Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Plodnost ptica zavisi od njihove sposobnosti da skladište dovoljno održive sperme tokom dužeg vremenskog perioda u tubulima za skladištenje sperme (SST). Tačan mehanizam kojim spermatozoidi ulaze, borave u i izlaze iz SST ostaje kontroverzan. Sperma kokoši šarkasija pokazala je visoku sklonost aglutinaciji, formirajući mobilne filamentozne snopove koji sadrže mnogo ćelija. Zbog teškoće posmatranja pokretljivosti i ponašanja spermatozoida u neprozirnom jajovodu, koristili smo mikrofluidni uređaj sa poprečnim presjekom mikrokanala sličnim onome kod spermatozoida kako bismo proučili aglutinaciju i pokretljivost spermatozoida. Ova studija razmatra kako se snopovi sperme formiraju, kako se kreću i njihovu moguću ulogu u produženju boravka sperme u SST-u. Istražili smo brzinu sperme i reološko ponašanje kada je protok tečnosti generisan unutar mikrofluidnog kanala hidrostatičkim pritiskom (brzina protoka = 33 µm/s). Spermatozoidi imaju tendenciju da plivaju protiv struje (pozitivna reologija) i brzina snopa spermatozoida je značajno smanjena u poređenju sa pojedinačnim spermatozoidima. Primijećeno je da se snopovi spermatozoida kreću spiralno i povećavaju dužinu i debljinu kako se regrutuje više pojedinačnih spermatozoida. Uočeno je kako se snopovi sperme približavaju i prianjaju uz bočne zidove mikrofluidnih kanala kako bi se izbjeglo da ih pomete brzina protoka fluida > 33 µm/s. Uočeno je kako se snopovi sperme približavaju i prianjaju uz bočne zidove mikrofluidnih kanala kako bi se izbjeglo da ih pomete brzina protoka fluida > 33 µm/s. Bilo je zamijećeno, što se pučki spermatozoidi približavaju i prilipaju bokovim stenkama mikrofluidnih kanala, da bi se izbjeglo smetanje sa skorom potoka tekućine> 33 mkm / s. Primijećeno je da se snopovi sperme približavaju i prianjaju uz bočne zidove mikrofluidnih kanala kako bi izbjegli da budu odneseni pri brzinama protoka tekućine >33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 m/s33 µm/s 扫过. Bilo je zamijećeno, što se pučki spermatozoidi približavaju i prilipaju bokovim stenkama mikrožidkostnog kanala, da bi se izbjeglo smanjenje potoka tekućine sa brzinom > 33 mkm/s. Primijećeno je da se snopovi sperme približavaju i prianjaju uz bočne zidove mikrofluidnog kanala kako bi izbjegli da ih odnese protok tekućine brzinom većom od 33 µm/s.Skenirajuća i transmisijska elektronska mikroskopija otkrile su da su snopovi sperme podržani obilnim gustim materijalom. Dobijeni podaci pokazuju jedinstvenu pokretljivost spermatozoida pilića Sharkazi, kao i sposobnost spermatozoida da se aglutiniraju i formiraju mobilne snopove, što doprinosi boljem razumijevanju dugotrajnog skladištenja spermatozoida u SMT-u.
Da bi došlo do oplodnje kod ljudi i većine životinja, sperma i jajne ćelije moraju stići na mjesto oplodnje u pravo vrijeme. Stoga se parenje mora dogoditi prije ili u vrijeme ovulacije. S druge strane, neki sisari, poput pasa, kao i vrste koje nisu sisari, poput insekata, riba, gmizavaca i ptica, skladište spermu u svojim reproduktivnim organima duži vremenski period dok im jajne ćelije ne budu spremne za oplodnju (asinhrona oplodnja 1 ). Ptice su u stanju da održe održivost spermatozoida sposobnih za oplodnju jajnih ćelija 2-10 sedmica2.
Ovo je jedinstvena karakteristika koja razlikuje ptice od drugih životinja, jer pruža visoku vjerovatnoću oplodnje nakon jedne inseminacije tokom nekoliko sedmica bez istovremenog parenja i ovulacije. Glavni organ za skladištenje sperme, nazvan tubul za skladištenje sperme (SST), nalazi se u unutrašnjim naborima sluznice na uterovaginalnom spoju. Do danas, mehanizmi kojima sperma ulazi, boravi i izlazi iz banke sperme nisu u potpunosti shvaćeni. Na osnovu prethodnih studija, postavljene su mnoge hipoteze, ali nijedna od njih nije potvrđena.
Forman4 je pretpostavio da spermatozoidi održavaju svoje prebivalište u SST šupljini kontinuiranim oscilatornim kretanjem suprotno od smjera protoka tekućine kroz proteinske kanale smještene na SST epitelnim ćelijama (reologija). ATP se iscrpljuje zbog stalne flagelarne aktivnosti potrebne za održavanje sperme u SST lumenu, a pokretljivost na kraju opada sve dok sperma ne bude iznesena iz banke sperme protokom tekućine i ne započne novo putovanje niz uzlazni jajovod kako bi oplodila spermatozoide. Jajna ćelija (Forman4). Ovaj model skladištenja sperme podržava detekcija akvaporina 2, 3 i 9 prisutnih u SST epitelnim ćelijama imunocitohemijom. Do danas nedostaju studije o reologiji pileće sperme i njenoj ulozi u skladištenju SST-a, selekciji vaginalne sperme i konkurenciji sperme. Kod pilića, sperma ulazi u vaginu nakon prirodnog parenja, ali više od 80% spermatozoida se izbacuje iz vagine ubrzo nakon parenja. To sugerira da je vagina primarno mjesto za selekciju sperme kod ptica. Osim toga, zabilježeno je da manje od 1% spermatozoida oplođenih u vagini završi u SST-ovima2. Kod umjetne oplodnje pilića u vagini, broj spermatozoida koji dostižu SST ima tendenciju povećanja 24 sata nakon oplodnje. Do sada, mehanizam selekcije sperme tokom ovog procesa nije jasan, a pokretljivost spermatozoida može igrati važnu ulogu u unosu sperme u SST. Zbog debelih i neprozirnih zidova jajovoda, teško je direktno pratiti pokretljivost spermatozoida u jajovodima ptica. Stoga nam nedostaje osnovno znanje o tome kako spermatozoidi prelaze u SST nakon oplodnje.
Reologija je nedavno prepoznata kao važan faktor koji kontroliše transport sperme u genitalijama sisara. Na osnovu sposobnosti pokretnih spermatozoida da migriraju u suprotnom smjeru, Zaferani i saradnici8 koristili su corra mikrofluidni sistem za pasivnu izolaciju pokretnih spermatozoida iz uzoraka sperme. Ova vrsta sortiranja sperme je neophodna za medicinsko liječenje neplodnosti i klinička istraživanja, te se preferira u odnosu na tradicionalne metode koje su dugotrajne i naporne, a mogu ugroziti morfologiju i strukturni integritet sperme. Međutim, do danas nisu provedene studije o utjecaju sekreta iz genitalnih organa pilića na pokretljivost spermatozoida.
Bez obzira na mehanizam koji održava spermu pohranjenom u SST-u, mnogi istraživači su primijetili da se rezidualni spermatozoidi aglutiniraju glava uz glavu u SST-u pilića 9, 10, prepelica 2 i purana 11 kako bi formirali aglutinirane snopiće sperme. Autori sugeriraju da postoji veza između ove aglutinacije i dugotrajnog skladištenja spermatozoida u SST-u.
Tingari i Lake12 su izvijestili o snažnoj povezanosti između spermatozoida u žlijezdi koja prima spermu kod pileta i doveli su u pitanje da li se ptičji spermatozoidi aglutiniraju na isti način kao i spermatozoidi sisara. Oni vjeruju da duboke veze između spermatozoida u sjemenovodu mogu biti posljedica stresa uzrokovanog prisustvom velikog broja spermatozoida u malom prostoru.
Prilikom procjene ponašanja spermatozoida na svježe visećim staklenim pločicama, mogu se vidjeti prolazni znakovi aglutinacije, posebno na rubovima kapljica sperme. Međutim, aglutinaciju je često poremetilo rotacijsko djelovanje povezano s kontinuiranim kretanjem, što objašnjava prolaznu prirodu ovog fenomena. Istraživači su također primijetili da su se, kada se razrjeđivač doda spermi, pojavili izduženi agregati ćelija nalik nitima.
Rani pokušaji imitiranja spermatozoida učinjeni su uklanjanjem tanke žice iz viseće kapi, što je rezultiralo izduženom vezikulom sličnom spermi koja je stršila iz kapi sperme. Spermatozoidi su se odmah postrojili paralelno unutar vezikule, ali cijela jedinica je brzo nestala zbog 3D ograničenja. Stoga, da bi se proučavala aglutinacija spermatozoida, potrebno je direktno posmatrati pokretljivost i ponašanje spermatozoida u izolovanim tubulima za skladištenje sperme, što je teško postići. Stoga je potrebno razviti instrument koji imitira spermatozoide kako bi se podržale studije pokretljivosti i ponašanja aglutinacije spermatozoida. Brillard i saradnici13 izvijestili su da je prosječna dužina tubula za skladištenje sperme kod odraslih pilića 400–600 µm, ali neki SST-ovi mogu biti dugi i do 2000 µm. Mero i Ogasawara14 podijelili su sjemenske žlijezde na uvećane i neuvećane tubule za skladištenje sperme, koje su obje bile iste dužine (~500 µm) i širine vrata (~38 µm), ali je srednji promjer lumena tubula bio 56,6 i 56,6 µm, odnosno 11,2 μm. U trenutnoj studiji koristili smo mikrofluidni uređaj s veličinom kanala 200 µm × 20 µm (Š × V), čiji je poprečni presjek donekle blizak onome kod amplificiranog SST-a. Osim toga, ispitali smo pokretljivost spermatozoida i ponašanje aglutinacije u tekućoj tekućini, što je u skladu s Foremanovom hipotezom da tekućina koju proizvode epitelne ćelije SST-a drži spermu u lumenu u protustrujnom (reološkom) smjeru.
Cilj ove studije bio je prevazići probleme posmatranja pokretljivosti spermatozoida u jajovodu i izbjeći poteškoće proučavanja reologije i ponašanja spermatozoida u dinamičnom okruženju. Korišten je mikrofluidni uređaj koji stvara hidrostatički pritisak kako bi se simulirala pokretljivost spermatozoida u genitalijama pileta.
Kada je kap razrijeđenog uzorka sperme (1:40) ubačena u mikrokanalni uređaj, mogle su se identificirati dvije vrste pokretljivosti spermatozoida (izolirani spermatozoidi i vezani spermatozoidi). Osim toga, spermatozoidi su imali tendenciju plivanja protiv struje (pozitivna reologija; video 1, 2). Iako su snopovi spermatozoida imali manju brzinu od brzine usamljenih spermatozoida (p < 0,001), oni su povećali postotak spermatozoida koji pokazuju pozitivnu reotaksiju (p < 0,001; Tabela 2). Iako su snopovi spermatozoida imali manju brzinu od brzine usamljenih spermatozoida (p < 0,001), oni su povećali postotak spermatozoida koji pokazuju pozitivnu reotaksiju (p < 0,001; Tabela 2). Iako pučki spermatozoidi imaju manju brzinu, nego u odinih spermatozoida (p < 0,001), oni povećavaju postotak spermatozoida, pokazujući pozitivan reotaksis (p < 0,001; tabela 2). Iako su snopovi spermatozoida imali manju brzinu od brzine pojedinačnih spermatozoida (p < 0,001), povećali su postotak spermatozoida koji pokazuju pozitivnu reotaksiju (p < 0,001; Tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001）, 但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比 (p < 0,001；表2）。).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显倧 阁 显倧百分比 (p <0,001 ； 2。。。。。。)））））） Iako je brzina pučkovih spermatozoida bila niža, nego kod pojedinačnih spermatozoida (p < 0,001), oni su povećali postotak spermatozoida sa pozitivnom reologijom (p < 0,001; tabela 2). Iako je brzina snopića sperme bila niža od brzine pojedinačnih spermatozoida (p < 0,001), oni su povećali postotak spermatozoida s pozitivnom reologijom (p < 0,001; Tabela 2).Pozitivna reologija za pojedinačne spermatozoide i snopiće procjenjuje se na približno 53% odnosno 85%.
Primijećeno je da spermatozoidi sharkashi kokoši odmah nakon ejakulacije formiraju linearne snopove, koji se sastoje od desetina jedinki. Ovi čuperci se vremenom povećavaju u dužini i debljini i mogu ostati in vitro nekoliko sati prije nego što se rasprše (video 3). Ovi filamentozni snopovi su oblikovani poput ehidne spermatozoida koji se formiraju na kraju epididimisa. Utvrđeno je da sperma sharkashi kokoši ima visoku sklonost aglutinaciji i formiranju mrežastog snopa za manje od jedne minute nakon sakupljanja. Ovi snopovi su dinamični i sposobni da se zalijepe za bilo koje obližnje zidove ili statične objekte. Iako snopovi sperme smanjuju brzinu spermatozoida, jasno je da makroskopski povećavaju njihovu linearnost. Dužina snopova varira ovisno o broju spermatozoida prikupljenih u snopovima. Izolovana su dva dijela snopa: početni dio, uključujući slobodnu glavu aglutiniranog spermatozoida, i terminalni dio, uključujući rep i cijeli distalni kraj spermatozoida. Korištenjem kamere velike brzine (950 fps), uočene su slobodne glave aglutiniranih spermatozoida u početnom dijelu snopa, odgovorne za kretanje snopa zbog svog oscilatornog kretanja, povlačeći preostale u snop spiralnim kretanjem (Video 4). Međutim, kod dugih čuperaka uočeno je da su se neke slobodne glave spermatozoida prilijepile za tijelo, a terminalni dio čuperka djeluje kao lopatice koje pomažu u pokretanju čuperka.
Dok su u sporom toku tečnosti, snopovi spermatozoida se kreću paralelno jedan s drugim, međutim, počinju se preklapati i lijepiti za sve što miruje, kako ih ne bi odnio trenutni tok kako se brzina protoka povećava. Snopovi se formiraju kada se nekoliko spermatozoida približi jedna drugoj, počnu se kretati sinhrono i obavijati jedna oko druge, a zatim se lijepe za ljepljivu supstancu. Slike 1 i 2 prikazuju kako se spermatozoide približavaju jedna drugoj, formirajući spoj dok se repovi obavijaju jedan oko drugog.
Istraživači su primijenili hidrostatički pritisak kako bi stvorili protok tekućine u mikrokanalu kako bi proučavali reologiju sperme. Korišten je mikrokanal veličine 200 µm × 20 µm (Š × V) i dužine 3,6 µm. Korišteni su mikrokanali između spremnika sa špricama postavljenim na krajevima. Boja za hranu korištena je kako bi kanali bili vidljiviji.
Pričvrstite interkonekcijske kablove i pribor na zid. Video je snimljen fazno-kontrastnim mikroskopom. Uz svaku sliku prikazane su slike fazno-kontrastne mikroskopije i mapiranja. (A) Veza između dva toka opire se protoku zbog spiralnog kretanja (crvena strelica). (B) Veza između snopa cijevi i zida kanala (crvene strelice), istovremeno su povezani sa dva druga snopa (žute strelice). (C) Snopovi sperme u mikrofluidnom kanalu počinju se međusobno povezivati ​​(crvene strelice), formirajući mrežu snopova sperme. (D) Formiranje mreže snopova sperme.
Kada je kap razrijeđene sperme ubačena u mikrofluidni uređaj i stvoren je protok, uočeno je da se snop sperme kreće suprotno od smjera protoka. Snopovi se čvrsto prilegaju uz zidove mikrokanala, a slobodne glave u početnom dijelu snopova čvrsto se prilegaju uz njih (video 5). Oni se također lijepe za sve nepokretne čestice na svom putu, poput krhotina, kako bi se oduprli odnošenju strujom. Vremenom, ovi čuperci postaju dugi filamenti koji hvataju druge pojedinačne spermatozoide i kraće čuperke (Video 6). Kako protok počinje da se usporava, dugi redovi sperme počinju formirati mrežu linija sperme (Video 7; Slika 2).
Pri velikoj brzini protoka (V > 33 µm/s), spiralni pokreti niti se povećavaju u pokušaju da se uhvati što više pojedinačnih snopova sperme koji formiraju bolje kako bi se oduprli sili zanošenja protoka. Pri velikoj brzini protoka (V > 33 µm/s), spiralni pokreti niti se povećavaju u pokušaju da se uhvati što više pojedinačnih snopova sperme koji formiraju bolje kako bi se oduprli sili zanošenja protoka. Pri visokoj brzini toka (V > 33 mkm/s) spiralevidnye dviženie se usilivaju, pošto oni pokušavaju da poprime mnoštvo odvojenih spermatozoida, obrazujućih pučki, koje su bolje protivostoje drejfujućoj silnoj potoci. Pri visokim brzinama protoka (V > 33 µm/s), spiralni pokreti niti se povećavaju dok pokušavaju uhvatiti mnogo pojedinačnih spermatozoida, formirajući snopove koji su bolje sposobni odoljeti sili zanošenja protoka.在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加,以试图捕捉许多形成束的单个精子,从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形 岕 束 形 岕 束 在 高 流速从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 Pri visokim brzinama toka (V > 33 mkm/s) spiralno kretanje se povećava u pokušaju da zahvati mnoštvo pojedinačnih spermatozoida, obrazujućih pučaka, da bi bolje suprostavili silama drejfa toka. Pri visokim brzinama protoka (V > 33 µm/s), spiralno kretanje filamenata se povećava u pokušaju da se uhvati što više pojedinačnih spermatozoida koji formiraju snopove kako bi se bolje oduprli silama drifta protoka.Također su pokušali pričvrstiti mikrokanale na bočne zidove.
Snopovi sperme identificirani su kao klasteri glava sperme i uvijenih repova pomoću svjetlosne mikroskopije (LM). Snopovi sperme s različitim agregatima također su identificirani kao uvijene glave i flagelarni agregati, višestruki spojeni repovi sperme, glave sperme pričvršćene za rep i glave sperme sa savijenim jezgrama kao višestruka spojena jezgra. Transmisijska elektronska mikroskopija (TEM). Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) pokazala je da su snopovi sperme bili obaleni agregati glava sperme, a agregati sperme pokazivali su pričvršćenu mrežu omotanih repova.
Morfologija i ultrastruktura spermatozoida, formiranje snopića spermatozoida proučavani su svjetlosnom mikroskopijom (polovični presjek), skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM) i transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM), razmazi sperme obojeni su akridin oranžom i pregledani epifluorescentnom mikroskopijom.
Bojenje razmaza sperme akridin oranžom (Sl. 3B) pokazalo je da su glave spermatozoida bile slijepljene i prekrivene sekretornim materijalom, što je dovelo do formiranja velikih čuperaka (Sl. 3D). Snopovi sperme sastojali su se od agregata sperme s mrežom pričvršćenih repova (Sl. 4A-C). Snopovi sperme sastavljeni su od repova mnogih spermatozoida slijepljenih zajedno (Sl. 4D). Sekreti (Sl. 4E,F) prekrivali su glave snopova spermatozoida.
Formiranje snopa spermatozoida Korištenjem fazno kontrastne mikroskopije i razmaza sperme obojenih akridin narandžastom, pokazano je da se glave spermatozoida drže zajedno. (A) Rano formiranje čuperaka sperme počinje sa spermatozoidom (bijeli krug) i tri spermatozoida (žuti krug), pri čemu spirala počinje na repu, a završava na glavi. (B) Fotomikrografija razmaza sperme obojenog akridin narandžastom koja prikazuje prirasle glave spermatozoida (strelice). Pražnjenje prekriva glavu(e). Uvećanje × 1000. (C) Razvoj velikog snopa transportovanog protokom u mikrofluidnom kanalu (korištenjem kamere velike brzine pri 950 fps). (D) Mikrografija razmaza sperme obojenog akridin narandžastom koja prikazuje velike čuperke (strelice). Uvećanje: ×200.
Skenirajući elektronski mikrografi snopa sperme i razmaza sperme obojenog akridin narandžastom bojom. (A, B, D, E) su digitalne skenirajuće elektronske mikrografije spermatozoida u boji, a C i F su mikrografije razmaza sperme obojenih akridin narandžastom bojom koje prikazuju pričvršćivanje više spermatozoida koji obavijaju repnu mrežu. (AC) Agregati spermatozoida prikazani su kao mreža pričvršćenih repova (strelice). (D) Adhezija nekoliko spermatozoida (s ljepljivom supstancom, ružičasti obris, strelica) koji se omotavaju oko repa. (E i F) Agregati glave sperme (pokazivači) prekriveni ljepljivim materijalom (pokazivači). Spermatozoidi su formirali snopove s nekoliko struktura nalik vrtlogu (F). (C) Uvećanja ×400 i (F) ×200.
Korištenjem transmisione elektronske mikroskopije otkrili smo da snopovi spermatozoida imaju pričvršćene repove (Sl. 6A, C), glave pričvršćene za repove (Sl. 6B) ili glave pričvršćene za repove (Sl. 6D). Glave spermatozoida u snopu su zakrivljene, a na presjeku predstavljaju dvije nuklearne regije (Sl. 6D). U snopu incizije, spermatozoidi su imali uvijenu glavu s dvije nuklearne regije i više flagelarnih regija (Sl. 5A).
Digitalna elektronska mikrografija u boji koja prikazuje spojne repove u snopu sperme i aglutinirajući materijal koji povezuje glave spermatozoida. (A) Pričvršćeni rep velikog broja spermatozoida. Obratite pažnju na to kako rep izgleda i u portretnoj (strelica) i u pejzažnoj (strelica) projekciji. (B) Glava (strelica) sperme je povezana s repom (strelica). (C) Nekoliko repova sperme (strelice) je pričvršćeno. (D) Aglutinirajući materijal (AS, plava) povezuje četiri glave sperme (ljubičasta).
Skenirajuća elektronska mikroskopija korištena je za detekciju glava spermatozoida u snopovima spermatozoida prekrivenim sekretima ili membranama (Slika 6B), što ukazuje na to da su snopovi spermatozoida usidreni ekstracelularnim materijalom. Aglutinirani materijal je bio koncentriran u glavi spermatozoida (sklop nalik glavi meduze; Sl. 5B) i proširen distalno, dajući briljantno žuti izgled pod fluorescentnom mikroskopijom kada je obojen akridin narandžastom (Sl. 6C). Ova supstanca je jasno vidljiva pod skenirajućim mikroskopom i smatra se vezivom. Polutanki presjeci (Sl. 5C) i razmazi sperme obojeni akridin narandžastom pokazali su snopove spermatozoida koji sadrže gusto zbijene glave i uvijene repove (Sl. 5D).
Različite fotomikrografije koje prikazuju agregaciju glava spermatozoida i presavijenih repova korištenjem različitih metoda. (A) Poprečni presjek digitalne transmisijske elektronske mikrografije u boji snopa spermatozoida koji prikazuje spiralno savijenu glavu spermatozoida s dvodjelnim jezgrom (plavo) i nekoliko flagelarnih dijelova (zeleno). (B) Digitalna skenirajuća elektronska mikrografija u boji koja prikazuje skup glava spermatozoida sličnih meduzama (strelice) koje izgledaju prekrivene. (C) Polutanki presjek koji prikazuje agregirane glave spermatozoida (strelice) i uvijene repove (strelice). (D) Mikrografija razmaza sperme obojenog akridin narandžastom bojom koja prikazuje agregate glava spermatozoida (strelice) i uvijene prianjajuće repove (strelice). Treba napomenuti da ljepljiva supstanca (S) prekriva glavu spermatozoida. (D) Uvećanje × 1000.
Korištenjem transmisijske elektronske mikroskopije (Sl. 7A), također je uočeno da su glave spermatozoida bile uvijene, a jezgra spiralnog oblika, što je potvrđeno razmazima sperme obojenim akridin oranžom i pregledanim fluorescentnom mikroskopijom (Sl. 7B).
(A) Digitalna transmisiona elektronska mikrografija u boji i (B) Razmaz sperme obojen akridin narandžastom bojom koji prikazuje spiralno savijene glave i pričvršćivanje glava i repova spermatozoida (strelice). (B) Uvećanje × 1000.
Zanimljivo otkriće je da se Sharkazijeva sperma agregira i formira pokretne filamentozne snopiće. Svojstva ovih snopića nam omogućavaju da razumijemo njihovu moguću ulogu u apsorpciji i skladištenju spermatozoida u SST-u.
Nakon parenja, spermatozoidi ulaze u vaginu i prolaze kroz intenzivan proces selekcije, što rezultira samo ograničenim brojem spermatozoida koji ulaze u SST15,16. Do danas, mehanizmi kojima spermatozoidi ulaze i izlaze iz SST-a nisu jasni. Kod peradi, spermatozoidi se čuvaju u SST-u duži period od 2 do 10 sedmica, ovisno o vrsti6. Kontroverza ostaje oko stanja sperme tokom skladištenja u SST-u. Da li su u pokretu ili miruju? Drugim riječima, kako spermatozoidi održavaju svoj položaj u SST-u tako dugo?
Forman4 je sugerirao da se zadržavanje i izbacivanje SST-a može objasniti pokretljivošću spermatozoida. Autori pretpostavljaju da spermatozoidi održavaju svoj položaj plivajući protiv toka tekućine koji stvara SST epitel i da se spermatozoidi izbacuju iz SST-a kada njihova brzina padne ispod tačke u kojoj se počinju kretati unazad zbog nedostatka energije. Zaniboni5 je potvrdio prisustvo akvaporina 2, 3 i 9 u apikalnom dijelu SST epitelnih ćelija, što može indirektno podržati Foremanov model skladištenja sperme. U trenutnoj studiji otkrili smo da gotovo polovina Sharkashijevih spermatozoida pokazuje pozitivnu reologiju u tekućoj tekućini i da aglutinirani snopovi spermatozoida povećavaju broj spermatozoida koji pokazuju pozitivnu reologiju, iako ih aglutinacija usporava. Način na koji spermatozoidi putuju kroz jajovod ptice do mjesta oplodnje nije u potpunosti razjašnjen. Kod sisara, folikularna tekućina kemoatraktantno privlači spermatozoide. Međutim, vjeruje se da kemoatraktanti usmjeravaju spermatozoide da se približe velikim udaljenostima7. Stoga su drugi mehanizmi odgovorni za transport sperme. Sposobnost sperme da se orijentiše i teče protiv tečnosti jajovoda koja se oslobađa nakon parenja, navodi se kao glavni faktor u ciljanju sperme kod miševa. Parker 17 je sugerisao da spermatozoidi prelaze jajovode plivajući protiv cilijarne struje kod ptica i gmizavaca. Iako to nije eksperimentalno dokazano kod ptica, Adolphi 18 je bio prvi koji je otkrio da ptičja sperma daje pozitivne rezultate kada se tanki sloj tečnosti između pokrovnog stakalca i pločice stvori trakom filter papira. Reologija. Hino i Yanagimachi [19] su stavili kompleks miša jajnik-jajovod-materica u perfuzijski prsten i ubrizgali 1 µl mastila u prevlaku kako bi vizualizirali protok tečnosti u jajovodima. Primijetili su vrlo aktivno kretanje kontrakcije i opuštanja u jajovodu, u kojem su se sve kuglice mastila stalno kretale prema ampuli jajovoda. Autori naglašavaju važnost protoka tečnosti u jajovodima od donjeg do gornjeg dijela jajovoda za podizanje i oplodnju sperme. Brillard20 je izvijestio da kod pilića i purana spermatozoidi migriraju aktivnim kretanjem od vaginalnog ulaza, gdje se skladište, do uterovaginalnog spoja, gdje se skladište. Međutim, ovo kretanje nije potrebno između uterovaginalnog spoja i infundibuluma jer se spermatozoidi transportuju pasivnim pomicanjem. Poznavajući ove prethodne preporuke i rezultate dobijene u trenutnoj studiji, može se pretpostaviti da je sposobnost spermatozoida da se kreću uzvodno (reologija) jedno od svojstava na kojima se zasniva proces selekcije. To određuje prolazak spermatozoida kroz vaginu i njihov ulazak u CCT radi skladištenja. Kao što je Forman4 sugerirao, ovo također može olakšati proces ulaska spermatozoida u SST i njegovo stanište na određeni vremenski period, a zatim izlaska kada im se brzina počne usporavati.
S druge strane, Matsuzaki i Sasanami21 sugerišu da ptičji spermatozoidi prolaze kroz promjene pokretljivosti od mirovanja do pokretljivosti u muškom i ženskom reproduktivnom traktu. Inhibicija pokretljivosti rezidentnih spermatozoida u SST-u predložena je kao objašnjenje dugog vremena skladištenja sperme, a zatim podmlađivanja nakon napuštanja SST-a. U hipoksičnim uslovima, Matsuzaki i saradnici1 su izvijestili o visokoj proizvodnji i oslobađanju laktata u SST-u, što može dovesti do inhibicije pokretljivosti rezidentnih spermatozoida. U ovom slučaju, važnost reologije sperme ogleda se u selekciji i apsorpciji spermatozoida, a ne u njihovom skladištenju.
Obrazac aglutinacije spermatozoida smatra se vjerovatnim objašnjenjem za dugi period skladištenja sperme u SST-u, budući da je to uobičajen obrazac zadržavanja sperme kod peradi2,22,23. Bakst i saradnici2 su primijetili da se većina spermatozoida lijepi jedna za drugu, formirajući fascikularne agregate, a pojedinačni spermatozoidi su rijetko pronađeni u CCM-u prepelice. S druge strane, Wen i saradnici24 su primijetili više raspršenih spermatozoida i manje čuperaka spermatozoida u lumenu SST-a kod pilića. Na osnovu ovih zapažanja, može se pretpostaviti da se sklonost aglutinaciji spermatozoida razlikuje između ptica i između spermatozoida u istom ejakulatu. Osim toga, Van Krey i saradnici9 sugerišu da je nasumična disocijacija aglutiniranih spermatozoida odgovorna za postepeno prodiranje spermatozoida u lumen jajovoda. Prema ovoj hipotezi, spermatozoidi sa nižim kapacitetom aglutinacije trebali bi prvo biti izbačeni iz SST-a. U ovom kontekstu, sposobnost spermatozoida da aglutiniraju može biti faktor koji utiče na ishod kompeticije spermatozoida kod prljavih ptica. Osim toga, što se aglutinirani spermatozoid duže disocira, to se duže održava plodnost.
Iako je agregacija spermatozoida i agregacija u snopove uočena u nekoliko studija2,22,24, ona nisu detaljno opisana zbog složenosti njihovog kinematičkog posmatranja unutar SST-a. Učinjeno je nekoliko pokušaja proučavanja aglutinacije spermatozoida in vitro. Opsežna, ali prolazna agregacija uočena je kada je tanka žica uklonjena iz viseće kapi sjemena. To dovodi do činjenice da izduženi mjehurić viri iz kapi, imitirajući sjemenu žlijezdu. Zbog 3D ograničenja i kratkog vremena sušenja kapanjem, cijeli blok je brzo propao9. U trenutnoj studiji, koristeći Sharkashi piliće i mikrofluidne čipove, uspjeli smo opisati kako se ovi čuperci formiraju i kako se kreću. Snopovi spermatozoida formirali su se odmah nakon sakupljanja sperme i utvrđeno je da se kreću spiralno, pokazujući pozitivnu reologiju kada su prisutni u toku. Nadalje, kada se makroskopski posmatra, uočeno je da snopovi spermatozoida povećavaju linearnost pokretljivosti u poređenju sa izolovanim spermatozoidima. Ovo ukazuje na to da se aglutinacija spermatozoida može dogoditi prije prodiranja SST-a i da proizvodnja spermatozoida nije ograničena na malo područje zbog stresa kao što je prethodno sugerirano (Tingari i Lake12). Tokom formiranja čuperka, spermatozoidi plivaju sinhrono dok ne formiraju spoj, zatim se njihovi repovi obavijaju jedan oko drugog i glava spermatozoida ostaje slobodna, ali rep i distalni dio spermatozoida se lijepe ljepljivom supstancom. Stoga je slobodna glava ligamenta odgovorna za kretanje, povlačeći ostatak ligamenta. Skenirajuća elektronska mikroskopija snopova spermatozoida pokazala je pričvršćene glave spermatozoida prekrivene s puno ljepljivog materijala, što ukazuje na to da su glave spermatozoida bile pričvršćene u snopovima mirovanja, što se moglo dogoditi nakon što su stigle do mjesta skladištenja (SST).
Kada se razmaz sperme oboji akridin narandžastom bojom, ekstracelularni adhezivni materijal oko spermatozoida može se vidjeti pod fluorescentnim mikroskopom. Ova supstanca omogućava snopovima sperme da se prilijepe i zadrže za bilo koje okolne površine ili čestice tako da ne plutaju s okolnim tokom. Dakle, naša zapažanja pokazuju ulogu adhezije spermatozoida u obliku mobilnih snopova. Njihova sposobnost da plivaju protiv struje i prilijepe se za obližnje površine omogućava spermi da duže ostanu u SST-u.
Rothschild25 je koristio hemocitometrijsku kameru za proučavanje plutajuće distribucije goveđe sperme u kapi suspenzije, praveći fotomikrografije kamerom s vertikalnom i horizontalnom optičkom osom mikroskopa. Rezultati su pokazali da su spermatozoidi privučeni površinom komore. Autori sugeriraju da mogu postojati hidrodinamičke interakcije između sperme i površine. Uzimajući ovo u obzir, zajedno sa sposobnošću sperme pilića Sharkashi da formira ljepljive čuperke, može se povećati vjerovatnoća da će se sperma prilijepiti za zid SST-a i biti pohranjena duži vremenski period.
Bccetti i Afzeliu26 su izvijestili da je glikokaliks sperme potreban za prepoznavanje i aglutinaciju gameta. Forman10 je primijetio da hidroliza α-glikozidnih veza u glikoprotein-glikolipidnim premazima tretiranjem ptičje sperme neuraminidazom rezultira smanjenom plodnošću bez utjecaja na pokretljivost spermatozoida. Autori sugeriraju da učinak neuraminidaze na glikokaliks oštećuje sekvestraciju sperme na utero-vaginalnom spoju, čime se smanjuje plodnost. Njihova zapažanja ne mogu zanemariti mogućnost da tretman neuraminidazom može smanjiti prepoznavanje sperme i oocita. Forman i Engel10 su otkrili da je plodnost smanjena kada su kokoši intravaginalno inseminirane spermom tretiranom neuraminidazom. Međutim, IVF sa spermom tretiranom neuraminidazom nije utjecao na plodnost u usporedbi s kontrolnim kokošima. Autori su zaključili da promjene u glikoprotein-glikolipidnom omotaču oko membrane sperme smanjuju sposobnost sperme za oplodnju oštećujući sekvestraciju sperme na utero-vaginalnom spoju, što zauzvrat povećava gubitak sperme zbog brzine utero-vaginalnog spoja, ali ne utiče na prepoznavanje spermatozoida i jajne ćelije.
Kod purana Bakst i Bauchan 11 pronašli su male vezikule i fragmente membrane u lumenu SST-a i primijetili da su se neke od ovih granula spojile sa membranom sperme. Autori sugeriraju da ovi odnosi mogu doprinijeti dugoročnom skladištenju spermatozoida u SST-u. Međutim, istraživači nisu precizirali izvor ovih čestica, da li ih luče CCT epitelne ćelije, da li ih proizvodi i luči muški reproduktivni sistem ili ih proizvodi sama sperma. Također, ove čestice su odgovorne za aglutinaciju. Grützner i saradnici27 izvijestili su da epididimalne epitelne ćelije proizvode i luče specifični protein koji je potreban za formiranje sjemenih puteva s jednom porom. Autori također izvještavaju da disperzija ovih snopova ovisi o interakciji epididimalnih proteina. Nixon i saradnici28 otkrili su da adneksi luče protein, kiseli osteonektin bogat cisteinom; SPARC je uključen u formiranje čuperaka sperme kod kratkokljunih ehidna i kljunara. Raspršivanje ovih snopova povezano je s gubitkom ovog proteina.
U trenutnoj studiji, ultrastrukturna analiza korištenjem elektronske mikroskopije pokazala je da su spermatozoidi prianjali na veliku količinu gustog materijala. Smatra se da su ove supstance odgovorne za aglutinaciju koja se kondenzuje između i oko prianjajućih glava, ali u nižim koncentracijama u području repa. Pretpostavljamo da se ova aglutinirajuća supstanca izlučuje iz muškog reproduktivnog sistema (epididimis ili vas deferens) zajedno sa spermom, budući da često primjećujemo odvajanje sperme od limfe i sjemene plazme tokom ejakulacije. Prijavljeno je da, dok ptičji spermatozoidi prolaze kroz epididimis i vas deferens, prolaze kroz promjene povezane sa sazrijevanjem koje podržavaju njihovu sposobnost vezivanja proteina i sticanja glikoproteina povezanih s lemom plazme. Perzistencija ovih proteina na rezidentnim membranama spermatozoida u SST-u sugerira da ovi proteini mogu utjecati na sticanje stabilnosti membrane spermatozoida 30 i odrediti njihovu plodnost 31. Ahammad i saradnici32 su izvijestili da spermatozoidi dobijeni iz različitih dijelova muškog reproduktivnog sistema (od testisa do distalnog sjemenovoda) pokazuju progresivno povećanje održivosti u uslovima skladištenja u tečnosti, bez obzira na temperaturu skladištenja, a održivost kod pilića se također povećava u jajovodima nakon vještačke oplodnje.
Čuperci sperme kod pilića Sharkashi imaju drugačije karakteristike i funkcije od drugih vrsta kao što su ehidne, kljunaši, šumski miševi, jelenji pacovi i zamorci. Kod pilića sharkashi, formiranje snopića spermatozoida smanjilo je brzinu plivanja u poređenju sa pojedinačnim spermatozoidima. Međutim, ovi snopovi su povećali procenat reološki pozitivnih spermatozoida i povećali sposobnost spermatozoida da se stabilizuju u dinamičnom okruženju. Dakle, naši rezultati potvrđuju prethodnu sugestiju da je aglutinacija sperme u SST-u povezana sa dugoročnim skladištenjem sperme. Također pretpostavljamo da sklonost sperme ka formiranju čuperaka može kontrolisati brzinu gubitka sperme u SST-u, što može promijeniti ishod konkurencije sperme. Prema ovoj pretpostavci, spermatozoidi sa niskim kapacitetom aglutinacije prvi oslobađaju SST, dok spermatozoidi sa visokim kapacitetom aglutinacije proizvode većinu potomstva. Formiranje snopića sperme sa jednom porom je korisno i utiče na odnos roditelja i djece, ali koristi drugačiji mehanizam. Kod ehidna i kljunaša, spermatozoidi su raspoređeni paralelno jedan s drugim kako bi se povećala brzina kretanja snopa. Snopovi ehidna kreću se oko tri puta brže od pojedinačnih spermatozoida. Vjeruje se da je formiranje takvih čuperaka sperme kod ehidna evolucijska adaptacija za održavanje dominacije, budući da su ženke promiskuitetne i obično se pare s nekoliko mužjaka. Stoga se spermatozoidi iz različitih ejakulata žestoko takmiče za oplodnju jajne ćelije.
Aglutinirani spermatozoidi kod sharkasi pilića lako se vizualiziraju korištenjem faznokontrastne mikroskopije, što se smatra povoljnim jer omogućava lako proučavanje ponašanja spermatozoida in vitro. Mehanizam kojim formiranje čuperaka sperme potiče reprodukciju kod sharkasi pilića također se razlikuje od onog koji se vidi kod nekih placentalnih sisara, što predstavlja kooperativno ponašanje sperme, kao što su šumski miševi, gdje neki spermatozoidi dopiru do jaja, pomažući drugim srodnim jedinkama da dođu do njihovih jaja i oštete ih. da se dokažu. altruističko ponašanje. Samooplodnja 34. Drugi primjer kooperativnog ponašanja kod spermatozoida pronađen je kod jelenskih miševa, gdje su spermatozoidi bili u stanju identificirati i kombinirati se s genetski najsrodnijim spermatozoidima i formirati kooperativne grupe kako bi povećali svoju brzinu u usporedbi sa nesrodnim spermatozoidima35.
Rezultati dobijeni u ovoj studiji ne protivreče Fomanovoj teoriji o dugotrajnom skladištenju spermatozoida u SST-u. Istraživači izvještavaju da se spermatozoidi nastavljaju kretati u toku epitelnih ćelija koje oblažu SST tokom dužeg vremenskog perioda, a nakon određenog vremenskog perioda, zalihe energije spermatozoida se iscrpljuju, što rezultira smanjenjem brzine, što omogućava izbacivanje supstanci male molekularne težine. energija spermatozoida protokom tečnosti iz lumena SST-a - šupljine jajovoda. U trenutnoj studiji primijetili smo da polovina pojedinačnih spermatozoida pokazuje sposobnost plivanja protiv protoka tečnosti, a njihova adhezija u snopu povećava njihovu sposobnost da pokažu pozitivnu reologiju. Nadalje, naši podaci su u skladu s podacima Matsuzaki i saradnika 1 koji su izvijestili da povećana sekrecija laktata u SST-u može inhibirati pokretljivost rezidentnih spermatozoida. Međutim, naši rezultati opisuju formiranje pokretnih ligamenata spermatozoida i njihovo reološko ponašanje u prisustvu dinamičkog okruženja unutar mikrokanala u pokušaju da se razjasni njihovo ponašanje u SST-u. Buduća istraživanja bi se mogla fokusirati na određivanje hemijskog sastava i porijekla aglutinirajućeg agensa, što će nesumnjivo pomoći istraživačima da razviju nove načine skladištenja tečne sperme i povećaju trajanje plodnosti.
Petnaest 30 sedmica starih mužjaka šarkasija bez vrata (homozigotno dominantno; Na-Na) odabrani su kao donori sperme u studiji. Ptice su uzgajane na Istraživačkoj živinarskoj farmi Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta Ashit, Governorate Ashit, Egipat. Ptice su bile smještene u pojedinačne kaveze (30 x 40 x 40 cm), podvrgnute svjetlosnom programu (16 sati svjetla i 8 sati mraka) i hranjene dijetom koja sadrži 160 g sirovog proteina, 2800 kcal metaboličke energije, 35 g kalcija po osobi i 5 grama dostupnog fosfora po kilogramu prehrane.
Prema podacima 36, ​​​​37, sperma je prikupljena od mužjaka abdominalnom masažom. Ukupno 45 uzoraka sperme prikupljeno je od 15 muškaraca tokom 3 dana. Sperma (n = 15/dan) je odmah razrijeđena 1:1 (v:v) sa Belsville Poultry Semen Diluentom, koji sadrži kalijum difosfat (1,27 g), mononatrijum glutamat monohidrat (0,867 g), fruktozu (0,5 d), bezvodni natrijum acetat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometan (0,195 g), kalijum citrat monohidrat (0,064 g), kalijum monofosfat (0,065 g), magnezijum hlorid (0,034 g) i H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolarnost 333 mOsm/kg38. Razrijeđeni uzorci sperme prvo su pregledani pod svjetlosnim mikroskopom kako bi se osigurala dobra kvaliteta sperme (vlaga), a zatim su pohranjeni u vodenoj kupelji na 37°C do upotrebe unutar pola sata nakon prikupljanja.
Kinematika i reologija spermatozoida opisane su korištenjem sistema mikrofluidnih uređaja. Uzorci sperme su dodatno razrijeđeni na 1:40 u Beltsville Avian Semen Diluentu, ubačeni u mikrofluidni uređaj (vidi dolje), a kinetički parametri su određeni korištenjem kompjuteriziranog sistema za analizu sperme (CASA) koji je prethodno razvijen za mikrofluidnu karakterizaciju. Dodatak se može preuzeti na: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Mjerene su brzina krivulje (VCL, μm/s), linearna brzina (VSL, μm/s) i prosječna brzina putanje (VAP, μm/s). Video snimci spermatozoida snimljeni su korištenjem invertovanog Optika XDS-3 fazno-kontrastnog mikroskopa (sa objektivom 40x) povezanog na Tucson ISH1000 kameru pri 30 fps tokom 3 s. Koristite CASA softver za proučavanje najmanje tri područja i 500 putanja spermatozoida po uzorku. Snimljeni video je obrađen korištenjem domaćeg CASA programa. Definicija pokretljivosti u CASA dodatku zasniva se na brzini plivanja sperme u poređenju sa brzinom protoka i ne uključuje druge parametre kao što je kretanje s jedne strane na drugu, jer se pokazalo da je to pouzdanije kod protoka tečnosti. Reološko kretanje se opisuje kao kretanje spermatozoida suprotno od smjera protoka tečnosti. Spermatozoidi sa reološkim svojstvima podijeljeni su s brojem pokretnih spermatozoida; spermatozoidi koji su bili u mirovanju i spermatozoidi koji se konvektivno kreću isključeni su iz brojanja.
Sve korištene hemikalije su nabavljene od Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egipat), osim ako nije drugačije navedeno. Uređaj je proizveden kako je opisano od strane El-sherry et al. 40, uz neke modifikacije. Materijali korišteni za izradu mikrokanala uključivali su staklene ploče (Howard Glass, Worcester, MA), SU-8-25 negativni rezist (MicroChem, Newton, CA), diaceton alkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Njemačka) i poliaceton.-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanali su izrađeni korištenjem meke litografije. Prvo je prozirna zaštitna maska ​​za lice sa željenim dizajnom mikrokanala odštampana na štampaču visoke rezolucije (Prismatic, Kairo, Egipat i Pacific Arts and Design, Markham, ON). Masteri su napravljeni korištenjem staklenih ploča kao podloga. Ploče su očišćene u acetonu, izopropanolu i deioniziranoj vodi, a zatim premazane slojem SU8-25 debljine 20 µm centrifugiranjem (3000 o/min, 1 min). Slojevi SU-8 su zatim nježno osušeni (65°C, 2 min i 95°C, 10 min) i izloženi UV zračenju tokom 50 sekundi. Nakon ekspozicije, pečeni su na 65°C i 95°C tokom 1 min i 4 min radi umrežavanja izloženih slojeva SU-8, nakon čega je uslijedilo razvijanje u diaceton alkoholu tokom 6,5 min. Vafli su tvrdo pečeni (200°C tokom 15 min) radi dodatnog učvršćivanja sloja SU-8.
PDMS je pripremljen miješanjem monomera i učvršćivača u težinskom omjeru 10:1, zatim degaziran u vakuumskom eksikatoru i izliven na glavni okvir SU-8. PDMS je sušen u pećnici (120°C, 30 minuta), a zatim su kanali izrezani, odvojeni od glavnog sloja i perforirani kako bi se omogućilo pričvršćivanje cijevi na ulazu i izlazu mikrokanala. Konačno, PDMS mikrokanali su trajno pričvršćeni na mikroskopska stakla pomoću prenosivog korona procesora (Electro-Technic Products, Chicago, IL) kao što je opisano drugdje. Mikrokanal korišten u ovoj studiji ima dimenzije 200 µm × 20 µm (Š × V) i dužinu od 3,6 cm.
Protok fluida izazvan hidrostatičkim pritiskom unutar mikrokanala postiže se održavanjem nivoa fluida u ulaznom rezervoaru iznad visinske razlike Δh39 u izlaznom rezervoaru (Slika 1).
gdje je f koeficijent trenja, definisan kao f = C/Re za laminarni tok u pravougaonom kanalu, gdje je C konstanta koja zavisi od odnosa stranica kanala, L je dužina mikrokanala, Vav je prosječna brzina unutar mikrokanala, Dh je hidraulički prečnik kanala, g – ubrzanje gravitacije. Koristeći ovu jednačinu, prosječna brzina kanala može se izračunati pomoću sljedeće jednačine: