i Cp NFRCS određen je primjenom metode koju su opisali Li et al.19 .Stavite 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs (pozitivna kontrola) u zasebne Petrijeve posude (37 °C).Krv koja je sadržavala 3,8% natrijum citrata pomiješana je sa 0,2 M CaCl2 u volumnom omjeru 10:1 da bi se započeo proces zgrušavanja krvi.20 µl 0,2 M CaCl2 mješavine krvi pacova naneseno je na površinu uzorka i stavljeno u praznu Petrijevu posudu.Kontrola je bila krv izlivena u prazne Petrijeve posude bez Ct.U fiksnim intervalima od 0, 3 i 5 minuta, zaustavite zgrušavanje dodavanjem 10 ml dejonizovane (DI) vode uzorku koji sadrži posudu bez ometanja ugruška.Nekoagulirani eritrociti (eritrociti) podliježu hemolizi u prisustvu deionizirane vode i oslobađaju hemoglobin.Hemoglobin u različitim vremenskim tačkama (HA(t)) mjeren je na 540 nm (λmax hemoglobin) korištenjem UV-Vis spektrofotometra.Kao referentni standard uzeta je apsolutna apsorpcija hemoglobina (AH(0)) u 0 min 20 µl krvi u 10 ml dejonizirane vode.Relativni unos hemoglobina (RHA) koagulirane krvi izračunat je iz omjera HA(t)/HA(0) korištenjem iste serije krvi.
Pomoću analizatora teksture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, SAD) određena su adhezivna svojstva NFRK-a na oštećeno tkivo.Cilindričnu posudu otvorenog dna pritisnite uz unutrašnjost svinjske kože (bez sloja masti).Uzorci (Ch NFRCS i Cp NFRCS) su nanošeni putem kanile u cilindrične kalupe kako bi se stvorila adhezija za kožu svinje.Nakon 3 minute inkubacije na sobnoj temperaturi (RT) (25°C), NFRCS adhezivna snaga je zabilježena konstantnom brzinom od 0,5 mm/sec.
Glavna karakteristika hirurških zaptivača je povećanje zgrušavanja krvi uz smanjenje gubitka krvi.Koagulacija bez gubitaka u NFRCS je procijenjena korištenjem ranije objavljene metode sa malim modifikacijama 19 .Napravite epruvetu za mikrocentrifugu (2 ml) (unutrašnji prečnik 10 mm) sa rupom od 8 × 5 mm2 na jednoj strani epruvete za centrifugiranje (koja predstavlja otvorenu ranu).NFRCS se koristi za zatvaranje otvora, a traka se koristi za zaptivanje vanjskih rubova.Dodajte 20 µl 0,2 M CaCl2 u epruvetu za mikrocentrifugu koja sadrži 3,8% premiks natrijum citrata.Nakon 10 minuta, epruvete za mikrocentrifugu su izvađene iz posuda i utvrđeno je povećanje mase posuda zbog oticanja krvi iz NFRK (n = 3).Gubitak krvi Ch NFRCS i Cp NFRCS su upoređeni sa Cs.
Mokri integritet NFRCS-a određen je na osnovu metode koju su opisali Mishra i Chaudhary21 uz manje modifikacije.Stavite NFRCS u erlenmajericu od 100 ml sa 50 ml vode i miješajte 60 s bez formiranja vrha.Vizuelna inspekcija i određivanje prioriteta uzoraka za fizički integritet na osnovu prikupljanja.
Snaga vezivanja HFFC-a za Ct proučavana je korištenjem prethodno objavljenih metoda uz manje modifikacije.Integritet površinskog premaza procijenjen je izlaganjem NFRK akustičnim valovima (vanjski stimulus) u prisustvu milliQ vode (Ct).Razvijeni NFRCS Ch NFRCS i Cp NFRCS stavljeni su u čašu napunjenu vodom i sonikirani 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 30 minuta, respektivno.Nakon sušenja, procentualna razlika između početne i konačne težine NFRCS-a korištena je za izračunavanje procenta gubitka materijala (HFFC).In vitro BCT je dodatno podržao snagu vezivanja ili gubitak površinskih materijala.Efikasnost vezivanja HFFC za Ct obezbeđuje koagulaciju krvi i elastičnu prevlaku na površini Ct22.
Homogenost razvijenog NFRCS-a određena je BCT-om uzoraka (30 mg) uzetih sa nasumično odabranih općih lokacija NFRCS-a.Slijedite prethodno spomenutu BCT proceduru da biste utvrdili usklađenost s NFRCS.Blizina između svih pet uzoraka osigurava jednoliku pokrivenost površine i taloženje HFFC-a u Ct mreži.
Nominalna površina kontakta s krvlju (NBCA) određena je kao što je prethodno objavljeno uz neke izmjene.Koagulirajte krv tako što ćete stegnuti 20 µl krvi između dvije površine Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs.Nakon 1 sata, dva dijela stenta su razdvojena i ručno je izmjerena površina ugruška.Prosječna vrijednost od tri ponavljanja smatrana je NBCA NFRCS19.
Analiza dinamičke sorpcije pare (DVS) korišćena je za procenu efikasnosti NFRCS da apsorbuje vodu iz spoljašnje sredine ili sa mesta povrede odgovornog za iniciranje koagulacije.DVS gravimetrijski procjenjuje ili bilježi unos i gubitak pare u uzorku koristeći ultra osjetljivu vagu s rezolucijom mase od ±0,1 µg.Parcijalni pritisak pare (relativna vlažnost) stvara elektronski regulator masenog protoka oko uzorka miješanjem zasićenih i suhih nosećih plinova. Prema smjernicama Evropske farmakopeje, na osnovu procenta upijanja vlage od strane uzoraka, uzorci su kategorizirani u 4 kategorije (0-0,012% w/w- nehigroskopni, 0,2-2% w/w blago higroskopni, 2-15% umjereno higroskopni,15%) i >23% w/w- nehigroskopni. Prema smjernicama Evropske farmakopeje, na osnovu procenta upijanja vlage od strane uzoraka, uzorci su kategorizirani u 4 kategorije (0-0,012% w/w- nehigroskopni, 0,2-2% w/w blago higroskopni, 2-15% umjereno higroskopni, i >23% vrlo higroskopni.15%).U skladu sa preporukama Evropske farmakopeje, u zavisnosti od procenta apsorpcije vlage od strane uzoraka, uzorci su podeljeni u 4 kategorije (0–0,012% w/w – nehigroskopni, 0,2–2% w/w blago higroskopni, 2–15 %).% umjereno gigroskopski i > 15% vrlo gigroskopski)23. % umjereno higroskopno i > 15% vrlo higroskopno)23.根据欧洲药典指南, 根据样品吸收水分的百分比, 样品分为4 类(0-0,012% w/w/w) /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分0-2% W-0-0 W.湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。U skladu sa preporukama Evropske farmakopeje, uzorci su podeljeni u 4 klase u zavisnosti od procenta apsorbovane vlage u uzorku (0-0,012% po težini – nehigroskopno, 0,2-2% po masi blago higroskopno, 2-15% po težini).% umjereno gigroskopski, > 15 % vrlo gigroskopski) 23. % umjereno higroskopno, > 15% vrlo higroskopno) 23.Higroskopska efikasnost NFCS X NFCS i TsN NFCS određena je na analizatoru DVS TA TGA Q5000 SA.Tokom ovog procesa, dobijeno je vreme rada, relativna vlažnost (RH) i težina uzorka u realnom vremenu na 25°C24.Sadržaj vlage izračunava se preciznom NFRCS analizom mase koristeći sljedeću jednadžbu:
MC je NFRCS vlažnost.m1 – suva težina NSAIL.m2 je NFRCS masa u realnom vremenu pri datoj RH.
Ukupna površina je procijenjena korištenjem eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon pražnjenja uzoraka na 25 °C tijekom 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Ukupna površina je procijenjena korištenjem eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon pražnjenja uzoraka na 25 °C tijekom 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Opšta površina površ je ocijenjena uz pomoć eksperimenta na adsorbciji azota židkim azotom nakon oporavljanja obrazova pri 25 °S tokom 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Ukupna površina je procijenjena korištenjem eksperimenta adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon što su uzorci ispražnjeni na 25°C tokom 10 h (< 7 × 10–3 Torr).25°C 10 sati (< 7 × 10-3 Torr)temperatura 25°C Ukupna površina površno se procenjivala korišćenjem eksperimenata na adsorbciji azota židkim azotom posle oporavljanja obrazova u toku 10 časova pri 25°C (< 7 × 10-3 tora). Ukupna površina je procijenjena korištenjem eksperimenata adsorpcije dušika s tekućim dušikom nakon što su uzorci ispražnjeni 10 sati na 25°C (< 7 x 10-3 torr).Ukupna površina, zapremina pora i veličina pora NFRCS određivani su Quantachrome iz NOVA 1000e, Austrija pomoću softvera RS 232.
Pripremite 5% eritrocita (fiziološki rastvor kao razblaživač) iz pune krvi.Zatim prenesite alikvot HFFC (0,25 ml) na ploču sa 96 jažica i 5% RBC mase (0,1 ml).Inkubirajte smjesu na 37°C 40 minuta.Mješavina crvenih krvnih zrnaca i seruma smatrana je pozitivnom kontrolom, a mješavina fiziološke otopine i crvenih krvnih stanica kao negativna kontrola.Hemaglutinacija je određena prema Stajitzky skali.Predložene skale su sljedeće: + + + + gusti zrnati agregati;+ + + glatki donji jastučići sa zakrivljenim ivicama;+ + glatki donji jastučići sa poderanim ivicama;+ uski crveni prstenovi oko rubova glatkih jastučića;– (negativno) diskretno crveno dugme 12 u centru donjeg bunara.
Hemokompatibilnost NFRCS je proučavana prema metodi Međunarodne organizacije za standardizaciju (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Gravimetrijska metoda koju su opisali Singh et al.Manje modifikacije su napravljene kako bi se procijenilo formiranje tromba u prisustvu ili na površini NFRCS.500 mg Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS je inkubirano u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS) tokom 24 sata na 37°C.Nakon 24 sata, PBS je uklonjen i NFRCS je tretiran sa 2 ml krvi koja je sadržavala 3,8% natrijum citrata.Na površinu NFRCS-a dodajte 0,04 ml 0,1 M CaCl2 inkubiranim uzorcima.Nakon 45 minuta dodano je 5 ml destilovane vode da se zaustavi koagulacija.Koagulirana krv na površini NFRK tretirana je 36-38% otopinom formaldehida.Ugrušci fiksirani formaldehidom su osušeni i izvagani.Procenat tromboze je procenjen izračunavanjem težine čaše bez krvi i uzorka (negativna kontrola) i čaše sa krvlju (pozitivna kontrola).
Kao početna potvrda, uzorci su vizualizirani pod optičkim mikroskopom kako bi se razumjela sposobnost površinskog premaza HFFC, Ct međusobno povezane i Ct mreže da formira pore.Tanki dijelovi Ch i Cp iz NFRCS-a su obrezani oštricom skalpela.Dobiveni dio je stavljen na staklo, prekriven pokrovnim stakalcem, a rubovi su fiksirani ljepilom.Pripremljeni dijapozitivi su pregledani pod optičkim mikroskopom i snimljene su fotografije pri različitim uvećanjima.
Taloženje polimera u Ct mrežama je vizualizovano pomoću fluorescentne mikroskopije zasnovane na metodi koju su opisali Rice et al.29. Kompozicija HFFC koja se koristi za formulaciju pomešana je sa fluorescentnom bojom (amarant), a NFRCS (Ch & Cp) je pripremljen prema prethodno pomenutom metodu. Kompozicija HFFC koja se koristi za formulaciju pomešana je sa fluorescentnom bojom (amarant), a NFRCS (Ch & Cp) je pripremljen prema prethodno pomenutom metodu.HFFC kompozicija koja se koristi za formulaciju pomešana je sa fluorescentnom bojom (amarant) i NFRCS (Ch i Cp) je dobijen prema prethodno navedenoj metodi.将用于配方的HFFCﻄ㐈物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方将用于配方的HFFCﻄ㐈物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方Kompozicija HFFC koja se koristi u formulaciji je pomešana sa fluorescentnom bojom (Amarant) i dobijena je NFRCS (Ch i Cp), kao što je ranije pomenuto.Iz dobivenih uzoraka izrezani su tanki rezovi NFRK-a, stavljeni na stakalce i prekriveni pokrovnim stakalcima.Posmatrajte pripremljene stakalce pod fluorescentnim mikroskopom koristeći zeleni filter (310-380 nm).Slike su snimljene uz povećanje od 4x da bi se razumjeli odnosi Ct i višak polimera taloženja u Ct mreži.
Topografija površine NFRCS Ch i Cp određena je pomoću mikroskopa atomske sile (AFM) sa ultra-oštrom TESP konzolom u tapping modu: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tajvan.Hrapavost površine određena je srednjim kvadratom (RMS) pomoću softvera (Scanning Probe Image Processor).Različite NFRCS lokacije su prikazane na 3D slikama kako bi se provjerila ujednačenost površine.Standardna devijacija rezultata za dato područje definira se kao hrapavost površine.RMS jednadžba je korištena za kvantifikaciju hrapavosti površine NFRCS31.
Studije zasnovane na FESEM-u su sprovedene korišćenjem FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, da bi se razumela morfologija površine Ch NFRCS i Cp NFRCS, koji su pokazali bolji BCT od Cm NFRCS.FESEM studija je izvedena prema metodi koju su opisali Zhao et al.32 sa manjim izmjenama.NFRCS 20 do 30 mg Ch NFRCS i Cp NFRCS su prethodno pomešani sa 20 µl 3,8% natrijum citrata pomešanog sa krvlju pacova.20 μl 0,2 M CaCl2 dodano je uzorcima tretiranim krvlju da se započne koagulacija i uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi 10 minuta.Dodatno, višak eritrocita je uklonjen sa površine NFRCS ispiranjem fiziološkim rastvorom.
Sljedeći uzorci su tretirani sa 0,1% glutaraldehida i zatim sušeni u pećnici na vrući zrak na 37°C kako bi se uklonila vlaga.Osušeni uzorci su premazani i analizirani 32 .Ostale slike dobijene tokom analize bile su formiranje ugruška na površini pojedinačnih pamučnih vlakana, taloženje polimera između Ct, morfologija (oblik) eritrocita, integritet ugruška i morfologija eritrocita u prisustvu NFRCS.Netretirane NFRCS površine i Ch i Cp tretirane NFRCS površine inkubirane krvlju skenirane su za elementarne jone (natrijum, kalij, azot, kalcijum, magnezijum, cink, bakar i selen)33.Uporedite procente elementarnih jona između tretiranih i neobrađenih uzoraka da biste razumeli akumulaciju elementarnih jona tokom formiranja ugruška i homogenost ugruška.
Debljina Cp HFFC površinskog premaza na površini Ct određena je pomoću FESEM-a.Poprečni presjeci Cp NFRCS-a su izrezani iz okvira i premazani prskanjem.Dobijeni uzorci prevlake raspršivanjem promatrani su pomoću FESEM-a i mjerena je debljina površinskog premaza 34, 35, 36 .
Rentgenski mikro-CT pruža 3D nedestruktivno snimanje visoke rezolucije i omogućava vam da proučavate unutrašnji strukturni raspored NFRK-a.Micro-CT koristi snop rendgenskih zraka koji prolazi kroz uzorak za snimanje lokalnog linearnog koeficijenta prigušenja rendgenskih zraka u uzorku, što pomaže da se dobiju morfološke informacije.Unutrašnja lokacija Ct u Cp NFRCS i krvlju tretiranog Cp NFRCS ispitana je mikro-CT radi razumijevanja efikasnosti apsorpcije i zgrušavanja krvi u prisustvu NFRCS37,38,39.3D strukture krvlju tretiranih i netretiranih Cp NFRCS uzoraka rekonstruisane su pomoću mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Njemačka).Koristeći VG STUDIO-MAX softver verziju 2.2, snimljeno je nekoliko rendgenskih snimaka iz različitih uglova (idealno pokrivanje od 360°) kako bi se razvile 3D slike za NFRCS.Prikupljeni projekcijski podaci su rekonstruisani u 3D volumetrijske slike pomoću odgovarajućeg jednostavnog 3D ScanIP Academic softvera.
Osim toga, da bi se razumjela distribucija ugruška, 20 µl prethodno pomiješane citrirane krvi i 20 µl 0,2 M CaCl2 dodano je u NFRCS da se započne zgrušavanje krvi.Pripremljeni uzorci se ostavljaju da se stvrdnu.Površina NFRK-a je tretirana 0,5% glutaraldehida i sušena u pećnici na vrući zrak na 30-40°C 30 min.Krvni ugrušak formiran na NFRCS je skeniran, rekonstruiran i vizualizirana je 3D slika krvnog ugruška.
Antibakterijski testovi su rađeni na Cp NFRCS (najbolje u poređenju sa Ch NFRCS) koristeći prethodno opisanu metodu uz manje modifikacije.Antibakterijska aktivnost Cp NFRCS i Cp HFFC određena je korištenjem tri različita test mikroorganizma [S.aureus (gram-pozitivne bakterije), E.coli (gram-negativne bakterije) i bijela Candida (C.albicans)] koji rastu na agaru u Petrijevim posudama u inkubatoru.Ravnomjerno inokulirajte 50 ml razrijeđene suspenzije bakterijske kulture u koncentraciji od 105-106 CFU ml-1 na agar medij.Sipajte medij u Petrijevu posudu i ostavite da se stvrdne.Na površini agar ploče napravljene su jažice za punjenje HFFC (3 jažice za HFFC i 1 za negativnu kontrolu).Dodajte 200 µl HFFC u 3 jažice i 200 µl pH 7,4 PBS u četvrtu jažicu.Na drugu stranu petrijeve posude stavite 12 mm Cp NFRCS disk na očvrsnuti agar i navlažite ga PBS (pH 7,4).Tablete ciprofloksacina, ampicilina i flukonazola smatraju se referentnim standardima za Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans.Ručno izmjerite zonu inhibicije i snimite digitalnu sliku zone inhibicije.
Nakon institucionalnog etičkog odobrenja, studija je provedena na Kasturba Medical College of Education and Research u Manipalu, Karnataka, u južnoj Indiji.Eksperimentalni protokol in vitro TEG pregledao je i odobrio Institucionalni etički komitet Medicinskog fakulteta Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Ispitanici su regrutovani od dobrovoljnih davalaca krvi (starosti od 18 do 55 godina) iz bolničke banke krvi.Osim toga, od volontera je pribavljen obrazac informiranog pristanka za uzimanje uzoraka krvi.Nativni TEG (N-TEG) ​​je korišten za proučavanje učinka formulacije Cp HFFC na punu krv pomiješanu s natrijum citratom.N-TEG je široko poznat po svojoj ulozi u reanimaciji na licu mjesta, što stvara probleme kliničarima zbog potencijala klinički značajnog kašnjenja rezultata (rutinski testovi koagulacije).N-TEG analiza je izvršena korištenjem pune krvi.Od svih učesnika dobijeni su informirani pristanak i detaljna medicinska istorija.Studija nije uključivala sudionike s hemostatskim ili trombotičkim komplikacijama kao što su trudnoća/postporođaj ili bolest jetre.Ispitanici koji su uzimali lijekove koji utiču na kaskadu koagulacije također su bili isključeni iz studije.Osnovni laboratorijski testovi (hemoglobin, protrombinsko vrijeme, aktivirani tromboplastin i broj trombocita) obavljeni su kod svih učesnika prema standardnim procedurama.N-TEG određuje viskoelastičnost krvnog ugruška, početnu strukturu ugruška, interakciju čestica, jačanje ugruška i lizu ugruška.N-TEG analiza daje grafičke i numeričke podatke o kolektivnim efektima nekoliko ćelijskih elemenata i plazme.N-TEG analiza je izvršena na dvije različite zapremine Cp HFFC (10 µl i 50 µl).Kao rezultat toga, 1 ml pune krvi sa limunskom kiselinom je dodan u 10 μl Cp HFFC.Dodajte 1 ml (Cp HFFC + citrirana krv), 340 µl miješane krvi u 20 µl 0,2 M CaCl2 koji sadrži TEG posudu.Nakon toga, TEG posude su stavljene u TEG® 5000, SAD za mjerenje R, K, alfa ugla, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% uzoraka krvi u prisustvu Cp HFFC41.
Protokol studije in vivo pregledao je i odobrio Institucionalni komitet za etiku životinja (IAEC), Medicinski fakultet Kasturba, Institut za visoko obrazovanje Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u skladu sa preporukama Komiteta za kontrolu i nadzor pokusa na životinjama (CPCSEA).Sve in vivo NFRCS studije (2 × 2 cm2) izvedene su na ženkama Wistar pacova (težine 200 do 250 g).Sve životinje su aklimatizovane na temperaturi od 24-26°C, životinje su imale slobodan pristup standardnoj hrani i vodi ad libitum.Sve životinje su nasumično podijeljene u različite grupe, svaka grupa se sastojala od tri životinje.Sve studije su izvedene u skladu sa Studijama na životinjama: Izveštaj in vivo eksperimenata 43 .Prije ispitivanja životinje su anestezirane intraperitonealnom (ip) primjenom mješavine od 20-50 mg ketamina (po 1 kg tjelesne težine) i 2-10 mg ksilazina (po 1 kg tjelesne težine).Nakon studije, volumen krvarenja je izračunat procjenom razlike između početne i konačne težine uzoraka, a kao volumen krvarenja uzorka uzeta je prosječna vrijednost dobijena iz tri testa.
Model amputacije repa štakora je implementiran kako bi se razumio potencijal NFRCS-a da modulira krvarenje u traumi, borbi ili saobraćajnoj nesreći (model ozljede).Odrežite 50% repa oštricom skalpela i stavite na zrak na 15 s kako biste osigurali normalno krvarenje.Osim toga, test uzorci su stavljeni na rep pacova primjenom pritiska (Ct, Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS).Krvarenje i PCT su prijavljeni za uzorke (n = 3)17,45.
Efikasnost kontrole pritiska NFRCS u borbi ispitana je na modelu površinske femoralne arterije.Femoralna arterija je otkrivena, probušena trokarom 24G i krvari u roku od 15 sekundi.Nakon što se uoči nekontrolisano krvarenje, uzorak se stavlja na mesto uboda uz pritisak.Neposredno nakon nanošenja testnog uzorka, zabilježeno je vrijeme zgrušavanja i opažena je hemostatska efikasnost u narednih 5 minuta.Isti postupak je ponovljen sa Cs i Ct46.
Dowling et al.47 predložio je model ozljede jetre za procjenu hemostatskog potencijala hemostatskih materijala u kontekstu intraoperativnog krvarenja.BCT je snimljen za uzorke Ct (negativna kontrola), Cs okvir (pozitivna kontrola), Ch NFRCS uzorke i Cp NFRCS uzorke.Suprahepatična vena pacova je otkrivena izvođenjem medijalne laparotomije.Nakon toga makazama je izrezan distalni dio lijevog režnja.Sečivom skalpela napravite rez na jetri i ostavite da krvari nekoliko sekundi.Precizno izvagani testni uzorci Ch NFRCS i Cp NFRCS stavljeni su na oštećenu površinu bez pozitivnog pritiska i BCT je snimljen.Kontrolna grupa (Ct) je zatim izvršila pritisak, a zatim Cs 30 s47 bez nanošenja povrede.
In vivo testovi zacjeljivanja rana izvedeni su korištenjem ekscizijskog modela rane kako bi se procijenila svojstva zacjeljivanja rana razvijenih NFRCS-ova na bazi polimera.Modeli ekscizijskih rana odabrani su i izvedeni prema ranije objavljenim metodama uz manje modifikacije19,32,48.Sve životinje su anestezirane kao što je prethodno opisano.Upotrijebite bušilicu za biopsiju (12 mm) da napravite kružni duboki rez na koži leđa.Pripremljena mjesta rane su obložena Cs (pozitivna kontrola), Ct (priznajući da pamučni jastučići ometaju zarastanje), Ch NFRCS i Cp NFRCS (eksperimentalna grupa) i negativnom kontrolom bez ikakvog tretmana.Svakog dana istraživanja mjerena je površina rane kod svih pacova.Digitalnim fotoaparatom snimite područje rane i stavite novi zavoj.Postotak zatvaranja rane mjeren je sljedećom formulom:
Na osnovu procenta zatvaranja rane 12. dana istraživanja, koža pacova najbolje grupe je izrezana ((Cp NFRCS) i kontrolna grupa) i proučavana H&E bojenjem i Massonovim trihromskim bojenjem. Na osnovu procenta zatvaranja rane 12. dana istraživanja, koža pacova najbolje grupe je izrezana ((Cp NFRCS) i kontrolna grupa) i proučavana H&E bojenjem i Massonovim trihromskim bojenjem.Na osnovu procenta zatvaranja rane 12. dana istraživanja, koža pacova najbolje grupe ((Cp NFRCS) i kontrolne grupe) je izrezana i pregledana bojenjem hematoksilin-eozinom i Massonovim trihromom.根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大组)的大鼠的大鼠的大鼠的大鼠的大鼠的sin三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比,切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大组)的大鼠的大鼠的大鼠的大鼠的大鼠的大鼠的大鼠的大组眳组)Pacovi u najboljoj grupi ((Cp NFRCS) i kontrolne grupe) su izrezani za bojenje hematoksilin-eozinom i Massonovo trihromsko bojenje na osnovu postotka zatvaranja rane 12. dana studije.Implementirani postupak bojenja proveden je prema prethodno opisanim metodama49,50.Ukratko, nakon fiksacije u 10% formalinu, uzorci su dehidrirani korištenjem niza stupnjevanih alkohola.Koristite mikrotom da dobijete tanke rezove (debljine 5 µm) izrezanog tkiva.Tanki serijski rezovi kontrola i Cp NFRCS tretirani su hematoksilinom i eozinom radi proučavanja histopatoloških promjena.Massonova trihromna boja je korištena za otkrivanje formiranja kolagenih vlakana.Dobiveni rezultati su slijepo proučavani od strane patologa.
Stabilnost Cp NFRCS uzoraka proučavana je na sobnoj temperaturi (25°C ± 2°C/60% RH ± 5%) tokom 12 mjeseci51.Cp NFRCS (površinska promjena boje i rast mikroba) vizualno je pregledan i testiran na otpornost na habanje i BCT prema gore navedenim metodama navedenim u odjeljku Materijali i metode.
Skalabilnost i reproduktivnost Cp NFRCS ispitana je pripremanjem Cp NFRCS veličine 15×15 cm2.Pored toga, uzorci od 30 mg (n = 5) su izrezani iz različitih frakcija Cp NFRCS i BCT proučavanih uzoraka je procijenjen kao što je opisano ranije u odjeljku Metode.
Pokušali smo razviti različite oblike i strukture koristeći Cp NFRCS kompozicije za različite biomedicinske primjene.Takvi oblici ili konfiguracije uključuju konusne briseve za krvarenje iz nosa, stomatološke zahvate i cilindrične briseve za vaginalno krvarenje.
Svi skupovi podataka izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija i analizirani su pomoću ANOVA koristeći Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, Kalifornija, SAD) praćeno Bonferronijevim testom višestrukih poređenja (*p<0.05).
Svi postupci sprovedeni u studijama na ljudima bili su u skladu sa standardima Instituta i Nacionalnog istraživačkog saveta, kao i sa Helsinškom deklaracijom iz 1964. i njenim naknadnim amandmanima, ili sličnim etičkim standardima.Svi učesnici su upoznati sa karakteristikama studije i njenoj dobrovoljnosti.Podaci o učesnicima ostaju povjerljivi nakon što se prikupe.Eksperimentalni protokol in vitro TEG pregledao je i odobrio Institucionalni etički komitet Medicinskog fakulteta Kasturba, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Volonteri su potpisali informirani pristanak za uzimanje uzoraka krvi.
Sve procedure sprovedene u studijama na životinjama sprovedene su u skladu sa Medicinskim fakultetom Kastuba, Institut za visoko obrazovanje Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Svi osmišljeni eksperimenti na životinjama izvedeni su u skladu sa smjernicama Komiteta za kontrolu i nadzor pokusa na životinjama (CPCSEA).Svi autori slijede smjernice ARRIVE.
FTIR spektri svih NFRCS su analizirani i upoređeni sa spektrom hitozana prikazanim na slici 2A.Karakteristični spektralni pikovi hitozana (snimljeni) na 3437 cm-1 (OH i NH rastezanje, preklapanje), 2945 i 2897 cm-1 (CH rastezanje), 1660 cm-1 (NH2 deformacija), 1589 cm-1 (N-H rastezanje 1 cm), (C-H rastezanje1-110 cm), 170 cm-1 –O, sekundarni hidroksil), 993 cm-1 (stretch CO, Bo-OH) 52.53.54.Dodatna tabela S1 prikazuje vrijednosti spektra apsorpcije FTIR NFRCS za hitozan (reporter), čisti hitozan, Cm, Ch i Cp.FTIR spektri svih NFRCS (Cm, Ch i Cp) pokazali su iste karakteristične apsorpcione trake kao i čisti hitozan bez ikakvih značajnih promjena (slika 2A).FTIR rezultati su potvrdili odsustvo hemijskih ili fizičkih interakcija između polimera koji se koriste za razvoj NFRCS, što ukazuje da su korišćeni polimeri inertni.
In vitro karakterizacija Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs.(A) predstavlja kombinovane FTIR spektre sastava hitozana i Cm NFRCS, Ch NFRCS i Cp NFRCS pod kompresijom.(B) a) Stopa uzimanja NFRCS Cm, Ch, Cp i Cg u punoj krvi (n = 3);Ct uzorci su pokazali veći BAR jer pamučni štapić ima veću efikasnost upijanja;b) Krv nakon apsorpcije krvi Ilustracija apsorbiranog uzorka.Grafički prikaz BCT testnog uzorka C (Cp NFRCS je imao najbolji BCT (15 s, n = 3)). Podaci u C, D, E i G su prikazani kao srednja vrijednost ± SD, a trake greške predstavljaju SD, ***p < 0,0001. Podaci u C, D, E i G su prikazani kao srednja vrijednost ± SD, a trake greške predstavljaju SD, ***p < 0,0001. Dannye u C, D, E i G predstavljaju srednje ± standardno otklone, a plan grešaka predstavlja standardno otklone, ***p <0,0001. Podaci u C, D, E i G su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija, a trake greške predstavljaju standardnu ​​devijaciju, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD,误差线代表SD，***p < 0,0001。 Podaci u C, D, E i G pokazuju srednju vrijednost ± standardno otklone, plan grešaka predstavlja standardno otklon, ***p <0,0001. Podaci u C, D, E i G su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija, trake greške predstavljaju standardnu ​​devijaciju, ***p<0,0001.