Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
L'evolució dels paràsits microbians implica una contraacció entre la selecció natural, que fa que els paràsits millorin, i la deriva genètica, que fa que els paràsits perdin gens i acumulin mutacions nocives.Aquí, per entendre com es produeix aquesta contraacció a escala d'una sola macromolècula, es descriu l'estructura crio-EM del ribosoma d'Encephalitozoon cuniculi, un organisme eucariota amb un dels genomes més petits de la natura.La reducció extrema de l'ARNr en els ribosomes d'E. cuniculi va acompanyada de canvis estructurals sense precedents, com l'evolució d'enllaçadors d'ARNr fusionats fins ara desconeguts i d'ARNr sense protuberància.A més, el ribosoma E. cuniculi va sobreviure a la pèrdua de fragments i proteïnes d'ARNr desenvolupant la capacitat d'utilitzar molècules petites com a imitacions estructurals de fragments i proteïnes d'ARNr degradats.En general, mostrem que les estructures moleculars pensades durant molt de temps que estaven reduïdes, degenerades i subjectes a mutacions debilitantes tenen una sèrie de mecanismes compensatoris que les mantenen actives malgrat les contraccions moleculars extremes.
Com que la majoria de grups de paràsits microbians tenen eines moleculars úniques per explotar els seus hostes, sovint hem de desenvolupar diferents terapèutiques per a diferents grups de paràsits1,2.Tanmateix, les noves evidències suggereixen que alguns aspectes de l'evolució dels paràsits són convergents i en gran mesura previsibles, cosa que indica una base potencial per a intervencions terapèutiques àmplies en paràsits microbians3,4,5,6,7,8,9.
Treballs anteriors han identificat una tendència evolutiva comuna en paràsits microbians anomenada reducció del genoma o decadència del genoma10,11,12,13.Les investigacions actuals mostren que quan els microorganismes abandonen el seu estil de vida lliure i es converteixen en paràsits intracel·lulars (o endosimbionts), els seus genomes pateixen metamorfosis lentes però sorprenents durant milions d'anys9,11.En un procés conegut com a decadència del genoma, els paràsits microbians acumulen mutacions nocives que converteixen molts gens anteriorment importants en pseudogens, donant lloc a una pèrdua gradual de gens i un col·lapse mutacional14,15.Aquest col·lapse pot destruir fins al 95% dels gens dels organismes intracel·lulars més antics en comparació amb les espècies de vida lliure estretament relacionades.Així doncs, l'evolució dels paràsits intracel·lulars és un estira-i-arronsa entre dues forces oposades: la selecció natural darwiniana, que porta a la millora dels paràsits, i l'enfonsament del genoma, que deixa els paràsits a l'oblit.No està clar com el paràsit va aconseguir sortir d'aquest estira-i-arronsa i retenir l'activitat de la seva estructura molecular.
Tot i que el mecanisme de la decadència del genoma no s'entén completament, sembla que es produeix principalment a causa de la deriva genètica freqüent.Com que els paràsits viuen en poblacions petites, asexuals i genèticament limitades, no poden eliminar eficaçment les mutacions nocives que de vegades es produeixen durant la replicació de l'ADN.Això condueix a l'acumulació irreversible de mutacions nocives i a la reducció del genoma del paràsit.Com a resultat, el paràsit no només perd gens que ja no són necessaris per a la seva supervivència en el medi intracel·lular.És la incapacitat de les poblacions de paràsits per eliminar eficaçment mutacions nocives esporàdiques la que fa que aquestes mutacions s'acumulin al llarg del genoma, inclosos els seus gens més importants.
Gran part de la nostra comprensió actual de la reducció del genoma es basa únicament en comparacions de seqüències del genoma, amb menys atenció als canvis en les molècules reals que realitzen funcions domèstiques i serveixen com a objectius potencials de fàrmacs.Els estudis comparatius han demostrat que la càrrega de les mutacions microbianes intracel·lulars nocives sembla predisposar les proteïnes i els àcids nucleics a plegar i agregar malament, fent-los més dependents de les chaperones i hipersensibles a la calor19,20,21,22,23.A més, diversos paràsits —evolució independent de vegades separada per fins a 2.500 milions d'anys— van experimentar una pèrdua similar de centres de control de qualitat en els seus mecanismes de síntesi de proteïnes5,6 i de reparació de l'ADN24.Tanmateix, se sap poc sobre l'impacte de l'estil de vida intracel·lular en totes les altres propietats de les macromolècules cel·lulars, inclosa l'adaptació molecular a una càrrega creixent de mutacions nocives.
En aquest treball, per tal d'entendre millor l'evolució de les proteïnes i els àcids nucleics dels microorganismes intracel·lulars, hem determinat l'estructura dels ribosomes del paràsit intracel·lular Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi és un organisme semblant a un fong que pertany a un grup de microsporidios paràsits que tenen genomes eucariotes inusualment petits i, per tant, s'utilitzen com a organismes model per estudiar la decadència del genoma25,26,27,28,29,30.Recentment, es va determinar l'estructura del ribosoma crio-EM per a genomes moderadament reduïts de Microsporidia, Paranosema locustae i Vairimorpha necatrix31,32 (~ 3,2 Mb de genoma).Aquestes estructures suggereixen que una certa pèrdua d'amplificació de l'ARNr es compensa amb el desenvolupament de nous contactes entre proteïnes ribosòmiques veïnes o l'adquisició de noves proteïnes ribosòmiques msL131,32.Les espècies Encephalitozoon (genoma ~ 2,5 milions de pb), juntament amb el seu parent més proper Ordospora, demostren el grau final de reducció del genoma en eucariotes: tenen menys de 2000 gens codificants de proteïnes, i s'espera que els seus ribosomes no només estiguin desproveïts de fragments d'expansió de l'ARNr (rRNA) de fragments de proteïnes ribosomes que també distingeixen els bacteris ribosomes d'eucaryomes. s per la seva manca d'homòlegs en el genoma d'E. cuniculi26,27,28.Per tant, vam concloure que el ribosoma d'E. cuniculi pot revelar estratègies desconegudes anteriorment per a l'adaptació molecular a la desintegració del genoma.
La nostra estructura crio-EM representa el ribosoma citoplasmàtic eucariota més petit que s'ha de caracteritzar i proporciona una visió de com el grau final de reducció del genoma afecta l'estructura, el muntatge i l'evolució de la maquinària molecular que és integral a la cèl·lula.Vam trobar que el ribosoma d'E. cuniculi viola molts dels principis àmpliament conservats del plegament de l'ARN i l'assemblatge del ribosoma, i vam descobrir una nova proteïna ribosòmica desconeguda anteriorment.De manera bastant inesperada, mostrem que els ribosomes de microsporidia han desenvolupat la capacitat d'unir molècules petites i es planteja la hipòtesi que els truncaments en l'ARNr i les proteïnes desencadenen innovacions evolutives que, finalment, poden conferir qualitats útils al ribosoma.
Per millorar la nostra comprensió de l'evolució de les proteïnes i els àcids nucleics en els organismes intracel·lulars, vam decidir aïllar les espores d'E. cuniculi de cultius de cèl·lules de mamífers infectades per tal de purificar els seus ribosomes i determinar l'estructura d'aquests ribosomes.És difícil obtenir un gran nombre de microsporidios paràsits perquè els microsporidios no es poden cultivar en un medi nutritiu.En canvi, creixen i es reprodueixen només dins de la cèl·lula hoste.Per tant, per obtenir biomassa d'E. cuniculi per a la purificació de ribosomes, vam infectar la línia cel·lular de ronyó de mamífer RK13 amb espores d'E. cuniculi i vam cultivar aquestes cèl·lules infectades durant diverses setmanes per permetre que E. cuniculi creixés i es multipliqués.Utilitzant una monocapa de cèl·lules infectades d'aproximadament mig metre quadrat, vam poder purificar uns 300 mg d'espores de Microsporidia i utilitzar-les per aïllar ribosomes.A continuació, vam interrompre les espores purificades amb perles de vidre i vam aïllar els ribosomes bruts mitjançant el fraccionament gradual de polietilenglicol dels lisats.Això ens va permetre obtenir aproximadament 300 µg de ribosomes crus d'E. cuniculi per a l'anàlisi estructural.
A continuació, vam recollir imatges crio-EM utilitzant les mostres de ribosoma resultants i vam processar aquestes imatges mitjançant màscares corresponents a la subunitat ribosòmica gran, el cap de la subunitat petita i la subunitat petita.Durant aquest procés, vam recollir imatges d'unes 108.000 partícules ribosòmiques i vam calcular imatges crio-EM amb una resolució de 2, 7 Å (figures suplementàries 1-3).A continuació, vam utilitzar imatges cryoEM per modelar l'ARNr, la proteïna ribosòmica i el factor d'hibernació Mdf1 associat als ribosomes d'E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Estructura del ribosoma E. cuniculi en complex amb el factor d'hibernació Mdf1 (pdb id 7QEP).b Mapa del factor d'hibernació Mdf1 associat al ribosoma E. cuniculi.c Mapa d'estructura secundària que compara l'ARNr recuperat en espècies de Microsporidians amb estructures ribosòmiques conegudes.Els panells mostren la ubicació dels fragments d'ARNr amplificats (ES) i dels llocs actius del ribosoma, inclòs el lloc de descodificació (DC), el bucle de sarcinicina (SRL) i el centre de peptidil transferasa (PTC).d La densitat d'electrons corresponent al centre de la peptidil transferasa del ribosoma d'E. cuniculi suggereix que aquest lloc catalític té la mateixa estructura en el paràsit E. cuniculi i els seus hostes, inclòs H. sapiens.e, f La densitat electrònica corresponent del centre de descodificació (e) i l'estructura esquemàtica del centre de descodificació (f) indiquen que E. cuniculi té residus U1491 en lloc d'A1491 (numeració E. coli) en molts altres eucariotes.Aquest canvi suggereix que E. cuniculi pot ser sensible als antibiòtics dirigits a aquest lloc actiu.
En contrast amb les estructures establertes prèviament dels ribosomes de V. necatrix i P. locustae (ambdues estructures representen la mateixa família de microsporidia Nosematidae i són molt semblants entre si), 31,32 els ribosomes d'E. cuniculi pateixen nombrosos processos de fragmentació de l'ARNr i de la proteïna.Desnaturalització addicional (figures suplementàries 4-6).En l'ARNr, els canvis més sorprenents van incloure la pèrdua completa del fragment d'ARNr 25S amplificat ES12L i la degeneració parcial de les hèlixs h39, h41 i H18 (Fig. 1c, Fig. 4 suplementària).Entre les proteïnes ribosòmiques, els canvis més sorprenents van incloure la pèrdua completa de la proteïna eS30 i l'escurçament de les proteïnes eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 i ​​eS7 (figures suplementàries 4, 5).
Així, la reducció extrema dels genomes de les espècies d'Encephalotozoon/Ordospora es reflecteix en la seva estructura de ribosomes: els ribosomes d'E. cuniculi experimenten la pèrdua més dramàtica de contingut proteic en ribosomes citoplasmàtics eucariotes subjectes a caracterització estructural, i ni tan sols tenen aquells fragments d'ARNr i proteïnes que no només es conserven en els tres dominis vitals dels eukaryotes.L'estructura del ribosoma d'E. cuniculi proporciona el primer model molecular d'aquests canvis i revela esdeveniments evolutius que s'han passat per alt tant per la genòmica comparada com pels estudis d'estructura biomolecular intracel·lular (figura suplementària 7).A continuació, descrivim cadascun d'aquests esdeveniments juntament amb els seus orígens evolutius probables i el seu impacte potencial en la funció del ribosoma.
Aleshores vam trobar que, a més de grans truncaments d'ARNr, els ribosomes d'E. cuniculi tenen variacions d'ARNr en un dels seus llocs actius.Tot i que el centre de la peptidil transferasa del ribosoma d'E. cuniculi té la mateixa estructura que altres ribosomes eucariotes (figura 1d), el centre de descodificació difereix a causa de la variació de la seqüència al nucleòtid 1491 (numeració d'E. coli, figura 1e, f).Aquesta observació és important perquè el lloc de descodificació dels ribosomes eucariotes normalment conté residus G1408 i A1491 en comparació amb els residus de tipus bacterià A1408 i G1491.Aquesta variació subjau a la diferent sensibilitat dels ribosomes bacterians i eucariotes a la família d'aminoglucòsids d'antibiòtics ribosòmics i altres molècules petites que es dirigeixen al lloc de descodificació.Al lloc de descodificació del ribosoma E. cuniculi, el residu A1491 es va substituir per U1491, creant potencialment una interfície d'unió única per a molècules petites dirigides a aquest lloc actiu.La mateixa variant A14901 també està present en altres microsporidia com P. locustae i V. necatrix, cosa que suggereix que està molt estesa entre les espècies de microsporidia (Fig. 1f).
Com que les nostres mostres de ribosoma d'E. cuniculi es van aïllar d'espores metabòlicament inactives, vam provar el mapa crio-EM d'E. cuniculi per a la unió de ribosoma descrita anteriorment en condicions d'estrès o inanició.Factors d'hibernació 31,32,36,37, 38. Vam fer coincidir l'estructura prèviament establerta del ribosoma hibernant amb el mapa crio-EM del ribosoma E. cuniculi.Per a l'acoblament, es van utilitzar ribosomes de S. cerevisiae en complex amb el factor d'hibernació Stm138, ribosomes de llagosta en complex amb factor Lso232 i ribosomes de V. necatrix en complex amb factors Mdf1 i Mdf231.Al mateix temps, hem trobat la densitat crio-EM corresponent al factor de repòs Mdf1.De manera similar a la unió de Mdf1 al ribosoma de V. necatrix, Mdf1 també s'uneix al ribosoma d'E. cuniculi, on bloqueja el lloc E del ribosoma, possiblement ajudant a que els ribosomes estiguin disponibles quan les espores del paràsit es tornen metabòlicament inactives després de la inactivació corporal (figura 2).).
Mdf1 bloqueja el lloc E del ribosoma, que sembla ajudar a inactivar el ribosoma quan les espores del paràsit es tornen metabòlicament inactives.En l'estructura del ribosoma d'E. cuniculi, hem trobat que Mdf1 forma un contacte desconegut anteriorment amb la tija del ribosoma L1, la part del ribosoma que facilita l'alliberament de l'ARNt desacilat del ribosoma durant la síntesi de proteïnes.Aquests contactes suggereixen que Mdf1 es dissocia del ribosoma mitjançant el mateix mecanisme que l'ARNt desacetilat, proporcionant una possible explicació de com el ribosoma elimina Mdf1 per reactivar la síntesi de proteïnes.
Tanmateix, la nostra estructura va revelar un contacte desconegut entre Mdf1 i la cama del ribosoma L1 (la part del ribosoma que ajuda a alliberar l'ARNt desacilat del ribosoma durant la síntesi de proteïnes).En particular, Mdf1 utilitza els mateixos contactes que el segment del colze de la molècula d'ARNt desacilada (Fig. 2).Aquest model molecular desconegut anteriorment va demostrar que Mdf1 es dissocia del ribosoma mitjançant el mateix mecanisme que l'ARNt desacetilat, la qual cosa explica com el ribosoma elimina aquest factor d'hibernació per reactivar la síntesi de proteïnes.
En construir el model d'ARNr, hem trobat que el ribosoma d'E. cuniculi té fragments d'ARNr plegats anormalment, que hem anomenat ARNr fusionat (Fig. 3).En els ribosomes que abasten els tres dominis de la vida, l'ARNr es plega en estructures en les quals la majoria de les bases de l'ARNr o bé es paren de bases i es pleguen entre si o interaccionen amb proteïnes ribosòmiques38,39,40.Tanmateix, als ribosomes d'E. cuniculi, els ARNr semblen violar aquest principi de plegament convertint algunes de les seves hèlixs en regions d'ARNr desplegades.
Estructura de l'hèlix d'ARNr H18 25S a S. cerevisiae, V. necatrix i E. cuniculi.Normalment, als ribosomes que abasten els tres dominis vitals, aquest enllaçador s'enrotlla en una hèlix d'ARN que conté de 24 a 34 residus.En canvi, a Microsporidia, aquest enllaçador d'ARNr es redueix gradualment a dos enllaços rics en uridina d'una cadena que contenen només 12 residus.La majoria d'aquests residus estan exposats a dissolvents.La figura mostra que els microsporidios paràsits semblen violar els principis generals del plegament de l'ARNr, on les bases de l'ARNr solen estar acoblades a altres bases o estan implicades en interaccions ARNr-proteïna.En els microsporidia, alguns fragments d'ARNr prenen un plec desfavorable, en el qual l'antiga hèlix d'ARNr es converteix en un fragment monocatenari allargat gairebé en línia recta.La presència d'aquestes regions inusuals permet que l'ARNr de microsporidia uneixi fragments d'ARNr distants utilitzant un nombre mínim de bases d'ARN.
L'exemple més sorprenent d'aquesta transició evolutiva es pot observar a l'hèlix d'ARNr H18 25S (Fig. 3).En espècies des d'E. coli fins a humans, les bases d'aquesta hèlix d'ARNr contenen 24-32 nucleòtids, formant una hèlix lleugerament irregular.En estructures ribosòmiques identificades prèviament de V. necatrix i P. locustae,31,32 les bases de l'hèlix H18 estan parcialment desenrotllades, però es conserva l'aparellament de bases de nucleòtids.Tanmateix, a E. cuniculi aquest fragment d'ARNr es converteix en els enllaços més curts 228UUUUUU232 i 301UUUUUUUU307.A diferència dels fragments d'ARNr típics, aquests enllaços rics en uridina no s'enrotllen ni fan contacte extensiu amb proteïnes ribosòmiques.En canvi, adopten estructures obertes al dissolvent i totalment desplegades en les quals les cadenes d'ARNr s'estenen gairebé rectes.Aquesta conformació estirada explica com E. cuniculi utilitza només 12 bases d'ARN per omplir el buit de 33 Å entre les hèlixs d'ARNr H16 i H18, mentre que altres espècies requereixen almenys el doble de bases d'ARNr per omplir el buit.
Així, podem demostrar que, mitjançant un plegament energèticament desfavorable, els microsporidia paràsits han desenvolupat una estratègia per contraure fins i tot aquells segments d'ARNr que es mantenen àmpliament conservats entre les espècies dels tres dominis de la vida.Aparentment, acumulant mutacions que transformen les hèlixs d'ARNr en enllaçadors de poli-U curts, E. cuniculi pot formar fragments d'ARNr inusuals que contenen el mínim de nucleòtids possible per a la lligadura de fragments d'ARNr distals.Això ajuda a explicar com els microsporidia van aconseguir una reducció espectacular de la seva estructura molecular bàsica sense perdre la seva integritat estructural i funcional.
Una altra característica inusual de l'ARNr d'E. cuniculi és l'aparició d'ARNr sense engrossiments (Fig. 4).Les protuberàncies són nucleòtids sense parells de bases que es retorcen fora de l'hèlix d'ARN en lloc d'amagar-s'hi.La majoria de les protuberàncies d'ARNr actuen com a adhesius moleculars, ajudant a unir proteïnes ribosòmiques adjacents o altres fragments d'ARNr.Algunes de les protuberàncies actuen com a frontisses, permetent que l'hèlix d'ARNr es flexioni i es plegui de manera òptima per a la síntesi productiva de proteïnes 41 .
a No hi ha una protrusió d'ARNr (numeració de S. cerevisiae) a l'estructura del ribosoma d'E. cuniculi, però està present en la majoria dels altres eucariotes b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens i E. cuniculi ribosomes interns.Els paràsits no tenen moltes de les protuberàncies antigues d'ARNr altament conservades.Aquests engrossiments estabilitzen l'estructura del ribosoma;per tant, la seva absència en microsporidia indica una estabilitat reduïda del plegament de l'ARNr en paràsits de microsporidia.La comparació amb les tiges P (tiges L7/L12 en bacteris) mostra que la pèrdua de protuberàncies d'ARNr de vegades coincideix amb l'aparició de noves protuberàncies al costat de les protuberàncies perdudes.L'hèlix H42 de l'ARNr 23S/28S té una protuberància antiga (U1206 a Saccharomyces cerevisiae) que es calcula que té almenys 3.500 milions d'anys a causa de la seva protecció en tres dominis de la vida.En els microsporidia, aquesta protuberància s'elimina.Tanmateix, va aparèixer una nova protuberància al costat de la protuberància perduda (A1306 a E. cuniculi).
Sorprenentment, vam trobar que els ribosomes d'E. cuniculi no tenen la majoria de les protuberàncies d'ARNr que es troben en altres espècies, incloent-hi més de 30 protuberàncies conservades en altres eucariotes (Fig. 4a).Aquesta pèrdua elimina molts contactes entre les subunitats ribosòmiques i les hèlixs d'ARNr adjacents, de vegades creant grans buits dins del ribosoma, fent que el ribosoma d'E. cuniculi sigui més porós en comparació amb els ribosomes més tradicionals (Fig. 4b).Notablement, vam trobar que la majoria d'aquestes protuberàncies també es van perdre a les estructures del ribosoma de V. necatrix i P. locustae identificades anteriorment, que van ser passats per alt per les anàlisis estructurals anteriors31,32.
De vegades, la pèrdua de protuberàncies d'ARNr va acompanyada del desenvolupament de noves protuberàncies al costat de la protuberància perduda.Per exemple, la tija P ribosòmica conté una protuberància U1208 (a Saccharomyces cerevisiae) que va sobreviure d'E. coli als humans i, per tant, s'estima que té 3.500 milions d'anys.Durant la síntesi de proteïnes, aquesta protuberància ajuda a la tija P a moure's entre conformacions obertes i tancades perquè el ribosoma pugui reclutar factors de traducció i lliurar-los al lloc actiu.En els ribosomes d'E. cuniculi, aquest engrossiment està absent;tanmateix, un nou engrossiment (G883) situat només en tres parells de bases pot contribuir a la restauració de la flexibilitat òptima de la tija P (Fig. 4c).
Les nostres dades sobre l'ARNr sense protuberància suggereixen que la minimització de l'ARNr no es limita a la pèrdua d'elements d'ARNr a la superfície del ribosoma, sinó que també pot implicar el nucli del ribosoma, creant un defecte molecular específic del paràsit que no s'ha descrit en cèl·lules de vida lliure.s'observen espècies vives.
Després de modelar proteïnes ribosòmiques canòniques i ARNr, vam trobar que els components ribosòmics convencionals no poden explicar les tres parts de la imatge crio-EM.Dos d'aquests fragments són molècules petites de mida (Fig. 5, Fig. 8 suplementària).El primer segment es troba entre les proteïnes ribosòmiques uL15 i eL18 en una posició normalment ocupada per l'extrem C-terminal d'eL18, que s'escurça a E. cuniculi.Tot i que no podem determinar la identitat d'aquesta molècula, la mida i la forma d'aquesta illa de densitat s'explica bé per la presència de molècules d'espermidina.La seva unió al ribosoma s'estabilitza per mutacions específiques de microsporidia a les proteïnes uL15 (Asp51 i Arg56), que semblen augmentar l'afinitat del ribosoma per aquesta petita molècula, ja que permeten que uL15 embolcalli la petita molècula en una estructura ribosòmica.Figura suplementària 2).8, dades addicionals 1, 2).
Imatges crio-EM que mostren la presència de nucleòtids fora de la ribosa units al ribosoma d'E. cuniculi.Al ribosoma E. cuniculi, aquest nucleòtid ocupa el mateix lloc que el nucleòtid 25S rRNA A3186 (numeració Saccharomyces cerevisiae) a la majoria dels altres ribosomes eucariotes.b A l'estructura ribosòmica d'E. cuniculi, aquest nucleòtid es troba entre les proteïnes ribosòmiques uL9 i eL20, estabilitzant així el contacte entre les dues proteïnes.Anàlisi de la conservació de la seqüència cd eL20 entre espècies de microsporidia.L'arbre filogenètic de les espècies de Microsporidia (c) i l'alineació de seqüències múltiple de la proteïna eL20 (d) mostren que els residus d'unió de nucleòtids F170 i K172 es conserven a la majoria de Microsporidia típics, amb l'excepció de S. lophii, amb l'excepció de la ramificació primerenca Microsporidia, que va conservar l'extensió ES39 de l'ARN.e Aquesta figura mostra que els residus d'unió de nucleòtids F170 i K172 només estan presents a eL20 del genoma de microsporidia molt reduït, però no en altres eucariotes.En general, aquestes dades suggereixen que els ribosomes de microsporidios han desenvolupat un lloc d'unió de nucleòtids que sembla unir molècules d'AMP i utilitzar-les per estabilitzar les interaccions proteïna-proteïna a l'estructura ribosòmica.L'alta conservació d'aquest lloc d'unió a Microsporidia i la seva absència en altres eucariotes suggereix que aquest lloc pot proporcionar un avantatge de supervivència selectiva per a Microsporidia.Així, la butxaca d'unió de nucleòtids al ribosoma de microsporidia no sembla ser una característica degenerada o una forma final de degradació de l'ARNr com s'ha descrit anteriorment, sinó una innovació evolutiva útil que permet que el ribosoma de microsporidia s'uneixi directament a petites molècules, utilitzant-les com a blocs de construcció moleculars.blocs de construcció per als ribosomes.Aquest descobriment fa que el ribosoma microsporidia sigui l'únic ribosoma conegut que utilitza un sol nucleòtid com a bloc de construcció estructural.f Via evolutiva hipotètica derivada de la unió de nucleòtids.
La segona densitat de pes molecular baix es troba a la interfície entre les proteïnes ribosòmiques uL9 i eL30 (Fig. 5a).Aquesta interfície es va descriure anteriorment a l'estructura del ribosoma Saccharomyces cerevisiae com a lloc d'unió per al nucleòtid 25S de l'ARNr A3186 (part de l'extensió d'ARNr ES39L)38.Es va demostrar que en els ribosomes degenerats de P. locustae ES39L, aquesta interfície s'uneix a un únic nucleòtid 31 desconegut, i se suposa que aquest nucleòtid és una forma final reduïda d'ARNr, en la qual la longitud de l'ARNr és de ~ 130-230 bases.ES39L es redueix a un sol nucleòtid 32,43.Les nostres imatges crio-EM donen suport a la idea que la densitat es pot explicar pels nucleòtids.Tanmateix, la resolució més alta de la nostra estructura va demostrar que aquest nucleòtid és una molècula extraribosomal, possiblement AMP (Fig. 5a, b).
Aleshores vam preguntar si el lloc d'unió dels nucleòtids apareixia al ribosoma d'E. cuniculi o si existia anteriorment.Com que la unió de nucleòtids està mediada principalment pels residus Phe170 i Lys172 a la proteïna ribosòmica eL30, vam avaluar la conservació d'aquests residus en 4396 eucariotes representatius.Com en el cas de uL15 anterior, vam trobar que els residus Phe170 i Lys172 només es conserven altament als Microsporidia típics, però absents en altres eucariotes, inclosos els Microsporidia Mitosporidium i Amphiamblys atípics, en els quals el fragment d'ARNr ES39L no es redueix 44, 45, 45, 6).-e).
En conjunt, aquestes dades donen suport a la idea que E. cuniculi i possiblement altres microsporidios canònics han desenvolupat la capacitat de capturar de manera eficient un gran nombre de metabòlits petits a l'estructura del ribosoma per compensar la disminució dels nivells d'ARNr i proteïnes.En fer-ho, han desenvolupat una capacitat única d'unir nucleòtids fora del ribosoma, demostrant que les estructures moleculars paràsites es compensen capturant abundants metabòlits petits i utilitzant-los com a imitacions estructurals de fragments d'ARN i proteïnes degradats..
La tercera part no simulada del nostre mapa crio-EM, que es troba a la gran subunitat ribosòmica.La resolució relativament alta (2, 6 Å) del nostre mapa suggereix que aquesta densitat pertany a proteïnes amb combinacions úniques de residus de cadena lateral gran, cosa que ens va permetre identificar aquesta densitat com una proteïna ribosòmica prèviament desconeguda que vam identificar com a msL2 (proteïna específica de Microsporidia L2) (mètodes, figura 6).La nostra recerca d'homologia va demostrar que msL2 es conserva al clade Microsporidia del gènere Encephaliter i Orosporidium, però absent en altres espècies, inclosos altres Microsporidia.A l'estructura ribosòmica, msL2 ocupa un buit format per la pèrdua de l'ARNr ES31L estès.En aquest buit, msL2 ajuda a estabilitzar el plegament de l'ARNr i pot compensar la pèrdua d'ES31L (figura 6).
a Densitat electrònica i model de la proteïna ribosòmica específica de Microsporidia msL2 que es troba als ribosomes d'E. cuniculi.b La majoria dels ribosomes eucariotes, inclòs el ribosoma 80S de Saccharomyces cerevisiae, tenen l'amplificació d'ARNr ES19L perduda en la majoria d'espècies de Microsporidians.L'estructura prèviament establerta del ribosoma de microsporidia de V. necatrix suggereix que la pèrdua d'ES19L en aquests paràsits es compensa amb l'evolució de la nova proteïna ribosòmica msL1.En aquest estudi, vam trobar que el ribosoma d'E. cuniculi també va desenvolupar una proteïna imitant l'ARN ribosòmic addicional com a compensació aparent per la pèrdua d'ES19L.Tanmateix, msL2 (actualment anotada com la hipotètica proteïna ECU06_1135) i msL1 tenen diferents orígens estructurals i evolutius.c Aquest descobriment de la generació de proteïnes ribosòmiques msL1 i msL2 no relacionades evolutivament suggereix que si els ribosomes acumulen mutacions perjudicials en el seu ARNr, poden assolir nivells sense precedents de diversitat compositiva fins i tot en un petit subconjunt d'espècies estretament relacionades.Aquest descobriment podria ajudar a aclarir l'origen i l'evolució del ribosoma mitocondrial, conegut pel seu ARNr molt reduït i la seva variabilitat anormal en la composició de proteïnes entre espècies.
A continuació, vam comparar la proteïna msL2 amb la proteïna msL1 descrita anteriorment, l'única proteïna ribosòmica específica de microsporidia coneguda que es troba al ribosoma de V. necatrix.Volíem provar si msL1 i msL2 estan relacionats evolutivament.La nostra anàlisi va demostrar que msL1 i msL2 ocupen la mateixa cavitat en l'estructura ribosòmica, però tenen diferents estructures primàries i terciàries, la qual cosa indica el seu origen evolutiu independent (Fig. 6).Així, el nostre descobriment de msL2 proporciona proves que grups d'espècies eucariotes compactes poden evolucionar de manera independent proteïnes ribosòmiques estructuralment diferents per compensar la pèrdua de fragments d'ARNr.Aquesta troballa és notable perquè la majoria dels ribosomes eucariotes citoplasmàtics contenen una proteïna invariant, inclosa la mateixa família de 81 proteïnes ribosòmiques.L'aparició de msL1 i msL2 en diversos clades de microsporidia en resposta a la pèrdua de segments d'ARNr estès suggereix que la degradació de l'arquitectura molecular del paràsit fa que els paràsits cerquin mutacions compensatòries, que eventualment poden conduir a la seva adquisició en diferents poblacions de paràsits.estructures.
Finalment, quan es va completar el nostre model, vam comparar la composició del ribosoma d'E. cuniculi amb la prevista a partir de la seqüència del genoma.Abans es pensava que diverses proteïnes ribosòmiques, incloses eL14, eL38, eL41 i eS30, faltaven al genoma d'E. cuniculi a causa de l'absència aparent dels seus homòlegs del genoma d'E. cuniculi.També es preveu la pèrdua de moltes proteïnes ribosòmiques en la majoria dels altres paràsits intracel·lulars i endosimbionts molt reduïts.Per exemple, tot i que la majoria de bacteris de vida lliure contenen la mateixa família de 54 proteïnes ribosòmiques, només 11 d'aquestes famílies de proteïnes tenen homòlegs detectables en cada genoma analitzat de bacteris restringits per l'hoste.En suport d'aquesta noció, s'ha observat experimentalment una pèrdua de proteïnes ribosòmiques en microsporidia de V. necatrix i P. locustae, que no tenen les proteïnes eL38 i eL4131,32.
Tanmateix, les nostres estructures mostren que només eL38, eL41 i eS30 es perden realment al ribosoma E. cuniculi.La proteïna eL14 es va conservar i la nostra estructura va mostrar per què aquesta proteïna no es podia trobar en la recerca d'homologia (Fig. 7).En els ribosomes d'E. cuniculi, la major part del lloc d'unió eL14 es perd a causa de la degradació de l'ES39L amplificat amb ARNr.En absència d'ES39L, eL14 va perdre la major part de la seva estructura secundària, i només el 18% de la seqüència eL14 era idèntica a E. cuniculi i S. cerevisiae.Aquesta mala preservació de la seqüència és notable perquè fins i tot Saccharomyces cerevisiae i Homo sapiens -organismes que van evolucionar amb 1.500 milions d'anys de diferència- comparteixen més del 51% dels mateixos residus a eL14.Aquesta pèrdua anòmala de conservació explica per què actualment E. cuniculi eL14 s'anota com a proteïna putativa M970_061160 i no com a proteïna ribosòmica eL1427.
i El ribosoma de Microsporidia va perdre l'extensió d'ARNr ES39L, que va eliminar parcialment el lloc d'unió a la proteïna ribosòmica eL14.En absència d'ES39L, la proteïna de microspores eL14 pateix una pèrdua d'estructura secundària, en la qual l'antiga hèlix α que s'uneix a l'ARNr degenera en un bucle de longitud mínima.b L'alineació de seqüències múltiple mostra que la proteïna eL14 està altament conservada en espècies eucariotes (57% d'identitat de seqüència entre llevats i homòlegs humans), però mal conservada i divergent en microsporidia (en què no més del 24% dels residus són idèntics a l'homòleg eL14).de S. cerevisiae o H. sapiens).Aquesta mala conservació de la seqüència i la variabilitat de l'estructura secundària explica per què mai s'ha trobat l'homòleg eL14 a E. cuniculi i per què es creu que aquesta proteïna s'ha perdut a E. cuniculi.En canvi, E. cuniculi eL14 es va anotar anteriorment com a proteïna putativa M970_061160.Aquesta observació suggereix que actualment la diversitat del genoma de microsporidia està sobreestimada: alguns gens que actualment es creu que s'han perdut en microsporidia es conserven de fet, encara que en formes molt diferenciades;en canvi, es creu que alguns codifiquen els gens de microsporidia per a proteïnes específiques de cuc (per exemple, la hipotètica proteïna M970_061160) en realitat codifiquen les proteïnes molt diverses que es troben en altres eucariotes.
Aquesta troballa suggereix que la desnaturalització de l'ARNr pot provocar una pèrdua dramàtica de la conservació de la seqüència a les proteïnes ribosòmiques adjacents, fent que aquestes proteïnes siguin indetectables per a les cerques d'homologia.Així, podem sobreestimar el grau real de degradació molecular dels petits organismes del genoma, ja que algunes proteïnes que es pensa que s'han perdut realment persisteixen, encara que en formes molt alterades.
Com poden els paràsits retenir la funció de les seves màquines moleculars en condicions de reducció extrema del genoma?El nostre estudi respon a aquesta pregunta descrivint la complexa estructura molecular (ribosoma) d'E. cuniculi, un organisme amb un dels genomes eucariotes més petits.
Fa gairebé dues dècades que se sap que les molècules de proteïnes i ARN dels paràsits microbians sovint difereixen de les seves molècules homòlogues en espècies de vida lliure perquè no tenen centres de control de qualitat, es redueixen al 50% de la seva mida en microbis de vida lliure, etc.moltes mutacions debilitantes que perjudiquen el plegament i la funció.Per exemple, s'espera que els ribosomes d'organismes de genoma petit, inclosos molts paràsits intracel·lulars i endosimbionts, no tinguin diverses proteïnes ribosòmiques i fins a un terç dels nucleòtids d'ARNr en comparació amb les espècies de vida lliure 27, 29, 30, 49. No obstant això, la forma en què aquestes molècules funcionen en paràsits segueix sent comparativament un gran paràsit.
El nostre estudi mostra que l'estructura de les macromolècules pot revelar molts aspectes de l'evolució que són difícils d'extreure dels estudis genòmics comparatius tradicionals de paràsits intracel·lulars i altres organismes restringits per l'hoste (figura suplementària 7).Per exemple, l'exemple de la proteïna eL14 mostra que podem sobreestimar el grau real de degradació de l'aparell molecular en espècies paràsites.Ara es creu que els paràsits encefàlics tenen centenars de gens específics de microsporidia.Tanmateix, els nostres resultats mostren que alguns d'aquests gens aparentment específics són en realitat només variants molt diferents de gens que són comuns en altres eucariotes.A més, l'exemple de la proteïna msL2 mostra com passem per alt les noves proteïnes ribosòmiques i subestimem el contingut de màquines moleculars paràsites.L'exemple de les molècules petites mostra com podem passar per alt les innovacions més enginyoses en les estructures moleculars paràsites que poden donar-los una nova activitat biològica.
En conjunt, aquests resultats milloren la nostra comprensió de les diferències entre les estructures moleculars dels organismes restringits a l'hoste i els seus homòlegs en organismes de vida lliure.Mostrem que les màquines moleculars, durant molt de temps pensades que estaven reduïdes, degenerades i subjectes a diverses mutacions debilitantes, tenen un conjunt de característiques estructurals inusuals sistemàticament ignorades.
D'altra banda, els fragments d'ARNr no voluminosos i els fragments fusionats que hem trobat als ribosomes d'E. cuniculi suggereixen que la reducció del genoma pot canviar fins i tot aquelles parts de la maquinària molecular bàsica que es conserven en els tres dominis de la vida, després de gairebé 3.500 milions d'anys.evolució independent de les espècies.
Els fragments d'ARNr fusionats i lliures de protuberància en els ribosomes d'E. cuniculi tenen un interès particular a la llum d'estudis anteriors de molècules d'ARN en bacteris endosimbiòtics.Per exemple, a l'endosimbiont de pugó Buchnera aphidicola, s'ha demostrat que les molècules d'ARNr i d'ARNt tenen estructures sensibles a la temperatura a causa del biaix de la composició A + T i una alta proporció de parells de bases no canònics20,50.Ara es creu que aquests canvis en l'ARN, així com els canvis en les molècules de proteïnes, són els responsables de la sobredependència dels endosimbionts dels socis i de la incapacitat dels endosimbionts per transferir calor 21, 23 .Tot i que l'ARNr de microsporidia paràsit té canvis estructuralment diferents, la naturalesa d'aquests canvis suggereix que una estabilitat tèrmica reduïda i una major dependència de les proteïnes chaperones poden ser característiques comunes de les molècules d'ARN en organismes amb genomes reduïts.
D'altra banda, les nostres estructures mostren que els microsporidis paràsits han desenvolupat una capacitat única per resistir fragments d'ARNr i proteïnes àmpliament conservats, desenvolupant la capacitat d'utilitzar metabòlits petits abundants i fàcilment disponibles com a imitadors estructurals d'ARNr i fragments de proteïnes degenerats.Degradació de l'estructura molecular..Aquesta opinió es recolza en el fet que les petites molècules que compensen la pèrdua de fragments de proteïnes en l'ARNr i els ribosomes d'E. cuniculi s'uneixen a residus específics de microsporidia a les proteïnes uL15 i eL30.Això suggereix que la unió de molècules petites als ribosomes pot ser un producte de la selecció positiva, en la qual s'han seleccionat mutacions específiques de Microsporidia en proteïnes ribosomes per la seva capacitat d'augmentar l'afinitat dels ribosomes per molècules petites, la qual cosa pot conduir a organismes ribosomes més eficients.El descobriment revela una innovació intel·ligent en l'estructura molecular dels paràsits microbians i ens proporciona una millor comprensió de com les estructures moleculars dels paràsits mantenen la seva funció malgrat l'evolució reductiva.
Actualment, la identificació d'aquestes petites molècules encara no està clara.No està clar per què l'aparició d'aquestes petites molècules a l'estructura ribosòmica difereix entre les espècies de microsporidia.En particular, no està clar per què s'observa la unió de nucleòtids als ribosomes d'E. cuniculi i P. locustae, i no als ribosomes de V. necatrix, malgrat la presència del residu F170 a les proteïnes eL20 i K172 de V. necatrix.Aquesta supressió pot ser causada pel residu 43 uL6 (situat al costat de la butxaca d'unió de nucleòtids), que és tirosina a V. necatrix i no treonina a E. cuniculi i P. locustae.La voluminosa cadena lateral aromàtica de Tyr43 pot interferir amb la unió de nucleòtids a causa de la superposició estèrica.Alternativament, l'aparent supressió de nucleòtids pot ser deguda a la baixa resolució de la imatge crio-EM, que dificulta el modelatge dels fragments ribosòmics de V. necatrix.
D'altra banda, el nostre treball suggereix que el procés de desintegració del genoma pot ser una força inventiva.En particular, l'estructura del ribosoma d'E. cuniculi suggereix que la pèrdua d'ARNr i fragments de proteïnes al ribosoma de microsporidia crea una pressió evolutiva que promou canvis en l'estructura del ribosoma.Aquestes variants es troben lluny del lloc actiu del ribosoma i semblen ajudar a mantenir (o restaurar) el conjunt òptim del ribosoma que, d'altra manera, es veuria interromput per l'ARNr reduït.Això suggereix que una innovació important del ribosoma de microsporidia sembla haver evolucionat cap a la necessitat d'amortir la deriva gènica.
Potser això s'il·lustra millor amb la unió de nucleòtids, que mai s'ha observat en altres organismes fins ara.El fet que els residus d'unió de nucleòtids estiguin presents en els microsporidios típics, però no en altres eucariotes, suggereix que els llocs d'unió de nucleòtids no són només relíquies que esperen desaparèixer, o el lloc final perquè l'ARNr es torni a la forma de nucleòtids individuals.En canvi, aquest lloc sembla una característica útil que podria haver evolucionat durant diverses rondes de selecció positiva.Els llocs d'unió de nucleòtids poden ser un subproducte de la selecció natural: una vegada que ES39L es degrada, els microsporidios es veuen obligats a buscar una compensació per restaurar la biogènesi òptima del ribosoma en absència d'ES39L.Com que aquest nucleòtid pot imitar els contactes moleculars del nucleòtid A3186 a ES39L, la molècula de nucleòtid es converteix en un bloc de construcció del ribosoma, la unió del qual es millora encara més per la mutació de la seqüència eL30.
Pel que fa a l'evolució molecular dels paràsits intracel·lulars, el nostre estudi mostra que les forces de la selecció natural darwiniana i la deriva genètica de la decadència del genoma no operen en paral·lel, sinó que oscil·len.En primer lloc, la deriva genètica elimina característiques importants de les biomolècules, fent que la compensació sigui molt necessària.Només quan els paràsits satisfan aquesta necessitat mitjançant la selecció natural darwiniana, les seves macromolècules tindran l'oportunitat de desenvolupar els seus trets més impressionants i innovadors.És important destacar que l'evolució dels llocs d'unió de nucleòtids al ribosoma d'E. cuniculi suggereix que aquest patró de pèrdua per guanyar de l'evolució molecular no només amortitza mutacions nocives, sinó que de vegades confereix funcions completament noves a les macromolècules paràsites.
Aquesta idea és coherent amb la teoria de l'equilibri mòbil de Sewell Wright, que afirma que un sistema estricte de selecció natural limita la capacitat d'innovar dels organismes51,52,53.Tanmateix, si la deriva genètica altera la selecció natural, aquestes deriva poden produir canvis que no són per si mateixos adaptatius (o fins i tot perjudicials), però que condueixen a canvis addicionals que proporcionen una major aptitud o una nova activitat biològica.El nostre marc recolza aquesta idea il·lustrant que el mateix tipus de mutació que redueix el plec i la funció d'una biomolècula sembla ser el desencadenant principal de la seva millora.D'acord amb el model evolutiu de guanyar-guanyar, el nostre estudi mostra que la descomposició del genoma, vista tradicionalment com un procés degeneratiu, també és un motor important d'innovació, de vegades i potser fins i tot sovint permet que les macromolècules adquireixin noves activitats parasitàries.poden utilitzar-los.