Gràcies per visitar Nature.com.Esteu utilitzant una versió del navegador amb suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).A més, per garantir un suport permanent, mostrem el lloc sense estils ni JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositives alhora.Utilitzeu els botons Anterior i Següent per moure's per tres diapositives alhora, o utilitzeu els botons lliscants al final per moure's per tres diapositives alhora.
La barrera hematoencefàlica i la barrera hematoencefàlica impedeixen que els agents bioterapèutics arribin als seus objectius al sistema nerviós central, dificultant així el tractament eficaç de les malalties neurològiques.Per descobrir nous transportadors cerebrals in vivo, vam introduir una biblioteca de pèptids del fag T7 i vam recollir sang i líquid cefaloraquidi (LCR) en sèrie mitjançant un model de rates de gran piscina conscient canulat.Els clons de fags específics es van enriquir molt en LCR després de quatre rondes de selecció.Les proves de pèptids candidats individuals van revelar un enriquiment de més de 1000 vegades en LCR.La bioactivitat del lliurament al cervell mediat per pèptids es va confirmar mitjançant una reducció del 40% del nivell d'amiloide-β al líquid cefaloraquidi mitjançant un inhibidor de pèptids BACE1 vinculat al nou pèptid de trànsit identificat.Aquests resultats suggereixen que els pèptids identificats mitjançant mètodes de selecció de fags in vivo poden ser vehicles útils per al lliurament sistèmic de macromolècules al cervell amb un efecte terapèutic.
La investigació sobre la teràpia dirigida al sistema nerviós central (SNC) s'ha centrat en gran mesura a identificar fàrmacs i agents optimitzats que presenten propietats d'orientació al SNC, amb menys esforç per descobrir els mecanismes que impulsen el lliurament actiu de fàrmacs al cervell.Això comença a canviar ara, ja que el lliurament de fàrmacs, especialment les molècules grans, és una part integral del desenvolupament de fàrmacs de neurociència moderna.L'entorn del sistema nerviós central està ben protegit pel sistema de barrera cerebrovascular, format per la barrera hematoencefàlica (BBB) ​​i la barrera hematoencefàlica (BCBB)1, el que fa que sigui difícil lliurar medicaments al cervell1,2.S'estima que gairebé tots els fàrmacs de molècules grans i més del 98% dels fàrmacs de molècules petites s'eliminen del cervell3.Per això és molt important identificar nous sistemes de transport cerebral que proporcionin un lliurament eficient i específic de fàrmacs terapèutics al SNC 4,5.Tanmateix, el BBB i el BCSFB també presenten una excel·lent oportunitat per al lliurament de fàrmacs, ja que penetren i entren a totes les estructures del cervell a través de la seva extensa vasculatura.Així, els esforços actuals per utilitzar mètodes no invasius de lliurament al cervell es basen en gran mesura en el mecanisme de transport mediat per receptors (PMT) mitjançant el receptor BBB6 endogen.Malgrat els avenços clau recents que utilitzen la via del receptor de la transferrina7,8, es requereix un desenvolupament addicional de nous sistemes de lliurament amb propietats millorades.Amb aquesta finalitat, el nostre objectiu era identificar pèptids capaços de mediar el transport de LCR, ja que en principi es podrien utilitzar per lliurar macromolècules al SNC o per obrir noves vies de receptors.En particular, receptors i transportadors específics del sistema cerebrovascular (BBB i BSCFB) poden servir com a dianes potencials per al lliurament actiu i específic de fàrmacs bioterapèutics.El líquid cefaloraquidi (LCR) és un producte secretor del plexe coroide (CS) i està en contacte directe amb el líquid intersticial del cervell a través de l'espai subaracnoideo i l'espai ventricular4.Recentment s'ha demostrat que el líquid cefaloraquidi subaracnoideo es difon excessivament a l'interstici del cervell9.Esperem accedir a l'espai parenquimàtic mitjançant aquest tracte d'entrada subaracnoïdal o directament a través del BBB.Per aconseguir-ho, hem implementat una estratègia robusta de selecció de fags in vivo que idealment identifica pèptids transportats per qualsevol d'aquestes dues vies diferents.
Ara descrivim un mètode de cribratge de visualització de fags in vivo seqüencial amb mostreig de CSF juntament amb una seqüenciació d'alt rendiment (HTS) per controlar les rondes de selecció inicials amb la major diversitat de biblioteques.El cribratge es va realitzar en rates conscients amb una cànula gran cisterna (CM) implantada de manera permanent per evitar la contaminació de la sang.És important destacar que aquest enfocament selecciona tant l'orientació cerebral com els pèptids amb activitat de transport a través de la barrera cerebrovascular.Hem utilitzat fags T7 a causa de la seva petita mida (~ 60 nm)10 i vam suggerir que són adequats per al transport de vesícules que permeten l'encreuament transcel·lular de la barrera endotelial i/o epitelial-medul·lar.Després de quatre rondes de panoràmica, les poblacions de fags es van aïllar mostrant un fort enriquiment de LCR in vivo i una associació de microvasos cerebrals.És important destacar que vam poder confirmar les nostres troballes demostrant que els pèptids millors candidats preferits i sintetitzats químicament són capaços de transportar càrrega de proteïnes al líquid cefaloraquidi.En primer lloc, es van establir els efectes farmacodinàmics del SNC combinant un pèptid de trànsit líder amb un inhibidor del pèptid BACE1.A més de demostrar que les estratègies de cribratge funcional in vivo poden identificar nous pèptids de transport cerebral com a transportadors efectius de càrrega de proteïnes, esperem que enfocaments de selecció funcional similars també esdevinguin importants per identificar noves vies de transport cerebral.
A partir de les unitats formadores de plaques (PFU), després de l'etapa d'envasament del fag, es va dissenyar i crear una biblioteca de pèptids de fags T7 lineals aleatoris de 12 mers amb una diversitat d'aproximadament 109 (vegeu Materials i mètodes).És important tenir en compte que hem analitzat acuradament aquesta biblioteca abans de la panoràmica in vivo.L'amplificació per PCR de mostres de biblioteques de fags mitjançant cebadors modificats va generar amplicons que eren directament aplicables a HTS (figura suplementària 1a).A causa de a) errors de seqüenciació HTS11, b) impacte en la qualitat dels primers (NNK) 1-12 i c) la presència de fags de tipus salvatge (pes) (insercions d'esquelet) a la biblioteca d'espera, es va implementar un procediment de filtratge de seqüències per extreure només informació de seqüència verificada (figura suplementària 1b).Aquests passos de filtre s'apliquen a totes les biblioteques de seqüenciació HTS.Per a la biblioteca estàndard, es van obtenir un total de 233.868 lectures, de les quals el 39% van superar els criteris de filtre i es van utilitzar per a l'anàlisi i selecció de la biblioteca per a les rondes posteriors (figura suplementària 1c–e).Les lectures eren predominantment múltiples de 3 parells de bases de longitud amb un pic a 36 nucleòtids (figura suplementària 1c), confirmant el disseny de la biblioteca (NNK) 1-12.En particular, aproximadament l'11% dels membres de la biblioteca contenien una inserció PAGISRELVDKL de tipus salvatge de 12 dimensions (wt) i gairebé la meitat de les seqüències (49%) contenien insercions o supressions.L'HTS de la biblioteca de la biblioteca va confirmar l'alta diversitat de pèptids a la biblioteca: més del 81% de les seqüències de pèptids es van trobar només una vegada i només l'1,5% es va produir en ≥4 còpies (figura suplementària 2a).Les freqüències d'aminoàcids (aa) a les 12 posicions del repertori es correlacionen bé amb les freqüències esperades per al nombre de codons generats pel repertori degenerat de NKK (figura suplementària 2b).La freqüència observada dels residus aa codificats per aquestes insercions es va correlacionar bé amb la freqüència calculada (r = 0, 893) (figura suplementària 2c).La preparació de biblioteques de fags per a la injecció inclou els passos d'amplificació i eliminació de l'endotoxina.S'ha demostrat anteriorment que això redueix potencialment la diversitat de biblioteques de fags12,13.Per tant, vam seqüenciar una biblioteca de fags amplificada per plaques que havia sofert l'eliminació d'endotoxines i la vam comparar amb la biblioteca original per estimar la freqüència d'AA.Es va observar una forta correlació (r = 0, 995) entre la piscina original i la piscina amplificada i purificada (figura suplementària 2d), cosa que indica que la competència entre clons amplificats en plaques utilitzant el fag T7 no va causar un biaix important.Aquesta comparació es basa en la freqüència dels motius tripèptids a cada biblioteca, ja que la diversitat de biblioteques (~ 109) no es pot capturar completament fins i tot amb HTS.L'anàlisi de freqüència d'aa a cada posició va revelar un petit biaix depenent de la posició a les tres últimes posicions del repertori introduït (figura suplementària 2e).En conclusió, vam concloure que la qualitat i la diversitat de la biblioteca eren acceptables i només es van observar canvis menors en la diversitat a causa de l'amplificació i la preparació de biblioteques de fags entre diverses rondes de selecció.
El mostreig de líquid cefaloraquidi en sèrie es pot realitzar mitjançant la implantació quirúrgica d'una cànula al CM de rates conscients per facilitar la identificació del fag T7 injectat per via intravenosa (iv) a través del BBB i/o BCSFB (Fig. 1a-b).Hem utilitzat dos braços de selecció independents (braços A i B) a les tres primeres rondes de selecció in vivo (Fig. 1c).Vam augmentar gradualment l'estricte de la selecció disminuint la quantitat total de fag introduït a les tres primeres rondes de selecció.Per a la quarta ronda de panoràmica, vam combinar mostres de les branques A i B i vam realitzar tres seleccions independents addicionals.Per estudiar les propietats in vivo de les partícules del fag T7 en aquest model, es va injectar un fag de tipus salvatge (insert mestre PAGISRELVDKL) a rates a través de la vena de la cua.La recuperació dels fags del líquid cefaloraquidi i de la sang en diferents moments va mostrar que els fags icosaèdrics T7 relativament petits tenien una fase inicial ràpida d'eliminació del compartiment sanguini (figura suplementària 3).A partir dels títols administrats i del volum de sang de les rates, vam calcular que només aproximadament l'1% en pes.El fag de la dosi administrada es va detectar a la sang 10 minuts després de la injecció intravenosa.Després d'aquest ràpid descens inicial, es va mesurar una eliminació primària més lenta amb una vida mitjana de 27,7 minuts.És important destacar que només es van recuperar molt pocs fags del compartiment CSF, cosa que indica un fons baix per a la migració de fags de tipus salvatge al compartiment CSF (figura suplementària 3).De mitjana, només es van detectar 1 x 10-3% de títols de fag T7 a la sang i 4 x 10-8% dels fags infusionats inicialment al líquid cefaloraquidi durant tot el període de mostreig (0-250 min).En particular, la vida mitjana (25, 7 min) del fag de tipus salvatge al líquid cefaloraquidi era similar a la observada a la sang.Aquestes dades demostren que la barrera que separa el compartiment CSF de la sang està intacta en rates canulades amb CM, permetent la selecció in vivo de biblioteques de fags per identificar clons que es transporten fàcilment de la sang al compartiment CSF.
(a) Configuració d'un mètode per tornar a mostrejar el líquid cefaloraquidi (LCR) d'una piscina gran.(b) Diagrama que mostra la ubicació cel·lular de la barrera del sistema nerviós central (SNC) i l'estratègia de selecció utilitzada per identificar pèptids que travessen la barrera hematoencefàlica (BBB) ​​i la barrera hematoencefàlica.( c ) Diagrama de flux de cribratge de visualització de fags in vivo.En cada ronda de selecció, es van injectar per via intravenosa els fags (identificadors d'animals dins de les fletxes).Dues branques alternatives independents (A, B) es mantenen per separat fins a la quarta ronda de selecció.Per a les rondes de selecció 3 i 4, es va seqüenciar manualment cada clon de fag extret del LCR.( d ) Cinètica del fag aïllat de sang (cercles vermells) i líquid cefaloraquidi (triangles verds) durant la primera ronda de selecció en dues rates canulades després de la injecció intravenosa de la biblioteca de pèptids T7 (2 x 1012 fags/animal).Els quadrats blaus indiquen la concentració inicial mitjana de fag a la sang, calculada a partir de la quantitat de fag injectat, tenint en compte el volum total de sang.Els quadrats negres indiquen el punt d'intersecció de la línia y extrapolada a partir de les concentracions de fags sanguinis.(e, f) Presenteu la freqüència relativa i la distribució de tots els possibles motius tripètids superposats que es troben al pèptid.Es mostra el nombre de motius trobats en 1000 lectures.Els motius enriquits significativament (p <0,001) es marquen amb punts vermells.( e ) Diagrama de dispersió de correlació que compara la freqüència relativa del motiu tripèptid de la biblioteca injectada amb el fag derivat de la sang dels animals # 1.1 i # 1.2.( f ) Diagrama de dispersió de correlació que compara les freqüències relatives dels motius de tripèptid de fags animals # 1.1 i # 1.2 aïllats a la sang i el líquid cefaloraquidi.( g, h ) Representació d'identificació de la seqüència de fags enriquits en sang ( g ) versus biblioteques injectades i fags enriquits en CSF ( h ) versus sang després d'una ronda de selecció in vivo en ambdós animals.La mida del codi d'una lletra indica amb quina freqüència es produeix aquest aminoàcid en aquesta posició.Verd = polar, morat = neutre, blau = bàsic, vermell = àcid i negre = aminoàcids hidrofòbics.La figura 1a, b va ser dissenyada i produïda per Eduard Urich.
Vam injectar una biblioteca de pèptids fags a dues rates instrumentals CM (clades A i B) i vam aïllar el fag del líquid cefaloraquidi i de la sang (figura 1d).L'eliminació ràpida inicial de la biblioteca va ser menys pronunciada en comparació amb el fag de tipus salvatge.La vida mitjana mitjana de la biblioteca injectada en ambdós animals va ser de 24,8 minuts en sang, similar al fag de tipus salvatge, i de 38,5 minuts en LCR.Les mostres de sang i de líquid cefaloraquidi de cada animal es van sotmetre a HTS i es van analitzar tots els pèptids identificats per detectar la presència d'un motiu tripèptid curt.Els motius tripètids es van triar perquè proporcionen una base mínima per a la formació d'estructura i les interaccions pèptid-proteïna14,15.Hem trobat una bona correlació en la distribució de motius entre la biblioteca de fags injectats i els clons extrets de la sang d'ambdós animals (Fig. 1e).Les dades indiquen que la composició de la biblioteca només s'enriqueix marginalment al compartiment sanguini.Les freqüències d'aminoàcids i les seqüències de consens es van analitzar més a cada posició mitjançant una adaptació del programari Weblogo16.Curiosament, vam trobar un fort enriquiment en residus de glicina en sang (Fig. 1g).Quan es va comparar la sang amb clons seleccionats del LCR, es va observar una selecció forta i una mica de deselecció de motius (Fig. 1f), i determinats aminoàcids estaven presents preferentment en posicions predeterminades en els 12 membres (Fig. 1h).En particular, els animals individuals difereixen significativament en el líquid cefaloraquidi, mentre que es va observar un enriquiment de glicina en sang en ambdós animals (figura suplementària 4a-j).Després d'un filtrat rigorós de les dades de la seqüència al líquid cefaloraquidi dels animals # 1.1 i # 1.2, es van obtenir un total de 964 i 420 pèptids únics de 12 mers (figura suplementària 1d-e).Els clons de fags aïllats es van amplificar i es van sotmetre a una segona ronda de selecció in vivo.Els fags extrets de la segona ronda de selecció es van sotmetre a HTS a cada animal i tots els pèptids identificats es van utilitzar com a entrada a un programa de reconeixement de motius per analitzar l'aparició de motius tripètids (Fig. 2a, b, ef).En comparació amb el primer cicle del fag recuperat del LCR, vam observar més selecció i deselecció de molts motius en LCR a les branques A i B (Fig. 2).Es va aplicar un algorisme d'identificació de xarxa per determinar si representaven diferents patrons de seqüència coherent.Es va observar una clara similitud entre les seqüències de 12 dimensions recuperades per CSF en el clade alternatiu A (Fig. 2c, d) i el clade B (Fig. 2g, h).L'anàlisi agrupada a cada branca va revelar diferents perfils de selecció per a pèptids de 12 mers (figura suplementària 5c, d) i un augment de la relació de títols de CSF/sang al llarg del temps per als clons agrupats després de la segona ronda de selecció en comparació amb la primera ronda de selecció (figura suplementària 5e).).
Enriquiment de motius i pèptids al líquid cefaloraquidi mitjançant dues rondes successives de selecció de visualització de fags funcionals in vivo.
Tots els fags del líquid cefaloraquidi recuperats de la primera ronda de cada animal (animals # 1.1 i # 1.2) es van agrupar, es van amplificar, es van seqüenciar amb HT i es van reinjectar junts (2 x 1010 fags/animal) 2 rates canulades SM (# 1.1 → #).2.1 i 2.2, 1.2 → 2.3 i 2.4).(a, b, e, f) Gràfics de dispersió de correlació que comparen la freqüència relativa dels motius tripèptids de tots els fags derivats del LCR a la primera i la segona rondes de selecció.Freqüència relativa i distribució de motius que representen tots els possibles tripèptids superposats que es troben en pèptids en ambdues orientacions.Es mostra el nombre de motius trobats en 1000 lectures.Els motius que es van seleccionar o excloure significativament (p < 0,001) en una de les biblioteques comparades es destaquen amb punts vermells.(c, d, g, h) Representació del logotip de la seqüència de totes les seqüències llargues de 12 aminoàcids riques en CSF basades en les rondes 2 i 1 de selecció in vivo.La mida del codi d'una lletra indica amb quina freqüència es produeix aquest aminoàcid en aquesta posició.Per representar el logotip, es compara la freqüència de seqüències de LCR extretes d'animals individuals entre dues rondes de selecció i es mostren les seqüències enriquides de la segona ronda: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 i (h) #1.2–#2.4.Els aminoàcids més enriquits en una posició determinada en (c, d) animals núm.2.1 i núm.2.2 o (g, h) en animals núm.2.3 i núm.2.4 es mostren en color.Verd = polar, morat = neutre, blau = bàsic, vermell = àcid i negre = aminoàcids hidrofòbics.
Després de la tercera ronda de selecció, vam identificar 124 seqüències de pèptids úniques (núm. 3.1 i núm. 3.2) de 332 clons de fags reconstituïts amb CSF aïllats de dos animals (figura suplementària 6a).La seqüència LGSVS (18,7%) va tenir la proporció relativa més alta, seguida de les insercions de tipus salvatge PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) i SARGSWREIVSLS (2,2%).A la quarta ronda final, vam agrupar dues branques seleccionades de manera independent de tres animals separats (Fig. 1c).Dels 925 clons de fags seqüenciats recuperats del LCR, a la quarta ronda vam trobar 64 seqüències de pèptids úniques (figura suplementària 6b), entre les quals la proporció relativa de fags de tipus salvatge va baixar al 0, 8%.Els clons de LCR més comuns a la quarta ronda van ser LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) i RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).L'interval de longitud dels pèptids seleccionats es deu a les insercions/delecions de nucleòtids o als codons de parada prematurs als primers de la biblioteca quan s'utilitzen codons degenerats per al disseny de la biblioteca NNK.Els codons de parada prematurs generen pèptids més curts i es seleccionen perquè contenen el motiu favorable aa.Els pèptids més llargs poden resultar d'insercions/delecions en els cebadors de les biblioteques sintètiques.Això posiciona el codó de parada dissenyat fora del marc i el llegeix fins que apareix un nou codó de parada aigües avall.En general, hem calculat els factors d'enriquiment per a les quatre rondes de selecció comparant les dades d'entrada amb les dades de sortida de la mostra.Per a la primera ronda de cribratge, vam utilitzar títols de fags de tipus salvatge com a referència de fons no específica.Curiosament, la selecció negativa de fags va ser molt forta en el primer cicle del LCR, però no a la sang (Fig. 3a), cosa que pot ser deguda a la baixa probabilitat de difusió passiva de la majoria dels membres de la biblioteca de pèptids al compartiment del LCR o els fags relatius tendeixen a ser retinguts o eliminats de manera més eficient del torrent sanguini que els bacteriòfags.Tanmateix, a la segona ronda de panoràmica, es va observar una forta selecció de fags en LCR en ambdós clades, cosa que suggereix que la ronda anterior es va enriquir en fags que mostraven pèptids que promouen la captació de LCR (Fig. 3a).De nou, sense un enriquiment sanguini significatiu.També a la tercera i quarta rondes, els clons de fags es van enriquir significativament en LCR.Comparant la freqüència relativa de cada seqüència de pèptids única entre les dues últimes rondes de selecció, vam trobar que les seqüències estaven encara més enriquides a la quarta ronda de selecció (Fig. 3b).Es van extreure un total de 931 motius de pèptids de les 64 seqüències peptídiques úniques utilitzant ambdues orientacions peptídiques.Els motius més enriquits de la quarta ronda es van examinar més de prop per als seus perfils d'enriquiment a totes les rondes en comparació amb la biblioteca injectada (tall: 10% d'enriquiment) (figura suplementària 6c).Els patrons generals de selecció van mostrar que la majoria dels motius estudiats es van enriquir en totes les rondes prèvies d'ambdues branques de selecció.Tanmateix, alguns motius (per exemple, SGL, VSG, LGS GSV) eren predominantment del clade alternatiu A, mentre que altres (per exemple, FGW, RTN, WGF, NTR) es van enriquir en el clade alternatiu B.
Validació del transport de LCR de pèptids mostrats en fags enriquits amb CSF i pèptids líders biotinilats conjugats a càrregues útils d'estreptavidina.
( a ) Relacions d'enriquiment calculades a les quatre rondes (R1-R4) basades en títols de fags (PFU) injectats (entrada = I) i títols de fags CSF determinats (sortida = O).Els factors d'enriquiment de les tres darreres rondes (R2-R4) es van calcular en comparació amb la ronda anterior i la primera ronda (R1) amb dades de pes.Les barres obertes són líquid cefaloraquidi, les barres ombrejades són plasma.(***p<0,001, basat en la prova t de Student).( b ) Llista dels pèptids fags més abundants, classificats segons la seva proporció relativa amb tots els fags recollits en CSF després de la ronda 4 de selecció.Els sis clons de fags més comuns es destaquen en color, numerats i els seus factors d'enriquiment entre les rondes 3 i 4 de selecció (inserts).( c, d ) Els sis clons de fags més enriquits, les biblioteques de pèptids de fags buits i parentals de la ronda 4 es van analitzar individualment en un model de mostreig de CSF.Es van recollir mostres de LCR i sang en els moments indicats.(c) Quantitats iguals de 6 clons de fags candidats (2 x 1010 fags/animals), fags buits (núm. 1779) (2 x 1010 fags/animals) i biblioteques de pèptids de fags (2 x 1012 fags/animals).Es mostra la farmacocinètica de CSF de cada clon de fags injectat i biblioteca de pèptids de fags al llarg del temps.( d ) mostra la relació CSF / sang mitjana per a tots els fags / ml recuperats durant el temps de mostreig.( e ) Es van vincular quatre pèptids líders sintètics i un control remenat amb biotina a estreptavidina a través del seu N-terminal (visualització de tetràmer) seguit d'una injecció (vena de la cua iv, 10 mg d'estreptavidina/kg).Almenys tres rates intubades (N = 3).).Es van recollir mostres de LCR als punts de temps indicats i es van mesurar les concentracions d'estreptavidina mitjançant ELISA anti-estreptavidina de LCR (nd = no detectat).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basat en la prova ANOVA).(f) Comparació de la seqüència d'aminoàcids del clon de pèptids fags més enriquit #2002 (morat) amb altres clons de pèptids fags seleccionats de la quarta ronda de selecció.Els fragments d'aminoàcids idèntics i similars estan codificats per colors.
De tots els fags enriquits a la quarta ronda (Fig. 3b), es van seleccionar sis clons candidats per a una anàlisi individual posterior al model de mostreig de CSF.Es van injectar quantitats iguals de sis biblioteques de fàgs candidats, de fags buits (sense inserció) i de pèptids de profagos a tres animals CM canulats i es va determinar la farmacocinètica en assajos de CSF (Fig. 3c) i sang (Fig. 7 suplementària).Tots els clons de fags provats es van dirigir al compartiment del LCR a un nivell 10-1000 vegades superior al del fag de control buit (núm. 1779).Per exemple, els clons #2020 i #2077 tenien uns títols de LCR 1000 vegades més alts que el fag de control.El perfil farmacocinètic de cada pèptid seleccionat és diferent, però tots tenen una alta capacitat d'homing del LCR.Vam observar una disminució constant al llarg del temps per als clons #1903 i #2011, mentre que per als clons #2077, #2002 i #2009 un augment durant els primers 10 minuts podria indicar transport actiu, però s'ha de verificar.Els clons #2020, #2002 i #2077 es van estabilitzar a nivells alts, mentre que la concentració de LCR del clon #2009 va disminuir lentament després de l'augment inicial.A continuació, vam comparar la freqüència relativa de cada candidat de LCR amb la seva concentració en sang (Fig. 3d).La correlació del títol mitjà de cada candidat de LCR amb el seu títol de sang en tots els moments de mostreig va mostrar que tres dels sis candidats estaven enriquits significativament en LCR de sang.Curiosament, el clon #2077 va mostrar una estabilitat de la sang més alta (figura suplementària 7).Per confirmar que els propis pèptids són capaços de transportar activament càrrega que no siguin les partícules del fag al compartiment del LCR, vam sintetitzar quatre pèptids líders derivatitzats amb biotina a l'extrem N-terminal on els pèptids s'uneixen a la partícula del fag.Els pèptids biotinilats (núms. 2002, 2009, 2020 i 2077) es van conjugar amb estreptavidina (SA) per obtenir formes multimèriques que imitaven una mica la geometria del fag.Aquest format també ens va permetre mesurar l'exposició a la SA en sang i líquid cefaloraquidi com a pèptids proteics que transporten càrrega.És important destacar que les dades dels fags sovint es podrien reproduir quan s'administraven pèptids sintètics en aquest format conjugat amb SA (Fig. 3e).Els pèptids remenats tenien menys exposició inicial i una eliminació més ràpida del LCR amb nivells indetectables en 48 hores.Per conèixer les vies de lliurament d'aquests clons de fags peptídics a l'espai CSF, es va analitzar la localització d'impactes de pèptids fags individuals mitjançant immunohistoquímica (IHC) per detectar directament partícules de fags 1 hora després de la injecció intravenosa in vivo.En particular, els clons # 2002, # 2077 i # 2009 es van poder detectar mitjançant una tinció forta als capil·lars cerebrals, mentre que el fag de control (# 1779) i el clon # 2020 no es van detectar (figura suplementària 8).Això suggereix que aquests pèptids contribueixen a l'efecte sobre el cervell precisament creuant el BBB.Es requereix una anàlisi més detallada per provar aquesta hipòtesi, ja que també pot estar implicada la ruta BSCFB.En comparar la seqüència d'aminoàcids del clon més enriquit (#2002) amb altres pèptids seleccionats, es va observar que alguns d'ells tenen extensions d'aminoàcids similars, cosa que pot indicar un mecanisme de transport similar (Fig. 3f).
A causa del seu perfil de plasma únic i d'un augment significatiu de LCR al llarg del temps, el clon de visualització de fags #2077 es va explorar més durant un període més llarg de 48 hores i va poder reproduir el ràpid augment de LCR observat en associació amb nivells de SA sostinguts (Fig. 4a).Pel que fa a altres clons de fags identificats, el # 2077 es va tacar fortament per als capil·lars cerebrals i va mostrar una colocalització significativa amb la lectina del marcador capil·lar quan es va veure amb una resolució més alta i possiblement una mica de tinció a l'espai parenquimàtic (figura 4b).Per investigar si es podrien obtenir efectes farmacològics mediats per pèptids al SNC, vam realitzar un experiment en què versions biotinilades de i) el pèptid de trànsit #2077 i ii) el pèptid inhibidor de BACE1 es van barrejar amb SA en dues proporcions diferents.Per a una combinació només hem utilitzat l'inhibidor del pèptid BACE1 i per a l'altra hem utilitzat una proporció 1:3 d'inhibidor del pèptid BACE1 al pèptid #2077.Ambdues mostres es van administrar per via intravenosa i es van mesurar els nivells de sang i líquid cefaloraquidi del pèptid beta-amiloide 40 (Abeta40) al llarg del temps.Abeta40 es va mesurar en LCR, ja que reflecteix la inhibició de BACE1 al parènquima cerebral.Com era d'esperar, ambdós complexos van reduir significativament els nivells sanguinis d'Abeta40 (Fig. 4c, d).Tanmateix, només les mostres que contenen una barreja de pèptid núm.2077 i un inhibidor del pèptid BACE1 conjugat a SA van provocar una disminució significativa d'Abeta40 al líquid cefaloraquidi (Fig. 4c).Les dades mostren que el pèptid núm.2077 és capaç de transportar la proteïna SA de 60 kDa al SNC i també indueix efectes farmacològics amb inhibidors del pèptid BACE1 conjugats amb SA.
( a ) Injecció clonal (2 × 10 fags/animal) del fag T7 que mostra perfils farmacocinètics a llarg termini del pèptid CSF # 2077 (RLSSVDSDLSGC) i del fag de control no injectat (# 1779) en almenys tres rates intubades amb CM.( b ) Imatge microscòpica confocal de microvasos corticals representatius en rates injectades amb fags (2 × 10 10 fags/animal) que mostra la contratinció del pèptid #2077 i dels vasos (lectina).Aquests clons de fags es van administrar a 3 rates i es van deixar circular durant 1 hora abans de la perfusió.Els cervells es van seccionar i es van tacar amb anticossos policlonals marcats amb FITC contra la càpsida del fag T7.Deu minuts abans de la perfusió i la fixació posterior, es va administrar per via intravenosa la lectina marcada amb DyLight594.Imatges fluorescents que mostren una tinció de lectina (vermell) del costat luminal dels microvasos i fags (verd) a la llum dels capil·lars i del teixit cerebral perivascular.La barra d'escala correspon a 10 µm.( c, d ) El pèptid inhibidor BACE1 biotinilat sol o en combinació amb el pèptid de trànsit biotinilat # 2077 es va acoblar a estreptavidina seguida d'una injecció intravenosa d'almenys tres rates CM canulades (10 mg d'estreptavidina/kg).La reducció de l'Aβ40 mediada per l'inhibidor del pèptid BACE1 es va mesurar mitjançant ELISA Aβ1-40 en sang (vermell) i líquid cefaloraquidi (taronja) en els punts de temps indicats.Per a una millor claredat, es dibuixa una línia de punts al gràfic a una escala del 100%.(c) Reducció percentual d'Aβ40 en sang (triangles vermells) i líquid cefaloraquidi (triangles taronges) en rates tractades amb estreptavidina conjugada al pèptid de trànsit #2077 i pèptid inhibidor BACE1 en una proporció 3:1.( d ) Reducció percentual de la sang Aβ40 (cercles vermells) i del líquid cefaloraquidi (cercles taronges) de rates tractades amb estreptavidina acoblada només a un pèptid inhibidor de BACE1.La concentració d'Aβ al control era de 420 pg/ml (desviació estàndard = 101 pg/ml).
La visualització de fags s'ha aplicat amb èxit en diverses àrees de la investigació biomèdica17.Aquest mètode s'ha utilitzat per a estudis de diversitat vascular in vivo18,19, així com per a estudis dirigits als vasos cerebrals20,21,22,23,24,25,26.En aquest estudi, hem ampliat l'aplicació d'aquest mètode de selecció no només a la identificació directa de pèptids dirigits als vasos cerebrals, sinó també al descobriment de candidats amb propietats de transport actiu per creuar la barrera hematoencefàlica.Ara descrivim el desenvolupament d'un procediment de selecció in vivo en rates intubades amb CM i demostrem el seu potencial per identificar pèptids amb propietats d'homing de LCR.Utilitzant el fag T7 que mostra una biblioteca de pèptids aleatoris de 12 mers, vam poder demostrar que el fag T7 és prou petit (uns 60 nm de diàmetre)10 per adaptar-se a la barrera hematoencefàlica, travessant així directament la barrera hematoencefàlica o plexe coroide.Vam observar que la recol·lecció de CSF de rates CM canulades era un mètode de cribratge funcional in vivo ben controlat i que el fag extret no només es va unir a la vasculatura, sinó que també funcionava com a transportador a través de la barrera hematoencefàlica.A més, en recollir sang i aplicar simultàniament HTS al LCR i als fags derivats de la sang, vam confirmar que la nostra elecció de LCR no estava influenciada per l'enriquiment de la sang o l'aptitud per a l'expansió entre les rondes de selecció.Tanmateix, el compartiment de la sang forma part del procediment de selecció, ja que els fags capaços d'arribar al compartiment del LCR han de sobreviure i circular pel torrent sanguini el temps suficient per enriquir-se al cervell.Per extreure informació de seqüència fiable de les dades HTS en brut, vam implementar filtres adaptats als errors de seqüenciació específics de la plataforma en el flux de treball d'anàlisi.En incorporar paràmetres cinètics al mètode de cribratge, vam confirmar la farmacocinètica ràpida dels fags T7 de tipus salvatge (t½ ~ 28 min) a la sang24, 27, 28 i també vam determinar la seva semivida en líquid cefaloraquidi (t½ ~ 26 min) per minut).Malgrat els perfils farmacocinètics similars a la sang i el LCR, només es va poder detectar el 0,001% de la concentració sanguínia del fag al LCR, cosa que indica una baixa mobilitat de fons del fag T7 de tipus salvatge a través de la barrera hematoencefàlica.Aquest treball destaca la importància de la primera ronda de selecció quan s'utilitzen estratègies de panoràmica in vivo, especialment per als sistemes de fags que s'eliminen ràpidament de la circulació, ja que pocs clons poden arribar al compartiment del SNC.Així, a la primera ronda, la reducció de la diversitat de biblioteques va ser molt gran, ja que només es va recollir un nombre limitat de clons en aquest model CSF molt estricte.Aquesta estratègia de panoràmica in vivo va incloure diversos passos de selecció, com ara l'acumulació activa al compartiment de LCR, la supervivència del clon al compartiment de la sang i l'eliminació ràpida de clons de fags T7 de la sang durant els primers 10 minuts (figura 1d i figura suplementària 4M).).Així, després de la primera ronda, es van identificar diferents clons de fags en LCR, tot i que es va utilitzar el mateix grup inicial per a animals individuals.Això suggereix que diversos passos de selecció estrictes per a les biblioteques font amb un gran nombre de membres de la biblioteca donen lloc a una reducció significativa de la diversitat.Per tant, els esdeveniments aleatoris es convertiran en una part integral del procés de selecció inicial, influint molt en el resultat.És probable que molts dels clons de la biblioteca original tinguessin una propensió d'enriquiment de CSF molt similar.Tanmateix, fins i tot en les mateixes condicions experimentals, els resultats de la selecció poden diferir a causa del nombre reduït de cada clon en particular al grup inicial.
Els motius enriquits en LCR difereixen dels de la sang.Curiosament, vam observar el primer canvi cap a pèptids rics en glicina a la sang d'animals individuals.(Fig. 1g, figures complementàries 4e, 4f).Els fags que contenen pèptids de glicina poden ser més estables i tenir menys probabilitats de ser trets de la circulació.Tanmateix, aquests pèptids rics en glicina no es van detectar a les mostres de líquid cefaloraquidi, cosa que suggereix que les biblioteques curades van passar per dos passos de selecció diferents: un a la sang i un altre que es va permetre acumular al líquid cefaloraquidi.Els clons enriquits amb CSF resultants de la quarta ronda de selecció s'han provat àmpliament.Es va confirmar que gairebé tots els clons provats individualment estaven enriquits en LCR en comparació amb el fag de control en blanc.Es va examinar amb més detall un cop de pèptid (núm. 2077).Va mostrar una semivida plasmàtica més llarga en comparació amb altres èxits (figura 3d i figura suplementària 7) i, curiosament, aquest pèptid contenia un residu de cisteïna a l'extrem C-terminal.Recentment s'ha demostrat que l'addició de cisteïna als pèptids pot millorar les seves propietats farmacocinètiques en unir-se a l'albúmina 29 .Això es desconeix actualment per al pèptid #2077 i requereix més estudi.Alguns pèptids van mostrar una dependència de la valència en l'enriquiment del LCR (dades no mostrades), que pot estar relacionada amb la geometria de la superfície mostrada de la càpsida T7.El sistema T7 que vam utilitzar mostrava 5-15 còpies de cada pèptid per partícula de fag.L'IHC es va realitzar en clons de fags de plom candidats injectats per via intravenosa a l'escorça cerebral de rates (figura suplementària 8).Les dades van mostrar que almenys tres clons (núm. 2002, núm. 2009 i núm. 2077) van interactuar amb el BBB.Queda per determinar si aquesta interacció BBB dóna lloc a l'acumulació de CSF o al moviment d'aquests clons directament al BCSFB.És important destacar que mostrem que els pèptids seleccionats conserven la seva capacitat de transport de LCR quan es sinteteixen i s'uneixen a la càrrega de proteïnes.La unió de pèptids biotinilats N-terminals a SA repeteix essencialment els resultats obtinguts amb els seus respectius clons de fags en sang i líquid cefaloraquidi (Fig. 3e).Finalment, mostrem que el pèptid de plom #2077 és capaç de promoure l'acció cerebral d'un inhibidor de pèptids biotinilats de BACE1 conjugat a SA, provocant efectes farmacodinàmics pronunciats al SNC reduint significativament els nivells d'Abeta40 en el LCR (Fig. 4).No hem pogut identificar cap homòleg a la base de dades realitzant una cerca d'homologia de la seqüència de pèptids de tots els resultats.És important tenir en compte que la mida de la biblioteca T7 és d'aproximadament 109, mentre que la mida de la biblioteca teòrica per a 12-mers és de 4 x 1015. Per tant, només hem seleccionat una petita fracció de l'espai de diversitat de la biblioteca de pèptids de 12-mer, la qual cosa pot significar que es poden identificar pèptids més optimitzats avaluant l'espai de seqüències d'èxit adjacents.Hipotèticament, una de les raons per les quals no hem trobat cap homòleg natural d'aquests pèptids pot ser la deselecció durant l'evolució per evitar l'entrada incontrolada de certs motius peptídics al cervell.
En conjunt, els nostres resultats proporcionen una base per a treballs futurs per identificar i caracteritzar els sistemes de transport de la barrera cerebrovascular in vivo amb més detall.La configuració bàsica d'aquest mètode es basa en una estratègia de selecció funcional que no només identifica clons amb propietats d'unió vascular cerebral, sinó que també inclou un pas crític en què els clons amb èxit tenen activitat intrínseca per creuar barreres biològiques in vivo al compartiment del SNC.és dilucidar el mecanisme de transport d'aquests pèptids i la seva preferència per unir-se a la microvasculatura específica de la regió cerebral.Això pot conduir al descobriment de noves vies per al transport de la BBB i els receptors.Esperem que els pèptids identificats es puguin unir directament a receptors cerebrovasculars o a lligands circulants transportats a través del BBB o BCSFB.Els vectors pèptids amb activitat de transport de LCR descoberts en aquest treball s'investigaran més a fons.Actualment estem investigant l'especificitat cerebral d'aquests pèptids per la seva capacitat per creuar el BBB i/o el BCSFB.Aquests nous pèptids seran eines extremadament valuoses per al descobriment potencial de nous receptors o vies i per al desenvolupament de noves plataformes altament eficients per al lliurament de macromolècules, com ara productes biològics, al cervell.
Canuleu la cisterna gran (CM) mitjançant una modificació del mètode descrit anteriorment.Es van muntar rates Wistar anestesiades (200-350 g) en un aparell estereotàxic i es va fer una incisió mitjana sobre el cuir cabellut afaitat i preparat asèpticament per exposar el crani.Perforar dos forats a la zona de la faixa superior i fixar els cargols de fixació als forats.Es va perforar un forat addicional a la cresta occipital lateral per guiar estereotàcticament una cànula d'acer inoxidable al CM.Apliqueu ciment dental al voltant de la cànula i fixeu-lo amb cargols.Després de la fotocurat i l'enduriment del ciment, la ferida de la pell es va tancar amb una sutura supramida 4/0.La col·locació correcta de la cànula es confirma per la fuita espontània de líquid cefaloraquidi (LCR).Traieu la rata de l'aparell estereotàxic, rebeu l'atenció postoperatòria adequada i la gestió del dolor i deixeu-la recuperar durant almenys una setmana fins que s'observin signes de sang al líquid cefaloraquidi.Les rates Wistar (Crl:WI/Han) es van obtenir de Charles River (França).Totes les rates es van mantenir en condicions específiques lliures de patògens.Tots els experiments amb animals van ser aprovats per l'Oficina Veterinària de la ciutat de Basilea, Suïssa, i es van realitzar d'acord amb la llicència d'animals núm. 2474 (Avaluació del transport actiu del cervell mitjançant la mesura dels nivells de candidats terapèutics al líquid cefaloraquidi i al cervell de rata).
Mantingueu suaument la rata conscient amb la cànula CM a la mà.Traieu Datura de la cànula i recolliu 10 µl de líquid cefaloraquidi que flueix espontàniament.Com que la permeabilitat de la cànula es va veure finalment compromesa, en aquest estudi només es van incloure mostres clares de líquid cefaloraquidi sense evidència de contaminació o decoloració de la sang.Paral·lelament, es van extreure aproximadament 10-20 μl de sang d'una petita incisió a la punta de la cua en tubs amb heparina (Sigma-Aldrich).El LCR i la sang es van recollir en diversos moments després de la injecció intravenosa del fag T7.Es van descartar aproximadament 5-10 μl de líquid abans de recollir cada mostra de LCR, que correspon al volum mort del catèter.
Les biblioteques es van generar mitjançant el vector T7Select 10-3b tal com es descriu al manual del sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Breument, es va sintetitzar una inserció aleatòria d'ADN de 12 mers en el format següent:
El codó NNK es va utilitzar per evitar codons de doble parada i la sobreexpressió d'aminoàcids a la inserció.N és una proporció equimolar barrejada manualment de cada nucleòtid, i K és una proporció equimolar barrejada manualment de nucleòtids d'adenina i citosina.Les regions monocatenàries es van convertir en DNA de doble cadena mitjançant una incubació posterior amb dNTP (Novagen) i l'enzim Klenow (New England Biolabs) al tampó Klenow (New England Biolabs) durant 3 hores a 37 ° C.Després de la reacció, es va recuperar l'ADN de doble cadena mitjançant precipitació amb EtOH.L'ADN resultant es va digerir amb els enzims de restricció EcoRI i HindIII (tots dos de Roche).La inserció escindida i purificada (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) es va lligar en el marc en un vector T7 preesclat després de l'aminoàcid 348 del gen de la càpsida 10B.Les reaccions de lligament es van incubar a 16 °C durant 18 hores abans de l'envasament in vitro.L'empaquetament de fags in vitro es va realitzar segons les instruccions subministrades amb el kit de clonació T7Select 10-3b (Novagen) i la solució d'envasament es va amplificar una vegada fins a la lisi mitjançant Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Els lisats es van centrifugar, es van valorar i es van congelar a -80 °C com a solució de reserva de glicerol.
Amplificació directa per PCR de regions variables de fags amplificades en brou o placa mitjançant cebadors de fusió patentats 454/Roche-amplicon.L'imprimació de fusió directa conté seqüències que flanquegen la regió variable (NNK) 12 (específica de la plantilla), l'adaptador A de titani GS FLX i una seqüència de claus de biblioteca de quatre bases (TCAG) (figura suplementària 1a):
L'imprimació de fusió inversa també conté biotina unida a les perles de captura i l'adaptador de titani GS FLX B necessari per a l'amplificació clonal durant la PCR en emulsió:
A continuació, els amplicons es van sotmetre a piroseqüenciació 454/Roche segons el protocol de titani 454 GS-FLX.Per a la seqüenciació manual de Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), l'ADN del fag T7 es va amplificar per PCR i es va seqüenciar amb els següents parells d'imprimadors:
Els inserts de plaques individuals es van sotmetre a una amplificació per PCR mitjançant el kit de polimerasa d'ADN d'inici ràpid de Roche (segons les instruccions del fabricant).Realitzeu un inici en calent (10 min a 95 °C) i 35 cicles de reforç (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C i 1 min a 72 °C).
El fag de les biblioteques, el fag de tipus salvatge, el fag rescatat de LCR i sang, o clons individuals es van amplificar a Escherichia coli BL5615 en brou TB (Sigma Aldrich) o en plats de 500 cm2 (Thermo Scientific) durant 4 h a 37 ° C.Els fags es van extreure de les plaques esbandint les plaques amb tampó Tris-EDTA (Fluka Analytical) o recollint les plaques amb puntes de pipeta estèrils.Els fags es van aïllar del sobrenedant de cultiu o del tampó d'extracció amb una ronda de precipitació de polietilè glicol (PEG 8000) (Promega) i es van tornar a suspendre en el tampó Tris-EDTA.
El fag amplificat es va sotmetre a 2-3 rondes d'eliminació d'endotoxines mitjançant perles d'eliminació d'endotoxines (Miltenyi Biotec) abans de la injecció intravenosa (IV) (500 μl/animal).A la primera ronda es van introduir 2×1012 fags;en el segon, 2×1010 fags;a la tercera i quarta ronda de selecció, 2×109 fags per animal.El contingut de fags en LCR i mostres de sang recollides en els punts de temps indicats es va determinar mitjançant el recompte de plaques segons les instruccions del fabricant (manual del sistema T7Select).La selecció de fags es va realitzar mitjançant la injecció intravenosa de biblioteques purificades a la vena de la cua o mitjançant la reinjecció de fags extrets de CSF de la ronda de selecció anterior, i les collites posteriors es van realitzar a 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min i 240 min CSF i mostres de sang respectivament.Es van realitzar un total de quatre rondes de panoràmica in vivo en les quals les dues branques seleccionades es van emmagatzemar i analitzar per separat durant les tres primeres rondes de selecció.Tots els inserts de fags extrets del LCR de les dues primeres rondes de selecció es van sotmetre a la piroseqüenciació 454/Roche, mentre que tots els clons extrets del CSF de les dues últimes rondes de selecció es van seqüenciar manualment.Tots els fags sanguinis de la primera ronda de selecció també van ser sotmesos a la piroseqüenciació 454/Roche.Per a la injecció de clons de fags, els fags seleccionats es van amplificar en E. coli (BL5615) en plaques de 500 cm2 a 37 °C durant 4 hores.Els clons seleccionats individualment i seqüenciats manualment es van propagar en medi TB.Després de l'extracció del fag, la purificació i l'eliminació de l'endotoxina (tal com es descriu anteriorment), es van injectar per via intravenosa 2 × 1010 fags/animal en 300 μl en una vena de la cua.
Preprocessament i filtratge qualitatiu de dades de seqüències.Les dades en brut 454/Roche es van convertir d'un format de mapa de flux estàndard binari (sff) a un format llegible per a persones de Pearson (fasta) mitjançant programari del proveïdor.Es va realitzar un processament posterior de la seqüència de nucleòtids mitjançant programes i scripts C propietaris (paquet de programari inèdit) tal com es descriu a continuació.L'anàlisi de dades primàries inclou estrictes procediments de filtrat en diverses etapes.Per filtrar les lectures que no contenien una seqüència d'ADN d'inserció de 12mers vàlida, les lectures es van alinear seqüencialment amb l'etiqueta inicial (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), l'etiqueta de parada (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) i la inserció de fons (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) mitjançant el test global de Needleman-Wunsch.alineació que permet fins a 2 inconsistències per alineació31.Per tant, les lectures sense etiquetes d'inici i parada i les lectures que contenien insercions de fons, és a dir, les alineacions que superen el nombre permès de no coincidències, es van eliminar de la biblioteca.Pel que fa a les lectures restants, la seqüència d'ADN N-mer que s'estén des de la marca d'inici i acaba abans que la marca de parada es va eliminar de la seqüència de lectura original i es va processar posteriorment (d'ara endavant, "inserció").Després de la traducció de la inserció, la porció després del primer codó de parada a l'extrem 5' de l'imprimació s'elimina de la inserció.A més, també es van eliminar els nucleòtids que conduïen a codons incomplets a l'extrem 3' de l'encebador.Per excloure les insercions que contenien només seqüències de fons, també es van eliminar les insercions traduïdes que començaven amb el patró d'aminoàcids "PAG".Els pèptids amb una longitud posterior a la traducció de menys de 3 aminoàcids es van eliminar de la biblioteca.Finalment, elimineu la redundància del grup d'insercions i determineu la freqüència de cada inserció única.Els resultats d'aquesta anàlisi van incloure una llista de seqüències de nucleòtids (insercions) i les seves freqüències (llegir) (figures suplementàries 1c i 2).
Agrupeu les insercions d'ADN N-mer per similitud de seqüència: per eliminar els errors de seqüenciació específics de 454/Roche (com ara problemes amb la seqüenciació d'extensions d'homopolímers) i eliminar les redundàncies menys importants, les insercions de seqüències d'ADN N-mer filtrades prèviament (insercions) s'ordenen per similitud.insercions (permeten fins a 2 bases no coincidents) mitjançant un algorisme iteratiu definit de la següent manera: les insercions s'ordenen primer per la seva freqüència (de més gran a més baixa) i, si són iguals, per la seva ordenació secundària per longitud (de més llarg a més curt) ).Així, les insercions més freqüents i llargues defineixen el primer “grup”.La freqüència del grup s'estableix a la freqüència clau.Aleshores, es va intentar afegir cada inserció que quedava a la llista ordenada al grup mitjançant l'alineació Needleman-Wunsch per parelles.Si el nombre de no coincidències, insercions o supressions en una alineació no supera el llindar de 2, s'afegeix una inserció al grup i la freqüència total del grup augmenta amb la freqüència amb què s'ha afegit la inserció.Les insercions afegides a un grup es marquen com a utilitzades i s'exclouen del processament posterior.Si la seqüència d'inserció no es pot afegir a un grup ja existent, la seqüència d'inserció s'utilitza per crear un grup nou amb la freqüència d'inserció adequada i es marca com a utilitzat.La iteració acaba quan cada seqüència d'inserció s'ha utilitzat per formar un grup nou o es pot incloure en un grup ja existent.Després de tot, les insercions agrupades que consisteixen en nucleòtids es tradueixen finalment en seqüències de pèptids (biblioteca de pèptids).El resultat d'aquesta anàlisi és un conjunt d'insercions i les seves freqüències corresponents que conformen el nombre de lectures consecutives (figura suplementària 2).
Generació de motius: a partir d'una llista de pèptids únics, es va crear una biblioteca que conté tots els patrons d'aminoàcids possibles (aa) tal com es mostra a continuació.Cada patró possible de longitud 3 es va extreure del pèptid i es va afegir el seu patró invers juntament amb una biblioteca de motius comuns que contenia tots els patrons (tripèptids).Es van seqüenciar biblioteques de motius altament repetitius i es va eliminar la redundància.A continuació, per a cada tripèptid de la biblioteca de motius, vam comprovar la seva presència a la biblioteca mitjançant eines computacionals.En aquest cas, la freqüència del pèptid que conté el tripèptid del motiu trobat s'afegeix i s'assigna al motiu a la biblioteca de motius ("nombre de motius").El resultat de la generació de motius és una matriu bidimensional que conté totes les ocurrències de tripèptids (motius) i els seus valors respectius, que són el nombre de lectures de seqüenciació que donen lloc al motiu corresponent quan les lectures es filtren, s'agrupen i es tradueixen.Mètriques tal com es descriu en detall anteriorment.
Normalització del nombre de motius i els corresponents diagrames de dispersió: el nombre de motius per a cada mostra es va normalitzar mitjançant
on ni és el nombre de lectures que contenen el tema i.Així, vi representa la freqüència percentual de lectures (o pèptids) que contenen el motiu i a la mostra.Els valors P per al nombre de motius no normalitzats es van calcular mitjançant la prova exacta de Fisher.Pel que fa als correlogrames del nombre de motius, les correlacions de Spearman es van calcular utilitzant el nombre normalitzat de motius amb R.
Per visualitzar el contingut d'aminoàcids a cada posició de la biblioteca de pèptids, es van crear els logogrames web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).En primer lloc, el contingut d'aminoàcids a cada posició del pèptid 12-mer s'emmagatzema en una matriu de 20 × 12.A continuació, es genera un conjunt de 1000 pèptids que contenen el mateix contingut relatiu d'aminoàcids a cada posició en format de seqüència fasta i es proporciona com a entrada al web-logo 3, que genera una representació gràfica del contingut relatiu d'aminoàcids a cada posició.per a una biblioteca de pèptids determinada.Per visualitzar conjunts de dades multidimensionals, es van crear mapes de calor mitjançant una eina desenvolupada internament a R (biosHeatmap, un paquet R que encara no s'ha publicat).Els dendrogrames presentats als mapes de calor es van calcular mitjançant el mètode de agrupació jeràrquica de Ward amb la mètrica de distància euclidiana.Per a l'anàlisi estadística de les dades de puntuació dels motius, es van calcular els valors de P per a la puntuació no normalitzada mitjançant la prova exacta de Fisher.Els valors P d'altres conjunts de dades es van calcular en R mitjançant la prova t de Student o ANOVA.
Els clons de fags seleccionats i els fags sense insercions es van injectar per via intravenosa a través de la vena de la cua (2 × 1010 fags/animal en 300 μl de PBS).Deu minuts abans de la perfusió i la fixació posterior, els mateixos animals van ser injectats per via intravenosa amb 100 μl de lectina marcada amb DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuts després de la injecció del fag, les rates es van perfondre pel cor amb 50 ml de PBS seguits de 50 ml de PFA/PBS al 4%.Les mostres de cervell es van fixar addicionalment durant la nit en un 4% de PFA/PBS i es van remullar en un 30% de sacarosa durant la nit a 4 ° C.Les mostres es congelen instantàniament a la barreja OCT.L'anàlisi immunohistoquímica de mostres congelades es va realitzar a temperatura ambient en crioseccions de 30 µm bloquejades amb 1% de BSA i incubades amb anticossos policlonals marcats amb FITC contra el fag T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C.Incubar durant la nit.Finalment, les seccions es van rentar 3 vegades amb PBS i es van examinar amb un microscopi làser confocal (Leica TCS SP5).
Tots els pèptids amb una puresa mínima del 98% van ser sintetitzats per GenScript USA, biotinilats i liofilitzats.La biotina s'uneix mitjançant un separador addicional de triple glicina a l'extrem N-terminal.Comproveu tots els pèptids mitjançant espectrometria de masses.
L'estreptavidina (Sigma S0677) es va barrejar amb un excés equimolar de 5 vegades de pèptid biotinilat, pèptid inhibidor de BACE1 biotinilat o una combinació (proporció 3:1) de pèptid inhibidor de BACE1 biotinilat i pèptid inhibidor de BACE1 en un 5-10% de DMSO / incubat en PBS.1 hora a temperatura ambient abans de la injecció.Els pèptids conjugats amb estreptavidina es van injectar per via intravenosa a una dosi de 10 mg/kg en una de les venes de la cua de rates amb cavitat cerebral.
La concentració de complexos estreptavidina-pèptid es va avaluar mitjançant ELISA.Les plaques de microtitulació Nunc Maxisorp (Sigma) es van recobrir durant la nit a 4 ° C amb 1, 5 μg / ml d'anticossos anti-estreptavidina de ratolí (Thermo, MA1-20011).Després de bloquejar (tampó de bloqueig: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) a temperatura ambient durant 2 hores, rentar la placa amb 0,05% Tween-20/PBS (tampó de rentat) durant 3 segons, es van afegir CSF i tampons de plasma: CSF 1:115).A continuació, es va incubar la placa durant la nit a 4 ° C amb anticossos de detecció (1 μg/ml, anti-estreptavidina-HRP, Novus NB120-7239).Després de tres passos de rentat, es va detectar estreptavidina mitjançant la incubació en solució de substrat TMB (Roche) durant un màxim de 20 min.Després d'aturar el desenvolupament del color amb H2SO4 1M, mesura l'absorbància a 450 nm.
La funció del complex inhibidor estreptavidina-pèptid-BACE1 es va avaluar mitjançant ELISA Aβ(1-40) segons el protocol del fabricant (Wako, 294-64701).Breument, les mostres de CSF es van diluir en un diluent estàndard (1:23) i es van incubar durant la nit a 4 ° C en plaques de 96 pous recobertes amb anticossos de captura BNT77.Després de cinc passos de rentat, es va afegir anticòs BA27 conjugat amb HRP i es va incubar durant 2 hores a 4 ° C, seguit de cinc passos de rentat.Es va detectar Aβ (1–40) mitjançant la incubació en solució de TMB durant 30 minuts a temperatura ambient.Després d'aturar el desenvolupament del color amb una solució de parada, mesura l'absorbància a 450 nm.Les mostres de plasma es van sotmetre a extracció en fase sòlida abans de l'ELISA Aβ(1–40).Es va afegir plasma al 0, 2% de DEA (Sigma) en plaques de 96 pous i es va incubar a temperatura ambient durant 30 minuts.Després de rentar successivament les plaques SPE (Oasis, 186000679) amb aigua i metanol al 100%, es van afegir mostres de plasma a les plaques SPE i es va eliminar tot el líquid.Les mostres es van rentar (primer amb un 5% de metanol i després un 30% de metanol) i es van eluir amb un 2% de NH4OH/90% de metanol.Després d'assecar l'eluït a 55 ° C durant 99 min a corrent N2 constant, les mostres es van reduir en diluents estàndard i es va mesurar Aβ (1-40) tal com es descriu anteriorment.
Com citar aquest article: Urich, E. et al.Lliurament de càrrega al cervell mitjançant pèptids de trànsit identificats in vivo.la ciència.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB i Moos T. Lliurament de fàrmacs macromoleculars al cervell mitjançant teràpia dirigida.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. i Martinez-Martinez, P. Lliurament de fàrmacs de pèptids i proteïnes a través de la barrera hematoencefàlica.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM La barrera hematoencefàlica: un coll d'ampolla en el desenvolupament de fàrmacs cerebrals.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, i Byrd, A. Perspectives per a una millora del lliurament de fàrmacs i l'orientació al cervell mitjançant la via del plexe coroide-CSF.Recerca farmacèutica 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernització de productes biofarmacèutics amb cavalls de Troia moleculars per al lliurament del cervell.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transport de pèptids mediat pel receptor WM a través de la barrera hematoencefàlica.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Augmentar la penetració cerebral i l'eficàcia dels anticossos terapèutics mitjançant llançadores moleculars monovalents.Neurona 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.El transport del receptor de transferrina (TfR) determina la captació cerebral de variants d'afinitat dels anticossos TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).