Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
La biòpsia líquida (LB) és un concepte que està guanyant popularitat ràpidament en l'àmbit biomèdic.El concepte es basa principalment en la detecció de fragments d'ADN extracel·lular circulant (ccfDNA), que s'alliberen principalment com a petits fragments després de la mort cel·lular en diversos teixits.Una petita proporció d'aquests fragments prové de teixits o organismes estrangers (estrangers).En el treball actual, hem aplicat aquest concepte als musclos, una espècie sentinella coneguda per la seva gran capacitat de filtració d'aigua de mar.Utilitzem la capacitat dels musclos d'actuar com a filtres naturals per capturar fragments d'ADN ambiental de diverses fonts per proporcionar informació sobre la biodiversitat dels ecosistemes costaners marins.Els nostres resultats mostren que l'hemolinfa del musclo conté fragments d'ADN que varien molt en grandària, d'1 a 5 kb.La seqüenciació d'escopeta va demostrar que un gran nombre de fragments d'ADN són d'origen microbià estrany.Entre ells, vam trobar fragments d'ADN de bacteris, arquees i virus, inclosos virus coneguts per infectar una varietat d'hostes que es troben habitualment als ecosistemes marins costaners.En conclusió, el nostre estudi demostra que el concepte de LB aplicat als musclos representa una font de coneixement rica però encara inexplorada sobre la diversitat microbiana als ecosistemes costaners marins.
L'impacte del canvi climàtic (CC) en la biodiversitat dels ecosistemes marins és una àrea d'investigació en ràpid creixement.L'escalfament global no només causa estrès fisiològics importants, sinó que també empeny els límits evolutius de l'estabilitat tèrmica dels organismes marins, afectant l'hàbitat d'una sèrie d'espècies, i els impulsa a buscar condicions més favorables [1, 2].A més d'afectar la biodiversitat dels metazous, el CC altera el delicat equilibri de les interaccions hoste-microbiana.Aquesta disbacteriosi microbiana suposa una greu amenaça per als ecosistemes marins, ja que fa que els organismes marins siguin més susceptibles als patògens infecciosos [3, 4].Es creu que els SS tenen un paper important en les morts massives, que és un problema greu per a la gestió dels ecosistemes marins globals [5, 6].Aquest és un tema important donat els impactes econòmics, ecològics i nutricionals de moltes espècies marines.Això és especialment cert per als bivalves que viuen a les regions polars, on els efectes de la CK són més immediats i greus [6, 7].De fet, bivalves com Mytilus spp.s'utilitzen àmpliament per controlar els efectes del CC sobre els ecosistemes marins.No és sorprenent que s'hagi desenvolupat un nombre relativament gran de biomarcadors per controlar la seva salut, sovint utilitzant un enfocament de dos nivells que inclou biomarcadors funcionals basats en l'activitat enzimàtica o en funcions cel·lulars com la viabilitat cel·lular i l'activitat fagocítica [8].Aquests mètodes també inclouen la mesura de la concentració d'indicadors de pressió específics que s'acumulen als teixits tous després de l'absorció de grans quantitats d'aigua de mar.Tanmateix, l'alta capacitat de filtració i el sistema circulatori semiobert dels bivalves ofereixen una oportunitat per desenvolupar nous biomarcadors d'hemolinfa utilitzant el concepte de biòpsia líquida (LB), un enfocament senzill i mínimament invasiu per a la gestió del pacient.mostres de sang [9, 10].Tot i que es poden trobar diversos tipus de molècules circulants a la LB humana, aquest concepte es basa principalment en l'anàlisi de seqüenciació d'ADN de fragments d'ADN extracel·lular circulant (ccfDNA) al plasma.De fet, la presència d'ADN circulant al plasma humà es coneix des de mitjans del segle XX [11], però només en els darrers anys l'arribada dels mètodes de seqüenciació d'alt rendiment ha portat al diagnòstic clínic basat en l'ADNccf.La presència d'aquests fragments d'ADN circulants es deu en part a l'alliberament passiu d'ADN genòmic (nuclear i mitocondrial) després de la mort cel·lular. En individus sans, la concentració de ccfDNA normalment és baixa (<10 ng/ml), però es pot augmentar de 5 a 10 vegades en pacients que pateixen diverses patologies o sotmesos a estrès, provocant danys als teixits. En individus sans, la concentració de ccfDNA normalment és baixa (<10 ng/ml), però es pot augmentar de 5 a 10 vegades en pacients que pateixen diverses patologies o sotmesos a estrès, provocant danys als teixits. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. En persones sanes, la concentració d'ADNcc és normalment baixa (<10 ng/ml), però pot augmentar de 5 a 10 vegades en pacients amb diverses patologies o amb estrès que provoca danys als teixits.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理有各种病理或病理或承常较低（<10 ng/mL）加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 病理 或 掸 忣 扏 手 或 扏增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увелича ны 10 увелича ны пи 10 с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Les concentracions de ccfDNA solen ser baixes (<10 ng/ml) en individus sans, però es poden augmentar de 5 a 10 vegades en pacients amb diverses patologies o estrès, donant lloc a danys als teixits.La mida dels fragments d'ADN ccf varia àmpliament, però normalment oscil·la entre 150 i 200 pb.[12].L'anàlisi del ccfDNA autoderivat, és a dir, el ccfDNA de cèl·lules hostes normals o transformades, es pot utilitzar per detectar canvis genètics i epigenètics presents en el genoma nuclear i/o mitocondrial, ajudant així els metges a seleccionar teràpies específiques dirigides a moleculars [13] .Tanmateix, el ccfDNA es pot obtenir a partir de fonts estrangeres com el ccfDNA de cèl·lules fetals durant l'embaràs o d'òrgans trasplantats [14,15,16,17].El ccfDNA també és una font important d'informació per detectar la presència d'àcids nucleics d'un agent infecciós (estranger), que permet la detecció no invasiva d'infeccions generalitzades no identificades pels hemocultius, evitant la biòpsia invasiva del teixit infectat [18].Estudis recents han demostrat que la sang humana conté una rica font d'informació que es pot utilitzar per identificar patògens virals i bacterians, i que al voltant de l'1% del ccfDNA que es troba al plasma humà és d'origen estranger [19].Aquests estudis demostren que la biodiversitat del microbioma circulant d'un organisme es pot avaluar mitjançant l'anàlisi de ccfDNA.Tanmateix, fins fa poc, aquest concepte s'utilitzava exclusivament en humans i, en menor mesura, en altres vertebrats [20, 21].
En el present article, utilitzem el potencial LB per analitzar el ccfDNA d'Aulacomya atra, una espècie del sud que es troba habitualment a les illes Kerguelen subantàrtiques, un grup d'illes al cim d'un gran altiplà que es va formar fa 35 milions d'anys.erupció volcànica.Mitjançant un sistema experimental in vitro, vam trobar que els fragments d'ADN a l'aigua de mar són agafats ràpidament pels musclos i entren al compartiment de l'hemolinfa.La seqüenciació d'escopeta ha demostrat que l'hemolinfa ccfDNA dels musclos conté fragments d'ADN d'origen propi i no propi, inclosos bacteris simbiòtics i fragments d'ADN de biomes típics dels ecosistemes costaners marins volcànics freds.L'hemolimfa ccfDNA també conté seqüències virals derivades de virus amb diferents rangs d'hostes.També hem trobat fragments d'ADN d'animals pluricel·lulars com peixos ossis, anemones de mar, algues i insectes.En conclusió, el nostre estudi demostra que el concepte LB es pot aplicar amb èxit als invertebrats marins per generar un ric repertori genòmic en ecosistemes marins.
Els adults (55-70 mm de llarg) Mytilus platensis (M. platensis) i Aulacomya atra (A. atra) es van recollir de les costes rocoses intermareals de Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E .).Illes Kerguelen el desembre de 2018. Altres musclos blaus adults (Mytilus spp.) es van obtenir d'un proveïdor comercial (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canadà) i es van col·locar en un dipòsit airejat amb temperatura controlada (4 °C) que contenia 10–20 L de salmorra artificial al 32‰.(cristall d'escull de sal marina artificial, Instant Ocean, Virgínia, EUA).Per a cada experiment, es va mesurar la longitud i el pes de les petxines individuals.
Un protocol d'accés obert gratuït per a aquest programa està disponible en línia (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Breument, l'hemolinfa LB es va recollir dels músculs abductors tal com es descriu [22].L'hemolinfa es va aclarir per centrifugació a 1200 × g durant 3 minuts, el sobrenedant es va congelar (-20 ° C) fins al seu ús.Per aïllar i purificar l'ADNc, les mostres (1,5-2,0 ml) es van descongelar i es van processar mitjançant el kit d'ADNc NucleoSnap (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) segons les instruccions del fabricant.El ccfDNA es va emmagatzemar a -80 ° C fins a una anàlisi posterior.En alguns experiments, el ccfDNA es va aïllar i purificar mitjançant el QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canadà).L'ADN purificat es va quantificar mitjançant un assaig estàndard PicoGreen.La distribució de fragments del ccfDNA aïllat es va analitzar mitjançant electroforesi capil·lar mitjançant un bioanalitzador Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) mitjançant un kit d'ADN d'alta sensibilitat.L'assaig es va realitzar utilitzant 1 µl de la mostra de ccfDNA segons les instruccions del fabricant.
Per a la seqüenciació de fragments d'hemolinfa ccfDNA, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canadà) va preparar biblioteques d'escopetes mitjançant el kit Illumina DNA Mix del kit Illumina MiSeq PE75.Es va utilitzar un adaptador estàndard (BioO).Els fitxers de dades en brut estan disponibles a l'Arxiu de lectura de seqüències NCBI (SRR8924808 i SRR8924809).La qualitat bàsica de la lectura es va avaluar mitjançant FastQC [23].Trimmomatic [24] s'ha utilitzat per a adaptadors de retall i lectures de mala qualitat.Les lectures d'escopeta amb extrems aparellats es van fusionar FLASH en lectures individuals més llargues amb una superposició mínima de 20 bp per evitar desajustos [25]. Les lectures combinades es van anotar amb BLASTN mitjançant una base de dades de taxonomia NCBI de bivalves (valor e <1e-3 i 90% d'homologia) i es va realitzar l'emmascarament de seqüències de baixa complexitat mitjançant DUST [26]. Les lectures combinades es van anotar amb BLASTN mitjançant una base de dades de taxonomia NCBI de bivalves (valor e <1e-3 i 90% d'homologia) i es va realitzar l'emmascarament de seqüències de baixa complexitat mitjançant DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы таннтсох тасимьх таспользованием оллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой низкой сло но сложной слологии пользованием pols [26]. Les lectures agrupades es van anotar amb BLASTN mitjançant la base de dades de taxonomia de bivalves NCBI (valor e <1e-3 i 90% d'homologia) i es va realitzar un emmascarament de seqüències de baixa complexitat mitjançant DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌并的诌数数＿诌数＿）用BLASTN低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 （并 读数 Ａ 读数 ） ） 同源）复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩詔 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичесанкой сономичесанкой сованием тых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), i а маскирование последовательностей нислове ностей нисловкобы с использованием DUST [26]. Les lectures agrupades es van anotar amb BLASTN mitjançant la base de dades taxonòmica de bivalves NCBI (valor e <1e-3 i 90% d'homologia) i es va realitzar un emmascarament de seqüències de baixa complexitat mitjançant DUST [26].Les lectures es van dividir en dos grups: relacionades amb seqüències de bivalves (aquí anomenades autolectures) i no relacionades (no autolecturas).Es van reunir dos grups per separat mitjançant MEGAHIT per generar contigs [27].Mentrestant, la distribució taxonòmica de les lectures del microbioma alienígena es va classificar mitjançant Kraken2 [28] i es va representar gràficament per un gràfic de sectors de Krona a Galaxy [29, 30].Es va determinar que els kmers òptims eren kmers-59 dels nostres experiments preliminars. A continuació, es van identificar els autocontinguts mitjançant l'alineació amb BLASTN (base de dades NCBI de bivalves, valor e <1e-10 i 60% d'homologia) per a una anotació final. A continuació, es van identificar els autocontinguts mitjançant l'alineació amb BLASTN (base de dades NCBI de bivalves, valor e <1e-10 i 60% d'homologia) per a una anotació final. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данныли идентифицированы) BI, значение i <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. A continuació, es van identificar els autocontinguts fent coincidir amb BLASTN (base de dades de bivalves NCBI, valor e <1e-10 i 60% d'homologia) per a l'anotació final.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来臍对齐来识廿褛识廿褛与最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сонтвенные контиги для окончательной аннотации путем сонзна посна х NCBI для двустворчатых моллюсков, значение i <1e-10 и гомология 60%). A continuació, es van identificar els autocontinguts per a l'anotació final fent coincidir amb BLASTN (base de dades de bivalves NCBI, valor e <1e-10 i 60% d'homologia). Paral·lelament, els contigs de grups no propis es van anotar amb BLASTN (base de dades nt NCBI, valor e <1e-10 i 60% d'homologia). Paral·lelament, els contigs de grups no propis es van anotar amb BLASTN (base de dades nt NCBI, valor e <1e-10 i 60% d'homologia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база даннных, 10 e-1 гомология 60%). Paral·lelament, els contigs de grups estrangers es van anotar amb BLASTN (base de dades NT NCBI, valor e <1e-10 i 60% d'homologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。组重叠组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。组重叠组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощьд на BLASBINT ачение i <1e-10 и гомология 60%). Paral·lelament, es van anotar els contigs no propis del grup amb BLASTN (base de dades nt NCBI, valor e <1e-10 i 60% d'homologia). BLASTX també es va realitzar en contigs no propis mitjançant les bases de dades NCBI de proteïnes nr i RefSeq (valor e <1e-10 i 60% d'homologia). BLASTX també es va realitzar en contigs no propis mitjançant les bases de dades NCBI de proteïnes nr i RefSeq (valor e <1e-10 i 60% d'homologia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белSeqe nr. 10 i гомология 60%). BLASTX també es va realitzar en contigs no propis mitjançant les bases de dades de proteïnes nr i RefSeq NCBI (valor e <1e-10 i 60% d'homologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０性） 性还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性０性） 性 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белных безни NC 10 e 10 Ref. гомология 60%). BLASTX també es va realitzar en contigs no propis mitjançant les bases de dades de proteïnes nr i RefSeq NCBI (valor e <1e-10 i 60% d'homologia).Els conjunts de BLASTN i BLASTX de no autocontinguts representen els contigs finals (vegeu el fitxer suplementari).
Els primers utilitzats per a la PCR es mostren a la taula S1.Es va utilitzar Taq DNA polimerasa (Bio Basic Canada, Markham, ON) per amplificar els gens diana del ccfDNA.Es van utilitzar les següents condicions de reacció: desnaturalització a 95 °C durant 3 minuts, 95 °C durant 1 minut, temperatura de recuit establerta durant 1 minut, allargament a 72 °C durant 1 minut, 35 cicles i finalment 72 °C en 10 minuts..Els productes de PCR es van separar per electroforesi en gels d'agarosa (1,5%) que contenien SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canadà) a 95 V.
Els musclos (Mytilus spp.) es van aclimatar en 500 ml d'aigua de mar oxigenada (32 PSU) durant 24 hores a 4 °C.L'ADN plasmidi que contenia una inserció que codificava la seqüència d'ADNc de galectina-7 humana (número d'accés NCBI L07769) es va afegir al vial a una concentració final de 190 μg/μl.Els musclos incubats en les mateixes condicions sense afegir ADN van ser el control.El tercer dipòsit de control contenia ADN sense musclos.Per controlar la qualitat de l'ADN a l'aigua de mar, es van prendre mostres d'aigua de mar (20 μl; tres repeticions) de cada dipòsit a l'hora indicada.Per a la traçabilitat de l'ADN plasmidi, els musclos LB es van collir en els moments indicats i es van analitzar mitjançant qPCR i ddPCR.A causa de l'alt contingut de sal de l'aigua de mar, les alíquotes es van diluir en aigua de qualitat de PCR (1:10) abans de tots els assajos de PCR.
La PCR de gotes digitals (ddPCR) es va realitzar mitjançant el protocol BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canadà).Utilitzeu el perfil de temperatura per determinar la temperatura òptima (taula S1).Les gotes es van generar mitjançant un generador de gotes QX200 (BioRad).La ddPCR es va dur a terme de la següent manera: 95 ° C durant 5 min, 50 cicles de 95 ° C durant 30 s i una temperatura de recuit determinada durant 1 min i 72 ° C durant 30 s, 4 ° C durant 5 min i 90 ° C en 5 minuts.El nombre de gotes i les reaccions positives (nombre de còpies/µl) es van mesurar mitjançant un lector de gotes QX200 (BioRad).Es van rebutjar mostres amb menys de 10.000 gotes.El control del patró no es va realitzar cada vegada que es va executar ddPCR.
La qPCR es va realitzar mitjançant primers específics Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austràlia) i LGALS7.Totes les PCR quantitatives es van realitzar en 20 µl mitjançant el kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN).La qPCR es va iniciar amb una incubació de 15 minuts a 95 °C seguida de 40 cicles a 95 °C durant 10 segons i a 60 °C durant 60 segons amb una recollida de dades.Les corbes de fusió es van generar mitjançant mesures successives a 95 °C durant 5 s, 65 °C durant 60 s i 97 °C al final de la qPCR.Cada qPCR es va realitzar per triplicat, excepte les mostres de control.
Com que els musclos són coneguts per la seva alta taxa de filtració, primer vam investigar si podien filtrar i retenir fragments d'ADN presents a l'aigua de mar.També ens interessava si aquests fragments s'acumulen al seu sistema limfàtic semiobert.Vam resoldre aquest problema de manera experimental rastrejant el destí dels fragments d'ADN solubles afegits als tancs de musclos blaus.Per facilitar el seguiment dels fragments d'ADN, hem utilitzat ADN plasmidi estranger (no propi) que conté el gen de la galectina-7 humana.ddPCR rastreja fragments d'ADN plasmidi en aigua de mar i musclos.Els nostres resultats mostren que si la quantitat de fragments d'ADN a l'aigua de mar es va mantenir relativament constant al llarg del temps (fins a 7 dies) en absència de musclos, aleshores en presència de musclos aquest nivell va desaparèixer gairebé completament en 8 hores (Fig. 1a, b).Els fragments d'ADN exògen es van detectar fàcilment en 15 minuts en líquid intravalvular i hemolinfa (Fig. 1c).Aquests fragments encara es podrien detectar fins a 4 hores després de l'exposició.Aquesta activitat de filtratge pel que fa als fragments d'ADN és comparable a l'activitat de filtratge de bacteris i algues [31].Aquests resultats suggereixen que els musclos poden filtrar i acumular ADN estrany als seus compartiments de fluids.
Concentracions relatives d'ADN plasmidi a l'aigua de mar en presència (A) o absència (B) de musclos, mesurades per ddPCR.A A, els resultats s'expressen en percentatges, amb les vores de les caselles que representen els percentils 75 i 25.La corba logarítmica ajustada es mostra en vermell i l'àrea ombrejada en gris representa l'interval de confiança del 95%.A B, la línia vermella representa la mitjana i la línia blava representa l'interval de confiança del 95% per a la concentració.C Acumulació d'ADN plasmídic a l'hemolinfa i al líquid valvular dels musclos en diferents moments després de l'addició d'ADN plasmidi.Els resultats es presenten com a còpies absolutes detectades/ml (± SE).
A continuació, vam investigar l'origen del ccfDNA en musclos recollits de llits de musclos a les illes Kerguelen, un grup remot d'illes amb influència antròpica limitada.Amb aquesta finalitat, es va aïllar i purificar l'ADNccc de les hemolinfes dels musclos mitjançant mètodes utilitzats habitualment per purificar l'ADNccc humà [32, 33].Vam trobar que les concentracions mitjanes d'hemolinfa ccfDNA als musclos es troben en el rang de micrograms per ml d'hemolimfa baixes (vegeu la taula S2, informació suplementària).Aquest rang de concentracions és molt més gran que en persones sanes (nanograms baixos per mil·lilitre), però en casos rars, en pacients amb càncer, el nivell de ccfDNA pot arribar a diversos micrograms per mil·lilitre [34, 35].Una anàlisi de la distribució de mida de l'hemolinfa ccfDNA va mostrar que aquests fragments varien molt en grandària, que van des de 1000 pb fins a 1000 pb.fins a 5000 pb (Fig. 2).Es van obtenir resultats similars mitjançant el QIAamp Investigator Kit basat en sílice, un mètode utilitzat habitualment en ciència forense per aïllar i purificar ràpidament l'ADN genòmic a partir de mostres d'ADN de baixa concentració, inclòs el ccfDNA [36].
Electroforegrama ccfDNA representatiu de l'hemolinfa del musclo.S'extreu amb el kit de plasma NucleoSnap (a dalt) i el kit d'investigador d'ADN QIAamp.B Gràfic de violí que mostra la distribució de les concentracions de ccfDNA d'hemolinfa (±SE) als musclos.Les línies negres i vermelles representen la mediana i el primer i tercer quartils, respectivament.
Aproximadament l'1% del ccfDNA en humans i primats té una font estrangera [21, 37].Tenint en compte el sistema circulatori semiobert dels bivalves, l'aigua de mar rica en microbis i la distribució de la mida del ccfDNA del musclo, vam plantejar la hipòtesi que l'hemolinfa ccfDNA del musclo podria contenir un conjunt ric i divers d'ADN microbià.Per provar aquesta hipòtesi, vam seqüenciar el ccfDNA d'hemolinfa a partir de mostres d'Aulacomya atra recollides de les illes Kerguelen, obtenint més de 10 milions de lectures, el 97,6% de les quals van passar el control de qualitat.A continuació, es van classificar les lectures segons fonts pròpies i no pròpies mitjançant les bases de dades de bivalves BLASTN i NCBI (Fig. S1, Informació suplementària).
En humans, l'ADN nuclear i mitocondrial es pot alliberar al torrent sanguini [38].Tanmateix, en el present estudi no ha estat possible descriure amb detall l'ADN genòmic nuclear dels musclos, atès que el genoma d'A. atra no ha estat seqüenciat ni descrit.Tanmateix, vam poder identificar una sèrie de fragments d'ADN ccfd del nostre propi origen mitjançant la biblioteca de bivalves (Fig. S2, informació suplementària).També vam confirmar la presència de fragments d'ADN del nostre propi origen mitjançant l'amplificació per PCR dirigida dels gens d'A. atra que es van seqüenciar (Fig. 3).De la mateixa manera, atès que el genoma mitocondrial d'A. atra està disponible a les bases de dades públiques, es poden trobar evidències de la presència de fragments d'ADN ccf mitocondrial a l'hemolimfa d'A. atra.La presència de fragments d'ADN mitocondrial es va confirmar mitjançant l'amplificació per PCR (Fig. 3).
Diversos gens mitocondrials estaven presents a l'hemolinfa d'A. atra (punts vermells – número d'estoc: SRX5705969) i M. platensis (punts blaus – número d'estoc: SRX5705968) amplificats per PCR.Figura adaptada de Breton et al., 2011 B Amplificació del sobrenedant d'hemolinfa de A. atra Emmagatzemat en paper FTA.Utilitzeu un punxó de 3 mm per afegir directament al tub de PCR que conté la barreja de PCR.
Donat l'abundant contingut microbià a l'aigua de mar, inicialment ens vam centrar en la caracterització de seqüències d'ADN microbià a l'hemolinfa.Per fer-ho, utilitzem dues estratègies diferents.La primera estratègia va utilitzar Kraken2, un programa de classificació de seqüències basat en algoritmes que pot identificar seqüències microbianes amb una precisió comparable a BLAST i altres eines [28].Es va determinar que més de 6719 lectures eren d'origen bacterià, mentre que 124 i 64 eren d'arquees i virus, respectivament (Fig. 4).Els fragments d'ADN bacterià més abundants van ser Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) i Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Aquesta distribució és coherent amb estudis anteriors del microbioma del musclo blau marí [39, 40].Els gammaproteobacteris eren la classe principal de proteobacteris (44%), incloent molts Vibronales (Fig. 4b).El mètode ddPCR va confirmar la presència de fragments d'ADN de Vibrio al ccfDNA de l'hemolinfa d'A. atra (Fig. 4c) [41].Per obtenir més informació sobre l'origen bacterià del ccfDNA, es va fer un enfocament addicional (Fig. S2, Informació suplementària). En aquest cas, les lectures superposades es van reunir com a lectures d'extrem parellat i es van classificar com d'origen propi (bivalves) o no propis mitjançant BLASTN i un valor e d'1e-3 i un tall amb > 90% d'homologia. En aquest cas, les lectures superposades es van reunir com a lectures d'extrem parellat i es van classificar com d'origen propi (bivalves) o no propis mitjançant BLASTN i un valor e d'1e-3 i un tall amb > 90% d'homologia. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны как чтения с парными концами и были собраны обственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и 1e нтинач и 1-3сея с гомологией> 90%. En aquest cas, les lectures superposades es van recollir com a lectures aparellades i es van classificar com a natives (bivalves) o no originals mitjançant BLASTN i valor e d'1e-3 i tall amb > 90% d'homologia.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 倢 倢 倢 倢 末端读数，并使用BLASTN值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 在 用 用 用 用 的 3和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и концами и концами и классиЄи классибраны енные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием несобственные по происхождению с использованием зованием зованием зованием зернач зна1 по происхождению мологии> 90%. En aquest cas, les lectures superposades es van recollir com a lectures aparellades i es van classificar com a pròpies (bivalves) o no originals mitjançant valors e BLASTN i 1e-3 i un llindar d'homologia > 90%.Com que el genoma d'A. atra encara no s'ha seqüenciat, hem utilitzat l'estratègia d'assemblatge de novo de l'assemblador MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Un total de 147.188 contigs han estat identificats com a dependents (bivalves) d'origen.A continuació, aquests contigs es van explotar amb valors e d'1e-10 utilitzant BLASTN i BLASTX.Aquesta estratègia ens va permetre identificar 482 fragments no bivalves presents a A. atra ccfDNA.Més de la meitat (57%) d'aquests fragments d'ADN es van obtenir de bacteris, principalment de simbionts branquials, inclosos els simbionts sulfotròfics, i de simbionts branquials Solemya velum (Fig. 5).
Abundància relativa a nivell de tipus.B Diversitat microbiana de dos fils principals (Firmicutes i Proteobacteris).Amplificació representativa de ddPCR C Vibrio spp.A. Fragments del gen de l'ARNr 16S (blau) en tres hemolimfes atra.
Es van analitzar un total de 482 contigs recollits.Perfil general de la distribució taxonòmica de les anotacions contig metagenòmics (procariotes i eucariotes).B Distribució detallada dels fragments d'ADN bacterià identificats per BLASTN i BLASTX.
L'anàlisi de Kraken2 també va mostrar que el ccfDNA del musclo contenia fragments d'ADN arqueo, inclosos fragments d'ADN d'Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) i Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).La presència de fragments d'ADN derivats d'Euryarchaeota i Crenarchaeota, trobats anteriorment a la comunitat microbiana de musclos de Califòrnia, no hauria de sorprendre [42].Tot i que Euryarchaeota s'associa sovint amb condicions extremes, ara es reconeix que tant Euryarchaeota com Crenarcheota es troben entre els procariotes més comuns en l'entorn criogènic marí [43, 44].La presència de microorganismes metanogènics als musclos no és sorprenent, tenint en compte els informes recents d'extenses fuites de metà de les fuites de fons a l'altiplà de Kerguelen [45] i la possible producció microbiana de metà observada a la costa de les illes Kerguelen [46].
Aleshores, la nostra atenció es va desplaçar cap a les lectures dels virus d'ADN.Segons el que sabem, aquest és el primer estudi fora de l'objectiu del contingut de virus dels musclos.Com era d'esperar, vam trobar fragments d'ADN de bacteriòfags (Caudovirales) (Fig. 6b).Tanmateix, l'ADN viral més comú prové d'un fílum de nucleocitovirus, també conegut com a virus d'ADN gran citoplasmàtic nuclear (NCLDV), que té el genoma més gran de qualsevol virus.Dins d'aquest fílum, la majoria de seqüències d'ADN pertanyen a les famílies Mimimidoviridae (58%) i Poxviridae (21%), els hostes naturals dels quals inclouen vertebrats i artròpodes, mentre que una petita proporció d'aquestes seqüències d'ADN pertanyen a algues virològiques conegudes.Infecta les algues eucariotes marines.Les seqüències també es van obtenir del virus Pandora, el virus gegant amb la mida més gran del genoma de qualsevol gènere viral conegut.Curiosament, el ventall d'hostes coneguts per estar infectats amb el virus, determinat per la seqüenciació de l'hemolinfa ccfDNA, era relativament gran (figura S3, informació suplementària).Inclou virus que infecten insectes com Baculoviridae i Iridoviridae, així com virus que infecten ameba, algues i vertebrats.També hem trobat seqüències que coincideixen amb el genoma de Pithovirus sibericum.Els pitovirus (també coneguts com a "virus zombis") es van aïllar per primera vegada del permafrost de 30.000 anys a Sibèria [47].Així, els nostres resultats són coherents amb els informes anteriors que mostren que no totes les espècies modernes d'aquests virus s'han extingit [48] i que aquests virus poden estar presents en ecosistemes marins subàrtics remots.
Finalment, vam provar per veure si podíem trobar fragments d'ADN d'altres animals pluricel·lulars.BLASTN i BLASTX van identificar un total de 482 contigs estrangers amb biblioteques nt, nr i RefSeq (genòmica i proteïna).Els nostres resultats mostren que entre els fragments estrangers de ccfDNA d'animals pluricel·lulars predomina l'ADN dels ossos ossis (Fig. 5).També s'han trobat fragments d'ADN d'insectes i altres espècies.No s'ha identificat una part relativament gran dels fragments d'ADN, possiblement a causa de la subrepresentació d'un gran nombre d'espècies marines a les bases de dades genòmiques en comparació amb les espècies terrestres [49].
En el present article, apliquem el concepte LB als musclos, argumentant que la seqüenciació de trets de ccfDNA d'hemolinfa pot proporcionar informació sobre la composició dels ecosistemes costaners marins.En particular, vam trobar que 1) l'hemolimfa del musclo conté concentracions relativament altes (nivells de micrograms) de fragments d'ADN circulants relativament grans (~ 1-5 kb);2) aquests fragments d'ADN són independents i no independents. 3) Entre les fonts estranyes d'aquests fragments d'ADN, hem trobat ADN bacterià, arqueològic i víric, així com ADN d'altres animals pluricel·lulars;4) L'acumulació d'aquests fragments de ccfDNA estrangers a l'hemolinfa es produeix ràpidament i contribueix a l'activitat de filtratge intern dels musclos.En conclusió, el nostre estudi demostra que el concepte de LB, que fins ara s'ha aplicat principalment en l'àmbit de la biomedicina, codifica una font de coneixement rica però inexplorada que es pot utilitzar per entendre millor la interacció entre les espècies sentinella i el seu entorn.
A més dels primats, s'ha informat d'aïllament de ccfDNA en mamífers, inclosos ratolins, gossos, gats i cavalls [50, 51, 52].No obstant això, pel que sabem, el nostre estudi és el primer que informa de la detecció i seqüenciació de ccfDNA en espècies marines amb un sistema de circulació oberta.Aquesta característica anatòmica i la capacitat de filtratge dels musclos poden explicar, almenys en part, les diferents característiques de mida dels fragments d'ADN circulants en comparació amb altres espècies.En humans, la majoria dels fragments d'ADN que circulen a la sang són petits fragments de mida que oscil·len entre 150 i 200 pb.amb un pic màxim de 167 pb [34, 53].Una porció petita però significativa dels fragments d'ADN té una mida d'entre 300 i 500 pb, i aproximadament el 5% són més llargs que 900 pb.[54].La raó d'aquesta distribució de mida és que la principal font d'ADNccf al plasma es produeix com a resultat de la mort cel·lular, ja sigui per mort cel·lular o per necrosi de cèl·lules hematopoètiques circulants en individus sans o per apoptosi de cèl·lules tumorals en pacients amb càncer (coneguda com ADN del tumor circulant)., ADNc).La distribució de la mida del ccfDNA de l'hemolinfa que vam trobar als musclos oscil·lava entre 1000 i 5000 pb, cosa que suggereix que el ccfDNA del musclo té un origen diferent.Aquesta és una hipòtesi lògica, ja que els musclos tenen un sistema vascular semiobert i viuen en ambients aquàtics marins que contenen altes concentracions d'ADN genòmic microbià.De fet, els nostres experiments de laboratori amb ADN exògen han demostrat que els musclos acumulen fragments d'ADN a l'aigua de mar, almenys al cap d'unes hores, es degraden després de l'absorció cel·lular i/o alliberats i/o emmagatzemats en diverses organitzacions.Atesa la raresa de les cèl·lules (tant procariotes com eucariotes), l'ús de compartiments intravalvulars reduirà la quantitat d'ADNccf tant de fonts pròpies com de fonts estrangeres.Tenint en compte la importància de la immunitat innata dels bivalves i el gran nombre de fagòcits circulants, vam plantejar a més la hipòtesi que fins i tot el ccfDNA estranger s'enriqueix en fagòcits circulants que acumulen ADN estranger després de la ingestió de microorganismes i/o restes cel·lulars.En conjunt, els nostres resultats mostren que l'hemolinfa bivalva ccfDNA és un dipòsit únic d'informació molecular i reforça el seu estatus com a espècie sentinella.
Les nostres dades indiquen que la seqüenciació i l'anàlisi de fragments d'hemolinfa ccfDNA derivats de bacteris poden proporcionar informació clau sobre la flora bacteriana hoste i els bacteris presents a l'ecosistema marí circumdant.Les tècniques de seqüenciació de trets han revelat seqüències del bacteri comensal A. atra branquia que s'haurien perdut si s'haguessin utilitzat els mètodes convencionals d'identificació d'ARNr 16S, degut en part a un biaix de la biblioteca de referència.De fet, el nostre ús de dades de LB recollides de M. platensis a la mateixa capa de musclos a Kerguelen va demostrar que la composició dels simbionts bacterians associats a brànquies era la mateixa per a ambdues espècies de musclos (Fig. S4, Informació suplementària).Aquesta similitud de dos musclos genèticament diferents pot reflectir la composició de les comunitats bacterianes als dipòsits freds, sulfurosos i volcànics de Kerguelen [55, 56, 57, 58].Els nivells més alts de microorganismes reductors de sofre s'han descrit bé quan es collien musclos de zones costaneres bioturbades [59], com la costa de Port-au-France.Una altra possibilitat és que la flora del musclo comensal es vegi afectada per la transmissió horitzontal [60, 61].Es necessiten més investigacions per determinar la correlació entre el medi marí, la superfície del fons marí i la composició dels bacteris simbiòtics dels musclos.Aquests estudis estan actualment en curs.
La longitud i la concentració del ccfDNA de l'hemolinfa, la seva facilitat de purificació i l'alta qualitat per permetre una seqüenciació ràpida de l'escopeta són alguns dels molts avantatges d'utilitzar ccfDNA de musclo per avaluar la biodiversitat als ecosistemes costaners marins.Aquest enfocament és especialment eficaç per caracteritzar comunitats virals (víromes) en un ecosistema determinat [62, 63].A diferència dels bacteris, les arquees i els eucariotes, els genomes virals no contenen gens conservats filogenèticament com les seqüències 16S.Els nostres resultats indiquen que les biòpsies líquides d'espècies indicadores com els musclos es poden utilitzar per identificar un nombre relativament gran de fragments de virus ccfDNA coneguts per infectar hostes que habiten normalment els ecosistemes marins costaners.Això inclou virus coneguts per infectar protozous, artròpodes, insectes, plantes i virus bacterians (per exemple, bacteriòfags).Es va trobar una distribució similar quan vam examinar el viroma de l'hemolinfa ccfDNA de musclos blaus (M. platensis) recollits a la mateixa capa de musclos a Kerguelen (taula S2, informació suplementària).La seqüenciació d'escopeta del ccfDNA és, de fet, un nou enfocament que guanya impuls en l'estudi del viroma dels humans o d'altres espècies [21, 37, 64].Aquest enfocament és especialment útil per estudiar els virus d'ADN de doble cadena, ja que no es conserva cap gen únic entre tots els virus d'ADN de doble cadena, que representen la classe de virus més diversa i àmplia de Baltimore [65].Tot i que la majoria d'aquests virus romanen sense classificar i poden incloure virus d'una part completament desconeguda del món viral [66], vam trobar que els viromes i els rangs d'hostes dels musclos A. atra i M. platensis es troben entre les dues espècies.de la mateixa manera (vegeu la figura S3, informació addicional).Aquesta similitud no és sorprenent, ja que pot reflectir una manca de selectivitat en l'absorció de l'ADN present a l'entorn.Actualment es necessiten estudis futurs amb ARN purificat per caracteritzar el viroma d'ARN.
En el nostre estudi, vam utilitzar un pipeline molt rigorós adaptat del treball de Kowarski i col·legues [37], que van utilitzar una supressió en dos passos de lectures i contigs agrupats abans i després del muntatge del ccfDNA natiu, donant lloc a una gran proporció de lectures no mapejades.Per tant, no podem descartar que algunes d'aquestes lectures sense cartografiar encara puguin tenir el seu propi origen, principalment perquè no disposem d'un genoma de referència per a aquesta espècie de musclo.També vam utilitzar aquesta canalització perquè ens preocupaven les quimeres entre les lectures pròpies i les no pròpies i les longituds de lectura generades per Illumina MiSeq PE75.Un altre motiu de la majoria de lectures no gràfices és que gran part dels microbis marins, especialment a zones remotes com Kerguelen, no han estat anotats.Hem utilitzat Illumina MiSeq PE75, assumint longituds de fragments d'ADN ccfd similars a l'ADN ccfd humà.Per a estudis futurs, tenint en compte els nostres resultats que mostren que l'hemolinfa ccfDNA té lectures més llargues que els humans i/o els mamífers, recomanem utilitzar una plataforma de seqüenciació més adequada per a fragments de ccfDNA més llargs.Aquesta pràctica farà que sigui molt més fàcil identificar més indicacions per a una anàlisi més profunda.L'obtenció de la seqüència completa del genoma nuclear d'A. atra no disponible actualment també facilitaria molt la discriminació del ccfDNA de fonts pròpies i no pròpies.Atès que la nostra investigació s'ha centrat en la possibilitat d'aplicar el concepte de biòpsia líquida als musclos, esperem que a mesura que aquest concepte s'utilitzi en futures investigacions, es desenvolupin noves eines i canalitzacions per augmentar el potencial d'aquest mètode per estudiar la diversitat microbiana dels musclos.ecosistema marí.
Com a biomarcador clínic no invasiu, els nivells elevats de ccfDNA en plasma humà s'associen a diverses malalties, danys als teixits i condicions d'estrès [67,68,69].Aquest augment s'associa amb l'alliberament de fragments d'ADN del seu propi origen després del dany dels teixits.Vam abordar aquest problema mitjançant l'estrès tèrmic agut, en què els musclos estaven exposats breument a una temperatura de 30 ° C.Hem realitzat aquesta anàlisi en tres tipus diferents de musclos en tres experiments independents.Tanmateix, no vam trobar cap canvi en els nivells de ccfDNA després d'un estrès tèrmic agut (vegeu la figura S5, informació addicional).Aquest descobriment pot explicar, almenys en part, el fet que els musclos tinguin un sistema circulatori semiobert i acumulin grans quantitats d'ADN estrany a causa de la seva alta activitat filtradora.D'altra banda, els musclos, com molts invertebrats, poden ser més resistents al dany tissular induït per l'estrès, limitant així l'alliberament de ccfDNA a la seva hemolinfa [70, 71].
Fins ara, l'anàlisi d'ADN de la biodiversitat en ecosistemes aquàtics s'ha centrat principalment en la codificació de metabarres d'ADN ambiental (eDNA).Tanmateix, aquest mètode sol estar limitat en l'anàlisi de la biodiversitat quan s'utilitzen primers.L'ús de la seqüenciació d'escopeta evita les limitacions de la PCR i la selecció esbiaixada de conjunts d'imprimadors.Així, en cert sentit, el nostre mètode s'acosta més al mètode de seqüenciació d'eDNA Shotgun d'alt rendiment utilitzat recentment, que és capaç de seqüenciar directament l'ADN fragmentat i analitzar gairebé tots els organismes [72, 73].Tanmateix, hi ha una sèrie de problemes fonamentals que distingeixen LB dels mètodes estàndards d'eDNA.Per descomptat, la diferència principal entre eDNA i LB és l'ús d'amfitrions de filtres naturals.S'ha informat de l'ús d'espècies marines com esponges i bivalves (Dresseina spp.) com a filtre natural per estudiar l'eDNA [74, 75].Tanmateix, l'estudi de Dreissena va utilitzar biòpsies de teixits de les quals es va extreure l'ADN.L'anàlisi del ccfDNA de LB no requereix biòpsia de teixit, equips especialitzats i de vegades costosos i logística associada a eDNA o biòpsia de teixit.De fet, recentment vam informar que el ccfDNA de LB es pot emmagatzemar i analitzar amb suport de FTA sense mantenir una cadena de fred, la qual cosa és un repte important per a la investigació en àrees remotes [76].L'extracció de ccfDNA de biòpsies líquides també és senzilla i proporciona ADN d'alta qualitat per a la seqüenciació d'escopeta i l'anàlisi per PCR.Aquest és un gran avantatge tenint en compte algunes de les limitacions tècniques associades a l'anàlisi d'eDNA [77].La senzillesa i el baix cost del mètode de mostreig també és especialment adequat per a programes de seguiment a llarg termini.A més de la seva alta capacitat de filtratge, una altra característica coneguda dels bivalves és la composició química de mucopolisacàrids del seu moc, que afavoreix l'absorció de virus [78, 79].Això fa que els bivalves siguin un filtre natural ideal per caracteritzar la biodiversitat i l'impacte del canvi climàtic en un ecosistema aquàtic determinat.Tot i que la presència de fragments d'ADN derivats de l'hoste es pot veure com una limitació del mètode en comparació amb l'eDNA, el cost associat a tenir un ccfDNA natiu en comparació amb l'eDNA és comprensible simultàniament per la gran quantitat d'informació disponible per als estudis de salut.host compensat.Això inclou la presència de seqüències virals integrades al genoma de l'hoste hoste.Això és especialment important per als musclos, donada la presència de retrovirus leucèmics de transmissió horitzontal en bivalves [80, 81].Un altre avantatge de LB respecte a l'eDNA és que aprofita l'activitat fagocítica de les cèl·lules sanguínies circulants a l'hemolinfa, que engoleix els microorganismes (i els seus genomes).La fagocitosi és la funció principal de les cèl·lules sanguínies als bivalves [82].Finalment, el mètode aprofita l'alta capacitat de filtratge dels musclos (mitjana 1,5 l/h d'aigua de mar) i la circulació de dos dies, que augmenten la mescla de diferents capes d'aigua de mar, permetent la captura d'eDNA heteròleg.[83, 84].Per tant, l'anàlisi del ccfDNA dels musclos és una via interessant donats els impactes nutricionals, econòmics i ambientals dels musclos.De manera similar a l'anàlisi de LB recollit en humans, aquest mètode també obre la possibilitat de mesurar els canvis genètics i epigenètics en l'ADN de l'hoste en resposta a substàncies exògenes.Per exemple, es poden preveure tecnologies de seqüenciació de tercera generació per dur a terme anàlisis de metilació a tot el genoma en ccfDNA natiu mitjançant la seqüenciació de nanopors.Aquest procés s'hauria de facilitar pel fet que la longitud dels fragments de ccfDNA del musclo és idealment compatible amb plataformes de seqüenciació de lectura llarga que permeten l'anàlisi de la metilació de l'ADN a tot el genoma a partir d'una única seqüenciació sense necessitat de transformacions químiques.Per tant, pot proporcionar una visió valuosa dels mecanismes subjacents que regeixen la resposta després de l'exposició al canvi climàtic o als contaminants [87].Tanmateix, l'ús de LB no està exempt de limitacions.No cal dir que això requereix la presència d'espècies indicadores a l'ecosistema.Com s'ha esmentat anteriorment, utilitzar LB per avaluar la biodiversitat d'un ecosistema determinat també requereix un pipeline bioinformàtic rigorós que tingui en compte la presència de fragments d'ADN de la font.Un altre problema important és la disponibilitat de genomes de referència per a espècies marines.S'espera que iniciatives com el Marine Mammal Genomes Project i el recentment establert projecte Fish10k [88] facilitin aquesta anàlisi en el futur.L'aplicació del concepte LB als organismes marins que s'alimenten per filtre també és compatible amb els darrers avenços en tecnologia de seqüenciació, per la qual cosa és molt adequat per al desenvolupament de biomarcadors multi-ohm per proporcionar informació important sobre la salut dels hàbitats marins en resposta a l'estrès ambiental.
Les dades de seqüenciació del genoma s'han dipositat a l'Arxiu de lectura de seqüències NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 a Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Impacte del canvi climàtic en la vida i els ecosistemes marins.Cole Biologia.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Considereu els impactes combinats del canvi climàtic i altres factors d'estrès locals sobre el medi marí.entorn científic general.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Ciència del primer de març.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. La reducció de la tolerància a la calor en condicions repetitives d'estrès per calor explica l'alta mortalitat estival dels musclos blaus.Informe científic 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, et al.Canvis recents en la freqüència, les causes i l'abast de les morts d'animals.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Múltiples patògens no específics de l'espècie poden haver causat la mortalitat massiva de Pinna nobilis.La vida.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Impacte potencial del canvi climàtic sobre les malalties zoonòtiques de l'Àrtic.Int J Salut circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Musclos blaus (Mytilus edulis spp.) Com a organismes senyalitzadors en el seguiment de la contaminació costanera: una revisió.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integració de la biòpsia líquida en el tractament del càncer.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, et al.Maduració de la biòpsia líquida: permet que l'ADN del tumor circuli.Nat Rev Càncer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Àcids nucleics en plasma humà.Actes de reunió de les filials de Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Un nou paper per a l'ADN lliure de cèl·lules com a marcador molecular per al tractament del càncer.Quantificació de l'anàlisi biomolar.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS La biòpsia líquida entra a la clínica: problemes d'implementació i reptes futurs.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW i altres.L'ADN fetal està present al plasma i sèrum materns.Lanceta.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Estudi del curs de l'embaràs i les seves complicacions utilitzant ARN extracel·lular circulant a la sang de les dones durant l'embaràs.Dopediatria.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, et al.Biòpsia líquida: l'ADN lliure de cèl·lules del donant s'utilitza per detectar lesions al·logèniques en un empelt de ronyó.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovacions en diagnòstic prenatal: seqüenciació del genoma del plasma matern.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al.Detecció ràpida de patògens amb seqüenciació metagenòmica de nova generació de fluids corporals infectats.Nat Medicina.2021;27:115-24.