L'adquisició i la distribució de nutrients integra els trets d'alimentació dels insectes i de la història de la vida. Per compensar les deficiències en nutrients específics en les diferents etapes de la vida, els insectes poden obtenir aquests nutrients mitjançant una alimentació suplementària, per exemple, alimentant-se de secrecions de vertebrats en un procés conegut com a bassals.arabiensis l'agitació a l'orina de vaca per a l'adquisició de nutrients millora les característiques de la història de la vida.
Assegureu-vos que és segur. L'arabiensis es va sentir atret per l'olor de l'orina de vaca fresca de 24 hores, 72 hores i 168 hores, i les femelles buscant hoste i alimentades amb sang (48 hores després de l'àpat de sang) es van mesurar en un olfactòmetre de tub Y, i es van combinar proves electrofísiques i anàlisis químiques per a femelles embarassades. Identificar compostos bioactius a l'orina de vaca en les quatre classes d'edat. Es van avaluar mescles sintètiques de compostos bioactius en proves de tub Y i de camp. Per investigar l'orina de vaca i la seva urea composta principal que conté nitrogen com a possibles dietes suplementàries per als vectors de la malària, es van mesurar els paràmetres d'alimentació i les característiques de la història de la vida. es van avaluar la supervivència, el vol lligat i la reproducció.
Busqueu la sang i l'alimentació de l'hoste. En estudis de laboratori i de camp, els àrabs es van sentir atrets per l'olor natural i sintètica de l'orina de vaca fresca i envellida. Les femelles embarassades eren indiferents a les respostes de l'orina de vaca als llocs de posta. , o reproducció.
Adquisició i distribució d'orina de vaca d'Anopheles arabinis per millorar les característiques de la història de la vida. L'alimentació suplementària d'orina de vaca afecta directament la capacitat del vector augmentant la supervivència diària i la densitat del vector, i indirectament alterant l'activitat de vol i, per tant, s'hauria de considerar en futurs models.
L'adquisició i distribució de nutrients integra l'alimentació dels insectes i les característiques de la història de vida [1,2,3]. Els insectes són capaços de seleccionar i adquirir aliments i realitzar una alimentació compensatòria en funció de la disponibilitat d'aliments i els requisits de nutrients [1, 3]. La distribució de nutrients depèn del procés de la història de la vida i pot comportar diferents requisits de qualitat i quantitat de la dieta en diferents etapes de vida dels insectes. alimentació suplementària, com ara fang, diversos excrements i secrecions de vertebrats, i carronya, un procés conegut com a bassals [2]. Tot i que es descriuen principalment una varietat d'espècies de papallones i arnes, també es produeixen forats d'aigua en altres ordres d'insectes, i l'atracció i l'alimentació d'aquest tipus de recursos poden tenir efectes significatius en la salut i altres característiques [5, 6, 7, 7, 8, 9, 9]. nopheles gambiae sensu lato (sl) emergeix com un adult "desnodrit" [8], per la qual cosa el reg pot tenir un paper important en les característiques de la seva història vital, però aquest comportament s'ha descuidat fins ara. L'ús de l'agitació com a mitjà per augmentar la ingesta de nutrients en aquest important vehicle requereix atenció, ja que pot tenir conseqüències epidemiològiques importants.
La ingesta de nitrogen en femelles adultes de mosquit anopheles està limitada a causa de les baixes reserves calòriques transportades des de l'etapa larvari i la utilització ineficient de la farina de sang [9]. La femella Ann.gambiae sl normalment compensa això complementant-se amb àpats de sang suplementaris [10, 11], posant així a més persones en risc de contraure la malaltia i augmentar el risc de contraure la malaltia i augmentar-ne l'ús. alimentació suplementària d'excrements de vertebrats per adquirir compostos nitrogenats que milloren l'adaptació i la maniobrabilitat de vol, tal com demostren altres insectes [2]. En aquest sentit, l'atracció forta i distinta d'una de les espècies germanes dins d'An. El complex d'espècies sl de Gambian, Anopheles arabinis, orina de vaca fresca i envellida [12,13,14] és coneguda per les seves preferències d'hoste associades. L'orina de vaca és un recurs ric en compostos nitrogenats, amb la urea que representa el 50-95% del nitrogen total de l'orina fresca [15, 16]. A mesura que l'orina de vaca envelleix, els microorganismes utilitzen aquests recursos per reduir la complexitat dels compostos nitrogenats en 24 hores [15]. dels quals produeixen compostos tòxics per als mosquits) prosperen [15], que pot ser femella. Ann.arabiensis se sent atreta preferentment per l'orina de 24 hores o menys [13, 14].
Durant el seu primer cicle de gonadotropina, es va avaluar arabiensis per a l'adquisició de compostos nitrogenats, inclosa la urea, mitjançant la barreja d'orina. A continuació, es van dur a terme una sèrie d'experiments per avaluar com les femelles assignen aquest recurs de nutrients potencials per millorar la supervivència, la reproducció i la reproducció fresca de l'alimentació, la reproducció i l'alimentació fresca. En la seva recerca d'aquest recurs nutricional potencial, arabiensis va descobrir correlacions químiques darrere de l'atractiu diferencial observat. Les mescles d'olor sintètiques de compostos orgànics volàtils (COV) identificades en l'orina envellida de 24 hores es van avaluar més en condicions de camp, ampliant els resultats obtinguts en condicions de laboratori i diferents efectes de l'estat boví en condicions de laboratori.Atracció de mosquits. Els resultats obtinguts confirmen que An.arabiensis adquireix i distribueix compostos nitrogenats que es troben a l'orina dels vertebrats per influir en les característiques de la història de la vida. Aquests resultats es discuteixen en el context de les possibles conseqüències epidemiològiques i com es poden utilitzar per a la vigilància i el control de vectors.
Les Anopheles arabicans (soca Dongola) es van mantenir a 25 ± 2 ° C, 65 ± 5% HR i un cicle de llum: fosc de 12:12 h. Les larves es van criar en safates de plàstic (20 cm × 18 cm × 7 cm) plenes d'aigua destil·lada i alimentades amb Tetramin® aliment per peixos (No es va recollir Tetramin®, alimentació per a peixos, 30 ml). lato Hertila, Åstorp, SE) i després es van transferir a gàbies Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) per permetre l'aparició d'adults. Els adults van rebre una solució de sacarosa al 10% ad libitum fins que 4 dies després de l'emergència (dpe), moment en el qual es van oferir l'experiment amb aigua a la nit, immediatament abans de l'experiment amb aigua. Com es descriu a continuació, les femelles utilitzades per a experiments amb tubs de vol es van morir de fam durant només 4-6 hores amb aigua ad libitum. Per preparar els mosquits xucladors de sang per a assajos biològics posteriors, 4 femelles dpe van rebre sang d'ovella desfibròtica (Håtunalab, Bro, SE) mitjançant un sistema d'alimentació de membrana (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Regne Unit). a continuació, o 10% de sacarosa ad libitum durant 3 dies abans dels experiments que es descriuen a continuació. Aquestes últimes femelles es van utilitzar per a bioassaigs amb tubs de vol i es van transferir al laboratori, i després van tenir aigua destil·lada ad libitum durant 4-6 hores abans de l'experiment.
Es van utilitzar assajos d'alimentació per quantificar el consum d'orina i urea en femelles adultes àrabs. A les femelles que buscaven hostes i alimentades amb sang se'ls va proporcionar una dieta que contenia un 1% d'orina de vaca fresca i envellida diluïda, diverses concentracions d'urea i dos controls (10% sacarosa i aigua) durant 48 h. 1; Sigma-Aldrich, Estocolm, SE) es va afegir a la dieta i es va subministrar en una matriu de 4 × 4 en tubs de microcentrífuga de 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, EUA; Figura 1A) Omplir fins a la vora (~ 300 µl). de diàmetre i 6 cm d'alçada; Semadeni, Ostermundigen, CH; Figura 1A) en total foscor a 25 ± 2 cm °C i 65 ± 5% d'humitat relativa. Aquests experiments es van repetir de 5 a 10 vegades. Després de l'exposició a la dieta, els mosquits es van col·locar a -20 °C fins a una anàlisi posterior.
Busqueu l'orina i la urea bovina absorbides per l'hoste i la femella xucladora de sang Anopheles arabianus. En l'assaig d'alimentació (A), les femelles van rebre una dieta que consistia en orina de vaca fresca i envellida, diverses concentracions d'urea, sacarosa (10%) i aigua destil·lada (H2O). -Les femelles que busquen absorbien orina de vaca de 72 hores menys de 168 hores d'orina de vaca (B). El contingut mitjà total de nitrogen (± desviació estàndard) de l'orina es representa a l'encaix. Les femelles que busquen hostes (D, F) i xucladores de sang (E, G) prenen urea de manera dependent de la dosi. ANOVA utilitzant l'anàlisi post hoc de Tukey; p < 0,05). Les barres d'error representen l'error estàndard de la mitjana (BE). La línia recta de punts representa la línia de regressió log-lineal (F, G)
Per alliberar els aliments absorbits, els mosquits es van col·locar individualment en tubs de microcentrífuga d'1,5 ml que contenien 230 µl d'aigua destil·lada i el teixit es va trencar amb un màgic d'un sol ús i un motor sense fil (VWR International, Lund, SE), seguit de centrifugació a 10 krpm durant 10 min. gma-Aldrich) i l'absorbància (λ620) es van determinar mitjançant un lector de microplaques basat en espectrofotòmetre (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternativament, els mosquits es van triturar en 1 ml d'aigua destil·lada, 900 µl dels quals es van transferir a una anàlisi de cubeta UV60; ista, SE). Per quantificar la ingesta dietètica, es va preparar una corba estàndard per dilució en sèrie per produir 0,2 µl a 2,4 µl de 1 mg ml-1 de cianur de xilè. A continuació, es va utilitzar la densitat òptica de les concentracions de colorant conegudes per determinar la quantitat d'aliment que ingeria cada mosquit.
Les dades de volum es van analitzar mitjançant l'anàlisi unidireccional de la variància (ANOVA) seguida de les comparacions per parelles post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA, 1989–2007). Les anàlisis de regressió lineal van descriure la ingesta d'urea depenent de la concentració i les respostes comparades entre els pacients i els pacients amb sang. 0 per a Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).
Aproximadament 20 µl de mostres d'orina de cada grup d'edat es van lligar a Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 de malla, Sigma Aldrich) i es van encapsular en càpsules d'estany (8 mm × 5 mm). Les càpsules es van inserir a la cambra de combustió d'un analitzador CHNS/O (Flash 2000) ri d'acord amb el protocol del fabricant. El nitrogen total (g N l-1) es va quantificar a partir de les concentracions d'urea conegudes utilitzades com a estàndard.
Per avaluar l'efecte de la dieta sobre la supervivència femenina que buscava l'hoste i xucla sang, els mosquits es van col·locar individualment en grans plaques de Petri (12 cm de diàmetre i 6 cm d'alçada; Semadeni) amb un forat cobert de malla a la tapa (3 cm de diàmetre) amb per a la ventilació i el subministrament d'aliments. , i dos controls, 10% de sacarosa i aigua. Cada dieta es va pipetear sobre un tampó dental (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) inserit en una xeringa de 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), l'èmbol es va treure i es va col·locar a sobre d'una placa de Petri (figura 1). es van comptar dues vegades al dia, mentre que els mosquits morts es van descartar fins que l'últim mosquit va morir (n = 40 per tractament). La supervivència dels mosquits alimentats amb diverses dietes es va analitzar estadísticament mitjançant corbes de supervivència de Kaplan-Meyer i proves de rang logarítmic per comparar les comparacions de distribució de supervivència entre dietes (IBM SPSS Estadístiques.0.204.0).
Un molí volador de mosquits personalitzat basat en Attisano et al.[17], fet de panells acrílics transparents de 5 mm de gruix (10 cm d'ample x 10 cm de llarg x 10 cm d'alçada) sense panells frontals i posteriors (Fig. 3: superior). Un conjunt pivotant amb un tub vertical fet d'una columna de cromatografia de gas (0,25 mm d'id; 0,25 mm de diàmetre interior; 7 cm d'extrem de col·locació suspesa d'un parell d'insectes). um imants a 9 cm de distància. Un tub horitzontal fet del mateix material (6,5 cm L) va dividir el tub vertical per formar un braç lligat i un braç que portava un petit tros de paper d'alumini com a senyal d'interrupció de la llum.
A les femelles famolencs durant 24 hores se'ls va donar la dieta anterior durant 30 minuts abans de la contenció. Les femelles completament alimentades es van anestesiar individualment amb gel durant 2-3 minuts i es van unir a agulles d'insectes amb cera d'abelles (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) i després es van lligar els tubs horitzontals per enregistraments horitzontals. -Registrador de dades construït, després emmagatzemat i mostrat amb el programari PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). El molí de vol es va col·locar en una habitació climatitzada (12 h:12 h, llum: fosc, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Per visualitzar el patró d'activitat de vol, es va calcular la distància total volada (m) i el nombre total d'activitats de vol consecutives per hora durant un període de 24 hores. A més, es van comparar les distàncies mitjanes volades per dones individuals entre els tractaments i es van analitzar mitjançant ANOVA unidireccional i l'anàlisi post hoc de Tukey (JMP Pro, v14.0.0, on es va considerar la distància mitjana, mentre que la mitjana de l'Institut es va considerar un nombre variable independent del tractament). de rondes es calcula en increments de 10 minuts.
Per avaluar l'efecte de la dieta en el rendiment reproductiu d'An.arabiensis, sis femelles (4 dpe) es van transferir directament a gàbies Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) després de la recollida de sang i després es van proporcionar la dieta experimental durant 48 h com es descriu anteriorment. A continuació, es van retirar les dietes i es van proporcionar tasses de posta (30 ml; Nolato Hertila) omplint 20 ml d'aigua cada tercer dia per 20 ml d'aigua destil·lada cada tercer dia. 24 hores. Repetiu cada règim dietètic 20-50 vegades. Els ous es van comptar i es van registrar per a cada gàbia experimental. Es van utilitzar submostres d'ous per avaluar la mida mitjana i la variació de longitud dels ous individuals (n ≥ 200 per dieta) mitjançant un microscopi Dialux-20 (DM1000; 2;Leica Microsystems Ltd., DE). Els ous restants es van mantenir en una habitació amb clima controlat en condicions estàndard de cria durant 24 hores, i es va mesurar una submostra de larves del primer estadi (n ≥ 200 per dieta), tal com es descriu anteriorment. JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Els volàtils de l'espai de cap d'orina fresca (1 h després del mostreig), 24 h, 72 h i 168 h es van recollir a partir de mostres recollides de bestiar zebú, races Arsi. Per comoditat, es van recollir mostres d'orina a primera hora del matí mentre les vaques encara estaven al graner. (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) en poliamida de 3 l amb tapa En bidons de plàstic de clorur de vinil. Els volàtils de l'espai de capçalera de cada mostra d'orina bovina es van recollir directament (fresca) o després de madurar a temperatura ambient durant 24 h, 72 h i 168 h, és a dir, cada mostra d'orina era representativa de cada grup d'edat.
Per a la recollida de volàtils de l'espai de capçalera, es va utilitzar un sistema de bucle tancat per fer circular un corrent de gas filtrat amb carbó actiu (100 ml min-1) a través d'una bossa de poliamida fins a la columna d'adsorció durant 2,5 h mitjançant una bomba de buit de diafragma (KNF Neuberger, Freiburg, DE). x 3 mm id) que contenia 35 mg de Porapak Q (malla 50/80; Waters Associates, Milford, MA, EUA) entre taps de llana de vidre. Abans d'utilitzar, la columna es va rentar amb 1 ml de n-hexà redistillat (Merck, Darmstadt, DE) i 1 ml de pentà (99,0% de dissolvent adsorbit amb Al GC volàtil pur). μl de pentà. Les col·leccions d'espai de capçalera es van agrupar i després es van emmagatzemar a -20 ° C fins que s'utilitzen per a una anàlisi posterior.
Les respostes del comportament dels extractes volàtils An.Headspace recollits d'orina fresca de 24 hores, 72 hores i 168 hores d'edat es van analitzar per a extractes volàtils de mosquits Arabidopsis mitjançant un olfactòmetre de tub de vidre recte [18]. Es va il·luminar un olfactòmetre de tub de vidre (80 cm × 9,5 cm id) amb 3 ± 1 lux de llum vermella des de dalt. El flux d'aire filtrat i humidificat amb carbó vegetal (25 ± 2 °C, 65 ± 2% d'humitat relativa) va passar el bioassaig a 30 cm s-1. dispensador de tampons (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), suspès d'una bobina de 5 cm a l'extrem de barlovento de l'olfactòmetre, amb canvis d'estimulador cada 5 minuts. Per a l'anàlisi, es va utilitzar com a estímul 10 μl de cada extracte d'espai de cap, diluït 1:10. gàbies 2-3 hores abans de l'inici de l'experiment. La gàbia d'alliberament es va col·locar al costat de sotavent de l'olfactòmetre, i els mosquits es van deixar aclimatar durant 1 min, i després es va obrir la vàlvula de papallona de la gàbia per alliberar-se. i per evitar els efectes d'un dia qualsevol, es van provar el mateix nombre de tractaments i controls en cada dia experimental. Es van analitzar les respostes de l'hoste i els ans alimentats amb sang. Es van analitzar els conjunts àrabs versus l'espai de cap mitjançant una regressió logística nominal seguida de comparacions per parelles per a proporcions imparells (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Els extractes de l'espai de cap d'orina de vaca fresca i envellida es van analitzar en gàbies Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Tasses de plàstic (30 mL; Nolato Hertila) plenes amb 20 mL d'aigua destil·lada sempre que el substrat de posta i es van col·locar a les cantonades oposades de les caixes ajustades a 24 cm. Es va utilitzar una quantitat igual de pentà per ajustar la tassa de control. Es van intercanviar gots de tractament i control entre cada experiment per controlar els efectes de la posició. Deu femelles alimentades amb sang es van alliberar en gàbies experimentals a ZT 9-11 i els ous en tasses es van comptar 24 hores després. el nombre d'ous posats a la tassa de control)/(nombre total d'ous posats). Cada tractament es va repetir 8 vegades.
L'anàlisi de cromatografia de gasos i de detecció de patrons d'antena electrònica (GC-EAD) d'An.arabiensis femení es va realitzar tal com es va descriure anteriorment [20]. Breument, es van separar extractes volàtils d'espai de cap fresc mitjançant un Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, EUA) equipat amb una columna HP-5 (30 m × 0,25 mm de gruix, pel·lícula Agilent Technologies).L'hidrogen es va utilitzar com a fase mòbil amb un cabal lineal mitjà de 45 cm s-1. Cada mostra (2 μl) es va injectar durant 30 segons en mode splitless amb una temperatura d'entrada de 225 °C. es va afegir 4 psi de nitrogen i es va dividir 1:1 en una creu Gerstel 3D/2 de baix volum mort (Gerstel, Mülheim, DE) entre el detector d'ionització de flama i l'EAD. aire midificat (1,5 l min−1). L'antena es va col·locar a 0,5 cm de la sortida del tub. Cada mosquit individual va representar una rèplica, i per als mosquits que buscaven hoste, es van realitzar almenys tres rèpliques en mostres d'orina de cada edat.
Identificació de compostos bioactius en col·leccions d'espai de cap d'orina bovina fresca i envellida mitjançant un espectròmetre de masses i GC combinat (GC-MS; 6890 GC i 5975 MS; Agilent Technologies) per obtenir respostes antenals en l'anàlisi GC-EAD, operant en mode d'ionització d'impacte electrònic a 70 eV. 25 mm de diàmetre interior, 0,25 μm de gruix de pel·lícula) utilitzant heli com a fase mòbil amb un cabal lineal mitjà de 35 cm s-1. Es va injectar una mostra de 2 μl amb la mateixa configuració de l'injector i la mateixa temperatura del forn que per a l'anàlisi GC-EAD. Els compostos identificats es van confirmar mitjançant la injecció d'estàndards autèntics (Fitxer addicional 1: Taula S2). Per a la quantificació, es va injectar acetat d'heptil (10 ng, 99,8% de puresa química, Aldrich) com a estàndard extern.
Avaluació de l'eficàcia d'una barreja d'olor sintètica que consisteix en compostos bioactius identificats en orina fresca i envellida per atreure Ans.arabiensis buscant l'hoste i xuclador de sang, utilitzant el mateix olfactòmetre i protocol que l'anterior. orina envellida (figura 5D-G; fitxer addicional 1: taula S2). Per a l'anàlisi, utilitzeu 10 μl d'una dilució 1:100 de la mescla totalment sintètica, amb una taxa d'alliberament global que oscil·la entre aproximadament 140-2400 ng h-1, per avaluar l'atractiu per a l'hoste i per a la succió de sang. s'eliminen els compostos únics de la barreja completa. Es van analitzar les respostes de l'hoste i de l'Ans alimentat amb sang i les mescles sintètiques i subtractives mitjançant una regressió logística nominal seguida de comparacions per parelles per a proporcions imparells (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Per avaluar si l'orina de vaca podria servir com a senyal d'hàbitat hoste per als mosquits de la malària, l'orina de vaca fresca i envellida, recollida tal com es descriu anteriorment, i l'aigua es van col·locar en galledes de malla de 3 l (100 ml) i es van col·locar en trampes d'esquer hoste.(Versió BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Deu trampes col·locades a 50 m de distància a les pastures, a 400 m de la comunitat del poble (Silay, Etiòpia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) i cap bestiar, en zones de cria permanent i pobles. es va comparar cada nit durant un total de cinc nits. Es van comparar els nombres de mosquits capturats en trampes amb esquer amb orina de diferents edats mitjançant regressió logística amb una distribució binomial beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
En un poble endèmic de malària a prop de la ciutat de Maki, a la regió d'Oròmia, Etiòpia (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Figura 6A). L'estudi es va dur a terme entre mitjans d'agost i mitjans de setembre abans de la fumigació residual interior anual, juntament amb una llarga temporada de pluges a tots els pobles. seleccionats per a l'estudi (Fig. 6A).Els criteris utilitzats per seleccionar les cases van ser: no s'admeten animals a la casa, no es permetia cuinar a l'interior (treu llenya o carbó) (almenys durant el període de prova) i cases amb un màxim de dos habitants, dormint en insecticides.sota la mosquitera tractada. L'aprovació ètica ha estat atorgada per la Junta de Revisió Ètica de la Investigació Institucional (IRB/022/2016) de la Facultat de Ciències Naturals (CNS-IRB), Universitat d'Addis Abeba, d'acord amb les directrius establertes per la Declaració de l'Associació Mèdica Mundial d'Hèlsinki. El disseny experimental va seguir un disseny quadrat llatí de 2 × 2, en el qual es van assignar barreges i controls sintètics a cases aparellades la primera nit i intercanviades entre cases la nit experimental següent. Aquest procés es va repetir deu vegades.
Es va dissoldre una barreja sintètica que contenia sis compostos bioactius en heptà (97,0% de dissolvent GC, Sigma Aldrich) i es va alliberar a 140 ng H-1 mitjançant un dispensador de metxa de cotó [20]. El dispensador de la metxa va permetre que tots els compostos es van alliberar en proports constants al llarg de les 12 hores. (CDC) Trap Light (John W. Hock Company, Gainesville, FL, EUA; Figura 6A). Les trampes es van penjar 0,8-1 m sobre el terreny, a prop del peu del llit, i un voluntari va dormir sota una mosquitera no tractada i es va operar entre 18:00 i 06: 30: Mosquitoes captura Esborrar l’anàlisi de la reacció en cadena (PCR) per identificar l’espècie identificada morfològicament com a A. gambiae sl. Els membres del complex [23]. A l’estudi del camp, es va analitzar la trampa de les cases aparellades mitjançant un model d’ajustament logístic nominal, on l’atracció era la variable dependent i el tractament (barreja sintètica contra control) va ser l’efecte fix (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.).Aquí, informem dels valors χ2 i p de la prova de relació de probabilitat.
Avalueu si és segur. Arabiensis va poder obtenir orina, la seva principal font de nitrogen, la urea, mitjançant l'alimentació directa, dins de les 48 hores posteriors a l'administració durant 4 dies després dels assaigs d'alimentació femenina de recerca d'hoste (dpe) i alimentades amb sang (Fig. 1A). 0001 i F (5.299) = 56, 00, p < 0, 0001, respectivament, Fig. 1B, C). A més, les dones que buscaven hoste menjaven menys a l'orina a les 72 hores en comparació amb l'orina a les 168 hores (Fig. 1B). a totes les altres concentracions i aigua, tot i que no es pot distingir del 10% de sacarosa (F(10.813) = 15,72, p <0,0001; Figura 1D). Això contrastava amb la resposta de les femelles alimentades amb sang, que normalment absorbien significativament més dietes que contenien urea que aigua, encara que (180% menys sucrosa) 5, p <0,0001; Figura 1).1E). A més, en comparar els dos estats fisiològics, les femelles flebotomitzades van absorbir més urea que les femelles que buscaven hoste a les concentracions més baixes, i aquestes femelles van absorbir quantitats similars d'urea a concentracions més altes (F (1.953) = 70, 802, p < 70, 80.Fig. 1F, G). Tot i que la ingesta d'una dieta que contenia urea semblava tenir valors òptims (Fig. 1D, E), les dones en ambdós estats fisiològics van poder modular la quantitat d'urea absorbida en tot el rang de concentracions d'urea d'una manera log-lineal (Fig. 1F, G).De la mateixa manera, els mosquits semblen controlar la seva absorció de nitrogen mitjançant la regulació de la quantitat d'orina absorbida, ja que la quantitat de nitrogen a l'orina es reflecteix en la quantitat absorbida (figura 1B, C i B).
Per avaluar els efectes de l'orina i la urea sobre la supervivència dels mosquits que buscaven l'hoste i xuclaven sang, les femelles van ser alimentades amb orina de les quatre edats (fresca, 24 h, 72 h i 168 h després de la deposició) i un rang de concentracions d'urea, així com aigua destil·lada i un 10% de sacarosa. en femelles que busquen hoste (orina: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urea: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Fig. 2B, C) i femelles alimentades amb sang (orina: χ2 = χ0, χ 0,00: p < 122,8; 2 = 137, 9, df = 5, p < 0, 0001; Figura 2D, E). En tots els experiments, les femelles alimentades amb una dieta d'orina, urea i aigua tenien taxes de supervivència significativament més baixes en comparació amb les dones alimentades amb una dieta de sacarosa (Figura 2B-E). 0,016) amb la probabilitat de supervivència més baixa (Fig. 2B). A més, les femelles que buscaven hoste alimentades amb 135 mM d'urea van sobreviure més que els controls d'aigua (p <0,04) (Fig.En comparació amb aigua, les dones alimentades amb orina fresca i orina de 24 hores van sobreviure més temps (p = 0,001 i p = 0,012, respectivament; figura 2D), mentre que les dones alimentades amb orina de 72 hores van sobreviure més temps que les donades amb orina fresca curta i orina envellida de 24 hores respectivament (p = 0,00 Wh i 24 hores, respectivament). En alimentades amb 135 mM d'urea, les femelles alimentades amb sang van sobreviure més temps que totes les altres concentracions d'urea i aigua (p <0, 013; Figura 2E).
Supervivència de l'hoste i femella xucladora de sang Anopheles arabinis alimentant-se d'orina de vaca i urea. En el bioassaig (A), es va proporcionar a les femelles una dieta que consistia en orina de vaca fresca i envellida, diverses concentracions d'urea, sacarosa (10%) i aigua destil·lada (H2O). les femelles alimentades amb orina (B, D) i urea (C, E), i els controls, sacarosa i aigua, estan mortes
La distància total i el nombre de rondes determinats a la prova del molí de vol durant un període de 24 hores va diferir entre els mosquits que buscaven l'hoste i els xucladors de sang, que van mostrar una menor activitat de vol en general (Fig. 3). Els mosquits de 68 hores que s'alimentaven d'orina presentaven diferents patrons de vol i eren principalment diürns. Els mosquits femelles que proporcionaven sacarosa o orina de 72 hores van mostrar activitat durant el període de 24 hores, mentre que les femelles que proporcionaven aigua estaven més actives durant el període mitjà. l'orina envellida va experimentar una disminució constant de l'activitat durant 24 hores (figura 3).
Rendiment de vol de la femella xucladora de sang Anopheles arabinis que s'alimenta d'orina de vaca i urea. A la prova del molí de vol, les femelles s'alimentaven d'orina de vaca fresca i envellida, diverses concentracions d'urea, sacarosa (10%) i aigua destil·lada (H2O) estaven lligades a horitzontals, que giraven lliurement (per a braços, sang total de la femella i braços oberts). es van registrar la distància i el nombre de vols per hora per a cada dieta durant un període de 24 hores (fosc: gris; clar: blanc). La distància mitjana i el nombre mitjà d'atacs es mostren a la dreta del gràfic d'activitat circadiana. Les barres d'error representen l'error estàndard de la mitjana. Anàlisi estadística veure text
En general, l'activitat de vol global de les dones que buscaven hostes va seguir un patró similar al de la distància de vol durant un període de 24 hores. La distància de vol mitjana es va veure significativament afectada per la dieta ingerida (F(5, 138) = 28,27, p <0,0001) i les dones que cercaven hostes van ingerir 72 hores d'orina i volaven significativament (en comparació amb totes les altres distàncies més llargues). Els mosquits alimentats amb crose van volar més temps que els frescos (p = 0,022) i els mosquits alimentats amb orina de 24 hores (p = 0,022). En contrast amb el patró d'activitat de vol descrit per la dieta d'orina, les femelles que cercaven hoste alimentades amb urea van mostrar una activitat de vol persistent durant 24 hores durant el període fosc, encara que la segona meitat d'activitat fosca va ser similar. -Les femelles que cercaven alimentades amb urea van augmentar significativament la distància mitjana de vol en funció de la concentració absorbida (F (5, 138) = 1310,91, p < 0,0001).
L'activitat de vol global dels mosquits xucladors de sang va ser estable i sostinguda durant 24 hores en totes les dietes, amb un augment de l'activitat de l'orina durant la segona meitat del període fosc per a les femelles alimentades amb aigua, així com en les femelles alimentades amb aigua fresca i de 24 hores (imatge 3). no ho va fer (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24). Amb una altra dieta d'orina i control (fresca, p = 0,0091; 72 hores, p = 0,0022; 168 hores, p = 0,001; sacarosa, p = 0,0017, p = 0,0017; dH).
Els efectes de l'alimentació d'orina i urea sobre els paràmetres reproductius es van avaluar en bioassaigs de posta d'ous (Figura 4A) i es van investigar segons el nombre d'ous posats per cada femella, la mida dels ous i les larves de primer estadi acabades d'eclosionar. El nombre d'ous posats. Fig. 4B).Les femelles alimentades amb orina de 24 hores, la farina de sang posava significativament més ous que les femelles alimentades amb altres dietes d'orina i eren similars a les alimentades amb sacarosa (Fig. 4B). De la mateixa manera, la mida dels ous posats per les femelles alimentades amb orina variava segons la dieta (F(5, 209, 0, 0, 1, 0, 1, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2). les femelles alimentades amb sacarosa podien ous significativament més grans que les femelles alimentades amb aigua, mentre que els ous de les femelles alimentades amb 168 h d'orina eren significativament més petits (Fig. 4C). Femelles alimentades amb orina de 72 hores que no pas amb ous posats a partir de larves d'ous. Femelles alimentades amb aigua i femelles alimentades amb orina de 168 hores (Figura 4D).
Rendiment reproductiu de les femelles Anopheles arabinis alimentant-se d'orina de vaca i urea. Les femelles alimentades amb sang van ser alimentades amb dietes consistents en orina de vaca fresca i envellida, diverses concentracions d'urea, sacarosa (10%) i aigua destil·lada (H2O) durant 48 hores abans de col·locar-les en bioassaigs i obtenir-ne un nombre de 8 hores de posta i substrats (B, E, E, 48 hores). La mida de les rvae (D, G) es va veure afectada significativament per la dieta proporcionada (orina de vaca: BD; urea: EG). Els mitjans de cada paràmetre mesurat amb diferents noms de lletres eren significativament diferents entre si (ANOVA unidireccional mitjançant l'anàlisi post hoc de Tukey; p <0,05). Les barres d'error representen l'error estàndard de la mitjana.
Com a component nitrogenat principal de l'orina, la urea, quan es va proporcionar com a dieta a les femelles alimentades amb sang, va afectar significativament els paràmetres reproductius en tots els estudis. El nombre d'ous posats per les femelles alimentades amb urea, després d'un àpat de sang, depenent de la concentració d'urea (F(11, 360) = 4,69; p < 0,000 µM 3,69; concentració femelles entre 0,000 µM i 4,1 µM urea, femelles van posar més ous (figura 4E). Les femelles alimentades amb concentracions d'urea de 134 µM o més posen ous més grans que les femelles alimentades amb aigua (F(10, 4245) = 36,7; p <0,0001; figura 4F) i mida de larva, tot i que afectades per concentracions similars d'urea (3,0001; figura 4F) = 3,0001; 0001) era més variable (Fig. 4G).
Atracció general per als extractes volàtils d'espai de cap d'orina bovina que busquen hostes. L'arabiesis avaluada a l'olfactòmetre de tub de vidre (Fig. 5A) es va veure significativament afectada per l'edat de l'orina (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Fig. 5B). altres tractaments (72 hores: p = 0,0060, 168 hores: p = 0,012, pentà: p = 0,00070), Excepte l'olor d'orina fresca (p = 0,13; Figura 5B). Tot i que l'atracció general dels mosquits xucladors de sang a l'orina no va ser significativa (p = 0,13 = χ2 = olor d'orina χ2 = χ2 = 0,0060). .067; Fig. 5C), es va trobar que aquestes femelles eren significativament més atractives per als extractes volàtils de l'espai del cap en comparació amb l'orina de 72 hores en comparació amb els controls (p = 0,0066; Figura 5C).
Respostes conductuals a les olors d'orina de vaca naturals i sintètiques a la recerca d'Anopheles arabianus hoste i alimentat amb sang. Esquema de l'olfactòmetre de tub de vidre (A). Atracció d'extractes volàtils de l'espai de cap d'orina de vaca fresca i envellida a mosquits hoste (B) i xucladors de sang (C). Es mostren l'orina de vaca envellida de 72 hores (F) i 168 hores (G). Les traces de detecció d'antenes d'electrons (EAD) mostren canvis de voltatge en resposta a compostos bioactius a l'espai de cap eluït del cromatògraf de gasos i detectats per un detector d'ionització de flama (FID). Es mostren compostos. Un únic asterisc (*) indica una resposta consistent de baixa amplitud. Els asteriscs dobles (**) indiquen respostes irreproducibles. Trobeu l'hoste (H) i el xuclador de sang (I) An.arabiensis té diferents atractius per a mescles sintètiques d'olors d'orina de vaca fresca i envellida. c anàlisi;p < 0,05).Les barres d'error representen l'error estàndard de l'escala
Ann.arabiensis femella, 72 h i 120 h després del menjar de sang, durant la posta, no es va mostrar cap preferència pels extractes volàtils de l'espai de cap d'orina de vaca fresca i envellida en comparació amb els controls de pentà (χ2 = 3,07, p> 0,05; Fitxer addicional 1: Fig. S1).
Per a les anàlisis femenines Ann.arabiensis, GC-EAD i GC-MS van identificar vuit, sis, tres i tres compostos bioactius (figura 5D-G). Tot i que es van observar diferències en el nombre de compostos que van provocar respostes electrofisiològiques, la majoria d'aquests compostos estaven presents a cada extracte volàtil de l'espai capçal recollit d'orina fresca i envellida. hold es van incloure en anàlisis posteriors.
La taxa total d'alliberament volàtil de compostos bioactius a la col·lecció d'espai de cap va augmentar de 29 µg h-1 en orina fresca a 242 µg h-1 en orina envellida de 168 hores, principalment a causa de l'augment del p-cresol i el m-formaldehid El fenol, així com el fenol. es va relacionar amb la disminució observada de la intensitat del senyal (abundància) al cromatograma (Fig. 5D)-G panell esquerre) i les respostes fisiològiques a aquests compostos (Fig. 5D-G panell dret).
En general, la mescla sintètica tenia una proporció natural similar de compostos bioactius identificats en extractes volàtils d'espais de capçalera d'orina fresca i envellida (Fig. 5D-G) i no semblava obtenir un atractiu significatiu a la recerca d'un hoste (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Fig. 5H) o mosquit = 1, 4 = 1 x 4 x 1 x 4 x 4 x 4 No obstant això, les comparacions post hoc per parelles entre tractaments van mostrar que els mosquits que buscaven hostes eren significativament atractius per a la barreja sintètica d'orina de 24 hores en comparació amb els controls de pentà (p = 0,0086; Figura 5H).
Per avaluar el paper dels components individuals en mescles sintètiques d'orina envellida de 24 hores, es van avaluar sis mescles subtractives amb mescles completes en l'assaig del tub Y, en què es van eliminar compostos individuals. En canvi, l'eliminació de compostos individuals de la mescla totalment sintètica no va afectar les respostes del comportament dels mosquits xucladors de sang (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), amb l'excepció del resultat de la mescla completa a 0,077 (χ2 = 11,38; 22; Fitxer addicional 1: Figura S2B).
En un poble endèmic de malària a Etiòpia, es va avaluar durant deu nits l'eficàcia d'una barreja sintètica d'orina de vaca de 24 hores per atreure mosquits en condicions de camp (Fig. 6A). Es van capturar i identificar un total de 4.861 mosquits, dels quals el 45,7% eren Anthrophes, gambiae, 9%, mosquits. El 35,4% eren Culex spp. (Fitxer addicional 1: Taula S1). Anopheles arabinis és l'únic membre del complex d'espècies d'An.Gambian identificat mitjançant l'anàlisi de PCR. De mitjana, es van capturar 320 mosquits per nit, temps durant el qual les trampes amb esquers de mescla sintètica van capturar més mosquits que no pas mescles, χ1960 = trampes aparellades. Es van col·locar trampes sense esquer a cadascuna de les cinc nits de control a l'inici, a la meitat i al final de l'assaig. Es van capturar nombres similars de mosquits a cada parell de trampes, la qual cosa indica que no hi ha biaix entre cases (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > estudi de la població durant el període de disminució de la població, sense control de 0,005). Les quitoes atrapades a les trampes que contenien la mescla sintètica es van incrementar significativament: recerca d'hoste (χ2(0, 2107) = 138,7, p <0,0001), alimentació de sang recent (χ2(0, 650) = 32,2, p <0,0001) i embaràs = 0,20,χ282(0,20,χ282) ;Fitxa addicional 1: Taula S1). Això també es reflecteix en el nombre total de mosquits capturats: host seeking > succionador de sang > embarassada > semiembarassada > mascle.
Avaluació de camp de l'eficàcia d'una barreja sintètica d'olors d'orina de vaca de 24 hores. Es van realitzar assajos de camp al centre-sud d'Etiòpia (mapa), a prop de la ciutat de Maki (inserció), utilitzant una trampa de llum dels Centres per al Control de Malalties (CDC) (dreta) en cases aparellades, amb un disseny quadrat llatí (atractiu fotogràfic d'imatge aèria) i captació d'esquer femení. nopheles arabesques (B), però no Anopheles farroes (C), d'una manera diferent, un efecte depenent de l'estat fisiològic. A més, aquestes trampes van capturar un nombre significativament augmentat de mosquits Culex hoste. (D) En comparació amb el control. Les barres de l'esquerra representen l'índex de selecció mitjà de mosquits capturats en parelles de mosquits capturats en parelles de mosquits capturats en parelles (open) i control (mentres) a la dreta representen l'índex de selecció mitjà en parells de trampes de control (obertes; N = 5).).Els asteriscs indiquen nivells de significació estadística (*p = 0,01 i ***p <0,0001)
Les tres espècies van ser capturades de manera diferent en trampes que contenien mescles sintètiques. Buscant hoste (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), alimentació de sang (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) i embaràs (χ2(1, 1345) = 61,40, p < 0,0001) .arabiensis va quedar atrapat a la trampa alliberant la mescla sintètica (Fig. 6B), mentre que la quantitat d'An no va variar. Es va trobar Pharoensis en diferents estats fisiològics (Fig. 6C). Per a Culex, només es va trobar un augment significatiu en el nombre de mosquits que buscaven hostes en trampes amb esquer amb la mescla sintètica (13 = 129) (10,13 = 129). 4; Fig. 6D), en comparació amb les trampes de control.
Per avaluar si els mosquits de la malària utilitzen l'olor d'orina de vaca com a senyal d'hàbitat hoste ubicades fora dels hostes potencials entre els llocs de reproducció i les comunitats rurals d'Etiòpia. Els dits dels peus van ser atrets i capturats, encara que en petit nombre, independentment de l'edat de l'orina (χ2 (5, 25) = 2,29, p = 0,13; fitxer addicional 1: figura S3). En canvi, els controls d'aigua no van capturar mosquits de malària a altes temperatures (fitxer addicional 1: figura S3).
Els mosquits de la malària adquireixen i distribueixen compostos que contenen nitrogen mitjançant l'alimentació compensatòria d'orina de vaca (és a dir, bassals) per millorar els trets de la història de la vida, de manera similar a altres insectes [2, 4, 24, 25, 26]. L'orina de vaca és un recurs renovable de fàcil accés estretament associat amb llocs de repòs per a llars de malària i cases rurals, com ara els vectors de malària i les cases rurals. els mosquits localitzen aquest recurs per l'olfacte i són capaços de regular l'absorció de compostos nitrogenats a l'orina, inclosa la urea, el principal component nitrogenat de l'orina [15, 16]. Depenent de l'estat fisiològic del mosquit femella, els nutrients de l'orina s'assignen per millorar l'activitat de vol i la supervivència de les mosquites femenines, així com la supervivència de la sang i la reproducció dels individus. Per tant, la barreja d'orina té un paper nutricional important per als vectors de la malària que estan tancats com els adults desnodrits [8], ja que proporciona a les femelles la capacitat d'adquirir compostos nitrogenats importants mitjançant l'alimentació de baix risc. pot ser l'objectiu de futurs programes de gestió de vectors.