Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) je mahunarka koja se koristi za proizvodnju hrane i poboljšanje tla. Globalna ekspanzija NLL-a kao usjeva privukla je mnoge patogene gljivice, uključujući antraknozu lupina, koja uzrokuje razornu bolest antraknoze. Dva alela, Lanr1 i AnMan, koji daju povećanu otpornost, korištena su u oplemenjivanju NLL-a, ali osnovni molekularni mehanizmi ostaju nepoznati. U ovoj studiji, markeri Lanr1 i AnMan korišteni su za skrining evropskih uzoraka NLL-a. Testiranje vakcine u kontroliranom okruženju potvrdilo je efikasnost oba rezistentna donora. Diferencijalno profiliranje genske ekspresije provedeno je na reprezentativnim rezistentnim i osjetljivim linijama. Rezistencija na antraknozu bila je povezana s prekomjernom ekspresijom termina genske ontologije "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" i "GO:0015979 Photosynthesis". Osim toga, linija Lanr1(83A:476) pokazala je značajno reprogramiranje transkriptoma brzo nakon inokulacije, dok su ostale linije pokazale kašnjenje u ovom odgovoru za oko 42 sata. Odbrambeni odgovori povezani su s genima TIR-NBS, CC-NBS-LRR i NBS-LRR, 10 proteina uključenih u patogenezu, proteinima za prijenos lipida, endoglukan-1,3-β-glukozidazom, proteinima ćelijskog zida bogatim glicinom i genima iz reaktivnog puta kisika. Rani odgovori na 83A:476, uključujući pažljivo suzbijanje gena povezanih s fotosintezom, poklopili su se s uspješnom zaštitom tokom vegetativne faze rasta gljivične biologije, što sugerira da efektor pokreće imunitet. Mandeloopova reakcija je usporena, kao i ukupni horizontalni otpor.
Uskolisni lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) je žitarica s visokim udjelom proteina porijeklom iz zapadnog Mediterana1,2. Trenutno se uzgaja kao prehrambena kultura za životinje i ljude. Također se smatra zelenim gnojivom u sistemima plodoreda zbog fiksacije dušika simbiotskim bakterijama koje fiksiraju dušik i ukupnog poboljšanja strukture tla. NLL je prošao kroz brz proces domestikacije u prošlom stoljeću i još uvijek je pod velikim pritiskom uzgoja3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Sa široko rasprostranjenim uzgojem NLL-a, sukcesija patogenih gljivica razvila je nove poljoprivredne niše i uzrokovala nove bolesti koje uništavaju usjeve. Najznačajniji događaj za uzgajivače lupina bila je pojava antraknoze, koju uzrokuje patogena gljivica Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najznačajniji događaj za uzgajivače lupina bila je pojava antraknoze, koju uzrokuje patogena gljivica Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najviše prikladnih za farmere i selekcionere ljupina bilo je pojavljivanje antraknoze, izazvanog patogenom gljivicom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najznačajnija za uzgajivače lupina bila je pojava antraknoze uzrokovane patogenom gljivicom Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病眄出现, 它是由眀出现, 它是由矗叏匎由矗(Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病眄出现, 它是由眀出现, 它是由矗叏匎由矗(Bondar)嵵Hired。1 Najviše štetnih za farmere i selekcionere ljupina je pojava antraknoze, koja izaziva patogenu gljivicu Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Najupečatljivija za uzgajivače lupina je pojava antraknoze koju uzrokuje patogena gljivica Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Najraniji izvještaji o bolesti došli su iz Brazila i Sjedinjenih Američkih Država, s tipičnim simptomima koji su se pojavili 1912. odnosno 1929. godine. Međutim, nakon otprilike 30 godina, patogen je označen kao Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf vrste Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld u Celenapravnoj morfologiji. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld u Ciljanoj morfologiji. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .i H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。i H. Schlenk, .Preliminarna fenotipizacija bolesti urađena sredinom 20. stoljeća pokazala je određenu otpornost kod NLL i žutog lupina (L. luteus L.), ali svi testirani pristupi bijelog lupina (L. albus L.) bili su vrlo osjetljivi15,16. Studije su pokazale da je razvoj antraknoze povezan s povećanim padavinama (vlažnošću zraka) i temperaturom (u rasponu od 12-28°C), što dovodi do kršenja otpornosti na višim temperaturama17, 18. U stvari, vrijeme potrebno za klijanje konidija i početak bolesti bilo je četiri puta kraće na 24°C (4 sata) nego na 12°C (16 sati) u uvjetima visoke vlažnosti19. Dakle, kontinuirano globalno zagrijavanje dovelo je do širenja antraknoze. Međutim, bolest je uočena u Francuskoj (1982.) i Ukrajini (1983.) kao nagovještaj nadolazeće prijetnje, ali ju je industrija lupina u to vrijeme očigledno ignorisala20,21. Nekoliko godina kasnije, ova razorna bolest proširila se cijelim svijetom i pogodila je i glavne zemlje proizvođače lupina poput Australije, Poljske i Njemačke22,23,24. Nakon izbijanja antraknoze sredinom 1990-ih, opsežno testiranje rezultiralo je identifikacijom nekoliko rezistentnih donora u uzorcima NLL19. Otpornost NLL na antraknozu kontroliraju dva odvojena dominantna alela koja se nalaze u različitim izvorima germplazme: Lanr1 u kultivarima Tanjil i Wonga te AnMan u kultivarima Mandalay25,26. Ovi aleli dopunjuju molekularne markere koji podržavaju selekciju rezistentne germplazme u programima oplemenjivanja25,26,27,28,29,30. Rezistentna linija 83A:476 koja nosi alel Lanr1 ukrštena je s osjetljivom divljom linijom P27255 kako bi se dobila RIL populacija koja se segregira za otpornost na antraknozu, što je omogućilo dodjeljivanje lokusa Lanr1 hromosomu NLL-1131, 32, 33. Poravnanjem markera mape povezanosti od bočnih lokusa otpornosti do antraknoze s genomskim okvirom, NLL je otkrio lokaciju sva tri alela na istom hromosomu (NLL-11), ali na različitim pozicijama29,34,35. Međutim, zbog malog broja RIL-ova i velike genetičke udaljenosti između markera i odgovarajućih alela, ne mogu se izvući pouzdani zaključci o njihovim osnovnim genima. S druge strane, upotreba reverzne genetike kod lupina je otežana zbog njihovog vrlo niskog regeneracijskog potencijala, što genetsku manipulaciju čini nezgrapnom37.
Razvoj domaće germplazme koja nosi željeni alel u homozigotnom stanju, kao što su 83A:476 (Lanr1) i Mandelup (AnMan), otvorio je vrata proučavanju otpornosti na antraknozu u suočenju sa prisustvom suprotstavljenih kombinacija alela u divljim populacijama. Mogućnosti molekularnih mehanizama. Uporedite odbrambene odgovore generisane specifičnim genotipovima. Ova studija je procijenila rani transkriptomski odgovor NLL-a na vakcinaciju protiv C. lupini. Prvo je pregledana evropska NLL germplazma panel koja sadrži 215 linija korištenjem molekularnih markera koji označavaju alele Lanr1 i AnMan. Fenotipizacija antraknoze je zatim izvršena na 50 NLL linija, prethodno odabranih za molekularne markere, pod kontrolisanim uslovima. Na osnovu ovih eksperimenata, četiri linije koje se razlikuju u otpornosti na antraknozu i alelnom sastavu Lanr1/AnMan odabrane su za diferencijalno profiliranje ekspresije odbrambenih gena korištenjem dva komplementarna pristupa: sekvenciranje RNK visokog protoka i kvantifikacija PCR-om u realnom vremenu.
Probir skupa NLL germplazme (N = 215) s markerima Lanr1 (Anseq3 i Anseq4) i AnMan (Anseq4) i AnMan (AnManM1) pokazao je da samo jedna linija (95726, blizu Salamanca-b) amplificira alel "otpornosti" za sve markere, dok je "Prisustvo 'osjetljivih' alela" pronašlo udio svih markera u 158 (~73,5%) linija. Trinaest linija je proizvelo dva "otporna" alela markera Lanr1, a 8 linija je proizvelo "otporne" alele markera Lanr1. Alel "otpornosti" markera AnMan (Dodatna tabela S1). Dvije linije su bile heterozigotne za marker Anseq3, a jedna heterozigotna za marker AnManM1. 42 linije (19,5%) su nosile suprotne faze alela Anseq3 i Anseq4, što ukazuje na visoku učestalost rekombinacije između ova dva lokusa. Fenotipovi antraknoze pod kontroliranim uvjetima (Dodatna tabela S2) pokazali su varijabilnost u otpornosti testiranih genotipova, što se odrazilo na težinu antraknoze. Razlike u prosječnim rezultatima kretale su se od 1,8 (umjereno otporne) do 6,9 (osjetljive), a razlike u težini biljaka kretale su se od 0,62 (osjetljive) do 4,45 g (otporne). Postojala je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u dva ponavljanja eksperimenta (0,51 za ocjenu težine bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za težinu biljke, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (-0,59 i -0,77, P < 0,0001). Postojala je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u dva ponavljanja eksperimenta (0,51 za ocjenu težine bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za težinu biljke, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (-0,59 i -0,77, P < 0,0001). Označena je pouzdana korelacija između značenja, koja se posmatraju u dva ponovljena eksperimenta (0,51 za ballove težnje bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za masu biljaka, P < 0,0001), a takođe između ovih dvaju parametara (-0,59 i -0,77, R < 0,00) 0,00). Značajna korelacija je utvrđena između vrijednosti uočenih u dva ponavljanja eksperimenta (0,51 za ocjenu težine bolesti, P = 0,00017 i 0,61 za težinu biljke, P < 0,0001), kao i između ova dva parametra (-0,59 i -0,77, P < 0,0001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分︥ =.0 分0,00017，植物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,70,00P <0,0001)在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 熄度 语分为 0,51 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以 及 个 参 个 参数 丈 （间（ （弈间（ （弈间（ 0,59 和– 0,59 和– 0,59 和- 0,77, P < 0,0001). Nasledila je značajna korelacija između značenja, koja se posmatraju u dva ponavljanja (ocena težnje bolesti 0,51, P = 0,00017 i masa biljaka 0,61, P <0,0001), i između ovih dveju parametara (-0,59 i -0,0001) 0,77, P <0,000. Postojala je značajna korelacija između vrijednosti uočenih u duplikatu (oštrina bolesti 0,51, P = 0,00017 i težina biljke 0,61, P < 0,0001), a između ova dva parametra (-0,59 i -0,0001) 0,77, P < 0,0001. ).Tipični simptomi koji se vide kod osjetljivih biljaka uključuju savijanje i uvijanje stabljike koje podsjeća na strukturu "pastirskog luka", nakon čega slijede ovalne lezije s narančastim/ružičastim sporozoitima (Dopunska slika 1). Australijski pristupi koji nose gene Lanr1 (83A:476 i Tanjil) i AnMan (Mandelup) su umjereno otporni, 0,0331 i 0,0036). Neke linije koje također nose "rezistentne" alele Lanr1 i/ili AnMan pokazuju simptome bolesti.
Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija kojima nedostaje bilo koji "rezistentni" marker alel pokazalo visok nivo otpornosti na antraknozu (uporediv ili viši nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P vrijednost < 0,0001 za oba parametra), Bojar (P vrijednost < 0,0001 za rezultat i 0,001 za težinu biljke) i populacija B-549/79b (P vrijednost < 0,0001 za rezultat i neznačajno za težinu). Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija kojima nedostaje bilo koji "rezistentni" marker alel pokazalo visok nivo otpornosti na antraknozu (uporediv ili viši nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P vrijednost < 0,0001 za oba parametra), Bojar (P vrijednost < 0,0001 za rezultat i 0,001 za težinu biljke) i populacija B-549/79b (P vrijednost < 0,0001 za rezultat i neznačajno za težinu). Interesantno, nekoliko linija NLL-a, bez ikakvog-bilo «rezistentnog» markerskog alela, pokazuje visok nivo otpornosti na antraknozu (postavljen ili više visok, od genotipova Lanr1 ili AnMan), kao što je Boregine (značenje P <0,0001 za obje ocjene parametara), Bojar (značenje P < 0,00) i0 populâcii B-549/79b (značenje P <0,0001 za ocjenu i neznatno za masu). Zanimljivo je da je nekoliko NLL linija kojima nedostaje bilo koji 'rezistentni' marker alel pokazalo visok nivo otpornosti na antraknozu (uporediv ili viši nego za genotipove Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P vrijednost < 0,0001 za oba parametra), Bojar (P vrijednost < 0,0001 za evaluaciju i 0,001 za težinu biljke) i populacija B-549/79b (P vrijednost < 0,0001 za evaluaciju i nije značajno za težinu).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭疎 的炭疎或AnMan 基因型相当或更高）,例如Boregine (两个参数的P 值< 0,0001)、Bojar（P 0,0001, 0,001, B-549/79b (P < 0,0001) Zanimljivo je da neki NLL sistemi koji nemaju nikakve "antigene" markere pokazuju visoku horizontalnu otpornost (ekvivalentnu Lanr1 ili AnMan genima ili veću), kao što su Boregine (oba parametra P < 0,0001), Bojar (P vrijednost < 0,0001, težina biljke 0,001) i soj B-549/79b (P vrijednost < 0,0001, težina nije značajna). Interesantno je da su neke linije NLL-a lišene bilo kakvih-bilo markerskih aleja «rezistentnosti», pokazale su visoke otpornosti na antraknozu (sravne ili više, nego što su genotipovi Lanr1 ili AnMan), takve kao Boregine (značenje P za obojene parametre <0,0001), Bojar (značenje P <0,000001001), Bojar (značenje P <0,010)0 B-549/79b (ocena P-značenje <0,0001, masovna neznačajna). Zanimljivo je da su neke NLL linije kojima nedostaju bilo kakvi aleli markera 'otpornosti' pokazale visoke nivoe otpornosti na antraknozu (uporedive sa ili veće od genotipova Lanr1 ili AnMan), kao što su Boregine (P-vrijednost za oba parametra <0,0001), Bojar (P-vrijednost <0,0001, težina biljke 0,001) i populacija B-549/79b (P-vrijednost <0,0001, težina nije značajna).Ovaj fenomen ukazuje na mogućnost novog genetskog izvora otpornosti, objašnjavajući uočeni nedostatak korelacije između marker genotipova i fenotipova bolesti (P ​​vrijednosti od ~0,42 do ~0,98). Dakle, Kolmogorov-Smirnov test je pokazao da su podaci o otpornosti na antraknozu približno normalno distribuirani za rezultate (P-vrijednosti 0,25 i 0,11) i masu biljke (P-vrijednosti 0,47 i 0,55), što sugerira hipotezu da je uključeno više alela od Lanr1 i AnMan.
Na osnovu rezultata skrininga otpornosti na antraknozu, za analizu transkriptoma odabrane su 4 linije: 83A:476, Boregine, Mandelup i Populacija 22660. Ove linije su ponovo testirane na otpornost na antraks u eksperimentima inokulacije sekvenciranjem RNK, pod uslovom da su iste kao u prethodnom testu. Vrijednosti rezultata bile su sljedeće: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) i populacija 22660 (6,11 ± 1,29).
Protokol Illumina NovaSeq 6000 postigao je prosječno 40,5 Mread parova po uzorku (29,7 do 54,4 Mreadova) (Dodatna tabela S3). Rezultati poravnanja u referentnoj sekvenci kretali su se od 75,5% do 88,6%. Prosječna korelacija podataka o broju očitavanja između eksperimentalnih varijanti i bioloških replikata kretala se od 0,812 do 0,997 (prosjek 0,959). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo ekspresiju, a ostalih 4785 gena je bilo eksprimirano na zanemarljivom nivou (osnovni prosjek < 5). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo ekspresiju, a ostalih 4785 gena je bilo eksprimirano na zanemarljivom nivou (osnovni prosjek < 5). Od 35 170 analiziranih genova 2917 nije ispoljilo ekspresiju, a ostalih 4785 genova ekspresiralo se na neznatnom nivou (bazovo srednje <5). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije pokazalo ekspresiju, a preostalih 4785 gena je eksprimirano na zanemarljivom nivou (osnovni prosjek <5).在分析的35,170 个基因中, 2917 个没有表达, 其他4785个基因的表达可以忽略不计 (基本平均值< 5)。35.170 Od 35 170 analiziranih genova 2917 nije ekspresirano, a ostalih 4785 gena su neznatne ekspresije (bazovo srednje vrijednosti <5). Od 35.170 analiziranih gena, 2917 nije bilo eksprimirano, a preostalih 4785 gena imalo je zanemarljivu ekspresiju (osnovna srednja vrijednost <5).Dakle, broj gena koji su smatrani eksprimiranim (osnovni prosjek ≥ 5) tokom eksperimenta bio je 27.468 (78,1%) (Dodatna tabela S4).
Od prve vremenske tačke, sve NLL linije su reagovale na inokulaciju C. lupini (soj Col-08) reprogramiranjem transkriptoma (Tabela 1), međutim, uočene su značajne razlike između linija. Tako je linija otpornosti 83A:476 (koja nosi gen Lanr1) pokazala značajno reprogramiranje transkriptoma u prvoj vremenskoj tački (6 hpi) sa 31-69 puta većim brojem izolovanih up- i down-gena u poređenju sa drugim vremenskim tačkama u ovoj vremenskoj tački. Pored toga, ovaj vrh je bio kratkotrajan, jer je ekspresija samo nekoliko gena ostala značajno izmijenjena u drugoj vremenskoj tački (12 hpi). Zanimljivo je da Boregine, koji je također pokazao visok nivo otpornosti u testu kalemljenja, nije prošao kroz tako masovno transkripciono reprogramiranje tokom eksperimenta. Međutim, broj diferencijalno eksprimiranih gena (DEG) bio je isti za Boregine i 83A:476 pri 12 HPI. I Mandelup i populacija 22660 pokazali su vrhove DEG-a u posljednjoj vremenskoj tački (48 l/s), što ukazuje na relativno kašnjenje u odbrambenim odgovorima.
Budući da je 83A:476 prošao kroz masovno reprogramiranje transkriptoma kao odgovor na C. lupini na 6 HPI u poređenju sa svim ostalim linijama, ~91% DEG-ova uočenih u ovom vremenskom trenutku bilo je specifično za liniju (Sl. 1). Međutim, postojalo je određeno preklapanje u ranim odgovorima između proučavanih linija, jer se 68,5%, 50,9% i 52,6% DEG-ova u Boregine, Mandelup i populaciji 22660, respektivno, preklapalo s onima pronađenim u 83A:476 u određenim vremenskim tačkama. Međutim, ovi DEG-ovi činili su samo mali dio (0,97–1,70%) svih DEG-ova trenutno detektovanih pomoću 83A:476. Pored toga, 11 DEG-ova iz svih linija bilo je koherentno u ovom trenutku (Dodatne tabele S4-S6), uključujući uobičajene komponente odbrambenih odgovora biljaka: protein za transfer lipida (TanjilG_32225), enzim endoglukan-1,3-β-glukozid (TanjilG_23384), dva proteina indukovana stresom poput SAM22 (TanjilG_31528 i TanjilG_31531), bazni lateks protein (TanjilG_32352) i dva strukturna proteina ćelijskog zida bogata glicinom (TanjilG_19701 i TanjilG_19702). Također je postojalo relativno veliko preklapanje u transkriptomskim odgovorima između 83A:476 i Boregine na 24 HPI (ukupno 16-38% DEG) i između Mandelupa i populacije 22660 na 48 HPI (ukupno 14-20% DEG).
Venov dijagram prikazuje broj diferencijalno eksprimiranih gena (DEG) u linijama uskolisne lupine (NLL) inokuliranim sa Colletotrichum lupini (soj Col-08 dobijen sa polja lupine u Wierzhenicama, Poljska, 1999). Analizirane NLL linije bile su: 83A:476 (rezistentna, nosi alel Lanr1), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno rezistentna, nosi alel AnMan) i populacija 22660 (vrlo osjetljiva). Skraćenica hpi označava sate nakon vakcinacije. Nulte vrijednosti su uklonjene radi pojednostavljenja grafikona.
Skup prekomjerno eksprimiranih gena nakon 6 hpi analiziran je na prisustvo kanonskih R genskih domena (Dodatna tabela S7). Ova studija je otkrila transkriptomsku indukciju klasičnih gena otpornosti na bolesti samo sa NBS-LRR domenima na 83A:476. Ovaj skup se sastojao od jednog TIR-NBS-LRR gena (tanjilg_05042), pet CC-NBS-LRR gena (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 i tanjilg_16162), te četiri NBS-LR, Tanjilg_16162), i četiri NBS-LRRE (tanjilg_16162), kao i četiri NBS-Lrr (tanjilg_16162) i četiri NBS-LRR (TANJILG_16162). Svi ovi geni imaju kanonske domene raspoređene u konzervirane sekvence. Pored gena NBS-LRR domene, nekoliko RLL kinaza je aktivirano nakon 6 hpi, i to jedna u Boregineu (TanjilG_19877), dvije u Mandelupu (TanjilG_07141 i TanjilG_19877) i u populaciji 22660 (TanjilG_09014 i TanjilG_10361) i dvije u 83A 27:476.
Geni sa značajno izmijenjenom ekspresijom kao odgovor na inokulaciju sa C. lupini (soj Col-08) podvrgnuti su analizi obogaćivanja Gene Ontology (GO) (Dodatna tabela S8). Najčešće prekomjerno zastupljen termin biološkog procesa bio je „GO:0006952 odbrambeni odgovor“ koji se pojavio u 6 od 16 (vrijeme × linija) kombinacija sa visokom značajnošću (P vrijednost < 0,001) (Slika 2). Najčešće prekomjerno zastupljen termin biološkog procesa bio je „GO:0006952 odbrambeni odgovor“ koji se pojavio u 6 od 16 (vrijeme × linija) kombinacija sa visokom značajnošću (P vrijednost < 0,001) (Slika 2). Najčešći uobičajeni terminom biološkog procesa bio je «GO: 0006952 zaštitni odgovor», koji se pojavio u 6 od 16 (vrijeme × linija) kombinacijom značajnosti (značenje P <0,001) (ris. 2). Najčešće prekomjerno zastupljen termin biološkog procesa bio je 'GO:0006952 obrambeni odgovor', koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (vrijeme × porijeklo) sa visokom značajnošću (P vrijednost < 0,001) (Slika 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16个 (时间×线)组合中的6 个中,具有高显着性 (P 值< 0,001) (图2)。 Najreprezentativniji termin biološkog procesa je „GO:0006952 odbrambeni odgovor“, koji se pojavljuje u 6 od 16 kombinacija (时间×线), sa visokom značajnošću (P vrijednost < 0,001) (图2). Najčešći uobičajeni terminom biološkog procesa bio je «GO: 0006952 odgovor odbrane», koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (srijeda × linija) s visokom značajnošću (značenje P <0,001) (ris. 2). Najčešće prekomjerno zastupljen termin biološkog procesa bio je 'GO:0006952 Odbrambeni odgovor', koji se pojavio u 6 od 16 kombinacija (vrijeme × linija) sa visokom značajnošću (P vrijednost < 0,001) (Slika 2).Ovaj termin je bio prekomjerno zastupljen u dvije vremenske tačke kod 83A: 476 i Boregine (6 i 24 hpi) i u jednoj vremenskoj tački kod Mandelup i populacije 22660 (12 i 6 hpi, respektivno). Ovo je očekivani rezultat, koji ističe antifungalni odgovor rezistentnih linija. Osim toga, 83A:476 je reagovao na C. lupini brzom indukcijom gena povezanih s oksidativnim naletom predstavljenim terminom "GO:0055114 redoks proces", što ukazuje na specifičan odbrambeni odgovor, dok je Boregine pokazao specifične odbrambene odgovore, povezane s terminom 'GO'. :0006950 Odgovor na stres”. Populacija 22660 aktivirala je horizontalni odgovor otpornosti koji uključuje sekundarne metabolite, ističući prekomjeran broj termina „GO:0016104 Proces biosinteze triterpena” i „GO:0006722 Proces metabolizma triterpena” (oba termina pripadaju istom skupu gena), uzimajući u obzir rezultate analize obogaćivanja GO termina, stabilnost Mandelupove reakcije bila je između Boregine i populacije 22660. Osim toga, rana reakcija 83A:476 (6 hpi) i odgođena reakcija Mandelupa i populacije 22660 uključuju termin GO:0015979 'fotosinteza' i druge povezane biološke procese.
Termini ontologije gena bioprocesa odabrani u anotaciji različito eksprimiranih gena tokom transkriptomskih odgovora uskolisne lupine (NLL) inokulirane antraksnim lupinom (soj Col-08 dobijen sa polja lupine u Wierzhenicama, Poljska, 1999. godine) su uveliko pretjerani. Analizirane NLL linije bile su: 83A:476 (rezistentna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno rezistentna, nosi homozigotni alel AnMan) i populacija 22660 (osjetljiva).
Budući da je cilj ove studije bio identificirati gene koji doprinose otpornosti na antraknozu, geni dodijeljeni terminima GO „GO: 0006952 Odbrambeni odgovori“ i „GO: 0055114 Redoks procesi“ analizirani su s graničnim vrijednostima od osnovnih vrijednosti ≥ 30 s najmanje jednom linijom. × vremenski trenutak koji kombinira statistički značajne vrijednosti log2 (promjena struka). Broj gena koji ispunjavaju ove kriterije bio je 65 za GO:0006952 i 524 za GO:0055114.
83A:476 je otkrio dva DEG vrha označena terminom GO:0006952, prvi na 6 gena po inču (64 gena, regulacija prema gore i dolje), a drugi na 24 gena po inču (15 gena, samo regulacija prema gore). Boregine je također pokazao da je GO:0006952 dostigao vrhunac u istoj vremenskoj tački, ali sa manje DEG-a (11 i 8) i preferencijalnom aktivacijom. Mandeloop je pokazao dva vrha GO:0006952 na 12 i 48 HPI, oba noseći 12 gena (prvi sa aktivirajućim genima, a drugi samo sa supresivnim genima), dok je populacija 22660 na 6 HPI (13 gena) imala veću predominaciju povećanja vrha. Treba napomenuti da je 96,4% GO:0006952 DEG u ovim vrhovima imalo isti tip odgovora (gore ili dolje), što ukazuje na značajno preklapanje u odbrambenim odgovorima uprkos razlikama u broju uključenih gena. Najveća grupa sekvenci povezanih s terminom GO:0006952 kodira protein 22 povezan s gladovanjem i stresom (SAM22-like), koji pripada proteinskoj kladi PR-10 (pathogenesis-associated protein) klase 10 i proteinu sličnom MLP-u (MLP-like protein) (Sl. 3). Dvije grupe su se razlikovale po prirodi ekspresije i smjeru odgovora. Geni koji kodiraju proteine ​​slične SAM22 pokazali su konzistentnu i značajnu indukciju u ranim vremenskim tačkama (6 ili 12 hpi) i uglavnom nisu reagirali na kraju eksperimenta (48 hpi), dok su proteini slični MLP-u pokazali koordinaciju na 6 hpi, 83A:476 i Mandelup na 48 hp/in, gotovo sve ostale tačke podataka nisu reagirale. Osim toga, razlike u profilima ekspresije gena proteina sličnih SAM22 pratile su uočenu varijabilnost u otpornosti na antraknozu, jer su otpornije linije imale više vremenskih tačaka koje su značajno inducirale ove gene od osjetljivijih gena. Drugi PR-10 gen sličan LlR18A/B pokazao je vrlo sličan obrazac ekspresije kao i gen proteina sličan SAM22.
Identificirane su glavne komponente biološkog procesnog termina "GO:0006952 Defense Response" i obrasci ekspresije kandidatskih gena alela Lanr1 i AnMan. Log2 skala predstavlja log2 vrijednosti (promjena struka) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobiven s polja lupine, Wizhenica, Poljska, 1999.) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u istom vremenskom trenutku. Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (rezistentna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno rezistentna, nosi homozigotni alel AnMan) i Populacija 22660 (osjetljiva).
Pored toga, procijenjeni su profili ekspresije RNA-seq kandidatskih gena Lanr1 (TanjilG_05042) i AnMan (TanjilG_12861) (Sl. 3). Gen TanjilG_05042 pokazao je značajan odgovor (aktivaciju) u 83A:476 samo u prvoj vremenskoj tački (6 hpi), dok je TanjilG_12861 bio značajan u Mandeloopu samo u dvije vremenske tačke: 6 hpi (smanjenje regulacije) i 24 hpi (6 hpi). Sa.). podesivim) ).
Najviše prekomjerno eksprimirani geni u terminu GO:0055114 "redoks proces" bili su geni koji kodiraju proteine ​​citokroma P450 i peroksidazu (Sl. 4). Za uzorke izolirane iz 83A:476 na 6 HPI, maksimalne ili minimalne log2 (promjena omjera) vrijednosti (za 86,6% gena) uglavnom su uočene između inokuliranih i kontrolnih biljaka, što ističe visok odgovor ovog genotipa na inokulaciju spola. 83A:476 pokazao je najznačajniji GO:0055114 DEG na 6 hpi (503 gena), dok su ostale linije na 48 hpi (Boregine, 31 gen; Mandelup, 85 gena; i Populacija 22660, 78 gena)). U većini gena porodice GO:0055114 uočena su dva tipa odgovora na vakcinaciju (aktivacija i inhibicija). Zanimljivo je da je do 97,6% diferentno eksprimiranih gena (DEG) identificirano za termin GO: 0055114 kod Mandelupe populacije sa 48 hp. Ova zapažanja ukazuju na to da je, uprkos značajno manjoj skali (tj. broju mutiranih redoks gena, 85 naspram 503), obrazac odgođenih transkriptomskih odgovora mandelupe populacije na antraknozu sličan ranom odgovoru 83A:476. U Boregine populaciji i populaciji 22660, ova konvergencija je niža, 51,6% odnosno 75,6%.
Otkriveni su obrasci ekspresije glavnih komponenti termina biološkog procesa "GO:0055114 Redoks proces". Log2 skala predstavlja log2 vrijednosti (promjena u broju strukova) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen sa polja lupine, Wizhenica, Poljska, 1999) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u istom vremenskom trenutku. Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (rezistentna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno rezistentna, nosi homozigotni alel AnMan) i Populacija 22660 (osjetljiva).
83A:476 Transkriptomski odgovori na inokulaciju sa C. lupini (soj Col-08) također su uključivali koordinirano utišavanje gena koji se pripisuju terminu GO:0015979 "fotosinteza" i drugim srodnim biološkim procesima (SLIKA 5). Ovaj GO:0015979 DEG set sadržavao je 105 gena koji su bili značajno represirani nakon 6 hpi kod 83A:476. U ovom podskupu, 37 gena je također bilo smanjeno kod Mandelupa nakon 48 HPI i 35 u istoj vremenskoj tački u populaciji od 22660, uključujući 19 DEG zajedničkih za oba genotipa. Nijedan DEG povezan sa terminom GO: 0015979 nije bio značajno aktiviran ni u jednoj kombinaciji (linija x vrijeme).
Otkriveni su obrasci ekspresije glavnih komponenti termina biološkog procesa „GO:0015979 Fotosinteza“. Log2 skala predstavlja log2 vrijednosti (promjena u broju strukova) između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen sa polja lupine, Wizhenica, Poljska, 1999) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka u istom vremenskom trenutku. Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (rezistentna, nosi homozigotni alel Lanr1), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina), Mandelup (umjereno rezistentna, nosi homozigotni alel AnMan) i Populacija 22660 (osjetljiva).
Na osnovu rezultata analize diferencijalne ekspresije i vjerovatno uključenih u odbrambene odgovore protiv patogenih gljivica, ovaj set od sedam gena je odabran za kvantifikaciju profila ekspresije pomoću PCR-a u realnom vremenu (Dodatna tabela S9).
Pretpostavljeni proteinski gen TanjilG_10657 je značajno indukovan u svim proučavanim linijama i vremenskim tačkama u poređenju sa kontrolnim (mimičnim) biljkama (Dodatne tabele S10, S11). Pored toga, profil ekspresije TanjilG_10657 pokazao je rastući trend tokom eksperimenta za sve linije. Populacija 22660 pokazala je najveću osjetljivost TanjilG_10657 na inokulaciju sa 114-strukom aktivacijom i najvišim relativnim nivoom ekspresije (4,4 ± 0,4) na 24 HPI (Slika 6a). Proteinski gen PR10 LlR18A TanjilG_27015 također je pokazao aktivaciju u svim linijama i vremenskim tačkama, sa statističkom značajnošću na većini podataka (Slika 6b). Slično kao kod TanjilG_10657, najviši relativni nivo ekspresije TanjilG_27015 je uočen u inokuliranoj populaciji 22660 na 24 HPI (19,5 ± 2,4). Gen kisele endohitinaze TanjilG_04706 bio je značajno pojačan u svim linijama i u svim vremenskim tačkama osim kod Boregine 6 hpi (Slika 6c). Bio je snažno indukovan u prvoj vremenskoj tački (6 HPI) kod 83A:476 (za 10,5 puta) i umjereno povećan u ostalim linijama (za 6,6-7,5 puta). Tokom eksperimenta, ekspresija TanjilG_04706 ostala je na sličnim nivoima kod 83A:476 i Boregine, dok se kod Mandelup i populacije 22660 značajno povećala, dostižući relativno visoke vrijednosti (5,9 ± 1,5 i 6,2 ± 1,5, respektivno). Gen sličan endoglukan-1,3-β-glukozidazi TanjilG_23384 pokazao je visoku aktivaciju u prve dvije vremenske tačke (6 i 12 hpi) u svim linijama osim populacije 22660 (Slika 6d). Najviši relativni nivoi ekspresije TanjilG_23384 uočeni su u drugoj vremenskoj tački (12 hpi) kod Mandelup (2,7 ± 0,3) i 83A:476 (1,5 ± 0,1). Na 24 HPI, ekspresija TanjilG_23384 bila je relativno niska u svim proučavanim linijama (od 0,04 ± 0,009 do 0,44 ± 0,12).
Profili ekspresije odabranih gena (ag) otkriveni kvantitativnom PCR metodom. Brojevi 6, 12 i 24 predstavljaju sate nakon vakcinacije. Geni LanDExH7 i LanTUB6 korišteni su za normalizaciju, a LanTUB6 je korišten za kalibraciju između serija. Trake greške predstavljaju standardnu ​​devijaciju na osnovu tri biološka ponavljanja, od kojih je svako prosjek tri tehnička ponavljanja. Statistička značajnost razlika u nivoima ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen 1999. godine sa polja lupine u Wierzenici, Poljska) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka označena je iznad tačaka podataka (*P vrijednost < 0,05, **P vrijednost ≤ 0,01, ***P vrijednost ≤ 0,001). Statistička značajnost razlika u nivoima ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen 1999. godine sa polja lupine u Wierzenici, Poljska) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka označena je iznad tačaka podataka (*P vrijednost < 0,05, **P vrijednost ≤ 0,01, ***P vrijednost ≤ 0,001). Statistička značajnost različitih u nivou ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, štamm Col-08, dobijen 1999. g. s polja ljupina u Verženice, Poljska) i kontrolnim (ložno inokuliranim) biljkama koje se primećuju nad tačkama dannyh (*značenje P < 0,01, P<0,05, P<0,05) ≤ 0,001). Statistički značajne razlike u nivoima ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen 1999. godine sa polja lupine u Wierzhenicama, Poljska) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka navedene su iznad tačaka podataka (*P vrijednost < 0,05, **P-vrijednost ≤ 0,01, ***P-vrijednost ≤ 0,001).接种（Colletotrichum lupini, Col-08株, 1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟接种）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数渍）植物之间表达水平差异的统计学显着性标记在数渀0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 0,001)。接种 (colletotrichum lupini, color-08 株, 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得) 和 秈捧 和 秈捧之间 水平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***0P. Statistički značajne razlike u nivoima ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, štamm Col-08, dobijen s polej ljupina u Verženice, Poljska, 1999. g.) i kontrolne (ložno inokulirane) biljke koje se primjećuju nad točkama dannyh (* vrijednost P < 0,05, P-značenje, P-značenje, P-značenje ≤ 0,001). Statistički značajne razlike u nivoima ekspresije između inokuliranih (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen sa polja lupine u Verženicama, Poljska, 1999. godine) i kontrolnih (lažno inokuliranih) biljaka navedene su iznad tačaka podataka (*P vrijednost < 0,05, **P-vrijednost ≤ 0,01, ***P-vrijednost ≤ 0,001).Analizirane NLL linije bile su: 83A:476 (rezistentna, nosi homozigotni alel Lanr1), Mandelup (umjereno rezistentna, nosi homozigotni alel AnMan), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina) i populacija 22660 (osjetljiva).
Kandidatni gen TanjilG_05042 na lokusu Lanr1 pokazao je značajno drugačiji obrazac ekspresije od profila dobijenih iz RNA-seq studija (Sl. 6e). Značajna aktivacija ovog gena uočena je u Mandelup i populaciji 22660 (do 39,7 i 11,7 puta, respektivno), što je rezultiralo relativno visokim nivoima ekspresije (do 1,4 ± 0,14 i 7,2 ± 1,3, respektivno). 83A:476 je također otkrio određenu pojačanu regulaciju gena TanjilG_05042 (do 3,8 puta), međutim, postignuti relativni nivoi ekspresije (0,044 ± 0,002) bili su više od 30 puta niži od onih uočenih u Mandelup i populaciji 22660. Analizirane qPCR metodom pokazale su značajne razlike u nivoima ekspresije između genotipova u lažno vakcinisanim (kontrolnim) varijantama, dostižući razliku od 58 puta između populacija 22660 i 83A:476, kao i između populacija 22660 i 22660. Dvostruka razlika postignuta je između Boregine i Mandalup.
Kandidatni gen na AnMan lokusu, TanjilG_12861, aktiviran je kao odgovor na vakcinaciju kod sojeva 83A:476 i Mandelup, bio je neutralan u populaciji 22660, a smanjen kod Boregine (slika 6f). Relativna ekspresija gena TanjilG_12861 bila je najveća kod inokuliranog soja 83A:476 (0,14±0,01). Gen TanjilG_05080 HSP17.4, protein toplotnog šoka klase I od 17,4 kDa, pokazao je niže relativne nivoe ekspresije kod svih proučavanih sojeva i vremenskih tačaka (slika 6g). Najviša vrijednost uočena je na 24 HPI kod populacije 22660 (0,14 ± 0,02, osmostruko povećanje odgovora na vakcinaciju).
Poređenje profila ekspresije gena (Sl. 7) otkrilo je visoku korelaciju između TanjilG_10657 i četiri druga gena: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80) i TanjilG_04706 (r = 0,79). Takvi rezultati mogu ukazivati ​​na koregulaciju ovih gena tokom odbrambenih odgovora. Geni TanjilG_12861 i TanjilG_23384 pokazali su različite profile ekspresije s nižim vrijednostima Pearsonovog koeficijenta korelacije (od 0,08 do 0,43 i -0,19 do 0,28, respektivno) u poređenju s drugim genima.
Korelacije između profila ekspresije gena detektovane su kvantitativnom PCR metodom. Analizirane su sljedeće linije uskolisne lupine: 83A:476 (rezistentna, nosi homozigotni alel Lanr1), Mandelup (umjereno rezistentna, nosi homozigotni alel AnMan), Boregine (rezistentna, nepoznata genetska pozadina) i Populacija 22660 (osjetljiva). Izračunate su tri vremenske tačke (6, 12 i 24 sata nakon inokulacije), uključujući inokulirane (Colletotrichum lupini, soj Col-08, dobijen sa polja lupine u Wierzhenicama, Poljska, 1999. godine) i kontrolne (lažno inokulirane) biljke. Skala prikazuje vrijednost Pearsonovog koeficijenta korelacije.
Na osnovu podataka dobijenih pri 6 konjskih snaga po inču, WGCNA je izvršena na 9981 DEG identifikovanih poređenjem inokuliranih i kontrolnih biljaka kako bi se fokusiralo na rane odbrambene odgovore (Dodatna tabela S12). Pronađeno je dvadeset dva genska modula (klastera) sa koreliranim (pozitivnim ili negativnim) profilima ekspresije između genotipova i eksperimentalnih varijanti. U prosjeku, nivoi ekspresije gena su bili opadajuće redoslijedom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (međutim, u obje varijante ovaj trend je bio jači kod kontrolnih biljaka). U prosjeku, nivoi ekspresije gena su bili opadajuće redoslijedom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (međutim, u obje varijante ovaj trend je bio jači kod kontrolnih biljaka). U srednjem stepenu ekspresije genova snižali se u poretku 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (u različitim varijantama, međutim, ova tendencija je bila jaka u kontrolnim biljkama). U prosjeku, nivoi ekspresije gena smanjivali su se redoslijedom 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (međutim, u obje varijante ovaj trend je bio jači kod kontrolnih biljaka).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660的顺序下降（然而,在两种变体中,这种趋势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 按 按 按 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> stanovništvo 22660 的 顺序 下降 （秌 在 （Ｇ 在在 在 植物 中 更）. U srednjem stepenu ekspresije genova snimili su se u nizu 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (odnosno u različitim varijantama ova tendencija je bila jaka u kontrolnim biljkama). U prosjeku, nivoi ekspresije gena su se smanjili u seriji 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populacija 22660 (međutim, u obje varijante, ovaj trend je bio jači kod kontrolnih biljaka).Vakcinacija je rezultirala pojačanom ekspresijom gena, posebno u modulima 18, 19, 14, 6 i 1 (u opadajućem redoslijedu efekta), negativnom regulacijom (npr. moduli 9 i 20) ili neutralnim efektima (npr. moduli 11, 22, 8 i 13). Analiza obogaćivanja GO termina (Dodatna tabela S13) otkrila je „GO: 0006952 Zaštitne odgovore“ za inokulirani modul (18) sa maksimalnom aktivacijom, uključujući gene analizirane qPCR-om (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015), kao i mnoge module fotosinteze koji su najviše inokulirani (9). Koncentrator modula 18 (Sl. 8) identificiran je kao gen TanjilG_26536 koji kodira protein LlR18B sličan PR-10, a koncentrator modula 9 identificiran je kao gen TanjilG_28955 koji kodira protein fotosistema II PsbQ. Kandidatni gen otpornosti na antraknozu Lanr1, TanjilG_05042, pronađen je u modulu 22 (Sl. 9) i povezan je s terminima „GO:0044260 Ćelijski makromolekularni metabolički procesi“ i „GO:0006355 Transkripcijska regulacija, DNK kalupi“ koji nose čvor TanjilG_01212. Gen kodira transkripcijski faktor toplotnog stresa A-4a (HSFA4a).
Analiza ponderirane mreže koekspresije gena modula s prekomjerno zastupljenim terminima bioloških procesa "GO: 0006952 Defense responses". Ligacija je pojednostavljena kako bi se istaknula četiri gena analizirana qPCR-om (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015).
Analiza ponderirane mreže koekspresije gena modula s prekomjerno zastupljenim terminom biološkog procesa "GO: 0006355: Transkripcijska regulacija, DNK templating" i koji nosi kandidatski gen otpornosti na antraknozu Lanr1 TanjilG_05042. Ligacija je pojednostavljena kako bi se izolirali gen TanjilG_05042 i centralni gen TanjilG_01212.
Probir na otpornost na antraknozu prikupljen u Australiji pokazao je da je većina rano priznatih kultivara bila osjetljiva; Kalya, Coromup i Mandelup opisani su kao umjereno otporni, dok su Wonga, Tanjil i 83A:476 opisani kao visoko otporni26,27,31. imali su isti alel otpornosti, označen kao Lanr1, a Coromup i Mandelup imali su drugačiji alel, označen kao AnMan10, 26, 39, dok je Kalya prenijela drugačiji alel, Lanr2. Probir na otpornost na antraknozu u Njemačkoj rezultirao je identifikacijom otporne linije Bo7212 s kandidatskim alelom koji nije Lanr1, označen kao LanrBo36.
Naša studija je otkrila vrlo nisku frekvenciju (oko 6%) alela Lanr1 u testiranoj germplazmi. Ovo zapažanje je u skladu s rezultatima skrininga istočnoevropske germplazme korištenjem markera Anseq3 i Anseq4, koji su pokazali da je alel Lanr1 prisutan samo u dvije bjeloruske linije. Ovo ukazuje na to da alel Lanr1 još uvijek nije široko korišten u lokalnim programima oplemenjivanja, za razliku od Australije, gdje je jedan od ključnih alela za oplemenjivanje uz pomoć markera. To može biti zbog nižeg nivoa otpornosti koji pruža alel Lanr1 u evropskim poljskim uslovima u poređenju s australijskim izvještajem. Osim toga, studije antraknoze u područjima s visokim padavinama u Australiji pokazale su da odgovori otpornosti posredovani alelom Lanr1 možda neće biti efikasni u vremenskim uslovima koji pogoduju rastu i brzom razvoju patogena19,42. U stvari, u ovoj studiji, neki simptomi antraknoze su također uočeni kod genotipova koji nose alel Lanr1, što ukazuje na to da otpornost može nestati pod optimalnim uslovima za razvoj C. lupini. Osim toga, moguća su lažno pozitivna tumačenja prisustva markera Anseq3 i Anseq4, koji su približno 1 cM udaljeni od lokusa Lanr1 28,30,43.
Naša studija je pokazala da je 83A:476, koji nosi alel Lanr1, reagirao na inokulaciju C. lupini reprogramiranjem transkriptoma velikih razmjera u prvoj analiziranoj vremenskoj tački (6 hpi), dok su kod Mandelupa, koji nosi alel AnMan, transkriptomski odgovori uočeni mnogo kasnije (od 24 do 48 hp). Ove vremenske varijacije u odbrambenim odgovorima povezane su s razlikama u simptomima bolesti, što naglašava važnost ranog prepoznavanja patogena za uspješan odgovor na otpornost. Da bi inficirale biljno tkivo, spore antraksa moraju proći kroz nekoliko razvojnih faza na površini domaćina, uključujući klijanje, diobu ćelija i formiranje apresorijuma. Dodatak je infektivna struktura koja se pričvršćuje za površinu domaćina i olakšava prodiranje u tkiva domaćina. Dakle, spore C. gloeosporioides u ekstraktu graška pokazale su prvu diobu jezgra nakon 75-90 minuta inkubacije, formiranje klicine cijevi nakon 90-120 minuta i supresiju nakon 4 sata 45. Mango C. gloeosporioides pokazao je više od 40% klijanja konidija nakon 3 sata inkubacije i oko 20% formiranja apresora nakon 4 sata. Gen C. gloeosporioides, povezan s virulencijom, pokazao je transkripcijsku aktivnost u konidijama koje formiraju epifite nakon 3,5 sata inkubacije u površinskom vosku avokada s visokim koncentracijama proteina CAP20 nakon 4 sata i 46 minuta. Slično tome, aktivnost gena biosinteze melanina kod C. trifolii indukovana je tokom 2-satne inkubacije, nakon čega je uslijedilo formiranje apresorijuma nakon 1 sata. Studije tkiva lista pokazale su da jagode inokulirane sa C. acutatum imaju prvu supresiju nakon 8 sati nakon infektivnog procesa, dok paradajz inokuliran sa C. coccodes ima prvu supresiju nakon 4 sata nakon infektivnog procesa48,49, što je u velikoj mjeri u skladu s vremenskom skalom infektivnog procesa Colletotrichum spp. Brzi odbrambeni odgovori na 83A:476 ukazuju na uključenost gena otpornosti biljaka i gena imuniteta pokrenutog efektorima (ETI) u ovoj liniji, dok Mandelupovi odloženi odgovori podržavaju hipotezu o imunitetu pokrenutom efektorima (MTI) koji je povezan s mikro-povezanim molekularnim obrascem 50. Rani odgovori na 83A: 476 i Mandelupa. Djelomično preklapanje između gena reguliranih prema gore ili dolje u odloženom odgovoru također podržava ovaj koncept, jer se ETI često smatra ubrzanim i poboljšanim MTI odgovorom koji kulminira programiranom smrću ćelija na mjestu infekcije, poznatom kao anafilaktički šok 51,52.
Većina gena koji se pripisuju previše zastupljenom terminu Gene Ontology GO:0006952 "Odbrambeni odgovor" su 11 homologa proteina 22 izazvanog stresom (slično SAM22) i sedam glavnih proteina sličnih lateks proteinima (MLP) 31, 34, 43 i 423 pokazali su sličnost sekvenci. Geni slični SAM22 pokazali su značajnu aktivaciju koja je trajala duže, pokazujući povećane nivoe otpornosti na antraknozu (83A:476 i Boregine). Međutim, geni slični MLP-u bili su smanjeno regulirani samo u linijama koje nose kandidatski alel otpornosti (83A:476/Lanr1 nakon 6 hpi i Mandelup/AnMan nakon 24 hpi). Treba napomenuti da svi identifikovani homolozi slični SAM22 potiču iz genskog klastera koji se prostire na približno 105 kb, dok geni slični MLP-u potiču iz odvojenih regija genoma. Koordinirana aktivacija takvih gena sličnih SAM22 pronađena je i u našoj prethodnoj studiji o otpornosti NLL-a na inokulaciju Diaporthetoxica, što ukazuje na to da su oni uključeni u horizontalne komponente odbrambenog odgovora. Ovaj zaključak također podržavaju izvještaji o pozitivnom odgovoru gena sličnih SAM22 na povredu ili tretman salicilnom kiselinom, induktorima gljivica ili vodikovim peroksidom.
Pokazalo se da geni slični MLP-u reaguju na različite abiotske i biotičke stresove, uključujući bakterijske, virusne i patogene gljivične infekcije kod mnogih biljnih vrsta55. Pravci odgovora na određene interakcije između biljaka i patogena kretali su se od snažnog povećanja (tj. tokom zaraze pamuka sa Verticillium dahliae) do značajnog smanjenja (tj. nakon infekcije stabla jabuke sa Alternaria spp.)56,57. Značajno smanjenje ekspresije gena sličnog MLP-u 423 uočeno je tokom odbrane avokada od infekcije F. niger i tokom infekcije stabla jabuke Botryosphaeria berengeriana f. cn. piricola i Alternaria alternata su patotipovi jabuke58,59. Pored toga, kalusi jabuke koji prekomjerno eksprimiraju gen sličan MLP-u 423 imali su nižu ekspresiju gena povezanih s otpornošću i bili su podložniji gljivičnim infekcijama59. Nakon Fusarium oxysporum f, gen sličan MLP-u 423 je također bio potisnut u rezistentnoj germplazmi običnog graha. cn. Infekcija graha 60.
Drugi članovi PR-10 porodice identifikovani u našoj RNA-seq studiji bili su geni LlR18A i LlR18B kao odgovor na pojačanu regulaciju, kao i pojačano (1 gen) ili smanjeno (3 gena) gen za protein za transfer lipida DIR1. Pored toga, WGCNA ističe gen LlR18B kao središte u ovom modulu, koji je veoma podložan vakcinaciji i nosi nekoliko gena zaštitnog odgovora. Geni LlR18A i LlR18B su indukovani u listovima žutog lupina kao odgovor na patogene bakterije, kao i u stabljikama NLL nakon inokulacije D. toxica, dok je rižin homolog ovih gena, RSOsPR10, brzo indukovan gljivičnom infekcijom za koju se pretpostavlja da je uključena u signalni put jasmonske kiseline53,61,62. Gen DIR1 kodira nespecifične proteine ​​za transport lipida koji su potrebni za nastanak sistemske stečene rezistencije (SAR). Razvojem zaštitnih reakcija, protein DIR1 se transportuje iz žarišta infekcije kroz floem kako bi izazvao SAR u udaljenim organima. Zanimljivo je da je gen TanjilG_02313 DIR1 značajno indukovan u prvoj vremenskoj tački u linijama 84A:476 i populaciji 22660, ali se otpornost na antraknozu uspješno razvila samo u liniji 84A:476. Ovo može ukazivati ​​na određenu subfunkcionalizaciju gena DIR1 u NLL, budući da su preostala tri homologa reagovala na inokulaciju samo u liniji 83A:476 nakon 6 hpi, a ovaj odgovor je bio usmjeren prema dolje.
U našoj studiji, najčešće komponente koje odgovaraju biološkom procesu nazvanom "GO:0055114 Redoks proces" bile su protein citohroma P450, peroksidaza, linolna kiselina 9S-/13S-lipoksigenaza i 1-aminociklopropan-1-karboksilna kiselina oksidaza. Pored toga, naša WGCNA definira homolog HSFA4a kao čvorište koje nosi module poput kandidata gena otpornosti na Lanr1, TanjilG_05042. HSFA4a je komponenta redoks-ovisne regulacije nuklearne transkripcije u biljkama.
Proteini citokroma P450 su oksidoreduktaze koje kataliziraju NADPH i/ili O2-ovisne reakcije hidroksilacije u primarnom i sekundarnom metabolizmu, uključujući metabolizam ksenobiotika, kao i hormona, masnih kiselina, sterola, komponenti ćelijskog zida, biopolimera i biosintezu zaštitnih spojeva 69. U našoj studiji, varijabilnost funkcije biljnog citokroma P450 smanjena je sa -10,6 log2 (promjena puta) na 5,7 zbog velikog broja promijenjenih homologa (37) i razlika u obrascima odgovora između specifičnih gena, što odražava reviziju naviše. Korištenje samo podataka RNA-sekvenciranja za razjašnjavanje pretpostavljene biološke funkcije NLL gena u tako velikoj proteinskoj superfamiliji bilo bi vrlo spekulativno. Međutim, vrijedi napomenuti da su neki geni citokroma P450 povezani s povećanom otpornošću na patogene gljivice ili bakterije, uključujući doprinos alergijskim reakcijama 69,70,71.
Peroksidaze klase III su multifunkcionalni biljni enzimi uključeni u širok spektar metaboličkih procesa tokom rasta i razvoja biljaka, kao i kao odgovor na stresne faktore iz okoline poput saliniteta, suše, visokog intenziteta svjetlosti i napada patogena72. Peroksidaze su uključene u interakciju nekoliko biljnih vrsta s anthracisom, uključujući Stylosanthes humilis i C. gloeosporioides, Lens culinaris i C. truncatum, Phaseolus vulgaris i C. lindemuthianum, Cucumis sativus i C. lagenarium73,74,75,76. Odgovor je vrlo brz, ponekad čak i na 4 HPI, prije nego što gljivica prodre u biljno tkivo73. Gen peroksidaze također je reagirao na inokulaciju D. toxica NLL. Pored svojih tipičnih funkcija regulacije oksidativnog naleta ili eliminacije oksidativnog stresa, peroksidaze mogu ometati rast patogena stvaranjem fizičkih barijera zasnovanih na ojačanju ćelijskog zida tokom lignifikacije, podjedinice ili umrežavanja specifičnih spojeva. Ova funkcija se in silico može pripisati genu TanjilG_03329 koji kodira pretpostavljenu anionsku peroksidazu koja formira lignin, a koja je u našoj studiji bila značajno pojačana kod linije otporne na 83A:476 pri 6 HPI, ali ne i kod drugih sojeva i vremenskih tačaka koje nisu reagirale.
9S-/13S-lipoksigenaza linolne kiseline je prvi korak u oksidativnom putu biosinteze lipida78. Produkti ovog puta imaju višestruke funkcije u odbrani biljaka, uključujući jačanje ćelijskog zida stvaranjem naslaga kaloze i pektina, te regulaciju oksidativnog stresa proizvodnjom reaktivnih vrsta kisika79,80,81,82,83. U ovoj studiji, ekspresija linolne kiseline 9S-/13S-lipoksigenaze bila je promijenjena kod svih sojeva, ali kod osjetljive populacije 22660, pojačana regulacija je prevladavala u različitim vremenskim tačkama, dok kod sojeva koji nose rezistentni Lanr1 i alel AnMan, naglašava diverzifikaciju oksilipinskog sloja u zaštitnim reakcijama antraksa između ovih genotipova.
Homolog 1-aminociklopropan-1-karboksilat oksidaze (ACO) je značajno pojačano (9 gena) ili smanjeno (2 gena) kada je inokuliran lupinom. Uz dva izuzetka, svi ovi odgovori su se javili pri 6 hp na 83A:476. Enzimska reakcija posredovana ACO proteinima je korak koji ograničava brzinu u proizvodnji etilena i stoga je visoko regulirana84. Etilen je biljni hormon koji igra različite uloge u regulaciji razvoja biljaka i odgovora na abiotske i biotičke stresne uslove. Indukcija ACO transkripcije i aktivacija signalnog puta etilena uključene su u povećanje otpornosti riže na hemibiotrofnu gljivicu oryzae oryzae regulacijom proizvodnje reaktivnih vrsta kisika i fitoaleksina. Vrlo sličan proces infekcije lista pronađen između M. oryzae i C. lupini88,89, na pozadini značajnog povećanja ACO homologa u liniji 83A:476 o čemu je izvještavano u ovoj studiji, pomjera mogućnost davanja otpornosti na NLL antraknozu etilen kao centralnog signalnog koraka u molekularnim putevima.
U ovoj studiji, uočena je velika supresija mnogih gena povezanih s fotosintezom nakon 6 hpi kod 83A:476 i nakon 48 hpi kod Mandeloop i populacije 22660. Obim i progresija ovih promjena proporcionalni su nivou. U ovom eksperimentu uočena je otpornost na antraknozu. Nedavno je zabilježena jaka i rana represija transkripata povezanih s fotosintezom u nekoliko modela interakcija biljaka i patogena, uključujući patogene bakterije i gljivice. Brzina (od 2 HPI u nekim interakcijama) i globalna supresija gena povezanih s fotosintezom kao odgovor na infekciju mogu pokrenuti imunitet biljaka na osnovu raspoređivanja reaktivnih vrsta kisika i njihove interakcije sa putem salicilne kiseline kako bi se posredovale alergijske reakcije 90,94.
Zaključno, predloženi mehanizmi odbrambenog odgovora za najotporniju liniju (83A:476) uključuju brzo prepoznavanje patogena od strane R gena (vjerovatno TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) i signalizaciju salicilne kiseline i etilena posredovanu alergijskim odgovorom, nakon čega slijedi uspostavljanje dugog dometa SAR-a. Djelovanje podržava protein DIR-1. Treba napomenuti da je biotrofički period za infekciju C. lupini vrlo kratak (otprilike 2 dana), nakon čega slijedi nekrotični rast95. Prelaz između ovih faza može biti povezan s nekrozom i ekspresijom proteina inducibilnih etilenom koji djeluju kao okidači za reakcije preosjetljivosti kod biljaka domaćina. Stoga je vremenski prozor za uspješno hvatanje C. lupini u biotrofičkoj fazi vrlo uzak. Reprogramiranje gena povezanih s redoksom i fotosintezom uočeno u 83A:476 nakon 6 hpi u skladu je s progresijom gljivičnih hifa i najavljuje razvoj uspješnog zaštitnog odgovora u biotrofičkoj fazi. Transkriptomski odgovori Mandelupa i populacije 22660 mogu biti previše odloženi da bi uhvatili gljivicu prije prelaska na nekrotični rast, međutim, Mandelup bi mogao biti efikasniji od populacije 22660 jer relativno brza regulacija PR-10 proteina potiče horizontalnu otpornost.
ETI, vođen kanonskim R genom, čini se da je uobičajeni mehanizam za otpornost graha na antraknozu. Dakle, kod modelne mahunarke Medicago truncatula, otpornost na antraknozu osigurava gen RCT1, član klase R gena biljke TIR-NBS-LRR97. Ovaj gen također daje otpornost na antraknozu širokog spektra kod lucerke kada se prenese na osjetljive biljke. Kod običnog graha (P. vulgaris) do danas je identificirano više od dva tuceta gena otpornosti na antraknozu. Neki od ovih gena nalaze se u regijama kojima nedostaju kanonski R geni, međutim mnogi drugi se nalaze na rubovima hromozoma koji nose genski klaster NBS-LRR, uključujući TIR-NBS-LRRs99. Studija SSR cijelog genoma također je potvrdila povezanost gena NBS-LRR s otpornošću na antraknozu kod običnog graha. Kanonski R gen je također pronađen u genomskoj regiji koja nosi glavni lokus otpornosti na antraknozu kod bijelog lupina 101.
Naš rad pokazuje da trenutna reakcija otpornosti, aktivirana u ranoj fazi infekcije biljke (poželjno ne kasnije od 12 hpi), efikasno štiti uskolisni lupin od antraknoze uzrokovane patogenom gljivicom Collelotrichum lupini. Koristeći visokopropusno sekvenciranje, demonstrirali smo diferencijalne profile ekspresije gena otpornosti na antraknozu kod NLL biljaka posredovanih genima otpornosti Lanr1 i AnMan. Uspješna odbrana uključuje pažljivo dizajniranje gena za proteine ​​uključene u redoks, fotosintezu i patogenezu unutar nekoliko sati od prvog kontakta biljke s patogenom. Slične zaštitne reakcije, ali odgođene u vremenu, mnogo su manje efikasne u zaštiti biljaka od bolesti. Otpornost na antraks posredovana genom Lanr1 podsjeća na tipičan brzi odgovor R gena (imunitet pokrenut efektorom), dok gen AnMan najvjerovatnije pruža horizontalni odgovor (imunitet pokrenut molekularnim obrascem povezanim s mikrobom), pružajući umjereni nivo održivosti.
215 NLL linija korištenih za skrining antraknoznih markera sastojalo se od 74 kultivara, 60 linija dobivenih križanjem ili uzgojem, 5 mutanata i 76 divljih ili originalnih germplazmi. Linije su došle iz 17 zemalja, uglavnom iz Poljske (58), Španije (47), Njemačke (27), Australije (26), Rusije (19), Bjelorusije (7), Italije (5) i drugih linija iz 10 zemalja. Skup također uključuje referentne rezistentne linije: 83A:476, Tanjil, Wonga koja nosi alel Lanr1 i Mandelup koja nosi alel AnMan. Linije su dobivene iz Europske baze podataka genetičkih resursa lupina koju održava Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Poljska (Dodatna tablica S1).
Biljke su uzgajane pod kontrolisanim uslovima (fotoperiod 16 sati, temperatura 25°C tokom dana i 18°C ​​​​noću). Analizirana su dva biološka ponavljanja. DNK je izolovana iz listova starih tri sedmice korištenjem DNeasy Plant Mini Kit-a (Qiagen, Hilden, Njemačka) prema protokolu. Kvalitet i koncentracija izolovane DNK procijenjeni su spektrofotometrijskim metodama (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Analizirani su marker AnManM1 koji označava gen otpornosti na antraknozu AnMan (izveden iz sorte Mandelup) i markeri Anseq3 i Anseq4 koji okružuju gen Lanr1 (izveden iz sorte Tanjil) 11,26,28. Homozigoti za rezistentni alel su ocijenjeni kao "1", osjetljivi - kao "0", a heterozigoti - kao 0,5.
Na osnovu rezultata skrininga za markere AnManM1, AnSeq3 i AnSeq4 i dostupnosti sjemena za završne eksperimente praćenja, odabrano je 50 NLL linija za fenotipizaciju otpornosti na antraknozu. Analiza je provedena u duplikatu u kompjuterski kontroliranom stakleniku sa 14-satnim fotoperiodom i temperaturnim rasponom od 22°C tokom dana i 19°C noću. Sjemenke se grebu (odsijecanje sjemene ljuske na suprotnoj strani embriona oštrim nožem) prije sjetve kako bi se spriječilo mirovanje sjemena zbog previše tvrde sjemene ljuske i kako bi se osiguralo ujednačeno klijanje. Biljke su uzgajane u saksijama (11 × 11 × 21 cm) sa sterilnom zemljom (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varšava, Poljska). Inokulacija je provedena sojem Colletotrichum lupini Col-08, uzgojenim 1999. godine iz stabljika uskolisnih biljaka lupine uzgajanih na polju u Verženici, Velikopoljska (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E). Izolati su uzgajani u SNA medijumu na 20° C. pod crnim svjetlom tokom 21 dan kako bi se indukovala sporulacija. Četiri sedmice nakon sjetve, kada su biljke dostigle fazu 4-6 listova, inokulacija je provedena prskanjem suspenzijom konidija u koncentraciji od 0,5 x 10⁶ konidija po ml. Nakon inokulacije, biljke su držane u mraku 24 sata pri vlažnosti od oko 98% i temperaturi od 25°C kako bi se olakšalo klijanje konidija i proces infekcije. Biljke su zatim uzgajane pod 14-satnim fotoperiodom na 22°C danju/19°C noću i 70% vlažnosti. Rezultat bolesti je utvrđen 22 dana nakon inokulacije i kretao se od 0 (imuno) do 9 (vrlo osjetljivo) ovisno o prisutnosti ili odsutnosti nekrotičnih lezija na stabljikama i listovima. Osim toga, nakon bodovanja, izmjerena je težina biljaka. Odnosi između marker genotipova i fenotipova bolesti izračunati su kao korelacije između tačaka i dva sekvenca (odsustvo heterozigotnih markera u skupu linija za analizu fenotipa otpornosti na antraknozu).