Alguns temes de resolució de problemes de LC mai no estan actualitzats, ja que hi ha problemes en la pràctica de LC, fins i tot quan la tecnologia dels instruments millora amb el temps. Hi ha moltes maneres en què els problemes poden sorgir en un sistema LC i acaben en una forma de pic deficient. Quan sorgeixen problemes relacionats amb la forma dels pics, una breu llista de possibles causes d'aquests resultats ajuda a simplificar la nostra experiència de resolució de problemes.
Ha estat divertit escriure aquesta columna "Resolució de problemes de LC" i pensar en temes cada mes, perquè alguns temes mai passen de moda. Mentre que en el camp de la investigació cromagràfica determinats temes o idees queden obsolets a mesura que són substituïts per idees més noves i millors, en el camp de la resolució de problemes, des que el primer article de resolució de problemes va aparèixer en aquesta revista (el LC) des de l'última època, alguns temes encara són rellevants.193 He centrat diverses seccions de resolució de problemes de LC en les tendències contemporànies que afecten la cromatografia líquida (LC) (per exemple, la comparació relativa de la nostra comprensió de l'efecte de la pressió sobre la retenció [2] Nous avenços) La nostra interpretació dels resultats de la LC i com resoldre problemes amb els instruments de LC moderns. resolució de problemes: els elements que són excel·lents per a qualsevol solucionador de problemes són essencials, independentment de l'edat del sistema que estem utilitzant. El tema central d'aquesta sèrie és molt rellevant per al famós gràfic de paret "LC Troubleshooting Guide" de LCGC (4) que es penja en molts laboratoris. tots aquests problemes en detall en un article, així que en aquesta primera entrega sobre el tema, em centraré en alguns dels que veig més sovint. Espero que els usuaris joves i grans de LC trobin alguns consells i recordatoris útils sobre aquest tema important.
Em trobo cada cop més responent a les preguntes de resolució de problemes amb "tot és possible". Aquesta resposta pot semblar fàcil quan considero observacions que són difícils d'interpretar, però sovint la trobo adequada. Amb moltes possibles causes de mala forma del pic, és important mantenir la ment oberta a l'hora de considerar quin podria ser el problema i poder prioritzar les possibles causes per començar a enfocar els nostres esforços a resoldre els problemes més importants.
Un pas clau en qualsevol exercici de resolució de problemes, però que crec que està infravalorat, és reconèixer que hi ha un problema que s'ha de resoldre. Reconèixer que hi ha un problema sovint significa reconèixer que el que li passa a l'eina és diferent de les nostres expectatives, que estan conformades per la teoria, el coneixement empíric i l'experiència (5). Les nostres expectatives per a la forma real del pic són senzilles. La teoria (6) dóna suport a l'esperança del llibre de text que, en la majoria dels casos, els pics cromatogràfics han de ser simètrics i s'ajusten a la forma d'una distribució gaussiana, tal com es mostra a la figura 1a. a la figura 1 es mostren algunes de les altres possibilitats que es podrien observar, és a dir, algunes de les maneres en què les coses podrien anar malament. A la resta d'aquesta entrega, dedicarem temps a discutir alguns exemples concrets de situacions que poden conduir a aquests tipus de formes.
De vegades, els pics no s'observen en absolut al cromatograma on s'espera que s'eliminin. El gràfic de paret anterior indica que l'absència d'un pic (suposant que la mostra realment conté l'analit objectiu a una concentració que hauria de fer que la resposta del detector sigui suficient per veure'l per sobre del soroll) sol estar relacionada amb algun problema de l'instrument o condicions incorrectes de la fase mòbil (si s'observa).pics, normalment massa "febles"). A la taula I es pot trobar una breu llista de problemes i solucions potencials d'aquesta categoria.
Com s'ha esmentat anteriorment, la qüestió de quant s'ha de tolerar l'eixamplament del pic abans de parar atenció i intentar solucionar-ho és un tema complex que parlaré en un article futur. La meva experiència és que l'eixamplament del pic significatiu sovint s'acompanya d'un canvi significatiu en la forma del pic, i la cua del pic és més comú que el pre-pic o la divisió.
Cadascun d'aquests problemes s'ha tractat amb detall en números anteriors de Troubleshooting LC, i els lectors interessats en aquests temes poden consultar aquests articles anteriors per obtenir informació sobre les causes arrel i les possibles solucions a aquests problemes.Més detalls.
Els pics de cua, el front de pics i la divisió poden ser causats per fenòmens químics o físics, i la llista de solucions potencials a aquests problemes varia molt, depenent de si estem tractant amb un problema químic o físic. Sovint, comparant els diferents pics d'un cromatograma, podeu trobar pistes importants sobre quin és el culpable. només un o uns quants pics es veuen afectats, però la resta es veuen bé, el més probable és que la causa sigui química.
Les causes químiques del pic de cua són massa complexes per discutir breument aquí. El lector interessat es remet al número recent de "LC Troubleshooting" per a una discussió més a fons (10). Tanmateix, una cosa fàcil de provar és reduir la massa de l'analit injectat i veure si la forma del pic millora. Si s'utilitzen masses d'analit petites, o bé s'han de canviar les condicions cromatogràfiques de manera que es puguin obtenir bones formes de pics fins i tot amb masses més grans injectades.
També hi ha moltes raons físiques potencials per a la col·locació de pics. Els lectors interessats en una discussió detallada de les possibilitats es refereixen a un altre número recent de "LC Troubleshooting" (11). Una de les causes físiques més comunes del pic de cua és una connexió deficient en un punt entre l'injector i el detector (12). no havíem utilitzat abans i vam instal·lar un bucle d'injecció de petit volum amb una virola que s'havia modelat sobre un capil·lar d'acer inoxidable. Després d'alguns experiments inicials de resolució de problemes, ens vam adonar que la profunditat del port a l'estator de la vàlvula d'injecció era molt més profunda del que estàvem acostumats, donant lloc a un gran volum mort a la part inferior del port. el volum mort a la part inferior del port.
Els fronts de pic com els que es mostren a la figura 1e també poden ser causats per problemes físics o químics. Una causa física comuna de la vora d'atac és que el llit de partícules de la columna no està ben empaquetat o que les partícules s'han reorganitzat amb el temps. Igual que amb el pic de cua causat per aquest fenomen físic, la millor manera d'arreglar-ho és substituir la columna i mantenir sovint la forma inicial. condicions de retenció lineals”. En condicions ideals (lineals), la quantitat d'analit retinguda per la fase estacionària (per tant, el factor de retenció) està relacionada linealment amb la concentració de l'analit a la columna. Cromatogràficament, això significa que a mesura que augmenta la massa d'analit injectada a la columna, el pic es fa més alt, però no més ample. r a mesura que s'injecta més massa. A més, les formes no lineals determinen la forma dels pics cromatogràfics, donant lloc a vores d'entrada o posterior. Igual que amb la sobrecàrrega de massa que provoca un pic de cua (10), el pic d'avanç causat per la retenció no lineal també es pot diagnosticar reduint la massa de l'analit injectat. s'ha de canviar per minimitzar aquest comportament.
De vegades observem el que sembla ser un pic "divisió", tal com es mostra a la figura 1f. El primer pas per resoldre aquest problema és determinar si la forma del pic es deu a una coelució parcial (és a dir, la presència de dos compostos diferents però molt eluents). Els pics de t” estan relacionats amb el físic El rendiment no té res a veure amb la columna en si. Sovint, la pista més important d'aquesta decisió és si tots els pics del cromatograma presenten formes dividides, o només un o dos. Si només són un o dos, probablement és un problema de coelució;si tots els pics estan dividits, probablement és un problema físic, molt probablement relacionat amb la columna en si.
Els pics dividits relacionats amb les propietats físiques de la pròpia columna solen ser deguts a frites d'entrada o sortida parcialment bloquejades, o a la reorganització de partícules a la columna, que permet que la fase mòbil flueixi més ràpid que la fase mòbil en determinades zones de la formació del canal de la columna. En altres regions (11).tanmateix, segons la meva experiència, aquesta sol ser una solució a curt termini més que a llarg termini. Això sovint és fatal amb les columnes modernes si les partícules es recombinen dins de la columna. En aquest punt, el millor és substituir la columna i continuar.
El pic de la figura 1g, també d'una instància recent al meu propi laboratori, sol indicar que el senyal és tan alt que ha arribat a l'extrem més alt del rang de resposta. Per als detectors d'absorbància òptica (UV-vis en aquest cas), quan la concentració d'analit és molt alta, l'analit absorbeix la major part de la llum que passa a través de la cèl·lula de flux del detector, deixant molt poca llum per ser detectada per diferents fonts fotogràfiques. de soroll, com ara llum dispersa i "corrent fosc", fent que el senyal sigui molt "difuso" en aparença i independent de la concentració d'analit.Quan això passa, el problema sovint es pot resoldre fàcilment reduint el volum d'injecció de l'analit, reduint el volum d'injecció, diluint la mostra o ambdues coses.
A l'escola de cromatografia, utilitzem el senyal del detector (és a dir, l'eix Y del cromatograma) com a indicador de la concentració d'analit a la mostra. Per tant, sembla estrany veure un cromatograma amb un senyal per sota de zero, ja que la interpretació senzilla és que això indica una concentració d'analit negativa, que per descomptat no és físicament possible.
En aquest cas, un pic negatiu simplement significa que les molècules que surten de la columna absorbeixen menys llum que la pròpia fase mòbil immediatament abans i després del pic. Això pot ocórrer, per exemple, quan s'utilitzen longituds d'ona de detecció relativament baixes (<230 nm) i additius de fase mòbil que absorbeixen la major part de la llum a aquestes longituds d'ona. pics per preparar una corba de calibratge i obtenir informació quantitativa precisa, per la qual cosa no hi ha cap raó fonamental per evitar-los per se (aquest mètode de vegades s'anomena "detecció UV indirecta") (13). Tanmateix, si realment volem evitar els pics negatius del tot, en el cas de la detecció d'absorbància, la millor solució és utilitzar una detecció diferent de longitud d'ona de detecció de manera que absorbeixi més la fase mòbil que absorbeixi la fase mòbil de la llum, de manera que canviï la fase mòbil o canviï la fase anal. que els analits.
També poden aparèixer pics negatius quan s'utilitza la detecció d'índex de refracció (RI) quan l'índex de refracció de components diferents de l'analit de la mostra, com la matriu de dissolvents, és diferent de l'índex de refracció de la fase mòbil. la fase mòbil.
A la tercera part sobre el tema bàsic de la resolució de problemes de LC, vaig discutir situacions en què la forma del pic observada difereix de la forma del pic esperada o normal. La resolució de problemes eficaç d'aquests problemes comença amb el coneixement de les formes del pic esperades (basat en la teoria o l'experiència prèvia amb mètodes existents), de manera que les desviacions d'aquestes expectatives són òbvies. els motius que veig més sovint. Conèixer aquests detalls proporciona un bon lloc per començar a resoldre problemes, però no capta totes les possibilitats. Els lectors interessats en una llista més detallada de causes i solucions poden consultar el gràfic de paret "LC Troubleshooting Guide" de LCGC.
(4) Gràfic de paret "LC Troubleshooting Guide" de LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, Nova York, NY, 1998), pàgs. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF i Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.