Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Plodnost ptica zavisi od njihove sposobnosti da skladište dovoljno održive sperme tokom dužeg vremenskog perioda u tubulima za skladištenje sperme (SST).Tačan mehanizam kojim spermatozoidi ulaze, borave i napuštaju SST ostaje kontroverzan.Sperma kokoši šarkasi pokazala je visoku sklonost aglutinaciji, formirajući pokretne filamentne snopove koji sadrže mnogo ćelija.Zbog poteškoća u promatranju pokretljivosti i ponašanja spermatozoida u neprozirnom jajovodu, za proučavanje aglutinacije i pokretljivosti spermatozoida koristili smo mikrofluidni uređaj s mikrokanalnim poprečnim presjekom sličnim onom u spermatozoida.Ova studija govori o tome kako se formiraju snopovi sperme, kako se kreću i njihovoj mogućoj ulozi u produženju boravka spermatozoida u SST.Istraživali smo brzinu sperme i reološko ponašanje kada je protok tečnosti generisan unutar mikrofluidnog kanala hidrostatskim pritiskom (brzina protoka = 33 µm/s).Spermatozoidi imaju tendenciju da plivaju protiv struje (pozitivna reologija) i brzina snopa spermatozoida je značajno smanjena u poređenju sa pojedinačnim spermatozoidima.Uočeno je da se snopovi sperme kreću spiralno i povećavaju dužinu i debljinu kako se regrutuje više pojedinačnih spermatozoida. Uočeni su snopovi sperme kako se približavaju i prianjaju uz bočne stijenke mikrofluidnih kanala kako bi se izbjeglo brisanje brzinom protoka tekućine > 33 µm/s. Uočeni su snopovi sperme kako se približavaju i prianjaju uz bočne stijenke mikrofluidnih kanala kako bi se izbjeglo brisanje brzinom protoka tekućine > 33 µm/s. Bilo je zamijećeno, što se pučki spermatozoidi približavaju i prilipaju bokovim stenkama mikrofluidnih kanala, da bi se izbjeglo smetanje sa skorom potoka tekućine> 33 mkm / s. Uočeno je da se snopovi sperme približavaju i prianjaju na bočne zidove mikrofluidnih kanala kako bi se izbjeglo odnošenje pri brzinama protoka tekućine >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 m/s33 µm/s 扫过. Bilo je zamijećeno, što se pučki spermatozoidi približavaju i prilipaju bokovim stenkama mikrožidkostnog kanala, da bi se izbjeglo smetanje potoka tekućine sa brzinom > 33 mkm/s. Uočeno je da se snopići sperme približavaju i prianjaju na bočne zidove mikrofluidnog kanala kako bi se izbjeglo odnošenje tekućine pri protoku >33 µm/s.Skeniranjem i transmisijskom elektronskom mikroskopom otkriveno je da su snopovi sperme podržani obiljem gustog materijala.Dobijeni podaci pokazuju jedinstvenu pokretljivost spermatozoida Sharkazi pilića, kao i sposobnost spermatozoida da se aglutiniraju i formiraju pokretne snopove, što doprinosi boljem razumijevanju dugotrajnog skladištenja spermatozoida u SMT.
Da bi se postigla oplodnja kod ljudi i većine životinja, sperma i jajašca moraju stići na mjesto oplodnje u pravo vrijeme.Stoga se parenje mora dogoditi prije ili u vrijeme ovulacije.S druge strane, neki sisari, kao što su psi, kao i vrste nesisara, kao što su insekti, ribe, gmizavci i ptice, pohranjuju spermu u svojim reproduktivnim organima na duži vremenski period dok njihova jaja nisu spremna za oplodnju (asinhrona oplodnja 1).Ptice su u stanju da održe održivost spermatozoida sposobnih da oplode jajašca 2-10 nedelja2.
Ovo je jedinstvena karakteristika koja razlikuje ptice od drugih životinja, jer pruža veliku vjerovatnoću oplodnje nakon jedne oplodnje tokom nekoliko sedmica bez istovremenog parenja i ovulacije.Glavni organ za skladištenje sperme, nazvan tubul za skladištenje sperme (SST), nalazi se u unutrašnjim naborima sluzokože na uterovaginalnom spoju.Do danas, mehanizmi pomoću kojih sperma ulazi, boravi i izlazi iz banke sperme nisu u potpunosti shvaćeni.Na osnovu prethodnih studija, postavljene su mnoge hipoteze, ali nijedna od njih nije potvrđena.
Forman4 je pretpostavio da spermatozoidi održavaju svoj boravak u SST šupljini kroz kontinuirano oscilatorno kretanje protiv smjera protoka tekućine kroz proteinske kanale smještene na epitelnim stanicama SST (reologija).ATP je iscrpljen zbog stalne flagelarne aktivnosti potrebne za održavanje spermatozoida u lumenu SST i pokretljivost na kraju opada sve dok se spermatozoidi ne iznesu iz banke sperme protokom tekućine i započnu novo putovanje niz uzlazni jajovod kako bi oplodili spermu.Jaje (Forman4).Ovaj model skladištenja sperme podržan je detekcijom imunocitohemijom akvaporina 2, 3 i 9 prisutnih u epitelnim ćelijama SST.Do danas nedostaju studije o reologiji pilećeg sjemena i njegovoj ulozi u skladištenju SST, odabiru vaginalne sperme i konkurenciji spermatozoida.Kod pilića, sperma ulazi u vaginu nakon prirodnog parenja, ali više od 80% spermatozoida se izbacuje iz vagine ubrzo nakon parenja.Ovo sugerira da je vagina primarno mjesto za odabir sperme kod ptica.Osim toga, objavljeno je da manje od 1% spermatozoida oplođenih u vagini završi u SST2.Kod vještačke oplodnje pilića u vagini, broj spermatozoida koji dostižu SST ima tendenciju povećanja 24 sata nakon oplodnje.Do sada je mehanizam selekcije spermatozoida tokom ovog procesa nejasan, a pokretljivost spermatozoida može igrati važnu ulogu u preuzimanju SST spermatozoida.Zbog debelih i neprozirnih zidova jajovoda, teško je direktno pratiti pokretljivost spermatozoida u jajovodima ptica.Stoga nam nedostaje osnovno znanje o tome kako spermatozoidi prelaze u SST nakon oplodnje.
Reologija je nedavno prepoznata kao važan faktor koji kontroliše transport sperme u genitalijama sisara.Na osnovu sposobnosti pokretnih spermatozoida da migriraju protivstrujno, Zaferani i saradnici 8 su koristili mikrofluidni sistem corra da pasivno izoluju pokretne spermatozoide iz uzoraka sperme.Ova vrsta sortiranja sjemena je neophodna za medicinsko liječenje neplodnosti i klinička istraživanja, i preferira se u odnosu na tradicionalne metode koje zahtijevaju vrijeme i rad i mogu ugroziti morfologiju sperme i strukturni integritet.Međutim, do danas nisu provedene studije o utjecaju sekreta iz genitalnih organa pilića na pokretljivost spermatozoida.
Bez obzira na mehanizam koji održava spermu pohranjenu u SST-u, mnogi istraživači su primijetili da se rezidentni spermatozoidi međusobno aglutiniraju u SST-u pilića 9, 10, prepelica 2 i purana 11 kako bi formirali aglutinirane snopove sperme.Autori sugeriraju da postoji veza između ove aglutinacije i dugotrajnog skladištenja spermatozoida u SST.
Tingari i Lake12 su izvijestili o snažnoj povezanosti između spermatozoida u žlijezdi piletine koja prima spermu i postavili pitanje da li se spermatozoidi ptica aglutiniraju na isti način kao spermatozoidi sisara.Vjeruju da duboke veze između spermatozoida u sjemenovodu mogu biti posljedica stresa uzrokovanog prisustvom velikog broja spermatozoida u malom prostoru.
Prilikom procjene ponašanja spermatozoida na svježim visećim staklenim predmetima, mogu se uočiti prolazni znakovi aglutinacije, posebno na rubovima kapljica sjemena.Međutim, aglutinacija je često bila poremećena rotacijskim djelovanjem povezanim s kontinuiranim kretanjem, što objašnjava prolaznu prirodu ovog fenomena.Istraživači su također primijetili da kada se razrjeđivač doda sjemenu, pojavljuju se izduženi agregati ćelija u obliku niti.
Rani pokušaji oponašanja spermatozoida napravljeni su uklanjanjem tanke žice sa viseće kapi, što je rezultiralo izduženim mjehurićem nalik spermi koji viri iz kapi sjemena.Spermatozoidi su se odmah poredali na paralelan način unutar vezikule, ali je cijela jedinica brzo nestala zbog 3D ograničenja.Stoga je za proučavanje aglutinacije spermatozoida potrebno promatrati pokretljivost i ponašanje spermatozoida direktno u izoliranim tubulima za skladištenje sperme, što je teško postići.Stoga je neophodno razviti instrument koji oponaša spermatozoide kako bi podržao studije pokretljivosti spermatozoida i ponašanja aglutinacije.Brillard i saradnici13 su izvijestili da je prosječna dužina tubula za skladištenje sperme kod odraslih pilića 400-600 µm, ali neki SST mogu biti dugi i do 2000 µm.Mero i Ogasawara14 podijelili su sjemenske žlijezde na uvećane i neuvećane tubule za skladištenje sperme, od kojih su oba bila iste dužine (~500 µm) i širine vrata (~38 µm), ali je srednji promjer lumena tubula bio 56,6 i 56,6 µm..11,2 μm, respektivno.U trenutnoj studiji koristili smo mikrofluidni uređaj s veličinom kanala od 200 µm × 20 µm (W × H), čiji je poprečni presjek donekle blizak onom kod pojačanog SST-a.Osim toga, ispitali smo pokretljivost spermatozoida i ponašanje aglutinacije u tekućoj tekućini, što je u skladu s Foremanovom hipotezom da tekućina koju proizvode SST epitelne stanice drži spermu u lumenu u suprotnom (reološkom) smjeru.
Cilj ovog istraživanja bio je da se prevaziđu problemi posmatranja pokretljivosti spermatozoida u jajovodu i da se izbegnu teškoće proučavanja reologije i ponašanja spermatozoida u dinamičnom okruženju.Korišten je mikrofluidni uređaj koji stvara hidrostatički pritisak za simulaciju pokretljivosti spermatozoida u genitalijama pilića.
Kada se kap razblaženog uzorka sperme (1:40) stavi u mikrokanalni uređaj, mogu se identifikovati dve vrste pokretljivosti spermatozoida (izolovani spermatozoidi i vezani spermatozoidi).Osim toga, spermatozoidi su imali tendenciju da plivaju protiv struje (pozitivna reologija; video 1, 2). Iako su snopovi spermatozoida imali manju brzinu od one usamljene sperme (p < 0,001), oni su povećali postotak spermatozoida koji pokazuju pozitivnu reotaksu (p < 0,001; Tabela 2). Iako su snopovi spermatozoida imali manju brzinu od one usamljene sperme (p < 0,001), oni su povećali postotak spermatozoida koji pokazuju pozitivnu reotaksu (p < 0,001; Tabela 2). Iako pučki spermatozoidi imaju veću nisku brzinu, nego u odinih spermatozoida (p < 0,001), oni povećavaju postotak spermatozoida, pokazujući pozitivan reotaksis (p < 0,001; tabela 2). Iako su snopovi spermatozoida imali manju brzinu nego pojedinačni spermatozoidi (p < 0,001), oni su povećali postotak spermatozoida koji pokazuju pozitivnu reotaksu (p < 0,001; Tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度 (p < 0,001)分比 (p < 0,001；表2)）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 羾 显倧 阁分比 (p <0,001 ； 2。。。。。。)））））） Iako je brzina pučkovih spermatozoida bila niža, nego kod pojedinačnih spermatozoida (p < 0,001), oni su povećali postotak spermatozoida s pozitivnom reologijom (p < 0,001; tabela 2). Iako je brzina snopova spermatozoida bila manja od brzine pojedinačnih spermatozoida (p < 0,001), oni su povećali procenat spermatozoida sa pozitivnom reologijom (p < 0,001; tabela 2).Pozitivna reologija za pojedinačne spermatozoide i čuperke procjenjuje se na približno 53% odnosno 85%.
Uočeno je da spermatozoidi šarkasi pilića odmah nakon ejakulacije formiraju linearne snopove, koji se sastoje od desetina jedinki.Ovi pramenovi se vremenom povećavaju u dužini i debljini i mogu ostati in vitro nekoliko sati prije nego što se rasprše (video 3).Ovi filamentozni snopovi su u obliku spermatozoida ehidne koji se formiraju na kraju epididimisa.Utvrđeno je da sperma kokoši šarkaši ima veliku tendenciju aglutinacije i formira mrežasti snop za manje od jedne minute nakon sakupljanja.Ove grede su dinamične i mogu se zalijepiti za sve obližnje zidove ili statične objekte.Iako snopovi sperme smanjuju brzinu spermatozoida, jasno je da makroskopski povećavaju njihovu linearnost.Dužina snopova varira u zavisnosti od broja spermatozoida prikupljenih u snopovima.Izolirana su dva dijela snopa: početni dio, uključujući slobodnu glavu aglutiniranog spermatozoida, i terminalni dio, uključujući rep i cijeli distalni kraj sperme.Korištenjem kamere velike brzine (950 fps) uočene su slobodne glave aglutiniranih spermatozoida u početnom dijelu snopa, odgovorne za pomicanje snopa svojim oscilatornim kretanjem, uvlačeći preostale u snop spiralnim kretanjem (Video 4).Međutim, u dugim čupercima, primijećeno je da su neke slobodne glave sperme zalijepljene za tijelo i krajnji dio čuperka djeluju kao lopatice koje pomažu u pokretanju čuperka.
Dok su u sporom toku tekućine, snopovi sperme se kreću paralelno jedan s drugim, međutim, počinju da se preklapaju i lijepe se za sve što miruje, kako ih ne bi isprao strujni tok kako se brzina protoka povećava.Snopovi se formiraju kada se šačica spermatozoida približi jedna drugoj, počnu se kretati sinhrono i omotati jedan oko drugog, a zatim se zalijepiti za ljepljivu supstancu.Slike 1 i 2 pokazuju kako se spermatozoidi približavaju jedni drugima, formirajući spoj dok se repovi omotaju jedan oko drugog.
Istraživači su primijenili hidrostatički pritisak kako bi stvorili protok tekućine u mikrokanalu za proučavanje reologije sperme.Korišten je mikrokanal veličine 200 µm × 20 µm (Š × V) i dužine 3,6 µm.Koristite mikrokanale između posuda sa špricama postavljenim na krajevima.Korištene su prehrambene boje kako bi kanali bili vidljiviji.
Vežite interkonektivne kablove i pribor za zid.Video je snimljen faznim kontrastnim mikroskopom.Uz svaku sliku, prikazani su faznokontrastne mikroskopije i slike mapiranja.(A) Veza između dva toka opire se strujanju zbog spiralnog kretanja (crvena strelica).(B) Veza između snopa cijevi i zida kanala (crvene strelice), istovremeno su spojeni na dva druga snopa (žute strelice).(C) Snopići sperme u mikrofluidnom kanalu počinju da se povezuju jedni s drugima (crvene strelice), formirajući mrežu snopova sperme.(D) Formiranje mreže snopova sperme.
Kada se kap razrijeđene sperme ubaci u mikrofluidni uređaj i stvori protok, snop sperme se pomiče suprotno smjeru toka.Snopovi dobro prianjaju uz zidove mikrokanala, a slobodne glave u početnom dijelu snopova dobro priliježu uz njih (video 5).Oni se također lijepe za sve stacionarne čestice na svom putu, kao što su krhotine, kako bi se oduprle da ih struja odnese.Vremenom, ovi čuperci postaju dugi filamenti koji zarobljavaju druge pojedinačne spermatozoide i kraće čuperke (Video 6).Kako protok počinje da usporava, dugačke linije sperme počinju da formiraju mrežu linija sperme (Video 7; Slika 2).
Pri velikoj brzini protoka (V > 33 µm/s), spiralna kretanja niti su povećana kao pokušaj da se uhvati mnogo pojedinačnih spermatozoida koji formiraju snopove što bolje odole sili klizanja toka. Pri velikoj brzini protoka (V > 33 µm/s), spiralna kretanja niti su povećana kao pokušaj da se uhvati mnogo pojedinačnih spermatozoida koji formiraju snopove što bolje odole sili klizanja toka. Pri visokoj brzini toka (V > 33 mkm/s) spiralevidnye dviženiâ se usilivaju, pošto oni pokušavaju da poprime mnoštvo pojedinačnih spermatozoida, obrazujućih pučki, koje su bolje protivostoje drejfujućoj silnoj potoci. Pri visokim brzinama protoka (V > 33 µm/s), spiralni pokreti lanaca se povećavaju jer pokušavaju uhvatiti mnoge pojedinačne spermatozoide koji formiraju snopove koji su sposobniji da se odupru sili protoka.在高流速 (V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形 岎 束 ，更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 Pri visokim brzinama toka (V > 33 mkm/s) spiralno kretanje se povećava u pokušaju da zahvati mnoštvo pojedinačnih spermatozoida, obrazujućih pučaka, da bi bolje suprostavili silama drejfa toka. Pri visokim brzinama protoka (V > 33 µm/s), spiralno kretanje filamenata se povećava u pokušaju da se uhvati mnogo pojedinačnih spermatozoida koji formiraju snopove kako bi se bolje oduprli silama strujanja.Takođe su pokušali da pričvrste mikrokanale na bočne zidove.
Snopići sperme su identificirani kao nakupine glava sperme i repa koji se uvijaju pomoću svjetlosne mikroskopije (LM).Snopovi spermatozoida s različitim agregatima također su identificirani kao uvrnute glave i bičevi agregati, višestruki spojeni repovi spermatozoida, glave spermatozoida pričvršćene za rep i glave spermatozoida sa savijenim jezgrama kao više spojenih jezgara.transmisiona elektronska mikroskopija (TEM).Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) pokazala je da su snopovi sperme bili obloženi agregati glava sperme, a agregati sperme pokazuju pričvršćenu mrežu umotanih repova.
Morfologija i ultrastruktura spermatozoida, formiranje snopova spermatozoida proučavani su svjetlosnom mikroskopom (polurez), skenirajućom elektronskom mikroskopom (SEM) i transmisijskom elektronskom mikroskopom (TEM), razmazi sperme su obojeni akridin narandžastom bojom i pregledani epifluorescentnom mikroskopom.
Bojenje razmaza spermatozoida akridin narandžastom (slika 3B) pokazalo je da su glave spermatozoida slepljene i prekrivene sekretornim materijalom, što je dovelo do formiranja velikih čuperaka (slika 3D).Snopići sperme sastojali su se od nakupina sperme sa mrežom pričvršćenih repova (slika 4A-C).Snopići sperme se sastoje od repova mnogih spermatozoida koji su zaglavljeni (slika 4D).Tajne (sl. 4E,F) pokrivale su glave snopova spermatozoida.
Formiranje snopa spermatozoida Korištenjem fazno-kontrastne mikroskopije i razmaza spermatozoida obojenih akridin narandžastom bojom, pokazalo se da se glave spermatozoida lijepe.(A) Rano formiranje spermatozoida počinje sa spermom (bijeli krug) i tri sperme (žuti krug), sa spiralom koja počinje na repu i završava na glavi.(B) Mikrofotografija razmaza sperme obojenog akridin narandžastom bojom na kojoj se vide prianjajuće glave sperme (strelice).Iscjedak pokriva glavu(e).Uvećanje × 1000. (C) Razvoj velikog snopa koji se prenosi protokom u mikrofluidnom kanalu (koristeći kameru velike brzine pri 950 fps).(D) Mikrofotografija razmaza sperme obojenog akridin narandžastom bojom na kojoj se vide veliki čuperci (strelice).Uvećanje: ×200.
Skenirajući elektronski mikrosnimak snopa sperme i razmaza sperme obojenog akridin narandžastom bojom.(A, B, D, E) su digitalne elektronske mikrofotografije spermatozoida sa skeniranjem u boji, a C i F su mikrofotografije razmaza spermatozoida obojenih akridin narandžastom bojom koji pokazuju pričvršćivanje više spermatozoida koji obavijaju kaudalnu mrežu.(AC) Agregati sperme su prikazani kao mreža pričvršćenih repova (strelice).(D) Adhezija nekoliko spermatozoida (sa adhezivnom supstancom, ružičasti obris, strelica) koji se omotavaju oko repa.(E i F) Agregati glava sperme (pokazivači) prekriveni ljepljivim materijalom (pokazivači).Spermatozoidi su formirali snopove sa nekoliko struktura nalik vrtlogu (F).(C) ×400 i (F) ×200 uvećanja.
Koristeći transmisionu elektronsku mikroskopiju, otkrili smo da snopovi sperme imaju pričvršćene repove (slika 6A, C), glave pričvršćene za repove (slika 6B) ili glave pričvršćene za repove (slika 6D).Glave spermatozoida u snopu su zakrivljene i predstavljaju u preseku dva nuklearna regiona (slika 6D).U incizijskom snopu, spermatozoidi su imali uvrnutu glavu sa dva nuklearna regiona i više flagelarnih regiona (slika 5A).
Digitalni elektronski mikrograf u boji koji prikazuje spojne repove u snopu sperme i aglutinirajući materijal koji povezuje glave sperme.(A) Priloženi rep velikog broja spermatozoida.Obratite pažnju na to kako rep izgleda u portretnoj (strelica) i pejzažnoj (strelica) projekciji.(B) Glava (strelica) sperme je povezana sa repom (strelica).(C) Nekoliko repova sperme (strelice) je pričvršćeno.(D) Materijal aglutinacije (AS, plava) povezuje četiri glave sperme (ljubičaste).
Skenirajuća elektronska mikroskopija je korištena za otkrivanje glava sperme u snopovima spermatozoida prekrivenih sekretima ili membranama (slika 6B), što ukazuje da su snopovi sperme usidreni ekstracelularnim materijalom.Aglutinirani materijal koncentrisan je u glavi sperme (sklop nalik na glavu meduze; slika 5B) i proširen distalno, dajući briljantno žuti izgled pod fluorescentnom mikroskopijom kada je obojen akridin narandžastom bojom (slika 6C).Ova supstanca je jasno vidljiva pod skenirajućim mikroskopom i smatra se vezivom.Polutanki preseci (slika 5C) i razmazi sperme obojeni akridin narandžastom bojom pokazali su snopove sperme koji sadrže gusto zbijene glave i uvijene repove (slika 5D).
Različite mikrofotografije koje prikazuju agregaciju glava i savijenih repova spermatozoida različitim metodama.(A) Elektronski mikrograf sa transmisijom digitalnog presjeka u boji snopa sperme koji prikazuje namotanu glavu sperme s dvodijelnim jezgrom (plavo) i nekoliko flagelarnih dijelova (zeleno).(B) Digitalni skenirajući elektronski mikrograf u boji koji prikazuje skup glava spermatozoida nalik na meduze (strelice) koje izgledaju kao da su prekrivene.(C) Polutanki presjek koji prikazuje agregirane glave sperme (strelice) i uvijene repove (strelice).(D) Mikrofotografija razmaza spermatozoida obojenog akridin narandžastom bojom koji prikazuje agregate glava sperme (strelice) i uvijenih prilijepljenih repova (strelice).Imajte na umu da ljepljiva supstanca (S) prekriva glavu spermatozoida.(D) × 1000 uvećanje.
Korištenjem transmisione elektronske mikroskopije (slika 7A), također je uočeno da su glave spermatozoida uvijene i da jezgra imaju spiralni oblik, što je potvrđeno razmazima sperme obojenih akridin narandžastom bojom i pregledanim fluorescentnom mikroskopom (slika 7B).
(A) Elektronski mikrograf sa digitalnim prenosom u boji i (B) razmaz spermatozoida obojen akridin narandžastom bojom koji prikazuje umotane glave i pričvršćenje glava i repa sperme (strelice).(B) × 1000 uvećanje.
Zanimljivo otkriće je da se Šarkazijeva sperma agregira i formira pokretne filamentne snopove.Svojstva ovih snopova nam omogućavaju da shvatimo njihovu moguću ulogu u apsorpciji i skladištenju spermatozoida u SST.
Nakon parenja, spermatozoidi ulaze u vaginu i prolaze kroz intenzivan proces selekcije, što rezultira samo ograničenim brojem spermatozoida koji ulazi u SST15,16.Do danas su nejasni mehanizmi pomoću kojih spermatozoidi ulaze i izlaze iz SST.Kod peradi se spermatozoidi čuvaju u SST-u na duži period od 2 do 10 sedmica, ovisno o vrsti6.Ostaju kontroverze o stanju sperme tokom skladištenja u SST.Jesu li u pokretu ili miruju?Drugim riječima, kako spermatozoidi održavaju svoju poziciju u SST tako dugo?
Forman4 je sugerirao da se zadržavanje i izbacivanje SST-a može objasniti u smislu pokretljivosti spermatozoida.Autori pretpostavljaju da spermatozoidi održavaju svoju poziciju tako što plivaju protiv protoka tečnosti koji stvara epitel SST i da se spermatozoidi izbacuju iz SST-a kada njihova brzina padne ispod tačke u kojoj se počinju kretati unazad zbog nedostatka energije.Zaniboni5 je potvrdio prisustvo akvaporina 2, 3 i 9 u apikalnom dijelu SST epitelnih ćelija, što može indirektno podržati Foremanov model skladištenja sperme.U trenutnoj studiji otkrili smo da skoro polovina Sharkashijevih spermatozoida pokazuje pozitivnu reologiju u tekućoj tekućini i da aglutinirani snopovi sperme povećavaju broj spermatozoida koji pokazuju pozitivnu reologiju, iako ih aglutinacija usporava.Kako spermatozoidi putuju uz jajovod ptice do mjesta oplodnje nije u potpunosti shvaćeno.Kod sisara, folikularna tečnost kemoprivlači spermatozoide.Međutim, vjeruje se da hemoatraktanti usmjeravaju spermatozoide na velike udaljenosti7.Stoga su drugi mehanizmi odgovorni za transport sperme.Sposobnost spermatozoida da se orijentira i teče prema tečnosti jajovoda koja se oslobađa nakon parenja je glavni faktor u ciljanju sperme kod miševa.Parker 17 je sugerirao da spermatozoidi prelaze jajovode plivajući protiv cilijarne struje kod ptica i gmizavaca.Iako to nije eksperimentalno demonstrirano na pticama, Adolphi18 je bio prvi koji je otkrio da ptičja sperma daje pozitivne rezultate kada se tanak sloj tekućine između pokrovnog stakla i stakalca stvori trakom filter papira.Reologija.Hino i Yanagimachi [19] postavili su mišji kompleks jajnik-tubal-uterina u perfuzijski prsten i ubrizgali 1 µl mastila u isthmus da bi vizualizirali protok tekućine u jajovodima.Primijetili su vrlo aktivno kretanje kontrakcije i opuštanja u jajovodu, u kojem su se sve kuglice tinte stalno kretale prema ampuli jajovoda.Autori ističu važnost protoka jajovodne tečnosti od donjih ka gornjim jajovodima za podizanje i oplodnju spermatozoida.Brillard20 je izvijestio da kod pilića i purana spermatozoidi migriraju aktivnim kretanjem od vaginalnog ulaza, gdje se pohranjuju, do utero-vaginalnog spoja, gdje se pohranjuju.Međutim, ovo kretanje nije potrebno između uterovaginalnog spoja i infundibuluma jer se spermatozoidi transportuju pasivnim pomicanjem.Poznavajući ove prethodne preporuke i rezultate dobijene u trenutnoj studiji, može se pretpostaviti da je sposobnost spermatozoida da se kreću uzvodno (reologija) jedno od svojstava na kojima se zasniva proces selekcije.Ovo određuje prolaz spermatozoida kroz vaginu i njihov ulazak u CCT radi skladištenja.Kao što je Forman4 sugerirao, ovo također može olakšati proces ulaska sperme u SST i njegovo stanište na određeni vremenski period, a zatim izlaska kada njihova brzina počne da se usporava.
S druge strane, Matsuzaki i Sasanami 21 sugerirali su da spermatozoidi ptica prolaze kroz promjene pokretljivosti od mirovanja do pokretljivosti u muškom i ženskom reproduktivnom traktu.Inhibicija rezidentne pokretljivosti spermatozoida u SST-u je predložena kako bi se objasnilo dugo vrijeme skladištenja sperme, a zatim i podmlađivanje nakon napuštanja SST-a.U uslovima hipoksije, Matsuzaki et al.1 je prijavio visoku proizvodnju i oslobađanje laktata u SST, što može dovesti do inhibicije pokretljivosti rezidentnih spermatozoida.U ovom slučaju, važnost reologije sperme ogleda se u odabiru i apsorpciji spermatozoida, a ne u njihovom skladištenju.
Obrazac aglutinacije sperme smatra se uvjerljivim objašnjenjem za dug period skladištenja sperme u SST, jer je ovo uobičajen obrazac zadržavanja sperme kod peradi2,22,23.Bakst et al.2 primijetio je da se većina spermatozoida prijanja jedna za drugu, formirajući fascikularne agregate, a pojedinačni spermatozoidi rijetko su pronađeni u CCM prepelica.S druge strane, Wen et al.24 su uočili više rasutih spermatozoida i manje čuperaka spermatozoida u SST lumenu kod pilića.Na osnovu ovih zapažanja, može se pretpostaviti da se sklonost aglutinaciji spermatozoida razlikuje između ptica i između spermatozoida u istom ejakulatu.Osim toga, Van Krey et al.9 sugerira da je nasumična disocijacija aglutiniranih spermatozoida odgovorna za postepeno prodiranje spermatozoida u lumen jajovoda.Prema ovoj hipotezi, spermatozoide sa nižim kapacitetom aglutinacije treba prvo izbaciti iz SST.U tom kontekstu, sposobnost spermatozoida da aglutiniraju može biti faktor koji utiče na ishod nadmetanja spermatozoida kod prljavih ptica.Osim toga, što se duže aglutinirani spermatozoidi disocira, to se duže održava plodnost.
Iako je agregacija spermatozoida i agregacija u snopove uočena u nekoliko studija2,22,24, oni nisu detaljno opisani zbog složenosti njihovog kinematičkog posmatranja unutar SST.Učinjeno je nekoliko pokušaja da se proučava aglutinacija sperme in vitro.Opsežna, ali prolazna agregacija uočena je kada je tanka žica uklonjena sa viseće kapi sjemena.To dovodi do činjenice da izduženi mjehur viri iz kapi, imitirajući sjemenu žlijezdu.Zbog 3D ograničenja i kratkog vremena sušenja, cijeli blok je brzo propao9.U trenutnoj studiji, koristeći Sharkashi piliće i mikrofluidni čips, uspjeli smo opisati kako se ovi pramenovi formiraju i kako se kreću.Snopići sperme su se formirali odmah nakon prikupljanja sperme i utvrđeno je da se kreću spiralno, pokazujući pozitivnu reologiju kada su prisutni u toku.Nadalje, kada se posmatra makroskopski, uočeno je da snopovi sperme povećavaju linearnost pokretljivosti u poređenju sa izolovanim spermatozoidima.Ovo sugerira da se aglutinacija spermatozoida može dogoditi prije penetracije SST-a i da proizvodnja sperme nije ograničena na malu površinu zbog stresa kao što je prethodno sugerirano (Tingari i Lake12).Tokom formiranja čuperka, spermatozoidi plivaju sinhronizovano dok ne formiraju spoj, zatim im se repovi omotaju jedan oko drugog i glava spermatozoida ostaje slobodna, ali se rep i distalni deo spermatozoida drže zajedno sa lepljivom supstancom.Stoga je slobodna glava ligamenta odgovorna za kretanje, povlačeći ostatak ligamenta.Skenirajuća elektronska mikroskopija snopova spermatozoida pokazala je pričvršćene glave sperme prekrivene puno ljepljivog materijala, što sugerira da su glave sperme bile pričvršćene u snopićima u mirovanju, što se moglo dogoditi nakon dolaska na mjesto skladištenja (SST).
Kada je razmaz sperme obojen akridin narandžastom bojom, ekstracelularni adhezivni materijal oko spermatozoida može se vidjeti pod fluorescentnim mikroskopom.Ova supstanca omogućava snopovima sperme da se prianjaju i prianjaju za sve okolne površine ili čestice, tako da ne plivaju s okolnim tokom.Dakle, naša zapažanja pokazuju ulogu adhezije spermatozoida u obliku mobilnih snopova.Njihova sposobnost da plivaju protiv struje i drže se za obližnje površine omogućava spermi da duže ostane u SST.
Rothschild25 je koristio kameru za hemocitometriju za proučavanje plutajuće distribucije goveđeg sjemena u kapi suspenzije, uzimajući fotomikrografije kroz kameru s vertikalnom i horizontalnom optičkom osom mikroskopa.Rezultati su pokazali da su spermatozoidi privučeni površinom komore.Autori sugeriraju da mogu postojati hidrodinamičke interakcije između sperme i površine.Uzimajući ovo u obzir, zajedno sa sposobnošću sjemena pilića Sharkashi da formira ljepljive čuperke, može povećati vjerovatnoću da će se sperma pričvrstiti na SST zid i biti pohranjena tokom dužeg vremenskog perioda.
Bccetti i Afzeliu26 su izvijestili da je glikokaliks sperme potreban za prepoznavanje i aglutinaciju gameta.Forman10 je primijetio da je hidroliza α-glikozidnih veza u glikoprotein-glikolipidnim prevlakama tretiranjem ptičjeg sjemena neuraminidazom rezultirala smanjenom plodnošću bez utjecaja na pokretljivost spermatozoida.Autori sugeriraju da učinak neuraminidaze na glikokaliks otežava sekvestraciju sperme na utero-vaginalnom spoju, čime se smanjuje plodnost.Njihova zapažanja ne mogu zanemariti mogućnost da liječenje neuraminidazom može smanjiti prepoznavanje spermatozoida i oocita.Forman i Engel10 su otkrili da je plodnost smanjena kada su kokoši intravaginalno oplodene sjemenom tretiranom neuraminidazom.Međutim, IVF sa spermom tretiranom neuraminidazom nije utjecao na plodnost u poređenju sa kontrolnim pilićima.Autori su zaključili da promjene u glikoprotein-glikolipidnom omotaču oko membrane spermatozoida smanjuju sposobnost spermatozoida da se oplode narušavajući sekvestraciju sperme na utero-vaginalnom spoju, što zauzvrat povećava gubitak sperme zbog brzine utero-vaginalnog spoja, a ne utiče na spermatozoid.
Kod purana Bakst i Bauchan 11 su pronašli male vezikule i fragmente membrane u lumenu SST-a i uočili da su se neke od ovih granula spojile sa membranom sperme.Autori sugeriraju da ovi odnosi mogu doprinijeti dugoročnom skladištenju spermatozoida u SST.Međutim, istraživači nisu precizirali izvor ovih čestica, da li ih luče CCT epitelne ćelije, proizvode i luče muški reproduktivni sistem ili proizvodi sama sperma.Takođe, ove čestice su odgovorne za aglutinaciju.Grützner et al27 izvijestili su da epididimalne epitelne stanice proizvode i luče specifičan protein koji je neophodan za formiranje sjemenih puteva s jednom porama.Autori također navode da disperzija ovih snopova ovisi o interakciji epididimalnih proteina.Nixon i saradnici28 su otkrili da adneksi luče protein, kiseli osteonektin bogat cisteinom;SPARC je uključen u formiranje čuperaka spermatozoida kod kratkokljunih ehidna i platipusa.Rasipanje ovih zraka povezano je sa gubitkom ovog proteina.
U trenutnoj studiji, ultrastrukturna analiza pomoću elektronske mikroskopije pokazala je da su spermatozoidi prianjali za veliku količinu gustog materijala.Smatra se da su ove tvari odgovorne za aglutinaciju koja se kondenzira između i oko prianjajućih glava, ali u nižim koncentracijama u regiji repa.Pretpostavljamo da se ova aglutinirajuća supstanca izlučuje iz muškog reproduktivnog sistema (epididimisa ili vas deferensa) zajedno sa sjemenom, jer često uočavamo da se sperma odvaja od limfe i sjemene plazme tokom ejakulacije.Prijavljeno je da dok ptičji spermatozoidi prolaze kroz epididimis i semenovod, prolaze kroz promjene vezane za sazrijevanje koje podržavaju njihovu sposobnost da vežu proteine ​​i stječu glikoproteine ​​povezane s lemom plazme.Postojanost ovih proteina na rezidentnim membranama spermatozoida u SST-u sugerira da ovi proteini mogu utjecati na stjecanje stabilnosti membrane sperme 30 i odrediti njihovu plodnost 31 .Ahammad i saradnici32 su objavili da spermatozoidi dobijeni iz različitih dijelova muškog reproduktivnog sistema (od testisa do distalnog sjemenovoda) pokazuju progresivno povećanje vitalnosti u uvjetima skladištenja u tekućini, bez obzira na temperaturu skladištenja, a održivost kod pilića također se povećava u jajovodima nakon umjetne oplodnje.
Šarkaši pileći spermatozoidi imaju različite karakteristike i funkcije od drugih vrsta kao što su ehidne, kljunasi, šumski miševi, jelenski štakori i zamorci.Kod pilića šarkasi, formiranje snopova spermatozoida smanjilo je njihovu brzinu plivanja u poređenju sa pojedinačnim spermatozoidima.Međutim, ovi snopovi su povećali postotak reološki pozitivnih spermatozoida i povećali sposobnost spermatozoida da se stabiliziraju u dinamičnom okruženju.Dakle, naši rezultati potvrđuju prethodnu sugestiju da je aglutinacija spermatozoida u SST povezana s dugotrajnim skladištenjem sperme.Također pretpostavljamo da sklonost spermatozoida da formiraju čuperke može kontrolirati stopu gubitka sperme u SST, što može promijeniti ishod nadmetanja spermatozoida.Prema ovoj pretpostavci, spermatozoidi sa niskim kapacitetom aglutinacije prvo oslobađaju SST, dok spermatozoidi sa visokim kapacitetom aglutinacije proizvode većinu potomstva.Formiranje snopova sperme s jednom porama je korisno i utiče na omjer roditelja i djece, ali koristi drugačiji mehanizam.Kod ehidna i platipusa, spermatozoidi su raspoređeni paralelno jedan s drugim kako bi se povećala brzina snopa naprijed.Snopovi ehidna kreću se oko tri puta brže od pojedinačnih spermatozoida.Vjeruje se da je formiranje takvih čuperaka sperme kod ehidna evolucijska adaptacija za održavanje dominacije, budući da su ženke promiskuitetne i obično se pare s nekoliko mužjaka.Stoga se spermatozoidi iz različitih ejakulata žestoko nadmeću za oplodnju jajne stanice.
Aglutinirane spermatozoide šarkasi pilića lako je vizualizirati uz pomoć faznog kontrastnog mikroskopa, što se smatra povoljnim jer omogućava lako proučavanje ponašanja spermatozoida in vitro.Mehanizam kojim formiranje spermatozoida potiče reprodukciju kod šarkasi pilića također se razlikuje od onog koji se vidi kod nekih placentnih sisara koji predstavljaju kooperativno ponašanje spermatozoida, kao što su šumski miševi, gdje neki spermatozoidi dospiju do jaja, pomažući drugim srodnim jedinkama da dosegnu i oštete svoja jajašca.da se dokažeš.altruističkog ponašanja.Samooplodnja 34. Još jedan primjer kooperativnog ponašanja kod spermatozoida pronađen je kod miševa jelena, gdje su spermatozoidi bili u stanju da identifikuju i kombinuju se sa genetski najsrodnijim spermatozoidima i formiraju kooperativne grupe kako bi povećali svoju brzinu u poređenju sa nepovezanim spermatozoidima35.
Rezultati dobijeni u ovoj studiji nisu u suprotnosti sa Fomanovom teorijom dugotrajnog skladištenja spermatozoida u SWS.Istraživači izvještavaju da se spermatozoidi nastavljaju kretati u toku epitelnih stanica koje oblažu SST kroz duži vremenski period, a nakon određenog vremenskog perioda, zalihe energije spermatozoida se iscrpljuju, što rezultira smanjenjem brzine, što omogućava izbacivanje tvari male molekularne težine.energija spermatozoida sa protokom tečnosti iz lumena SST šupljine jajovoda.U trenutnoj studiji, uočili smo da polovina pojedinačnih spermatozoida pokazuje sposobnost da pliva protiv tekućine koja teče, a njihova adhezija u snopu povećala je njihovu sposobnost da pokažu pozitivnu reologiju.Nadalje, naši podaci su u skladu s onima Matsuzaki et al.1 koji je izvijestio da povećano lučenje laktata u SST može inhibirati rezidentnu pokretljivost spermatozoida.Međutim, naši rezultati opisuju formiranje pokretnih ligamenata spermatozoida i njihovo reološko ponašanje u prisustvu dinamičkog okruženja unutar mikrokanala u pokušaju da se razjasni njihovo ponašanje u SST.Buduća istraživanja mogu se fokusirati na određivanje hemijskog sastava i porijekla aglutinirajućeg agensa, što će nesumnjivo pomoći istraživačima da razviju nove načine skladištenja tečnog sjemena i produže trajanje plodnosti.
Petnaest 30-nedeljnih golovratih mužjaka šarkasija (homozigotni dominantni; Na Na) odabrano je kao donori sperme u studiji.Ptice su uzgajane na Istraživačkoj farmi živine Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta Ašit, provincija Ašit, Egipat.Ptice su bile smještene u individualne kaveze (30 x 40 x 40 cm), podvrgnute svjetlosnom programu (16 sati svjetla i 8 sati mraka) i hranjene hranom koja je sadržavala 160 g sirovih proteina, 2800 kcal metabolične energije, po 35 g kalcija.5 grama dostupnog fosfora po kilogramu ishrane.
Prema podacima 36, ​​37, sperma je uzeta od muškaraca masažom abdomena.Ukupno je prikupljeno 45 uzoraka sjemena od 15 muškaraca tokom 3 dana.Sjeme (n = 15/dan) je odmah razrijeđeno 1:1 (v:v) sa Belsville razblaživačem sjemena peradi, koji sadrži kalijum difosfat (1,27 g), mononatrijum glutamat monohidrat (0,867 g), fruktozu (0,5 d) bezvodni natrijum.acetat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometan (0,195 g), kalijum citrat monohidrat (0,064 g), kalijum monofosfat (0,065 g), magnezijum hlorid (0,034 g) i H2O (100 ml), pH = 7,3mol.Razrijeđeni uzorci sjemena prvo su pregledani pod svjetlosnim mikroskopom kako bi se osigurala dobra kvaliteta sjemena (vlaga), a zatim su pohranjeni u vodenom kupatilu na 37°C do upotrebe u roku od pola sata nakon uzimanja.
Kinematika i reologija spermatozoida opisana je pomoću sistema mikrofluidnih uređaja.Uzorci sperme su dalje razrijeđeni na 1:40 u Beltsville Avian Semen Diluentu, ubačeni u mikrofluidni uređaj (vidi dolje), a kinetički parametri su određeni korištenjem sistema za kompjuteriziranu analizu sjemena (CASA) koji je prethodno razvijen za mikrofluidnu karakterizaciju.o mobilnosti spermatozoida u tečnim medijima (Departman za mašinstvo, Fakultet inženjerskih nauka, Univerzitet Asiut, Egipat).Dodatak se može preuzeti na: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Izmjerena je brzina krivulje (VCL, μm/s), linearna brzina (VSL, μm/s) i prosječna brzina putanje (VAP, μm/s).Video zapisi spermatozoida snimljeni su pomoću invertovanog mikroskopa s faznim kontrastom Optika XDS-3 (sa objektivom 40x) spojenog na Tucson ISH1000 kameru pri 30 fps u trajanju od 3 s.Koristite CASA softver za proučavanje najmanje tri područja i 500 putanja sperme po uzorku.Snimljeni video je obrađen pomoću kućne CASA.Definicija pokretljivosti u CASA dodatku zasniva se na brzini plivanja spermatozoida u poređenju sa brzinom protoka i ne uključuje druge parametre kao što je kretanje s jedne na drugu stranu, jer se pokazalo da je to pouzdanije u protoku tekućine.Reološko kretanje se opisuje kao kretanje spermatozoida u suprotnom smjeru protoka tekućine.Spermatozoidi sa reološkim svojstvima podijeljeni su brojem pokretnih spermatozoida;spermatozoidi koji su bili u mirovanju i spermatozoidi koji se konvektivno kreću bili su isključeni iz brojanja.
Sve korištene kemikalije dobivene su od Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egipat) osim ako nije drugačije naznačeno.Uređaj je proizveden kako su opisali El-sherry et al.40 sa nekim modifikacijama.Materijali koji su korišteni za izradu mikrokanala uključivali su staklene ploče (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negativnu otpornost (MicroChem, Newton, CA), diacetonski alkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Njemačka) i poliaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Mikrokanali se proizvode mekom litografijom.Prvo je na štampaču visoke rezolucije (Prismatic, Kairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON) štampana prozirna zaštitna maska ​​za lice sa željenim dizajnom mikrokanala.Majstori su rađeni sa staklenim pločama kao podlogama.Ploče su očišćene u acetonu, izopropanolu i deioniziranoj vodi, a zatim premazane 20 µm slojem SU8-25 centrifugiranjem (3000 o/min, 1 min).Slojevi SU-8 su zatim lagano osušeni (65°C, 2 min i 95°C, 10 min) i izloženi UV zračenju 50 s.Peći nakon ekspozicije na 65°C i 95°C u trajanju od 1 min i 4 min kako bi se poprečno povezali izloženi SU-8 slojevi, nakon čega je slijedilo razvijanje u diaceton alkoholu u trajanju od 6,5 min.Čvrsto pecite vafle (200°C 15 min) kako bi se sloj SU-8 dodatno stvrdnuo.
PDMS je pripremljen miješanjem monomera i učvršćivača u težinskom omjeru 10:1, zatim degasiran u vakuum eksikatoru i izliven na glavni okvir SU-8.PDMS je osušen u pećnici (120°C, 30 min), zatim su kanali izrezani, odvojeni od glavnog i perforirani kako bi se omogućilo pričvršćivanje cijevi na ulaz i izlaz iz mikrokanala.Konačno, PDMS mikrokanali su trajno pričvršćeni na mikroskopske pločice pomoću prijenosnog korona procesora (Electro-Technic Products, Chicago, IL) kao što je opisano na drugom mjestu.Mikrokanal korišten u ovoj studiji ima dimenzije 200 µm × 20 µm (Š × V) i dug je 3,6 cm.
Protok fluida izazvan hidrostatskim pritiskom unutar mikrokanala postiže se održavanjem nivoa tečnosti u ulaznom rezervoaru iznad visinske razlike Δh39 u izlaznom rezervoaru (slika 1).
gde je f koeficijent trenja, definisan kao f = C/Re za laminarni tok u pravougaonom kanalu, gde je C konstanta koja zavisi od aspekta kanala, L je dužina mikrokanala, Vav je prosečna brzina unutar mikrokanala, Dh je hidraulički prečnik kanala, g – ubrzanje gravitacije.Koristeći ovu jednačinu, prosječna brzina kanala može se izračunati pomoću sljedeće jednačine: