Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
La fertilitat dels ocells depèn de la seva capacitat per emmagatzemar prou esperma viable durant un període prolongat de temps als túbuls d'emmagatzematge d'esperma (SST).El mecanisme exacte pel qual els espermatozoides entren, resideixen i surten del SST continua sent controvertit.L'esperma de les gallines sharkasi mostrava una alta tendència a l'aglutinació, formant feixos filamentosos mòbils que contenien moltes cèl·lules.A causa de la dificultat d'observar la motilitat i el comportament dels espermatozoides en una trompa de Fal·lopi opaca, hem utilitzat un dispositiu microfluídic amb una secció transversal de microcanals similar a la dels espermatozoides per estudiar l'aglutinació i la motilitat dels espermatozoides.Aquest estudi analitza com es formen els paquets d'espermatozoides, com es mouen i el seu possible paper a l'hora d'ampliar la residència dels espermatozoides a la SST.Es va investigar la velocitat de l'esperma i el comportament reològic quan es va generar un flux de fluid dins d'un canal microfluídic per pressió hidrostàtica (taxa de cabal = 33 µm/s).Els espermatozoides tendeixen a nedar contra corrent (reologia positiva) i la velocitat del paquet d'espermatozoides es redueix significativament en comparació amb els espermatozoides únics.S'ha observat que els paquets d'esperma es mouen en espiral i augmenten de longitud i gruix a mesura que es recluten més espermatozoides únics. Es van observar feixos d'esperma apropant-se i adherint-se a les parets laterals dels canals microfluídics per evitar ser escombrats amb una velocitat de flux de fluid > 33 µm/s. Es van observar feixos d'esperma apropant-se i adherint-se a les parets laterals dels canals microfluídics per evitar ser escombrats amb una velocitat de flux de fluid > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенюкам стенюкам стенкам стенкам чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. S'ha observat que els feixos d'esperma s'apropen i s'adhereixen a les parets laterals dels canals microfluídics per evitar ser escombrats a velocitats de flux de fluid > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速流体流速在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 怉 怫 怟 s/s33 µm/s 扫过。 Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стендокрам стенконкам жмижаются чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. S'ha observat que els feixos d'esperma s'apropen i s'adhereixen a les parets laterals del canal microfluídic per evitar ser arrossegats pel flux de fluids a >33 µm/s.La microscòpia electrònica d'escaneig i transmissió va revelar que els feixos d'esperma estaven recolzats per abundant material dens.Les dades obtingudes demostren la mobilitat única dels espermatozoides de pollastre Sharkazi, així com la capacitat dels espermatozoides d'aglutinar i formar paquets mòbils, la qual cosa contribueix a una millor comprensió de l'emmagatzematge a llarg termini dels espermatozoides en SMT.
Per aconseguir la fecundació en humans i en la majoria dels animals, els espermatozoides i els òvuls han d'arribar al lloc de la fecundació en el moment adequat.Per tant, l'aparellament s'ha de produir abans o en el moment de l'ovulació.D'altra banda, alguns mamífers, com els gossos, així com les espècies no mamífers, com els insectes, els peixos, els rèptils i els ocells, emmagatzemen espermatozoides en els seus òrgans reproductors durant un període prolongat de temps fins que els seus ous estan preparats per a la fecundació (fertilització asíncrona 1 ).Els ocells són capaços de mantenir la viabilitat dels espermatozoides capaços de fecundar els ous durant 2-10 setmanes2.
Aquesta és una característica única que distingeix els ocells d'altres animals, ja que proporciona una alta probabilitat de fecundació després d'una única inseminació durant diverses setmanes sense aparellament i ovulació simultània.El principal òrgan d'emmagatzematge d'esperma, anomenat túbul d'emmagatzematge d'esperma (SST), es troba als plecs de la mucosa interna a la unió uterovaginal.Fins ara, els mecanismes pels quals els espermatozoides entren, resideixen i surten del banc d'esperma no s'entenen del tot.A partir d'estudis anteriors, s'han plantejat moltes hipòtesis, però cap d'elles ha estat confirmada.
Forman4 va plantejar la hipòtesi que els espermatozoides mantenen la seva residència a la cavitat SST mitjançant un moviment oscil·latori continu en contra de la direcció del flux de fluids a través dels canals de proteïnes situats a les cèl·lules epitelials SST (reologia).L'ATP s'esgota a causa de l'activitat flagel·lar constant necessària per mantenir els espermatozoides a la llum SST i la motilitat acaba disminuint fins que els espermatozoides es treuen del banc d'esperma mitjançant el flux de líquid i comencen un nou viatge per la trompa de Fal·lopi ascendent per fecundar l'esperma.Ou (Forman4).Aquest model d'emmagatzematge d'esperma es recolza en la detecció per immunocitoquímica de les aquaporines 2, 3 i 9 presents a les cèl·lules epitelials SST.Fins ara, falten estudis sobre la reologia del semen de pollastre i el seu paper en l'emmagatzematge de SST, la selecció d'esperma vaginal i la competència d'esperma.En les gallines, l'esperma entra a la vagina després de l'aparellament natural, però més del 80% dels espermatozoides són expulsats de la vagina poc després de l'aparellament.Això suggereix que la vagina és el lloc principal per a la selecció d'esperma en les aus.A més, s'ha informat que menys de l'1% dels espermatozoides fecundats a la vagina acaben en SST2.En la inseminació artificial de pollets a la vagina, el nombre d'espermatozoides que arriben a la SST tendeix a augmentar 24 hores després de la inseminació.Fins ara, el mecanisme de selecció d'esperma durant aquest procés no està clar, i la motilitat dels espermatozoides pot tenir un paper important en la captació d'esperma SST.A causa de les parets gruixudes i opaques de les trompes de Fal·lopi, és difícil controlar directament la motilitat dels espermatozoides a les trompes de Fal·lopi de les aus.Per tant, no tenim coneixements bàsics sobre com els espermatozoides passen a la SST després de la fecundació.
La reologia s'ha reconegut recentment com un factor important que controla el transport d'espermatozoides als genitals dels mamífers.A partir de la capacitat dels espermatozoides mòbils de migrar a contracorrent, Zaferani et al8 van utilitzar un sistema microfluídic de corra per aïllar passivament els espermatozoides mòbils de mostres de semen enquadernades.Aquest tipus de classificació de semen és essencial per al tractament mèdic de la infertilitat i la investigació clínica, i es prefereix als mètodes tradicionals que requereixen temps i mà d'obra i poden comprometre la morfologia i la integritat estructural de l'esperma.Tanmateix, fins ara, no s'han realitzat estudis sobre l'efecte de les secrecions dels òrgans genitals dels pollastres sobre la motilitat dels espermatozoides.
Independentment del mecanisme que manté l'esperma emmagatzemat a l'SST, molts investigadors han observat que els espermatozoides residents aglutinen cap a cap a l'SST de pollastres 9, 10, guatlles 2 i galls dindis 11 per formar paquets d'esperma aglutinats.Els autors suggereixen que hi ha un vincle entre aquesta aglutinació i l'emmagatzematge a llarg termini d'espermatozoides a la SST.
Tingari i Lake12 van informar d'una forta associació entre els espermatozoides a la glàndula receptora d'esperma del pollastre i van qüestionar si els espermatozoides aviaris s'aglutinen de la mateixa manera que els espermatozoides dels mamífers.Creuen que les connexions profundes entre espermatozoides en els conductes deferents poden ser degudes a l'estrès provocat per la presència d'un gran nombre d'espermatozoides en un espai reduït.
Quan s'avalua el comportament dels espermatozoides en portaobjectes de vidre penjats frescos, es poden observar signes transitoris d'aglutinació, especialment a les vores de les gotes de semen.No obstant això, l'aglutinació sovint es veia alterada per l'acció de rotació associada al moviment continu, la qual cosa explica la naturalesa transitòria d'aquest fenomen.Els investigadors també es van adonar que quan es va afegir el diluent al semen, van aparèixer agregats cel·lulars allargats "semblants a fil".
Els primers intents d'imitar un espermatozoide es van fer eliminant un fil prim d'una gota penjant, la qual cosa va donar lloc a una vesícula allargada semblant a un esperma que sobresortia de la gota de semen.Els espermatozoides es van alinear immediatament de manera paral·lela dins de la vesícula, però tota la unitat va desaparèixer ràpidament a causa de la limitació 3D.Per tant, per estudiar l'aglutinació dels espermatozoides, cal observar la motilitat i el comportament dels espermatozoides directament en túbuls d'emmagatzematge d'espermatozoides aïllats, cosa que és difícil d'aconseguir.Per tant, és necessari desenvolupar un instrument que imiti els espermatozoides per donar suport als estudis de la motilitat dels espermatozoides i el comportament d'aglutinació.Brillard et al13 van informar que la longitud mitjana dels túbuls d'emmagatzematge d'esperma en pollets adults és de 400 a 600 µm, però alguns SST poden arribar als 2000 µm.Mero i Ogasawara14 van dividir les glàndules seminíferes en túbuls d'emmagatzematge d'esperma engrandits i no engrandits, tots dos eren la mateixa longitud (~ 500 µm) i amplada del coll (~ 38 µm), però el diàmetre mitjà del lumen dels túbuls era de 56,6 i 56,6 µm.., respectivament 11,2 μm, respectivament.En l'estudi actual, hem utilitzat un dispositiu microfluídic amb una mida de canal de 200 µm × 20 µm (W × H), la secció transversal del qual és una mica propera a la del SST amplificat.A més, vam examinar la motilitat dels espermatozoides i el comportament d'aglutinació en el fluid que flueix, que és coherent amb la hipòtesi de Foreman que el líquid produït per les cèl·lules epitelials SST manté l'esperma a la llum en una direcció (reològica) a contracorrent.
L'objectiu d'aquest estudi va ser superar els problemes d'observació de la motilitat dels espermatozoides a la trompa de Fal·lopi i evitar les dificultats d'estudiar la reologia i el comportament dels espermatozoides en un entorn dinàmic.Es va utilitzar un dispositiu microfluídic que crea pressió hidrostàtica per simular la motilitat dels espermatozoides als genitals d'un pollastre.
Quan es va carregar una gota d'una mostra d'esperma diluïda (1:40) al dispositiu de microcanal, es van poder identificar dos tipus de motilitat de l'esperma (esperma aïllat i esperma lligat).A més, els espermatozoides tendien a nedar contra corrent (reologia positiva; vídeo 1, 2). Tot i que els paquets d'esperma tenien una velocitat menor que la dels espermatozoides solitaris (p < 0, 001), van augmentar el percentatge d'espermatozoides que mostraven reotaxi positiva (p < 0, 001; Taula 2). Tot i que els paquets d'esperma tenien una velocitat menor que la dels espermatozoides solitaris (p < 0, 001), van augmentar el percentatge d'espermatozoides que mostraven reotaxi positiva (p < 0, 001; Taula 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоих сперматозои в 0, ни зои в 0, ни ли процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Tot i que els paquets d'espermatozoides tenien una velocitat inferior a la dels espermatozoides únics (p < 0, 001), van augmentar el percentatge d'espermatozoides que mostraven reotaxi positiva (p < 0, 001; Taula 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示浾显示阁显示阁显的速度（p < 0,001），分比（p <0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显瀾 昳怏 昳怏 昳怏 昀分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,0001), нт сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Tot i que la velocitat dels paquets d'esperma va ser inferior a la dels espermatozoides únics (p < 0,001), van augmentar el percentatge d'espermatozoides amb reologia positiva (p < 0,001; Taula 2).La reologia positiva per a espermatozoides únics i tufs s'estima en aproximadament un 53% i un 85%, respectivament.
S'ha observat que els espermatozoides de les gallines sharkasi immediatament després de l'ejaculació formen paquets lineals, formats per desenes d'individus.Aquests flocs augmenten de llargada i gruix amb el temps i poden romandre in vitro durant diverses hores abans de dissipar-se (vídeo 3).Aquests feixos filamentosos tenen forma d'espermatozoides d'equidna que es formen a l'extrem de l'epidídim.S'ha trobat que el semen de gallina Sharkashi té una alta tendència a aglutinar-se i formar un paquet reticulat en menys d'un minut després de la recollida.Aquestes bigues són dinàmiques i poden enganxar-se a qualsevol paret propera o objectes estàtics.Encara que els feixos espermàtics redueixen la velocitat dels espermatozoides, és evident que macroscòpicament augmenten la seva linealitat.La longitud dels feixos varia en funció del nombre d'espermatozoides recollits en feixos.Es van aïllar dues parts del feix: la part inicial, que inclou el cap lliure de l'esperma aglutinat, i la part terminal, que inclou la cua i tot l'extrem distal de l'espermatozoide.Mitjançant una càmera d'alta velocitat (950 fps), es van observar caps lliures d'espermatozoides aglutinats a la part inicial del feix, responsables del moviment del feix pel seu moviment oscil·latori, arrossegant els restants al feix amb un moviment helicoïdal (Vídeo 4).Tanmateix, en els flocs llargs, s'ha observat que alguns caps d'esperma lliures s'adhereixen al cos i la part terminal del floc actuen com a paletes per ajudar a impulsar el floc.
Mentre que en un flux lent de líquid, els feixos d'esperma es mouen paral·lels entre si, però, comencen a superposar-se i s'enganxen a tot el que està quiet, per no ser arrossegats pel flux de corrent a mesura que augmenta la velocitat del flux.Els feixos es formen quan un grapat d'espermatozoides s'apropen entre si, comencen a moure's en sincronia i s'emboliquen els uns al voltant dels altres, i després s'enganxen a una substància enganxosa.Les figures 1 i 2 mostren com els espermatozoides s'acosten entre si, formant una unió a mesura que les cues s'emboliquen entre si.
Els investigadors van aplicar pressió hidrostàtica per crear un flux de fluid en un microcanal per estudiar la reologia dels espermatozoides.Es va utilitzar un microcanal amb una mida de 200 µm × 20 µm (W × H) i una longitud de 3, 6 µm.Utilitzeu microcanals entre recipients amb xeringues col·locades als extrems.S'utilitzava colorant alimentari per fer més visibles els canals.
Lliga els cables d'interconnexió i els accessoris a la paret.El vídeo es va fer amb un microscopi de contrast de fase.Amb cada imatge, es presenten imatges de cartografia i microscòpia de contrast de fase.(A) La connexió entre dos corrents resisteix el flux a causa del moviment helicoïdal (fletxa vermella).(B) La connexió entre el feix de tubs i la paret del canal (fletxes vermelles), alhora que es connecten a altres dos feixos (fletxes grogues).(C) Els paquets d'esperma al canal microfluídic comencen a connectar-se entre ells (fletxes vermelles), formant una malla de feixos d'esperma.(D) Formació d'una xarxa d'espermatozoides.
Quan es va carregar una gota d'esperma diluït al dispositiu microfluídic i es va crear un flux, es va observar que el feix d'esperma es movia en contra de la direcció del flux.Els paquets s'ajusten perfectament a les parets dels microcanals i els caps lliures de la part inicial dels paquets s'ajusten perfectament contra ells (vídeo 5).També s'enganxen a qualsevol partícula estacionària al seu pas, com ara restes, per resistir-se a ser arrossegats pel corrent.Amb el temps, aquests flocs es converteixen en filaments llargs que atrapen altres espermatozoides únics i flocs més curts (vídeo 6).A mesura que el flux comença a disminuir, llargues línies d'esperma comencen a formar una xarxa de línies d'esperma (Vídeo 7; Figura 2).
A alta velocitat de flux (V > 33 µm/s), els moviments en espiral dels fils s'incrementen com un intent d'atrapar molts paquets individuals que formen espermatozoides resisteixen millor la força de deriva del flux. A alta velocitat de flux (V > 33 µm/s), els moviments en espiral dels fils s'incrementen com un intent d'atrapar molts paquets individuals que formen espermatozoides resisteixen millor la força de deriva del flux. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, постонь мкапы ножество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дротивостоят дротивостоят дрелих пучки. A cabals elevats (V > 33 µm/s), els moviments helicoïdals de les cadenes augmenten a mesura que intenten atrapar molts espermatozoides individuals formant feixos que són més capaços de resistir la força de deriva del flux.在高流速(V > 33 µm/s) 时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束纹的螺旋运动增加地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形 成 束 形 成 束 形 成 束 玪 动 增加 ，更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в постопхтся отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейтока. A cabals elevats (V > 33 µm/s), el moviment helicoïdal dels filaments augmenta en un intent de capturar molts espermatozoides individuals que formen feixos per resistir millor les forces de deriva del flux.També van intentar connectar microcanals a les parets laterals.
Els feixos d'esperma es van identificar com a grups de caps d'esperma i cues arrissades mitjançant microscòpia de llum (LM).També s'han identificat paquets d'esperma amb diversos agregats com a caps retorçats i agregats flagel·lars, múltiples cues d'espermatozoides fusionades, caps d'espermatozoides units a una cua i caps d'espermatozoides amb nuclis doblegats com a nuclis múltiples fusionats.microscòpia electrònica de transmissió (TEM).La microscòpia electrònica d'escaneig (SEM) va mostrar que els paquets d'esperma eren agregats de caps d'espermatozoides enfundats i els agregats d'espermatozoides mostraven una xarxa adjunta de cues embolicades.
La morfologia i la ultraestructura dels espermatozoides, la formació de feixos d'espermatozoides es van estudiar mitjançant microscòpia lleugera (mitja secció), microscòpia electrònica d'escaneig (SEM) i microscòpia electrònica de transmissió (TEM), els frotis d'espermatozoides es van tenyir amb taronja d'acridina i es van examinar mitjançant microscòpia d'epifluorescència.
La tinció de frotis d'esperma amb taronja d'acridina (Fig. 3B) va mostrar que els caps dels espermatozoides estaven enganxats i coberts amb material secretor, la qual cosa va provocar la formació de grans filets (Fig. 3D).Els feixos d'esperma constaven d'agregats d'esperma amb una xarxa de cues unides (Fig. 4A-C).Els feixos d'esperma estan formats per les cues de molts espermatozoides enganxats (Fig. 4D).Els secrets (Fig. 4E,F) cobrien els caps dels feixos d'espermatozoides.
Formació del paquet d'espermatozoides Mitjançant la microscòpia de contrast de fase i els frotis d'esperma tenyits amb taronja d'acridina, es va demostrar que els caps dels espermatozoides s'enganxen.(A) La formació primerenca del floc espermàtic comença amb un espermatozoide (cercle blanc) i tres espermatozoides (cercle groc), amb l'espiral que comença a la cua i acaba al cap.(B) Fotomicrografia d'un frotis d'esperma tenyit amb taronja d'acridina que mostra caps d'esperma adherits (fletxes).La descàrrega cobreix el(s) cap(s).Ampliació × 1000. (C) Desenvolupament d'un feix gran transportat per flux en un canal microfluídic (utilitzant una càmera d'alta velocitat a 950 fps).(D) Micrografia d'un frotis d'esperma tenyit amb taronja d'acridina que mostra grans fletxes (fletxes).Ampliació: ×200.
Micrografia electrònica d'escaneig d'un feix d'esperma i un frotis d'esperma tenyits amb taronja d'acridina.(A, B, D, E) són micrografies digitals d'electrons d'escaneig en color d'espermatozoides, i C i F són micrografies de frotis d'esperma tenyits de taronja d'acridina que mostren l'adhesió de múltiples espermatozoides que embolcallen la xarxa caudal.(AC) Els agregats d'esperma es mostren com una xarxa de cues unides (fletxes).(D) Adhesió de diversos espermatozoides (amb substància adhesiva, contorn rosa, fletxa) que envolten la cua.(E i F) Agregats del cap d'esperma (punters) coberts amb material adhesiu (punters).Els espermatozoides van formar feixos amb diverses estructures semblants a vòrtex (F).(C) × 400 i (F) × 200 augments.
Mitjançant la microscòpia electrònica de transmissió, vam trobar que els paquets d'espermatozoides tenien cues unides (Fig. 6A, C), caps units a cues (Fig. 6B) o caps units a cues (Fig. 6D).Els caps dels espermatozoides del feix són corbats, presentant en secció dues regions nuclears (Fig. 6D).En el paquet d'incisió, els espermatozoides tenien un cap torçat amb dues regions nuclears i múltiples regions flagel·lars (Fig. 5A).
Micrografia digital d'electrons en color que mostra les cues de connexió del paquet d'espermatozoides i el material aglutinant que connecta els caps dels espermatozoides.(A) Cua adjunta d'un gran nombre d'espermatozoides.Observeu com es veu la cua tant en projecció vertical (fletxa) com en horitzontal (fletxa).(B) El cap (fletxa) de l'esperma està connectat a la cua (fletxa).(C) S'adjunten diverses cues d'esperma (fletxes).(D) El material d'aglutinació (AS, blau) connecta quatre caps d'esperma (morat).
La microscòpia electrònica d'escaneig es va utilitzar per detectar caps d'esperma en feixos d'esperma coberts de secrecions o membranes (figura 6B), cosa que indica que els feixos d'esperma estaven ancorats per material extracel·lular.El material aglutinat es va concentrar al cap de l'esperma (conjunt semblant al cap de medusa; Fig. 5B) i es va expandir distalment, donant un aspecte groc brillant sota microscòpia de fluorescència quan es tenyia amb taronja d'acridina (Fig. 6C).Aquesta substància és clarament visible sota un microscopi d'escaneig i es considera un aglutinant.Les seccions semiprimes (Fig. 5C) i els frotis d'esperma tenyits amb taronja d'acridina mostraven paquets d'esperma que contenien caps densament empaquetats i cues arrissades (Fig. 5D).
Diverses microfotografies que mostren l'agregació de caps d'esperma i cues plegades mitjançant diversos mètodes.(A) Micrografia electrònica de transmissió de color digital de secció transversal d'un paquet d'espermatozoides que mostra un cap d'esperma enrotllat amb un nucli de dues parts (blau) i diverses parts flagel·lars (verd).(B) Micrografia electrònica digital d'escaneig en color que mostra un cúmul de caps d'esperma semblants a meduses (fletxes) que semblen estar coberts.(C) Secció semifina que mostra caps d'esperma agregats (fletxes) i cues arrissades (fletxes).(D) Micrografia d'un frotis d'esperma tenyit amb taronja d'acridina que mostra agregats de caps d'esperma (fletxes) i cues adherides arrissades (fletxes).Tingueu en compte que una substància enganxosa (S) cobreix el cap de l'espermatozoide.(D) × 1000 augments.
Mitjançant la microscòpia electrònica de transmissió (Fig. 7A), també es va observar que els caps dels espermatozoides estaven retorçats i els nuclis tenien una forma d'espiral, tal com van confirmar els frotis d'esperma tenyits amb taronja d'acridina i examinats mitjançant microscòpia de fluorescència (Fig. 7B).
(A) Micrografia electrònica de transmissió de color digital i (B) Frotis d'esperma tenyit de taronja d'acridina que mostra caps enrotllats i unió de caps i cues d'esperma (fletxes).(B) augment de 1000.
Una troballa interessant és que l'esperma de Sharkazi s'agrega per formar paquets filamentosos mòbils.Les propietats d'aquests feixos ens permeten entendre el seu possible paper en l'absorció i emmagatzematge d'espermatozoides a la SST.
Després de l'aparellament, els espermatozoides entren a la vagina i se sotmeten a un procés de selecció intens, el que resulta en que només un nombre limitat d'espermatozoides entren a la SST15,16.Fins ara, els mecanismes pels quals els espermatozoides entren i surten de la SST no estan clars.En les aus de corral, els espermatozoides s'emmagatzemen a l'SST durant un període prolongat de 2 a 10 setmanes, depenent de l'espècie6.Hi ha polèmica sobre l'estat del semen durant l'emmagatzematge a la SST.Estan en moviment o en repòs?En altres paraules, com mantenen els espermatozoides la seva posició a la SST durant tant de temps?
Forman4 va suggerir que la residència i l'expulsió de SST es podrien explicar en termes de motilitat dels espermatozoides.Els autors plantegen la hipòtesi que els espermatozoides mantenen la seva posició nedant contra el flux de fluid creat per l'epiteli SST i que els espermatozoides són expulsats de l'SST quan la seva velocitat cau per sota del punt en què comencen a moure's cap enrere per falta d'energia.Zaniboni5 va confirmar la presència d'aquaporines 2, 3 i 9 a la porció apical de les cèl·lules epitelials SST, que poden donar suport indirectament al model d'emmagatzematge d'esperma de Foreman.En l'estudi actual, hem trobat que gairebé la meitat dels espermatozoides de Sharkashi mostren reologia positiva en el fluid que flueix, i que els paquets d'espermatozoides aglutinats augmenten el nombre d'espermatozoides que mostren reologia positiva, tot i que l'aglutinació els frena.No s'entén del tot com els espermatozoides viatgen per la trompa de Fal·lopi de l'ocell fins al lloc de la fecundació.En els mamífers, el líquid fol·licular atrau els espermatozoides.Tanmateix, es creu que els quimioatractius dirigeixen els espermatozoides a apropar-se a llargues distàncies7.Per tant, altres mecanismes són els responsables del transport dels espermatozoides.S'ha informat que la capacitat dels espermatozoides d'orientar-se i fluir contra el líquid de les trompes de Fal·lopi alliberat després de l'aparellament és un factor important a l'hora d'orientar els espermatozoides dels ratolins.Parker 17 va suggerir que els espermatozoides travessen els oviductes nedant contra el corrent ciliar en ocells i rèptils.Tot i que no s'ha demostrat experimentalment en ocells, Adolphi18 va ser el primer a trobar que l'esperma avià dóna resultats positius quan es crea una fina capa de líquid entre un cobreobjectes i un portaobjectes amb una tira de paper de filtre.Reologia.Hino i Yanagimachi [19] van col·locar un complex ovari-tubular-uterí de ratolí en un anell de perfusió i van injectar 1 µl de tinta a l'istme per visualitzar el flux de líquid a les trompes de Fal·lopi.Van notar un moviment molt actiu de contracció i relaxació a la trompa de Fal·lopi, en el qual totes les boles de tinta es desplaçaven constantment cap a l'ampolla de la trompa de Fal·lopi.Els autors subratllen la importància del flux de líquid tubari des de les trompes de Fal·lopi inferiors a les superiors per a l'elevació i la fecundació dels espermatozoides.Brillard20 va informar que en pollastres i galls dindis, els espermatozoides migren per moviment actiu des de l'entrada vaginal, on s'emmagatzemen, fins a la unió utero-vaginal, on s'emmagatzemen.Tanmateix, aquest moviment no és necessari entre la unió uterovaginal i l'infundíbul perquè els espermatozoides són transportats per desplaçament passiu.Coneixent aquestes recomanacions prèvies i els resultats obtinguts en l'estudi actual, es pot suposar que la capacitat dels espermatozoides per moure's aigües amunt (reologia) és una de les propietats en què es basa el procés de selecció.Això determina el pas dels espermatozoides per la vagina i la seva entrada al CCT per a l'emmagatzematge.Tal com va suggerir Forman4, això també pot facilitar el procés d'entrada dels espermatozoides al SST i al seu hàbitat durant un període de temps i després sortir quan la seva velocitat comença a disminuir.
D'altra banda, Matsuzaki i Sasanami 21 van suggerir que els espermatozoides aviaris experimenten canvis de motilitat de la latència a la motilitat en els aparells reproductors masculins i femenins.S'ha proposat la inhibició de la motilitat dels espermatozoides residents a l'SST per explicar el llarg temps d'emmagatzematge dels espermatozoides i després el rejoveniment després de sortir de l'SST.En condicions hipòxiques, Matsuzaki et al.1 va informar d'una alta producció i alliberament de lactat a la SST, que pot provocar la inhibició de la motilitat dels espermatozoides residents.En aquest cas, la importància de la reologia espermàtica es reflecteix en la selecció i absorció dels espermatozoides, i no en el seu emmagatzematge.
El patró d'aglutinació dels espermatozoides es considera una explicació plausible per al llarg període d'emmagatzematge d'esperma a la SST, ja que aquest és un patró comú de retenció d'esperma a les aus de corral2,22,23.Bakst et al.2 va observar que la majoria d'espermatozoides s'adherien entre si, formant agregats fasciculars, i rarament es trobaven espermatozoides únics al CCM de guatlla.D'altra banda, Wen et al.24 van observar més espermatozoides dispersos i menys flocs d'espermatozoides al lumen SST en pollastres.A partir d'aquestes observacions, es pot suposar que la propensió a l'aglutinació dels espermatozoides difereix entre les aus i entre els espermatozoides d'un mateix ejaculat.A més, Van Krey et al.9 va suggerir que la dissociació aleatòria d'espermatozoides aglutinats és responsable de la penetració gradual d'espermatozoides a la llum de la trompa de Fal·lopi.Segons aquesta hipòtesi, primer els espermatozoides amb menor capacitat d'aglutinació haurien de ser expulsats de la SST.En aquest context, la capacitat dels espermatozoides d'aglutinar pot ser un factor que influeixi en el resultat de la competència espermàtica en ocells bruts.A més, com més temps es dissoci l'espermatozoide aglutinat, més temps es manté la fertilitat.
Tot i que en diversos estudis s'ha observat l'agregació i l'agregació en paquets d'espermatozoides2,22,24, no s'han descrit en detall a causa de la complexitat de la seva observació cinemàtica dins de l'SST.S'han fet diversos intents d'estudiar l'aglutinació espermàtica in vitro.Es va observar una agregació extensa però transitòria quan es va treure el cable prim de la gota de llavors penjant.Això porta al fet que una bombolla allargada sobresurt de la gota, imitant la glàndula seminal.A causa de les limitacions en 3D i els temps d'assecat per degoteig curts, tot el bloc va caure ràpidament en mal estat9.En l'estudi actual, utilitzant pollastres Sharkashi i xips microfluídics, vam poder descriure com es formen aquests flocs i com es mouen.Els feixos d'esperma es van formar immediatament després de la recollida de semen i es va trobar que es mouen en espiral, mostrant una reologia positiva quan estan presents al flux.A més, quan es veuen macroscòpicament, s'ha observat que els paquets d'esperma augmenten la linealitat de la motilitat en comparació amb els espermatozoides aïllats.Això suggereix que l'aglutinació d'esperma es pot produir abans de la penetració de la SST i que la producció d'esperma no es limita a una petita àrea a causa de l'estrès, com s'havia suggerit anteriorment (Tingari i Lake12).Durant la formació del floc, els espermatozoides neden en sincronia fins que formen una unió, després les seves cues s'emboliquen entre si i el cap de l'espermatozoide roman lliure, però la cua i la part distal de l'espermatozoide s'enganxen amb una substància enganxosa.Per tant, el cap lliure del lligament és el responsable del moviment, arrossegant la resta del lligament.La microscòpia electrònica d'escaneig dels paquets d'espermatozoides va mostrar caps d'esperma adherits coberts amb una gran quantitat de material enganxós, cosa que suggereix que els caps d'esperma estaven units en paquets de repòs, cosa que podria haver-se produït després d'arribar al lloc d'emmagatzematge (SST).
Quan un frotis d'esperma es tenyeix amb taronja d'acridina, el material adhesiu extracel·lular al voltant de les cèl·lules espermàtiques es pot veure amb un microscopi fluorescent.Aquesta substància permet que els feixos d'esperma s'adhereixin i s'adhereixin a les superfícies o partícules circumdants, de manera que no es desplacen amb el flux circumdant.Així, les nostres observacions mostren el paper de l'adhesió dels espermatozoides en forma de paquets mòbils.La seva capacitat de nedar contra el corrent i enganxar-se a les superfícies properes permet que els espermatozoides romanguin més temps a la SST.
Rothschild25 va utilitzar una càmera d'hemocitometria per estudiar la distribució flotant del semen boví en una gota de suspensió, fent microfotografies a través d'una càmera amb l'eix òptic tant vertical com horitzontal del microscopi.Els resultats van mostrar que els espermatozoides estaven atrets per la superfície de la cambra.Els autors suggereixen que hi pot haver interaccions hidrodinàmiques entre l'esperma i la superfície.Tenint això en compte, juntament amb la capacitat del semen de pollastre de Sharkashi per formar flocs enganxosos, pot augmentar la probabilitat que el semen s'adhereixi a la paret SST i s'emmagatzemi durant llargs períodes de temps.
Bccetti i Afzeliu26 van informar que el glicocàlix dels espermatozoides és necessari per al reconeixement i l'aglutinació dels gàmetes.Forman10 va observar que la hidròlisi dels enllaços α-glicosídics en els recobriments de glicoproteïna-glicolípid mitjançant el tractament de semen avià amb neuraminidasa va donar lloc a una fertilitat reduïda sense afectar la motilitat dels espermatozoides.Els autors suggereixen que l'efecte de la neuraminidasa sobre el glicocàlix afecta el segrest d'esperma a la unió utero-vaginal, reduint així la fertilitat.Les seves observacions no poden ignorar la possibilitat que el tractament amb neuraminidasa pugui reduir el reconeixement d'espermatozoides i oòcits.Forman i Engel10 van trobar que la fertilitat es reduïa quan les gallines eren inseminades per via intravaginal amb semen tractat amb neuraminidasa.Tanmateix, la FIV amb espermatozoides tractats amb neuraminidasa no va afectar la fertilitat en comparació amb els pollastres control.Els autors van concloure que els canvis en el recobriment de glicoproteïna-glicolípid al voltant de la membrana espermàtica reduïen la capacitat dels espermatozoides de fecundar perjudicant el segrest d'esperma a la unió útero-vaginal, que al seu torn va augmentar la pèrdua d'esperma a causa de la velocitat de la unió utero-vaginal, però no afecta el reconeixement d'esperma i òvuls.
En els galls dindis, Bakst i Bauchan 11 van trobar petites vesícules i fragments de membrana a la llum del SST i van observar que alguns d'aquests grànuls s'havien fusionat amb la membrana espermàtica.Els autors suggereixen que aquestes relacions poden contribuir a l'emmagatzematge a llarg termini d'espermatozoides en SST.Tanmateix, els investigadors no van especificar la font d'aquestes partícules, si són secretades per cèl·lules epitelials CCT, produïdes i secretades pel sistema reproductor masculí o produïdes pel propi espermatozoide.A més, aquestes partícules són les responsables de l'aglutinació.Grützner et al27 van informar que les cèl·lules epitelials epididimals produeixen i segreguen una proteïna específica que es requereix per a la formació de tractes seminals d'un sol por.Els autors també informen que la dispersió d'aquests paquets depèn de la interacció de les proteïnes epidídimàries.Nixon et al28 van trobar que els annexos secreten una proteïna, l'osteonectina àcida rica en cisteïna;SPARC participa en la formació d'espermatozoides en equidnes de bec curt i ornitorincs.La dispersió d'aquests feixos està associada a la pèrdua d'aquesta proteïna.
En l'estudi actual, l'anàlisi ultraestructural mitjançant microscòpia electrònica va demostrar que els espermatozoides s'adhereixen a una gran quantitat de material dens.Es creu que aquestes substàncies són les responsables de l'aglutinació que es condensa entre i al voltant dels caps adherents, però a concentracions més baixes a la regió de la cua.Suposem que aquesta substància aglutinant s'excreta de l'aparell reproductor masculí (epidídim o conductes deferents) juntament amb el semen, ja que sovint observem que el semen es separa de la limfa i del plasma seminal durant l'ejaculació.S'ha informat que a mesura que els espermatozoides aviaris passen per l'epidídim i els conductes deferents, experimenten canvis relacionats amb la maduració que donen suport a la seva capacitat d'unir proteïnes i adquirir glicoproteïnes associades al lema plasmàtic.La persistència d'aquestes proteïnes a les membranes espermàtiques residents a la SST suggereix que aquestes proteïnes poden influir en l'adquisició de l'estabilitat de la membrana espermàtica 30 i determinar la seva fertilitat 31 .Ahammad et al32 van informar que els espermatozoides obtinguts de diverses parts del sistema reproductor masculí (des dels testicles fins al conducte deferent distal) van mostrar un augment progressiu de la viabilitat en condicions d'emmagatzematge de líquids, independentment de la temperatura d'emmagatzematge, i la viabilitat en pollastres també augmenta a les trompes de Fal·lopi després de la inseminació artificial.
Els espermatozoides de pollastre Sharkashi tenen característiques i funcions diferents a les d'altres espècies com ara equidnes, ornitorincs, ratolins de fusta, rates de cérvol i conillets d'índies.En els pollastres sharkasi, la formació d'espermatozoides va reduir la seva velocitat de natació en comparació amb els espermatozoides únics.Tanmateix, aquests paquets van augmentar el percentatge d'espermatozoides reològicament positius i van augmentar la capacitat dels espermatozoides per estabilitzar-se en un entorn dinàmic.Així, els nostres resultats confirmen el suggeriment anterior que l'aglutinació d'esperma en SST està associada amb l'emmagatzematge d'esperma a llarg termini.També plantegem la hipòtesi que la propensió dels espermatozoides a formar flocs pot controlar la taxa de pèrdua d'esperma en SST, que pot alterar el resultat de la competència espermàtica.Segons aquesta suposició, els espermatozoides amb capacitat d'aglutinació baixa alliberen primer SST, mentre que els espermatozoides amb capacitat d'aglutinació alta produeixen la major part de la descendència.La formació d'espermatozoides d'un sol porus és beneficiosa i afecta la relació pares-fills, però utilitza un mecanisme diferent.En els equidnes i els ornitorincs, els espermatozoides es disposen paral·lels entre si per augmentar la velocitat d'avançament del feix.Els paquets d'equidnes es mouen unes tres vegades més ràpid que els espermatozoides únics.Es creu que la formació d'aquests espermatozoides en els equidnes és una adaptació evolutiva per mantenir el domini, ja que les femelles són promiscues i solen aparellar-se amb diversos mascles.Per tant, els espermatozoides de diferents ejaculats competeixen ferotgement per la fecundació de l'òvul.
Els espermatozoides aglutinats de pollastres sharkasi són fàcils de visualitzar mitjançant la microscòpia de contrast de fase, que es considera avantatjosa perquè permet un estudi fàcil del comportament dels espermatozoides in vitro.El mecanisme pel qual la formació d'espermatozoides afavoreix la reproducció en pollastres sharkasi també és diferent del que s'observa en alguns mamífers placentaris que representen un comportament d'esperma cooperatiu com els ratolins de fusta, on alguns espermatozoides arriben als ous, ajudant a altres individus relacionats a arribar i danyar els seus ous.per demostrar-te.comportament altruista.Autofecundació 34. Un altre exemple de comportament cooperatiu en espermatozoides es va trobar en ratolins de cérvol, on els espermatozoides van ser capaços d'identificar-se i combinar-se amb els espermatozoides més relacionats genèticament i formar grups cooperatius per augmentar la seva velocitat en comparació amb els espermatozoides no relacionats35.
Els resultats obtinguts en aquest estudi no contradiuen la teoria de Foman de l'emmagatzematge a llarg termini d'espermatozoides en SWS.Els investigadors informen que els espermatozoides continuen movent-se en el flux de cèl·lules epitelials que recobreixen la SST durant un període de temps prolongat i, després d'un cert període de temps, els dipòsits d'energia dels espermatozoides s'esgoten, donant lloc a una disminució de la velocitat, que permet l'expulsió de substàncies de petit pes molecular.energia dels espermatozoides amb el flux de líquid del lumen de la SST La cavitat de la trompa de Fal·lopi.En l'estudi actual, vam observar que la meitat dels espermatozoides individuals mostraven la capacitat de nedar contra els fluids que flueixen, i la seva adhesió al paquet augmentava la seva capacitat de mostrar reologia positiva.A més, les nostres dades són coherents amb les de Matsuzaki et al.1 que va informar que l'augment de la secreció de lactat en SST pot inhibir la motilitat dels espermatozoides residents.Tanmateix, els nostres resultats descriuen la formació de lligaments mòbils dels espermatozoides i el seu comportament reològic en presència d'un entorn dinàmic dins d'un microcanal per intentar dilucidar el seu comportament en SST.La investigació futura es pot centrar a determinar la composició química i l'origen de l'agent aglutinant, cosa que sens dubte ajudarà els investigadors a desenvolupar noves maneres d'emmagatzemar semen líquid i augmentar la durada de la fertilitat.
Es van seleccionar 15 sharkasi mascles de coll nu de 30 setmanes (dominant homozigot; Na Na) com a donants d'esperma a l'estudi.Els ocells van ser criats a la granja avícola de recerca de la Facultat d'Agricultura, Universitat d'Ashit, governació d'Ashit, Egipte.Els ocells van ser allotjats en gàbies individuals (30 x 40 x 40 cm), sotmesos a un programa de llum (16 hores de llum i 8 hores de foscor) i alimentats amb una dieta que contenia 160 g de proteïna bruta, 2800 kcal d'energia metabolizable, 35 g de calci cadascuna.5 grams de fòsfor disponible per quilogram de dieta.
Segons les dades 36, 37, es va recollir semen dels mascles mitjançant massatge abdominal.Es van recollir un total de 45 mostres de semen de 15 homes durant 3 dies.El semen (n = 15/dia) es va diluir immediatament 1:1 (v:v) amb Belsville Poultry Semen Diluent, que conté difosfat de potassi (1,27 g), glutamat monosòdic monohidrat (0,867 g), fructosa (0,5 d) de sodi anhidre.acetat (0,43 g), tris(hidroximetil)aminometà (0,195 g), citrat de potassi monohidrat (0,064 g), monofosfat de potassi (0,065 g), clorur de magnesi (0,034 g) i H2O (100 ml), pH = 7, 5, osmolaritat m333O8m33kg.Les mostres de semen diluït es van examinar primer amb un microscopi de llum per garantir una bona qualitat del semen (humitat) i després es van emmagatzemar en un bany maria a 37 ° C fins al seu ús durant mitja hora després de la recollida.
La cinemàtica i la reologia dels espermatozoides es descriuen mitjançant un sistema de dispositius microfluídics.Les mostres de semen es van diluir encara més a 1:40 a Beltsville Avian Semen Diluent, es van carregar en un dispositiu microfluídic (vegeu a continuació) i es van determinar els paràmetres cinètics mitjançant un sistema d'anàlisi de semen computaritzat (CASA) desenvolupat prèviament per a la caracterització de microfluídica.sobre la mobilitat dels espermatozoides en medis líquids (Departament d'Enginyeria Mecànica, Facultat d'Enginyeria, Universitat d'Assiut, Egipte).El connector es pot descarregar a: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39.Es van mesurar la velocitat de la corba (VCL, μm/s), la velocitat lineal (VSL, μm/s) i la velocitat mitjana de la trajectòria (VAP, μm/s).Els vídeos d'espermatozoides es van fer mitjançant un microscopi de contrast de fase Optika XDS-3 invertit (amb objectiu 40x) connectat a una càmera Tucson ISH1000 a 30 fps durant 3 s.Utilitzeu el programari CASA per estudiar almenys tres àrees i 500 trajectòries d'esperma per mostra.El vídeo gravat es va processar amb un CASA casolà.La definició de motilitat al connector CASA es basa en la velocitat de natació de l'esperma en comparació amb el cabal, i no inclou altres paràmetres com el moviment de costat a costat, ja que s'ha trobat que és més fiable en el flux de fluids.El moviment reològic es descriu com el moviment dels espermatozoides en contra de la direcció del flux de fluids.Els espermatozoides amb propietats reològiques es van dividir pel nombre d'espermatozoides mòbils;Els espermatozoides que estaven en repòs i els espermatozoides en moviment convectiu van ser exclosos del recompte.
Tots els productes químics utilitzats es van obtenir d'Elgomhoria Pharmaceuticals (El Caire, Egipte), tret que s'indiqui el contrari.El dispositiu es va fabricar tal com es descriu per El-sherry et al.40 amb algunes modificacions.Els materials utilitzats per fabricar els microcanals incloïen plaques de vidre (Howard Glass, Worcester, MA), resistència negativa SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), alcohol de diacetona (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanya) i poliacetona.-184, Dow Corning, Midland, Michigan).Els microcanals es fabriquen mitjançant litografia suau.En primer lloc, es va imprimir una màscara protectora transparent amb el disseny de microcanal desitjat en una impressora d'alta resolució (Prismatic, El Caire, Egipte i Pacific Arts and Design, Markham, ON).Els mestres es van fer utilitzant plaques de vidre com a substrats.Les plaques es van netejar amb acetona, isopropanol i aigua desionitzada i després es van recobrir amb una capa de 20 µm de SU8-25 mitjançant un recobriment per centrifugació (3000 rpm, 1 min).Les capes SU-8 es van assecar suaument (65 ° C, 2 min i 95 ° C, 10 min) i es van exposar a la radiació UV durant 50 s.Enfornar després de l'exposició a 65 ° C i 95 ° C durant 1 min i 4 min per reticular les capes SU-8 exposades, seguit del desenvolupament en alcohol de diacetona durant 6,5 min.Enforna les neules amb força (200 ° C durant 15 min) per solidificar encara més la capa SU-8.
El PDMS es va preparar barrejant el monòmer i l'enduridor en una proporció de pes de 10:1, després es va desgasificar en un dessecador al buit i es va abocar al marc principal SU-8.El PDMS es va curar en un forn (120 ° C, 30 min), després es van tallar els canals, es van separar del mestre i es van perforar per permetre que els tubs es connectessin a l'entrada i sortida del microcanal.Finalment, els microcanals PDMS es van connectar permanentment a diapositives de microscopi mitjançant un processador de corona portàtil (Electro-Technic Products, Chicago, IL) tal com es descriu en un altre lloc.El microcanal utilitzat en aquest estudi mesura 200 µm × 20 µm (W × H) i fa 3,6 cm de llarg.
El flux de fluid induït per la pressió hidrostàtica a l'interior del microcanal s'aconsegueix mantenint el nivell de fluid al dipòsit d'entrada per sobre de la diferència d'altura Δh39 al dipòsit de sortida (Fig. 1).
on f és el coeficient de fricció, definit com f = C/Re per al flux laminar en un canal rectangular, on C és una constant depenent de la relació d'aspecte del canal, L és la longitud del microcanal, Vav és la velocitat mitjana dins del microcanal, Dh és el diàmetre hidràulic del canal, g - acceleració de la gravetat.Amb aquesta equació, la velocitat mitjana del canal es pot calcular mitjançant l'equació següent: