Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
El sagnat incontrolat és una de les principals causes de mort.Aconseguir una hemostàsia ràpida garanteix la supervivència del subjecte com a primers auxilis durant el combat, els accidents de trànsit i les operacions de reducció de morts.Bastida composta reforçada amb fibra nanoporosa (NFRCS) derivat d'una composició formadora de pel·lícula hemostàtica simple (HFFC) ja que una fase contínua pot desencadenar i millorar l'hemostàsia.El desenvolupament del NFRCS es basa en el disseny de l'ala de la libèl·lula.L'estructura de les ales de libèl·lula consta d'ales transversals i longitudinals, i les membranes de les ales estan connectades entre si per mantenir la integritat de la microestructura.L'HFFC recobreix uniformement la superfície de la fibra amb una pel·lícula de gruix nanomètric i connecta el gruix del cotó (Ct) distribuït aleatòriament (fase dispersa) per formar una estructura nanoporosa.La combinació de fases contínues i disperses redueix deu vegades el cost del producte en comparació amb els productes disponibles comercialment.Els NFRCS modificats (tampons o polseres) es poden utilitzar en una varietat d'aplicacions biomèdiques.Els estudis in vivo han conclòs que el Cp NFRCS desenvolupat desencadena i millora el procés de coagulació al lloc d'aplicació.NFRCS pot modular el microambient i actuar a nivell cel·lular a causa de la seva estructura nanoporosa que resulta en una millor cicatrització de ferides en el model de ferida per escisió.
El sagnat incontrolat durant el combat, les situacions intraoperatòries i d'emergència poden suposar una greu amenaça per a la vida dels ferits1.Aquestes condicions condueixen a més a un augment global de la resistència vascular perifèrica, donant lloc a un xoc hemorràgic.Les mesures adequades per controlar el sagnat durant i després de la cirurgia es consideren potencialment mortals2,3.El dany als grans vasos condueix a una pèrdua massiva de sang, el que resulta en una taxa de mortalitat ≤ 50% en combat i 31% durant la cirurgia1.La pèrdua massiva de sang condueix a una disminució del volum corporal, la qual cosa redueix la producció cardíaca.Un augment de la resistència vascular perifèrica total i un deteriorament progressiu de la microcirculació condueixen a hipòxia en els òrgans de suport vital.Es pot produir un xoc hemorràgic si la malaltia continua sense intervenció efectiva1,4,5.Altres complicacions inclouen la progressió de la hipotèrmia i l'acidosi metabòlica, així com un trastorn de la coagulació que impedeix el procés de coagulació.El xoc hemorràgic greu s'associa amb un major risc de mort6,7,8.En el xoc de grau III (progressiu), la transfusió de sang és essencial per a la supervivència del pacient durant la morbiditat i mortalitat intraoperatòria i postoperatòria.Per superar totes les situacions que amenacen la vida anteriors, hem desenvolupat una bastida composta reforçada amb fibres nanoporoses (NFRCS) que utilitza una concentració mínima de polímer (0,5%) mitjançant una combinació de polímers hemostàtics solubles en aigua.
Amb l'ús de reforç de fibra, es poden desenvolupar productes rendibles.Les fibres disposades a l'atzar s'assemblen a l'estructura de l'ala d'una libèl·lula, equilibrada per les ratlles horitzontals i verticals de les ales.Les venes transversals i longitudinals de l'ala es comuniquen amb la membrana de l'ala (fig. 1).NFRCS consisteix en Ct reforçat com a sistema de bastida amb millor resistència física i mecànica (figura 1).A causa de l'assequibilitat i l'artesania, els cirurgians prefereixen utilitzar calibres de fil de cotó (Ct) durant les operacions i els apòsits. Per tant, tenint en compte els seus múltiples beneficis, incloent> 90% de cel·lulosa cristal·lina (imparteix en la millora de l'activitat hemostàtica), la Ct es va utilitzar com a sistema esquelètic de NFRCS9,10. Per tant, tenint en compte els seus múltiples beneficis, incloent> 90% de cel·lulosa cristal·lina (imparteix en la millora de l'activitat hemostàtica), la Ct es va utilitzar com a sistema esquelètic de NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристалличесвесклой в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Per tant, donats els seus nombrosos beneficis, inclosa el 90% de cel·lulosa cristal·lina (implicada en l'augment de l'activitat hemostàtica), la Ct es va utilitzar com a sistema esquelètic NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血强止血滢止血滴止血滴 NF ， NF ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Per tant, donats els seus nombrosos beneficis, incloent més del 90% de cel·lulosa cristal·lina (ajuda a millorar l'activitat hemostàtica), el Ct es va utilitzar com a bastida per a NFRCS9,10.El Ct es va recobrir superficialment (es va observar la formació de pel·lícula nanogruixuda) i es va interconnectar amb una composició formadora de pel·lícula hemostàtica (HFFC).L'HFFC actua com un matrigel, mantenint junts Ct col·locats aleatòriament.El disseny desenvolupat transmet l'estrès dins de la fase dispersa (fibres de reforç).És difícil obtenir estructures nanoporoses amb bona resistència mecànica utilitzant concentracions mínimes de polímers.A més, no és fàcil personalitzar diferents motlles per a diferents aplicacions biomèdiques.
La figura mostra un diagrama del disseny NFRCS basat en l'estructura d'ala de libèl·lula (A).Aquesta imatge mostra una analogia comparativa de l'estructura de l'ala d'una libèl·lula (les venes que s'entrecreuen i longitudinals de l'ala estan interconnectades) i una microfotografia de secció transversal de Cp NFRCS (B).Representació esquemàtica de NFRCS.
Els NFRC es van desenvolupar utilitzant HFFC com a fase contínua per abordar les limitacions anteriors.L'HFFC es compon de diversos polímers hemostàtics pel·lícules que inclouen quitosà (com a polímer hemostàtic principal) amb metilcel·lulosa (MC), hidroxipropilmetilcel·lulosa (HPMC 50 cp) i alcohol polivinílic (PVA)) (125 kDa) com a polímer de suport que afavoreix la formació de trombes.formació.L'addició de polivinilpirrolidina K30 (PVP K30) va millorar la capacitat d'absorció d'humitat del NFRCS.Es va afegir polietilenglicol 400 (PEG 400) per millorar la reticulació del polímer en les barreges de polímers units.Es van aplicar a Ct tres composicions hemostàtiques HFFC diferents (Cm HFFC, Ch HFFC i Cp HFFC), és a dir, quitosà amb MC (Cm), quitosà amb HPMC (Ch) i quitosà amb PVA (Cp).Diversos estudis de caracterització in vitro i in vivo han confirmat l'activitat hemostàtica i de cicatrització de ferides de NFRCS.Els materials compostos que ofereix NFRCS es poden utilitzar per personalitzar diverses formes de bastides per satisfer necessitats específiques.
A més, NFRCS es pot modificar com a embenat o rotllo per cobrir tota l'àrea de lesió de les extremitats inferiors i altres parts del cos.Específicament per a lesions de les extremitats de combat, el disseny NFRCS dissenyat es pot canviar a mig braç o cama sencera (figura suplementària S11).El NFRCS es pot convertir en una polsera amb cola de teixit, que es pot utilitzar per aturar l'hemorràgia de lesions suïcides greus al canell.El nostre objectiu principal és desenvolupar un NFRCS amb el mínim polímer possible que es pugui lliurar a una gran població (per sota del llindar de pobresa) i que es pugui col·locar en una farmaciola.Disseny senzill, eficient i econòmic, NFRCS beneficia les comunitats locals i pot tenir un impacte global.
El quitosà (pes molecular 80 kDa) i l'amarant es van comprar a Merck, Índia.La hidroxipropil metilcel·lulosa 50 Cp, el polietilenglicol 400 i la metilcel·lulosa es van comprar a Loba Chemie Pvt.LLC, Bombai.L'alcohol polivinílic (pes molecular 125 kDa) (87-90% hidrolitzat) es va comprar a National Chemicals, Gujarat.La polivinilpirrolidina K30 es va comprar a Molychem, Bombai, es van comprar hisops estèrils a Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, amb aigua Milli Q (sistema de purificació d'aigua Direct-Q3, Merck, Índia) com a transportista.
NFRCS es va desenvolupar mitjançant un mètode de liofilització11,12.Totes les composicions d'HFFC (taula 1) es van preparar mitjançant un agitador mecànic.Prepareu una solució de quitosà al 0,5% utilitzant àcid acètic a l'1% en aigua amb agitació contínua a 800 rpm amb un agitador mecànic.El pes exacte del polímer carregat indicat a la taula 1 es va afegir a la solució de quitosà i es va agitar fins que es va obtenir una solució de polímer transparent.Es van afegir PVP K30 i PEG 400 a la mescla resultant en les quantitats indicades a la taula 1, i es va continuar agitant fins que es va obtenir una solució de polímer viscosa clara.El bany resultant de solució de polímer es va sonicar durant 60 minuts per eliminar les bombolles d'aire atrapades de la barreja de polímer.Tal com es mostra a la figura suplementària S1 (b), Ct es va distribuir uniformement a cada pou d'una placa de 6 pous (motlle) complementada amb 5 ml d'HFFC.
La placa de sis pous es va sonicar durant 60 min per aconseguir una humectació i una distribució uniformes de HFFC a la xarxa Ct.A continuació, congela la placa de sis pous a -20 °C durant 8-12 hores.Les plaques de congelació es van liofilitzar durant 48 hores per obtenir diverses formulacions de NFRCS.El mateix procediment s'utilitza per produir diferents formes i estructures, com tampons o tampons cilíndrics, o qualsevol altra forma per a diferents aplicacions.
El quitosà pesat amb precisió (80 kDa) (3%) es dissol en àcid acètic a l'1% mitjançant un agitador magnètic.A la solució de quitosà resultant es va afegir 1% de PEG 400 i es va agitar durant 30 minuts.Aboqui la solució resultant en un recipient quadrat o rectangular i congela a -80 °C durant 12 hores.Les mostres congelades es van liofilitzar durant 48 hores per obtenir Cs13 porós.
El NFRCS desenvolupat es va sotmetre a experiments mitjançant espectroscòpia infraroja de transformada de Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tòquio, Japó) per confirmar la compatibilitat química del quitosà amb altres polímers14,15.Els espectres FTIR (amplada de l'interval espectral de 400 a 4000 cm-1) de totes les mostres provades es van obtenir realitzant 32 exploracions.
La taxa d'absorció de sang (BAR) per a totes les formulacions es va avaluar mitjançant el mètode descrit per Chen et al.16 amb lleugeres modificacions.Els NFRK desenvolupats de totes les composicions es van assecar en un forn al buit a 105 ° C durant la nit per eliminar el dissolvent residual.Es van col·locar 30 mg de NFRCS (pes inicial de la mostra - W0) i 30 mg de Ct (control positiu) en plats separats que contenien una barreja prèvia de citrat de sodi al 3, 8%.A intervals de temps predeterminats, és a dir, 5, 10, 20, 30, 40 i 60 segons, es van eliminar els NFRCS i es van netejar les seves superfícies de sang no absorbida col·locant les mostres a Ct durant 30 segons.Es va considerar el pes final de sang absorbit per NFRCS 16 (W1) en cada moment.Calcula el percentatge de BAR utilitzant la fórmula següent:
El temps de coagulació de la sang (BCT) es va determinar tal com va informar Wang et al.17 .El temps necessari perquè la sang sencera (sang de rata barrejada amb un 3,8% de citrat de sodi) coaguli en presència de NFRCS es va calcular com a BCT de la mostra de prova.Els diferents components de NFRCS (30 mg) es van col·locar en vials de 10 ml de tapa de rosca i es van incubar a 37 ° C.Es va afegir sang (0,5 ml) al vial i es van afegir 0,3 ml de CaCl2 0,2 ​​M per activar la coagulació de la sang.Finalment, inverteix el vial cada 15 segons (fins a 180°) fins que es formi un coàgul ferm.El BCT de la mostra s'estima pel nombre de voltes vails17,18.A partir de BCT, es van seleccionar dues composicions òptimes de NFRCS Cm, Ch i Cp per a estudis de caracterització posteriors.
El BCT de les composicions Ch NFRCS i Cp NFRCS es va determinar mitjançant la implementació del mètode descrit per Li et al.19 .Col·loqueu 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs (control positiu) en plaques de Petri separades (37 ° C).La sang que contenia un 3,8% de citrat de sodi es va barrejar amb 0,2 M de CaCl2 en una proporció de volum de 10:1 per iniciar el procés de coagulació de la sang.Es van aplicar 20 µl de barreja de sang de rata CaCl2 0, 2 M a la superfície de la mostra i es van col·locar en una placa de Petri buida.El control era sang abocada en plaques de Petri buides sense Ct.A intervals fixos de 0, 3 i 5 minuts, atureu la coagulació afegint 10 ml d'aigua desionitzada (DI) a la mostra que conté el plat sense alterar el coàgul.Els eritròcits no coagulats (eritròcits) pateixen hemòlisi en presència d'aigua desionitzada i alliberen hemoglobina.L'hemoglobina en diferents moments (HA(t)) es va mesurar a 540 nm (hemoglobina λmax) mitjançant un espectrofotòmetre UV-Vis.Es va prendre com a estàndard de referència l'absorció absoluta d'hemoglobina (AH(0)) en 0 min de 20 µl de sang en 10 ml d'aigua desionitzada.La captació relativa d'hemoglobina (RHA) de la sang coagulada es va calcular a partir de la relació HA(t)/HA(0) utilitzant el mateix lot de sang.
Mitjançant un analitzador de textures (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, EUA), es van determinar les propietats adhesives de NFRK al teixit danyat.Premeu un plat cilíndric de fons obert contra l'interior de la pell de porc (sense la capa de greix).Les mostres (Ch NFRCS i Cp NFRCS) es van aplicar mitjançant cànula en motlles cilíndrics per crear adhesió a la pell del porc.Després d'una incubació de 3 minuts a temperatura ambient (RT) (25 ° C), es va registrar la força adhesiva NFRCS a una velocitat constant de 0, 5 mm/s.
La característica principal dels segelladors quirúrgics és augmentar la coagulació de la sang alhora que redueix la pèrdua de sang.La coagulació sense pèrdues en NFRCS es va avaluar mitjançant un mètode publicat prèviament amb lleugeres modificacions 19 .Feu un tub de microcentrífuga (2 ml) (diàmetre interior 10 mm) amb un forat de 8 × 5 mm2 a un costat del tub de centrífuga (que representa una ferida oberta).NFRCS s'utilitza per tancar l'obertura i la cinta s'utilitza per segellar les vores exteriors.Afegiu 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M al tub de microcentrífuga que conté la premescla de citrat de sodi al 3,8%.Després de 10 minuts, es van retirar els tubs de microcentrífuga dels plats i es va determinar l'augment de la massa dels plats a causa de la sortida de sang del NFRK (n = 3).La pèrdua de sang Ch NFRCS i Cp NFRCS es van comparar amb Cs.
La integritat humida de NFRCS es va determinar a partir del mètode descrit per Mishra i Chaudhary21 amb petites modificacions.Col·loqueu el NFRCS en un matràs Erlenmeyer de 100 ml amb 50 ml d'aigua i agiteu durant 60 s sense formar cap tapa.Inspecció visual i priorització de mostres per a la integritat física en funció de la recollida.
La força d'unió de l'HFFC a Ct es va estudiar mitjançant mètodes publicats anteriorment amb modificacions menors.La integritat del recobriment superficial es va avaluar exposant NFRK a ones acústiques (estímul extern) en presència d'aigua milliQ (Ct).Els NFRCS Ch NFRCS i Cp NFRCS desenvolupats es van col·locar en un vas de precipitats ple d'aigua i es van sonicar durant 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 30 min, respectivament.Després de l'assecat, es va utilitzar la diferència percentual entre el pes inicial i final del NFRCS per calcular el percentatge de pèrdua de material (HFFC).La BCT in vitro va recolzar encara més la força d'unió o la pèrdua de materials superficials.L'eficiència de la unió de HFFC a Ct proporciona coagulació de la sang i un recobriment elàstic a la superfície de Ct22.
L'homogeneïtat del NFRCS desenvolupat es va determinar mitjançant el BCT de mostres (30 mg) preses d'ubicacions generals seleccionades aleatòriament del NFRCS.Seguiu el procediment BCT esmentat anteriorment per determinar el compliment de NFRCS.La proximitat entre les cinc mostres garanteix una cobertura uniforme de la superfície i la deposició de HFFC a la malla Ct.
L'àrea de contacte amb sang nominal (NBCA) es va determinar tal com es va informar anteriorment amb algunes modificacions.Coaguleu la sang fixant 20 µl de sang entre les dues superfícies de Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs.Després d'1 hora, es van separar les dues parts de l'stent i es van mesurar manualment l'àrea del coàgul.El valor mitjà de tres repeticions es va considerar NBCA NFRCS19.
L'anàlisi d'absorció de vapor dinàmica (DVS) es va utilitzar per avaluar l'efectivitat del NFRCS per absorbir aigua de l'entorn extern o del lloc de lesió responsable d'iniciar la coagulació.El DVS avalua o registra l'absorció i la pèrdua de vapor en una mostra gravimètricament mitjançant una balança ultrasensible amb una resolució de massa de ±0,1 µg.Una pressió de vapor parcial (humitat relativa) és generada per un controlador electrònic de flux massiu al voltant de la mostra mitjançant la barreja de gasos portadors saturats i secs. D'acord amb les directrius de la Farmacopea Europea, segons el percentatge d'absorció d'humitat per part de les mostres, les mostres es van classificar en 4 categories (0-0,012% p/p - no higroscòpic, 0,2-2% p/p lleugerament higroscòpic, 2-15% moderadament higroscòpic) i > 15% higroscòpic) Segons les directrius de la Farmacopea Europea, segons el percentatge d'absorció d'humitat per part de les mostres, les mostres es van classificar en 4 categories (0-0,012% p/p - no higroscòpic, 0,2-2% p/p lleugerament higroscòpic, 2-15% moderadament higroscòpic) i > 15% higroscòpic i > 15%D'acord amb les recomanacions de la Farmacopea Europea, depenent del percentatge d'absorció d'humitat per part de les mostres, les mostres es van dividir en 4 categories (0-0,012% p/p - no higroscòpic, 0,2-2% p/p lleugerament higroscòpic, 2-15%).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderadament higroscòpic i > 15% molt higroscòpic)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012% w/0,012% w/0,012% w/0,012% w/0,012% p/p. /w 轻微吸湿性、2-15% 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分为 分为 分为 分 分 0（ 0 0.湿 性 、 、 、 、 0,2-2% p/p 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15%非常吸湿）23。D'acord amb les recomanacions de la Farmacopea Europea, les mostres es divideixen en 4 classes en funció del percentatge d'humitat absorbida per la mostra (0-0,012% en pes - no higroscòpica, 0,2-2% en pes lleugerament higroscòpica, 2-15% en pes).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderadament higroscòpic, > 15% molt higroscòpic) 23.L'eficiència higroscòpica de NFCS X NFCS i TsN NFCS es va determinar en un analitzador DVS TA TGA Q5000 SA.Durant aquest procés, es va obtenir el temps d'execució, la humitat relativa (HR) i el pes de la mostra en temps real a 25 ° C24.El contingut d'humitat es calcula mitjançant una anàlisi de massa NFRCS precisa mitjançant l'equació següent:
MC és la humitat NFRCS.m1 - pes sec dels AINE.m2 és la massa NFRCS en temps real a una RH determinada.
La superfície total es va estimar mitjançant un experiment d'adsorció de nitrogen amb nitrogen líquid després de buidar les mostres a 25 ° C durant 10 h (< 7 × 10–3 Torr). La superfície total es va estimar mitjançant un experiment d'adsorció de nitrogen amb nitrogen líquid després de buidar les mostres a 25 ° C durant 10 h (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азоток по сперимента ожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). La superfície total es va estimar mitjançant un experiment d'adsorció de nitrogen amb nitrogen líquid després de buidar les mostres a 25 ° C durant 10 h (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表面总表。在 25 °C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбцод сорбцод писорбцод писалась с использованием ле опорожнения образцов в течение 10 часов при 25 °C (< 7 × 10-3 торр). La superfície total es va estimar mitjançant experiments d'adsorció de nitrogen amb nitrogen líquid després de buidar les mostres durant 10 hores a 25 ° C (< 7 x 10-3 torr).La superfície total, el volum de porus i la mida dels porus NFRCS es van determinar amb un Quantachrome de NOVA 1000e, Àustria mitjançant el programari RS 232.
Prepareu un 5% de glòbuls vermells (solució salina com a diluent) a partir de sang sencera.A continuació, transferiu una alíquota de HFFC (0,25 ml) a una placa de 96 pous i un 5% de massa RBC (0,1 ml).Incubar la mescla a 37 °C durant 40 minuts.Es va considerar una barreja de glòbuls vermells i sèrum com a control positiu, i una barreja de solució salina i glòbuls vermells com a control negatiu.L'hemaglutinació es va determinar segons l'escala Stajitzky.Les escales proposades són les següents: + + + + agregats granulars densos;+ + + coixinets inferiors llisos amb vores corbes;+ + coixinets inferiors llisos amb vores trencades;+ anells vermells estrets al voltant de les vores dels coixinets llisos;– (negatiu) botó vermell discret 12 al centre del pou inferior.
L'hemocompatibilitat de NFRCS es va estudiar segons el mètode de l'Organització Internacional d'Estandardització (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.El mètode gravimètric descrit per Singh et al.Es van fer modificacions menors per avaluar la formació de trombes en presència o a la superfície de NFRCS.Es van incubar 500 mg de Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS en solució salina tamponada amb fosfat (PBS) durant 24 hores a 37 ° C.Després de 24 hores, es va eliminar el PBS i es va tractar NFRCS amb 2 ml de sang que contenia un 3,8% de citrat de sodi.A la superfície del NFRCS, afegiu 0,04 ml de CaCl2 0,1 M a les mostres incubades.Després de 45 minuts, es van afegir 5 ml d'aigua destil·lada per aturar la coagulació.La sang coagulada a la superfície de NFRK es va tractar amb una solució de formaldehid al 36-38%.Els coàguls fixats amb formaldehid es van assecar i es van pesar.El percentatge de trombosi es va estimar calculant el pes del got sense sang i mostra (control negatiu) i del got amb sang (control positiu).
Com a confirmació inicial, les mostres es van visualitzar sota un microscopi òptic per entendre la capacitat del recobriment de la superfície de HFFC, Ct interconnectat i la xarxa de Ct per formar porus.Les seccions primes de Ch i Cp de NFRCS es van retallar amb una fulla de bisturí.La secció resultant es va col·locar sobre un portaobjectes de vidre, es va cobrir amb un cobreobjectes i es van fixar les vores amb cola.Les diapositives preparades es van veure amb un microscopi òptic i es van fer fotografies amb diferents augments.
La deposició de polímers en xarxes Ct es va visualitzar mitjançant microscòpia de fluorescència basada en el mètode descrit per Rice et al.29. La composició d'HFFC utilitzada per a la formulació es va barrejar amb un colorant fluorescent (amarant) i es va preparar NFRCS (Ch i Cp) segons el mètode esmentat anteriorment. La composició d'HFFC utilitzada per a la formulació es va barrejar amb un colorant fluorescent (amarant) i es va preparar NFRCS (Ch i Cp) segons el mètode esmentat anteriorment.La composició de HFFC utilitzada per a la formulació es va barrejar amb un colorant fluorescent (amarant) i es va obtenir NFRCS (Ch i Cp) segons el mètode esmentat anteriorment.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶到的斶Chp将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶到的斶ChpLa composició d'HFFC utilitzada en la formulació es va barrejar amb un colorant fluorescent (Amarant) i va rebre NFRCS (Ch i Cp), com s'ha esmentat anteriorment.Es van tallar seccions primes de NFRK de les mostres obtingudes, es van col·locar sobre portaobjectes de vidre i es van cobrir amb cobertors.Observeu les diapositives preparades sota un microscopi fluorescent amb un filtre verd (310-380 nm).Les imatges es van prendre amb un augment de 4x per entendre les relacions Ct i l'excés de deposició de polímers a la xarxa Ct.
La topografia superficial de NFRCS Ch i Cp es va determinar mitjançant un microscopi de força atòmica (AFM) amb un voladís TESP ultra afilat en mode de toc: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.La rugositat de la superfície es va determinar mitjançant l'arrel quadrada mitjana (RMS) mitjançant un programari (Scanning Probe Image Processor).Es van representar diverses ubicacions NFRCS en imatges 3D per comprovar la uniformitat de la superfície.La desviació estàndard de la puntuació per a una àrea determinada es defineix com la rugositat de la superfície.L'equació RMS es va utilitzar per quantificar la rugositat superficial de NFRCS31.
Es van realitzar estudis basats en FESEM mitjançant FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tòquio, per entendre la morfologia superficial de Ch NFRCS i Cp NFRCS, que mostraven un millor BCT que Cm NFRCS.L'estudi FESEM es va realitzar segons el mètode descrit per Zhao et al.32 amb petites modificacions.NFRCS 20 a 30 mg Ch NFRCS i Cp NFRCS es van barrejar prèviament amb 20 µl de citrat de sodi al 3, 8% premesclat amb sang de rata.Es van afegir 20 μl de CaCl2 0, 2 M a les mostres tractades amb sang per iniciar la coagulació i les mostres es van incubar a temperatura ambient durant 10 minuts.A més, es van eliminar l'excés d'eritròcits de la superfície NFRCS esbandint amb solució salina.
Les mostres posteriors es van tractar amb glutaraldehid al 0, 1% i després es van assecar en un forn d'aire calent a 37 ° C per eliminar la humitat.Les mostres seques van ser recobertes i analitzades 32 .Altres imatges obtingudes durant l'anàlisi van ser la formació de coàguls a la superfície de fibres de cotó individuals, la deposició de polímers entre Ct, la morfologia (forma) dels eritròcits, la integritat del coàgul i la morfologia dels eritròcits en presència de NFRCS.Les àrees NFRCS no tractades i les àrees NFRCS tractades amb Ch i Cp incubades amb sang es van escanejar per ions elementals (sodi, potassi, nitrogen, calci, magnesi, zinc, coure i seleni)33.Compareu els percentatges d'ions elementals entre mostres tractades i no tractades per entendre l'acumulació d'ions elementals durant la formació del coàgul i l'homogeneïtat del coàgul.
El gruix del recobriment superficial Cp HFFC a la superfície Ct es va determinar mitjançant FESEM.Les seccions transversals de Cp NFRCS es van tallar del marc i es van revestir amb pols.FESEM va observar les mostres de recobriment de pulverització resultant i es va mesurar el gruix del recobriment superficial 34, 35, 36.
La micro-TC de raigs X proporciona imatges 3D no destructives d'alta resolució i us permet estudiar la disposició estructural interna de NFRK.La micro-TC utilitza un feix de raigs X que travessa la mostra per registrar el coeficient d'atenuació lineal local dels raigs X de la mostra, que ajuda a obtenir informació morfològica.La ubicació interna de Ct a Cp NFRCS i Cp NFRCS tractada amb sang es va examinar mitjançant micro-TC per entendre l'eficiència d'absorció i la coagulació de la sang en presència de NFRCS37,38,39.Les estructures 3D de mostres de Cp NFRCS tractades i no tractades amb sang es van reconstruir mitjançant micro-TC (V|tome|x S240, Phoenix, Alemanya).Mitjançant la versió 2.2 del programari VG STUDIO-MAX, es van prendre diverses imatges de raigs X des de diferents angles (idealment una cobertura de 360 ​​°) per desenvolupar imatges 3D per a NFRCS.Les dades de projecció recollides es van reconstruir en imatges volumètriques 3D mitjançant el programari 3D ScanIP Academic senzill corresponent.
A més, per entendre la distribució del coàgul, es van afegir 20 µl de sang citratada premesclada i 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M al NFRCS per iniciar la coagulació de la sang.Les mostres preparades es deixen endurir.La superfície NFRK es va tractar amb glutaraldehid al 0, 5% i es va assecar en un forn d'aire calent a 30-40 ° C durant 30 min.El coàgul de sang format al NFRCS es va escanejar, reconstruir i es va visualitzar una imatge en 3D del coàgul de sang.
Es van realitzar assajos antibacterians a Cp NFRCS (millor en comparació amb Ch NFRCS) mitjançant el mètode descrit anteriorment amb petites modificacions.L'activitat antibacteriana de Cp NFRCS i Cp HFFC es va determinar mitjançant tres microorganismes de prova diferents [S.aureus (bacteris gram-positius), E.coli (bacteris gram-negatius) i Candida blanca (C.albicans)] que creixen en agar en plaques de Petri en una incubadora.Inocular uniformement 50 ml de la suspensió de cultiu bacterian diluït a una concentració de 105-106 CFU ml-1 al medi d'agar.Aboqueu el medi en una placa de Petri i deixeu-lo solidificar.Es van fer pous a la superfície de la placa d'agar per omplir-los amb HFFC (3 pous per a HFFC i 1 per a control negatiu).Afegiu 200 µl de HFFC a 3 pous i 200 µl de pH 7,4 PBS al quart pou.A l'altre costat de la placa de Petri, col·loqueu un disc Cp NFRCS de 12 mm a l'agar solidificat i humitegeu-lo amb PBS (pH 7,4).Les pastilles de ciprofloxacina, ampicil·lina i fluconazol es consideren estàndards de referència per a Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Candida albicans.Mesureu manualment la zona d'inhibició i feu una imatge digital de la zona d'inhibició.
Després de l'aprovació ètica institucional, l'estudi es va dur a terme al Kasturba Medical College of Education and Research a Manipal, Karnataka, al sud de l'Índia.El protocol experimental de TEG in vitro ha estat revisat i aprovat pel Comitè d'Ètica Institucional de Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Els subjectes van ser reclutats entre donants de sang voluntaris (entre 18 i 55 anys) del banc de sang de l'hospital.A més, es va obtenir un consentiment informat dels voluntaris per a la recollida de mostres de sang.El TEG natiu (N-TEG) ​​es va utilitzar per estudiar l'efecte de la formulació de Cp HFFC en sang sencera premesclada amb citrat de sodi.N-TEG és àmpliament reconegut pel seu paper en la reanimació al punt de cura, que crea problemes per als metges a causa del potencial de retard clínicament significatiu en els resultats (proves de coagulació de rutina).L'anàlisi N-TEG es va realitzar amb sang sencera.Es va obtenir el consentiment informat i la història clínica detallada de tots els participants.L'estudi no va incloure participants amb complicacions hemostàtiques o trombòtiques com l'embaràs/postpart o malaltia hepàtica.També es van excloure de l'estudi els subjectes que prenien fàrmacs que afecten la cascada de la coagulació.Es van realitzar proves bàsiques de laboratori (hemoglobina, temps de protrombina, tromboplastina activada i recompte de plaquetes) a tots els participants segons procediments estàndard.N-TEG determina la viscoelasticitat del coàgul de sang, l'estructura inicial del coàgul, la interacció de partícules, l'enfortiment del coàgul i la lisi del coàgul.L'anàlisi N-TEG proporciona dades gràfiques i numèriques sobre els efectes col·lectius de diversos elements cel·lulars i plasma.L'anàlisi N-TEG es va realitzar en dos volums diferents de Cp HFFC (10 µl i 50 µl).Com a resultat, es va afegir 1 ml de sang sencera amb àcid cítric a 10 μl de Cp HFFC.Afegiu 1 ml (Cp HFFC + sang citrada), 340 µl de sang barrejada a 20 µl de CaCl2 0,2 ​​M que conté TEG.A continuació, es van carregar plats TEG a TEG® 5000, EUA per mesurar R, K, angle alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY el 30% de les mostres de sang en presència de Cp HFFC41.
El protocol d'estudi in vivo va ser revisat i aprovat pel Comitè Institucional d'Ètica Animal (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Tots els experiments amb animals es van realitzar d'acord amb les recomanacions del Comitè per al Control i Supervisió de l'Experimentació Animal (CPCSEA).Tots els estudis NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) es van realitzar en rates Wistar femelles (de 200 a 250 g de pes).Tots els animals es van aclimatar a una temperatura de 24-26 °C, els animals tenien accés lliure a menjar i aigua estàndard ad libitum.Tots els animals es van dividir aleatòriament en diferents grups, cada grup estava format per tres animals.Tots els estudis es van realitzar d'acord amb Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 .Abans de l'estudi, els animals van ser anestesiats mitjançant l'administració intraperitoneal (ip) d'una barreja de 20-50 mg de ketamina (per 1 kg de pes corporal) i 2-10 mg de xilazina (per 1 kg de pes corporal).Després de l'estudi, es va calcular el volum de sagnat avaluant la diferència entre el pes inicial i final de les mostres, es va prendre com a volum de sagnat de la mostra el valor mitjà obtingut de les tres proves.
El model d'amputació de la cua de rata es va implementar per entendre el potencial de NFRCS per modular el sagnat en trauma, combat o accident de trànsit (model de lesió).Talleu el 50% de la cua amb una fulla de bisturí i poseu-la a l'aire durant 15 s per assegurar un sagnat normal.A més, es van col·locar mostres de prova a la cua d'una rata aplicant pressió (Ct, Cs, Ch NFRCS i Cp NFRCS).Es va informar de sagnat i PCT per a mostres de prova (n ​​= 3)17,45.
L'efectivitat del control de pressió NFRCS en combat es va investigar en un model de l'artèria femoral superficial.L'artèria femoral s'exposa, es punxa amb un trocar de 24G i es sagna en 15 segons.Després d'observar un sagnat incontrolat, la mostra de prova es col·loca al lloc de punció amb pressió aplicada.Immediatament després de l'aplicació de la mostra de prova, es va registrar el temps de coagulació i es va observar l'eficiència hemostàtica durant els 5 minuts següents.El mateix procediment es va repetir amb Cs i Ct46.
Dowling et al.47 van proposar un model de lesió hepàtica per avaluar el potencial hemostàtic dels materials hemostàtics en el context de l'hemorràgia intraoperatòria.Es va registrar BCT per a mostres Ct (control negatiu), marc Cs (control positiu), mostres Ch NFRCS i mostres Cp NFRCS.La vena cava suprahepàtica de la rata es va exposar realitzant una laparotomia mitjana.Després d'això, la part distal del lòbul esquerre es va tallar amb unes tisores.Feu una incisió al fetge amb una fulla de bisturí i deixeu-lo sagnar uns segons.Es van col·locar mostres de prova Ch NFRCS i Cp NFRCS pesades amb precisió a la superfície danyada sense cap pressió positiva i es va registrar BCT.Després, el grup control (Ct) va aplicar pressió seguida de Cs 30 s47 sense trencar la lesió.
Es van realitzar assajos de cicatrització de ferides in vivo mitjançant un model de ferides escissionals per avaluar les propietats de curació de ferides dels NFRCS basats en polímers desenvolupats.Es van seleccionar i realitzar models de ferides escissionals segons mètodes publicats anteriorment amb petites modificacions19,32,48.Tots els animals van ser anestesiats tal com es va descriure anteriorment.Utilitzeu un punxó de biòpsia (12 mm) per fer una incisió circular profunda a la pell de l'esquena.Els llocs de ferides preparats es van vestir amb Cs (control positiu), Ct (reconeixent que els coixinets de cotó interfereixen amb la cicatrització), Ch NFRCS i Cp NFRCS (grup experimental) i un control negatiu sense cap tractament.Cada dia de l'estudi, es va mesurar l'àrea de la ferida en totes les rates.Utilitzeu una càmera digital per fer una foto de la zona de la ferida i poseu-vos un apòsit nou.El percentatge de tancament de la ferida es va mesurar amb la fórmula següent:
En funció del percentatge de tancament de la ferida el 12è dia de l'estudi, es va extirpar la pell de rata del millor grup ((Cp NFRCS) i el grup control) i es va estudiar mitjançant la tinció d'H&E i la tinció de tricrom de Masson. En funció del percentatge de tancament de la ferida el 12è dia de l'estudi, es va extirpar la pell de rata del millor grup ((Cp NFRCS) i el grup control) i es va estudiar mitjançant la tinció d'H&E i la tinció de tricrom de Masson.En funció del percentatge de tancament de la ferida el 12è dia de l'estudi, es va extirpar la pell de les rates del millor grup ((Cp NFRCS) i del grup control) i es va examinar mitjançant una tinció amb hematoxilina-eosina i tricrom de Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠百分比切除最佳组&Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠百分比切进鼠皌按进鼠皌H&E眳组）Les rates del millor grup ((Cp NFRCS) i grups de control) van ser extirpades per a la tinció d'hematoxilina-eosina i la tinció de tricrom de Masson en funció del percentatge de tancament de la ferida el dia 12 de l'estudi.El procediment de tinció implementat es va dur a terme segons els mètodes descrits anteriorment49,50.Breument, després de la fixació en formalina al 10%, les mostres es van deshidratar mitjançant una sèrie d'alcohols graduats.Utilitzeu un micròtom per obtenir seccions primes (5 µm de gruix) del teixit extirpat.Les seccions en sèrie primes de controls i Cp NFRCS es van tractar amb hematoxilina i eosina per estudiar els canvis histopatològics.La tinció de tricrom de Masson es va utilitzar per detectar la formació de fibrilles de col·lagen.Els resultats obtinguts van ser estudiats a cegues pels patòlegs.
L'estabilitat de les mostres de Cp NFRCS es va estudiar a temperatura ambient (25 °C ± 2 °C/60% HR ± 5%) durant 12 mesos51.Cp NFRCS (decoloració de la superfície i creixement microbià) es va inspeccionar visualment i es va provar la resistència al desgast del plec i el BCT segons els mètodes anteriors descrits a la secció Materials i mètodes.
L'escalabilitat i la reproductibilitat de Cp NFRCS es va examinar preparant Cp NFRCS amb una mida de 15 × 15 cm2.A més, es van extirpar mostres de 30 mg (n = 5) de diverses fraccions Cp NFRCS i es va avaluar el BCT de les mostres estudiades tal com es va descriure anteriorment a la secció Mètodes.
Hem intentat desenvolupar diverses formes i estructures utilitzant composicions de Cp NFRCS per a diverses aplicacions biomèdiques.Aquestes formes o configuracions inclouen hisops cònics per a hemorràgies nasals, procediments dentals i hisops cilíndrics per a hemorràgies vaginals.
Tots els conjunts de dades s'expressen com a mitjana ± desviació estàndard i es van analitzar mitjançant ANOVA mitjançant Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, EUA) seguit de la prova de comparacions múltiples de Bonferroni (* p<0.05).
Tots els procediments realitzats en estudis humans estaven d'acord amb els estàndards de l'Institut i del National Research Council, així com la Declaració d'Hèlsinki 1964 i les seves esmenes posteriors, o estàndards ètics similars.Tots els participants van ser informats sobre les característiques de l'estudi i el seu caràcter voluntari.Les dades dels participants romanen confidencials un cop s'han recollit.El protocol experimental de TEG in vitro ha estat revisat i aprovat pel Comitè d'Ètica Institucional de Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Els voluntaris van signar el consentiment informat per recollir mostres de sang.
Tots els procediments realitzats en estudis amb animals es van dur a terme d'acord amb la Facultat de Medicina de Kastuba, Institut d'Educació Superior Manipal, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Tots els experiments amb animals dissenyats es van realitzar d'acord amb les directrius del Comitè per al Control i Supervisió de l'Experimentació Animal (CPCSEA).Tots els autors segueixen les directrius ARRIVE.
Es van analitzar els espectres FTIR de tots els NFRCS i es van comparar amb l'espectre de quitosà que es mostra a la figura 2A.Pics espectrals característics de quitosà (enregistrats) a 3437 cm-1 (estirament de OH i NH, solapament), 2945 i 2897 cm-1 (estirament de CH), 1660 cm-1 (tensió NH2), 1589 cm-1 (flexió N–H), 1157 cm-1 (estirament secundari O- cm--10), 1157 cm-10 (estirament secundari O- cm--10) yl), 993 cm-1 (estirament CO, Bo-OH) 52,53,54.La taula complementària S1 mostra els valors de l'espectre d'absorció FTIR NFRCS per a quitosà (reporter), quitosà pur, Cm, Ch i Cp.Els espectres FTIR de tots els NFRCS (Cm, Ch i Cp) van mostrar les mateixes bandes d'absorció característiques que el quitosà pur sense cap canvi significatiu (Fig. 2A).Els resultats FTIR van confirmar l'absència d'interaccions químiques o físiques entre els polímers utilitzats per desenvolupar el NFRCS, indicant que els polímers utilitzats són inerts.
Caracterització in vitro de Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS i Cs.(A) representa els espectres FTIR combinats de les composicions de quitosà i Cm NFRCS, Ch NFRCS i Cp NFRCS sota compressió.(B) a) Taxa de captació de sang sencera de NFRCS Cm, Ch, Cp i Cg (n = 3);Les mostres de Ct van mostrar una BAR més alta perquè el hisop de cotó té una eficiència d'absorció més alta;b) Sang després de l'absorció de sang Il·lustració de la mostra absorbida.Representació gràfica del BCT de la mostra de prova C (Cp NFRCS va tenir el millor BCT (15 s, n = 3)). Les dades de C, D, E i G es van mostrar com a mitjana ± SD, i les barres d'error representen SD, *** p <0, 0001. Les dades de C, D, E i G es van mostrar com a mitjana ± SD, i les barres d'error representen SD, *** p <0, 0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешноставлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешноставлены как среднее предностей прешностей прешностей on, ***p <0,0001. Les dades de C, D, E i G es presenten com a mitjana ± desviació estàndard, i les barres d'error representen la desviació estàndard, *** p <0, 0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p <0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p <0,0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрештносдне погрештносде погрештностестна е отклонение, ***p <0,0001. Les dades de C, D, E i G es mostren com a mitjana ± desviació estàndard, les barres d'error representen la desviació estàndard, *** p <0, 0001.