Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir una assistència continuada, mostrarem el lloc web sense estils ni JavaScript.
La morfogènesi intestinal humana estableix característiques criptòvil·loses de microarquitectura epitelial 3D i organització espacial. Aquesta estructura única és necessària per mantenir l'homeòstasi intestinal protegint el nínxol de cèl·lules mare a la cripta basal dels antígens microbians exògens i els seus metabòlits. A més, les vellositats intestinals i el moc secretor presenten cèl·lules epitelials funcionalment diferenciades amb una barrera protectora a la superfície de la mucosa intestinal. Per tant, recrear estructures epitelials 3D és crucial per a la construcció de models intestinals in vitro. En particular, l'intestí mimètic orgànic en un xip pot induir la morfogènesi 3D espontània de l'epiteli intestinal amb funcions fisiològiques i biomecànica millorades. Aquí, proporcionem un protocol reproduïble per induir de manera robusta la morfogènesi intestinal a l'intestí en un xip microfluídic, així com en un xip híbrid incrustat amb Transwell. Descrivim mètodes detallats per a la fabricació de dispositius, el cultiu de cèl·lules epitelials organoides intestinals o Caco-2 en entorns convencionals, així com en una plataforma microfluídica, la inducció de la morfogènesi 3D i la caracterització d'epitelis 3D establerts. utilitzant múltiples modalitats d'imatge. Aquest protocol aconsegueix la regeneració de la microarquitectura intestinal funcional controlant el flux de fluid basolateral durant 5 dies. El nostre mètode de morfogènesi in vitro utilitza tensió de cisallament i moviment mecànic fisiològicament rellevants i no requereix enginyeria o manipulació cel·lular complexa, cosa que pot superar altres tècniques existents. Preveiem que el nostre protocol proposat podria tenir àmplies implicacions per a la comunitat de recerca biomèdica, proporcionant un mètode per regenerar capes epitelials intestinals 3D in vitro per a aplicacions biomèdiques, clíniques i farmacèutiques.
Els experiments demostren que les cèl·lules epitelials intestinals Caco-2 cultivades en dispositius microfluídics de bicapa1,2,3,4,5 o en intestí6,7 poden experimentar una morfogènesi 3D espontània in vitro sense una comprensió clara del mecanisme subjacent. En el nostre estudi recent, vam trobar que l'eliminació dels antagonistes de morfògens secretats basolateralment dels dispositius de cultiu és necessària i suficient per induir la morfogènesi epitelial 3D in vitro, cosa que s'ha demostrat amb Caco-2 i organoides intestinals derivats de pacients. Es van validar les cèl·lules epitelials. En aquest estudi, ens vam centrar específicament en la producció cel·lular i la distribució de la concentració d'un potent antagonista de Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), en dispositius microfluídics modificats que contenen insercions Transwell, anomenats "xip híbrid". Demostrem que l'addició d'antagonistes de Wnt exògens (com ara DKK-1, repressor de Wnt 1, proteïna relacionada amb el frizzled secretada 1 o Soggy-1) a l'intestí en el xip inhibeix la morfogènesi o interromp la capa epitelial 3D preestructurada, cosa que suggereix que l'estrès antagonista durant el cultiu és responsable de la morfogènesi intestinal in vitro. Per tant, un enfocament pràctic per aconseguir una morfogènesi robusta a la interfície epitelial és eliminar o mantenir mínimament els nivells d'antagonistes de Wnt al compartiment basolateral mitjançant un rentat actiu (per exemple, en plataformes gut-on-a-chip o híbrides en un xip) o difusió. Medis basolaterals (per exemple, d'insercions Transwell a grans reservoris basolaterals en pous).
En aquest protocol, proporcionem un mètode detallat per fabricar microdispositius "gut-on-a-chip" i xips híbrids inseribles amb Transwell (passos 1-5) per cultivar cèl·lules epitelials intestinals en membranes poroses basades en polidimetilsiloxà (PDMS) (passos 6A, 7A, 8, 9) o membranes de polièster d'inserts Transwell (passos 6B, 7B, 8, 9) i induir morfogènesi 3D in vitro (pas 10). També hem identificat característiques cel·lulars i moleculars indicatives d'histogènesi específica de teixit i diferenciació cel·lular dependent del llinatge mitjançant l'aplicació de múltiples modalitats d'imatge (passos 11-24). Induïm la morfogènesi utilitzant cèl·lules epitelials intestinals humanes, com ara Caco-2 o organoides intestinals, en dos formats de cultiu amb detalls tècnics que inclouen la modificació superficial de membranes poroses, la creació de monocapes 2D i la bioquímica intestinal i la reproducció del microambient biomecànic in vitro. Per induir la morfogènesi 3D a partir de monocapes epitelials 2D, hem eliminat els antagonistes dels morfògens en ambdós cultius. es forma fent fluir el medi cap al compartiment basolateral del cultiu. Finalment, proporcionem una representació de la utilitat d'una capa epitelial 3D regenerable que es pot utilitzar per modelar el creixement epitelial dependent de morfogens, cocultius longitudinals hoste-microbioma, infecció per patògens, lesions inflamatòries, disfunció de la barrera epitelial i teràpies basades en probiòtics. Exemple. Influències.
El nostre protocol pot ser útil per a una àmplia gamma de científics en recerca bàsica (per exemple, biologia de la mucosa intestinal, biologia de cèl·lules mare i biologia del desenvolupament) i aplicada (per exemple, proves preclíniques de fàrmacs, modelització de malalties, enginyeria de teixits i gastroenterologia) d'ampli impacte. A causa de la reproductibilitat i la robustesa del nostre protocol per induir la morfogènesi 3D de l'epiteli intestinal in vitro, preveiem que la nostra estratègia tècnica es pot difondre a públics que estudien la dinàmica de la senyalització cel·lular durant el desenvolupament intestinal, la regeneració o l'homeòstasi. A més, el nostre protocol és útil per interrogar la infecció sota diversos agents infecciosos com el norovirus 8, el coronavirus 2 de la síndrome respiratòria aguda greu (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae. També són útils els públics de patologia i patogènesi de malalties. L'ús d'un sistema de microfisiologia intestinal en un xip pot permetre el cocultiu longitudinal 10 i l'avaluació posterior de la defensa de l'hoste, les respostes immunitàries i la reparació de lesions relacionades amb patògens al tracte gastrointestinal (GI) 11. Altres trastorns GI associats amb la síndrome de l'intestí permeable, la celiaquia, la malaltia de Crohn, la colitis ulcerosa, la pouquitis o la síndrome de l'intestí irritable es poden simular quan es preparen capes epitelials intestinals en 3D utilitzant les capes epitelials intestinals en 3D del pacient, aquestes malalties inclouen atròfia vilosa, escurçament de les criptes, dany mucosal o barrera epitelial deteriorada. Biòpsia o organoides intestinals derivats de cèl·lules mare 12,13. Per modelar millor la major complexitat de l'entorn de la malaltia, els lectors poden considerar afegir tipus de cèl·lules rellevants per a la malaltia, com ara cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMC) del pacient, a models que contenen microarquitectures 3D de vellositat intestinal i cripta. cèl·lules immunitàries específiques de teixit, 5.
Com que la microestructura epitelial 3D es pot fixar i visualitzar sense el procés de seccionament, els observadors que treballen en transcriptòmica espacial i imatges d'alta resolució o superresolució poden estar interessats en el nostre mapatge de la dinàmica espaciotemporal de gens i proteïnes en nínxols epitelials. Interessats en la tecnologia. Resposta a estímuls microbians o immunitaris. A més, la interacció longitudinal entre l'hoste i el microbioma 10, 14 que coordina l'homeòstasi intestinal es pot establir a la capa mucosa intestinal 3D cocultivant diverses espècies microbianes, comunitats microbianes o microbiota fecal, especialment a l'intestí en un xip. a la plataforma. Aquest enfocament és particularment atractiu per al públic que estudia immunologia de la mucosa, gastroenterologia, microbioma humà, culturòmica i microbiologia clínica que busca cultivar microbiota intestinal prèviament no cultivada al laboratori. Si el nostre protocol de morfogènesi in vitro es pot adaptar a formats de cultiu escalables, com ara inserts multipou en plaques de 24, 96 o 384 pous que reposen contínuament els compartiments basolaterals, el protocol també es pot difondre a aquells que desenvolupen plataformes de cribratge o validació farmacèutiques, biomèdiques o d'alt rendiment per a la indústria alimentària. Com a prova de principi, recentment hem demostrat la viabilitat d'un sistema de morfogènesi multiplex d'alt rendiment escalable a un format de placa de 24 pous. A més, s'han comercialitzat múltiples productes organ-on-a-chip16,17,18. Per tant, la validació del nostre mètode de morfogènesi in vitro pot ser accelerada i potencialment adoptada per molts laboratoris de recerca, indústria o agències governamentals i reguladores per comprendre la reprogramació cel·lular de la morfogènesi intestinal in vitro a nivell transcriptòmic per provar fàrmacs o bioterapèutiques L'absorció i el transport de candidats a fàrmacs es va avaluar mitjançant substituts intestinals en 3D o models d'òrgan en un xip personalitzats o comercials per avaluar la reproductibilitat del procés de morfogènesi intestinal.
S'ha utilitzat un nombre limitat de models experimentals rellevants per a humans per estudiar la morfogènesi epitelial intestinal, principalment a causa de la manca de protocols implementables per induir la morfogènesi 3D in vitro. De fet, gran part del coneixement actual sobre la morfogènesi intestinal es basa en estudis amb animals (per exemple, peix zebra20, ratolins21 o pollastres22). Tanmateix, requereixen molta mà d'obra i costos, poden ser èticament qüestionables i, el més important, no determinen amb precisió els processos de desenvolupament humà. Aquests models també són molt limitats en la seva capacitat de ser provats de manera escalable de múltiples vies. Per tant, el nostre protocol per regenerar estructures de teixit 3D in vitro supera els models animals in vivo, així com altres models tradicionals de cultiu cel·lular 2D estàtics. Com s'ha descrit anteriorment, la utilització d'estructures epitelials 3D ens va permetre examinar la localització espacial de cèl·lules diferenciades a l'eix cripta-vellositat en resposta a diversos estímuls mucosals o immunitaris. Les capes epitelials 3D poden proporcionar un espai per estudiar com les cèl·lules microbianes competeixen per formar nínxols espacials i l'evolució ecològica en resposta a factors de l'hoste (per exemple, capes de moc internes versus externes, secreció d'IgA i pèptids antimicrobians). A més, la morfologia epitelial 3D ens pot permetre entendre com la microbiota intestinal estructura les seves comunitats i produeix sinèrgicament metabòlits microbians (per exemple, àcids grassos de cadena curta) que configuren l'organització cel·lular i els nínxols de cèl·lules mare a les criptes basals. Aquestes característiques només es poden demostrar quan s'estableixen capes epitelials 3D in vitro.
A més del nostre mètode de creació d'estructures epitelials intestinals en 3D, hi ha diversos mètodes in vitro. El cultiu d'organoides intestinals és una tècnica d'enginyeria de teixits d'última generació basada en el cultiu de cèl·lules mare intestinals en condicions morfogèniques específiques23,24,25. Tanmateix, l'ús de models d'organoides en 3D per a l'anàlisi del transport o els cocultius hoste-microbioma sovint és un repte perquè el lumen intestinal està tancat dins de l'organoide i, per tant, la introducció de components luminals com ara cèl·lules microbianes o antígens exògens és limitada. L'accés als lumens d'organoides es pot millorar mitjançant un microinjector,26,27 però aquest mètode és invasiu i requereix molta mà d'obra i requereix coneixements especialitzats per dur-lo a terme. A més, els cultius d'organoides tradicionals mantinguts en bastides d'hidrogel en condicions estàtiques no reflecteixen amb precisió la biomecànica activa in vivo.
Altres enfocaments emprats per diversos grups de recerca utilitzen bastides d'hidrogel 3D preestructurades per imitar l'estructura epitelial intestinal cultivant cèl·lules intestinals humanes aïllades a la superfície del gel. Fabriqueu bastides d'hidrogel mitjançant motlles impresos en 3D, microfresats o fabricats litogràficament. Aquest mètode mostra la disposició autoorganitzada de cèl·lules epitelials aïllades in vitro amb gradients de morfogen fisiològicament rellevants, establint una estructura epitelial d'alta relació d'aspecte i interacció entre l'estroma i l'epiteli mitjançant la inclusió de cèl·lules estromals a la bastida. Tanmateix, la naturalesa de les bastides preestructurades pot impedir la visualització del procés morfogenètic espontani en si. Aquests models tampoc proporcionen flux luminal o intersticial dinàmic, ja que no tenen la tensió de cisallament del fluid que les cèl·lules intestinals necessiten per patir morfogènesi i obtenir una funció fisiològica. Un altre estudi recent va utilitzar bastides d'hidrogel en una plataforma microfluídica i va modelar estructures epitelials intestinals mitjançant tècniques de gravat làser. Els organoides intestinals de ratolí segueixen patrons gravats per formar estructures tubulars intestinals, i el flux de fluid intraluminal es pot recapitular mitjançant un mòdul de microfluídica. Tanmateix, aquest model ni... exhibeix processos morfogenètics espontanis ni inclou moviments mecanobiològics intestinals. Les tècniques d'impressió 3D del mateix grup van poder crear tubs intestinals en miniatura amb processos morfogenètics espontanis. Malgrat la complexa fabricació de diferents segments intestinals dins del tub, aquest model també manca de flux de fluid luminal i deformació mecànica. A més, l'operabilitat del model pot ser limitada, especialment després que el procés de bioimpressió s'hagi completat, pertorbant les condicions experimentals o les interaccions cèl·lula a cèl·lula. En canvi, el nostre protocol proposat proporciona morfogènesi intestinal espontània, tensió de cisallament fisiològicament rellevant, biomecànica que imiten la motilitat intestinal, accessibilitat a compartiments apicals i basolaterals independents i recreació de microentorns biològics complexos de modularitat. Per tant, el nostre protocol de morfogènesi 3D in vitro pot proporcionar un enfocament complementari per superar els reptes dels mètodes existents.
El nostre protocol se centra completament en la morfogènesi epitelial 3D, només amb cèl·lules epitelials en cultiu i sense altres tipus de cèl·lules circumdants com ara cèl·lules mesenquimals, cèl·lules endotelials i cèl·lules immunitàries. Com s'ha descrit anteriorment, el nucli del nostre protocol és la inducció de la morfogènesi epitelial mitjançant l'eliminació dels inhibidors de morfògens secretats al costat basolateral del medi introduït. Si bé la robusta modularitat del nostre intestí en un xip i híbrid en un xip ens permet recrear la capa epitelial 3D ondulant, encara cal tenir en compte complexitats biològiques addicionals com ara les interaccions epitelial-mesenquimals33,34, la deposició de la matriu extracel·lular (MEC)35 i, en el nostre model, les característiques de les criptes i els vellositats que transmeten nínxols de cèl·lules mare a les criptes basals. Les cèl·lules estromals (per exemple, els fibroblasts) del mesènquima tenen un paper clau en la producció de proteïnes de la MEC i la regulació de la morfogènesi intestinal in vivo35,37,38. L'addició de cèl·lules mesenquimals al nostre model va millorar el procés morfogenètic. i l'eficiència d'adhesió cel·lular. La capa endotelial (és a dir, els capil·lars o els limfàtics) juga un paper important en la regulació del transport molecular39 i el reclutament de cèl·lules immunitàries40 en el microambient intestinal. A més, els components vasculars que es poden connectar entre models de teixits són un requisit previ quan es dissenyen models de teixits per demostrar interaccions multiòrgan. Per tant, pot ser necessari incloure cèl·lules endotelials per modelar característiques fisiològiques més precises amb resolució a nivell d'òrgan. Les cèl·lules immunitàries derivades del pacient també són essencials per mostrar respostes immunitàries innates, presentació d'antígens, interacció immunitària adaptativa innata i immunitat específica de teixits en el context de la imitació de malalties intestinals.
L'ús de xips híbrids és més senzill que el de "gut-on-a-chip" perquè la configuració del dispositiu és més senzilla i l'ús d'inserts Transwell permet un cultiu escalable de l'epiteli intestinal. Tanmateix, els inserts Transwell disponibles comercialment amb membranes de polièster no són elàstics i no poden simular moviments peristàltics. A més, el compartiment apical de l'insert Transwell col·locat al xip híbrid va romandre estacionari sense tensió de cisallament al costat apical. Clarament, les propietats estàtiques del compartiment apical rarament permeten un cocultiu bacterià a llarg termini en xips híbrids. Si bé podem induir de manera robusta la morfogènesi 3D en inserts Transwell quan utilitzem xips híbrids, l'escassetat de biomecànica fisiològicament rellevant i flux de fluid apical pot limitar la viabilitat de les plataformes de xips híbrids per a possibles aplicacions.
Les reconstruccions a escala completa de l'eix cripta-vil·lusió humana en cultius d'intestí en un xip i híbrids en un xip no s'han establert completament. Com que la morfogènesi comença a partir d'una monocapa epitelial, les microarquitectures 3D no proporcionen necessàriament similitud morfològica amb les criptes in vivo. Tot i que vam caracteritzar la població cel·lular proliferant prop del domini de les criptes basals a l'epiteli 3D microenginyeritzat, les regions de les criptes i les vilositats no estaven clarament delimitades. Tot i que els canals superiors més alts del xip condueixen a una major alçada de l'epiteli microenginyeritzat, l'alçada màxima encara està limitada a ~300-400 µm. La profunditat real de les criptes intestinals humanes a l'intestí prim i gros és de ~135 µm i ~400 µm, respectivament, i l'alçada de les vellositats de l'intestí prim és de ~600 µm41.
Des del punt de vista de la imatge, la imatge de superresolució in situ de microarquitectures 3D pot estar limitada a l'intestí en un xip, ja que la distància de treball necessària des de la lent de l'objectiu fins a la capa epitelial és de l'ordre d'uns pocs mil·límetres. Per superar aquest problema, pot ser necessari un objectiu distant. A més, fer seccions primes per a la preparació de mostres d'imatge és un repte a causa de l'alta elasticitat del PDMS. A més, com que la microfabricació capa per capa de l'intestí en un xip implica una adhesió permanent entre cada capa, és extremadament difícil obrir o treure la capa superior per examinar l'estructura superficial de la capa epitelial. Per exemple, mitjançant un microscopi electrònic de rastreig (SEM).
La hidrofobicitat del PDMS ha estat un factor limitant en estudis basats en microfluids que tracten molècules petites hidrofòbiques, ja que el PDMS pot adsorbir de manera inespecífica aquestes molècules hidrofòbiques. Es poden considerar alternatives al PDMS amb altres materials polimèrics. Alternativament, es pot considerar la modificació superficial del PDMS (per exemple, recobriment amb materials lipofílics 42 o poli(etilenglicol) 43) per minimitzar l'adsorció de molècules hidrofòbiques.
Finalment, el nostre mètode no s'ha caracteritzat bé pel que fa a proporcionar una plataforma experimental de cribratge d'alt rendiment o "talla única" fàcil d'utilitzar. El protocol actual requereix una bomba de xeringa per microdispositiu, cosa que ocupa espai en una incubadora de CO2 i impedeix experiments a gran escala. Aquesta limitació es pot millorar significativament mitjançant l'escalabilitat de formats de cultiu innovadors (per exemple, insercions poroses de 24 pous, 96 pous o 384 pous que permeten la reposició i eliminació contínues de medis basolaterals).
Per induir la morfogènesi 3D de l'epiteli intestinal humà in vitro, vam utilitzar un dispositiu intestinal de xip microfluídic que conté dos microcanals paral·lels i una membrana porosa elàstica entremig per crear una interfície lumen-capil·lar. També demostrem l'ús d'un dispositiu microfluídic d'un sol canal (un xip híbrid) que proporciona un flux basolateral continu sota les capes epitelials polaritzades que creixen en insercions Transwell. En ambdues plataformes, es pot demostrar la morfogènesi de diverses cèl·lules epitelials intestinals humanes aplicant la manipulació direccional del flux per eliminar els antagonistes dels morfògens del compartiment basolateral. Tot el procediment experimental (Figura 1) consta de cinc parts: (i) microfabricació del xip intestinal o del xip híbrid inserible Transwell (passos 1-5; Requadre 1), (ii) preparació de cèl·lules epitelials intestinals (cèl·lules Caco-2) o organoides intestinals humans; caselles 2-5), (iii) cultiu de cèl·lules epitelials intestinals en xips intestinals o xips híbrids (passos 6-9), (iv) inducció de morfogènesi 3D in vitro (pas 10) i (v)) per caracteritzar la microestructura epitelial 3D (passos 11-24). Finalment, es va dissenyar un grup de control adequat (que es descriu més endavant) per validar l'eficàcia de la morfogènesi in vitro comparant la morfogènesi epitelial amb controls espacials, temporals, condicionals o procedimentals.
Vam utilitzar dues plataformes de cultiu diferents: gut-on-a-chip amb canals rectes o canals complicats no lineals, o xips híbrids que contenen inserts Transwell (TW) en un dispositiu microfluídic, fabricat tal com es descriu al quadre 1, i els passos 1-5. "Fabricació de dispositius" mostra els passos principals per fer un xip únic o un xip híbrid. "Cultiu de cèl·lules epitelials intestinals humanes" explica la font cel·lular (Caco-2 o organoides intestinals humans) i el procediment de cultiu utilitzat en aquest protocol. "Morfogènesi in vitro" mostra els passos generals en què les cèl·lules epitelials derivades de Caco-2 o organoides es cultiven en un xip intestinal o en inserts Transwell d'un xip híbrid, seguit de la inducció de la morfogènesi 3D i la formació d'una estructura epitelial caracteritzada. El número de pas del programa o el número de quadre es mostra sota cada fletxa. L'aplicació proporciona exemples de com es poden utilitzar les capes epitelials intestinals establertes, per exemple, en la caracterització de la diferenciació cel·lular, estudis de fisiologia intestinal, establiment d'ecosistemes hoste-microbioma i modelització de malalties. Imatges d'immunofluorescència a "Cell "Diferenciació" que mostra nuclis, F-actina i MUC2 expressats a la capa epitelial 3D de Caco-2 generada al xip intestinal. La senyalització MUC2 és present a les cèl·lules caliciformes i al moc secretat per les superfícies mucoses. Les imatges fluorescents a Gut Physiology mostren moc produït per tinció de residus d'àcid siàlic i N-acetilglucosamina utilitzant aglutinina fluorescent de germen de blat. Les dues imatges superposades a "Cocultius hoste-microbi" mostren cocultius representatius de microbioma hoste a l'intestí en un xip. El panell esquerre mostra el cocultiu d'E. coli que expressa proteïna fluorescent verda (GFP) amb cèl·lules epitelials 3D Caco-2 microenginyades. El panell dret mostra la localització de GFP E. coli cocultivada amb cèl·lules epitelials 3D Caco-2, seguida de tinció d'immunofluorescència amb F-actina (vermell) i nuclis (blau). El modelatge de malalties il·lustra l'intestí sa versus el permeable en xips d'inflamació intestinal sota repte fisiològic amb antígens bacterians (per exemple, lipopolisacàrid, LPS) i cèl·lules immunitàries (p. ex., PBMC; verd). Es van cultivar cèl·lules Caco-2 per establir una capa epitelial 3D. Barra d'escala, 50 µm. Imatges a la fila inferior: "Diferenciació de cèl·lules" adaptada amb permís de la referència. 2. Oxford University Press; Reproduït amb permís de la Ref. 5. NAS; "Cocultiu host-microbe" adaptat amb permís de la ref. 3. NAS; "Modelització de malalties" adaptat amb permís de la referència. 5. NAS.
Tant els xips "gut-on-chip" com els híbrids es van fabricar utilitzant rèpliques de PDMS que es van desemmotllar de motlles de silici mitjançant litografia tova1,44 i es van modelar amb SU-8. El disseny dels microcanals de cada xip es determina considerant la hidrodinàmica com la tensió de cisallament i la pressió hidrodinàmica1,4,12. El disseny original de "gut-on-a-chip" (Dades ampliades Fig. 1a), que consistia en dos microcanals rectes paral·lels juxtaposats, ha evolucionat cap a un disseny complex de "gut-on-a-chip" (Dades ampliades Fig. 1b) que inclou un parell de microcanals corbats per induir un major temps de residència del fluid, patrons de flux no lineals i deformació multiaxial de cèl·lules cultivades (Fig. 2a-f)12. Quan cal recrear una biomecànica intestinal més complexa, es poden triar "gut-on-a-chips" complexos. Hem demostrat que el Gut-Chip enrevessat també indueix fortament la morfogènesi 3D en un període de temps similar amb un grau similar de creixement epitelial en comparació amb l'original. Gut-Chip, independentment del tipus de cèl·lula cultivada. Per tant, per induir la morfogènesi 3D, els dissenys d'intestí lineals i complexos en xip són intercanviables. Les rèpliques de PDMS curades en motlles de silici amb patrons SU-8 van proporcionar característiques negatives després del desemmotllament (Fig. 2a). Per fabricar l'intestí en un xip, la capa superior de PDMS preparada es va unir seqüencialment a una pel·lícula porosa de PDMS i després es va alinear amb la capa inferior de PDMS mitjançant una unió irreversible utilitzant un tractador corona (Fig. 2b-f). Per fabricar xips híbrids, les rèpliques de PDMS curades es van unir a portaobjectes de vidre per crear dispositius microfluídics d'un sol canal que poguessin allotjar insercions Transwell (Fig. 2h i Dades ampliades Fig. 2). El procés d'unió es realitza tractant les superfícies de la rèplica de PDMS i el vidre amb plasma d'oxigen o tractament corona. Després de l'esterilització del dispositiu microfabricat unit al tub de silicona, la configuració del dispositiu estava a punt per realitzar la morfogènesi 3D de l'epiteli intestinal (Figura 2g).
a, Il·lustració esquemàtica de la preparació de peces de PDMS a partir de motlles de silici amb patrons SU-8. La solució de PDMS sense curar es va abocar en un motlle de silici (esquerra), es va curar a 60 °C (mig) i es va desemmotllar (dreta). El PDMS desemmotllat es va tallar a trossos i es va netejar per a un ús posterior. b, Fotografia del motlle de silici utilitzat per preparar la capa superior de PDMS. c, Fotografia del motlle de silici utilitzat per fabricar la membrana porosa de PDMS. d, Una sèrie de fotografies dels components superiors i inferiors de PDMS i el dispositiu intestinal en un xip muntat. e, Esquema de l'alineació dels components superiors, de membrana i inferiors de PDMS. Cada capa està unida irreversiblement mitjançant tractament amb plasma o corona. f, Esquema del dispositiu "gut-on-a-chip" fabricat amb microcanals enrotllats superposats i cambres de buit. g, Configuració de "gut-on-a-chip" per al cultiu cel·lular microfluídic. El "gut-on-a-chip" fabricat muntat amb un tub de silicona i una xeringa es va col·locar sobre un cobreobjectes. El dispositiu amb xip es va col·locar a la tapa d'una placa de Petri de 150 mm per al processament. L'aglutinant s'utilitza per tancar el tub de silicona. h, instantànies visuals de la fabricació de xips híbrids i morfogènesi 3D mitjançant xips híbrids. Es van inserir insercions Transwell preparades independentment per cultivar monocapes 2D de cèl·lules epitelials intestinals al xip híbrid per induir la morfogènesi intestinal 3D. El medi es perfon a través de microcanals sota la capa cel·lular establerta a l'inserció Transwell. Barra d'escala, 1 cm. h Reimprès amb permís de la referència. 4. Elsevier.
En aquest protocol, la línia cel·lular Caco-2 i els organoides intestinals es van utilitzar com a fonts epitelials (Fig. 3a). Ambdós tipus de cèl·lules es van cultivar independentment (Requadre 2 i Requadre 5) i es van utilitzar per sembrar els microcanals recoberts d'ECM de l'intestí en xip o insercions Transwell. Quan les cèl·lules són confluents (>95% de cobertura en matràs), es recol·lecten cèl·lules Caco-2 cultivades rutinàriament (entre els passatges 10 i 50) en matràs T per preparar suspensions de cèl·lules dissociades mitjançant fluid de tripsinització (requadre 2). Els organoides intestinals humans de biòpsies intestinals o reseccions quirúrgiques es van cultivar en cúpules de Matrigel en plaques de 24 pous per suportar el microambient estructural. El medi que conté morfògens essencials (com ara Wnt, R-spondina i Noggin) i factors de creixement preparats tal com es descriu al Requadre 3 es va suplementar cada dos dies fins que els organoides van créixer fins a ~500 µm de diàmetre. Els organoides completament crescuts es recol·lecten i es dissocien en cèl·lules individuals per sembrar-les a insercions intestinals o Transwell en un xip (quadre 5). Com ja hem informat anteriorment, es pot diferenciar segons el tipus de malaltia12,13 (per exemple, colitis ulcerosa, malaltia de Crohn, càncer colorectal o donant normal), el lloc de la lesió (per exemple, lesió versus zona no lesionada) i la ubicació gastrointestinal al tracte (per exemple, duodè, jejú, íle, cec, còlon o recte). A la casella 5 oferim un protocol optimitzat per al cultiu d'organoides colònics (coloides) que normalment requereixen concentracions més altes de morfògens que els organoides de l'intestí prim.
a, Flux de treball per a la inducció de la morfogènesi intestinal en el xip intestinal. En aquest protocol s'utilitza epiteli intestinal humà Caco-2 i organoides intestinals per demostrar la morfogènesi 3D. Les cèl·lules epitelials aïllades es van sembrar al dispositiu gut-on-a-chip preparat (preparació del xip). Un cop sembrades i unides les cèl·lules a la membrana porosa de PDMS el dia 0 (D0), s'inicia i es manté el flux apical (AP) durant els primers 2 dies (flux, AP, D0-D2). També s'inicia el flux basolateral (BL) juntament amb moviments d'estirament cíclics (estirament, flux, AP i BL) quan es forma una monocapa 2D completa. La morfogènesi intestinal 3D es va produir espontàniament després de 5 dies de cultiu microfluídic (morfogènesi, D5). Les imatges de contrast de fase mostren una morfologia representativa de les cèl·lules Caco-2 a cada pas experimental o punt temporal (gràfic de barres, 100 µm). Quatre diagrames esquemàtics que il·lustren les cascades corresponents de morfogènesi intestinal (a dalt a la dreta). Les fletxes discontínues a l'esquema representen la direcció del flux de fluid.b, Imatge SEM que mostra la topologia superficial de l'epiteli 3D de Caco-2 establert (esquerra). El requadre que ressalta l'àrea ampliada (quadre blanc discontinu) mostra les microvellositats regenerades a la capa 3D de Caco-2 (dreta).c, Vista frontal horitzontal de les membranes de claudina (ZO-1, vermell) i de raspall continu de Caco-2 establertes marcades amb F-actina (verd) i nuclis (blau). Visualització confocal per immunofluorescència de cèl·lules epitelials en xips intestinals. Les fletxes que apunten a l'esquema central indiquen la ubicació del pla focal per a cada vista confocal.d, Curs temporal dels canvis morfològics en organoides cultivats en un xip obtinguts per microscòpia de contrast de fase els dies 3, 7, 9, 11 i 13. El requadre (a dalt a la dreta) mostra l'alt augment de la imatge proporcionada.e, Microfotografia DIC de l'epiteli 3D organoide establert a l'intestí en una llesca presa el dia 7.f, Superposat Imatges d'immunofluorescència que mostren marcadors per a cèl·lules mare (LGR5; magenta), cèl·lules caliciformes (MUC2; verd), actina F (gris) i nuclis (cian) cultivats en xips intestinals durant 3 dies, respectivament (esquerra) i organoides de 13 dies (mig) a la capa epitelial. Vegeu també la Figura 3 de dades ampliades, que destaca la senyalització LGR5 sense la senyalització MUC2. Imatges de fluorescència que mostren la microestructura epitelial (dreta) de l'epiteli organoide 3D establert a l'intestí en un xip tenyint la membrana plasmàtica amb el colorant CellMask (dreta) el dia 13 del cultiu. La barra d'escala és de 50 μm, tret que s'indiqui el contrari. b Reimprès amb permís de referència. 2. Oxford University Press; c Adaptat amb permís de Referència. 2. Oxford University Press; e i f adaptats amb permís de referència. 12 Sota llicència Creative Commons CC BY 4.0.
En l'intestí en un xip, cal modificar la superfície hidrofòbica de la membrana porosa de PDMS per a un recobriment ECM reeixit. En aquest protocol, apliquem dos mètodes diferents per modificar la hidrofobicitat de les membranes de PDMS. Per al cultiu de cèl·lules Caco-2, l'activació superficial mitjançant tractament UV/ozó per si sola va ser suficient per reduir la hidrofobicitat de la superfície de PDMS, recobrir l'ECM i unir les cèl·lules Caco-2 a la membrana de PDMS. Tanmateix, el cultiu microfluídic de l'epiteli organoide requereix una funcionalització superficial basada en productes químics per aconseguir una deposició eficient de proteïnes ECM aplicant seqüencialment polietilenimina (PEI) i glutaraldehid als microcanals de PDMS. Després de la modificació superficial, es van dipositar proteïnes ECM per cobrir la superfície de PDMS funcionalitzada i després es van introduir a l'epiteli organoide aïllat. Després que les cèl·lules s'uneixin, el cultiu cel·lular microfluídic comença perfusionant només el medi al microcanal superior fins que les cèl·lules formen una monocapa completa, mentre que el microcanal inferior manté condicions estàtiques. Aquest mètode optimitzat per a l'activació superficial i el recobriment ECM permet la unió d'organoides. epiteli per induir la morfogènesi 3D a la superfície del PDMS.
Els cultius Transwell també requereixen un recobriment ECM abans de la sembra cel·lular; tanmateix, els cultius Transwell no requereixen passos complexos de pretractament per activar la superfície dels inserts porosos. Per al cultiu de cèl·lules Caco-2 en inserts Transwell, el recobriment ECM en inserts porosos accelera la unió de cèl·lules Caco-2 dissociades (<1 hora) i la formació de barreres d'unió estreta (<1-2 dies). Per cultivar organoides en inserts Transwell, els organoides aïllats es sembren en inserts recoberts d'ECM, s'uneixen a la superfície de la membrana (<3 h) i es mantenen fins que els organoides formen una monocapa completa amb integritat de barrera. Els cultius Transwell es realitzen en plaques de 24 pous sense l'ús de xips híbrids.
La morfogènesi 3D in vitro es pot iniciar aplicant un flux de fluids a l'aspecte basolateral d'una capa epitelial establerta. A l'intestí en un xip, la morfogènesi epitelial va començar quan el medi es va perfondre als microcanals superior i inferior (Fig. 3a). Com s'ha descrit anteriorment, és fonamental introduir un flux de fluids al compartiment inferior (basolateral) per a l'eliminació contínua dels inhibidors de morfogen secretats direccionalment. Per proporcionar nutrients i sèrum suficients a les cèl·lules unides a les membranes poroses i generar tensió de cisallament luminal, normalment apliquem un flux dual a l'intestí en un xip. En els xips híbrids, es van inserir insercions Transwell que contenien monocapes epitelials als xips híbrids. A continuació, es va aplicar el medi sota el costat basolateral de l'inserció porosa de Transwell a través del microcanal. La morfogènesi intestinal es va produir de 3 a 5 dies després de l'inici del flux basolateral en ambdues plataformes de cultiu.
Les característiques morfològiques de les capes epitelials 3D microenginyades es poden analitzar aplicant diverses modalitats d'imatge, com ara la microscòpia de contrast de fase, la microscòpia de contrast d'interferència diferencial (DIC), el SEM o la microscòpia confocal d'immunofluorescència (figures 3 i 4). La imatge de contrast de fase o DIC es pot realitzar fàcilment en qualsevol moment durant el cultiu per controlar la forma i la protrusió de les capes epitelials 3D. A causa de la transparència òptica de les pel·lícules de PDMS i polièster, tant les plataformes de xip en un xip com les de xip híbrid poden proporcionar imatges in situ en temps real sense necessitat de seccionar o desmuntar el dispositiu. Quan es realitzen imatges d'immunofluorescència (figures 1, 3c, f i 4b, c), les cèl·lules es fixen normalment amb paraformaldehid (PFA) al 4% (pes/vol), seguit de Triton X-100 i albúmina sèrica bovina (BSA) al 2% (pes/vol), per ordre. Segons el tipus de cèl·lula, es poden utilitzar diferents fixadors, permeabilitzants i agents bloquejants. Primari Els anticossos dirigits a marcadors de cèl·lules o regions dependents del llinatge s'utilitzen per ressaltar cèl·lules immobilitzades in situ al xip, seguits d'anticossos secundaris juntament amb un colorant de contratinció dirigit al nucli (per exemple, 4′,6-diamidino-2-fenilè) indol, DAPI) o F-actina (per exemple, fal·loïdina marcada fluorescentment). Les imatges en directe basades en fluorescència també es poden realitzar in situ per detectar la producció de moc (Fig. 1, "Diferenciació cel·lular" i "Fisiologia intestinal"), la colonització aleatòria de cèl·lules microbianes (Fig. 1, "Cocultiu hoste-microbi"), el reclutament de cèl·lules immunitàries (Fig. 1, "Modelització de malalties") o els contorns de la morfologia epitelial 3D (Fig. 3c, f i 4b, c). Quan es modifica l'intestí al xip per separar la capa superior de la capa inferior de microcanals, tal com es descriu a la referència. Com es mostra a la Fig. 2, la morfologia epitelial 3D, així com les microvellositats a la vora apical del raspall, es poden visualitzar mitjançant SEM (Fig. 3b). L'expressió dels marcadors de diferenciació es pot avaluar mitjançant la PCR5 quantitativa o la seqüenciació d'ARN unicel·lular. En aquest cas, les capes 3D de cèl·lules epitelials cultivades en xips intestinals o xips híbrids es recol·lecten mitjançant tripsinització i després s'utilitzen per a anàlisis moleculars o genètiques.
a, Flux de treball per a la inducció de la morfogènesi intestinal en un xip híbrid. En aquest protocol s'utilitzen Caco-2 i organoides intestinals per demostrar la morfogènesi 3D en una plataforma de xips híbrids. Es van sembrar cèl·lules epitelials dissociades en inserts Transwell preparats (preparació TW; vegeu la figura següent). Un cop sembrades (sembrades) les cèl·lules i unides a membranes de polièster en inserts Transwell, totes les cèl·lules es van cultivar en condicions estàtiques (cultiu TW). Després de 7 dies, es va integrar un únic insert Transwell que contenia una monocapa 2D de cèl·lules epitelials en un xip híbrid per introduir un flux basolateral (Flow, BL), que finalment va conduir a la generació d'una capa epitelial 3D (morfogènesi). Micrografies de contrast de fase que mostren les característiques morfològiques de les cèl·lules epitelials d'òrgans humans derivades del còlon ascendent de donant normal (línia C103) a cada pas o punt temporal experimental. Els esquemes de les capes superiors il·lustren la configuració experimental per a cada pas. b, Els xips híbrids (esquema esquerre) poden conduir a la morfogènesi 3D de cèl·lules epitelials organoides amb vistes de microscòpia confocal de dalt a baix. preses a diferents posicions Z (superior, mitjana i inferior; vegeu l'esquema dret i les línies de punts corresponents). van mostrar característiques morfològiques òbvies. F-actina (cian), nucli (gris). c, Micrografies confocals de fluorescència (vista angular 3D) de cèl·lules epitelials derivades d'organoides cultivades en Transwell estàtic (TW; inserit dins del requadre blanc discontinu) versus xip híbrid (vista completa més gran) comparant la morfologia 2D i 3D, respectivament. Un parell de vistes transversals verticals 2D (inserides a la cantonada superior dreta; "XZ") també mostren característiques 2D i 3D. Barra d'escala, 100 µm. c Reimprès amb permís de la referència. 4. Elsevier.
Els controls es poden preparar cultivant les mateixes cèl·lules (Caco-2 o cèl·lules epitelials organoides intestinals) en monocapes bidimensionals en condicions de cultiu estàtic convencionals. En particular, la depleció de nutrients pot produir-se a causa de la capacitat de volum limitada dels microcanals (és a dir, ~4 µL al canal superior en el disseny original de xip intestinal). Per tant, també es pot comparar la morfologia epitelial abans i després de l'aplicació del flux basolateral.
El procés de litografia suau s'ha de dur a terme en una sala blanca. Per a cada capa del xip (capes superiors i inferiors i membranes) i xips híbrids, es van utilitzar diferents fotomàscares i es van fabricar en oblies de silici separades perquè les altures dels microcanals eren diferents. Les altures objectiu dels microcanals superior i inferior de l'intestí del xip són de 500 µm i 200 µm, respectivament. L'alçada objectiu del canal del xip híbrid és de 200 µm.
Col·loqueu una oblia de silici de 3 polzades en un plat amb acetona. Remeneu suaument la placa durant 30 segons i després assequeu l'oblia a l'aire. Transferiu l'oblia a un plat amb IPA i després gireu la placa durant 30 segons per netejar-la.
Opcionalment, es pot utilitzar una solució de piranya (barreja de peròxid d'hidrogen i àcid sulfúric concentrat, 1:3 (vol/vol)) per maximitzar l'eliminació de residus orgànics de la superfície de la oblia de silici.
La solució de piranya és extremadament corrosiva i genera calor. Calen precaucions de seguretat addicionals. Per a l'eliminació de residus, deixeu que la solució es refredi i transferiu-la a un contenidor de residus net i sec. Utilitzeu contenidors secundaris i etiqueteu correctament els contenidors de residus. Seguiu les directrius de seguretat de la instal·lació per obtenir procediments més detallats.
Deshidrateu les oblies col·locant-les en una placa calenta a 200 °C durant 10 minuts. Després de la deshidratació, l'oblia es va sacsejar cinc vegades a l'aire per refredar-la.
Aboqueu ~10 g de fotorresina SU-8 2100 al centre de l'oblia de silici netejada. Utilitzeu pinces per estendre la fotorresina uniformement sobre l'oblia. De tant en tant, col·loqueu l'oblia en una placa calenta a 65 °C per fer que la fotorresina sigui menys enganxosa i més fàcil d'escampar. No col·loqueu l'oblia directament sobre la placa calenta.
El SU-8 es va distribuir uniformement a l'oblea mitjançant un recobriment per rotació. Programeu una rotació entrant del SU-8 durant 5-10 s per propagar-se a 500 rpm amb una acceleració de 100 rpm/s. Ajusteu el gir principal per a un patró de gruix de 200 µm a 1.500 rpm o aconseguiu un gruix de 250 µm (fent una alçada de 500 µm per a la capa superior de l'intestí del xip; vegeu "Passos crítics" a continuació) ajustat a una acceleració de 300 rpm/s 30 segons a 1.200 rpm.
La velocitat de gir principal es pot ajustar segons el gruix objectiu del patró SU-8 a la oblia de silici.
Per fabricar patrons de SU-8 de 500 µm d'alçada per a la capa superior de l'intestí del xip, els passos de recobriment per centrifugació i cocció suau d'aquest requadre (passos 7 i 8) es van repetir seqüencialment (vegeu el pas 9) per produir dues capes de 250 µm de gruix de SU-8, que es poden superposar i unir mitjançant exposició UV al pas 12 d'aquest requadre, creant una capa de 500 µm d'alçada.
Coure suaument les oblies recobertes de SU-8 col·locant-les amb cura en una placa calenta a 65 °C durant 5 minuts, després canviar la configuració a 95 °C i incubar durant 40 minuts més.
Per aconseguir una alçada de 500 μm del patró SU-8 al microcanal superior, repetiu els passos 7 i 8 per generar dues capes SU-8 de 250 μm de gruix.
Amb l'alineador de màscares UV, realitzeu una prova de làmpada segons les instruccions del fabricant per calcular el temps d'exposició de l'oblea. (temps d'exposició, ms) = (dosi d'exposició, mJ/cm2)/(potència de la làmpada, mW/cm2).
Després de determinar el temps d'exposició, col·loqueu la fotomàscara al portamàscara de l'alineador de màscares UV i col·loqueu la fotomàscara a l'oblia recoberta de SU-8.
Col·loqueu la superfície impresa de la fotomàscara directament sobre el costat recobert de SU-8 de la oblia de silici per minimitzar la dispersió UV.
Exposeu l'oblia recoberta de SU-8 i la fotomàscara verticalment a 260 mJ/cm2 de llum UV durant el temps d'exposició predeterminat (vegeu el pas 10 d'aquest requadre).
Després de l'exposició als raigs UV, les oblies de silici recobertes de SU-8 es van coure a 65 °C durant 5 minuts i a 95 °C durant 15 minuts a cada placa calenta per fabricar patrons amb una alçada de 200 μm. Es va ampliar el temps de postcocció a 95 °C a 30 minuts per fabricar patrons amb una alçada de 500 μm.
El revelador s'aboca en un recipient de vidre i es col·loca la galeta cuita al recipient. El volum de revelador SU-8 pot variar segons la mida de la placa de vidre. Assegureu-vos d'utilitzar prou revelador SU-8 per eliminar completament el SU-8 no exposat. Per exemple, quan utilitzeu un recipient de vidre de 150 mm de diàmetre amb una capacitat d'1 L, utilitzeu ~300 mL de revelador SU-8. Reveleu el motlle durant 25 minuts amb una rotació suau ocasional.
Esbandiu el motlle desenvolupat amb ~10 mL de revelador fresc seguit d'IPA ruixant la solució amb una pipeta.
Col·loqueu l'oblia en un netejador de plasma i exposeu-la a plasma d'oxigen (gas atmosfèric, pressió objectiu 1 × 10−5 Torr, potència 125 W) durant 1,5 min.
Col·loqueu l'oblia en un dessecador de buit amb un portaobjectes de vidre a l'interior. Les oblies i els portaobjectes es poden col·locar un al costat de l'altre. Si el dessecador de buit està dividit en diverses capes per una placa, col·loqueu els portaobjectes a la cambra inferior i les oblies a la cambra superior. Deixeu caure 100 μL de solució de tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil)silà sobre un portaobjectes de vidre i apliqueu buit per a la silanització.
Descongeleu un vial de cèl·lules Caco-2 congelades en un bany d'aigua a 37 °C i, a continuació, transferiu les cèl·lules descongelades a un matràs T75 que conté 15 mL de medi Caco-2 preescalfat a 37 °C.
Per passar cèl·lules Caco-2 a una confluència d'aproximadament el 90%, primer escalfeu el medi Caco-2, PBS i tripsina al 0,25%/EDTA 1 mM en un bany d'aigua a 37 °C.
Aspireu el medi mitjançant aspiració al buit. Renteu les cèl·lules dues vegades amb 5 mL de PBS calent repetint l'aspiració al buit i afegint PBS fresc.