Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nedavno je razvijena antimikrobna platforma bez hemikalija, zasnovana na nanotehnologiji korištenjem vještačkih vodenih nanostruktura (EWNS). EWNS imaju visoko površinsko naelektrisanje i bogate su reaktivnim vrstama kisika (ROS) koje mogu interagovati sa brojnim mikroorganizmima i inaktivirati ih, uključujući patogene koji se prenose hranom. Ovdje je pokazano da se njihova svojstva tokom sinteze mogu fino podesiti i optimizovati kako bi se dodatno poboljšao njihov antibakterijski potencijal. Laboratorijska platforma EWNS dizajnirana je za fino podešavanje svojstava EWNS promjenom parametara sinteze. Karakterizacija svojstava EWNS (naelektrisanje, veličina i sadržaj ROS) izvršena je korištenjem modernih analitičkih metoda. Pored toga, mikroorganizmi u hrani poput Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum i Saccharomyces cerevisiae inokulirani su na površinu organskih paradajza kako bi se procijenio njihov potencijal mikrobne inaktivacije. Rezultati predstavljeni ovdje pokazuju da se svojstva EWNS mogu fino podesiti tokom sinteze, što rezultira eksponencijalnim povećanjem efikasnosti inaktivacije. Posebno, površinski naboj se povećao za faktor četiri, a sadržaj ROS-a se povećao. Brzina uklanjanja mikroba bila je mikrobno zavisna i kretala se od 1,0 do 3,8 log nakon 45 minuta izlaganja dozi aerosola od 40.000 #/cm3 EWNS.
Mikrobna kontaminacija je glavni uzrok bolesti koje se prenose hranom uzrokovanih unošenjem patogena ili njihovih toksina. Bolesti koje se prenose hranom uzrokuju oko 76 miliona bolesti, 325.000 hospitalizacija i 5.000 smrtnih slučajeva svake godine samo u Sjedinjenim Američkim Državama1. Osim toga, Ministarstvo poljoprivrede Sjedinjenih Američkih Država (USDA) procjenjuje da je povećana konzumacija svježih proizvoda odgovorna za 48 posto svih bolesti koje se prenose hranom prijavljenih u Sjedinjenim Američkim Državama2. Troškovi bolesti i smrti od patogena koji se prenose hranom u Sjedinjenim Američkim Državama su vrlo visoki, a Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) procjenjuju ih na više od 15,6 milijardi američkih dolara godišnje3.
Trenutno se hemijske4, radijacijske5 i termičke6 antimikrobne intervencije radi osiguranja sigurnosti hrane uglavnom provode na ograničenim kritičnim kontrolnim tačkama (KKT) u proizvodnom lancu (obično nakon berbe i/ili tokom pakovanja), umjesto da se kontinuirano provode na način da svježi proizvodi budu podložni unakrsnoj kontaminaciji7. Antimikrobne intervencije su potrebne za bolju kontrolu bolesti koje se prenose hranom i kvarenja hrane i imaju potencijal da se primjenjuju u cijelom kontinuumu od farme do stola. Manji uticaj i troškovi.
Nedavno je razvijena nanotehnološka antimikrobna platforma bez hemikalija za inaktivaciju bakterija na površinama i u zraku korištenjem umjetnih vodenih nanostruktura (EWNS). Za sintezu EVNS-a korištena su dva paralelna procesa: elektrosprej i ionizacija vode (slika 1a). Prethodno je pokazano da EWNS imaju jedinstven skup fizičkih i bioloških svojstava8,9,10. EWNS ima u prosjeku 10 elektrona po strukturi i prosječnu nanometarsku veličinu od 25 nm (slika 1b,c)8,9,10. Osim toga, elektronska spinska rezonanca (ESR) pokazala je da EWNS sadrže veliku količinu reaktivnih vrsta kisika (ROS), uglavnom hidroksil (OH•) i superoksid (O2-) radikala (slika 1c)8. EWNS su dugo ostajali u zraku i mogli su se sudarati s mikrobima suspendiranim u zraku i prisutnima na površinama, isporučujući svoj ROS teret i uzrokujući inaktivaciju mikroba (slika 1d). Ove ranije studije su također pokazale da EWNS mogu stupiti u interakciju s različitim gram-negativnim i gram-pozitivnim bakterijama od javnog značaja, uključujući mikobakterije, na površinama i u zraku i inaktivirati ih. Transmisijska elektronska mikroskopija pokazala je da je inaktivacija uzrokovana poremećajem ćelijske membrane. Osim toga, studije akutne inhalacije pokazale su da visoke doze EWNS-a ne uzrokuju oštećenje pluća ili upalu8.
(a) Elektroraspršivanje nastaje kada se visoki napon primijeni između kapilare koja sadrži tekućinu i kontraelektrode. (b) Primjena visokog napona rezultira dva različita fenomena: (i) elektroraspršivanje vode i (ii) stvaranje reaktivnih vrsta kisika (iona) zarobljenih u EWNS-u. (c) Jedinstvena struktura EWNS-a. (d) EWNS su vrlo mobilni zbog svoje nanoskalne prirode i mogu stupiti u interakciju s patogenima koji se prenose zrakom.
Nedavno je demonstrirana i sposobnost EWNS antimikrobne platforme da inaktivira mikroorganizme koji se prenose hranom na površini svježe hrane. Također je pokazano da se površinski naboj EWNS-a može koristiti u kombinaciji s električnim poljem za ciljanu dostavu. Što je još važnije, obećavajući početni rezultat od približno 1,4 log smanjenja aktivnosti organskog paradajza protiv različitih mikroorganizama u hrani, kao što su E. coli i Listeria, uočen je unutar 90 minuta izlaganja EWNS-u pri koncentraciji od približno 50.000#/cm311. Osim toga, preliminarni organoleptički testovi nisu pokazali organoleptički učinak u usporedbi s kontrolnim paradajzom. Iako ovi početni rezultati inaktivacije obećavaju sigurnost hrane čak i pri vrlo niskim dozama EWNS-a od 50.000#/cc. vidi, jasno je da bi veći potencijal inaktivacije bio korisniji za daljnje smanjenje rizika od infekcije i kvarenja.
Ovdje ćemo fokusirati naša istraživanja na razvoj platforme za generiranje EWNS-a kako bismo fino podesili parametre sinteze i optimizirali fizičko-hemijska svojstva EWNS-a radi poboljšanja njihovog antibakterijskog potencijala. Konkretno, optimizacija se fokusirala na povećanje njihovog površinskog naboja (radi poboljšanja ciljane isporuke) i sadržaja ROS-a (radi poboljšanja efikasnosti inaktivacije). Karakterizacija optimiziranih fizičko-hemijskih svojstava (veličina, naboj i sadržaj ROS-a) korištenjem modernih analitičkih metoda i korištenjem uobičajenih mikroorganizama u hrani kao što su E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae i M. parafortuitum.
EVNS je sintetiziran istovremenim elektroraspršivanjem i ionizacijom vode visoke čistoće (18 MΩ cm–1). Električni atomizer 12 se obično koristi za atomizaciju tekućina i sintetičkih polimernih i keramičkih čestica 13 i vlakana 14 kontrolirane veličine.
Kao što je detaljno opisano u prethodnim publikacijama 8, 9, 10, 11, u tipičnom eksperimentu, visoki napon se primjenjuje između metalne kapilare i uzemljene kontraelektrode. Tokom ovog procesa, dešavaju se dva različita fenomena: 1) elektroraspršivanje i 2) jonizacija vode. Jako električno polje između dvije elektrode uzrokuje nakupljanje negativnih naboja na površini kondenzovane vode, što rezultira formiranjem Taylorovih konusa. Kao rezultat toga, formiraju se visoko nabijene kapljice vode, koje se nastavljaju raspadati na manje čestice, prema Rayleighovoj teoriji16. Istovremeno, jako električno polje uzrokuje da se neki molekuli vode cijepaju i otimaju elektrone (jonizacija), čime se generira velika količina reaktivnih vrsta kisika (ROS)17. Istovremeno generirani ROS18 paketi su enkapsulirani u EWNS (Slika 1c).
Na slici 2a prikazan je sistem za generisanje EWNS-a razvijen i korišten u sintezi EWNS-a u ovoj studiji. Pročišćena voda pohranjena u zatvorenoj boci dovedena je kroz teflonsku cijev (unutrašnji promjer 2 mm) do igle od nehrđajućeg čelika 30G (metalna kapilara). Kao što je prikazano na slici 2b, protok vode kontrolira se pritiskom zraka unutar boce. Igla je pričvršćena na teflonsku konzolu koja se može ručno podesiti na određenu udaljenost od kontraelektrode. Protuelektroda je polirani aluminijski disk s rupom u sredini za uzorkovanje. Ispod kontraelektrode nalazi se aluminijski lijevak za uzorkovanje, koji je povezan s ostatkom eksperimentalne postavke putem otvora za uzorkovanje (slika 2b). Sve komponente uzorkivača su električno uzemljene kako bi se izbjeglo nakupljanje naboja koje bi moglo degradirati uzorkovanje čestica.
(a) Sistem za generisanje inženjerskih nanostruktura vode (EWNS). (b) Presjek uzorkivača i elektroraspršivača koji prikazuje najvažnije parametre. (c) Eksperimentalna postavka za inaktivaciju bakterija.
Gore opisani sistem za generisanje EWNS-a sposoban je za promjenu ključnih radnih parametara kako bi se olakšalo fino podešavanje EWNS svojstava. Podesite primijenjeni napon (V), udaljenost između igle i kontraelektrode (L) i protok vode (φ) kroz kapilaru kako biste fino podesili EWNS karakteristike. Simboli [V (kV), L (cm)] se koriste za označavanje različitih kombinacija. Podesite protok vode kako biste dobili stabilan Taylorov konus određenog skupa [V, L]. Za potrebe ove studije, otvor kontraelektrode (D) postavljen je na 0,5 inča (1,29 cm).
Zbog ograničene geometrije i asimetrije, jačina električnog polja ne može se izračunati iz prvih principa. Umjesto toga, za izračunavanje električnog polja korišten je softver QuickField™ (Svendborg, Danska). Električno polje nije uniformno, pa je vrijednost električnog polja na vrhu kapilare korištena kao referentna vrijednost za različite konfiguracije.
Tokom studije, nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i kontraelektrode procijenjeno je u smislu formiranja Taylorovog konusa, stabilnosti Taylorovog konusa, stabilnosti proizvodnje EWNS-a i ponovljivosti. Različite kombinacije prikazane su u Dodatnoj tabeli S1.
Izlaz sistema za generisanje EWNS-a bio je direktno povezan sa Scanning Mobility Particle Sizer-om (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) za mjerenje koncentracije broja čestica i korišten je sa Faradayevim aerosolnim elektrometrom (TSI, model 3068B, Shoreview, SAD). MN) za mjerenje protoka aerosola, kao što je opisano u našoj prethodnoj publikaciji9. I SMPS i aerosolni elektrometar uzorkovali su pri brzini protoka od 0,5 L/min (ukupni protok uzorka 1 L/min). Koncentracije čestica i aerosolni fluksevi mjereni su 120 s. Mjerenje ponoviti 30 puta. Ukupno naelektrisanje aerosola izračunava se iz trenutnih mjerenja, a prosječno EWNS naelektrisanje procjenjuje se iz ukupnog broja uzorkovanih EWNS čestica. Prosječni trošak EWNS-a može se izračunati pomoću jednačine (1):
gdje je IEl izmjerena struja, NSMPS je brojčani udio izmjeren pomoću SMPS-a, a φEl je brzina protoka do elektrometra.
Budući da relativna vlažnost (RH) utiče na površinski naboj, temperatura i (RH) su tokom eksperimenta održavane konstantnim na 21°C i 45%.
Za mjerenje veličine i životnog vijeka EWNS-a korišteni su mikroskopija atomskih sila (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornija) i AC260T sonda (Olympus, Tokio, Japan). Brzina skeniranja AFM-a je 1 Hz, a područje skeniranja je 5 µm × 5 µm sa 256 linija skeniranja. Sve slike su podvrgnute poravnanju slike prvog reda korištenjem Asylum softvera (maska ​​sa rasponom od 100 nm i pragom od 100 pm).
Uklonite lijevak za uzorkovanje i postavite površinu tinjca na udaljenost od 2,0 cm od kontraelektrode u prosječnom vremenu od 120 s kako biste izbjegli koalescenciju čestica i stvaranje nepravilnih kapljica na površini tinjca. EWNS je nanesen direktno na svježe izrezane površine tinjca (Ted Pella, Redding, CA). Odmah nakon raspršivanja, površina tinjca je vizualizirana pomoću AFM-a. Površinski kontaktni ugao svježe izrezanog nemodificiranog tinjca je blizu 0°, tako da se EWNS širi preko površine tinjca u obliku kupole20. Prečnik (a) i visina (h) difuznih kapljica su izmjereni direktno iz AFM topografije i korišteni za izračunavanje kupolastog difuzijskog volumena EWNS korištenjem naše prethodno validirane metode8. Pod pretpostavkom da ugrađeni EVNS ima isti volumen, ekvivalentni prečnik se može izračunati iz jednačine (2):
U skladu s našom prethodno razvijenom metodom, korištena je spinska zamka elektronske spinske rezonancije (ESR) za detekciju prisustva kratkotrajnih radikalnih međuprodukata u EWNS-u. Aerosoli su propušteni kroz rastvor koji sadrži 235 mM DEPMPO (5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Sva EPR mjerenja su izvršena korištenjem Bruker EMX spektrometra (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD) i nizova ravnih ćelija. Za prikupljanje i analizu podataka korišten je Acquisit softver (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD). Karakterizacija ROS-a je izvršena samo za skup radnih uslova [-6,5 kV, 4,0 cm]. Koncentracije EWNS-a su mjerene korištenjem SMPS-a nakon što je uzet u obzir gubitak EWNS-a u impaktoru.
Nivoi ozona praćeni su pomoću 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Za sva EWNS svojstva, izmjerena vrijednost je srednja vrijednost mjerenja, a greška mjerenja je standardna devijacija. Izvršen je t-test kako bi se uporedila vrijednost optimiziranog EWNS atributa s odgovarajućom vrijednošću osnovnog EWNS-a.
Slika 2c prikazuje prethodno razvijen i okarakteriziran sistem za prolaz elektrostatičke precipitacije (EPES) koji se može koristiti za ciljanje EWNS11 na površine. EPES koristi EWNS naboj u kombinaciji s jakim električnim poljem kako bi ga direktno "usmjerio" na površinu mete. Detalji EPES sistema predstavljeni su u nedavnoj publikaciji Pyrgiotakisa i saradnika.11. Dakle, EPES se sastoji od 3D printane PVC komore sa suženim krajevima koja sadrži dvije paralelne metalne ploče od nehrđajućeg čelika (nerđajući čelik 304, polirane do ogledala) u sredini, udaljene 15,24 cm. Ploče su bile povezane na vanjski izvor visokog napona (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), donja ploča je uvijek bila pozitivna, a gornja ploča je uvijek bila uzemljena (plutajuća). Zidovi komore su prekriveni aluminijskom folijom, koja je električno uzemljena kako bi se spriječio gubitak čestica. Komora ima zatvorena prednja vrata za utovar koja omogućavaju postavljanje ispitnih površina na plastične nosače, podižući ih s donje metalne ploče kako bi se izbjegle smetnje visokog napona.
Efikasnost taloženja EWNS-a u EPES-u izračunata je prema prethodno razvijenom protokolu detaljno opisanom u Dodatnoj slici S111.
Kao kontrolna komora, drugi protok kroz cilindričnu komoru je serijski povezan sa EPES sistemom koristeći među-HEPA filter za uklanjanje EWNS-a. Kao što je prikazano na slici 2c, EWNS aerosol je pumpan kroz dvije komore povezane serijski. Filter između kontrolne sobe i EPES-a uklanja sve preostale EWNS-ove, što rezultira istom temperaturom (T), relativnom vlažnosti (RH) i nivoima ozona.
Utvrđeno je da važni mikroorganizmi koji se prenose hranom kontaminiraju svježe proizvode, kao što su Escherichia coli (ATCC #27325), indikator fekalija, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen koji se prenosi hranom, Listeria innocua (ATCC #33090), alternativa patogenoj Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) kao alternativa kvascu koji uzrokuje kvarenje, i Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) kao otpornije žive bakterije kupljene su od ATCC (Manassas, Virginia).
Nasumično kupite kutije organskih cherry rajčica na lokalnoj pijaci i stavite ih u hladnjak na 4°C do upotrebe (do 3 dana). Odaberite rajčice za eksperiment jedne veličine, promjera oko 1,5 cm.
Protokoli za inkubaciju, inokulaciju, ekspoziciju i brojanje kolonija detaljno su opisani u našim prethodnim publikacijama i detaljno objašnjeni u Dodatnim podacima 11. Performanse EWNS-a procijenjene su izlaganjem inokuliranih rajčica koncentraciji od 40.000 #/cm3 tokom 45 minuta. Ukratko, u vremenu t = 0 min, tri rajčice su korištene za procjenu preživjelih mikroorganizama. Tri rajčice su stavljene u EPES i izložene EWNS-u u koncentraciji od 40.000 #/cc (rajčice izložene EWNS-u), a tri druge su stavljene u kontrolnu komoru (kontrolne rajčice). Nijedna od grupa rajčica nije podvrgnuta dodatnoj obradi. Rajčice izložene EWNS-u i kontrolne skupine uklonjene su nakon 45 minuta kako bi se procijenio učinak EWNS-a.
Svaki eksperiment je proveden u tri ponavljanja. Analiza podataka je izvršena prema protokolu opisanom u Dodatnim podacima.
Uzorci bakterija E. coli, Enterobacter i L. innocua izloženi EWNS-u (45 min, koncentracija EWNS aerosola 40.000 #/cm3) i neizloženi su taloženi kako bi se procijenili mehanizmi inaktivacije. Talog je fiksiran 2 sata na sobnoj temperaturi u 0,1 M rastvoru natrijum kakodilata (pH 7,4) sa fiksativom od 2,5% glutaraldehida, 1,25% paraformaldehida i 0,03% pikrinske kiseline. Nakon ispiranja, fiksirani su sa 1% osmijum tetroksida (OsO4)/1,5% kalijum ferocijanida (KFeCN6) tokom 2 sata, isprani 3 puta vodom i inkubirani u 1% uranil acetatu tokom 1 sata, a zatim isprani dva puta vodom. Naknadna dehidracija od 10 minuta sa 50%, 70%, 90%, 100% alkoholom. Uzorci su zatim stavljeni u propilen oksid na 1 sat i impregnirani smjesom propilen oksida i TAAP Epona (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) u omjeru 1:1. Uzorci su ugrađeni u TAAB Epon i polimerizirani na 60°C tokom 48 sati. Očvrsla granulirana smola je izrezana i vizualizirana TEM-om korištenjem JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan), konvencionalnog transmisionog elektronskog mikroskopa opremljenog AMT 2k CCD kamerom (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, SAD).
Svi eksperimenti su provedeni u tri ponavljanja. Za svaku vremensku tačku, bakterijski ispirci su nasađeni u tri ponavljanja, što je rezultiralo ukupno devet podatkovnih tačaka po tački, čiji je prosjek korišten kao bakterijska koncentracija za taj određeni organizam. Standardna devijacija je korištena kao greška mjerenja. Sve tačke se računaju.
Logaritam smanjenja koncentracije bakterija u poređenju sa t = 0 min izračunat je pomoću sljedeće formule:
gdje je C0 koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u vremenu 0 (tj. nakon što se površina osušila, ali prije nego što je stavljena u komoru), a Cn je koncentracija bakterija na površini nakon n minuta izlaganja.
Da bi se uzelo u obzir prirodno razgrađivanje bakterija tokom perioda izlaganja od 45 minuta, izračunata je i logaritamska redukcija u poređenju sa kontrolnom grupom nakon 45 minuta na sljedeći način:
Gdje je Cn koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u vremenu n, a Cn-Control je koncentracija kontrolnih bakterija u vremenu n. Podaci su prikazani kao logaritam smanjenja u poređenju s kontrolom (bez izloženosti EWNS-u).
Tokom studije, nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i kontraelektrode procijenjeno je u smislu formiranja Taylorovog konusa, stabilnosti Taylorovog konusa, stabilnosti proizvodnje EWNS-a i reproducibilnosti. Različite kombinacije prikazane su u Dodatnoj tabeli S1. Dva slučaja su odabrana za kompletnu studiju koja pokazuje stabilna i reproducibilna svojstva (Taylorov konus, proizvodnja EWNS-a i stabilnost tokom vremena). Na slici 3 prikazani su rezultati o naboju, veličini i sadržaju ROS-a za dva slučaja. Rezultati su također sažeti u Tabeli 1. Kao referenca, Slika 3 i Tabela 1 uključuju svojstva prethodno sintetiziranog neoptimiziranog EWNS-a8, 9, 10, 11 (osnovni EWNS). Izračuni statističke značajnosti korištenjem dvostranog t-testa ponovo su objavljeni u Dodatnoj tabeli S2. Pored toga, dodatni podaci uključuju studije o utjecaju promjera otvora za uzorkovanje kontraelektrode (D) i udaljenosti između uzemljene elektrode i vrha igle (L) (Dodatne slike S2 ​​i S3).
(a–c) AFM distribucija veličine. (d–f) Karakteristika površinskog naboja. (g) Karakterizacija ROS i ESR.
Također je važno napomenuti da su za sve gore navedene uslove izmjerene struje jonizacije bile u rasponu od 2-6 µA, a naponi u rasponu od -3,8 do -6,5 kV, što je rezultiralo potrošnjom energije za ovaj jedno-terminalni EWNS modul za generisanje manjom od 50 mW. Iako je EWNS sintetiziran pod visokim pritiskom, nivoi ozona bili su vrlo niski, nikada ne prelazeći 60 ppb.
Dodatna slika S4 prikazuje simulirana električna polja za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Polja prema scenarijima [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] izračunata su kao 2 × 10⁶ V/m i 4,7 × 10⁶ V/m, respektivno. To je i očekivano, budući da je odnos napona i udaljenosti mnogo veći u drugom slučaju.
Na slikama 3a i 3b prikazan je promjer EWNS-a izmjeren pomoću AFM8. Prosječni promjeri EWNS-a za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] izračunati su kao 27 nm i 19 nm, respektivno. Geometrijske standardne devijacije distribucija za slučajeve [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] iznose 1,41 i 1,45, respektivno, što ukazuje na usku distribuciju veličine. I srednja veličina i geometrijska standardna devijacija su vrlo blizu osnovnom EWNS-u, iznoseći 25 nm i 1,41, respektivno. Na slici 3c prikazana je distribucija veličine osnovnog EWNS-a izmjerena istom metodom pod istim uslovima.
Na slici 3d,e prikazani su rezultati karakterizacije naboja. Podaci predstavljaju prosječna mjerenja 30 istovremenih mjerenja koncentracije (#/cm3) i struje (I). Analiza pokazuje da je prosječno naboje na EWNS-u 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- za [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], respektivno. U poređenju sa Baseline-EWNS (10 ± 2 e-), njihovo površinsko naboje su značajno veće, dvostruko veće nego u scenariju [-6,5 kV, 4,0 cm] i četiri puta veće nego u scenariju [-3,8 kV, 0,5 cm]. Slika 3f prikazuje osnovne podatke o plaćanju za EWNS.
Iz mapa koncentracije broja EWNS (Dopunske slike S5 i S6), može se vidjeti da scena [-6,5 kV, 4,0 cm] ima značajno veći broj čestica nego scena [-3,8 kV, 0,5 cm]. Također treba napomenuti da su koncentracije broja EWNS praćene do 4 sata (Dopunske slike S5 i S6), gdje je stabilnost generacije EWNS pokazala iste nivoe koncentracije broja čestica u oba slučaja.
Slika 3g prikazuje EPR spektar nakon oduzimanja kontrole (pozadine) za optimizirani EWNS na [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektar je također upoređen s osnovnom linijom EWNS-a u prethodno objavljenom radu. Izračunati broj EWNS-a koji reaguju sa spin zamkom je 7,5 × 10⁴ EWNS/s, što je slično prethodno objavljenoj osnovnoj liniji-EWNS8. EPR spektri jasno su ukazali na prisustvo dvije vrste ROS-a, gdje je O2- dominirao, dok je OH• bio prisutan u manjoj količini. Osim toga, direktno poređenje intenziteta vrhova pokazalo je da optimizirani EWNS ima značajno veći sadržaj ROS-a u poređenju s osnovnom linijom EWNS-a.
Na sl. 4 prikazana je efikasnost taloženja EWNS-a u EPES-u. Podaci su također sumirani u Tabeli I i upoređeni s originalnim EWNS podacima. Za oba EUNS slučaja, taloženje je bilo blizu 100% čak i pri niskom naponu od 3,0 kV. Tipično, 3,0 kV je dovoljno za postizanje 100% taloženja bez obzira na promjenu površinskog naboja. Pod istim uvjetima, efikasnost taloženja Baseline-EWNS-a bila je samo 56% zbog nižeg naboja (prosječno 10 elektrona po EWNS-u).
Slika 5 i Tabela 2 sumiraju stepen inaktivacije mikroorganizama inokuliranih na površini paradajza nakon izlaganja približno 40.000 #/cm3 EWNS-a tokom 45 minuta pod optimalnom scenariju [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulirane E. coli i L. innocua pokazale su značajno smanjenje od 3,8 log nakon 45 minuta izlaganja. Pod istim uslovima, S. enterica je pokazala niže log smanjenje od 2,2 log, dok su S. cerevisiae i M. parafortuitum pokazali smanjenje od 1,0 log.
Elektronske mikrografije (Slika 6) prikazuju fizičke promjene izazvane EWNS-om u ćelijama E. coli, Salmonella enterica i L. innocua, što dovodi do inaktivacije. Kontrolne bakterije su pokazale neoštećene ćelijske membrane, dok su izložene bakterije imale oštećene vanjske membrane.
Elektronsko-mikroskopsko snimanje kontrolnih i izloženih bakterija otkrilo je oštećenje membrane.
Podaci o fizičko-hemijskim svojstvima optimizovanih EWNS-a zajedno pokazuju da su svojstva EWNS-a (površinski naboj i sadržaj ROS-a) značajno poboljšana u poređenju sa prethodno objavljenim osnovnim podacima EWNS-a8,9,10,11. S druge strane, njihova veličina je ostala u nanometarskom opsegu, što je vrlo slično prethodno objavljenim rezultatima, što im omogućava da ostanu u zraku duži vremenski period. Uočena polidisperznost može se objasniti promjenama površinskog naboja, koje određuju veličinu Rayleighovog efekta, slučajnosti i potencijalnog spajanja EWNS-a. Međutim, kako su detaljno opisali Nielsen i saradnici22, visoki površinski naboj smanjuje isparavanje efektivnim povećanjem površinske energije/napona kapljice vode. Ova teorija je eksperimentalno potvrđena za mikrokapljice22 i EWNS u našoj prethodnoj publikaciji8. Gubitak vremena također može utjecati na veličinu i doprinijeti uočenoj raspodjeli veličine.
Osim toga, naboj po strukturi iznosi oko 22–44 e-, ovisno o okolnostima, što je znatno više u usporedbi s osnovnim EWNS-om, koji ima prosječno naboje od 10 ± 2 elektrona po strukturi. Međutim, treba napomenuti da je ovo prosječno naboje EWNS-a. Seto i suradnici. Pokazalo se da naboj nije ujednačen i da slijedi logaritamsko-normalnu distribuciju21. U usporedbi s našim prethodnim radom, udvostručenje površinskog naboja udvostručuje učinkovitost taloženja u EPES sustavu na gotovo 100%11.