Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Nove imunološke i masene spektrometrijske metode za kompleksnu analizu perzistentnih oligosaharida u kukuruznim zrnima prethodno tretiranim AFEX-om. Lignocelulozna biomasa je održiva alternativa fosilnim gorivima i široko se koristi za razvoj biotehnologija za proizvodnju proizvoda kao što su hrana, stočna hrana, goriva i hemikalije. Ključ ovih tehnologija je razvoj cjenovno konkurentnih procesa za pretvaranje složenih ugljikohidrata prisutnih u ćelijskim zidovima biljaka u jednostavne šećere poput glukoze, ksiloze i arabinoze. Budući da je lignocelulozna biomasa vrlo tvrdoglava, mora se podvrgnuti termohemijskim tretmanima (npr. eksfolijacija amonijačnih vlakana (AFEX), razrijeđene kiseline (DA), jonske tekućine (IL)) i biološkim tretmanima (npr. enzimska hidroliza i mikrobna fermentacija) u kombinaciji kako bi se dobio željeni proizvod. Međutim, kada se komercijalni gljivični enzimi koriste u procesu hidrolize, samo 75-85% formiranih rastvorljivih šećera su monosaharidi, a preostalih 15-25% su rastvorljivi, neobradivi oligosaharidi, koji nisu uvijek dostupni mikroorganizmima. Prethodno smo uspješno izolovali i pročistili rastvorljive tvrdoglave oligosaharide koristeći kombinaciju separacije ugljika i dijatomejske zemlje i hromatografije isključivanja po veličini, a također smo istražili njihova inhibitorna svojstva prema enzimima. Otkrili smo da je oligosaharide koji sadrže metilirane uronske kiselinske supstitucije s višim stepenom polimerizacije (DP) teže obraditi komercijalnim mješavinama enzima nego oligosaharide s niskim DP i neutralne oligosaharide. Ovdje izvještavamo o upotrebi nekoliko dodatnih metoda, uključujući profiliranje glikana korištenjem monoklonskih antitijela (mAb) specifičnih za glikane biljne biomase za karakterizaciju glikanskih veza u ćelijskim zidovima biljaka i enzimskim hidrolizatima, lasersku desorpcijsku ionizaciju uz pomoć matrice, masenu spektrometriju s vremenom leta. MALDI-TOF-MS) koristi strukturno informativne dijagnostičke vrhove dobivene spektroskopijom nakon sekundarnog raspada negativnih iona, plinsku hromatografiju i masenu spektrometriju (GC-MS) za karakterizaciju oligosaharidnih veza sa i bez derivatizacije. Zbog male veličine oligosaharida (DP 4-20), ove molekule je teško koristiti za vezivanje i karakterizaciju mAb. Da bismo prevazišli ovaj problem, primijenili smo novu metodu imobilizacije oligosaharida zasnovanu na konjugaciji biotina koja je uspješno obilježila većinu oligosaharida rastvorljivih u niskom DP na površini mikroploče, koja je zatim korištena u visokopropusnom mAb sistemu za specifičnu analizu ligacije. Ova nova metoda će olakšati razvoj naprednijih visokopropusnih glikomskih testova u budućnosti koji se mogu koristiti za izolaciju i karakterizaciju oligosaharida prisutnih u biomarkerima u dijagnostičke svrhe.
Lignocelulozna biomasa, sastavljena od poljoprivrednih, šumarskih, travnatih i drvenastih materijala, potencijalna je sirovina za proizvodnju bioproizvoda, uključujući hranu, stočnu hranu, gorivo i hemijske prekursore za proizvodnju proizvoda veće vrijednosti1. Ugljikohidrati (kao što su celuloza i hemiceluloza) prisutni u ćelijskim zidovima biljaka depolimeriziraju se u monosaharide hemijskom obradom i biotransformacijom (kao što su enzimska hidroliza i mikrobna fermentacija). Uobičajeni predtretmani uključuju ekspanziju amonijačnih vlakana (AFEX), razrijeđenu kiselinu (DA), ionsku tekućinu (IL) i eksploziju pare (SE), koji koriste kombinaciju hemikalija i topline za smanjenje proizvodnje lignoceluloze otvaranjem ćelijskih zidova biljaka3,4. tvrdoglavost materije, 5. Enzimska hidroliza se provodi pri visokom opterećenju čvrstim tvarima korištenjem komercijalnih enzima koji sadrže aktivne ugljikohidrate (CAZymes) i mikrobne fermentacije korištenjem transgenih kvasaca ili bakterija za proizvodnju biogoriva i hemikalija 6.
CAZimi u komercijalnim enzimima sastavljeni su od složene mješavine enzima koji sinergijski cijepaju složene veze ugljikohidrata i šećera formirajući monosaharide2,7. Kao što smo ranije izvijestili, složena mreža aromatskih polimera lignina s ugljikohidratima čini ih vrlo teško obrađenim, što dovodi do nepotpune konverzije šećera, akumulirajući 15-25% spolnih oligosaharida koji se ne proizvode tokom enzimske hidrolize prethodno tretirane biomase. Ovo je čest problem kod različitih metoda prethodne obrade biomase. Neki od razloga za ovo usko grlo uključuju inhibiciju enzima tokom hidrolize ili odsustvo ili niske nivoe esencijalnih enzima koji su potrebni za razbijanje šećernih veza u biljnoj biomasi. Razumijevanje sastava i strukturnih karakteristika šećera, kao što su šećerne veze u oligosaharidima, pomoći će nam da poboljšamo konverziju šećera tokom hidrolize, čineći biotehnološke procese konkurentnim po troškovima s proizvodima dobivenim iz nafte.
Određivanje strukture ugljikohidrata je izazovno i zahtijeva kombinaciju metoda kao što su tekućinska kromatografija (LC)11,12, nuklearna magnetska rezonantna spektroskopija (NMR)13, kapilarna elektroforeza (CE)14,15,16 i masena spektrometrija (MS)17. ,osamnaest. MS metode kao što je masena spektrometrija s vremenskim mjerenjem leta s laserskom desorpcijom i ionizacijom pomoću matrice (MALDI-TOF-MS) su svestrana metoda za identifikaciju struktura ugljikohidrata. Nedavno se tandem MS adukata natrijevih iona s disocijacijom induciranom kolizijom (CID) najčešće koristi za identifikaciju otisaka prstiju koji odgovaraju položajima vezivanja oligosaharida, anomernim konfiguracijama, sekvencama i položajima grananja 20, 21.
Analiza glikana je odličan alat za detaljnu identifikaciju ugljikohidratnih veza22. Ova metoda koristi monoklonska antitijela (mAb) usmjerena na glikan ćelijskog zida biljke kao sonde za razumijevanje složenih ugljikohidratnih veza. Više od 250 mAb je dostupno širom svijeta, dizajniranih protiv različitih linearnih i razgranatih oligosaharida korištenjem različitih saharida24. Nekoliko mAb se široko koristi za karakterizaciju strukture, sastava i modifikacija ćelijskog zida biljke, budući da postoje značajne razlike ovisno o vrsti biljne ćelije, organu, starosti, razvojnom stadiju i okruženju rasta25,26. U novije vrijeme, ova metoda se koristi za razumijevanje populacija vezikula u biljnim i životinjskim sistemima i njihovih odgovarajućih uloga u transportu glikana, kako je određeno subćelijskim markerima, razvojnim stadijima ili podražajima iz okoline, te za određivanje enzimske aktivnosti. Neke od različitih struktura glikana i ksilana koje su identificirane uključuju pektin (P), ksilan (X), manan (M), ksiloglukane (XylG), glukane s miješanim vezama (MLG), arabinoksilan (ArbX), galaktomanan (GalG), glukuronsku kiselinu-arabinoksilan (GArbX) i arabino-galaktan (ArbG)29.
Međutim, uprkos svim ovim istraživačkim naporima, samo nekoliko studija se fokusiralo na prirodu akumulacije oligosaharida tokom hidrolize sa visokim sadržajem čvrstih materija (HSL), uključujući oslobađanje oligosaharida, promjene dužine oligomernog lanca tokom hidrolize, različite polimere sa niskim DP i njihove krivulje distribucije 30,31,32. U međuvremenu, iako se analiza glikana pokazala kao koristan alat za sveobuhvatnu analizu strukture glikana, teško je procijeniti vodorastvorljive oligosaharide sa niskim DP korištenjem metoda antitijela. Manji DP oligosaharidi sa molekularnom težinom manjom od 5-10 kDa ne vežu se za ELISA ploče 33, 34 i ispiru se prije dodavanja antitijela.
Ovdje, po prvi put, demonstriramo ELISA test na pločama obloženim avidinom korištenjem monoklonskih antitijela, kombinirajući jednostepeni postupak biotinilacije za topljive refraktorne oligosaharide s analizom glikoma. Naš pristup analizi glikoma validiran je analizom komplementarnih oligosaharidnih veza zasnovanom na MALDI-TOF-MS i GC-MS korištenjem derivatizacije hidroliziranih šećernih sastava trimetilsililom (TMS). Ovaj inovativni pristup može se u budućnosti razviti kao visokopropusna metoda i pronaći širu primjenu u biomedicinskim istraživanjima35.
Posttranslacijske modifikacije enzima i antitijela, poput glikozilacije,36 utječu na njihovu biološku aktivnost. Na primjer, promjene u glikozilaciji serumskih proteina igraju važnu ulogu u inflamatornom artritisu, a promjene u glikozilaciji koriste se kao dijagnostički markeri37. U literaturi je zabilježeno da se različiti glikani lako pojavljuju u raznim bolestima, uključujući kronične upalne bolesti gastrointestinalnog trakta i jetre, virusne infekcije, rak jajnika, dojke i prostate38,39,40. Razumijevanje strukture glikana korištenjem ELISA metoda za glikane na bazi antitijela pružit će dodatno povjerenje u dijagnozu bolesti bez upotrebe složenih MS metoda.
Naša prethodna studija pokazala je da tvrdokorni oligosaharidi ostaju nehidrolizirani nakon prethodne obrade i enzimske hidrolize (Slika 1). U našem prethodno objavljenom radu, razvili smo metodu ekstrakcije aktivnim ugljem u čvrstoj fazi za izolaciju oligosaharida iz hidrolizata kukuruzne sjemenke (ACSH)8 prethodno tretiranog AFEX-om. Nakon početne ekstrakcije i odvajanja, oligosaharidi su dalje frakcionirani pomoću hromatografije isključivanja veličine (SEC) i sakupljeni po redoslijedu molekularne težine. Monomeri i oligomeri šećera oslobođeni iz različitih predtretmana analizirani su analizom sastava šećera. Prilikom poređenja sadržaja šećernih oligomera dobijenih različitim metodama prethodne obrade, prisustvo tvrdokornih oligosaharida je čest problem u konverziji biomase u monosaharide i može dovesti do smanjenja prinosa šećera za najmanje 10-15%, pa čak i do 18%. SAD. Ova metoda se koristi za dalju proizvodnju velikih razmjera oligosaharidnih frakcija. Dobiveni ACH i njegove naknadne frakcije s različitim molekularnim težinama korištene su kao eksperimentalni materijal za karakterizaciju oligosaharida u ovom radu.
Nakon prethodne obrade i enzimske hidrolize, perzistentni oligosaharidi ostali su nehidrolizirani. Ovdje (A) je metoda odvajanja oligosaharida u kojoj se oligosaharidi izoliraju iz hidrolizata kukuruznih sjemenki prethodno tretiranih AFEX-om (ACSH) korištenjem sloja aktivnog uglja i dijatomejske zemlje; (B) Metoda za odvajanje oligosaharida. Oligosaharidi su dalje odvojeni hromatografijom isključivanja veličine (SEC); (C) Monomeri i oligomeri saharida oslobođeni iz različitih prethodnih obrada (razrijeđena kiselina: DA, jonska tekućina: IL i AFEX). Uslovi enzimske hidrolize: visoko punjenje čvrstim tvarima od 25% (w/w) (približno 8% punjenje glukanom), 96 sati hidrolize, punjenje komercijalnim enzimima od 20 mg/g (omjer Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) i (D) Monomeri i oligomeri šećera oslobođeni iz kukuruznih sjemenki prethodno tretiranih AFEX-om (ACS).
Analiza glikana pokazala se kao koristan alat za sveobuhvatnu strukturnu analizu glikana u ekstraktima izoliranim iz ostataka čvrste biomase. Međutim, saharidi rastvorljivi u vodi su nedovoljno zastupljeni korištenjem ove tradicionalne metode41 jer je oligosaharide niske molekularne težine teško imobilizirati na ELISA pločama i ispiru se prije dodavanja antitijela. Stoga je za vezivanje i karakterizaciju antitijela korištena metoda jednostepene biotinilacije za oblaganje rastvorljivih, neusklađenih oligosaharida na ELISA pločama obloženim avidinom. Ova metoda je testirana korištenjem našeg prethodno proizvedenog ACSH i frakcije zasnovane na njegovoj molekularnoj težini (ili stepenu polimerizacije, DP). Jednostepena biotinilacija je korištena za povećanje afiniteta vezivanja oligosaharida dodavanjem biotin-LC-hidrazida na redukcijski kraj ugljikohidrata (Slika 2). U rastvoru, hemiacetalna grupa na redukcijskom kraju reaguje sa hidrazidnom grupom biotin-LC-hidrazida i formira hidrazonsku vezu. U prisustvu redukcionog sredstva NaCNBH3, hidrazonska veza se reducira do stabilnog biotiniliranog krajnjeg proizvoda. Modifikacijom kraja koji redukuje šećer, postalo je moguće vezivanje oligosaharida s niskim DP-om za ELISA ploče, a u našoj studiji to je učinjeno na pločama obloženim avidinom korištenjem mAb-ova usmjerenih na glikan.
Probir monoklonskih antitijela zasnovan na ELISA testu za biotinilirane oligosaharide. Ovdje (A) je kombinovana biotinilacija oligosaharida i naknadni ELISA skrining sa mAb-ovima usmjerenim na glikan na pločama obloženim NeutrAvidinom, a (B) prikazuje jednostepeni postupak za biotinilaciju reakcijskih produkata.
Ploče obložene avidinom s antitijelima konjugiranim s oligosaharidom dodane su primarnim i sekundarnim antitijelima i isprane u mediju osjetljivom na svjetlost i vrijeme. Nakon što je vezivanje antitijela završeno, dodaje se TMB supstrat za inkubaciju ploče. Reakcija je konačno zaustavljena sumpornom kiselinom. Inkubirane ploče analizirane su pomoću ELISA čitača kako bi se odredila jačina vezivanja svakog antitijela i detektovalo unakrsno povezivanje specifično za antitijelo. Za detalje i parametre eksperimenta pogledajte odgovarajući odjeljak „Materijali i metode“.
Demonstriramo korisnost ove novo razvijene metode za specifične primjene karakterizacijom rastvorljivih oligosaharida prisutnih u ACSH, kao i u sirovim i pročišćenim frakcijama oligosaharida izolovanim iz lignoceluloznih hidrolizata. Kao što je prikazano na Slici 3, najčešći epitopom supstituisani ksilani identifikovani u ACSH korištenjem metoda ispitivanja bioaciliranog glikoma su obično uronski (U) ili metiluronski (MeU) i pektinski arabinogalaktani. Većina njih je također pronađena u našoj prethodnoj studiji o analizi glikana nehidrolizovanih čvrstih materija (UHS)43.
Detekcija rekalcitrantnih oligosaharidnih epitopa korištenjem monoklonskog antitijela usmjerenog na glikan ćelijskog zida. "Neutralna" frakcija je ACN frakcija, a "kisela" frakcija je FA frakcija. Svjetlije crvene boje na mapi temperature označavaju veći sadržaj epitopa, a svjetlije plave označavaju praznu pozadinu. Vrijednosti boja na skali zasnivaju se na sirovim OD vrijednostima za formulacije N=2. Glavni epitopi koje prepoznaju antitijela prikazani su s desne strane.
Ove necelulozne strukture nisu mogle biti cijepane najčešćim celulozama i hemicelulazama u testiranoj komercijalnoj smjesi enzima, koja uključuje najčešće korištene komercijalne enzime. Stoga su za njihovu hidrolizu potrebni novi pomoćni enzimi. Bez potrebnih neceluloznih pomoćnih enzima, ove necelulozne veze sprječavaju potpunu konverziju u monosaharide, čak i ako se njihovi matični šećerni polimeri ekstenzivno hidroliziraju u kraće fragmente i rastvaraju korištenjem komercijalnih smjesa enzima.
Dalja studija distribucije signala i njegove jačine vezivanja pokazala je da su epitopi za vezivanje bili niži u frakcijama šećera s visokim DP (A, B, C, DP do 20+) nego u frakcijama s niskim DP (D, E, F, DP) u dimerima) (Slika 1). Kiseli fragmenti su češći u neceluloznim epitopima nego u neutralnim fragmentima. Ovi fenomeni su u skladu s obrascem uočenim u našoj prethodnoj studiji, gdje su visoki DP i kiseli dijelovi bili otporniji na enzimsku hidrolizu. Stoga, prisustvo neceluloznih glikanskih epitopa i U i MeU supstitucija može uveliko doprinijeti stabilnosti oligosaharida. Treba napomenuti da efikasnost vezivanja i detekcije može biti problematična za oligosaharide s niskim DP, posebno ako je epitop dimerni ili trimerni oligosaharid. Ovo se može testirati korištenjem komercijalnih oligosaharida različitih dužina, od kojih svaki sadrži samo jedan epitop koji se veže za specifično mAb.
Dakle, upotreba strukturno specifičnih antitijela otkrila je određene tipove rekalcitrantnih veza. U zavisnosti od vrste korištenog antitijela, odgovarajućeg obrasca ligacije i jačine signala koji proizvodi (najviše i najmanje zastupljeno), novi enzimi se mogu identificirati i semikvantitativno dodati u smjesu enzima radi potpunije glikokonverzije. Uzimajući analizu ACSH oligosaharida kao primjer, možemo kreirati bazu podataka glikanskih veza za svaki biomasni materijal. Ovdje treba napomenuti da treba uzeti u obzir različit afinitet antitijela, a ako je njihov afinitet nepoznat, to će stvoriti određene poteškoće pri poređenju signala različitih antitijela. Osim toga, poređenje glikanskih veza može najbolje funkcionirati između uzoraka za isto antitijelo. Ove tvrdokorne veze se zatim mogu povezati s CAZyme bazom podataka, iz koje možemo identificirati enzime, odabrati kandidate za enzime i testirati enzime koji prekidaju veze ili razviti mikrobne sisteme za ekspresiju ovih enzima za upotrebu u biorafinerijama44.
Kako bismo procijenili kako imunološke metode dopunjuju alternativne metode za karakterizaciju oligosaharida niske molekularne težine prisutnih u lignoceluloznim hidrolizatima, izvršili smo MALDI (Sl. 4, S1-S8) i analizu saharida izvedenih iz TMS-a na osnovu GC-MS na istom panelu (Sl. 5) oligosaharidnog dijela. MALDI se koristi za poređenje da li se masena distribucija molekula oligosaharida podudara sa željenom strukturom. Na Sl. 4 prikazan je MS neutralnih komponenti ACN-A i ACN-B. ACN-A analiza potvrdila je niz pentoznih šećera u rasponu od DP 4-8 (Sl. 4) do DP 22 (Sl. S1), čije težine odgovaraju MeU-ksilanskim oligosaharidima. ACN-B analiza potvrdila je seriju pentoza i gluoksilana sa DP 8-15. U dodatnom materijalu kao što je Slika S3, mape distribucije mase kiselih dijelova FA-C pokazuju niz (Me)U supstituiranih pentoznih šećera sa DP od 8-15 koji su u skladu sa supstituiranim ksilanima pronađenim u ELISA-baziranom mAb skriningu. Epitopi su konzistentni.
MALDI-MS spektar rastvorljivih neusklađenih oligosaharida prisutnih u ACS-u. Ovdje su prikazane (A) ACN-A frakcije niskog masenog raspona koje sadrže metilovane uronske kiseline (DP 4-8) supstituisane glukuroksilanskim oligosaharidi i (B) ACN-B ksilan i metilovani uronski kiselinski oligosaharidi supstituisani glukuroksilanom (DP 8-15).
Analiza sastava glikanskog ostatka refraktornih oligosaharida. Ovdje (A) Sastav TMS saharida različitih frakcija oligosaharida dobijenih GC-MS analizom. (B) Strukture različitih šećera izvedenih iz TMS-a prisutnih u oligosaharidima. ACN – frakcija acetonitrila koja sadrži neutralne oligosaharide i FA – frakcija ferulinske kiseline koja sadrži kisele oligosaharide.
Još jedan zanimljiv zaključak je izveden iz LC-MS analize oligosaharidne frakcije, kao što je prikazano na slici S9 (metode se mogu vidjeti u dodatnom elektronskom materijalu). Fragmenti heksoznih i -OAc grupa su više puta uočeni tokom ligacije ACN-B frakcije. Ovo otkriće ne samo da potvrđuje fragmentaciju uočenu u glikomu i MALDI-TOF analizi, već i pruža nove informacije o potencijalnim derivatima ugljikohidrata u prethodno tretiranoj lignoceluloznoj biomasi.
Također smo izvršili analizu sastava glikana oligosaharidnih frakcija korištenjem TMS derivatizacije glikana. Korištenjem GC-MS-a odredili smo sastav neutralnih (nederiviranih) i kiselih šećera (GluA i GalA) u oligosaharidnoj frakciji (Sl. 5). Glukuronska kiselina se nalazi u kiselim komponentama C i D, dok se galakturonska kiselina nalazi u kiselim komponentama A i B, koje su obje komponente kiselih šećera s visokim DP-om. Ovi rezultati ne samo da potvrđuju naše ELISA i MALDI podatke, već su i u skladu s našim prethodnim studijama akumulacije oligosaharida. Stoga vjerujemo da su moderne imunološke metode koje koriste biotinilaciju oligosaharida i naknadno ELISA skrining dovoljne za detekciju rastvorljivih rekalcitantnih oligosaharida u različitim biološkim uzorcima.
Budući da su metode skrininga mAb-a zasnovane na ELISA testu validirane pomoću nekoliko različitih metoda, željeli smo dalje istražiti potencijal ove nove kvantitativne metode. Dva komercijalna oligosaharida, ksiloheksasaharid oligosaharid (XHE) i 23-α-L-arabinofuranozil-ksilotrioza (A2XX), kupljena su i testirana korištenjem novog mAb pristupa usmjerenog na glikan ćelijskog zida. Slika 6 prikazuje linearnu korelaciju između signala vezivanja biotinila i logaritamske koncentracije oligosaharida, što sugerira mogući Langmuirov model adsorpcije. Među mAb-ovima, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 i CCRC-M151 korelirali su sa XHE, a CCRC-M108, CCRC-M109 i LM11 korelirali su sa A2XX u rasponu od 1 nm do 100 nano. Zbog ograničene dostupnosti antitijela tokom eksperimenta, ograničeni eksperimenti su provedeni sa svakom koncentracijom oligosaharida. Ovdje treba napomenuti da neka antitijela reaguju vrlo različito na isti oligosaharid kao supstrat, vjerovatno zato što se vežu za neznatno različite epitope i mogu imati vrlo različite afinitete vezivanja. Mehanizmi i implikacije tačne identifikacije epitopa biće mnogo složeniji kada se novi pristup mAb primijeni na stvarne uzorke.
Dva komercijalna oligosaharida korištena su za određivanje raspona detekcije različitih monoklonskih protivtela (mAb) koji ciljaju glikane. Ovdje linearne korelacije s logaritamskom koncentracijom oligosaharida ukazuju na Langmuirove obrasce adsorpcije za (A) XHE s mAb i (B) A2XX s mAb. Odgovarajući epitopi ukazuju na strukture komercijalnih oligosaharida korištenih kao supstrati u testu.
Upotreba monoklonskih antitijela usmjerenih na glikane (glikomska analiza ili ELISA-bazirani mAb skrining) je moćan alat za dubinsku karakterizaciju većine glavnih glikana ćelijskog zida koji čine biljnu biomasu. Međutim, klasična analiza glikana karakterizira samo veće glikane ćelijskog zida, jer većina oligosaharida nije efikasno imobilizirana na ELISA pločama. U ovoj studiji, kukuruzna slamka prethodno tretirana AFEX-om enzimski je hidrolizirana pri visokom sadržaju čvrstih tvari. Analiza šećera korištena je za određivanje sastava rekalcitrantnih ugljikohidrata ćelijskog zida u hidrolizatu. Međutim, mAb analiza manjih oligosaharida u hidrolizatima je podcijenjena i potrebni su dodatni alati za efikasnu imobilizaciju oligosaharida na ELISA pločama.
Ovdje predstavljamo novu i efikasnu metodu imobilizacije oligosaharida za skrining monoklonskih antitijela kombinovanjem biotinilacije oligosaharida nakon čega slijedi ELISA skrining na pločama obloženim NeutrAvidin™. Imobilizirani biotinilirani oligosaharidi pokazali su dovoljan afinitet za antitijelo kako bi omogućili brzu i efikasnu detekciju rekalcitrantnih oligosaharida. Analiza sastava ovih tvrdoglavih oligosaharida zasnovana na masenoj spektrometriji potvrdila je rezultate ovog novog pristupa imunoskriningu. Dakle, ove studije pokazuju da se kombinacija biotinilacije oligosaharida i ELISA skrininga s monoklonskim antitijelima usmjerenim na glikan može koristiti za detekciju unakrsnih veza u oligosaharidima i može se široko primjenjivati ​​u drugim biohemijskim studijama koje karakteriziraju strukturu oligosaharida.
Ova metoda profiliranja glikana na bazi biotina je prvi izvještaj koji je sposoban istražiti rekalcitrantne ugljikohidratne veze topljivih oligosaharida u biljnoj biomasi. Ovo pomaže u razumijevanju zašto su neki dijelovi biomase toliko tvrdoglavi kada je u pitanju proizvodnja biogoriva. Ova metoda popunjava važnu prazninu u metodama analize glikoma i proširuje svoju primjenu na širi spektar supstrata izvan biljnih oligosaharida. U budućnosti bismo mogli koristiti robotiku za biotinilaciju i koristiti metodu koju smo razvili za visokopropusnu analizu uzoraka pomoću ELISA testa.
Kukuruzna slama (CS) uzgojena iz hibridnog sjemena Pioneer 33A14 ubrana je 2010. godine na farmi Kramer u Rayu, Colorado. Uz dozvolu vlasnika zemljišta, ova biomasa se može koristiti za istraživanje. Uzorci su čuvani suhi, s < 6% vlage, u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi. Uzorci su čuvani suhi, s < 6% vlage, u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi. Obrazcy hranilisʹsâ suhim pri vlažnosti < 6% u paketima sa zastežkoj-molniej pri sobnoj temperaturi. Uzorci su čuvani suhi pri vlažnosti <6% u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Obrazcy hranât v paketah s zastežkoj-molniej pri sobnoj temperaturi s vlažnostom < 6%. Uzorci se čuvaju u vrećicama sa zatvaračem na sobnoj temperaturi sa vlažnošću < 6%.Studija je provedena u skladu s lokalnim i nacionalnim smjernicama. Analiza sastava provedena je korištenjem NREL protokola. Utvrđeno je da sastav sadrži 31,4% glukana, 18,7% ksilana, 3,3% arabinana, 1,2% galaktana, 2,2% acetila, 14,3% lignina, 1,7% proteina i 13,4% pepela.
Cellic® CTec2 (138 mg proteina/ml, lot VCNI 0001) je kompleksna mješavina celulaze, β-glukozidaze i Cellic® HTec2 (157 mg proteina/ml, lot VHN00001) od Novozymesa (Franklinton, NC, SAD). Multifect Pectinase® (72 mg proteina/mL), kompleksna mješavina enzima za razgradnju pektina, donirala je kompanija DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, SAD). Koncentracije proteina enzima određene su procjenom sadržaja proteina (i oduzimanjem doprinosa neproteinskog dušika) korištenjem Kjeldahl analize dušika (AOAC metoda 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, SAD). Dijatomejska zemlja 545 kupljena je od EMD Millipore (Billerica, MA). Aktivni ugalj (DARCO, granule veličine 100 mesh), Avicel (PH-101), bukov ksilan i sve ostale hemikalije kupljene su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
AFEX predtretman je proveden u GLBRC-u (Laboratorij za istraživanje konverzije biomase, MSU, Lansing, MI, SAD). Prethodni tretman je proveden na 140°C tokom 15 minuta. Vrijeme zadržavanja je bilo 46 minuta pri omjeru 1:1 bezvodnog amonijaka i biomase uz 60% (w/w) punjenja u stolnom reaktoru od nehrđajućeg čelika (Parr Instruments Company). Trajalo je 30 minuta. Reaktor je zagrijan na 140°C i amonijak je brzo oslobođen, omogućavajući biomasi da se brzo vrati na sobnu temperaturu. Sastav AFEX-om prethodno tretirane kukuruzne slame (ACS) bio je sličan sastavu netretirane kukuruzne slame (UT-CS).
ACSH s visokim udjelom čvrstih tvari 25% (w/w) (približno 8% dekstrana) pripremljen je kao početni materijal za proizvodnju oligosaharida u velikim razmjerima. Enzimska hidroliza ACS-a provedena je korištenjem komercijalne mješavine enzima, uključujući Cellic® Ctec2 10 mg proteina/g glukana (u prethodno tretiranoj biomasi), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg proteina/g glukana i Multifect Pectinase (Genencor Inc, SAD). ). ), 5 mg proteina/g dekstrana. Enzimska hidroliza provedena je u bioreaktoru od 5 litara s radnom zapreminom od 3 litre, pH 4,8, 50°C i 250 rpm. Nakon hidrolize tokom 96 sati, hidrolizat je sakupljen centrifugiranjem na 6000 rpm tokom 30 minuta, a zatim na 14000 rpm tokom 30 minuta kako bi se uklonile nehidrolizirane čvrste tvari. Hidrolizat je zatim podvrgnut sterilnoj filtraciji kroz filter čašu od 0,22 mm. Filtrirani hidrolizat je čuvan u sterilnim bocama na 4°C, a zatim frakcionisan na aktivnom uglju.
Analiza sastava uzoraka biomase na bazi ekstrakta prema NREL laboratorijskim analitičkim procedurama: priprema uzoraka za analizu sastava (NREL/TP-510-42620) i određivanje strukturnih ugljikohidrata i lignina u biomasi (NREL/TP-510 – 42618)47.
Analiza oligosaharida u hidrolizatnom toku provedena je na skali od 2 ml korištenjem metode kisele hidrolize zasnovane na autoklavu. Uzorak hidrolizata pomiješati sa 69,7 µl 72% sumporne kiseline u epruveti za kulturu od 10 ml sa navojnim čepom i inkubirati 1 sat na radnom stolu na 121 °C, ohladiti na ledu i filtrirati u bočicu za visokoefikasnu tečnu hromatografiju (HPLC). Koncentracija oligosaharida određena je oduzimanjem koncentracije monosaharida u nehidroliziranom uzorku od ukupne koncentracije šećera u kiselinom hidroliziranom uzorku.
Koncentracije glukoze, ksiloze i arabinoze u kiselo hidroliziranoj biomasi analizirane su korištenjem Shimadzu HPLC sistema opremljenog automatskim uzorkivačem, grijačem kolone, izokratskom pumpom i detektorom indeksa prelamanja na Bio-Rad Aminex HPX-87H koloni. Kolona je održavana na 50°C i eluirana protokom 5 mM H2SO4 u vodi od 0,6 ml/min.
Supernatant hidrolizata je razrijeđen i analiziran na sadržaj monomera i oligosaharida. Monomerni šećeri dobijeni nakon enzimske hidrolize analizirani su HPLC-om opremljenim Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P kolonom i kolonom za zaštitu od pepela. Temperatura kolone održavana je na 80°C, a voda je korištena kao mobilna faza sa brzinom protoka od 0,6 ml/min. Oligosaharidi su određeni hidrolizom u razrijeđenoj kiselini na 121°C prema metodama opisanim u referencama 41, 48, 49.
Analiza saharida provedena je na sirovim, AFEX-om prethodno tretiranim i svim nehidroliziranim ostacima biomase (uključujući proizvodnju serijskih ekstrakata ćelijskog zida i njihov skrining na mAb) korištenjem prethodno opisanih postupaka 27, 43, 50, 51. Za analizu glikoma, ostaci materijala biljnog ćelijskog zida nerastvorljivi u alkoholu pripremaju se iz ostataka biomase i podvrgavaju serijskoj ekstrakciji sa sve agresivnijim reagensima kao što su amonijum oksalat (50 mM), natrijum karbonat (50 mM i 0,5% w/v), CON. (1M i 4M, oba sa 1% w/v natrijum borohidrida) i kiseli hlorit kao što je prethodno opisano 52,53. Ekstrakti su zatim podvrgnuti ELISA testu na kompleksnom panelu mAb50 usmjerenih na glikan ćelijskog zida, a reakcije vezivanja mAb predstavljene su kao toplotna mapa. mAb koji ciljaju glikan biljnog ćelijskog zida kupljeni su iz laboratorijskih zaliha (CCRC, JIM i MAC serije).
Jednostepena biotinilacija oligosaharida. Konjugacija ugljikohidrata s biotin-LC-hidrazidom provedena je sljedećim postupkom. Biotin-LC-hidrazid (4,6 mg/12 μmol) je rastvoren u dimetil sulfoksidu (DMSO, 70 μl) snažnim miješanjem i zagrijavanjem na 65°C tokom 1 minute. Dodana je ledena octena kiselina (30 µl) i smjesa je izlivena na natrijum cijanoborohidrid (6,4 mg/100 µmol) i potpuno rastvorena nakon zagrijavanja na 65°C tokom oko 1 minute. Zatim je od 5 do 8 μl reakcijske smjese dodano u osušeni oligosaharid (1-100 nmol) da bi se dobio 10-struki ili veći molarni višak oznake u odnosu na reducirajući kraj. Reakcija je provedena na 65°C tokom 2 sata, nakon čega su uzorci odmah pročišćeni. U eksperimentima označavanja bez redukcije nije korišten natrijum cijanoborohidrid, a uzorci su reagirali na 65°C tokom 2,5 sata.
ELISA premazivanje i pranje uzoraka biotiniliranih oligosaharida. U svaku jažicu ploče obložene avidinom dodano je 25 μl biotiniliranih uzoraka (100 μl svakog koncentriranog uzorka razrijeđenog u 5 ml 0,1 M Tris puferskog rastvora (TBS)). Kontrolni jažice su obložene sa 50 μl biotina u koncentraciji od 10 μg/ml u 0,1 M TBS. Deionizirana voda je korištena kao premaz za slijepa mjerenja. Tableta je inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi u mraku. Ploču isprati 3 puta sa 0,1% obranog mlijeka u 0,1 M TBS koristeći program br. 11 za Grenier flat 3A.
Dodavanje i ispiranje primarnih antitijela. U svaku jažicu dodati 40 µl primarnog antitijela. Inkubirati mikroploču 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku. Ploče su zatim isprane 3 puta sa 0,1% mlijeka u 0,1M TBS koristeći program pranja #11 za Grenier Flat 3A.
Dodajte sekundarno antitijelo i isperite. U svaku jažicu dodajte 50 µl sekundarnog mišjeg/pacovskog antitijela (razrijeđenog 1:5000 u 0,1% mlijeku u 0,1 M TBS). Inkubirajte mikroploču 1 sat na sobnoj temperaturi u mraku. Mikroploče su zatim isprane 5 puta sa 0,1% mlijeka u 0,1 M TBS koristeći Grenier Flat 5A program pranja ploča #12.
Dodavanje supstrata. Dodajte 50 µl 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) osnovnom supstratu (dodavanjem 2 kapi pufera, 3 kapi TMB-a, 2 kapi vodikovog peroksida u 15 ml deionizirane vode). Pripremite TMB supstrat i promiješajte na vrtlogu prije upotrebe. Inkubirajte mikroploču na sobnoj temperaturi 30 minuta. U mraku.
Završite korak i očitajte tabletu. Dodajte 50 µl 1 N sumporne kiseline u svaku jažicu i zabilježite apsorbanciju od 450 do 655 nm pomoću ELISA čitača.
Pripremite rastvore od 1 mg/ml ovih analita u deioniziranoj vodi: arabinoza, ramnoza, fukoza, ksiloza, galakturonska kiselina (GalA), glukuronska kiselina (GlcA), manoza, glukoza, galaktoza, laktoza, N-acetilmanozamin (manNAc), N-acetilglukozamin (glcNAc), N-acetilgalaktozamin (galNAc), inozitol (interni standard). Dva standarda su pripremljena dodavanjem rastvora šećera od 1 mg/mL prikazanih u Tabeli 1. Uzorci se zamrzavaju i liofiliziraju na -80°C dok se ne ukloni sva voda (obično oko 12-18 sati).
U epruvete sa navojnim čepom na analitičkoj vagi dodajte 100–500 µg uzorka. Zabilježite dodanu količinu. Najbolje je rastvoriti uzorak u određenoj koncentraciji rastvarača i dodati ga u epruvetu kao tečni alikvot. Koristite 20 µl inozitola koncentracije 1 mg/ml kao interni standard za svaku epruvetu s uzorkom. Količina internog standarda dodanog uzorku mora biti ista kao i količina internog standarda dodanog u standardnu ​​epruvetu.
U bočicu sa navojnim čepom dodajte 8 ml bezvodnog metanola. Zatim dodajte 4 ml 3 N metanolnog rastvora HCl, zatvorite i protresite. Ovaj postupak ne koristi vodu.
Dodajte 500 µl 1 M rastvora HCl u metanolu u uzorke oligosaharida i standardne TMS epruvete. Uzorci su inkubirani preko noći (168 sati) na 80°C u termalnom bloku. Osušite produkt metanolize na sobnoj temperaturi pomoću razvodnika za sušenje. Dodajte 200 µl MeOH i ponovo osušite. Ovaj postupak se ponavlja dva puta. Dodajte 200 µl metanola, 100 µl piridina i 100 µl anhidrida octene kiseline u uzorak i dobro promiješajte. Inkubirajte uzorke na sobnoj temperaturi 30 minuta. Dodajte 200 µl metanola i ponovo osušite.
Dodajte 200 µl Tri-Sila i zagrijavajte zatvorenu epruvetu 20 minuta. 80°C, zatim ohladite na sobnu temperaturu. Koristite razvodnik za sušenje da biste dodatno osušili uzorak do volumena od približno 50 µl. Važno je napomenuti da nismo dozvolili da se uzorci potpuno osuše.
Dodajte 2 ml heksana i dobro promiješajte vrtloženjem. Napunite vrhove Pasteurovih pipeta (5-8 mm) komadom staklene vune umetanjem staklene vune na vrh pipete promjera 5-3/4 inča. Uzorci su centrifugirani na 3000 g tokom 2 minute. Svi nerastvorljivi ostaci su istaloženi. Osušite uzorak na 100-150 µl. Volumen od približno 1 μl je ubrizgan u GC-MS na početnoj temperaturi od 80 °C i početnom vremenu od 2,0 minute (Tabela 2).