Alguns temes de resolució de problemes de LC mai estan desactualitzats, ja que hi ha problemes en la pràctica de LC, fins i tot a mesura que la tecnologia dels instruments millora amb el temps. Hi ha moltes maneres en què poden sorgir problemes en un sistema LC i acabar en una mala forma del pic. Quan sorgeixen problemes relacionats amb la forma del pic, una breu llista de possibles causes d'aquests resultats ajuda a simplificar la nostra experiència de resolució de problemes.
Ha estat divertit escriure aquesta columna de "Solució de problemes de LC" i pensar en temes cada mes, perquè alguns temes mai passen de moda. Mentre que en el camp de la investigació en cromatografia certs temes o idees es tornen obsolets a mesura que són substituïts per idees més noves i millors, en el camp de la resolució de problemes, des que va aparèixer el primer article de resolució de problemes en aquesta revista (la LC Journal en aquell moment) ja que alguns temes encara són rellevants) el 1983 (1). Durant els darrers anys, he centrat diverses seccions de resolució de problemes de LC en les tendències contemporànies que afecten la cromatografia líquida (LC) (per exemple, la comparació relativa de la nostra comprensió de l'efecte de la pressió sobre la retenció [2] Nous avenços) La nostra interpretació dels resultats de LC i com solucionar problemes amb instruments de LC moderns. En l'entrega d'aquest mes, continuo la meva sèrie (3), que va començar el desembre de 2021, que es va centrar en alguns dels temes de "vida o mort" de la resolució de problemes de LC: els elements que són excel·lents per a qualsevol solucionador de problemes són essencials, independentment de l'edat del sistema que utilitzem. El tema central d'aquesta sèrie és molt rellevant per al famós gràfic mural "Guia de resolució de problemes de LC" de l'LCGC (4). penjat en molts laboratoris. Per a la tercera part d'aquesta sèrie, he optat per centrar-me en qüestions relacionades amb la forma del pic o les característiques del pic. Increïblement, el gràfic mural enumera 44 causes potencials diferents d'una mala forma del pic! No podem considerar tots aquests problemes en detall en un sol article, així que en aquesta primera entrega sobre el tema, em centraré en alguns dels que veig més sovint. Espero que els usuaris de LC, joves i grans, trobin alguns consells i recordatoris útils sobre aquest tema important.
Cada cop responc més a preguntes de resolució de problemes amb "tot és possible". Aquesta resposta pot semblar fàcil quan es consideren observacions difícils d'interpretar, però sovint la trobo adequada. Amb moltes causes possibles d'una mala forma del pic, és important mantenir la ment oberta a l'hora de considerar quin podria ser el problema i poder prioritzar les causes potencials per començar els nostres esforços de resolució de problemes, centrant-nos en les possibilitats més comunes; aquest punt és molt important.
Un pas clau en qualsevol exercici de resolució de problemes, però que crec que està infravalorat, és reconèixer que hi ha un problema que cal resoldre. Reconèixer que hi ha un problema sovint significa reconèixer que el que li passa a l'eina és diferent de les nostres expectatives, que estan modelades per la teoria, el coneixement empíric i l'experiència (5). La "forma del pic" a la qual es fa referència aquí en realitat no només es refereix a la forma del pic (simètric, asimètric, suau, esponjós, vora d'atac, cua, etc.), sinó també a l'amplada. Les nostres expectatives sobre la forma real del pic són simples. La teoria (6) dóna suport a l'expectativa del llibre de text que, en la majoria dels casos, els pics cromatogràfics haurien de ser simètrics i ajustar-se a la forma d'una distribució gaussiana, com es mostra a la Figura 1a. El que esperem de les amplades dels pics és una qüestió més complexa, i discutirem aquest tema en un futur article. Les altres formes dels pics de la Figura 1 mostren algunes de les altres possibilitats que es podrien observar, és a dir, algunes de les maneres en què les coses podrien anar malament. A la resta d'aquesta entrega, dedicarem temps a discutir alguns exemples específics de situacions que poden conduir a aquestes. tipus de forma.
De vegades, els pics no s'observen en absolut al cromatograma on s'espera que s'elueixin. El gràfic mural anterior indica que l'absència d'un pic (suposant que la mostra realment conté l'analit objectiu a una concentració que hauria de fer que la resposta del detector sigui suficient per veure'l per sobre del soroll) sol estar relacionada amb algun problema de l'instrument o amb condicions incorrectes de la fase mòbil (si és que s'observen). pics, generalment massa "febles"). A la Taula I es pot trobar una breu llista de possibles problemes i solucions en aquesta categoria.
Com s'ha esmentat anteriorment, la qüestió de quanta eixamplament de pics s'ha de tolerar abans de prestar atenció i intentar solucionar-ho és un tema complex que tractaré en un futur article. La meva experiència és que un eixamplament significatiu de pics sovint va acompanyat d'un canvi significatiu en la forma del pic, i la cua del pic és més freqüent que el pre-pic o la divisió. Tanmateix, els pics nominalment simètrics també s'eixamplen, cosa que pot ser causada per diverses raons:
Cadascun d'aquests problemes s'ha tractat detalladament en números anteriors de Troubleshooting LC, i els lectors interessats en aquests temes poden consultar aquests articles anteriors per obtenir informació sobre les causes fonamentals i les possibles solucions a aquests problemes. Més detalls.
La cua dels pics, el front dels pics i la divisió poden ser causats per fenòmens químics o físics, i la llista de possibles solucions a aquests problemes varia molt, depenent de si es tracta d'un problema químic o físic. Sovint, comparant els diferents pics d'un cromatograma, es poden trobar pistes importants sobre quin és el culpable. Si tots els pics d'un cromatograma presenten formes similars, és molt probable que la causa no sigui física. Si només un o uns quants pics estan afectats, però la resta semblen correctes, és molt probable que la causa sigui química.
Les causes químiques de la cua dels pics són massa complexes per discutir-les breument aquí. El lector interessat pot consultar el número recent de "LC Troubleshooting" per a una discussió més detallada (10). Tanmateix, una cosa fàcil d'intentar és reduir la massa de l'analit injectat i veure si la forma del pic millora. Si és així, aleshores aquesta és una bona pista que el problema és la "sobrecàrrega de massa". En aquest cas, el mètode s'ha de limitar a injectar petites masses d'analit o s'han de canviar les condicions cromatogràfiques per tal que es puguin obtenir bones formes dels pics fins i tot amb masses més grans injectades.
També hi ha moltes possibles raons físiques per a la cua de pic. Els lectors interessats en una discussió detallada de les possibilitats poden consultar un altre número recent de "LC Troubleshooting" (11). Una de les causes físiques més comunes de la cua de pic és una mala connexió en un punt entre l'injector i el detector (12). Un exemple extrem es mostra a la Figura 1d, obtingut al meu laboratori fa unes setmanes. En aquest cas, vam construir un sistema amb una nova vàlvula d'injecció que no havíem utilitzat abans i vam instal·lar un bucle d'injecció de petit volum amb una fèrula que s'havia modelat sobre un capil·lar d'acer inoxidable. Després d'alguns experiments inicials de resolució de problemes, ens vam adonar que la profunditat del port a l'estator de la vàlvula d'injecció era molt més profunda del que estàvem acostumats, cosa que resultava en un gran volum mort a la part inferior del port. Aquest problema es resol fàcilment substituint el bucle d'injecció per un altre tub, podem ajustar la fèrula a la posició adequada per eliminar el volum mort a la part inferior del port.
Els fronts de pic com els que es mostren a la Figura 1e també poden ser causats per problemes físics o químics. Una causa física comuna del vora d'atac és que el llit de partícules de la columna no està ben empaquetat o que les partícules s'han reorganitzat amb el temps. Igual que amb la cua del pic causada per aquest fenomen físic, la millor manera de solucionar-ho és substituir la columna i continuar. Fonamentalment, les formes dels pics del vora d'atac amb origen químic sovint sorgeixen del que anomenem condicions de retenció "no lineals". En condicions ideals (lineals), la quantitat d'analit retinguda per la fase estacionària (per tant, el factor de retenció) està relacionada linealment amb la concentració de l'analit a la columna. Cromatogràficament, això significa que a mesura que augmenta la massa d'analit injectada a la columna, el pic es fa més alt, però no més ample. Aquesta relació es trenca quan el comportament de retenció no és lineal, i els pics no només es fan més alts sinó també més amples a mesura que s'injecta més massa. A més, les formes no lineals determinen la forma dels pics cromatogràfics, donant lloc a vores d'atac o de sortida. Igual que amb la sobrecàrrega de massa que causa la cua del pic (10), el pic El límit causat per la retenció no lineal també es pot diagnosticar reduint la massa d'analit injectada. Si la forma del pic millora, cal modificar el mètode per no superar la qualitat d'injecció que causa el límit, o bé cal canviar les condicions cromatogràfiques per minimitzar aquest comportament.
De vegades observem el que sembla ser un pic "dividit", com es mostra a la Figura 1f. El primer pas per resoldre aquest problema és determinar si la forma del pic es deu a una coelució parcial (és a dir, a la presència de dos compostos diferents però que elueixen estretament). Si en realitat hi ha dos analits diferents que elueixen a prop, es tracta de millorar la seva resolució (per exemple, augmentant la selectivitat, la retenció o el recompte de plaques), i els pics aparentment "dividits" estan relacionats amb la física. El rendiment no té res a veure amb la columna en si. Sovint, la pista més important per a aquesta decisió és si tots els pics del cromatograma presenten formes dividides, o només una o dues. Si només n'hi ha una o dues, probablement és un problema de coelució; si tots els pics estan dividits, probablement és un problema físic, molt probablement relacionat amb la columna en si.
Els pics dividits relacionats amb les propietats físiques de la columna en si solen ser deguts a frites d'entrada o sortida parcialment bloquejades, o a la reorganització de partícules a la columna, cosa que permet que la fase mòbil flueixi més ràpid que la fase mòbil en certes zones de la formació del canal de la columna en altres regions (11). La frita parcialment obstruïda de vegades es pot eliminar invertint el flux a través de la columna; tanmateix, segons la meva experiència, aquesta sol ser una solució a curt termini en lloc de llarg termini. Això sovint és fatal amb les columnes modernes si les partícules es recombinen dins de la columna. En aquest punt, és millor substituir la columna i continuar.
El pic de la Figura 1g, també d'un cas recent al meu propi laboratori, normalment indica que el senyal és tan alt que ha arribat a l'extrem superior del rang de resposta. Per als detectors d'absorbància òptica (UV-vis en aquest cas), quan la concentració d'anàlit és molt alta, l'anàlit absorbeix la major part de la llum que passa a través de la cel·la de flux del detector, deixant molt poca llum per detectar. En aquestes condicions, el senyal elèctric del fotodetector està molt influenciat per diverses fonts de soroll, com ara la llum dispersa i el "corrent fosc", cosa que fa que el senyal tingui un aspecte molt "borrós" i sigui independent de la concentració d'anàlit. Quan això passa, el problema sovint es pot resoldre fàcilment reduint el volum d'injecció de l'anàlit: reduint el volum d'injecció, diluint la mostra o ambdues coses.
A l'escola de cromatografia, utilitzem el senyal del detector (és a dir, l'eix y del cromatograma) com a indicador de la concentració d'anàlit a la mostra. Per tant, sembla estrany veure un cromatograma amb un senyal per sota de zero, ja que la interpretació simple és que això indica una concentració negativa d'anàlit, cosa que, per descomptat, no és físicament possible. Segons la meva experiència, els pics negatius s'observen amb més freqüència quan s'utilitzen detectors d'absorbància òptica (per exemple, UV-vis).
En aquest cas, un pic negatiu simplement significa que les molècules que s'elueixen de la columna absorbeixen menys llum que la fase mòbil immediatament abans i després del pic. Això pot passar, per exemple, quan s'utilitzen longituds d'ona de detecció relativament baixes (<230 nm) i additius de fase mòbil que absorbeixen la major part de la llum a aquestes longituds d'ona. Aquests additius poden ser components del dissolvent de la fase mòbil com el metanol o components tampó com l'acetat o el formiat. En realitat, es poden utilitzar pics negatius per preparar una corba de calibratge i obtenir informació quantitativa precisa, de manera que no hi ha cap raó fonamental per evitar-los per se (aquest mètode de vegades es coneix com a "detecció UV indirecta") (13). Tanmateix, si realment volem evitar els pics negatius per complet, en el cas de la detecció d'absorbància, la millor solució és utilitzar una longitud d'ona de detecció diferent perquè l'analit absorbeixi més que la fase mòbil, o canviar la composició de la fase mòbil perquè absorbeixin menys llum que els analits.
També poden aparèixer pics negatius quan s'utilitza la detecció per índex de refracció (IR) quan l'índex de refracció de components diferents de l'analit de la mostra, com ara la matriu del dissolvent, és diferent de l'índex de refracció de la fase mòbil. Això també passa amb la detecció UV-vis, però aquest efecte tendeix a atenuar-se en relació amb la detecció per IR. En ambdós casos, els pics negatius es poden minimitzar fent que la composició de la matriu de la mostra coincideixi més amb la de la fase mòbil.
A la tercera part sobre el tema bàsic de la resolució de problemes de LC, vaig discutir situacions en què la forma del pic observada difereix de la forma del pic esperada o normal. La resolució eficaç d'aquests problemes comença amb el coneixement de les formes esperades dels pics (basades en la teoria o l'experiència prèvia amb mètodes existents), de manera que les desviacions d'aquestes expectatives són òbvies. Els problemes de forma del pic tenen moltes causes potencials diferents (massa ample, cua, vora d'atac, etc.). En aquesta entrega, discutiré detalladament algunes de les raons que veig més sovint. Conèixer aquests detalls proporciona un bon punt de partida per a la resolució de problemes, però no captura totes les possibilitats. Els lectors interessats en una llista més detallada de causes i solucions poden consultar el gràfic mural "Guia de resolució de problemes de LC" de l'LCGC.
(4) Gràfic mural "Guia de resolució de problemes de LC" de l'LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Anàlisi de dades i processament de senyals en cromatografia (Elsevier, Nova York, NY, 1998), pàg. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF i Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.