Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que utilitzeu té un suport limitat per a CSS. Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer). Mentrestant, per garantir un suport continuat, mostrarem el lloc sense estils ni JavaScript.
La morfogènesi de l'intestí humà estableix les característiques de la cripta-vellositat de la microarquitectura epitelial 3D i l'organització espacial. Aquesta estructura única és necessària per mantenir l'homeòstasi intestinal protegint el nínxol de cèl·lules mare a la cripta basal dels antígens microbians exògens i els seus metabòlits. Les estructures epitelials D són crucials per a la construcció de models intestinals in vitro. En particular, l'intestí mimètic orgànic en un xip pot induir una morfogènesi 3D espontània de l'epiteli intestinal amb funcions fisiològiques i biomecànica millorades. , cultiu de Caco-2 o cèl·lules epitelials organoides intestinals en entorns convencionals, així com en una plataforma microfluídica, inducció de morfogènesi 3D i caracterització d'epitelis 3D establerts mitjançant múltiples modalitats d'imatge. Aquest protocol aconsegueix la regeneració de la microarquitectura intestinal funcional mitjançant el control del flux de fluids basolaterals per a 5 d. requereixen enginyeria o manipulació cel·lular complexa, que pot superar altres tècniques existents. Preveiem que el nostre protocol proposat podria tenir àmplies implicacions per a la comunitat de recerca biomèdica, proporcionant un mètode per regenerar capes epitelials intestinals en 3D in vitro per a aplicacions biomèdiques, clíniques i farmacèutiques.
Els experiments demostren que les cèl·lules epitelials intestinals Caco-2 cultivades en gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o dispositius microfluídics de bicapa6,7 poden patir una morfogènesi 3D espontània in vitro sense una comprensió clara del mecanisme subjacent. morfogènesi in vitro, que ha estat demostrada per Caco-2 i organoides intestinals derivats del pacient.Les cèl·lules epitelials es van validar. En aquest estudi, ens vam centrar específicament en la producció cel·lular i la distribució de la concentració d'un potent antagonista de Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), en dispositius microfluídics modificats i gut-on-a-xip que contenen insercions Transwell, anomenats "Hybrid Chip". -proteïna relacionada 1, o Soggy-1) a l'intestí del xip inhibeix la morfogènesi o altera la capa epitelial 3D preestructurada, cosa que suggereix que l'estrès antagònic durant el cultiu és responsable de la morfogènesi intestinal in vitro. (p. ex., en plataformes gut-on-a-xip o híbrid-on-a-xip) o difusió. Mitjans basolaterals (p. ex., des d'insercions de Transwell a grans dipòsits basolaterals en pous).
En aquest protocol, proporcionem un mètode detallat per fabricar microdispositius gut-on-a-chip i xips híbrids inseribles de Transwell (passos 1-5) per cultivar cèl·lules epitelials intestinals en membranes poroses basades en polidimetilsiloxà (PDMS) (passos 6A, 7A, 8, 9) o membranes de polièster d'inserció induïda de Transwell , 6B i 7B (steps 3 8B) morfogènesi in vitro (pas 10). També hem identificat característiques cel·lulars i moleculars indicatives de la histogènesi específica del teixit i la diferenciació cel·lular depenent del llinatge mitjançant l'aplicació de múltiples modalitats d'imatge (passos 11-24). del microambient biomecànic.in vitro. Per induir la morfogènesi 3D a partir de monocapes epitelials 2D, vam eliminar els antagonistes del morfogen en ambdues formes cultivades fent fluir el medi cap al compartiment basolateral del cultiu. -cultius, infecció per patògens, lesions inflamatòries, disfunció de la barrera epitelial i teràpies basades en probiòtics Exemple.influències.
El nostre protocol pot ser útil per a una àmplia gamma de científics en recerca bàsica (per exemple, biologia de la mucosa intestinal, biologia de cèl·lules mare i biologia del desenvolupament) i aplicada (per exemple, proves preclíniques de fàrmacs, modelització de malalties, enginyeria de teixits i gastroenterologia) ampli impacte. s estudien la dinàmica de la senyalització cel·lular durant el desenvolupament intestinal, la regeneració o l'homeòstasi. A més, el nostre protocol és útil per interrogar la infecció sota diversos agents infecciosos com Norovirus 8, Síndrome Respiratòria Aguda Sever Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae.Els públics de patologia i patogènesi també són útils. L'ús d'un sistema de microfisiologia intestinal al xip pot permetre el co-cultiu longitudinal 10 i l'avaluació posterior de la defensa de l'hoste, les respostes immunitàries i la reparació de lesions relacionades amb patògens al tracte gastrointestinal (GI) 11 . o la síndrome de l'intestí irritable es pot simular quan es preparen capes epitelials intestinals en 3D utilitzant les capes epitelials intestinals 3D del pacient, aquestes malalties inclouen l'atròfia de les vellositats, l'escurçament de la cripta, el dany a la mucosa o la barrera epitelial deteriorada. tipus, com les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica del pacient (PBMC), fins a models que contenen microarquitectures de vil·lositats intestinals-cripta en 3D.cèl·lules immunitàries específiques del teixit, 5.
Com que la microestructura epitelial en 3D es pot fixar i visualitzar sense el procés de secció, els espectadors que treballen en transcriptòmica espacial i imatges d'alta resolució o superresolució poden estar interessats en el nostre mapeig de la dinàmica espaciotemporal de gens i proteïnes en nínxols epitelials.Interessat en la tecnologia. Resposta a estímuls microbians o immunitaris. A més, la diafonia longitudinal hoste-microbioma 10, 14 que coordinen l'homeòstasi intestinal es pot establir a la capa mucosa intestinal 3D mitjançant el cocultiu de diverses espècies microbianes, comunitats microbianes o microbiota fecal, especialment a l'intestí sobre un xip.Aquest enfocament és especialment atractiu per a públics que estudien la immunologia de la mucosa, la gastroenterologia, el microbioma humà, la culturòmica i la microbiologia clínica que busquen conrear microbiota intestinal prèviament no cultivada al laboratori. el protocol també es pot difondre a aquells que desenvolupen plataformes de cribratge o validació farmacèutiques, biomèdiques o d'alt rendiment per a la indústria alimentària. Com a prova de principi, recentment hem demostrat la viabilitat d'un sistema de morfogènesi múltiple d'alt rendiment escalable a un format de placa de 24 pous. El mètode de morfogènesi pot ser accelerat i potencialment adoptat per molts laboratoris de recerca, indústria o govern i agències reguladores per entendre la reprogramació cel·lular de la morfogènesi intestinal in vitro a nivell transcriptòmic per provar fàrmacs o bioterapèutics.
S'han utilitzat un nombre limitat de models experimentals rellevants per a humans per estudiar la morfogènesi epitelial intestinal, principalment a causa de la manca de protocols implementables per induir la morfogènesi 3D in vitro. De fet, gran part del coneixement actual sobre la morfogènesi intestinal es basa en estudis amb animals (p. Per tant, el nostre protocol per regenerar estructures de teixit 3D in vitro supera els models animals in vivo, així com altres models de cultiu cel·lular 2D estàtics tradicionals. Com es va descriure anteriorment, la utilització d'estructures epitelials 3D ens va permetre examinar la resposta diferenciada de les cèl·lules espacials en diverses criptes localitzades. estímuls mucosos o immunitaris. Les capes epitelials 3D poden proporcionar un espai per estudiar com les cèl·lules microbianes competeixen per formar nínxols espacials i l'evolució ecològica en resposta als factors hoste (per exemple, capes de moc internes versus exteriors, secreció d'IgA i pèptids antimicrobians). p. ex., àcids grassos de cadena curta) que configuren l'organització cel·lular i nínxols de cèl·lules mare a les criptes basals. Aquestes característiques només es poden demostrar quan s'estableixen capes epitelials 3D in vitro.
A més del nostre mètode de creació d'estructures epitelials intestinals en 3D, hi ha diversos mètodes in vitro. El cultiu d'organoides intestinals és una tècnica d'enginyeria de teixits d'última generació basada en el cultiu de cèl·lules mare intestinals en condicions de morfogen específiques23,24,25. per tant, la introducció de components luminals com ara cèl·lules microbianes o antígens exògens és limitada.L'accés als lúmenes organoides es pot millorar mitjançant un microinjector,26,27, però aquest mètode és invasiu i de mà d'obra i requereix coneixements especialitzats per dur-lo a terme. A més, els cultius organoides tradicionals mantinguts en bastides d'hidrogel en condicions estàtiques no reflecteixen amb precisió la biomecànica activa in vivo.
Altres enfocaments emprats per diversos grups d'investigació utilitzen bastides d'hidrogel 3D preestructurades per imitar l'estructura epitelial intestinal cultivant cèl·lules intestinals humanes aïllades a la superfície del gel. Fabriqueu bastides d'hidrogel amb motlles impresos en 3D, microfresats o fabricats litogràficament. Aquest mètode mostra la disposició de cèl·lules aïllades en gradients epiliològics rellevants i aïllats en vitro. No obstant això, la naturalesa de les bastides preestructurades pot impedir la visualització del procés morfogenètic espontani en si. Aquests models tampoc proporcionen un flux luminal o intersticial dinàmic, mancant de l'estrès de cisalla del fluid que necessiten per a l'estudi de la morfogènesi de les cèl·lules intestinals recents i per obtenir una funció hidromorfogenètica utilitzada recentment en l'estudi de les cèl·lules intestinals. una plataforma microfluídica i estructures epitelials intestinals modelades mitjançant tècniques de gravat làser. Els organoides intestinals del ratolí segueixen patrons gravats per formar estructures tubulars intestinals, i el flux de fluid intraluminal es pot recapitular mitjançant un mòdul de microfluídica. No obstant això, aquest model no presenta processos morfogenètics espontanis ni inclou moviments mecanobiològics intestinals que creen moviments mecanobiològics espontanis del mateix grup de tubs a miniintestí. Malgrat la complexa fabricació de diferents segments intestinals dins del tub, aquest model també no té flux de fluid luminal i deformació mecànica. A més, l'operabilitat del model pot estar limitada, especialment després que el procés de bioimpressió s'hagi completat, pertorbant les condicions experimentals o les interaccions cèl·lula a cèl·lula. per tant, el nostre protocol de morfogènesi 3D in vitro pot proporcionar un enfocament complementari per superar els reptes dels mètodes existents.
El nostre protocol està totalment centrat en la morfogènesi epitelial 3D, amb només cèl·lules epitelials en cultiu i cap altre tipus de cèl·lules circumdants, com ara cèl·lules mesenquimals, cèl·lules endotelials i cèl·lules immunitàries. Com s'ha descrit anteriorment, el nucli del nostre protocol és la inducció de la morfogènesi epitelial eliminant els inhibidors morfolaterals del nostre medi lateral basolateral. on-a-chip i hybrid-on-a-xip ens permet recrear la capa epitelial 3D ondulant, complexitats biològiques addicionals com les interaccions epitelial-mesenquimals33,34, la deposició de matriu extracel·lular (ECM) 35 i, en el nostre model, les característiques de cripta-vellositat que transmeten les cèl·lules mare considerades més nínxols de cèl·lules mare (per exemple, els nínxols de cèl·lules mare basals). el quim té un paper clau en la producció de proteïnes ECM i en la regulació de la morfogènesi intestinal in vivo35,37,38. L'addició de cèl·lules mesenquimals al nostre model va millorar el procés morfogenètic i l'eficiència d'adhesió cel·lular. es poden connectar entre models de teixits són un requisit previ quan els models de teixits estan dissenyats per demostrar interaccions multi-òrgans. Per tant, és possible que s'hagin d'incloure cèl·lules endotelials per modelar característiques fisiològiques més precises amb resolució a nivell d'òrgans. Les cèl·lules immunitàries derivades del pacient també són essencials per mostrar respostes immunitàries innates, presentació d'antigens, adaptació de l'antigen i context immunològic creuat en el teixit intestinal. malaltia.
L'ús de xips híbrids és més senzill que gut-on-a-xip perquè la configuració del dispositiu és més senzilla i l'ús d'insercions Transwell permet un cultiu escalable de l'epiteli intestinal. No obstant això, els inserts Transwell comercialment disponibles amb membranes de polièster no són elàstics i no poden simular moviments peristàltics. De fet, les propietats estàtiques del compartiment apical rarament permeten el co-cultiu de bacteris a llarg termini en xips híbrids. Tot i que podem induir de manera robusta la morfogènesi 3D a les insercions Transwell quan utilitzem xips híbrids, l'escassetat de biomecànica fisiològicament rellevant i el flux de fluids apicals poden limitar la viabilitat de plataformes de xips híbrids per a aplicacions potencials.
Les reconstruccions a gran escala de l'eix cripta-vellositat humana en cultius d'intestí en xip i híbrids en xip no s'han establert completament. Atès que la morfogènesi comença a partir d'una monocapa epitelial, les microarquitectures 3D no proporcionen necessàriament una similitud morfològica amb les criptes in vivo. la cripta i les regions velloses no estaven clarament delimitades. Tot i que els canals superiors més alts del xip condueixen a una alçada més gran de l'epiteli de microenginyeria, l'alçada màxima encara es limita a ~ 300-400 µm. La profunditat real de les criptes intestinals humanes a l'intestí prim i gros és de ~ 135 µm i ~ 400 µm i l'alçada intestinal, respectivament, ~ 400 µm i ~ 400 µm.
Des del punt de vista de la imatge, la imatge de super-resolució in situ de microarquitectures 3D es pot limitar a l'intestí en un xip, ja que la distància de treball necessària des de la lent objectiu fins a la capa epitelial és de l'ordre d'uns pocs mil·límetres. Per superar aquest problema, pot ser necessari un objectiu llunyà. La microfabricació de l'intestí en un xip implica una adhesió permanent entre cada capa, és molt difícil obrir o treure la capa superior per examinar l'estructura superficial de la capa epitelial. Per exemple, utilitzant un microscopi electrònic d'escaneig (SEM).
La hidrofobicitat del PDMS ha estat un factor limitant en els estudis basats en microfluídics que tracten amb molècules petites hidrofòbiques, ja que el PDMS pot adsorbir aquestes molècules hidròfobes de manera inespecífica. Es poden considerar alternatives al PDMS amb altres materials polimèrics. Alternativament, la modificació de la superfície del PDMS (per exemple, el recobriment amb materials lipòfils) per minimitzar el glicol d'etil 43 o es pot minimitzar el polietilglicol 43 molècules fòbiques.
Finalment, el nostre mètode no s'ha caracteritzat bé pel que fa a proporcionar un cribratge d'alt rendiment o una plataforma experimental fàcil d'utilitzar "única". El protocol actual requereix una bomba de xeringa per microdispositiu, que ocupa espai en una incubadora de CO2 i evita experiments a gran escala. que permeten la reposició i eliminació contínua de medis basolaterals).
Per induir la morfogènesi 3D de l'epiteli intestinal humà in vitro, hem utilitzat un dispositiu intestinal de xip microfluídic que conté dos microcanals paral·lels i una membrana porosa elàstica entremig per crear una interfície lumen-capil·lar. Les cèl·lules epitelials es poden demostrar aplicant la manipulació direccional del flux per eliminar els antagonistes del morfogen del compartiment basolateral. Tot el procediment experimental (figura 1) consta de cinc parts: (i) microfabricació del xip intestinal o xip híbrid insertable Transwell (passos 1-5; quadre 1), (ii) preparació de cèl·lules organoides intestinals epitelials humanes o intestinals;quadres 2-5), (iii) cultiu de cèl·lules epitelials intestinals en xips intestinals o xips híbrids (passos 6-9), (iv) inducció de la morfogènesi 3D in vitro (pas 10) i (v)) per caracteritzar la microestructura epitelial 3D (passos 11-24). morfogènesi telial a controls espacials, temporals, condicionals o procedimentals.
Hem utilitzat dues plataformes de cultiu diferents: gut-on-a-xip amb canals rectes o canals no lineals envoltats, o xips híbrids que contenen insercions Transwell (TW) en un dispositiu microfluídic, fabricat tal com es descriu al quadre 1, i el pas 1-5 "Device Fabrication" mostra els passos principals per fer un únic xip o un xip híbrid. ) i el procediment de cultiu utilitzat en aquest protocol "Morfogènesi in vitro" mostra els passos generals en què es cultiven cèl·lules epitelials derivades d'organoides o Caco-2 en un xip intestinal o en insercions Transwell d'un xip híbrid, seguida de la inducció de la morfogènesi 3D i la formació d'una estructura epitelial caracteritzada. en la caracterització de la diferenciació cel·lular, estudis de fisiologia intestinal, establiment d'ecosistemes de microbioma hoste i modelatge de malalties. Imatges d'immunofluorescència a "Diferenciació cel·lular" que mostren nuclis, actina F i MUC2 expressats a la capa epitelial 3D Caco-2 generada al xip intestinal. La fisiologia mostra la mucositat produïda per la tinció d'àcid siàlic i residus de N-acetilglucosamina mitjançant aglutinina fluorescent de germen de blat. Les dues imatges superposades a "Host-Microbe Co-Cultures" mostren co-cultius representatius del microbioma hoste a l'intestí en un xip. El panell esquerre mostra el co-cultiu de la proteïna E. cèl·lules lials. El panell dret mostra la localització de GFP E. coli co-cultivades amb cèl·lules epitelials 3D Caco-2, seguida d'una tinció d'immunofluorescència amb actina F (vermell) i nuclis (blau). El modelatge de malalties il·lustra un intestí sa versus un intestí permeable en xips d'inflamació intestinal amb xips d'inflamació intestinal (p. cèl·lules (per exemple, PBMC;verd). Es van cultivar cèl·lules Caco-2 per establir una capa epitelial 3D. Barra d'escala, 50 µm. Imatges a la fila inferior: "Diferenciació de cèl·lules" adaptada amb permís de referència.2.Oxford University Press;Reproduït amb permís de la Ref.5.NAS;Adaptació “Host-Microbe Co-Culture” amb permís de la ref.3.NAS;Adaptació de “Disease Modeling” amb permís de referència.5.NAS.
Tant xips gut-on-xip com híbrids es van fabricar utilitzant rèpliques de PDMS que es van desmoldar a partir de motlles de silici mitjançant litografia suau1,44 i modelades amb SU-8. , ha evolucionat cap a un complex gut-on-a-chip (dades esteses Fig. 1b) que inclou un parell de microcanals corbats per induir un augment del temps de residència del fluid, patrons de flux no lineals i deformació multiaxial de les cèl·lules cultivades (Fig. 2a-f) voluted Gut-Chip també indueix fortament la morfogènesi 3D en un període de temps similar amb un grau similar de creixement epitelial en comparació amb el Gut-Chip original, independentment del tipus de cèl·lula cultivada. Per tant, per induir la morfogènesi 3D, els dissenys lineals i complexos d'intestí en xip són intercanviables.2a). Per fabricar l'intestí en un xip, la capa superior preparada de PDMS es va unir seqüencialment a una pel·lícula PDMS porosa i després es va alinear amb la capa inferior de PDMS mitjançant unió irreversible mitjançant un tractament de corona (Fig. 2b-f). Dades esteses Fig. 2). El procés d'enllaç es realitza tractant les superfícies de la rèplica PDMS i el vidre amb plasma d'oxigen o tractament corona. Després de l'esterilització del dispositiu microfabricat connectat al tub de silicona, la configuració del dispositiu estava preparada per realitzar la morfogènesi 3D de l'epiteli intestinal (figura 2g).
a, Il·lustració esquemàtica de la preparació de peces de PDMS a partir de motlles de silici estampats SU-8. La solució de PDMS no curada es va abocar en un motlle de silici (esquerra), es va curar a 60 °C (mig) i es va desemmotllar (dreta). d, Una sèrie de fotografies dels components PDMS superiors i inferiors i del dispositiu intestinal muntat en xip. e, Esquema de l'alineació dels components PDMS superior, de membrana i inferior. Cada capa està unida de manera irreversible mitjançant tractament amb plasma o corona. Cultiu de cèl·lules idiques. L'intestí fabricat en un xip muntat amb un tub de silicona i una xeringa es va col·locar en un cobreobjectes. El dispositiu de xip es va col·locar a la tapa d'una placa de Petri de 150 mm per al seu processament. L'aglutinant s'utilitza per tancar el tub de silicona. incorporat al xip híbrid per induir la morfogènesi 3D intestinal. El medi es perfon a través de microcanals sota la capa cel·lular establerta a la inserció de Transwell. Barra d'escala, 1 cm.h Reimpressió amb permís de referència.4.Elsevier.
En aquest protocol, la línia cel·lular Caco-2 i els organoides intestinals es van utilitzar com a fonts epitelials (Fig. 3a). Ambdós tipus de cèl·lules es van cultivar de manera independent (quadre 2 i quadre 5) i es van utilitzar per sembrar els microcanals recoberts d'ECM d'intestí en xip o insercions Transwell. 50) en matràs en T es recullen per preparar suspensions cel·lulars dissociades mitjançant líquid de tripsinització (quadre 2). Els organoides intestinals humans de biòpsies intestinals o reseccions quirúrgiques es van cultivar en cúpules de bastida Matrigel en plaques de 24 pous per donar suport al microambient estructural. es va suplementar cada dos dies fins que els organoides van créixer a ~ 500 µm de diàmetre. Els organoides completament crescuts es recullen i es dissocien en cèl·lules individuals per sembrar-los a l'intestí o a les insercions de Transwell en un xip (Requadre 5). Com hem informat anteriorment, es pot diferenciar segons el tipus de malaltia12,13 (p. lesió versus àrea no lesionada) i localització gastrointestinal al tracte (per exemple, duodè, jejú, ile, cec, còlon o recte). Proporcionem un protocol optimitzat al quadre 5 per al cultiu d'organoides colònics (coloides) que normalment requereixen concentracions més altes de morfogens que els organoides intestinals prims.
a, Flux de treball per a la inducció de la morfogènesi intestinal al xip intestinal. L'epiteli intestinal humà i els organoides intestinals Caco-2 s'utilitzen en aquest protocol per demostrar la morfogènesi en 3D. Les cèl·lules epitelials aïllades es van sembrar en el dispositiu preparat d'intestí en xip (preparació de xip). El flux ical (AP) s'inicia i es manté durant els 2 primers dies (flux, AP, D0-D2). El flux basolateral (BL) també s'inicia juntament amb moviments d'estirament cíclic (estirament, flux, AP i BL) quan es forma una monocapa completa 2D. cada pas experimental o punt temporal (gràfic de barres, 100 µm). Quatre diagrames esquemàtics que il·lustren les cascades corresponents de la morfogènesi intestinal (a dalt a la dreta). Les fletxes discontínues de l'esquema representen la direcció del flux del fluid. b, imatge SEM que mostra la topologia superficial de l'epiteli 3D Caco-2 establert (esquerra). Capa (dreta).c, Vista frontal horitzontal de Caco-2 3D establert, claudina (ZO-1, vermell) i membranes de vora de pinzell contínues etiquetades amb actina F (verd) i nuclis (blau) Visualització confocal d'immunofluorescència de cèl·lules epitelials en fitxes intestinals. d en un xip obtingut per microscòpia de contrast de fase els dies 3, 7, 9, 11 i 13. L'inserció (a dalt a la dreta) mostra l'alt augment de la imatge proporcionada. e, microfotografia DIC de l'epiteli 3D organoide establert a l'intestí a la rodanxa presa el dia 7.f, marcadors d'immunofluorescència superposats per a imatges esteGR5;magenta), cèl·lules caliciformes (MUC2; verd), actina F (gris) i nuclis (cian) cultivats en encenalls intestinals durant 3 dies, respectivament (esquerra) i organoides de 13 dies (mitjana) a la capa epitelial. id epiteli establert a l'intestí en un xip tenyint la membrana plasmàtica amb el colorant CellMask (dreta) el dia 13 de cultiu.La barra d'escala és de 50 μm tret que s'indiqui el contrari.b Reimpressió amb permís de referència.2.Oxford University Press;c Adaptat amb permís de Reference.2.Oxford University Press;e i f adaptats amb permís per referència.12 Sota llicència Creative Commons CC BY 4.0.
A l'intestí en un xip, cal modificar la superfície hidròfoba de la membrana porosa PDMS per obtenir un recobriment ECM reeixit. En aquest protocol, apliquem dos mètodes diferents per modificar la hidrofobicitat de les membranes PDMS. Per al cultiu de cèl·lules Caco-2, només l'activació superficial mitjançant el tractament UV/ozó va ser suficient per reduir la hidrofobicitat de la superfície PDMS i la membrana PDMS, enganxem la cèl·lula Caco-CM2, adjuntem a la membrana ECM2. El cultiu ídic de l'epiteli organoide requereix una funcionalització superficial basada en productes químics per aconseguir una deposició eficient de proteïnes ECM aplicant seqüencialment polietilènimina (PEI) i glutaraldehid als microcanals PDMS. Després de la modificació de la superfície, les proteïnes ECM es van dipositar per cobrir la superfície PDMS funcionalitzada i després es van introduir a la superfície de PDMS funcionalitzada i després es van introduir a la superfície aïllada de les cèl·lules aïllades. el medi al microcanal superior fins que les cèl·lules formen una monocapa completa, mentre que el microcanal inferior manté les condicions estàtiques. Aquest mètode optimitzat per a l'activació superficial i el recobriment ECM permet la fixació de l'epiteli organoide per induir la morfogènesi 3D a la superfície del PDMS.
Els cultius Transwell també requereixen un recobriment d'ECM abans de la sembra de cèl·lules;tanmateix, els cultius Transwell no requereixen passos complexos de pretractament per activar la superfície de les insercions poroses. Per fer créixer cèl·lules Caco-2 a les insercions de Transwell, el recobriment d'ECM a les insercions poroses accelera la unió de cèl·lules Caco-2 dissociades (<1 hora) i la formació de barreres d'unió estreta (<1-2 dies). superfície de la membrana (<3 h) i es manté fins que els organoides formen una monocapa completa amb integritat de barrera. Els cultius Transwell es realitzen en plaques de 24 pous sense utilitzar xips híbrids.
La morfogènesi 3D in vitro es pot iniciar aplicant un flux de fluid a l'aspecte basolateral d'una capa epitelial establerta. A l'intestí en un xip, la morfogènesi epitelial va començar quan el medi es va perfondre als microcanals superior i inferior (Fig. 3a). nutrients i sèrum a les cèl·lules unides a membranes poroses i generen estrès de cisalla luminal, normalment apliquem un flux dual a l'intestí en un xip. En xips híbrids, insercions Transwell que contenien monocapes epitelials es van inserir en els xips híbrids. Després, el medi es va aplicar sota el costat basolateral de la inserció porosa de Transwell a través del microcanal.
Les característiques morfològiques de les capes epitelials 3D de microenginyeria es poden analitzar aplicant diverses modalitats d'imatge, inclosa la microscòpia de contrast de fase, la microscòpia de contrast d'interferència diferencial (DIC), SEM o la microscòpia confocal d'immunofluorescència (figures 3 i 4). A la transparència òptica de les pel·lícules de PDMS i de polièster, tant les plataformes d'intestí en xip com de xip híbrid poden proporcionar imatges in situ en temps real sense necessitat de seccionar o desmuntar el dispositiu. -100 i 2% (pes/vol) ) albúmina sèrica bovina (BSA), per ordre. Depenent del tipus de cèl·lula, es poden utilitzar diferents fixadors, permeabilitzadors i agents de bloqueig. S'utilitzen anticossos primaris dirigits a marcadors de cèl·lules o regions dependents del llinatge per ressaltar cèl·lules immobilitzades in situ al xip, seguits d'anticossos secundaris (nucli d'anticossos diana, midi-4', midi-4', etc.). -fenilè) indol, DAPI) o F-actina (per exemple, fal·loidina marcada amb fluorescència). També es poden realitzar imatges en directe basades en fluorescència in situ per detectar la producció de moc (Fig.1, "Diferenciació cel·lular" i "Fisiologia intestinal"), la colonització aleatòria de cèl·lules microbianes (Fig. 1, "Cocultiu hoste-microbe"), el reclutament de cèl·lules immunitàries (Fig. 1, "Modelització de malalties") o els contorns de la morfologia epitelial en 3D (Fig. 3c, l'intestí i la modificació de la capa per separar-la). Capa de microcanal inferior, tal com es descriu a la ref. Tal com es mostra a la figura 2, la morfologia epitelial 3D així com les microvellositats de la vora del raspall apical es poden visualitzar mitjançant SEM (Fig. 3b). L'expressió dels marcadors de diferenciació es pot avaluar mitjançant la seqüenciació quantitativa d'ARN unicel·lular o PCR5. obtingut per tripsinització i després utilitzat per a anàlisis moleculars o genètiques.
a, Flux de treball per a la inducció de la morfogènesi intestinal en un xip híbrid. En aquest protocol s'utilitzen caco-2 i organoides intestinals per demostrar la morfogènesi 3D en una plataforma de xips híbrids. Les cèl·lules epitelials dissociades es van sembrar en insercions Transwell preparades (preparació TW; vegeu la figura següent). Una vegada que les cèl·lules es van sembrar (llavor) i es van col·locar totes les cèl·lules en condicions de polièsters en un cultiu transestàtic. Cultiu W). Després de 7 dies, es va integrar una sola inserció de Transwell que contenia una monocapa 2D de cèl·lules epitelials en un xip híbrid per introduir un flux basolateral (Flow, BL), que finalment va conduir a la generació d'una capa epitelial 3D (morfogènesi). .Els esquemes de les capes superiors il·lustren la configuració experimental per a cada pas.b, Els xips híbrids (esquema esquerra) poden conduir a la morfogènesi 3D de cèl·lules epitelials organoides amb vistes de microscòpia confocal de dalt a baix preses en diferents posicions Z (superior, mitjà i inferior);vegeu l'esquema de la dreta i les línies de punts corresponents).mostraven característiques morfològiques òbvies. F-actina (cian), nucli (gris). c, Micrografies confocals de fluorescència (vista en angle 3D) de cèl·lules epitelials derivades d'organoides cultivades en Transwell estàtic (TW; inserit dins de la caixa de guions blancs) versus xip híbrid (pla més gran) comparant la morfologia 2D versus la parell de tall vertical, respectivament, en 3D. cantonada superior dreta; "XZ") també mostren característiques 2D i 3D.Barra d'escala, 100 µm.c Reimpressió amb permís de referència.4.Elsevier.
Els controls es poden preparar cultivant les mateixes cèl·lules (caco-2 o cèl·lules epitelials organoides intestinals) en monocapes bidimensionals en condicions de cultiu estàtic convencionals.
El procés de litografia suau s'ha de realitzar en una sala neta. Per a cada capa del xip (capes superiors i inferiors i membranes) i xips híbrids, es van utilitzar diferents fotomàscares i es van fabricar en hòsties de silici separades perquè les alçades dels microcanals eren diferents. µm.
Col·loqueu una hòstia de silici de 3 polzades en un plat amb acetona. Gireu suaument la placa durant 30 segons, després assequeu l'hòstia a l'aire. Transferiu l'hòstia a una placa amb IPA i, a continuació, feu girar la placa durant 30 segons per netejar-la.
Opcionalment, es pot utilitzar una solució de piranha (barreja de peròxid d'hidrogen i àcid sulfúric concentrat, 1:3 (vol/vol)) per maximitzar l'eliminació de residus orgànics de la superfície de l'hòstia de silici.
La solució de piranha és extremadament corrosiva i genera calor. Calen precaucions de seguretat addicionals. Per eliminar els residus, deixeu que la solució es refredi i transferiu-la a un contenidor de residus net i sec. Utilitzeu contenidors secundaris i etiqueteu correctament els contenidors de residus. Si us plau, seguiu les directrius de seguretat de la instal·lació per a procediments més detallats.
Deshidrateu les hòsties col·locant-les en una placa calenta a 200 °C durant 10 min. Després de la deshidratació, la hòstia es va sacsejar cinc vegades a l'aire perquè es refredi.
Aboqueu ~ 10 g de fotoresist SU-8 2100 al centre de l'hòstia de silici netejada. Utilitzeu unes pinces per estendre la hòstia de manera uniforme a l'hòstia. De tant en tant, col·loqueu l'hòstia en una placa calenta a 65 ° C per fer que la hòstia sigui menys enganxosa i més fàcil d'estendre. No col·loqueu l'hòstia directament a la placa calenta.
El SU-8 es va distribuir uniformement a l'hòstia executant un recobriment de gir. Programeu una rotació entrant del SU-8 durant 5-10 s perquè es propagui a 500 rpm a una acceleració de 100 rpm/s. Estableix el gir principal per a un patró de gruix de 200 µm a 1.500 rpm (o aconseguir una alçada superior a 500 rpm per de l'intestí al xip; vegeu "Pasos crítics" a continuació) establert a una acceleració de 300 rpm/s 30 segons a 1.200 rpm.
La velocitat de gir principal es pot ajustar segons el gruix objectiu del patró SU-8 a l'hòstia de silici.
Per fabricar patrons SU-8 de 500 µm d'alçada per a la capa superior de l'intestí del xip, es van repetir seqüencialment el recobriment de gir i els passos de cocció suau d'aquesta caixa (vegeu el pas 9) (vegeu el pas 9) per produir dues capes de 250 µm Una capa gruixuda de SU-8, que es pot unir mitjançant capes d'exposició UV en aquest pas de µ50 µm2 .
Enforna suaument les hòsties recobertes de SU-8 col·locant amb cura les hòsties en una placa calenta a 65 ° C durant 5 minuts, després canvia la configuració a 95 ° C i s'incuba durant 40 min addicionals.
Per aconseguir una alçada de 500 μm del patró SU-8 al microcanal superior, repetiu els passos 7 i 8 per generar dues capes SU-8 de 250 μm de gruix.
Utilitzant l'alineador de màscara UV, realitzeu una prova de llum segons les instruccions del fabricant per calcular el temps d'exposició de l'hòstia. (temps d'exposició, ms) = (dosi d'exposició, mJ/cm2)/(potència de la làmpada, mW/cm2).
Després de determinar el temps d'exposició, col·loqueu la fotomàscara al suport de la màscara de l'alineador de la màscara UV i col·loqueu la fotomàscara a la hòstia recoberta de SU-8.
Col·loqueu la superfície impresa de la fotomàscara directament al costat recobert de SU-8 de l'hòstia de silici per minimitzar la dispersió UV.
Exposeu l'hòstia recoberta de SU-8 i la fotomàscara verticalment a 260 mJ/cm2 de llum UV durant el temps d'exposició predeterminat (vegeu el pas 10 d'aquest quadre).
Després de l'exposició UV, les hòsties de silici recobertes de SU-8 es van coure a 65 ° C durant 5 min i 95 ° C durant 15 min a cada placa calenta per fabricar patrons amb una alçada de 200 μm. Amplieu el temps posterior a la cocció de 95 ° C a 30 min per fabricar patrons amb una alçada de 500 μm.
El desenvolupador s’aboca en un plat de vidre i la hòstia al forn es col·loca al plat. El volum del desenvolupador SU-8 pot variar depenent de la mida de la placa de vidre. Assegureu-vos d’utilitzar prou desenvolupador SU-8 per eliminar completament SU-8. Per exemple, quan s’utilitza un plat de vidre de 150 mm de diàmetre amb una capacitat d’1 L, utilitzar ~ 300 ml de desenvolupador SU-8.Developel.Develefelopelopel el motlle per a 25 minuts amb una suau rotració.
Esbandiu el motlle desenvolupat amb ~ 10 ml de revelador fresc seguit d'IPA ruixant la solució amb una pipeta.
Col·loqueu la hòstia en un netejador de plasma i exposeu-la al plasma d'oxigen (gas atmosfèric, pressió objectiu 1 × 10−5 Torr, potència 125 W) durant 1,5 min.
Col·loqueu l'hòstia en un dessecador al buit amb una làmina de vidre a l'interior. Les hòsties i les làmines es poden col·locar una al costat de l'altra. Si el dessecador al buit es divideix en diverses capes per una placa, col·loqueu les làmines a la cambra inferior i les hòsties a la cambra superior. i aplicar el buit per a la silanització.
Descongelar un vial de cèl·lules Caco-2 congelades en un bany d'aigua a 37 ° C i després transferir les cèl·lules descongelades a un matràs T75 que conté 15 ml de medi Caco-2 preescalfat a 37 ° C.
Per passar cèl·lules Caco-2 a ~ 90% de confluència, primer calent el medi Caco-2, PBS i 0,25% de tripsina/1 mM EDTA en un bany d'aigua a 37 ° C.
Aspirar el medi mitjançant aspiració al buit. Rentar les cèl·lules dues vegades amb 5 ml de PBS calent repetint l'aspiració al buit i afegint PBS fresc.