Gràcies per visitar Nature.com. Esteu utilitzant una versió del navegador amb compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). A més, per garantir una assistència contínua, mostrem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Recentment, s'ha desenvolupat una plataforma antimicrobiana lliure de productes químics basada en la nanotecnologia que utilitza nanoestructures d'aigua artificial (EWNS). Les EWNS tenen una càrrega superficial elevada i són riques en espècies reactives d'oxigen (ROS) que poden interactuar amb diversos microorganismes i inactivar-los, inclosos els patògens transmesos pels aliments. Aquí es demostra que les seves propietats durant la síntesi es poden ajustar i optimitzar per millorar encara més el seu potencial antibacterià. La plataforma de laboratori EWNS va ser dissenyada per ajustar les propietats de les EWNS canviant els paràmetres de síntesi. La caracterització de les propietats de les EWNS (càrrega, mida i contingut de ROS) es va realitzar mitjançant mètodes analítics moderns. A més, es van inocular microorganismes alimentaris com ara Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum i Saccharomyces cerevisiae a la superfície de tomàquets de raïm orgànics per avaluar el seu potencial d'inactivació microbiana. Els resultats presentats aquí demostren que les propietats de les EWNS es poden ajustar durant la síntesi, la qual cosa resulta en un augment exponencial de l'eficiència d'inactivació. En particular, la càrrega superficial va augmentar per un factor de quatre, i el contingut de ROS va augmentar. La taxa d'eliminació microbiana depenia dels microbis i oscil·lava entre 1,0 i 3,8 log després de 45 minuts d'exposició a una dosi d'aerosol de 40.000 #/cm3 EWNS.
La contaminació microbiana és la principal causa de les malalties transmeses pels aliments causades per la ingestió de patògens o les seves toxines. Les malalties transmeses pels aliments representen uns 76 milions de malalties, 325.000 hospitalitzacions i 5.000 morts cada any només als Estats Units1. A més, el Departament d'Agricultura dels Estats Units (USDA) estima que l'augment del consum de productes frescos és responsable del 48% de totes les malalties transmeses pels aliments notificades als Estats Units2. El cost de les malalties i morts per patògens transmesos pels aliments als Estats Units és molt elevat, estimat pels Centres per al Control i la Prevenció de Malalties (CDC) en més de 15.600 milions de dòlars anuals3.
Actualment, les intervencions antimicrobianes químiques4, radioactives5 i tèrmiques6 per garantir la seguretat alimentària s'implementen principalment en punts crítics de control (PCC) limitats de la cadena de producció (normalment després de la collita i/o durant l'envasament) en lloc d'implementar-se contínuament de manera que els productes frescos estiguin subjectes a contaminació creuada7. Es necessiten intervencions antimicrobianes per controlar millor les malalties transmeses pels aliments i el deteriorament dels aliments i tenen el potencial de ser aplicades en tot el continu de la granja a la taula. Menys impacte i cost.
Recentment s'ha desenvolupat una plataforma antimicrobiana lliure de productes químics basada en nanotecnologia per inactivar bacteris en superfícies i a l'aire mitjançant nanoestructures d'aigua artificial (EWNS). Per a la síntesi d'EVNS, es van utilitzar dos processos paral·lels: electroaspersió i ionització d'aigua (Fig. 1a). Anteriorment s'ha demostrat que els EWNS tenen un conjunt únic de propietats físiques i biològiques8,9,10. Els EWNS tenen una mitjana de 10 electrons per estructura i una mida nanomètrica mitjana de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. A més, la ressonància d'espín electrònic (ESR) va mostrar que els EWNS contenen una gran quantitat d'espècies reactives d'oxigen (ROS), principalment radicals hidroxil (OH•) i superòxid (O2-) (Fig. 1c)8. Els EWNS romanien a l'aire durant molt de temps i podien xocar amb microbis suspesos a l'aire i presents a les superfícies, lliurant la seva càrrega útil ROS i causant la inactivació microbiana (Fig. 1d). Aquests estudis anteriors també van mostrar que les EWNS poden interactuar amb diversos bacteris gramnegatius i grampositius d'importància per a la salut pública, inclosos els micobacteris, i inactivar-los en superfícies i a l'aire8,9. La microscòpia electrònica de transmissió va mostrar que la inactivació va ser causada per la disrupció de la membrana cel·lular. A més, els estudis d'inhalació aguda han demostrat que les dosis altes d'EWNS no causen danys pulmonars ni inflamació8.
(a) L'electropolvorització es produeix quan s'aplica un alt voltatge entre un capil·lar que conté líquid i un contraelèctrode. (b) L'aplicació d'alt voltatge provoca dos fenòmens diferents: (i) electropolvorització d'aigua i (ii) generació d'espècies reactives d'oxigen (ions) atrapades a les EWNS. (c) L'estructura única de les EWNS. (d) Les EWNS són altament mòbils a causa de la seva naturalesa a nanoescala i poden interactuar amb patògens transportats per l'aire.
Recentment també s'ha demostrat la capacitat de la plataforma antimicrobiana EWNS per inactivar microorganismes transmesos pels aliments a la superfície d'aliments frescos. També s'ha demostrat que la càrrega superficial d'EWNS es pot utilitzar en combinació amb un camp elèctric per a un subministrament dirigit. Més important encara, es va observar un resultat inicial prometedor d'aproximadament 1,4 log de reducció de l'activitat del tomàquet orgànic contra diversos microorganismes alimentaris com ara E. coli i Listeria en 90 minuts d'exposició a EWNS a una concentració d'aproximadament 50.000#/cm311. A més, les proves preliminars d'avaluació organolèptica no van mostrar cap efecte organolèptic en comparació amb el tomàquet de control. Tot i que aquests resultats inicials d'inactivació prometen seguretat alimentària fins i tot a dosis molt baixes d'EWNS de 50.000#/cc. vegeu, és clar que un potencial d'inactivació més alt seria més beneficiós per reduir encara més el risc d'infecció i deteriorament.
Aquí, centrarem la nostra recerca en el desenvolupament d'una plataforma de generació d'EWNS per ajustar els paràmetres de síntesi i optimitzar les propietats fisicoquímiques dels EWNS per millorar el seu potencial antibacterià. En particular, l'optimització s'ha centrat en augmentar la seva càrrega superficial (per millorar l'administració dirigida) i el contingut de ROS (per millorar l'eficiència d'inactivació). Caracterització de propietats fisicoquímiques optimitzades (mida, càrrega i contingut de ROS) mitjançant mètodes analítics moderns i utilitzant microorganismes alimentaris comuns com ara E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae i M. parafortuitum.
L'EVNS es va sintetitzar mitjançant electropolvorització i ionització simultànies d'aigua d'alta puresa (18 MΩ cm–1). L'atomitzador elèctric 12 s'utilitza normalment per atomitzar líquids i partícules 13 i ceràmiques de polímer sintètic i fibres 14 de mida controlada.
Com es detalla en publicacions anteriors 8, 9, 10, 11, en un experiment típic, s'aplica un alt voltatge entre un capil·lar metàl·lic i un contraelèctrode connectat a terra. Durant aquest procés, es produeixen dos fenòmens diferents: 1) electroaspersió i 2) ionització de l'aigua. Un fort camp elèctric entre els dos elèctrodes fa que s'acumulin càrregues negatives a la superfície de l'aigua condensada, donant lloc a la formació de cons de Taylor. Com a resultat, es formen gotes d'aigua altament carregades, que continuen trencant-se en partícules més petites, segons la teoria de Rayleigh16. Al mateix temps, un fort camp elèctric fa que algunes de les molècules d'aigua es divideixin i desprenguin electrons (ionització), generant així una gran quantitat d'espècies reactives d'oxigen (ROS)17. Els paquets ROS18 generats simultàniament es van encapsular en EWNS (Fig. 1c).
La figura 2a mostra el sistema de generació d'EWNS desenvolupat i utilitzat en la síntesi d'EWNS en aquest estudi. L'aigua purificada emmagatzemada en una ampolla tancada es va alimentar a través d'un tub de tefló (2 mm de diàmetre interior) a una agulla d'acer inoxidable de 30G (capil·lar metàl·lic). Com es mostra a la figura 2b, el flux d'aigua es controla mitjançant la pressió d'aire dins de l'ampolla. L'agulla està connectada a una consola de tefló que es pot ajustar manualment a una certa distància del contraelèctrode. El contraelèctrode és un disc d'alumini polit amb un forat al mig per al mostreig. Sota el contraelèctrode hi ha un embut de mostreig d'alumini, que està connectat a la resta de la configuració experimental a través d'un port de mostreig (Fig. 2b). Tots els components del mostrejador estan connectats a terra elèctricament per evitar l'acumulació de càrrega que podria degradar el mostreig de partícules.
(a) Sistema de generació de nanoestructures d'aigua dissenyades (EWNS). (b) Secció transversal del mostrejador i la unitat d'electropolvorització que mostra els paràmetres més importants. (c) Configuració experimental per a la inactivació de bacteris.
El sistema de generació d'EWNS descrit anteriorment és capaç de canviar els paràmetres operatius clau per facilitar l'ajust fi de les propietats de l'EWNS. Ajusteu el voltatge aplicat (V), la distància entre l'agulla i el contraelèctrode (L) i el flux d'aigua (φ) a través del capil·lar per ajustar les característiques de l'EWNS. Els símbols [V (kV), L (cm)] s'utilitzen per denotar diferents combinacions. Ajusteu el flux d'aigua per obtenir un con de Taylor estable d'un cert conjunt [V, L]. Per als propòsits d'aquest estudi, l'obertura del contraelèctrode (D) es va establir a 0,5 polzades (1,29 cm).
A causa de la geometria limitada i l'asimetria, la intensitat del camp elèctric no es pot calcular a partir de principis bàsics. En comptes d'això, es va utilitzar el programari QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)19 per calcular el camp elèctric. El camp elèctric no és uniforme, per la qual cosa el valor del camp elèctric a la punta del capil·lar es va utilitzar com a valor de referència per a diverses configuracions.
Durant l'estudi, es van avaluar diverses combinacions de voltatge i distància entre l'agulla i el contraelèctrode pel que fa a la formació del con de Taylor, l'estabilitat del con de Taylor, l'estabilitat de la producció d'EWNS i la reproductibilitat. Diverses combinacions es mostren a la Taula Suplementària S1.
La sortida del sistema de generació d'EWNS es va connectar directament a un mesurador de partícules de mobilitat d'escaneig (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) per mesurar la concentració numèrica de partícules i es va utilitzar amb un electròmetre d'aerosols de Faraday (TSI, model 3068B, Shoreview, EUA). MN) per mesurar els fluxos d'aerosols, tal com es descriu a la nostra publicació anterior9. Tant l'SMPS com l'electròmetre d'aerosols van prendre mostres a un cabal de 0,5 L/min (cabal total de mostra d'1 L/min). Les concentracions de partícules i els fluxos d'aerosols es van mesurar durant 120 s. Repetiu la mesura 30 vegades. La càrrega total d'aerosols es calcula a partir de les mesures actuals i la càrrega mitjana d'EWNS s'estima a partir del nombre total de partícules d'EWNS mostrejades. El cost mitjà de l'EWNS es pot calcular mitjançant l'equació (1):
on IEl és el corrent mesurat, NSMPS és la concentració numèrica mesurada amb l'SMPS i φEl és el cabal cap a l'electròmetre.
Com que la humitat relativa (HR) afecta la càrrega superficial, la temperatura i la (HR) es van mantenir constants a 21 °C i 45%, respectivament, durant l'experiment.
Es va utilitzar microscòpia de força atòmica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) i la sonda AC260T (Olympus, Tòquio, Japó) per mesurar la mida i la vida útil de l'EWNS. La velocitat d'escaneig AFM és d'1 Hz i l'àrea d'escaneig és de 5 µm × 5 µm amb 256 línies d'escaneig. Totes les imatges es van sotmetre a una alineació d'imatges de primer ordre mitjançant el programari Asylum (màscara amb un rang de 100 nm i un llindar de 100 pm).
Traieu l'embut de mostreig i col·loqueu la superfície de la mica a una distància de 2,0 cm del contraelèctrode durant un temps mitjà de 120 s per evitar la coalescència de partícules i la formació de gotes irregulars a la superfície de la mica. L'EWNS es va aplicar directament a les superfícies de mica acabades de tallar (Ted Pella, Redding, CA). Immediatament després de la polvorització, la superfície de la mica es va visualitzar mitjançant AFM. L'angle de contacte superficial de la mica sense modificar acabada de tallar és proper a 0°, de manera que l'EWNS es propaga sobre la superfície de la mica en forma de cúpula20. El diàmetre (a) i l'alçada (h) de les gotes difusores es van mesurar directament a partir de la topografia AFM i es van utilitzar per calcular el volum de difusió en cúpula EWNS mitjançant el nostre mètode validat prèviament8. Suposant que l'EVNS integrat té el mateix volum, el diàmetre equivalent es pot calcular a partir de l'equació (2):
D'acord amb el nostre mètode desenvolupat prèviament, es va utilitzar una trampa d'espín de ressonància d'espín electrònic (ESR) per detectar la presència d'intermediaris radicals de vida curta en EWNS. Els aerosols es van fer passar a través d'una solució que contenia 235 mM de DEPMPO (5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-òxid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Totes les mesures EPR es van realitzar mitjançant un espectròmetre Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) i matrius de cel·les planes. Es va utilitzar el programari Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) per recopilar i analitzar les dades. La caracterització ROS es va realitzar només per a un conjunt de condicions operatives [-6,5 kV, 4,0 cm]. Les concentracions d'EWNS es van mesurar mitjançant SMPS després de tenir en compte la pèrdua d'EWNS a l'impactador.
Els nivells d'ozó es van monitoritzar mitjançant un monitor d'ozó de doble feix 205™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Per a totes les propietats EWNS, el valor de mesura és la mitjana de les mesures i l'error de mesura és la desviació estàndard. Es va realitzar una prova t per comparar el valor de l'atribut EWNS optimitzat amb el valor corresponent de l'EWNS base.
La figura 2c mostra un sistema de pas per precipitació electrostàtica (EPES) desenvolupat i caracteritzat prèviament que es pot utilitzar per dirigir EWNS11 a superfícies. L'EPES utilitza una càrrega EWNS en combinació amb un camp elèctric fort per "apuntar" directament a la superfície de l'objectiu. Els detalls del sistema EPES es presenten en una publicació recent de Pyrgiotakis et al.11. Així, l'EPES consisteix en una cambra de PVC impresa en 3D amb extrems cònics que contenen dues plaques metàl·liques paral·leles d'acer inoxidable (acer inoxidable 304, polit mirall) al mig, separades per 15,24 cm. Les plaques es van connectar a una font externa d'alt voltatge (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), la placa inferior sempre era positiva i la placa superior sempre estava connectada a terra (flotant). Les parets de la cambra estan cobertes amb paper d'alumini, que està connectat a terra elèctricament per evitar la pèrdua de partícules. La cambra té una porta de càrrega frontal segellada que permet col·locar les superfícies de prova sobre bastidors de plàstic, aixecant-les de la placa metàl·lica inferior per evitar interferències d'alt voltatge.
L'eficiència de deposició d'EWNS en EPES es va calcular segons un protocol desenvolupat prèviament detallat a la figura suplementària S111.
Com a cambra de control, el segon flux a través de la cambra cilíndrica es connecta en sèrie amb el sistema EPES mitjançant un filtre HEPA intermedi per eliminar les EWNS. Com es mostra a la figura 2c, l'aerosol d'EWNS es va bombar a través de dues cambres connectades en sèrie. El filtre entre la sala de control i l'EPES elimina les restes d'EWNS, cosa que resulta en la mateixa temperatura (T), humitat relativa (HR) i nivells d'ozó.
S'ha descobert que importants microorganismes transmesos pels aliments contaminen productes frescos com ara Escherichia coli (ATCC #27325), un indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), un patogen transmès pels aliments, Listeria innocua (ATCC #33090), una alternativa a la patògena Listeria monocytogenes. , Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) com a alternativa al llevat de deteriorament, i Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) com a bacteri viu més resistent es van comprar a ATCC (Manassas, Virgínia).
Compra a l'atzar caixes de tomàquets de raïm orgànics al teu mercat local i refrigereu-los a 4 °C fins al moment de fer-los servir (fins a 3 dies). Selecciona tomàquets per experimentar amb una mida, d'aproximadament 1,25 cm de diàmetre.
Els protocols per a la incubació, la inoculació, l'exposició i el recompte de colònies s'han detallat en les nostres publicacions anteriors i s'han explicat detalladament a les dades suplementàries 11. El rendiment de l'EWNS es va avaluar exposant tomàquets inoculats a 40.000 #/cm3 durant 45 minuts. Breument, en el temps t = 0 min, es van utilitzar tres tomàquets per avaluar els microorganismes supervivents. Es van col·locar tres tomàquets en EPES i es van exposar a EWNS a 40.000 #/cc (tomàquets exposats a EWNS) i tres més es van col·locar a la cambra de control (tomàquets de control). Cap dels grups de tomàquets va ser sotmès a un processament addicional. Els tomàquets i els controls exposats a EWNS es van retirar després de 45 minuts per avaluar l'efecte de l'EWNS.
Cada experiment es va dur a terme per triplicat. L'anàlisi de dades es va realitzar segons el protocol descrit a les dades suplementàries.
Es van pelletar mostres bacterianes d'E. coli, Enterobacter i L. innocua exposades a EWNS (45 min, concentració d'aerosol d'EWNS 40.000 #/cm3) i no exposades per avaluar els mecanismes d'inactivació. El precipitat es va fixar durant 2 hores a temperatura ambient en una solució de cacodilat de sodi 0,1 M (pH 7,4) amb un fixador de glutaraldehid al 2,5%, paraformaldehid a l'1,25% i àcid pícric al 0,03%. Després del rentat, es van fixar amb tetròxid d'osmi (OsO4) a l'1,5% i ferrocianur de potassi (KFeCN6) a l'1 durant 2 h, es van rentar 3 vegades amb aigua i es van incubar en acetat d'uranil a l'1% durant 1 h, i després es van rentar dues vegades amb aigua. Deshidratació posterior de 10 minuts cadascuna amb alcohol al 50%, 70%, 90% i 100%. A continuació, les mostres es van col·locar en òxid de propilè durant 1 hora i es van impregnar amb una barreja 1:1 d'òxid de propilè i TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Les mostres es van incrustar en TAAB Epon i es van polimeritzar a 60 °C durant 48 hores. La resina granular curada es va tallar i visualitzar mitjançant TEM utilitzant un JEOL 1200EX (JEOL, Tòquio, Japó), un microscopi electrònic de transmissió convencional equipat amb una càmera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, EUA).
Tots els experiments es van dur a terme per triplicat. Per a cada punt de temps, els rentats bacterians es van sembrar per triplicat, donant com a resultat un total de nou punts de dades per punt, la mitjana dels quals es va utilitzar com a concentració bacteriana per a aquell organisme en particular. La desviació estàndard es va utilitzar com a error de mesura. Tots els punts compten.
El logaritme de la disminució de la concentració de bacteris en comparació amb t = 0 min es va calcular mitjançant la fórmula següent:
on C0 és la concentració de bacteris a la mostra de control en el temps 0 (és a dir, després que la superfície s'hagi assecat però abans de col·locar-la a la cambra) i Cn és la concentració de bacteris a la superfície després de n minuts d'exposició.
Per tenir en compte la degradació natural dels bacteris durant el període d'exposició de 45 minuts, també es va calcular la reducció logarítmica en comparació amb el control als 45 minuts de la manera següent:
On Cn és la concentració de bacteris a la mostra de control en el temps n i Cn-Control és la concentració de bacteris de control en el temps n. Les dades es presenten com una reducció logarítmica en comparació amb el control (sense exposició a EWNS).
Durant l'estudi, es van avaluar diverses combinacions de voltatge i distància entre l'agulla i el contraelèctrode en termes de formació de con de Taylor, estabilitat del con de Taylor, estabilitat de la producció d'EWNS i reproductibilitat. A la taula suplementària S1 es mostren diverses combinacions. Es van seleccionar dos casos per a un estudi complet que mostra propietats estables i reproduïbles (con de Taylor, producció d'EWNS i estabilitat al llarg del temps). A la figura 3 es mostren els resultats sobre la càrrega, la mida i el contingut de ROS per a dos casos. Els resultats també es resumeixen a la taula 1. Com a referència, la figura 3 i la taula 1 inclouen les propietats dels EWNS8, 9, 10, 11 (EWNS de referència) no optimitzats sintetitzats prèviament. Els càlculs de significació estadística mitjançant una prova t bilateral es tornen a publicar a la taula suplementària S2. A més, les dades addicionals inclouen estudis sobre l'efecte del diàmetre del forat de mostreig del contraelèctrode (D) i la distància entre l'elèctrode de terra i la punta de l'agulla (L) (figures suplementàries S2 i S3).
(a–c) Distribució de mida AFM. (d–f) Característica de càrrega superficial. (g) Caracterització de ROS i ESR.
També és important tenir en compte que, per a totes les condicions anteriors, els corrents d'ionització mesurats es van situar en el rang de 2-6 µA, i els voltatges es van situar en el rang de -3,8 a -6,5 kV, cosa que va resultar en un consum d'energia per a aquest mòdul de generació EWNS d'un sol terminal inferior a 50 mW. Tot i que l'EWNS es va sintetitzar a alta pressió, els nivells d'ozó van ser molt baixos, sense superar mai els 60 ppb.
La figura suplementària S4 mostra els camps elèctrics simulats per als escenaris [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivament. Els camps segons els escenaris [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] es calculen com a 2 × 105 V/m i 4,7 × 105 V/m, respectivament. Això és d'esperar, ja que la relació entre el voltatge i la distància és molt més alta en el segon cas.
A la figura 3a i b es mostra el diàmetre de l'EWNS mesurat amb l'AFM8. Els diàmetres mitjans de l'EWNS per als escenaris [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] es van calcular com a 27 nm i 19 nm, respectivament. Les desviacions estàndard geomètriques de les distribucions per als casos [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] són 1,41 i 1,45, respectivament, cosa que indica una distribució de mida estreta. Tant la mida mitjana com la desviació estàndard geomètrica són molt properes a l'EWNS de referència, sent 25 nm i 1,41, respectivament. A la figura 3c es mostra la distribució de mida de l'EWNS de referència mesurat utilitzant el mateix mètode en les mateixes condicions.
A la figura 3d, e es mostren els resultats de la caracterització de la càrrega. Les dades són mesures mitjanes de 30 mesures simultànies de concentració (#/cm3) i corrent (I). L'anàlisi mostra que la càrrega mitjana a l'EWNS és de 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- per a [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivament. En comparació amb l'EWNS de referència (10 ± 2 e-), la seva càrrega superficial és significativament més alta, el doble que la de l'escenari [-6,5 kV, 4,0 cm] i quatre vegades la de [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figura 3f mostra les dades bàsiques de pagament de l'EWNS.
A partir dels mapes de concentració numèrica d'EWNS (figures suplementàries S5 i S6), es pot veure que l'escena [-6,5 kV, 4,0 cm] té un nombre significativament més alt de partícules que l'escena [-3,8 kV, 0,5 cm]. També cal destacar que les concentracions numèriques d'EWNS es van controlar durant un màxim de 4 hores (figures suplementàries S5 i S6), on l'estabilitat de la generació d'EWNS va mostrar els mateixos nivells de concentracions numèriques de partícules en ambdós casos.
La figura 3g mostra l'espectre EPR després de la subtracció de control (fons) per a EWNS optimitzats a [-6,5 kV, 4,0 cm]. L'espectre ROS també es compara amb la línia de base d'EWNS en un article publicat anteriorment. El nombre calculat d'EWNS que reaccionen amb la trampa d'espín és de 7,5 × 104 EWNS/s, que és similar a la línia de base-EWNS8 publicada anteriorment. Els espectres EPR van indicar clarament la presència de dos tipus de ROS, on predominava l'O2-, mentre que l'OH• estava present en una quantitat menor. A més, una comparació directa de les intensitats màximes va mostrar que els EWNS optimitzats tenien un contingut de ROS significativament més alt en comparació amb els EWNS de línia de base.
La figura 4 mostra l'eficiència de deposició d'EWNS en EPES. Les dades també es resumeixen a la Taula I i es comparen amb les dades originals d'EWNS. Per a tots dos casos d'EUNS, la deposició va ser propera al 100% fins i tot a un voltatge baix de 3,0 kV. Normalment, 3,0 kV és suficient per aconseguir una deposició del 100% independentment del canvi de càrrega superficial. En les mateixes condicions, l'eficiència de deposició del Baseline-EWNS va ser només del 56% a causa de la menor càrrega (mitjana de 10 electrons per EWNS).
La Figura 5 i la Taula 2 resumeixen el grau d'inactivació dels microorganismes inoculats a la superfície dels tomàquets després de l'exposició a aproximadament 40.000 #/cm3 EWNS durant 45 minuts en l'escenari òptim [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli i L. innocua inoculades van mostrar una reducció significativa de 3,8 log després de 45 minuts d'exposició. En les mateixes condicions, S. enterica va mostrar una reducció logarítmica inferior de 2,2 log, mentre que S. cerevisiae i M. parafortuitum van mostrar una reducció d'1,0 log.
Micrografies electròniques (Figura 6) que mostren els canvis físics induïts per EWNS en cèl·lules d'E. coli, Salmonella enterica i L. innocua que provoquen la inactivació. Els bacteris de control mostraven membranes cel·lulars intactes, mentre que els bacteris exposats tenien membranes externes danyades.
Les imatges de microscòpia electrònica dels bacteris de control i exposats van revelar danys a la membrana.
Les dades sobre les propietats fisicoquímiques dels EWNS optimitzats mostren col·lectivament que les propietats dels EWNS (càrrega superficial i contingut de ROS) van millorar significativament en comparació amb les dades de referència dels EWNS publicades anteriorment8,9,10,11. D'altra banda, la seva mida es va mantenir en el rang nanomètric, cosa que és molt similar als resultats publicats anteriorment, cosa que els permet romandre a l'aire durant un llarg període de temps. La polidispersitat observada es pot explicar pels canvis en la càrrega superficial, que determinen la magnitud de l'efecte Rayleigh, l'aleatorietat i la possible fusió dels EWNS. Tanmateix, tal com detallen Nielsen et al.22, una càrrega superficial elevada redueix l'evaporació augmentant eficaçment l'energia/tensió superficial de la gota d'aigua. Aquesta teoria es va confirmar experimentalment per a microgotes22 i EWNS a la nostra publicació anterior8. La pèrdua de temps extra també pot afectar la mida i contribuir a la distribució de mida observada.
A més, la càrrega per estructura és d'uns 22–44 e-, depenent de les circumstàncies, cosa que és significativament més alta en comparació amb l'EWNS bàsic, que té una càrrega mitjana de 10 ± 2 electrons per estructura. Tanmateix, cal tenir en compte que aquesta és la càrrega mitjana de l'EWNS. Seto et al. S'ha demostrat que la càrrega no és uniforme i segueix una distribució log-normal21. En comparació amb el nostre treball anterior, duplicar la càrrega superficial duplica l'eficiència de deposició en el sistema EPES a gairebé el 100%11.