Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) je mahunarka koja se koristi za proizvodnju hrane i poboljšanje tla.Globalna ekspanzija NLL kao kulture privukla je mnoge patogene gljive, uključujući antraknozu lupine, koja uzrokuje razornu bolest antraknoze.Dva alela, Lanr1 i AnMan, koji daju povećanu otpornost, korištena su u uzgoju NLL-a, ali osnovni molekularni mehanizmi ostaju nepoznati.U ovoj studiji, Lanr1 i AnMan markeri su korišteni za skrining evropskih NLL uzoraka.Testiranje vakcine u kontrolisanom okruženju potvrdilo je efikasnost oba rezistentna donora.Profiliranje diferencijalne ekspresije gena je izvedeno na reprezentativnim rezistentnim i osjetljivim linijama.Otpornost na antraknozu bila je povezana sa prekomjernom ekspresijom pojmova ontologije gena “GO:0006952 Defense Response”, “GO:0055114 Redox Process” i “GO:0015979 Photosynthesis”.Pored toga, Lanr1(83A:476) linija je pokazala značajno reprogramiranje transkriptoma brzo nakon inokulacije, dok su druge linije pokazale kašnjenje u ovom odgovoru za oko 42 sata.Odbrambeni odgovori su povezani sa genima TIR-NBS, CC-NBS-LRR i NBS-LRR, 10 proteina uključenih u patogenezu, proteinima za prijenos lipida, endoglukan-1,3-β-glukozidazom, proteinima ćelijskog zida bogatim glicinom i genima iz reaktivnog puta kisika.Rani odgovori na 83A:476, uključujući pažljivu supresiju gena povezanih s fotosintezom, poklopili su se s uspješnom zaštitom tokom vegetativne faze rasta biologije gljiva, što sugerira da efektor pokreće imunitet.Mandeloop reakcija je usporena, kao i ukupni horizontalni otpor.
Uskolisna lupina (NLL, Lupinus angustifolius L.) je visokoproteinska žitarica porijeklom iz zapadnog Mediterana1,2.Trenutno se uzgaja kao hrana za životinje i ljude.Takođe se smatra zelenim đubrivom u sistemima plodoreda zbog fiksacije azota simbiotskim bakterijama koje fiksiraju azot i opšteg poboljšanja strukture zemljišta.NLL je prošao brzi proces pripitomljavanja u prošlom stoljeću i još uvijek je pod visokim pritiskom uzgoja3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Sa široko rasprostranjenim uzgojem NLL, niz patogenih gljiva razvilo je nove poljoprivredne niše i izazvalo nove bolesti koje uništavaju usjeve. Najznačajnija za uzgajivače i uzgajivače lupine bila je pojava antraknoze, uzrokovane patogenom gljivom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najznačajnija za uzgajivače i uzgajivače lupine bila je pojava antraknoze, uzrokovane patogenom gljivom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najviše prikladnih za farmere i selekcionere ljupina bilo je pojavljivanje antraknoze, izazvanog patogenom gljivicom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Uzgajivačima i uzgajivačima lupine najznačajnija je bila pojava antraknoze uzrokovane patogenom gljivom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现, 它是由眏者来说,最引人注目的是炭疽病的出现, 它是由眏者匎由眏Bondar 由, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现, 它是由絗 它是由絗Haired。1 Najviše štetnih za farmere i selekcionere ljupina je pojava antraknoze, koja izaziva patogenu gljivicu Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Uzgajivače i uzgajivače vučije najviše pogađa pojava antraknoze uzrokovane patogenom gljivom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Najraniji izvještaji o bolesti došli su iz Brazila i Sjedinjenih Država, s tipičnim simptomima koji su se pojavili 1912. i 1929. godine.Međutim, nakon otprilike 30 godina, patogen je označen kao Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld u Celenapravnoj morfologiji. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld u ciljanoj morfologiji. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .i H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。i H. Schlenk, .Preliminarna fenotipizacija bolesti urađena sredinom 20. stoljeća pokazala je određenu rezistenciju kod NLL i žute vučije (L. luteus L.), ali su sve testirane aksesije bijele lupine (L. albus L.) bile vrlo osjetljive15,16.Istraživanja su pokazala da je razvoj antraknoze povezan sa povećanim padavinama (vlažnošću vazduha) i temperaturom (u rasponu od 12-28°C), što dovodi do narušavanja rezistencije na višim temperaturama17, 18. Zapravo, vreme potrebno da konidije proklijaju i da se bolest započne, bilo je četiri puta kraće na 24°C (12 sati) pri visokoj vlažnosti (12 sati)Stoga je globalno zagrijavanje koje je u toku dovelo do širenja antraknoze.Međutim, bolest je u Francuskoj (1982.) i Ukrajini (1983.) uočena kao predznaka nadolazeće prijetnje, ali je očigledno ignorirana od strane industrije lupine u to vrijeme20,21.Nekoliko godina kasnije, ova razorna bolest se proširila po cijelom svijetu i zahvatila velike zemlje koje proizvode vučicu kao što su Australija, Poljska i Njemačka22,23,24.Nakon izbijanja antraknoze sredinom 1990-ih, opsežni skrining je rezultirao identifikacijom nekoliko rezistentnih donora u uzorcima NLL19.Otpornost NLL na antraknozu kontrolišu dva odvojena dominantna alela pronađena u različitim izvorima germplazme: Lanr1 u sorti Tanjil i Wonga i AnMan u sorti.Mandalay 25, 26. Ovi aleli dopunjuju molekularne markere koji podržavaju selekciju rezistentne germplazme u programima uzgoja25,26,27,28,29,30.Rezistentna linija razmnožavanja 83A:476 koja nosi alel Lanr1 ukrštena je sa osjetljivom divljom linijom P27255 da bi se dobila RIL populacija koja se segregira za otpornost na antraknozu, što je omogućilo dodjelu Lanr1 lokusa hromozomu NLL-1131, 32, 33 sa hromozomom NLL-1131, 32, 33 sa genomskim okvirom rezistencije na ramsku rezistenciju. , NLL je otkrio lokaciju sva tri alela na istom hromozomu (NLL-11), ali na različitim pozicijama29,34,35.Međutim, zbog malog broja RIL-ova i velike genetske udaljenosti između markera i odgovarajućih alela, ne mogu se izvući pouzdani zaključci o njihovim genima u osnovi.S druge strane, upotreba reverzne genetike kod lupina je teška zbog njihovog vrlo niskog potencijala regeneracije, što genetsku manipulaciju čini glomaznom37.
Razvoj pripitomljene germplazme koja nosi željeni alel u homozigotnom stanju, kao što su 83A:476 (Lanr1) i Mandelup (AnMan), otvorio je vrata proučavanju otpornosti na antraknozu u odnosu na prisustvo suprotstavljenih kombinacija alela u divljim populacijama.Mogućnosti molekularnih mehanizama.Uporedite odbrambene odgovore generisane specifičnim genotipovima.Ova studija je procijenila rani odgovor transkriptoma NLL na vakcinaciju protiv C. lupini.Prvo, evropski panel zametne plazme NLL koji je sadržavao 215 linija je pregledan pomoću molekularnih markera koji označavaju alele Lanr1 i AnMan.Fenotipizacija antraknoze je zatim izvršena na 50 NLL linija, prethodno odabranih za molekularne markere, u kontrolisanim uslovima.Na osnovu ovih eksperimenata, četiri linije koje se razlikuju po rezistenciji na antraknozu i Lanr1/AnMan alelnom sastavu su odabrane za diferencijalno profilisanje ekspresije odbrambenih gena koristeći dva komplementarna pristupa: visokopropusno RNA sekvenciranje i PCR kvantifikaciju u realnom vremenu.
Skrining seta NLL germplazme (N = 215) sa markerima Lanr1 (Anseq3 i Anseq4) i AnMan (Anseq4) i AnMan (AnManM1) pokazao je da samo jedna linija (95726, u blizini Salamanke-b) pojačava "rezistentni markeri" koji je pronađen, dok je alel "proizvodljivosti" pronađen za sve "preceptorske" svih markera u 158 (~73,5%) linija.Trinaest linija je proizvelo dva “otporna” alela Lanr1 markera, a 8 linija je proizvelo “otporne” alele Lanr1.marker.Alel "otpornosti" AnMan markera (dodatna tabela S1).Dvije linije su bile heterozigotne za Anseq3 marker i jedna heterozigotna za AnManM1 marker.42 linije (19,5%) nosile su suprotne faze alela Anseq3 i Anseq4, što ukazuje na visoku učestalost rekombinacije između ova dva lokusa.Fenotipovi antraknoze u kontrolisanim uslovima (dopunska tabela S2) otkrili su varijabilnost u otpornosti testiranih genotipova, što se odrazilo na težinu antraknoze.Razlike u srednjim ocjenama kretale su se od 1,8 (umjereno otporne) do 6,9 (osjetljive), a razlike u težini biljaka bile su od 0,62 (osjetljive) do 4,45 g (otporne). Postojala je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u dvije replikacije eksperimenta (0,51 za ocjene ozbiljnosti bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za masu biljke, P < 0,0001) kao i između ova dva parametra (− 0,59 i − 0,77, P < 0,0001). Uočena je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u dvije replikacije eksperimenta (0,51 za ocjene težine bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za masu biljke, P < 0,0001) kao i između ova dva parametra (− 0,59 i − 0,77, P < 0,0001). Označena je dostojna korelacija između značenja, koja se posmatraju u dva ponovljena eksperimenta (0,51 za ballov težnje bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za masu biljaka, P < 0,0001), a takođe između ovih dvaju parametara (-0,59 i -0,77, R < 0,00) 0,00). Utvrđena je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u dva ponavljanja eksperimenta (0,51 za ocjene težine bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za masu biljke, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (- 0,59 i -0,77, P < 0,0001)).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性(疾病严重程度00.01)（0700000000物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和-0,77，P <0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 的 值1, p = 0,00017, 植物 为 为 0,61, p <0,0001) 以及 两 个 参数 之–间 （（-（0.59 （（-（9.（9.5和– 0,59 和- 0,77, P < 0,0001)。 Nasledila je značajna korelacija između značenja, koja se posmatraju u dva ponavljanja (ocena težnje bolesti 0,51, P = 0,00017 i masa biljaka 0,61, P <0,0001), i između ovih dveju parametara (-0,59 i -0,0001) 0,77, P <0,000. Postojala je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u duplikatu (skor težine bolesti 0,51, P = 0,00017 i težina biljke 0,61, P < 0,0001) i između ova dva parametra (-0,59 i -0,0001) 0,77, P<0,0001. ).Tipični simptomi koji se vide kod osjetljivih biljaka uključuju savijanje i uvijanje stabljike nalik strukturi „pastirskog luka“, praćeno ovalnim lezijama s narandžastim/ružičastim sporozoitima (dopunska slika 1).Australski akcesiji koji nose Lanr1 (83A:476 i Tanjil) i AnMan (Mandelup) gene su umjereno otporni, 0,0331 i 0,0036).Neke linije koje također nose "otporne" Lanr1 i/ili AnMan alele pokazuju simptome bolesti.
Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija bez bilo kakvog "otpornog" markerskog alela otkrilo visok nivo otpornosti na antraknozu (uporediv ili veći nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P vrijednost < 0,0001 za oba parametra), Bojar (P vrijednost < 0,0001 za rezultat i vrijednost B-0,009) i Popula < 0,009 (vrijednost B-0,009) 01 za rezultat i beznačajan za težinu). Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija bez bilo kakvog "otpornog" markerskog alela otkrilo visok nivo otpornosti na antraknozu (uporediv ili veći nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P vrijednost < 0,0001 za oba parametra), Bojar (P vrijednost < 0,0001 za rezultat i vrijednost B-0,009) i Popula < 0,009 (vrijednost B-0,009) 01 za rezultat i beznačajan za težinu). Interesantno, nekoliko linija NLL-a, bez ikakvog-bilo «rezistentnog» markerskog alela, pokazuje visok nivo otpornosti na antraknozu (postavljen ili više visok, od genotipova Lanr1 ili AnMan), kao što je Boregine (značenje P <0,0001 za ocjenu obojih parametara), Bojar (značenje P < 0,000) i biljne vrijednosti 9/79b (značenje P <0,0001 za ocjenu i neznatno za masu). Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija bez bilo kakvog 'rezistentnog' markerskog alela pokazalo visok nivo otpornosti na antraknozu (uporediv ili veći od genotipova Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P vrijednost < 0,0001 za oba parametra), Bojar (P vrijednost < 0,0001 za procjenu i 0,0001 vrijednost za populaciju i B-7P vrijednost < 0). 0001 za evaluaciju i nije značajno za težinu).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平高水平的炭疽AM1渎an 基因型相当或更高）,例如Boregine (两个参数的P 值< 0,0001)、Bojar (P 值<庇分0000) .001）和种群B-549/79b (得分P 值< 0,0001), 重量不显着）。 Zanimljivo je da neki NLL sistemi koji nemaju nikakve “antigene” markere pokazuju visoku horizontalnu rezistenciju (ekvivalent Lanr1 ili AnMan genima ili više), kao što su Boregine (oba parametra P < 0,0001), Bojar (P vrijednost < 0,0001, težina biljke 0,001) i soj B-549/7 značajna težina (P vrijednost <0,0b). Interesantno, da su neke linije NLL-a lišene bilo kakvih-bilo markiranih aleja «rezistentnosti», pokazale su visoke otpornosti na antraknozu (sravne ili više, nego što su genotipovi Lanr1 ili AnMan), takve kao Boregine (značenje P za obojene parametre <0,0001), Bojar (značenje P <0,07000001), Bojar (značenje P <0,0700005) b (ocena P-značenje <0,0001, neznačajna masa). Zanimljivo je da su neke NLL linije bez alela markera "rezistencije" pokazale visok nivo otpornosti na antraknozu (uporediv ili veći od genotipova Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P vrijednost za oba parametra <0,0001) , Bojar (P-vrijednost < 0,0001, populacija B-01, težina biljke) 0,0001, težina nije značajna).Ovaj fenomen ukazuje na mogućnost novog genetskog izvora rezistencije, objašnjavajući uočeni nedostatak korelacije između genotipova markera i fenotipova bolesti (P ​​vrijednosti od ~0,42 do ~0,98).Tako je Kolmogorov-Smirnov test pokazao da su podaci o otpornosti na antraknozu približno normalno raspoređeni za bodove (P-vrijednosti 0,25 i 0,11) i biljnu masu (P-vrijednosti 0,47 i 0,55), što sugerira da pretpostavljam da je uključeno više alela od Lanr1 i AnMan.
Na osnovu rezultata skrininga otpornosti na antraknozu, 4 linije su odabrane za analizu transkriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup i Populacija 22660. Ove linije su ponovo testirane na otpornost na antraks u eksperimentima inokulacije sekvenciranjem RNK, pod uslovom da su iste kao u prethodnom testu.Vrijednosti skora su bile sljedeće: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) i populacija 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 postigao je u prosjeku 40,5 Mread parova po uzorku (29,7 do 54,4 Mreads) (dodatna tabela S3).Rezultati poravnanja u referentnoj sekvenci kretali su se od 75,5% do 88,6%.Prosječna korelacija podataka broja očitanih između eksperimentalnih varijanti između bioloških replika kretala se od 0,812 do 0,997 (srednja vrijednost 0,959). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo ekspresiju, a ostalih 4785 gena je bilo izraženo na zanemarljivom nivou (osnovna srednja vrijednost < 5). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo ekspresiju, a ostalih 4785 gena je bilo izraženo na zanemarljivom nivou (osnovna srednja vrijednost < 5). Od 35 170 analiziranih genova 2917 nije ispoljilo ekspresiju, a ostalih 4785 genova ekspresiralo se na neznatnom nivou (bazovo srednje <5). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo ekspresiju, a preostalih 4785 gena je bilo izraženo na zanemarljivom nivou (osnovna srednja vrijednost <5).在分析的35,170 个基因中, 2917 个没有表达, 其他4785 个基因的表达可以帿值< 5).35,170 Od 35 170 analiziranih genova 2917 nije ekspresirano, a ostalih 4785 gena su neznatne ekspresije (bazovo srednje vrijednosti <5). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije eksprimirano, a preostalih 4785 gena je imalo zanemarljivu ekspresiju (osnovna srednja vrijednost <5).Dakle, broj gena koji se smatra eksprimiranim (osnovna srednja vrijednost ≥ 5) tokom eksperimenta bio je 27.468 (78,1%) (dodatna tabela S4).
Od prve vremenske tačke, sve NLL linije su reagovale na inokulaciju C. lupini (soj Col-08) reprogramiranjem transkriptoma (Tabela 1), međutim, uočene su značajne razlike između linija.Tako je linija otpornosti 83A:476 (koja nosi gen Lanr1) pokazala značajno reprogramiranje transkriptoma u prvoj vremenskoj tački (6 hpi) sa 31-69 puta povećanjem broja izolovanih up- i down-gena u poređenju sa drugim vremenskim tačkama u ovoj vremenskoj tački.Osim toga, ovaj maksimum je bio kratkotrajan, jer je ekspresija samo nekoliko gena ostala značajno izmijenjena u drugoj vremenskoj tački (12 hpi).Zanimljivo je da Boregine, koji je takođe pokazao visok nivo otpornosti u testu grafta, nije prošao tako masivno reprogramiranje transkripcije tokom eksperimenta.Međutim, broj različito eksprimiranih gena (DEG) bio je isti za Boregine i 83A:476 na 12 HPI.I Mandelup i populacija 22660 su pokazali DEG vrhove u posljednjoj vremenskoj tački (48 l/s), što ukazuje na relativno kašnjenje u odgovorima odbrane.
Budući da je 83A:476 prošao masivno reprogramiranje transkriptoma kao odgovor na C. lupini pri 6 HPI u poređenju sa svim drugim linijama, ~91% DEG-ova uočenih u ovom trenutku bilo je specifično za lozu (Slika 1).Međutim, bilo je određenog preklapanja u ranim odgovorima između studija, jer se 68,5%, 50,9% i 52,6% DEG u Boregineu, Mandelupu i populaciji 22660, respektivno, preklapalo sa onima pronađenim u 83A:476 u određenim vremenskim periodima.Međutim, ovi DEG-ovi su činili samo mali dio (0,97–1,70%) svih DEG-ova koji su trenutno detektovani korištenjem 83A:476.Osim toga, 11 stupnjeva iz svih linija je u to vrijeme bilo koherentno (dopunske tabele S4-S6), uključujući uobičajene komponente odbrambenih odgovora biljaka: protein prijenosa lipida (TanjilG_32225), enzim endoglukan-1,3-β-glukozida (TanjilG_23384), dva proteina stress1G_23384 (TanjilG_23384), dva proteina stress1G_5282 (Tanjil_Slike2). _31531), osnovni protein lateksa (TanjilG_32352) i dva proteina strukturnih ćelijskih stijenki bogata glicinom (TanjilG_19701 i TanjilG_19702).Postojalo je i relativno veliko preklapanje u odgovorima transkriptoma između 83A:476 i Boregine na 24 HPI (ukupno 16-38% DEG) i između Mandelup-a i Populacije 22660 na 48 HPI (ukupno 14-20% DEG).
Venov dijagram koji prikazuje broj različito eksprimiranih gena (DEG) u linijama uskolisne vučije (NLL) inokuliranih Colletotrichum lupini (soj Col-08 dobijen sa polja vučice u Wierzhenice, Poljska, 1999.).Analizirane NLL linije su: 83A:476 (otporne, nose Lanr1 alel), Boregine (otporne, genetska pozadina nepoznata), Mandelup (umjereno otporne, nose AnMan alel) i populacija 22660 (veoma osjetljiva).Skraćenica hpi stoji satima nakon vakcinacije.Nulte vrijednosti su uklonjene radi pojednostavljenja grafikona.
Skup prekomjerno eksprimiranih gena na 6 hpi analiziran je na prisustvo kanonskih R genskih domena (Dopunska tabela S7).Ova studija je otkrila indukciju transkriptoma klasičnih gena otpornosti na bolesti sa NBS-LRR domenima samo na 83A:476.Ovaj set se sastojao od jednog TIR-NBS-LRR gena (tanjilg_05042), pet CC-NBS-LRR gena (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, i tanjilg_16162), i F6 FourBS-1LR N, i F6 FourBS-16162-1. (tanjilg_16162) kao i Četiri NBS-Lrr (tanjilg_16162) i Četiri NBS-LRR (TANJILG_16162).Svi ovi geni imaju kanonske domene raspoređene u očuvane sekvence.Pored gena domene NBS-LRR, aktivirano je nekoliko RLL kinaza na 6 hpi, i to jedna u Boregine (TanjilG_19877), dvije u Mandelupu (TanjilG_07141 i TanjilG_19877) i u populaciji 22660 (TanjilG_0981) 76.
Geni sa značajno izmijenjenom ekspresijom kao odgovor na inokulaciju sa C. lupini (soj Col-08) podvrgnuti su analizi obogaćivanja genske ontologije (GO) (dodatna tabela S8). Najčešće prezastupljeni termin biološkog procesa bio je „GO:0006952 odbrambeni odgovor“ koji se pojavio u 6 od 16 (vreme × linija) kombinacija sa visokim značajem (P vrijednost < 0,001) (slika 2). Najčešće prezastupljeni termin biološkog procesa bio je „GO:0006952 odbrambeni odgovor“ koji se pojavio u 6 od 16 (vreme × linija) kombinacija sa visokim značajem (P vrijednost < 0,001) (slika 2). Najčešći uobičajeni terminom biološkog procesa bio je «GO: 0006952 zaštitni odgovor», koji se pojavio u 6 od 16 (vrijeme × linija) kombinacijom značajnosti (značenje P <0,001) (ris. 2). Najčešće prezastupljeni termin biološkog procesa bio je 'GO:0006952 odbrambeni odgovor', koji se pojavio u 6 od 16 (vreme × linija) kombinacija sa visokim značajem (P vrijednost < 0,001) (slika 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 现在16 现在16.个中，具有高显着性 (P 值< 0,001) (图2)。 Najreprezentativniji termin biološkog procesa je „GO:0006952 odbrambeni odgovor“, koji se pojavljuje u 6 od 16 (时间×线) kombinacija, sa visokim značajem (P vrijednost < 0,001) (图2). Najčešći uobičajeni terminom biološkog procesa bio je «GO: 0006952 odgovor odbrane», koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (srijeda × linija) s visokom značajnošću (značenje P <0,001) (ris. 2). Najčešći prezastupljeni pojam biološkog procesa bio je 'GO:0006952 Odbrambeni odgovor', koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (vreme × linija) sa visokim značajem (P vrijednost < 0,001) (slika 2).Ovaj termin je bio previše zastupljen u dvije vremenske tačke u 83A: 476 i Boregine (6 i 24 hpi) iu jednom vremenskom trenutku u Mandelupu i Populaciji 22660 (12 i 6 hpi, respektivno).Ovo je očekivani rezultat, koji naglašava antifungalni odgovor rezistentnih linija.Osim toga, 83A:476 je odgovorio na C. lupini brzim induciranjem gena povezanih s oksidativnim praskom predstavljenim terminom “GO:0055114 redoks proces”, što ukazuje na specifičan odbrambeni odgovor, dok je Boregine otkrio specifične odbrambene odgovore, povezane s terminom 'GO'.:0006950 Odgovor na stres”.Populacija 22660 aktivirala je odgovor horizontalne rezistencije koji uključuje sekundarne metabolite, ističući prekomjeran broj pojmova “GO:0016104 Proces biosinteze triterpena” i “GO:0006722 Proces metabolizma triterpena” (oba termina pripadaju istom skupu gena, rezultat je Borupova analiza gena i GO Stabilitet), uzimajući u obzir rezultate Borupeove analize. populacija 22660. Osim toga, rana reakcija 83A:476 (6 hpi) i odgođena reakcija Mandelup i Populacija 22660 uključuju termin GO:0015979 'fotosinteza' i druge povezane biološke procese.
Pojmovi ontologije bioprocesnog gena odabrani u anotaciji različito eksprimiranih gena tokom transkriptomskih odgovora uskolisne vučike (NLL) inokulirane antraksom vučjicom (soj Col-08 dobiven sa polja vučice u Wierzhenice, Poljska, 1999.) su uvelike preuveličani.Analizirane NLL linije su: 83A:476 (otporne, nose homozigotni alel Lanr1), Boregine (otporne, nepoznate genetske pozadine), Mandelup (umjereno otporne, nose homozigotni AnMan alel) i populacija 22660 (osjetljiva).
Budući da je ova studija imala za cilj da identifikuje gene koji doprinose otpornosti na antraknozu, geni koji su dodijeljeni terminima GO “GO: 0006952 Odbrambeni odgovori” i “GO: 0055114 Redoks procesi” analizirani su s graničnim vrijednostima jer osnovna linija znači ≥ 30 s najmanje jednom linijom.× tačka u vremenu koja kombinuje statistički značajne vrednosti log2 (promena puta).Broj gena koji zadovoljavaju ove kriterije bio je 65 za GO:0006952 i 524 za GO:0055114.
83A:476 je otkrio dva DEG vrha označena terminom GO:0006952, prvi sa 6 gena po inču (64 gena, regulacija gore i dolje) i drugi sa 24 gena po inču (15 gena, samo regulacija gore).Boregine je takođe pokazao da je GO:0006952 dostigao vrhunac u isto vreme, ali sa manje DEG (11 i 8) i preferencijalnom aktivacijom.Mandeloop je pokazao dva vrha GO:0006952 na 12 i 48 HPI, oba nose 12 gena (prvi sa aktivirajućim genima, a drugi sa samo supresivnim genima), dok je populacija od 22660 sa 6 HPI (13 gena) imala veću dominaciju pika povećanja.regulacija.Treba napomenuti da je 96,4% GO:0006952 DEG u ovim pikovima imalo isti tip odgovora (gore ili dole), što ukazuje na značajno preklapanje u odgovorima odbrane uprkos razlikama u broju uključenih gena.Najveća grupa sekvenci koja se odnosi na termin GO:0006952 kodira protein poruke 22 povezan sa stresom gladovanja (sličan SAM22), koji pripada proteinskoj kladi proteina povezanog sa patogenezom (PR-10) klase 10 i lateksu jezgra proteina.sličan (MLP-sličan) protein) protein (slika 3).Dvije grupe su se razlikovale po prirodi izražavanja i smjeru odgovora.Geni koji kodiraju proteine ​​slične SAM22 pokazali su konzistentnu i značajnu indukciju u ranim vremenskim tačkama (6 ili 12 hpi) i generalno nisu reagirali na kraju eksperimenta (48 hpi), dok su proteini slični MLP-u pokazali koordinaciju na 6 hpi.hpi.83A:476 i Mandelup pri 48 hp/in, skoro sve druge tačke podataka nisu reagovale.Osim toga, razlike u profilima ekspresije proteinskih gena sličnih SAM22 pratile su uočenu varijabilnost u otpornosti na antraknozu, jer su otpornije linije imale više vremenskih tačaka koje su značajno inducirale ove gene nego osjetljiviji geni.Drugi LlR18A/B-sličan PR-10 gen pokazao je vrlo sličan obrazac ekspresije kao i proteinski gen sličan SAM22.
Identificirane su glavne komponente termina biološkog procesa “GO:0006952 Defense Response” i obrasci ekspresije gena kandidata za Lanr1 i AnMan alele.Log2 skala predstavlja log2 vrijednosti (promjenu puta) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen sa polja vučice, Wizhenica, Poljska, 1999) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u isto vrijeme.Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (otporne, nose homozigotni Lanr1 alel), Boregine (otporne, genetska pozadina nepoznata), Mandelup (umjereno otporne, nose homozigotni AnMan alel) i Populacija 22660 (osjetljiva).
Pored toga, procijenjeni su profili ekspresije RNA-seq kandidata gena Lanr1 (TanjilG_05042) i AnMan (TanjilG_12861) (slika 3).Gen TanjilG_05042 pokazao je značajan odgovor (aktivaciju) na 83A:476 samo u prvoj vremenskoj tački (6 hpi), dok je TanjilG_12861 bio značajan u Mandeloop-u samo u dvije vremenske tačke: 6 hpi (regulacija naniže) i 24 hpi (6 hpi).Sa.).podesivo) ).
Najviše eksprimirani geni u terminu GO:0055114 “redox proces” bili su geni koji kodiraju proteine ​​citokroma P450 i peroksidazu (slika 4).Za uzorke izolovane iz 83A:476 na 6 HPI, maksimalne ili minimalne log2 (promjene puta) vrijednosti (za 86,6% gena) općenito su uočene između inokuliranih i kontrolnih biljaka, naglašavajući visoku reakciju ovog genotipa na inokulacijski spol.83A:476 je pokazao najznačajniji GO: 0055114 DEG na 6 hpi (503 gena), dok su ostale linije na 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gena; i Populacija 22660, 78 gena)).U većini gena porodice GO:0055114 uočena su dva tipa odgovora na vakcinaciju (aktivacija i inhibicija).Zanimljivo je da do 97,6% DEG-ova identificiranih za termin GO: 0055114 u Mandelupeu pri 48 hp. Ova zapažanja sugeriraju da je, uprkos značajno manjoj skali (tj., broju mutiranih redoks gena, 85 naspram 503), obrazac odgođenog odgovora na transkriptome:7 ranog odgovora manderacnoze4 na 8 rani odgovor na 8 .U Boregine i Populaciji 22660, ova konvergencija je niža na 51,6% i 75,6%, respektivno.
Otkriveni su obrasci izražavanja glavnih komponenti pojma biološkog procesa „GO:0055114 Redox proces“.Log2 skala predstavlja log2 vrijednosti (promjenu puta) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen sa polja vučice, Wizhenica, Poljska, 1999) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u isto vrijeme.Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (otporne, nose homozigotni Lanr1 alel), Boregine (otporne, genetska pozadina nepoznata), Mandelup (umjereno otporne, nose homozigotni AnMan alel) i Populacija 22660 (osjetljiva).
83A:476 Transkriptomski odgovori na inokulaciju sa C. lupini (soj Col-08) su takođe uključivali koordinirano utišavanje gena koji se pripisuju terminu GO:0015979 “fotosinteza” i drugim srodnim biološkim procesima (slika 5).Ovaj GO:0015979 DEG set sadržavao je 105 gena koji su bili značajno potisnuti pri 6 hpi na 83A:476.U ovoj podskupini, 37 gena je također smanjeno u Mandelupu na 48 HPI i 35 u isto vrijeme u populaciji od 22660, uključujući 19 DEG zajedničkih za oba genotipa.Nijedan DEG koji se odnosi na termin GO: 0015979 nije značajno aktiviran u bilo kojoj kombinaciji (red x vrijeme).
Otkriveni su obrasci izražavanja glavnih komponenti pojma biološkog procesa “GO:0015979 Fotosinteza”.Log2 skala predstavlja log2 vrijednosti (promjenu puta) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen sa polja vučice, Wizhenica, Poljska, 1999) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u isto vrijeme.Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (otporne, nose homozigotni Lanr1 alel), Boregine (otporne, genetska pozadina nepoznata), Mandelup (umjereno otporne, nose homozigotni AnMan alel) i Populacija 22660 (osjetljiva).
Na osnovu rezultata diferencijalne analize ekspresije i vjerovatno uključenih u odbrambene odgovore protiv patogenih gljiva, ovaj set od sedam gena odabran je za kvantifikaciju profila ekspresije pomoću PCR-a u realnom vremenu (dodatna tabela S9).
Pretpostavljeni gen za protein TanjilG_10657 značajno je induciran u svim proučavanim linijama i vremenskim tačkama u poređenju sa kontrolnim (mimičnim) biljkama (dopunske tabele S10, S11).Osim toga, profil ekspresije TanjilG_10657 pokazao je rastući trend tokom eksperimenta za sve linije.Populacija 22660 pokazala je najveću osjetljivost TanjilG_10657 na inokulaciju sa 114-strukom aktivacijom i najvišim relativnim nivoom ekspresije (4,4 ± 0,4) na 24 HPI (slika 6a).Gen proteina PR10 LlR18A TanjilG_27015 takođe je pokazao aktivaciju u svim linijama i vremenskim tačkama, sa statističkom značajnošću u većini tačaka podataka (slika 6b).Slično kao kod TanjilG_10657, najviši relativni nivo ekspresije TanjilG_27015 uočen je kod 22660 inokulisane populacije pri 24 HPI (19,5 ± 2,4).Gen kiselinske endohitinaze TanjilG_04706 je značajno povećan u svim linijama iu svim vremenskim tačkama osim za Boregine 6 hpi (slika 6c).Snažno je indukovana u prvoj vremenskoj tački (6 HPI) na 83A:476 (za 10,5 puta) i umjereno povećana u ostalim linijama (za 6,6-7,5 puta).Tokom eksperimenta, ekspresija TanjilG_04706 ostala je na sličnim nivoima u 83A:476 i Boregine, dok je u Mandelupu i Populaciji 22660 značajno porasla, dostižući relativno visoke vrijednosti (5,9 ± 1,5 i 6,2 ± 1,5, respektivno).Gen sličan endoglukan-1,3-β-glukozidazi TanjilG_23384 pokazao je visoku aktivaciju u prve dvije vremenske tačke (6 i 12 hpi) u svim linijama osim populacije 22660 (slika 6d).Najviši relativni nivoi ekspresije TanjilG_23384 uočeni su u drugoj vremenskoj tački (12 hpi) u Mandelup-u (2,7 ± 0,3) i 83A:476 (1,5 ± 0,1).Na 24 HPI, ekspresija TanjilG_23384 bila je relativno niska u svim ispitivanim linijama (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Profili ekspresije odabranih gena (ag) otkriveni kvantitativnim PCR-om.Brojevi 6, 12 i 24 predstavljaju sate nakon vakcinacije.Geni LanDExH7 i LanTUB6 su korišteni za normalizaciju, a LanTUB6 je korišten za međuserijsku kalibraciju.Trake grešaka predstavljaju standardnu ​​devijaciju zasnovanu na tri biološke replike, od kojih je svaka prosek tri tehničke replike. Statistička značajnost razlika u nivoima ekspresije između inokulisanih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen 1999. godine sa polja vučice u Wierzenici, Poljska) i kontrolnih (lažno inokulisanih) biljaka označena je iznad tačaka podataka (*P vrijednost < 0,05, **P vrijednost ≤1,0 0 ***P vrijednost). Statistička značajnost razlika u nivoima ekspresije između inokulisanih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen 1999. godine sa polja vučice u Wierzenici, Poljska) i kontrolnih (lažno inokulisanih) biljaka označena je iznad tačaka podataka (*P vrijednost < 0,05, **P vrijednost ≤1,0 0 ***P vrijednost). Statistička značajnost različitih u nivou ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, štamm Col-08, dobijen 1999. g. sa polja lûpina u Verženice, Poljska) i kontrolnim (ložno inokuliranim) biljkama koje se primećuju nad točkom dannyh (*značenje P < 0,00 ≤ ≤ ≤ 0 ≤ 0 ≤ ≤ 0≤ ,001). Statistički značajne razlike u nivoima ekspresije između inokulisanih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen 1999. godine sa polja vučice u Wierzhenice, Poljska) i kontrolnih (lažno inokulisanih) biljaka zabeležene su iznad tačaka podataka (*P vrednost < 0,05, **P-vrednost ≤ ≤ P-0).接种 (Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999. 年从波兰 Wierzenica的羽扇豆田获得)水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值0.≉〼0.≉接种 (colletotrichum lupini, color-08 株, 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) 和 秈捧 和 对捧水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 01) 。0. Statistički značajne razlike u nivou ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, štamm Col-08, dobijen s polej ljupina u Verženice, Poljska, 1999. g.) i kontrolne (ložno inokulirane) biljke koje se primjećuju nad točkom danih (* vrijednost P < 0,05, P≤0, značenje 0,001). Statistički značajne razlike u nivoima ekspresije između inokulisanih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen sa polja vučice u Verženice, Poljska, 1999. godine) i kontrolnih (lažno inokulisanih) biljaka zabeležene su iznad tačaka podataka (*P vrednost < 0,05 , **P-vrednost ≤1,00 ≤ P-vrednost.01,00).Analizirane NLL linije su: 83A:476 (otporne, nose homozigotni Lanr1 alel), Mandelup (umjereno otporne, nose homozigotni AnMan alel), Boregine (otporne, nepoznate genetske pozadine) i populacija 22660 (osjetljiva).
Kandidat gen TanjilG_05042 na Lanr1 lokusu pokazao je značajno drugačiji obrazac ekspresije od profila dobijenih iz RNA-seq studija (slika 6e).Značajna aktivacija ovog gena je uočena u Mandelup i populaciji 22660 (do 39,7 odnosno 11,7 puta, respektivno), što je rezultiralo relativno visokim nivoima ekspresije (do 1,4 ± 0,14 i 7,2 ± 1,3, respektivno).83A:476 je također otkrio određenu regulaciju gena TanjilG_05042 (do 3,8 puta), međutim, postignuti relativni nivoi ekspresije (0,044 ± 0,002) bili su više od 30 puta niži od onih uočenih u Mandelup i populaciji 22660.analizirane qPCR-om pokazale su značajne razlike u nivoima ekspresije između genotipova u lažno vakcinisanim (kontrolnim) varijantama, dostižući 58 puta razliku između populacija 22660 i 83A:476, kao i između populacija 22660 i 22660. Dvostruka razlika i Mandal Boregine je postignuta.
Kandidat gen na AnMan lokusu, TanjilG_12861, aktiviran je kao odgovor na vakcinaciju u 83A:476 i Mandelup, bio je neutralan u populaciji od 22660, i bio je smanjen u Boregine (slika 6f).Relativna ekspresija gena TanjilG_12861 bila je najveća kod inokulisanog 83A: 476 (0,14±0,01).Gen proteina toplotnog šoka klase I od 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 pokazao je niže relativne nivoe ekspresije u svim proučavanim sojevima i vremenskim tačkama (slika 6g).Najviša vrijednost je uočena na 24 HPI u populaciji 22660 (0,14 ± 0,02, osmostruko povećanje u odgovoru na vakcinaciju).
Poređenje profila ekspresije gena (Slika 7) otkrilo je visoku korelaciju između TanjilG_10657 i četiri druga gena: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80 G_0) i TanjilG_05042 (r = 0,80, 70).Takvi rezultati mogu ukazivati ​​na koregulaciju ovih gena tokom odbrambenih odgovora.Geni TanjilG_12861 i TanjilG_23384 pokazali su različite profile ekspresije sa nižim vrijednostima Pearsonovog koeficijenta korelacije (od 0,08 do 0,43 i -0,19 do 0,28, respektivno) u poređenju sa drugim genima.
Korelacije između profila genske ekspresije otkrivene su pomoću kvantitativne PCR.Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (otporne, nose homozigotni Lanr1 alel), Mandelup (umjereno otporne, nose homozigotni AnMan alel), Boregine (otporne, genetska pozadina nepoznata) i Populacija 22660 (osjetljiva).Izračunate su tri vremenske tačke (6, 12 i 24 sata nakon inokulacije), uključujući inokulisane (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen sa polja lupine u Wierzhenice, Poljska, 1999) i kontrolne (lažno inokulisane) biljke.Skala pokazuje vrijednost Pearsonovog koeficijenta korelacije.
Na osnovu podataka dobijenih pri 6 konjskih snaga po inču, WGCNA je izvedena na 9981 DEG identificirana poređenjem inokuliranih i kontrolnih biljaka kako bi se fokusirali na rane odbrambene odgovore (dodatna tabela S12).Pronađena su 22 genska modula (klastera) sa koreliranim (pozitivnim ili negativnim) profilima ekspresije između genotipova i eksperimentalnih varijanti. U prosjeku, nivoi ekspresije gena su opadali redom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (u obje varijante, međutim, ovaj trend je bio jači u kontrolnim biljkama). U prosjeku, nivoi ekspresije gena su opadali redom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (u obje varijante, međutim, ovaj trend je bio jači u kontrolnim biljkama). U srednjem stepenu ekspresije genova snižali se u poretku 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (u različitim varijantama, međutim, ova tendencija je bila jaka u kontrolnim biljkama). U prosjeku, nivoi ekspresije gena su se smanjili redom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (u obje varijante, međutim, ovaj trend je bio jači u kontrolnim biljkama).平均而言，基因表达水平按 按 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 的顺序下降势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 按 按 按 按 按 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> stanovništvo 22660 的 顺序 下降 （Ｇ 在 秌 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。. U srednjem stepenu ekspresije genova snimili su se u nizu 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (odnosno u različitim varijantama ova tendencija je bila jaka u kontrolnim biljkama). U prosjeku, nivoi ekspresije gena su se smanjili u seriji 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (međutim, u obje varijante, ovaj trend je bio jači u kontrolnim biljkama).Vakcinacija je rezultirala povećanjem ekspresije gena, posebno u modulima 18, 19, 14, 6 i 1 (u opadajućem redoslijedu efekta), negativnom regulacijom (npr. moduli 9 i 20) ili sa neutralnim efektima (npr. moduli 11, 22, 8 i 13).Analiza obogaćivanja termina GO (dodatna tabela S13) otkrila je "GO: 0006952 zaštitni odgovori" za inokulirani modul (18) s maksimalnom aktivacijom, uključujući gene analizirane qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_106p_2 kao i većina su00657, TanjilG_10657). moduli fotosinteze (9).Koncentrator modula 18 (slika 8) identifikovan je kao gen TanjilG_26536 koji kodira protein LlR18B sličan PR-10, a koncentrator modula 9 je identifikovan kao gen TanjilG_28955 koji kodira protein fotosistema II PsbQ.Kandidat gen za otpornost na antraknozu Lanr1, TanjilG_05042, pronađen je u modulu 22 (slika 9) i povezan je s terminima “GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processs” i “GO:0006355 Transkripcijska regulacija, DNK šablona” koji nose tanjil212.gen kodira transkripcijski faktor toplotnog stresa A-4a (HSFA4a).
Ponderisana mrežna analiza koekspresije gena modula sa previše zastupljenim terminima biološkog procesa “GO: 0006952 Odbrambeni odgovori”.Ligacija je pojednostavljena kako bi se istakla četiri gena analizirana qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015).
Ponderisana mrežna analiza ko-ekspresije gena modula sa prezastupljenim terminom biološkog procesa „GO: 0006355: Regulacija transkripcije, DNK predložak” i koji nosi kandidatski gen otpornosti na antraknozu Lanr1 TanjilG_05042.Ligacija je pojednostavljena kako bi se izolirali gen TanjilG_05042 i centralni gen TanjilG_01212.
Probir otpornosti na antraknozu prikupljen u Australiji pokazao je da je većina rano puštenih sorti bila osjetljiva;Kalya, Coromup i Mandelup su opisani kao umjereno otporni, dok su Wonga, Tanjil i 83A:476 opisani kao visoko otporni26,27,31.je imao isti alel otpornosti, označen Lanr1, a Coromup i Mandelup su imali drugačiji alel, označen kao AnMan10, 26, 39, dok je Kalya prenio drugi alel., Lanr2.Provjera rezistencije na antraknozu u Njemačkoj rezultirala je identifikacijom rezistentne linije Bo7212 sa alelom kandidata koji nije Lanr1, označen kao LanrBo36.
Naša studija je otkrila vrlo nisku učestalost (oko 6%) alela Lanr1 u testiranoj germplazmi.Ovo zapažanje je u skladu sa rezultatima skrininga istočnoevropske germplazme pomoću markera Anseq3 i Anseq4, koji su pokazali da je alel Lanr1 prisutan u samo dve beloruske linije.Ovo sugerira da alel Lanr1 još uvijek nije široko korišten u lokalnim programima uzgoja, za razliku od Australije, gdje je jedan od ključnih alela za uzgoj uz pomoć markera.Ovo može biti zbog nižeg nivoa otpornosti alela Lanr1 u evropskim terenskim uslovima u poređenju sa australskim izveštajem.Osim toga, studije antraknoze u područjima s velikim količinama padavina u Australiji su pokazale da reakcije otpornosti posredovane alelom Lanr1 možda neće biti efikasne u vremenskim uvjetima koji pogoduju rastu i brzom razvoju patogena19,42.U stvari, u ovoj studiji, neki simptomi antraknoze su takođe uočeni kod genotipova koji nose alel Lanr1, što sugeriše da otpornost može nestati pod optimalnim uslovima za razvoj C. lupini.Osim toga, moguće su lažno pozitivne interpretacije prisustva markera Anseq3 i Anseq4, koji su približno 1 cM od Lanr1 lokusa 28,30,43.
Naša studija je pokazala da je 83A:476, koji nosi alel Lanr1, odgovorio na inokulaciju C. lupini reprogramiranjem transkriptoma velikih razmjera u prvoj analiziranoj vremenskoj tački (6 hpi), dok su kod Mandelupa, koji nosi alel AnMan, transkriptomski odgovori uočeni mnogo kasnije.(od 24 do 48 KS).Ove vremenske varijacije u odgovorima odbrane povezane su s razlikama u simptomima bolesti, naglašavajući važnost ranog prepoznavanja patogena za uspješan odgovor na rezistenciju.Da bi zarazile biljno tkivo, spore antraksa moraju proći kroz nekoliko razvojnih faza na površini domaćina, uključujući klijanje, diobu stanica i formiranje apresorija.Dodatak je infektivna struktura koja se pričvršćuje za površinu domaćina i olakšava prodiranje u tkiva domaćina.Tako su spore C. gloeosporioides u ekstraktu graška pokazale prvu podjelu jezgra nakon 75-90 minuta inkubacije, formiranje zametne cijevi nakon 90-120 minuta, a supresiju nakon 4 sata 45 .Mango C. gloeosporioides pokazao je više od 40% konidijalne klijavosti nakon 3 sata inkubacije i oko 20% formiranja apresora nakon 4 sata.CAP20 gen C. gloeosporioides povezan sa virulencijom pokazao je transkripcionu aktivnost u konidijama koje formiraju epifite nakon 3,5 h inkubacije u površinskom vosku avokada s visokim koncentracijama CAP20 proteina nakon 4 h 46 min.Slično, aktivnost gena za biosintezu melanina u C. trifolii indukovana je tokom 2-satne inkubacije nakon čega je uslijedilo formiranje apresorija nakon 1 sata.Istraživanja lisnog tkiva pokazala su da jagode inokulirane sa C. acutatum imaju prvu supresiju na 8 hpi, dok paradajz inokuliran sa C. coccode ima prvu supresiju na 4 hpi48,49.uglavnom u skladu sa vremenskom skalom Colletotrichum spp.infektivnog procesa.Brzi odbrambeni odgovori na 83A:476 ukazuju na uključenost gena otpornosti biljaka i imunosti izazvanih efektorima (ETI) u ovoj liniji, dok Mandelupovi odgođeni odgovori podržavaju hipotezu o mikro-povezanom molekularnom uzorku aktiviranog imuniteta (MTI) 50. Rani odgovori na 83A i Mandelup: 476Djelomično preklapanje između gore ili niže reguliranih gena u odloženom odgovoru također podržava ovaj koncept, jer se ETI često smatra ubrzanim i pojačanim MTI odgovorom koji kulminira programiranom ćelijskom smrću na mjestu infekcije, poznatom kao anafilaktički šok 51,52 .
Većina gena koji se pripisuju pretjerano zastupljenom terminu Gene Ontology GO:0006952 “Odbrambeni odgovor” su 11 homologa proteina poruke 22 poruke izazvanog stresom (slično SAM22) i sedam glavnih proteina sličnih lateks proteinu (MLP).-slični proteini 31, 34, 43 i 423 pokazali su sličnost sekvenci.Geni slični SAM22 pokazali su značajnu aktivaciju koja je trajala duže, pokazujući povećan nivo otpornosti na antraknozu (83A:476 i Boregine).Međutim, geni slični MLP-u bili su smanjeni samo u linijama koje nose kandidatski alel rezistencije (83A:476/Lanr1 na 6 hpi i Mandelup/AnMan na 24 hpi).Treba napomenuti da svi identifikovani homolozi slični SAM22 potiču iz klastera gena koji se proteže oko 105 kb, dok geni slični MLP-u potiču iz odvojenih regiona genoma.Koordinirana aktivacija takvih gena sličnih SAM22 također je pronađena u našoj prethodnoj studiji otpornosti NLL na inokulaciju Diaporthetoxica, što sugerira da su oni uključeni u horizontalne komponente odbrambenog odgovora.Ovaj zaključak je također podržan izvještajima o pozitivnom odgovoru gena sličnih SAM22 na ozljedu ili liječenje salicilnom kiselinom, gljivičnim induktorima ili vodikovim peroksidom.
Pokazalo se da geni slični MLP-u odgovaraju na različite abiotičke i biotičke stresove, uključujući bakterijske, virusne i patogene gljivične infekcije kod mnogih biljnih vrsta55.Smjerovi odgovora na određene interakcije između biljaka i patogena kretali su se od snažnog povećanja (tj. tokom zaraze pamuka Verticillium dahliae) do značajnog opadanja (tj. nakon infekcije stabla jabuke Alternaria spp.)56,57.Značajno smanjenje regulacije MLP-like 423 gena uočeno je tokom odbrane avokada od infekcije F. niger i tokom infekcije stabla jabuke Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola i Alternaria alternata su patotipovi jabuke58,59.Osim toga, kalusi jabuke koji prekomjerno eksprimiraju gen 423 sličan MLP-u imali su nižu ekspresiju gena povezanih s rezistencijom i bili su osjetljiviji na gljivične infekcije59.Nakon Fusarium oxysporum f, gen 423 sličan MLP-u također je potisnut u rezistentnoj germplazmi graha.cn.Infekcija pasulja 60.
Ostali članovi porodice PR-10 identifikovani u našoj RNA-seq studiji bili su geni LlR18A i LlR18B kao odgovor na regulaciju, kao i pojačano regulisani (1 gen) ili niže regulisani (3 gena) gen za protein transfera lipida DIR1..Osim toga, WGCNA ističe gen LlR18B kao čvorište u ovom modulu, koji je vrlo osjetljiv na vakcinaciju i nosi nekoliko gena zaštitnog odgovora.Geni LlR18A i LlR18B inducirani su u žutom lišću lupine kao odgovor na patogene bakterije, kao i u stabljikama NLL nakon inokulacije D. toxica, dok je homolog riže ovih gena, RSOsPR10, brzo induciran gljivičnom infekcijom za koju se pretpostavlja da je uključena u signalni put gena jasmonic5IR16, koji nije kod jasmonske kiseline. proteini za transport lipida koji su potrebni za nastanak sistemske stečene rezistencije (SAR).Sa razvojem zaštitnih reakcija, DIR1 protein se transportuje iz žarišta infekcije kroz floem da izazove SAR u udaljenim organima.Zanimljivo je da je gen TanjilG_02313 DIR1 značajno induciran u prvoj vremenskoj tački u linijama 84A:476 i populaciji 22660, ali se otpornost na antraknozu uspješno razvila samo u liniji 84A:476.Ovo može ukazivati ​​na određenu subfunkcionalizaciju DIR1 gena u NLL, budući da su preostala tri homologa odgovorila na inokulaciju samo u liniji 83A:476 pri 6 hpi, a ovaj odgovor je bio usmjeren naniže.
U našoj studiji, najčešće komponente koje odgovaraju biološkom procesu nazvanom “GO:0055114 Redoks proces” bile su protein citokroma P450, peroksidaza, 9S-/13S-lipoksigenaza linolne kiseline i oksidaza 1-aminociklopropan-1-karboksilne kiseline.Osim toga, naš WGCNA definira homolog HSFA4a kao čvorište koje nosi module kao što je kandidat za gen otpornosti Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a je komponenta redoks zavisne regulacije nuklearne transkripcije u biljkama.
Proteini citohroma P450 su oksidoreduktaze koje kataliziraju NADPH i/ili O2-zavisne reakcije hidroksilacije u primarnom i sekundarnom metabolizmu, uključujući metabolizam ksenobiotika, kao i hormone, masne kiseline, sterole, komponente ćelijskog zida, biopolimere i biosintezu hidroksilnih spojeva. -10,6 log2 (promjena puta) na 5,7 zbog velikog broja izmijenjenih homologa (37) i razlika u obrascima odgovora između specifičnih gena, što odražava reviziju naviše..Korištenje samo RNA-seq podataka da se razjasni pretpostavljena biološka funkcija NLL gena u tako velikoj proteinskoj superfamiliji bilo bi vrlo spekulativno.Međutim, vrijedno je napomenuti da su neki geni citokroma P450 povezani s povećanom otpornošću na patogene gljive ili bakterije, uključujući doprinos alergijskim reakcijama69,70,71.
Peroksidaze klase III su multifunkcionalni biljni enzimi uključeni u širok spektar metaboličkih procesa tokom rasta i razvoja biljaka, kao i kao odgovor na stresove okoline kao što su salinitet, suša, jak intenzitet svjetlosti i napad patogena72.Peroksidaze su uključene u interakciju nekoliko biljnih vrsta s Anthracisom, uključujući Stylosanthes humilis i C. gloeosporioides, Lens culinaris i C. truncatum, Phaseolus vulgaris i C. lindemuthianum, Cucumis sativus i C. lagenarium73,74,75,7Odgovor je vrlo brz, ponekad čak i na 4 HPI, prije nego što gljiva prodre u biljno tkivo73.Gen peroksidaze je također reagirao na inokulaciju D. toxica NLL.Pored svojih tipičnih funkcija za regulaciju oksidativnog pucanja ili eliminaciju oksidativnog stresa, peroksidaze mogu ometati rast patogena stvaranjem fizičkih barijera zasnovanih na ojačanju ćelijskog zida tokom lignifikacije, podjedinica ili umrežavanja specifičnih spojeva.Ova funkcija se in silico može pripisati genu TanjilG_03329 koji kodira pretpostavljenu anjonsku peroksidazu koja stvara lignin, a koja je u našoj studiji značajno povećana u rezistentnoj liniji 83A:476 pri 6 HPI, ali ne i u drugim sojevima i vremenskim točkama koji nisu reagirali.
9S-/13S-lipoksigenaza linoleinske kiseline je prvi korak u oksidativnom putu biosinteze lipida78.Proizvodi ovog puta imaju višestruku funkciju u odbrani biljaka, uključujući jačanje stanične stijenke kroz stvaranje naslaga kaloze i pektina, te regulaciju oksidativnog stresa kroz proizvodnju reaktivnih vrsta kisika79,80,81,82,83.U ovoj studiji, ekspresija 9S-/13S-lipoksigenaze linoleinske kiseline je promijenjena u svim sojevima, ali u osjetljivoj populaciji 22660, regulacija je prevladavala u različitim vremenskim tačkama, dok u sojevima koji nose rezistentni Lanr1 i AnMan alel, naglašava diverzifikaciju ovih hralipin genotipa u zaštitnom sloju oxy tipa.
Homolog 1-aminociklopropan-1-karboksilat oksidaze (ACO) bio je značajno povećan (9 gena) ili smanjen (2 gena) kada je inokuliran lupinom.Uz dva izuzetka, svi ovi odgovori su se desili pri 6 KS.na 83A:476.Enzimska reakcija posredovana ACO proteinima je korak koji ograničava brzinu proizvodnje etilena i stoga je visoko regulirana84.Etilen je biljni hormon koji igra različite uloge u regulaciji razvoja biljaka i odgovoru na abiotičke i biotičke stresne uslove.Indukcija ACO transkripcije i aktivacija signalnog puta etilena su uključeni u povećanje otpornosti riže na hemibiotrofnu gljivu oryzae oryzae regulacijom proizvodnje reaktivnih vrsta kisika i fitoaleksina.Vrlo sličan proces infekcije listova pronađen između M. oryzae i C. lupini88,89, u pozadini značajne regulacije ACO homologa u liniji 83A:476 objavljenoj u ovoj studiji, pomjera mogućnost davanja rezistencije na NLL antraknozu Etilen kao signalni središnji korak u molekularnim putevima.
U ovoj studiji, primećena je supresija velikog broja gena povezanih sa fotosintezom pri 6 hpi u 83A:476 i na 48 hpi u Mandeloopu i populaciji 22660.Obim i napredak ovih promjena proporcionalan je nivou.U ovom eksperimentu je uočena otpornost na antraknozu.Nedavno je zabilježena snažna i rana represija transkripta povezanih s fotosintezom u nekoliko modela interakcija između biljaka i patogena, uključujući patogene bakterije i gljive.Žurba (od 2 HPI u nekim interakcijama) i globalna supresija gena povezanih s fotosintezom kao odgovor na infekciju mogu pokrenuti imunitet biljaka na osnovu primjene reaktivnih vrsta kisika i njihove interakcije sa putem salicilne kiseline za posredovanje alergijskih reakcija 90,94.
Zaključno, mehanizmi odbrambenog odgovora predloženi za najotporniju lozu (83A:476) uključuju brzo prepoznavanje patogena od strane R gena (vjerovatno TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) i salicilnu kiselinu i etilen posredovane alergijskim odgovorom signalizaciju, nakon čega slijedi uspostavljanje SAR dugog dometa.djelovanje je podržano DIR-1 proteinom.Treba napomenuti da je biotrofični period za infekciju C. lupini vrlo kratak (otprilike 2 dana), praćen nekrotičnim rastom95.Prijelaz između ovih faza može biti povezan s nekrozom i ekspresijom etilenom inducibilnih proteina koji djeluju kao okidači za reakcije preosjetljivosti u biljkama domaćinima.Stoga je vremenski okvir za uspješno hvatanje C. lupini u biotrofnoj fazi vrlo uzak.Reprogramiranje gena povezanih sa redoks i fotosintezom uočeno u 83A:476 na 6 hpi je u skladu s progresijom gljivičnih hifa i najavljuje razvoj uspješnog zaštitnog odgovora u biotrofnoj fazi.Transkriptomski odgovori Mandelupa i populacije 22660 mogu biti previše odgođeni da bi uhvatili gljivicu prije nego što pređu na nekrotični rast, međutim, Mandelup može biti učinkovitiji od populacije 22660 jer relativno brza regulacija proteina PR-10 potiče horizontalnu otpornost.
Čini se da je ETI, vođen kanonskim R genom, uobičajen mehanizam za otpornost zrna na antraknozu.Tako, u modelu mahunarke Medicago truncatula, otpornost na antraknozu daje gen RCT1, član TIR-NBS-LRR97 biljne R genske klase.Ovaj gen također daje antraknozu širokog spektra otpornosti lucerke kada se prenese na osjetljive biljke.U grahu (P. vulgaris) do danas je identifikovano više od dva desetina gena otpornosti na antraknozu.Neki od ovih gena se nalaze u regijama u kojima nedostaju kanonski R geni, međutim mnogi drugi se nalaze na rubovima hromozoma koji nose klaster gena NBS-LRR, uključujući TIR-NBS-LRRs99.SSR studija u cijelom genomu također je potvrdila povezanost gena NBS-LRR sa rezistencijom na antraknozu u grahu.Kanonski R gen je također pronađen u genomskoj regiji koja nosi glavni lokus otpornosti na antraknozu u bijeloj vučici 101.
Naš rad pokazuje da neposredna reakcija otpornosti, aktivirana u ranoj fazi infekcije biljke (po mogućnosti ne kasnije od 12 hpi), učinkovito štiti uskolisnu vučicu od antraknoze uzrokovane patogenom gljivom Collelotrichum lupini.Koristeći sekvenciranje visoke propusnosti, demonstrirali smo diferencijalne profile ekspresije gena otpornosti na antraknozu u NLL biljkama posredovane genima otpornosti Lanr1 i AnMan.Uspješna odbrana uključuje pažljivo dizajniranje gena za proteine ​​uključene u redoks, fotosintezu i patogenezu u roku od nekoliko sati od prvog kontakta biljke s patogenom.Slične zaštitne reakcije, ali odložene u vremenu, mnogo su manje efikasne u zaštiti biljaka od bolesti.Otpornost na antraks posredovan genom Lanr1 nalikuje tipičnom brzom odgovoru gena R (imunitet izazvan efektorom), dok AnMan gen najvjerovatnije pruža horizontalni odgovor (imunitet pokrenut molekularnim obrascem povezanim s mikrobom), pružajući umjerenu razinu održivosti.
215 NLL linija korištenih za skrining na markere antraknoze sastojalo se od 74 sorte, 60 linija dobijenih ukrštanjem ili uzgojem, 5 mutanata i 76 divljih ili originalnih germplazme.Linije su stizale iz 17 zemalja, uglavnom iz Poljske (58), Španije (47), Njemačke (27), Australije (26), Rusije (19), Bjelorusije (7), Italije (5) i drugih linija.iz 10 zemalja.Set također uključuje referentne otporne linije: 83A:476, Tanjil, Wonga koji nosi alel Lanr1 i Mandelup koji nosi alel AnMan.Linije su dobivene iz Europske baze podataka o genetskim resursima lupina koju održava Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poljska (dodatna tabela S1).
Biljke su uzgajane u kontrolisanim uslovima (fotoperiod 16 sati, temperatura 25°C danju i 18°C ​​noću).Analizirane su dvije biološke replike.DNK je izolovan iz listova starih tri nedelje korišćenjem DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemačka) prema protokolu.Kvalitet i koncentracija izolovane DNK ocjenjivani su spektrofotometrijskim metodama (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD).AnManM1 marker koji označava gen otpornosti na antraknozu AnMan (izveden iz sorte Mandelup) i markeri Anseq3 i Anseq4 koji flankiraju gen Lanr1 (izveden iz sorte Tanjil) analizirani su 11,26,28.Homozigoti za rezistentni alel su ocijenjeni sa „1″, osetljivi – sa „0″, a heterozigoti – sa 0,5.
Na osnovu rezultata skrininga na markere AnManM1, AnSeq3 i AnSeq4 i dostupnosti sjemena za konačne naknadne eksperimente, odabrano je 50 NLL linija za fenotipizaciju otpornosti na antraknozu.Analiza je obavljena u duplikatu u kompjuterski kontrolisanom stakleniku sa fotoperiodom od 14 sati sa temperaturnim opsegom od 22°C tokom dana i 19°C noću.Sjeme se grebe (odsijecanje sjemenske ovojnice na suprotnoj strani embriona oštrim sječivom) prije sjetve kako bi se spriječilo mirovanje sjemena zbog pretvrde ovojnice sjemena i kako bi se osiguralo jednolično klijanje.Biljke su uzgajane u saksijama (11 × 11 × 21 cm) sa sterilnom zemljom (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Poljska).Inokulacija je obavljena sojem Colletotrichum lupini Col-08, uzgojenim 1999. godine iz stabljika uskolisnih biljaka lupine uzgajanih u polju u Verženici, Velika Poljska (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Nabavite područje.Izolati su uzgajani u SNA mediju na 20°C pod crnim svjetlom 21 dan da bi se izazvala sporulacija.Četiri sedmice nakon sjetve, kada su biljke dostigle fazu 4-6 lista, inokulacija je izvršena prskanjem suspenzijom konidija u koncentraciji 0,5 x 106 konidija po ml.Nakon inokulacije, biljke su držane u mraku 24 sata na vlažnosti od oko 98% i temperaturi od 25°C kako bi se olakšalo klijanje konidija i proces infekcije.Biljke su zatim uzgajane u fotoperiodu od 14 sati na 22°C dan/19°C noć i 70% vlažnosti.Rezultat bolesti je napravljen 22 dana nakon inokulacije i kretao se od 0 (imun) do 9 (veoma osjetljiv) u zavisnosti od prisustva ili odsustva nekrotičnih lezija na stabljikama i listovima.Osim toga, nakon bodovanja, izmjerena je težina biljaka.Odnosi između markerskih genotipova i fenotipova bolesti izračunati su kao tačkaste korelacije dva niza (odsustvo heterozigotnih markera u setu linija za analizu fenotipa otpornosti na antraknozu).