Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que utilitzeu té un suport limitat per a CSS. Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer). Mentrestant, per garantir un suport continuat, mostrarem el lloc sense estils ni JavaScript.
Les partícules de sílice porosa es van preparar mitjançant un mètode sol-gel amb algunes modificacions per obtenir partícules macroporoses. Aquestes partícules es van derivatitzar mitjançant polimerització per transferència de cadena de fragmentació d'addició reversible (RAFT) amb N-fenilmaleimida-metilvinilisocianat (PMI) i estirè per preparar la intercalació de N-fenilmaleimida de poliestirè en fase estacionària. mm id) es van empaquetar mitjançant l'empaquetament de purins. Separació de columna PMP avaluada d'una barreja de pèptids formada per cinc pèptids (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) les condicions cromatogràfiques òptimes de la digestió i l'elaboració de l'àlbum cromatogràfic de la UH. El recompte de plaques orètiques de la barreja de pèptids és de fins a 280.000 plaques/m². En comparar el rendiment de separació de la columna desenvolupada amb la columna comercial Ascentis Express RP-Amide, es va observar que el rendiment de separació de la columna PMP era superior a la columna comercial en termes d'eficiència i resolució de separació.
En els darrers anys, la indústria biofarmacèutica s'ha convertit en un mercat global en expansió amb un augment substancial de la quota de mercat. Amb el creixement explosiu de la indústria biofarmacèutica1,2,3, l'anàlisi de pèptids i proteïnes és molt desitjada. A més del pèptid objectiu, es generen diverses impureses durant la síntesi de pèptids, per la qual cosa es requereix la purificació cromatogràfica de la proteïna del cos de pèptids i l'anàlisi de la purificació de les cèl·lules de fluids desitjats, l'anàlisi del cos de pèptids i la purificació de fluids desitjats. és una tasca extremadament difícil a causa del gran nombre d'espècies potencialment detectables en una sola mostra. Tot i que l'espectrometria de masses és una eina eficaç per a la seqüenciació de pèptids i proteïnes, si aquestes mostres s'injecten a l'espectròmetre de masses d'una sola passada, la separació no serà l'ideal. Aquest problema es pot mitigar mitjançant la implementació de cromatografia líquida (LC), que reduirà el nombre d'anàlisis de masses abans de l'anàlisi de masses. 5,6.A més, durant la separació en fase líquida, els analits es poden enfocar en regions estretes, concentrant així aquests analits i millorant la sensibilitat de detecció de MS. La cromatografia líquida (LC) ha avançat significativament durant l'última dècada i s'ha convertit en una tècnica popular en anàlisi proteòmica7,8,9,10.
La cromatografia líquida en fase inversa (RP-LC) s'utilitza àmpliament per a la purificació i separació de barreges de pèptids utilitzant sílice modificada amb octadecil (ODS) com a fase estacionària. es i proteïnes amb fragments polars i no polars per interaccionar amb aquests analits i retenir-los16. La cromatografia de mode mixt, que proporciona interaccions multimodals, pot ser una alternativa a RP-LC per a la separació de pèptids, proteïnes i altres mescles complexes. S'han preparat diverses fases estacionàries de mode mixt i s'han utilitzat columnes, separacions de pèptids i s'han utilitzat columnes, separacions de pèptids i proteïnes en fases. 21.Les fases estacionàries de mode mixt (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalació polar/RPLC) són adequades per a separacions de pèptids i proteïnes a causa de la presència de grups polars i no polars22,23,24,25,26,27,28. r analits, ja que la separació depèn de la interacció entre l'analit i la fase estacionària.Interaccions multimodals 29, 30, 31, 32. Recentment, Zhang et al.30 va preparar una fase estacionària de poliamina terminada en dodecil i va separar amb èxit hidrocarburs, antidepressius, flavonoides, nucleòsids, estrògens i diversos altres analits. L'intercalador polar té grups polars i no polars, per la qual cosa es pot utilitzar per separar pèptids i proteïnes que tenen tant pèptids com hidrofòbics incrustats i columnes hidrofòbiques. 8 columnes) estan disponibles comercialment amb el nom comercial Ascentis Express RP-Amide columns, però aquestes columnes s'utilitzen només per a l'anàlisi de l'amina 33.
En l'estudi actual, es va preparar i avaluar una fase estacionària incrustada en polars (poliestirè incrustat en N-fenilmaleimida) per a la separació de pèptids i digerits de tripsina de HSA. La fase estacionària es va preparar utilitzant la següent estratègia. Les partícules de sílice porosa es van preparar segons el procediment indicat a la nostra publicació anterior amb algunes modificacions a la proporció de preparació d'àcid uMOSG, polietilglicè, aigua, aigua. Es va ajustar per preparar partícules de sílice amb gran mida de porus. En segon lloc, es va sintetitzar un nou lligand, fenilmaleimida-metil vinil isocianat, i es va utilitzar per derivatitzar partícules de sílice per preparar una fase estacionària incrustada polar. d dins de la columna. Avaluar la separació de la columna empaquetada de barreges de pèptids formades per cinc pèptids;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) i Tripsin digest of human serum albumin (HAS).La barreja de pèptids i la tripsina digest de HSA es va observar per separar la columna amb una bona resolució i eficiència de separació de la columna ExpressRP. -Columna d'amida. Es va observar que tant els pèptids com les proteïnes estaven ben resolts i eficients a la columna PMP, que era més eficient que la columna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicol), urea, àcid acètic, trimetoxi ortosilicat (TMOS), trimetilclorosilà (TMCS), tripsina, albúmina sèrica humana (HSA), clorur d'amoni, urea, hexà metildisilasà (HMDS), clorur de metacriloil (MC), peroxidoil (MC-4), peroxidoil (MC-4), TEMP-POLC-Benzoil-HP Grau d'acetonitril (ACN), metanol, 2-propanol i acetona comprat a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Es va agitar una barreja d'urea (8 g), polietilenglicol (8 g) i 8 ml d'àcid acètic 0,01 N durant 10 minuts, i després es van afegir 24 ml de TMOS en condicions de gel. Es va preparar a 70 °C durant 12 hores. La massa suau seca es va mòlta suaument en un forn i es va calcinar a 550 °C durant 12 hores. Es van preparar i caracteritzar tres lots per examinar la reproductibilitat en la mida de la partícula, la mida dels porus i la superfície.
Mitjançant la modificació de la superfície de les partícules de sílice amb lligand presintetitzat fenilmaleimida-metilvinilisocianat (PCMP) seguida de polimerització radial amb estirè, es va preparar un compost que conté grup polar.Fase estacionària d'àrids i cadenes de poliestirè. A continuació es descriu el procés d'elaboració.
Es van dissoldre N-fenilmaleimida (200 mg) i isocianat de metil vinil (100 mg) en toluè sec i es van afegir 0,1 ml de 2,2′-azoisobutironitril (AIBN) al matràs de reacció per preparar fenilmaleimida-isocianat de metil vinil. posar al forn a 40ºC durant 3 hores.
Les partícules de sílice seques (2 g) es van dispersar en toluè sec (100 ml), es van agitar i es van sonicar en un matràs de fons rodó de 500 ml durant 10 min. PMCP (10 mg) es va dissoldre en toluè i es va afegir gota a gota al matràs de reacció mitjançant un embut de goteig. A continuació, es van dissoldre partícules de sílice unides a PMCP (100 g) en toluè (200 ml) i es va afegir 4-hidroxi-TEMPO (2 ml) en presència de 100 µL de dilaurat de dibutilestany com a catalitzador. La mescla es va agitar a 50 °C, es va filtrar durant 50 °C durant 8 hores.
L'estirè (1 ml), el peròxid de benzoil BPO (0,5 ml) i les partícules de sílice unides a TEMPO-PMCP (1,5 g) es van dispersar en toluè i es van purgar amb nitrogen. La polimerització de l'estirè es va dur a terme a 100 °C durant 12 hores.
Les mostres es van desgasificar a 393 K durant 1 hora per obtenir una pressió residual inferior a 10-3 Torr. La quantitat de N2 adsorbida a una pressió relativa de P/P0 = 0,99 es va utilitzar per determinar el volum total de porus. Es va examinar la morfologia de les partícules de sílice nues i lligades amb lligands amb microscòpia electrònica d'escaneig (Tòquio, Japó i microscòpia electrònica d'alta tecnologia). partícules de sílice unides) es van col·locar en una columna d'alumini mitjançant cinta adhesiva de carboni. Es va xapar or a les mostres amb un recobridor de pols Q150T i es va dipositar una capa d'Au de 5 nm a les mostres. Això millora l'eficiència del procés mitjançant baixes tensions i proporciona un gra fi i polverització en fred. n (Worcestershire, Regne Unit) es va utilitzar l'analitzador de mida de partícules Mastersizer 2000 per obtenir la distribució de la mida de les partícules. Les partícules de sílice nues i les partícules de sílice lligades a lligands (5 mg cadascuna) es van dispersar en 5 ml d'isopropanol, es van sonicar durant 10 min, es van vortexar durant 5 min i es van col·locar al banc òptic Master a una velocitat perimètrica de 5 min. rang de temperatura de 30 a 800 °C.
Les columnes d'acer inoxidable amb revestiment de vidre de dimensions (100 × 1,8 mm d'i) es van empaquetar mitjançant el mètode d'embalatge de purins, aplicant el mateix procediment utilitzat a la ref.31. Es va connectar una columna d'acer inoxidable (revestida de vidre, 100 × 1,8 mm d.i.) amb un racó de sortida que contenia una frita d'1 µm a un empacador de purins (Alltech Deerfield, IL, EUA). Ompliu la columna seqüencialment aplicant pressions de 100 MP durant 10 minuts, 80 MP durant 15 minuts i 60 MP durant 30 minuts. Durant l'embalatge, es va aplicar vibració mecànica amb dos agitadors de columna GC (Alltech, Deerfield, IL, EUA) per garantir un empaquetament uniforme de la columna. des de la unitat d'embalatge de purins i connecteu un altre accessori a l'entrada i al sistema LC per comprovar-ne el rendiment.
Es va construir una bomba LC (10AD Shimadzu, Japó), injector (Valco (EUA) C14 W.05) amb bucle d'injecció de 50 nL, desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A), finestra capil·lar UV-VIS Detector especial de dispositiu µLC (UV-2075) i microcolumnes revestides de vidre per reduir al mínim l'efecte de connexió de tubs molt estrets. embalatge, capil·lars (50 μm id 365 i capil·lars d'unió reductora (50 μm) es van instal·lar a la sortida d'1/16 "de la unió reductora. La recollida de dades i el processament cromatogràfic es van fer amb el programari Multichro 2000. Monitorització a 254 nm Els analits es van provar per a l'absorció de dades UV, origen cromatogràfic MA8.
Albúmina de sèrum humà, pols liofilitzat, ≥ 96% (electroforesi en gel d'agarosa) 3 mg barrejat amb tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL) i bicarbonat d'amoni 0,2 M (1 mL). % TFA.Filtrar la solució i guardar per sota de 4 °C.
La separació de les mescles de pèptids i els digerits de tripsina HSA es van avaluar per separat en columnes PMP. Comproveu la separació de la barreja de pèptids i el digerit de tripsina de HSA per la columna PMP i compareu els resultats amb la columna Ascentis Express RP-Amide. El número de placa teòric es calcula de la següent manera:
A la FIG.2 .Les imatges SEM de partícules de sílice nues (A, B) mostren que, a diferència dels nostres estudis anteriors, aquestes partícules són esfèriques en les quals les partícules són allargades o tenen una simetria irregular. La superfície de les partícules de sílice unides a lligands (C, D) és més llisa que la de les partícules de sílice nues, la qual cosa pot ser degut al recobriment de les cadenes a la superfície de les partícules de sílice.
Imatges de microscopi electrònic d'escaneig de partícules nues de sílice (A, B) i partícules de sílice unides a lligands (C, D).
Les distribucions de la mida de partícules de les partícules de sílice nues i les partícules de sílice unides a lligands es mostren a la figura 3 (A). Les corbes de distribució de la mida de les partícules basades en el volum van mostrar que la mida de les partícules de sílice augmentava després de la modificació química (Fig. 3A). , en comparació amb el nostre estudi anterior amb un valor ad (0,5) de 3,05 μm (partícules de sílice lligades a poliestirè) 34. Aquest lot tenia una distribució de la mida de partícula més estreta en comparació amb el nostre estudi anterior a causa de les proporcions variables de PEG, urea, TMOS i àcid acètic a la barreja de reacció. estudiat anteriorment. Això vol dir que la funcionalització superficial de partícules de sílice amb estirè només va dipositar una capa de poliestirè (0,97 µm) a la superfície de la sílice, mentre que en la fase PMP el gruix de la capa era d'1,38 µm.
Distribució de la mida de partícules (A) i distribució de la mida dels porus (B) de partícules de sílice nues i partícules de sílice lligades a lligands.
La mida dels porus, el volum de porus i la superfície de les partícules de sílice de l'estudi actual es mostren a la taula 1 (B). Els perfils PSD de les partícules de sílice nues i les partícules de sílice unides a lligands es mostren a la figura 3 (B). Els resultats són comparables al nostre estudi anterior. tal com es mostra a la taula 1(B), i el canvi de la corba es mostra a la figura 3(B). De la mateixa manera, el volum de porus de les partícules de sílice va disminuir de 0,67 a 0,58 cm3/g després de la modificació química. /g) de les partícules de sílice també va disminuir de 116 m2/g a 105 m2/g després de la modificació química.
Els resultats de l'anàlisi elemental de la fase estacionària es mostren a la taula 2. La càrrega de carboni de la fase estacionària actual és del 6,35%, que és inferior a la càrrega de carboni del nostre estudi anterior (partícules de sílice unides a poliestirè, 7,93%35 i 10,21%, respectivament). Es van utilitzar nds com la fenilmaleimida-metilvinilisocianat (PCMP) i 4-hidroxi-TEMPO. El percentatge en pes de nitrogen de la fase estacionària actual és del 2,21%, en comparació amb el 0,1735 i el 0,85% en pes de nitrogen en estudis anteriors, respectivament. 4) i (5) eren del 2,7% i del 2,9%, respectivament, mentre que la càrrega de carboni del producte final (6) va ser del 6,35%, tal com es mostra a la taula 2. La pèrdua de pes es va comprovar amb la fase estacionària PMP, i la corba TGA es mostra a la figura 4. La corba TGA mostra una pèrdua de pes del 8,6%, que també conté el lligand C35 en bona concordança amb el carboni, però no només conté N. , O i H.
El lligand fenilmaleimida-metilvinilisocianat es va escollir per a la modificació superficial de partícules de sílice perquè té grups fenilmaleimida polar i grups vinilisocianat. Els grups vinilisocianat poden reaccionar encara més amb l'estirè mitjançant la polimerització de radicals vius. La part d'imida no té càrrega virtual a pH normal. La polaritat de la fase estacionària es pot controlar mitjançant la quantitat òptima d'estirè i el temps de reacció de la polimerització radical lliure. L'últim pas de la reacció (polimerització radical lliure) és crític i pot canviar la polaritat de la fase estacionària. Els SP preparats amb diferents concentracions d'estirè tenen diferents càrregues de carboni. De nou, carregueu aquestes fases estacionàries en columnes d'acer inoxidable i comproveu-ne el rendiment cromatogràfic (selectivitat, resolució, valor N, etc.). A partir d'aquests experiments, es va seleccionar una formulació optimitzada per preparar la fase estacionària de PMP i garantir una bona retenció de polaritat anal controlada.
També es van avaluar cinc barreges de pèptids (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) mitjançant una columna PMP mitjançant una fase mòbil;60/40 (v/v) acetonitril/aigua (0,1% TFA) a un cabal de 80 μL/min. En condicions d'elució òptimes, el nombre teòric de plaques (N) per columna (100 × 1,8 mm id) és de 20.000 ± 100 (200.000 plaques P/m² per al valor de les tres plaques P/m²). es mostren grams a la figura 5A. Anàlisi ràpida en una columna PMP a un cabal elevat (700 μL/min), es van eluir cinc pèptids en un minut, els valors de N eren molt bons, 13.500 ± 330 per columna (100 × 1,8 mm id), Correspon a 135.000 plaques identificades (figura 50000 identificades/columna). 0,8 mm id) es van empaquetar amb tres lots diferents de fase estacionària de PMP per comprovar la reproductibilitat. La concentració d'analit per a cada columna es va registrar utilitzant les condicions d'elució òptimes i el nombre de plaques teòriques N i el temps de retenció per separar la mateixa barreja de prova a cada columna. Les dades de reproductibilitat de les columnes PMP es mostren a la taula 4.
Separació de la barreja de pèptids a la columna PMP (B) i la columna Ascentis Express RP-Amide (A);fase mòbil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensions de la columna PMP (100 × 1,8 mm id);analític L'ordre d'elució dels compostos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (leucina) encefalina àcida)).
Es va avaluar una columna PMP (100 × 1,8 mm id) per a la separació de digerits tríptics d'albúmina sèrica humana en cromatografia líquida d'alt rendiment. El cromatograma de la figura 6 mostra que la mostra està ben separada i la resolució és molt bona. Els digerits HSA es van analitzar amb un cabal de 100 µL/min, fase mòbil acetona/30 i 70FAitril/30% en aigua. cromatograma (Figura 6), la digestió HSA s'ha dividit en 17 pics corresponents a 17 pèptids. Es va calcular l'eficiència de separació de cada pic en el resum HSA i els valors es donen a la taula 5.
Es va separar un digest tríptic de HSA (100 × 1, 8 mm id) en una columna PMP;cabal (100 µL/min), fase mòbil 60/40 acetonitril/aigua amb 0,1% TFA.
on L és la longitud de la columna, η és la viscositat de la fase mòbil, ΔP és la contrapressió de la columna i u és la velocitat lineal de la fase mòbil. El nostre estudi anterior Ref.34.La permeabilitat de la columna plena de partícules superficialment poroses és: 1,7 × 10-15 per a partícules d'1,3 μm, 3,1 × 10-15 per partícules d'1,7 μm, 5,2 × 10-15 i 2,5 × 10-14 per partícules de 1,3 μm. La permeabilitat de la fase PMP és similar a la de les partícules de nucli de 5 μm.
on Wx és el pes de la columna empaquetada amb cloroform, Wy és el pes de la columna empaquetada amb metanol i ρ és la densitat del dissolvent. Densitats de metanol (ρ = 0,7866) i cloroform (ρ = 1,484). 31 que hem estudiat anteriorment eren 0,63 i 0,55, respectivament. Això vol dir que la presència de lligands d'urea redueix la permeabilitat de la fase estacionària. D'altra banda, la porositat total de la columna PMP (100 × 1,8 mm id) és de 0,60. fases, els lligands C18 s'uneixen a les partícules de sílice com a cadenes lineals, mentre que en les fases estacionàries de poliestirè, es forma una capa de polímer relativament gruixuda al seu voltant. En un experiment típic, la porositat de la columna es calcula com:
Les figures 7A, B mostren la columna PMP (100 × 1,8 mm id) i la columna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) utilitzant les mateixes condicions d'elució (és a dir, 60/40 ACN / H2O i 0,1% TFA).) de la parcel·la de van Deemter.Les mescles de pèptids seleccionades (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) es van preparar en 20 µl/ El cabal mínim per a ambdues columnes és de 800 µL/min. La columna Express RP-Amide era de 2,6 µm i 3,9 µm, respectivament. Els valors HETP indiquen que l'eficiència de separació de la columna PMP (100 × 1,8 mm id) és molt millor que la columna Ascentis Express RP-Amide disponible comercialment (100 × 1,8 mm id). estudi. La major eficiència de separació de la columna PMP (100 × 1,8 mm id) en comparació amb la columna Ascentis Express RP-Amide es basa en les millores en la forma, la mida de les partícules i els complexos procediments d'embalatge de la columna utilitzats en el treball actual34.
(A) Gràfic de van Deemter (HETP versus velocitat lineal de la fase mòbil) obtingut mitjançant una columna PMP (100 × 1,8 mm id) en 60/40 ACN/H2O amb 0,1% TFA. amb un 0,1% de TFA.
Es va preparar i avaluar una fase estacionària de poliestirè incrustat polar per a la separació de mescles de pèptids sintètics i digerits de tripsina d'albúmina sèrica humana (HAS) en cromatografia líquida d'alt rendiment. El rendiment cromatogràfic de columnes PMP per a mescles de pèptids és excel·lent en eficiència i resolució de separació. , síntesi controlada de la fase estacionària i embalatge de columnes complexos. A més de l'alta eficiència de separació, la contrapressió de columna baixa a cabals elevats és un altre avantatge d'aquesta fase estacionària. Les columnes PMP presenten una bona reproductibilitat i es poden utilitzar per a l'anàlisi de barreges de pèptids i la digestió de tripsina de diverses proteïnes. Tenim la intenció d'utilitzar aquesta columna per a la separació de productes naturals, extractes de plantes líquides i fongs. també s'avaluarà per a la separació de proteïnes i anticossos monoclonals.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Recerca sobre sistemes de separació de pèptids per cromatografia en fase inversa Part I: desenvolupament d'un protocol de caracterització de columnes.J.Cromatografia.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Pèptids actius millorats dissenyats per al tractament de malalties infeccioses.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. i Khrestchatisky, M. Peptides terapèutics sintètics: ciència i mercat.descobriment de drogues.15 (1-2) avui, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2001009).
Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Cromatografia líquida proteòmica avançada.J.Cromatografia.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al.La cromatografia líquida avançada-espectrometria de masses permet la incorporació de metabolòmica i proteòmica àmpliament orientades.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ El paper de l'UHPLC en el desenvolupament de fàrmacs.J.Set. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspectes fonamentals i pràctics de la cromatografia líquida a ultraalta pressió per a separacions ràpides.J.Set. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA i Tchelitcheff, P. Aplicació de la cromatografia líquida d'ultra-alt rendiment en el desenvolupament de fàrmacs.J.Cromatografia.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Hidrogels macroporosos monolítics preparats a partir d'emulsions de fase interna alta d'oli en aigua per a una purificació eficient d'enterovirus.Chemical.Britain.J.401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA El paper de la cromatografia líquida en la proteòmica.J.Cromatografia.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Emerging trends in reverse-phase liquid chromatography separations of therapeutic peptides and proteins: theory and applications.J.Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Separació bidimensional de pèptids mitjançant un sistema RP-RP-HPLC utilitzant diferents valors de pH en la primera i segona dimensions de separació.J.Set. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Es van investigar les característiques de transferència de massa i el rendiment cinètic de columnes cromatogràfiques d'alta eficiència empaquetades amb partícules C18 sub-2 μm totalment i superficialment poroses.J.Set. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Tendències recents i reptes analítics en l'aïllament, identificació i validació de pèptids bioactius vegetals.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-x (02018-x).
Mueller, JB et al.The proteomic landscape of the kingdom of life.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al.Downstream processing of therapeutic peptides by preparative liquid chromatography.Molecule (Basel, Switzerland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Cromatografia en mode mixt i la seva aplicació als biopolímers.J.Cromatografia.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Lligands for mixed-mode protein chromatography: principi, caracterització i disseny.J.Biotecnologia.144(1), 3-11 (2009).