Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir el suport continu, renderem el lloc web sense estils ni JavaScript.
L'evolució dels paràsits microbians implica una contraacció entre la selecció natural, que fa que els paràsits millorin, i la deriva genètica, que fa que els paràsits perdin gens i acumulin mutacions nocives. Aquí, per tal d'entendre com es produeix aquesta contraacció a escala d'una sola macromolècula, descrivim l'estructura crio-EM del ribosoma d'Encephalitozoon cuniculi, un organisme eucariota amb un dels genomes més petits de la natura. La reducció extrema de l'ARN ribosòmic en els ribosomes d'E. cuniculi s'acompanya de canvis estructurals sense precedents, com ara l'evolució d'enllaçadors d'ARN ribosòmic fusionats prèviament desconeguts i ARN ribosòmic sense protuberàncies. A més, el ribosoma d'E. cuniculi va sobreviure a la pèrdua de fragments i proteïnes d'ARN ribosòmic desenvolupant la capacitat d'utilitzar petites molècules com a imitacions estructurals de fragments i proteïnes d'ARN ribosòmic degradats. En general, mostrem que les estructures moleculars que durant molt de temps es pensava que eren reduïdes, degenerades i subjectes a mutacions debilitants tenen una sèrie de mecanismes compensatoris que les mantenen actives malgrat les contraccions moleculars extremes.
Com que la majoria de grups de paràsits microbians tenen eines moleculars úniques per explotar els seus hostes, sovint hem de desenvolupar diferents teràpies per a diferents grups de paràsits1,2. Tanmateix, noves evidències suggereixen que alguns aspectes de l'evolució dels paràsits són convergents i en gran part predictibles, cosa que indica una base potencial per a intervencions terapèutiques àmplies en paràsits microbians3,4,5,6,7,8,9.
Treballs anteriors han identificat una tendència evolutiva comuna en els paràsits microbians anomenada reducció del genoma o decadència del genoma10,11,12,13. La investigació actual mostra que quan els microorganismes abandonen el seu estil de vida lliure i es converteixen en paràsits intracel·lulars (o endosimbionts), els seus genomes experimenten metamorfosis lentes però sorprenents durant milions d'anys9,11. En un procés conegut com a decadència del genoma, els paràsits microbians acumulen mutacions nocives que converteixen molts gens anteriorment importants en pseudogens, cosa que provoca una pèrdua gradual de gens i un col·lapse mutacional14,15. Aquest col·lapse pot destruir fins al 95% dels gens dels organismes intracel·lulars més antics en comparació amb les espècies de vida lliure estretament relacionades. Per tant, l'evolució dels paràsits intracel·lulars és un estira-i-arronsa entre dues forces oposades: la selecció natural darwiniana, que condueix a la millora dels paràsits, i el col·lapse del genoma, que llença els paràsits a l'oblit. Com el paràsit va aconseguir sortir d'aquest estira-i-arronsa i retenir l'activitat de la seva estructura molecular encara no està clar.
Tot i que el mecanisme de deteriorament del genoma no es coneix completament, sembla que es produeix principalment a causa de la deriva genètica freqüent. Com que els paràsits viuen en poblacions petites, asexuals i genèticament limitades, no poden eliminar eficaçment les mutacions nocives que de vegades es produeixen durant la replicació de l'ADN. Això condueix a l'acumulació irreversible de mutacions nocives i a la reducció del genoma del paràsit. Com a resultat, el paràsit no només perd gens que ja no són necessaris per a la seva supervivència en l'entorn intracel·lular. És la incapacitat de les poblacions de paràsits per eliminar eficaçment les mutacions nocives esporàdiques el que fa que aquestes mutacions s'acumulin per tot el genoma, inclosos els seus gens més importants.
Gran part de la nostra comprensió actual de la reducció del genoma es basa únicament en comparacions de seqüències genòmiques, amb menys atenció als canvis en les molècules reals que realitzen funcions d'ordre intern i serveixen com a possibles dianes farmacològiques. Estudis comparatius han demostrat que la càrrega de mutacions microbianes intracel·lulars nocives sembla predisposar les proteïnes i els àcids nucleics a plegar-se malament i agregar-se, fent-los més dependents de les chaperones i hipersensibles a la calor19,20,21,22,23. A més, diversos paràsits —evolució independent de vegades separats per fins a 2.500 milions d'anys— van experimentar una pèrdua similar de centres de control de qualitat en la seva síntesi de proteïnes5,6 i en els mecanismes de reparació de l'ADN24. Tanmateix, se sap poc sobre l'impacte de l'estil de vida intracel·lular en totes les altres propietats de les macromolècules cel·lulars, inclosa l'adaptació molecular a una càrrega creixent de mutacions nocives.
En aquest treball, per tal de comprendre millor l'evolució de les proteïnes i els àcids nucleics dels microorganismes intracel·lulars, hem determinat l'estructura dels ribosomes del paràsit intracel·lular Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi és un organisme semblant a un fong que pertany a un grup de microsporidis paràsits que tenen genomes eucariotes inusualment petits i, per tant, s'utilitzen com a organismes model per estudiar la degradació del genoma25,26,27,28,29,30. Recentment, s'ha determinat l'estructura dels ribosomes crio-EM per a genomes moderadament reduïts de Microsporidia, Paranosema locustae i Vairimorpha necatrix31,32 (genoma d'aproximadament 3,2 Mb). Aquestes estructures suggereixen que una certa pèrdua d'amplificació de l'ARNr es compensa amb el desenvolupament de nous contactes entre proteïnes ribosòmiques veïnes o l'adquisició de noves proteïnes ribosòmiques msL131,32. L'espècie Encephalitozoon (genoma ~2,5 milions de pb), juntament amb el seu parent més proper Ordospora, demostren el grau màxim de reducció del genoma en els eucariotes: tenen menys de 2000 gens codificants de proteïnes, i s'espera que els seus ribosomes no només estiguin desproveïts de fragments d'expansió d'ARNr (fragments d'ARNr que distingeixen els ribosomes eucariotes dels ribosomes bacterians), sinó que també tinguin quatre proteïnes ribosòmiques a causa de la seva manca d'homòlegs en el genoma d'E. cuniculi26,27,28. Per tant, vam concloure que el ribosoma d'E. cuniculi pot revelar estratègies prèviament desconegudes per a l'adaptació molecular a la degradació del genoma.
La nostra estructura crio-EM representa el ribosoma citoplasmàtic eucariota més petit que s'ha caracteritzat i proporciona informació sobre com el grau final de reducció del genoma afecta l'estructura, l'assemblatge i l'evolució de la maquinària molecular que és integral a la cèl·lula. Vam descobrir que el ribosoma d'E. cuniculi viola molts dels principis àmpliament conservats del plegament de l'ARN i l'assemblatge dels ribosomes, i vam descobrir una nova proteïna ribosòmica prèviament desconeguda. De manera força inesperada, mostrem que els ribosomes de microsporidia han evolucionat la capacitat d'unir-se a petites molècules i plantegem la hipòtesi que els truncaments de l'ARNr i les proteïnes desencadenen innovacions evolutives que, en última instància, poden conferir qualitats útils al ribosoma.
Per millorar la nostra comprensió de l'evolució de les proteïnes i els àcids nucleics en organismes intracel·lulars, vam decidir aïllar les espores d'E. cuniculi de cultius de cèl·lules de mamífers infectades per tal de purificar els seus ribosomes i determinar l'estructura d'aquests ribosomes. És difícil obtenir un gran nombre de microsporídies paràsites perquè les microsporídies no es poden cultivar en un medi nutritiu. En canvi, creixen i es reprodueixen només dins de la cèl·lula hoste. Per tant, per obtenir biomassa d'E. cuniculi per a la purificació de ribosomes, vam infectar la línia cel·lular de ronyó de mamífer RK13 amb espores d'E. cuniculi i vam cultivar aquestes cèl·lules infectades durant diverses setmanes per permetre que E. cuniculi creixés i es multipliqués. Utilitzant una monocapa de cèl·lules infectades d'aproximadament mig metre quadrat, vam poder purificar uns 300 mg d'espores de Microsporídies i utilitzar-les per aïllar ribosomes. A continuació, vam interrompre les espores purificades amb perles de vidre i vam aïllar els ribosomes crus mitjançant el fraccionament gradual amb polietilenglicol dels lisats. Això ens va permetre obtenir aproximadament 300 µg de ribosomes d'E. cuniculi en brut per a l'anàlisi estructural.
A continuació, vam recollir imatges de crio-EM utilitzant les mostres de ribosomes resultants i vam processar aquestes imatges utilitzant màscares corresponents a la subunitat ribosòmica gran, el cap de la subunitat petita i la subunitat petita. Durant aquest procés, vam recollir imatges d'unes 108.000 partícules ribosòmiques i vam calcular imatges de crio-EM amb una resolució de 2,7 Å (Figures suplementàries 1-3). A continuació, vam utilitzar imatges de crio-EM per modelar l'ARNr, la proteïna ribosòmica i el factor d'hibernació Mdf1 associats amb els ribosomes d'E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Estructura del ribosoma d'E. cuniculi en complex amb el factor d'hibernació Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mapa del factor d'hibernació Mdf1 associat amb el ribosoma d'E. cuniculi. c Mapa de l'estructura secundària que compara l'ARNr recuperat en espècies de microsporidians amb estructures ribosòmiques conegudes. Els panells mostren la ubicació dels fragments d'ARNr amplificats (ES) i els llocs actius dels ribosomes, incloent-hi el lloc de descodificació (DC), el bucle de sarcinicina (SRL) i el centre de peptidil transferasa (PTC). d La densitat d'electrons corresponent al centre de peptidil transferasa del ribosoma d'E. cuniculi suggereix que aquest lloc catalític té la mateixa estructura en el paràsit d'E. cuniculi i els seus hostes, incloent-hi H. sapiens. e, f La densitat d'electrons corresponent del centre de descodificació (e) i l'estructura esquemàtica del centre de descodificació (f) indiquen que E. cuniculi té residus U1491 en lloc d'A1491 (numeració d'E. coli) en molts altres eucariotes. Aquest canvi suggereix que l'E. cuniculi pot ser sensible als antibiòtics que es dirigeixen a aquest lloc actiu.
A diferència de les estructures prèviament establertes dels ribosomes de V. necatrix i P. locustae (ambdues estructures representen la mateixa família de microsporídies Nosematidae i són molt similars entre si), 31,32 els ribosomes d'E. cuniculi experimenten nombrosos processos de fragmentació de l'ARNr i les proteïnes. Desnaturalització addicional (Figures suplementàries 4-6). En l'ARNr, els canvis més sorprenents van incloure la pèrdua completa del fragment d'ARNr 25S amplificat ES12L i la degeneració parcial de les hèlixs h39, h41 i H18 (Fig. 1c, Fig. suplementària 4). Entre les proteïnes ribosòmiques, els canvis més sorprenents van incloure la pèrdua completa de la proteïna eS30 i l'escurçament de les proteïnes eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 i ​​eS7 (Figures suplementàries 4, 5).
Així doncs, la reducció extrema dels genomes de les espècies d'Encephalotozoon/Ordospora es reflecteix en l'estructura dels seus ribosomes: els ribosomes d'E. cuniculi experimenten la pèrdua més dràstica de contingut proteic en els ribosomes citoplasmàtics eucariotes subjectes a caracterització estructural, i ni tan sols tenen aquells fragments d'ARNr i proteïnes que es conserven àmpliament no només en els eucariotes, sinó també en els tres dominis de la vida. L'estructura del ribosoma d'E. cuniculi proporciona el primer model molecular per a aquests canvis i revela esdeveniments evolutius que han estat passats per alt tant per la genòmica comparativa com per els estudis d'estructura biomolecular intracel·lular (figura suplementària 7). A continuació, descrivim cadascun d'aquests esdeveniments juntament amb els seus probables orígens evolutius i el seu impacte potencial en la funció dels ribosomes.
Aleshores vam descobrir que, a més de grans truncaments de rRNA, els ribosomes d'E. cuniculi tenen variacions de rRNA en un dels seus llocs actius. Tot i que el centre peptidil transferasa del ribosoma d'E. cuniculi té la mateixa estructura que altres ribosomes eucariotes (Fig. 1d), el centre de descodificació difereix a causa de la variació de seqüència al nucleòtid 1491 (numeració d'E. coli, Fig. 1e, f). Aquesta observació és important perquè el lloc de descodificació dels ribosomes eucariotes normalment conté residus G1408 i A1491 en comparació amb els residus de tipus bacterià A1408 i G1491. Aquesta variació subjau a la diferent sensibilitat dels ribosomes bacterians i eucariotes a la família d'aminoglicòsids d'antibiòtics ribosòmics i altres molècules petites que es dirigeixen al lloc de descodificació. Al lloc de descodificació del ribosoma d'E. cuniculi, el residu A1491 es va substituir per U1491, creant potencialment una interfície d'unió única per a molècules petites que es dirigeixen a aquest lloc actiu. La mateixa variant A14901 també és present en altres microsporídies com ara P. locustae i V. necatrix, cosa que suggereix que està molt estesa entre les espècies de microsporídies (Fig. 1f).
Com que les nostres mostres de ribosomes d'E. cuniculi es van aïllar d'espores metabòlicament inactives, vam provar el mapa crio-EM d'E. cuniculi per a la unió de ribosomes descrita anteriorment en condicions d'estrès o inanició. Factors d'hibernació 31,32,36,37, 38. Vam comparar l'estructura prèviament establerta del ribosoma hibernant amb el mapa crio-EM del ribosoma d'E. cuniculi. Per a l'acoblament, es van utilitzar ribosomes de S. cerevisiae en complex amb el factor d'hibernació Stm138, ribosomes de locust en complex amb el factor Lso232 i ribosomes de V. necatrix en complex amb els factors Mdf1 i Mdf231. Al mateix temps, vam trobar que la densitat crio-EM corresponent al factor de repòs Mdf1. De manera similar a la unió de Mdf1 al ribosoma de V. necatrix, Mdf1 també s'uneix al ribosoma d'E. cuniculi, on bloqueja el lloc E del ribosoma, cosa que possiblement ajuda a fer que els ribosomes estiguin disponibles quan les espores del paràsit es tornen metabòlicament inactives després de la inactivació corporal (Figura 2).
Mdf1 bloqueja el lloc E del ribosoma, cosa que sembla ajudar a inactivar el ribosoma quan les espores del paràsit es tornen metabòlicament inactives. En l'estructura del ribosoma d'E. cuniculi, vam descobrir que Mdf1 forma un contacte prèviament desconegut amb la tija del ribosoma L1, la part del ribosoma que facilita l'alliberament de l'ARNt desacetilat del ribosoma durant la síntesi de proteïnes. Aquests contactes suggereixen que Mdf1 es dissocia del ribosoma utilitzant el mateix mecanisme que l'ARNt desacetilat, cosa que proporciona una possible explicació de com el ribosoma elimina Mdf1 per reactivar la síntesi de proteïnes.
Tanmateix, la nostra estructura va revelar un contacte desconegut entre Mdf1 i la pota L1 del ribosoma (la part del ribosoma que ajuda a alliberar l'ARNt desacetilat del ribosoma durant la síntesi de proteïnes). En particular, Mdf1 utilitza els mateixos contactes que el segment de colze de la molècula d'ARNt desacetilat (Fig. 2). Aquest model molecular, prèviament desconegut, va mostrar que Mdf1 es dissocia del ribosoma utilitzant el mateix mecanisme que l'ARNt desacetilat, la qual cosa explica com el ribosoma elimina aquest factor d'hibernació per reactivar la síntesi de proteïnes.
En construir el model d'ARNr, vam descobrir que el ribosoma d'E. cuniculi té fragments d'ARNr plegats de manera anormal, que vam anomenar ARNr fusionat (Fig. 3). En els ribosomes que abasten els tres dominis de la vida, l'ARNr es plega en estructures en què la majoria de les bases d'ARNr s'aparellen i es pleguen entre si o interactuen amb proteïnes ribosòmiques38,39,40. Tanmateix, en els ribosomes d'E. cuniculi, els ARNr semblen violar aquest principi de plegament convertint algunes de les seves hèlixs en regions d'ARNr desplegades.
Estructura de l'hèlix H18 25S de l'ARNr en S. cerevisiae, V. necatrix i E. cuniculi. Normalment, en els ribosomes que abasten els tres dominis vitals, aquest enllaçador s'enrotlla en una hèlix d'ARN que conté de 24 a 34 residus. En els microsporídies, en canvi, aquest enllaçador d'ARNr es redueix gradualment a dos enllaçadors rics en uridina monocatenaris que contenen només 12 residus. La majoria d'aquests residus estan exposats a dissolvents. La figura mostra que els microsporídies paràsits semblen violar els principis generals del plegament de l'ARNr, on les bases de l'ARNr solen estar acoblades a altres bases o implicades en interaccions ARNr-proteïna. En els microsporídies, alguns fragments d'ARNr adopten un plegament desfavorable, en què l'anterior hèlix d'ARNr es converteix en un fragment monocatenari allargat gairebé en línia recta. La presència d'aquestes regions inusuals permet que l'ARNr dels microsporídies s'uneixi a fragments d'ARNr distants utilitzant un nombre mínim de bases d'ARN.
L'exemple més sorprenent d'aquesta transició evolutiva es pot observar en l'hèlix H18 25S de l'ARNr (Fig. 3). En espècies des d'E. coli fins als humans, les bases d'aquesta hèlix d'ARNr contenen de 24 a 32 nucleòtids, formant una hèlix lleugerament irregular. En estructures ribosòmiques identificades prèviament de V. necatrix i P. locustae,31,32 les bases de l'hèlix H18 estan parcialment desenrotllades, però es conserva l'aparellament de bases de nucleòtids. Tanmateix, a E. cuniculi aquest fragment d'ARNr es converteix en els enllaçadors més curts 228UUUGU232 i 301UUUUUUUUUU307. A diferència dels fragments d'ARNr típics, aquests enllaçadors rics en uridina no s'enrotllen ni fan contacte extensiu amb les proteïnes ribosòmiques. En canvi, adopten estructures obertes al dissolvent i completament desplegades en què les cadenes d'ARNr s'estenen gairebé rectes. Aquesta conformació estirada explica com E. cuniculi utilitza només 12 bases d'ARN per omplir el buit de 33 Å entre les hèlixs d'ARN ribosòmiques H16 i H18, mentre que altres espècies requereixen almenys el doble de bases d'ARN ribosòmiques per omplir el buit.
Així doncs, podem demostrar que, mitjançant un plegament energèticament desfavorable, els microsporídies paràsits han desenvolupat una estratègia per contraure fins i tot aquells segments d'ARNr que romanen àmpliament conservats entre espècies en els tres dominis de la vida. Pel que sembla, acumulant mutacions que transformen les hèlixs d'ARNr en enllaços poli-U curts, E. cuniculi pot formar fragments d'ARNr inusuals que contenen el mínim de nucleòtids possible per a la lligadura de fragments d'ARNr distals. Això ajuda a explicar com els microsporídies van aconseguir una reducció dràstica de la seva estructura molecular bàsica sense perdre la seva integritat estructural i funcional.
Una altra característica inusual de l'ARNr d'E. cuniculi és l'aparició d'ARNr sense engruiximents (Fig. 4). Els protuberàncies són nucleòtids sense parells de bases que es giren fora de l'hèlix d'ARN en lloc d'amagar-s'hi. La majoria de les protuberàncies de l'ARNr actuen com a adhesius moleculars, ajudant a unir-se a proteïnes ribosòmiques adjacents o altres fragments d'ARNr. Algunes de les protuberàncies actuen com a frontisses, permetent que l'hèlix d'ARNr es flexioni i es plegui de manera òptima per a una síntesi de proteïnes productiva 41.
a Una protusió d'ARNr (numeració de S. cerevisiae) és absent de l'estructura dels ribosomes d'E. cuniculi, però és present a la majoria dels altres eucariotes b Ribosomes interns d'E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens i E. cuniculi. Els paràsits no tenen molts dels protuberàncies d'ARNr antigues i altament conservades. Aquests engruiximents estabilitzen l'estructura dels ribosomes; per tant, la seva absència en els microsporídies indica una estabilitat reduïda del plegament de l'ARNr en els paràsits microsporídies. La comparació amb les tiges P (tiges L7/L12 en bacteris) mostra que la pèrdua de protuberàncies d'ARNr de vegades coincideix amb l'aparició de noves protuberàncies al costat de les protuberàncies perdudes. L'hèlix H42 de l'ARNr 23S/28S té una protuberància antiga (U1206 en Saccharomyces cerevisiae) que s'estima que té almenys 3.500 milions d'anys a causa de la seva protecció en tres dominis de la vida. En els microsporídies, aquesta protuberància s'elimina. No obstant això, va aparèixer un nou bony al costat del bony perdut (A1306 a E. cuniculi).
Sorprenentment, vam descobrir que els ribosomes d'E. cuniculi no presenten la majoria dels protuberàncies de l'ARN ribosòmic que es troben en altres espècies, incloent-hi més de 30 protuberàncies conservades en altres eucariotes (Fig. 4a). Aquesta pèrdua elimina molts contactes entre les subunitats ribosòmiques i les hèlixs d'ARN ribosòmic adjacents, de vegades creant grans buits dins del ribosoma, fent que el ribosoma d'E. cuniculi sigui més porós en comparació amb els ribosomes més tradicionals (Fig. 4b). Cal destacar que vam descobrir que la majoria d'aquests protuberàncies també es perdien a les estructures de ribosomes de V. necatrix i P. locustae identificades anteriorment, que havien estat passades per alt per anàlisis estructurals anteriors31,32.
De vegades, la pèrdua de protuberàncies de l'ARN ribosòmic s'acompanya del desenvolupament de noves protuberàncies al costat de la protuberància perduda. Per exemple, la tija P ribosòmica conté una protuberància U1208 (en Saccharomyces cerevisiae) que va sobreviure des de l'E. coli fins als humans i, per tant, s'estima que té 3.500 milions d'anys. Durant la síntesi de proteïnes, aquesta protuberància ajuda la tija P a moure's entre conformacions obertes i tancades perquè el ribosoma pugui reclutar factors de traducció i lliurar-los al lloc actiu. En els ribosomes de l'E. cuniculi, aquest engruiximent és absent; tanmateix, un nou engruiximent (G883) localitzat només en tres parells de bases pot contribuir a la restauració de la flexibilitat òptima de la tija P (Fig. 4c).
Les nostres dades sobre l'ARN ribosòmic sense protuberàncies suggereixen que la minimització de l'ARN ribosòmic no es limita a la pèrdua d'elements d'ARN ribosòmic a la superfície del ribosoma, sinó que també pot implicar el nucli del ribosoma, creant un defecte molecular específic del paràsit que no s'ha descrit en cèl·lules de vida lliure. S'observen espècies vives.
Després de modelar les proteïnes ribosòmiques canòniques i l'ARN ribosòmic, vam descobrir que els components ribosòmics convencionals no poden explicar les tres parts de la imatge crio-EM. Dos d'aquests fragments són molècules petites (Fig. 5, Fig. suplementària 8). El primer segment està intercalat entre les proteïnes ribosòmiques uL15 i eL18 en una posició que normalment ocupa l'extrem C-terminal d'eL18, que s'escurça a E. cuniculi. Tot i que no podem determinar la identitat d'aquesta molècula, la mida i la forma d'aquesta illa de densitat s'expliquen bé per la presència de molècules d'espermidina. La seva unió al ribosoma s'estabilitza mitjançant mutacions específiques de microsporídies a les proteïnes uL15 (Asp51 i Arg56), que semblen augmentar l'afinitat del ribosoma per aquesta petita molècula, ja que permeten que uL15 embolcalli la petita molècula en una estructura ribosòmica. Figura suplementària 2). 8, dades addicionals 1, 2).
Imatges crioelectròniques que mostren la presència de nucleòtids fora de la ribosa unida al ribosoma d'E. cuniculi. En el ribosoma d'E. cuniculi, aquest nucleòtid ocupa el mateix lloc que el nucleòtid A3186 de l'ARNr 25S (numeració de Saccharomyces cerevisiae) en la majoria dels altres ribosomes eucariotes. b En l'estructura ribosòmica d'E. cuniculi, aquest nucleòtid es troba entre les proteïnes ribosòmiques uL9 i eL20, estabilitzant així el contacte entre les dues proteïnes. cd Anàlisi de conservació de la seqüència d'eL20 entre espècies de microsporídies. L'arbre filogenètic de les espècies de Microsporídies (c) i l'alineació de seqüències múltiples de la proteïna eL20 (d) mostren que els residus d'unió a nucleòtids F170 i K172 es conserven en la majoria dels Microsporídies típics, amb l'excepció de S. lophii, amb l'excepció dels Microsporídies de ramificació primerenca, que van conservar l'extensió de l'ARNr ES39L. e Aquesta figura mostra que els residus d'unió a nucleòtids F170 i K172 només són presents a eL20 del genoma de microsporídies altament reduït, però no en altres eucariotes. En general, aquestes dades suggereixen que els ribosomes microsporídies han desenvolupat un lloc d'unió a nucleòtids que sembla unir-se a molècules d'AMP i utilitzar-les per estabilitzar les interaccions proteïna-proteïna en l'estructura ribosòmica. L'alta conservació d'aquest lloc d'unió en Microsporídies i la seva absència en altres eucariotes suggereix que aquest lloc pot proporcionar un avantatge de supervivència selectiva per als Microsporídies. Per tant, la butxaca d'unió a nucleòtids al ribosoma de microsporídies no sembla ser una característica degenerada o una forma final de degradació de l'ARN ribosòmic com s'ha descrit anteriorment, sinó més aviat una innovació evolutiva útil que permet al ribosoma de microsporídies unir-se directament a petites molècules, utilitzant-les com a blocs de construcció moleculars per als ribosomes. Aquest descobriment fa que el ribosoma de microsporídies sigui l'únic ribosoma conegut que utilitza un sol nucleòtid com a bloc de construcció estructural. f Via evolutiva hipotètica derivada de la unió a nucleòtids.
La segona densitat de baix pes molecular es troba a la interfície entre les proteïnes ribosòmiques uL9 i eL30 (Fig. 5a). Aquesta interfície s'havia descrit anteriorment a l'estructura del ribosoma de Saccharomyces cerevisiae com a lloc d'unió per al nucleòtid 25S de l'ARNr A3186 (part de l'extensió de l'ARNr ES39L)38. Es va demostrar que en els ribosomes ES39L degenerats de P. locustae, aquesta interfície s'uneix a un únic nucleòtid desconegut31, i se suposa que aquest nucleòtid és una forma final reduïda de l'ARNr, en què la longitud de l'ARNr és d'aproximadament 130-230 bases. L'ES39L es redueix a un únic nucleòtid32,43. Les nostres imatges de crio-EM donen suport a la idea que la densitat es pot explicar per nucleòtids. Tanmateix, la resolució més alta de la nostra estructura va mostrar que aquest nucleòtid és una molècula extraribosòmica, possiblement AMP (Fig. 5a, b).
A continuació, ens vam preguntar si el lloc d'unió de nucleòtids apareixia al ribosoma d'E. cuniculi o si existia prèviament. Com que la unió de nucleòtids està mediada principalment pels residus Phe170 i Lys172 de la proteïna ribosòmica eL30, vam avaluar la conservació d'aquests residus en 4396 eucariotes representatius. Com en el cas d'uL15 anterior, vam trobar que els residus Phe170 i Lys172 només estan altament conservats en Microsporidia típica, però absents en altres eucariotes, inclosos Microsporidia atípica Mitosporidium i Amphiamblys, en què el fragment d'ARNr ES39L no es redueix 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
En conjunt, aquestes dades donen suport a la idea que E. cuniculi i possiblement altres microsporidis canònics han desenvolupat la capacitat de capturar eficientment un gran nombre de petits metabòlits a l'estructura del ribosoma per compensar la disminució dels nivells de rRNA i proteïnes. En fer-ho, han desenvolupat una capacitat única per unir-se a nucleòtids fora del ribosoma, demostrant que les estructures moleculars parasitàries compensen capturant abundants petits metabòlits i utilitzant-los com a imitacions estructurals de fragments de ARN i proteïnes degradats.
La tercera part no simulada del nostre mapa crio-EM, que es troba a la subunitat ribosòmica gran. La resolució relativament alta (2,6 Å) del nostre mapa suggereix que aquesta densitat pertany a proteïnes amb combinacions úniques de residus de cadena lateral gran, cosa que ens va permetre identificar aquesta densitat com una proteïna ribosòmica prèviament desconeguda que vam identificar com a msL2 (proteïna L2 específica de microsporidia) (mètodes, figura 6). La nostra cerca d'homologia va mostrar que msL2 es conserva al clade Microsporidia del gènere Encephaliter i Orosporidium, però està absent en altres espècies, incloent-hi altres Microsporidia. A l'estructura ribosòmica, msL2 ocupa un buit format per la pèrdua de l'ARN ribosòmic ES31L estès. En aquest buit, msL2 ajuda a estabilitzar el plegament de l'ARN ribosòmic i pot compensar la pèrdua d'ES31L (Figura 6).
a Densitat electrònica i model de la proteïna ribosòmica msL2 específica de Microsporidies que es troba als ribosomes d'E. cuniculi. b La majoria dels ribosomes eucariotes, inclòs el ribosoma 80S de Saccharomyces cerevisiae, tenen una pèrdua d'amplificació d'ARN ribosòmic ES19L en la majoria d'espècies de microsporidies. L'estructura prèviament establerta del ribosoma de microsporidies de V. necatrix suggereix que la pèrdua d'ES19L en aquests paràsits es compensa amb l'evolució de la nova proteïna ribosòmica msL1. En aquest estudi, vam trobar que el ribosoma d'E. cuniculi també va desenvolupar una proteïna imitadora d'ARN ribosòmic addicional com a compensació aparent per la pèrdua d'ES19L. Tanmateix, msL2 (actualment anotat com la hipotètica proteïna ECU06_1135) i msL1 tenen orígens estructurals i evolutius diferents. c Aquest descobriment de la generació de proteïnes ribosòmiques msL1 i msL2 evolutivament no relacionades suggereix que si els ribosomes acumulen mutacions perjudicials en el seu ARNr, poden assolir nivells de diversitat composicional sense precedents fins i tot en un petit subconjunt d'espècies estretament relacionades. Aquest descobriment podria ajudar a aclarir l'origen i l'evolució del ribosoma mitocondrial, que és conegut pel seu ARNr altament reduït i la seva variabilitat anormal en la composició de proteïnes entre espècies.
A continuació, vam comparar la proteïna msL2 amb la proteïna msL1 descrita anteriorment, l'única proteïna ribosòmica específica de microsporídies coneguda que es troba al ribosoma de V. necatrix. Volíem comprovar si msL1 i msL2 estan evolutivament relacionats. La nostra anàlisi va mostrar que msL1 i msL2 ocupen la mateixa cavitat en l'estructura ribosòmica, però tenen estructures primàries i terciàries diferents, cosa que indica el seu origen evolutiu independent (Fig. 6). Així, el nostre descobriment de msL2 proporciona proves que grups d'espècies eucariotes compactes poden evolucionar independentment proteïnes ribosòmiques estructuralment diferents per compensar la pèrdua de fragments d'ARNr. Aquesta troballa és notable, ja que la majoria dels ribosomes eucariotes citoplasmàtics contenen una proteïna invariant, inclosa la mateixa família de 81 proteïnes ribosòmiques. L'aparició de msL1 i msL2 en diversos clades de microsporídies en resposta a la pèrdua de segments d'ARNr estesos suggereix que la degradació de l'arquitectura molecular del paràsit fa que els paràsits busquin mutacions compensatòries, cosa que eventualment pot conduir a la seva adquisició en diferents estructures de poblacions de paràsits.
Finalment, quan el nostre model va estar completat, vam comparar la composició del ribosoma d'E. cuniculi amb la predita a partir de la seqüència del genoma. Anteriorment es pensava que diverses proteïnes ribosòmiques, incloent-hi eL14, eL38, eL41 i eS30, faltaven al genoma d'E. cuniculi a causa de l'aparent absència dels seus homòlegs del genoma d'E. cuniculi. També es prediu la pèrdua de moltes proteïnes ribosòmiques en la majoria d'altres paràsits intracel·lulars i endosimbionts altament reduïts. Per exemple, tot i que la majoria dels bacteris de vida lliure contenen la mateixa família de 54 proteïnes ribosòmiques, només 11 d'aquestes famílies de proteïnes tenen homòlegs detectables a cada genoma analitzat de bacteris restringits a l'hoste. En suport d'aquesta idea, s'ha observat experimentalment una pèrdua de proteïnes ribosòmiques en microsporidis de V. necatrix i P. locustae, que no tenen les proteïnes eL38 i eL4131,32.
Tanmateix, les nostres estructures mostren que només eL38, eL41 i eS30 es perden realment al ribosoma d'E. cuniculi. La proteïna eL14 es va conservar i la nostra estructura va mostrar per què no es va poder trobar aquesta proteïna a la cerca d'homologia (Fig. 7). En els ribosomes d'E. cuniculi, la major part del lloc d'unió d'eL14 es perd a causa de la degradació de l'ES39L amplificat per rRNA. En absència d'ES39L, eL14 va perdre la major part de la seva estructura secundària, i només el 18% de la seqüència d'eL14 era idèntica a E. cuniculi i S. cerevisiae. Aquesta mala preservació de la seqüència és remarcable perquè fins i tot Saccharomyces cerevisiae i Homo sapiens —organismes que van evolucionar amb 1.500 milions d'anys de diferència— comparteixen més del 51% dels mateixos residus a eL14. Aquesta pèrdua anòmala de conservació explica per què E. cuniculi eL14 està actualment anotada com la putativa proteïna M970_061160 i no com la proteïna ribosòmica eL1427.
i el ribosoma Microsporidies va perdre l'extensió d'ARN ribosòmic ES39L, cosa que va eliminar parcialment el lloc d'unió a la proteïna ribosòmica eL14. En absència d'ES39L, la proteïna de la microespora eL14 pateix una pèrdua d'estructura secundària, en la qual l'antiga hèlix α d'unió a l'ARN ribosòmic degenera en un bucle de longitud mínima. b L'alineació de seqüències múltiples mostra que la proteïna eL14 està altament conservada en espècies eucariotes (57% d'identitat de seqüència entre homòlegs de llevat i humans), però poc conservada i divergent en microsporidies (en què no més del 24% dels residus són idèntics a l'homòleg eL14). de S. cerevisiae o H. sapiens). Aquesta baixa conservació de seqüències i variabilitat de l'estructura secundària explica per què l'homòleg eL14 no s'ha trobat mai a E. cuniculi i per què es creu que aquesta proteïna s'ha perdut a E. cuniculi. En canvi, E. cuniculi eL14 es va anotar anteriorment com una putativa proteïna M970_061160. Aquesta observació suggereix que la diversitat del genoma dels microsporídies està actualment sobreestimada: alguns gens que actualment es creu que es perden en els microsporídies es conserven, tot i que en formes altament diferenciades; en canvi, es creu que alguns codifiquen gens de microsporídies per a proteïnes específiques de cucs (per exemple, la hipotètica proteïna M970_061160) en realitat codifica les proteïnes molt diverses que es troben en altres eucariotes.
Aquesta troballa suggereix que la desnaturalització de l'ARN ribosòmic pot conduir a una pèrdua dràstica de la conservació de seqüències en proteïnes ribosòmiques adjacents, fent que aquestes proteïnes no es puguin detectar per a les cerques d'homologia. Per tant, podem sobreestimar el grau real de degradació molecular en organismes de genoma petit, ja que algunes proteïnes que es pensava que es perden en realitat persisteixen, tot i que en formes molt alterades.
Com poden els paràsits conservar la funció de les seves màquines moleculars en condicions de reducció extrema del genoma? El nostre estudi respon a aquesta pregunta descrivint la complexa estructura molecular (ribosoma) d'E. cuniculi, un organisme amb un dels genomes eucariotes més petits.
Fa gairebé dues dècades que se sap que les molècules de proteïnes i ARN dels paràsits microbians sovint difereixen de les seves molècules homòlogues en espècies de vida lliure perquè manquen de centres de control de qualitat, es redueixen al 50% de la seva mida en microbis de vida lliure, etc., moltes mutacions debilitants que perjudiquen el plegament i la funció. Per exemple, s'espera que els ribosomes dels organismes de genoma petit, inclosos molts paràsits intracel·lulars i endosimbionts, no tinguin diverses proteïnes ribosòmiques i fins a un terç dels nucleòtids d'ARNr en comparació amb les espècies de vida lliure 27, 29, 30, 49. Tanmateix, la manera com funcionen aquestes molècules en els paràsits continua sent en gran part un misteri, estudiat principalment a través de la genòmica comparativa.
El nostre estudi demostra que l'estructura de les macromolècules pot revelar molts aspectes de l'evolució que són difícils d'extreure dels estudis genòmics comparatius tradicionals de paràsits intracel·lulars i altres organismes restringits a l'hoste (figura suplementària 7). Per exemple, l'exemple de la proteïna eL14 mostra que podem sobreestimar el grau real de degradació de l'aparell molecular en espècies paràsites. Ara es creu que els paràsits encefalítics tenen centenars de gens específics de microsporídies. Tanmateix, els nostres resultats mostren que alguns d'aquests gens aparentment específics són en realitat variants molt diferents de gens que són comuns en altres eucariotes. A més, l'exemple de la proteïna msL2 mostra com passem per alt les noves proteïnes ribosòmiques i subestimem el contingut de les màquines moleculars paràsites. L'exemple de les molècules petites mostra com podem passar per alt les innovacions més enginyoses en estructures moleculars paràsites que els poden donar una nova activitat biològica.
En conjunt, aquests resultats milloren la nostra comprensió de les diferències entre les estructures moleculars dels organismes amb restricció a l'hoste i les seves contraparts en organismes de vida lliure. Demostrem que les màquines moleculars, que durant molt de temps es pensava que eren reduïdes, degenerades i subjectes a diverses mutacions debilitants, en canvi tenen un conjunt de característiques estructurals inusuals que s'han passat per alt sistemàticament.
D'altra banda, els fragments d'ARNr no voluminosos i els fragments fusionats que hem trobat als ribosomes d'E. cuniculi suggereixen que la reducció del genoma pot canviar fins i tot aquelles parts de la maquinària molecular bàsica que es conserven en els tres dominis de la vida, després de gairebé 3.500 milions d'anys d'evolució independent de les espècies.
Els fragments d'ARNr fusionats i sense protuberància en els ribosomes d'E. cuniculi són d'especial interès a la llum d'estudis previs de molècules d'ARN en bacteris endosimbiòtics. Per exemple, en l'endosimbiont del pugó Buchnera aphidicola, s'ha demostrat que les molècules d'ARNr i tRNA tenen estructures sensibles a la temperatura a causa del biaix de composició A+T i una alta proporció de parells de bases no canònics20,50. Ara es creu que aquests canvis en l'ARN, així com els canvis en les molècules de proteïnes, són responsables de la sobredependència dels endosimbionts de les parelles i de la incapacitat dels endosimbionts per transferir calor21, 23. Tot i que l'ARNr de les microsporídies paràsites té canvis estructuralment diferents, la naturalesa d'aquests canvis suggereix que una estabilitat tèrmica reduïda i una major dependència de les proteïnes chaperones poden ser característiques comunes de les molècules d'ARN en organismes amb genomes reduïts.
D'altra banda, les nostres estructures mostren que els microsporídies dels paràsits han desenvolupat una capacitat única per resistir fragments de proteïna i rRNA àmpliament conservats, desenvolupant la capacitat d'utilitzar petits metabòlits abundants i fàcilment disponibles com a imitadors estructurals de fragments de proteïna i rRNA degenerats. Degradació de l'estructura molecular. Aquesta opinió està recolzada pel fet que les molècules petites que compensen la pèrdua de fragments de proteïna en el rRNA i els ribosomes d'E. cuniculi s'uneixen a residus específics de microsporídies en les proteïnes uL15 i eL30. Això suggereix que la unió de molècules petites als ribosomes pot ser un producte de selecció positiva, en què les mutacions específiques de microsporídies en proteïnes ribosòmiques s'han seleccionat per la seva capacitat d'augmentar l'afinitat dels ribosomes per les molècules petites, cosa que pot conduir a organismes ribosòmics més eficients. El descobriment revela una innovació intel·ligent en l'estructura molecular dels paràsits microbians i ens dóna una millor comprensió de com les estructures moleculars dels paràsits mantenen la seva funció malgrat l'evolució reductiva.
Actualment, la identificació d'aquestes petites molècules continua sense estar clara. No està clar per què l'aparició d'aquestes petites molècules en l'estructura ribosòmica difereix entre les espècies de microsporídies. En particular, no està clar per què s'observa la unió de nucleòtids als ribosomes d'E. cuniculi i P. locustae, i no als ribosomes de V. necatrix, malgrat la presència del residu F170 a les proteïnes eL20 i K172 de V. necatrix. Aquesta deleció pot ser causada pel residu 43 uL6 (situat adjacent a la butxaca d'unió de nucleòtids), que és tirosina a V. necatrix i no treonina a E. cuniculi i P. locustae. La voluminosa cadena lateral aromàtica de Tyr43 pot interferir amb la unió de nucleòtids a causa del solapament estèric. Alternativament, l'aparent deleció de nucleòtids pot ser deguda a la baixa resolució de les imatges crio-EM, que dificulta el modelatge dels fragments ribosòmics de V. necatrix.
D'altra banda, el nostre treball suggereix que el procés de deteriorament del genoma pot ser una força inventiva. En particular, l'estructura del ribosoma d'E. cuniculi suggereix que la pèrdua de fragments d'ARN ribosòmic i proteic en el ribosoma de microsporidia crea una pressió evolutiva que promou canvis en l'estructura del ribosoma. Aquestes variants es produeixen lluny del lloc actiu del ribosoma i semblen ajudar a mantenir (o restaurar) l'assemblatge òptim dels ribosomes que, d'altra banda, es veuria interromput per la reducció de l'ARN ribosòmic. Això suggereix que una innovació important del ribosoma de microsporidia sembla haver evolucionat cap a la necessitat d'amortir la deriva gènica.
Potser això s'il·lustra millor amb la unió de nucleòtids, que no s'ha observat mai en altres organismes fins ara. El fet que els residus d'unió de nucleòtids siguin presents en microsporídies típics, però no en altres eucariotes, suggereix que els llocs d'unió de nucleòtids no són només relíquies que esperen desaparèixer, o el lloc final perquè l'ARN ribosòdic es restauri a la forma de nucleòtids individuals. En canvi, aquest lloc sembla una característica útil que podria haver evolucionat al llarg de diverses rondes de selecció positiva. Els llocs d'unió de nucleòtids poden ser un subproducte de la selecció natural: un cop degradat l'ES39L, els microsporídies es veuen obligats a buscar una compensació per restaurar la biogènesi òptima dels ribosomes en absència d'ES39L. Com que aquest nucleòtid pot imitar els contactes moleculars del nucleòtid A3186 a l'ES39L, la molècula de nucleòtids esdevé un element bàsic del ribosoma, la unió del qual millora encara més mitjançant la mutació de la seqüència eL30.
Pel que fa a l'evolució molecular dels paràsits intracel·lulars, el nostre estudi demostra que les forces de la selecció natural darwiniana i la deriva genètica de la degradació del genoma no operen en paral·lel, sinó que oscil·len. En primer lloc, la deriva genètica elimina característiques importants de les biomolècules, cosa que fa que la compensació sigui molt necessària. Només quan els paràsits satisfacin aquesta necessitat mitjançant la selecció natural darwiniana, les seves macromolècules tindran l'oportunitat de desenvolupar els seus trets més impressionants i innovadors. És important destacar que l'evolució dels llocs d'unió de nucleòtids al ribosoma d'E. cuniculi suggereix que aquest patró de pèrdua a guany d'evolució molecular no només amortitza mutacions nocives, sinó que de vegades confereix funcions completament noves a les macromolècules paràsites.
Aquesta idea és coherent amb la teoria de l'equilibri mòbil de Sewell Wright, que afirma que un sistema estricte de selecció natural limita la capacitat dels organismes per innovar51,52,53. Tanmateix, si la deriva genètica interromp la selecció natural, aquestes derives poden produir canvis que no són en si mateixos adaptatius (o fins i tot perjudicials), sinó que condueixen a canvis addicionals que proporcionen una major aptitud o una nova activitat biològica. El nostre marc de treball recolza aquesta idea il·lustrant que el mateix tipus de mutació que redueix el plegament i la funció d'una biomolècula sembla ser el principal detonant de la seva millora. D'acord amb el model evolutiu guanyador-guanyador, el nostre estudi demostra que la decadència del genoma, tradicionalment vista com un procés degeneratiu, també és un motor important de la innovació, que de vegades i potser fins i tot sovint permet que les macromolècules adquireixin noves activitats parasitàries que puguin utilitzar-les.