Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir una assistència continuada, mostrarem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Les partícules poroses de sílice es van preparar mitjançant un mètode sol-gel amb algunes modificacions per obtenir partícules macroporoses. Aquestes partícules es van derivatitzar mitjançant polimerització de transferència de cadena de fragmentació d'addició reversible (RAFT) amb N-fenilmaleimida-metilvinilisocianat (PMI) i estirè per preparar la intercalació de N-fenilmaleimida de la fase estacionària de poliestirè (PMP). Les columnes d'acer inoxidable de diàmetre estret (100 × 1,8 mm de diàmetre interior) es van omplir mitjançant ompliment en suspensió. Es va avaluar la separació de columnes PMP d'una barreja de pèptids que consistia en cinc pèptids (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) rendiment cromatogràfic) i digestió amb tripsina de l'albúmina sèrica humana (HAS). En condicions d'elució òptimes, el recompte teòric de plaques de la barreja de pèptids és de fins a 280.000 plaques/m². Comparant el rendiment de separació de la columna desenvolupada amb la comercial En la columna Ascentis Express RP-Amide, es va observar que el rendiment de separació de la columna PMP era superior al de la columna comercial pel que fa a l'eficiència de separació i la resolució.
En els darrers anys, la indústria biofarmacèutica s'ha convertit en un mercat global en expansió amb un augment substancial de la quota de mercat. Amb el creixement explosiu de la indústria biofarmacèutica1,2,3, l'anàlisi de pèptids i proteïnes és molt desitjable. A més del pèptid diana, es generen diverses impureses durant la síntesi de pèptids, cosa que requereix una purificació cromatogràfica per obtenir pèptids de la puresa desitjada. L'anàlisi i la caracterització de proteïnes en fluids corporals, teixits i cèl·lules és una tasca extremadament difícil a causa del gran nombre d'espècies potencialment detectables en una sola mostra. Tot i que l'espectrometria de masses és una eina eficaç per a la seqüenciació de pèptids i proteïnes, si aquestes mostres s'injecten a l'espectròmetre de masses en una sola passada, la separació no serà ideal. Aquest problema es pot mitigar implementant separacions per cromatografia líquida (LC) abans de l'anàlisi MS, cosa que reduirà el nombre d'anàlits que entren a l'espectròmetre de masses en un moment determinat4,5,6. A més, durant la separació de fase líquida, els anàlits es poden concentrar en regions estretes, concentrant així aquests anàlits i millorant la sensibilitat de detecció MS. La cromatografia líquida (LC) ha avançat significativament durant l'última dècada i s'ha convertit en una tècnica popular en anàlisi proteòmica7,8,9,10.
La cromatografia líquida de fase inversa (RP-LC) s'utilitza àmpliament per a la purificació i separació de mescles de pèptids utilitzant sílice modificada amb octadecil (ODS) com a fase estacionària11,12,13. Tanmateix, les fases estacionàries RP no proporcionen una separació satisfactòria de pèptids i proteïnes a causa de la seva estructura complexa i naturalesa amfifílica14,15. Per tant, es requereixen fases estacionàries especialment dissenyades per analitzar pèptids i proteïnes amb grups polars i no polars per interactuar amb aquests analits i retenir-los16. La cromatografia de mode mixt, que proporciona interaccions multimodals, pot ser una alternativa a la RP-LC per a la separació de pèptids, proteïnes i altres mescles complexes. S'han preparat diverses fases estacionàries de mode mixt i s'han utilitzat columnes empaquetades amb aquestes fases per a separacions de pèptids i proteïnes17,18,19,20,21. Les fases estacionàries de mode mixt (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalació polar/RPLC) són adequades per a separacions de pèptids i proteïnes a causa de la presència de components polars i no polars. grups22,23,24,25,26,27,28. De la mateixa manera, les fases estacionàries intercalants polars amb grups polars units covalentment mostren un bon poder de separació i una selectivitat única per a analits polars i no polars, ja que la separació depèn de la interacció entre l'analit i la fase estacionària. Interaccions multimodals 29, 30, 31, 32. Recentment, Zhang et al. 30 van preparar una fase estacionària de poliamina terminada en dodecil i van separar amb èxit hidrocarburs, antidepressius, flavonoides, nucleòsids, estrògens i diversos altres analits. L'intercalador polar té grups polars i no polars, de manera que es pot utilitzar per separar pèptids i proteïnes que tenen grups hidròfobs i hidròfils. Les columnes incrustades polarment (per exemple, columnes C18 incrustades en amida) estan disponibles comercialment amb el nom comercial de columnes Ascentis Express RP-Amide, però aquestes columnes només s'utilitzen per a l'anàlisi de l'amina 33.
En l'estudi actual, es va preparar i avaluar una fase estacionària polarment incrustada (poliestirè incrustat en N-fenilmaleimida) per a la separació de pèptids i digerits de tripsina de HSA. La fase estacionària es va preparar utilitzant l'estratègia següent. Les partícules de sílice porosa es van preparar segons el procediment indicat a la nostra publicació anterior amb algunes modificacions al protocol de preparació. Es va ajustar la proporció d'urea, polietilenglicol (PEG), TMOS, aigua i àcid acètic per preparar partícules de sílice amb una mida de porus gran. En segon lloc, es va sintetitzar un nou lligand, fenilmaleimida-metilvinil isocianat, i es va utilitzar per derivatitzar partícules de sílice per preparar una fase estacionària polarment incrustada. La fase estacionària resultant es va envasar en una columna d'acer inoxidable (100 × 1,8 mm de diàmetre interior) utilitzant l'esquema d'envasament optimitzat. L'envasament de la columna s'ajuda amb vibració mecànica per garantir que es formi un llit homogeni dins de la columna. Avaluar la separació de la columna envasada de mescles de pèptids que consisteixen en cinc pèptids; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) i digestió amb tripsina d'albúmina sèrica humana (HAS). Es va observar que la barreja de pèptids i la digestió amb tripsina de HSA se separaven amb bona resolució i eficiència. El rendiment de separació de la columna PMP es va comparar amb el de la columna Ascentis Express RP-Amide. Es va observar que tant els pèptids com les proteïnes estaven ben resolts i eren eficients a la columna PMP, que era més eficient que la columna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicol), urea, àcid acètic, trimetoxi ortosilicat (TMOS), trimetilclorosilà (TMCS), tripsina, albúmina sèrica humana (HSA), clorur d'amoni, urea, hexà metildisilazà (HMDS), clorur de metacriloil (MC), estirè, 4-hidroxi-TEMPO, peròxid de benzoil (BPO), acetonitril de grau HPLC (ACN), metanol, 2-propanol i acetona. Comprats a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Es va agitar durant 10 minuts una barreja d'urea (8 g), polietilenglicol (8 g) i 8 mL d'àcid acètic 0,01 N, i després s'hi van afegir 24 mL de TMOS en condicions de gel. La barreja de reacció es va escalfar a 40 °C durant 6 hores i després a 120 °C durant 8 hores en un autoclau d'acer inoxidable. Es va vessar l'aigua i el material residual es va assecar a 70 °C durant 12 hores. La massa tova seca es va moldre suaument en un forn i es va calcinar a 550 °C durant 12 hores. Es van preparar i caracteritzar tres lots per examinar la reproductibilitat en la mida de partícula, la mida dels porus i la superfície.
Mitjançant la modificació superficial de partícules de sílice amb el lligand fenilmaleimida-metilvinilisocianat (PCMP) presintetitzat seguit de polimerització radial amb estirè, es va preparar un compost que conté un grup polar. Fase estacionària per a agregats i cadenes de poliestirè. El procés de preparació es descriu a continuació.
Es van dissoldre N-fenilmaleimida (200 mg) i isocianat de metilvinil (100 mg) en toluè sec, i es van afegir 0,1 mL de 2,2′-azoisobutironitril (AIBN) al matràs de reacció per preparar el copolímer de fenilmaleimida-isocianat de metilvinil (PMCP). La mescla es va escalfar a 60 °C durant 3 hores, es va filtrar i es va assecar en un forn a 40 °C durant 3 hores.
Les partícules de sílice seques (2 g) es van dispersar en toluè sec (100 mL), es van agitar i es van sonicar en un matràs de fons rodó de 500 mL durant 10 min. El PMCP (10 mg) es va dissoldre en toluè i es va afegir gota a gota al matràs de reacció mitjançant un embut de degoteig. La mescla es va refluir a 100 °C durant 8 hores, es va filtrar i es va rentar amb acetona i es va assecar a 60 °C durant 3 hores. A continuació, les partícules de sílice unides a PMCP (100 g) es van dissoldre en toluè (200 ml) i es va afegir 4-hidroxi-TEMPO (2 mL) en presència de 100 µL de dilaurat de dibutilenyó com a catalitzador. La mescla es va agitar a 50 °C durant 8 hores, es va filtrar i es va assecar a 50 °C durant 3 hores.
L'estirè (1 mL), el peròxid de benzoil BPO (0,5 mL) i les partícules de sílice unides a TEMPO-PMCP (1,5 g) es van dispersar en toluè i es van purgar amb nitrogen. La polimerització de l'estirè es va dur a terme a 100 °C durant 12 hores. El producte resultant es va rentar amb metanol i es va assecar a 60 °C durant la nit. L'esquema general de la reacció es mostra a la Figura 1.
Les mostres es van desgasificar a 393 K durant 1 hora per obtenir una pressió residual inferior a 10-3 Torr. La quantitat de N2 adsorbida a una pressió relativa de P/P0 = 0,99 es va utilitzar per determinar el volum total de porus. La morfologia de les partícules de sílice nues i unides a lligands es va examinar amb microscòpia electrònica de rastreig (Hitachi High Technologies, Tòquio, Japó). Les mostres assecades (sílice nua i partícules de sílice unides a lligands) es van col·locar en una columna d'alumini utilitzant cinta adhesiva de carboni. Es va xapar or a les mostres utilitzant un recobridor de pulverització catòdica Q150T i es va dipositar una capa d'Au de 5 nm sobre les mostres. Això millora l'eficiència del procés utilitzant baixos voltatges i proporciona una pulverització catòdica freda de gra fi. Es va utilitzar un analitzador elemental Thermo Electron (Waltham, MA, EUA) Flash EA1112 per a l'anàlisi elemental. Es va utilitzar un analitzador de mida de partícules Malvern (Worcestershire, Regne Unit) Mastersizer 2000 per obtenir la distribució de la mida de les partícules. Partícules de sílice nues i Les partícules de sílice unides a lligands (5 mg cadascuna) es van dispersar en 5 mL d'isopropanol, es van sonicar durant 10 min, es van vortexar durant 5 min i es van col·locar al banc òptic del Mastersizer. L'anàlisi termogravimètrica es va realitzar a una velocitat de 5 °C per minut en un rang de temperatura de 30 a 800 °C.
Es van empaquetar columnes d'acer inoxidable de diàmetre estret amb revestiment de vidre de dimensions (100 × 1,8 mm de diàmetre interior) mitjançant el mètode d'embalatge de fangs, aplicant el mateix procediment utilitzat a la Ref. 31. Una columna d'acer inoxidable (revestida de vidre, 100 × 1,8 mm de diàmetre interior) amb un raccord de sortida que conté una frita d'1 µm es va connectar a un obturador de suspensió (Alltech Deerfield, IL, EUA). Es va preparar una suspensió de fase estacionària suspenent 150 mg de fase estacionària en 1,2 mL de metanol i enviar-la a la columna d'emmagatzematge. Es va utilitzar metanol com a dissolvent de la suspensió, així com com a dissolvent propulsor. S'omplia la columna seqüencialment aplicant pressions de 100 MP durant 10 minuts, 80 MP durant 15 minuts i 60 MP durant 30 minuts. Durant l'ompliment, es va aplicar vibració mecànica amb dos agitadors de columna GC (Alltech, Deerfield, IL, EUA) per garantir un ompliment uniforme de la columna. Tanqueu l'omplidor de suspensió i allibereu la pressió lentament per evitar qualsevol dany dins de la columna. Desconnecteu la columna de la unitat d'ompliment de suspensió i connecteu un altre raccord a l'entrada i al sistema LC per comprovar-ne el rendiment.
Es va construir una bomba LC (10AD Shimadzu, Japó), un injector (Valco (EUA) C14 W.05) amb un bucle d'injecció de 50 nL, un desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A), una finestra capil·lar UV-VIS, un detector de dispositiu µLC especial (UV-2075) i microcolumnes revestides de vidre. Es va utilitzar un tub de connexió molt estret i curt per minimitzar l'efecte de l'eixamplament addicional de la banda de la columna. Després de l'empaquetament, es van instal·lar capil·lars (50 μm de diàmetre interior 365) i capil·lars d'unió reductora (50 μm) a la sortida d'1/16″ de la unió reductora. La recollida de dades i el processament cromatogràfic es van dur a terme mitjançant el programari Multichro 2000. El seguiment a 254 nm. Els analits es van analitzar per a l'absorbància UV. Les dades cromatogràfiques van ser analitzades per OriginPro8 (Northampton, MA).
Albúmina de sèrum humà, pols liofilitzada, ≥ 96% (electroforesi en gel d'agarosa) 3 mg barrejada amb tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL) i bicarbonat d'amoni 0,2 M (1 mL). La solució es va agitar durant 10 minuts i es va mantenir en un bany d'aigua a 37 °C durant 6 hores, i després es va apagar amb 1 mL de TFA al 0,1%. Filtreu la solució i guardeu-la per sota de 4 °C.
La separació de mescles de pèptids i digests de tripsina HSA es va avaluar per separat en columnes PMP. Comproveu la separació de la mescla de pèptids i el digest de tripsina HSA per la columna PMP i compareu els resultats amb la columna Ascentis Express RP-Amide. El nombre de placa teòric es calcula de la següent manera:
Les imatges SEM de partícules de sílice nues i partícules de sílice unides a lligands es mostren a la FIG. 2. Les imatges SEM de partícules de sílice nues (A, B) mostren que, a diferència dels nostres estudis anteriors, aquestes partícules són esfèriques, en què les partícules són allargades o tenen simetria irregular. La superfície de les partícules de sílice unides a lligands (C, D) és més llisa que la de les partícules de sílice nues, cosa que pot ser deguda al recobriment de cadenes de poliestirè a la superfície de les partícules de sílice.
Imatges de microscopi electrònic de rastreig de partícules de sílice nues (A, B) i partícules de sílice unides a lligands (C, D).
Les distribucions de mida de partícula de partícules de sílice nues i partícules de sílice unides a lligands es mostren a la Figura 3(A). Les corbes de distribució de mida de partícula basades en el volum van mostrar que la mida de les partícules de sílice va augmentar després de la modificació química (Fig. 3A). Les dades de distribució de mida de partícula de les partícules de sílice de l'estudi actual i de l'estudi anterior es comparen a la Taula 1(A). La mida de partícula basada en el volum, d(0,5), de PMP és de 3,36 μm, en comparació amb el nostre estudi anterior amb un valor ad(0,5) de 3,05 μm (partícules de sílice unides a poliestirè)34. Aquest lot tenia una distribució de mida de partícula més estreta en comparació amb el nostre estudi anterior a causa de les proporcions variables de PEG, urea, TMOS i àcid acètic a la mescla de reacció. La mida de partícula de la fase PMP és lleugerament més gran que la de la fase de partícules de sílice unides a poliestirè que vam estudiar anteriorment. Això significa que la funcionalització superficial de les partícules de sílice amb estirè només va dipositar una capa de poliestirè (0,97 µm) a la superfície de sílice, mentre que a la fase PMP El gruix de la capa era d'1,38 µm.
Distribució de la mida de les partícules (A) i distribució de la mida dels porus (B) de les partícules de sílice nues i les partícules de sílice unides a lligands.
La mida dels porus, el volum dels porus i la superfície de les partícules de sílice de l'estudi actual es mostren a la Taula 1(B). Els perfils de PSD de les partícules de sílice nues i les partícules de sílice unides a lligands es mostren a la Figura 3(B). Els resultats són comparables al nostre estudi anterior. Les mides dels porus de les partícules de sílice nues i unides a lligands són 310 i 241, respectivament, cosa que indica que la mida dels porus disminueix en 69 després de la modificació química, com es mostra a la Taula 1(B), i el canvi de la corba es mostra a la Fig. 3(B). De la mateixa manera, el volum dels porus de les partícules de sílice va disminuir de 0,67 a 0,58 cm3/g després de la modificació química. La superfície específica de les partícules de sílice estudiades actualment és de 116 m2/g, cosa que és comparable al nostre estudi anterior (124 m2/g). Com es mostra a la Taula 1(B), la superfície (m2/g) de les partícules de sílice també va disminuir de 116 m2/g a 105 m2/g després de la modificació química. modificació.
Els resultats de l'anàlisi elemental de la fase estacionària es mostren a la Taula 2. La càrrega de carboni de la fase estacionària actual és del 6,35%, que és inferior a la càrrega de carboni del nostre estudi anterior (partícules de sílice enllaçades amb poliestirè, 7,93%35 i 10,21%, respectivament)42. La càrrega de carboni de la fase estacionària actual és baixa, ja que en la preparació de l'SP actual, a més de l'estirè, es van utilitzar alguns lligands polars com el fenilmaleimida-metilvinilisocianat (PCMP) i el 4-hidroxi-TEMPO. El percentatge en pes de nitrogen de la fase estacionària actual és del 2,21%, en comparació amb el 0,1735 i el 0,85% en pes de nitrogen en estudis anteriors, respectivament. Això significa que el percentatge en pes de nitrogen és més alt a la fase estacionària actual a causa de la fenilmaleimida. De la mateixa manera, les càrregues de carboni dels productes (4) i (5) van ser del 2,7% i el 2,9%, respectivament, mentre que la càrrega de carboni del producte final... El producte (6) va ser del 6,35%, tal com es mostra a la Taula 2. La pèrdua de pes es va comprovar amb la fase estacionària PMP, i la corba TGA es mostra a la Figura 4. La corba TGA mostra una pèrdua de pes del 8,6%, que concorda amb la càrrega de carboni (6,35%) perquè els lligands contenen no només C sinó també N, O i H.
El lligand fenilmaleimida-metilvinilisocianat es va escollir per a la modificació superficial de partícules de sílice perquè té grups fenilmaleimida polars i grups vinilisocianat. Els grups isocianat de vinil poden reaccionar encara més amb l'estirè mitjançant la polimerització radicalària viva. La segona raó és inserir un grup que tingui una interacció moderada amb l'analit i cap interacció electrostàtica forta entre l'analit i la fase estacionària, ja que la fracció fenilmaleimida no té càrrega virtual a pH normal. La polaritat de la fase estacionària es pot controlar mitjançant la quantitat òptima d'estirè i el temps de reacció de la polimerització radicalària. L'últim pas de la reacció (polimerització radicalària) és crític i pot canviar la polaritat de la fase estacionària. Es va realitzar una anàlisi elemental per comprovar la càrrega de carboni d'aquestes fases estacionàries. Es va observar que augmentar la quantitat d'estirè i el temps de reacció augmentava la càrrega de carboni de la fase estacionària i viceversa. Els SP preparats amb diferents concentracions d'estirè tenen diferents càrregues de carboni. De nou, carregueu aquestes fases estacionàries en columnes d'acer inoxidable i comproveu la seva cromatografia. rendiment (selectivitat, resolució, valor N, etc.). A partir d'aquests experiments, es va seleccionar una formulació optimitzada per preparar la fase estacionària PMP per garantir una polaritat controlada i una bona retenció de l'analit.
També es van avaluar cinc mescles de pèptids (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) mitjançant una columna PMP amb una fase mòbil; 60/40 (v/v) acetonitril/aigua (0,1% TFA) a un cabal de 80 μL/min. En condicions d'elució òptimes, el nombre teòric de plaques (N) per columna (100 × 1,8 mm diàmetre interior) és de 20.000 ± 100 (200.000 plaques/m²). La taula 3 mostra els valors de N per a les tres columnes PMP i els cromatogrames es mostren a la figura 5A. Anàlisi ràpida en una columna PMP a un cabal elevat (700 μL/min), es van eluir cinc pèptids en un minut, els valors de N van ser molt bons, 13.500 ± 330 per columna (100 × 1,8 mm diàmetre interior), correspon a 135.000 plaques/m (figura 5B). Es van omplir tres columnes de mida idèntica (100 × 1,8 mm diàmetre interior) amb tres lots diferents de fase estacionària PMP per comprovar la reproductibilitat. El La concentració d'anàlit per a cada columna es va registrar utilitzant les condicions d'elució òptimes i el nombre de plats teòrics N i el temps de retenció per separar la mateixa mescla de prova a cada columna. Les dades de reproductibilitat per a les columnes PMP es mostren a la Taula 4. La reproductibilitat de la columna PMP es correlaciona bé amb valors molt baixos de %RSD, com es mostra a la Taula 3.
Separació de la barreja de pèptids a la columna PMP (B) i a la columna Ascentis Express RP-Amide (A); fase mòbil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensions de la columna PMP (100 × 1,8 mm diàmetre interior); analítica. L'ordre d'elució dels compostos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (leucina) (encefalina àcida).
Es va avaluar una columna PMP (100 × 1,8 mm de diàmetre interior) per a la separació de digests tríptics d'albúmina sèrica humana en cromatografia líquida d'alta resolució. El cromatograma de la Figura 6 mostra que la mostra està ben separada i la resolució és molt bona. Els digests d'HSA es van analitzar utilitzant un cabal de 100 µL/min, fase mòbil 70/30 acetonitril/aigua i 0,1% de TFA. Com es mostra al cromatograma (Figura 6), la digestió d'HSA s'ha dividit en 17 pics corresponents a 17 pèptids. Es va calcular l'eficiència de separació de cada pic en el digest d'HSA i els valors es donen a la Taula 5.
Es va separar un digestat tríptic d'HSA (100 × 1,8 mm de diàmetre interior) en una columna PMP; cabal (100 µL/min), fase mòbil 60/40 acetonitril/aigua amb 0,1% de TFA.
on L és la longitud de la columna, η és la viscositat de la fase mòbil, ΔP és la contrapressió de la columna i u és la velocitat lineal de la fase mòbil. La permeabilitat de la columna PMP era de 2,5 × 10-14 m2, el cabal era de 25 μL/min i es va utilitzar ACN/aigua 60/40 v/v. La permeabilitat de la columna PMP (100 × 1,8 mm diàmetre interior) era similar a la del nostre estudi anterior Ref.34. La permeabilitat de la columna plena de partícules superficialment poroses és: 1,7 × 10-15 per a partícules d'1,3 μm, 3,1 × 10-15 per a partícules d'1,7 μm, 5,2 × 10-15 i 2,5 × 10-14 m2 per a partícules de 2,6 μm. Per a partícules de 5 μm 43. Per tant, la permeabilitat de la fase PMP és similar a la de les partícules de nucli-cortical de 5 μm.
on Wx és el pes de la columna plena de cloroform, Wy és el pes de la columna plena de metanol i ρ és la densitat del dissolvent. Les densitats de metanol (ρ = 0,7866) i cloroform (ρ = 1,484). La porositat total de les columnes SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm diàmetre interior) 34 i les columnes C18-Urea 31 que hem estudiat anteriorment van ser de 0,63 i 0,55, respectivament. Això significa que la presència de lligands d'urea redueix la permeabilitat de la fase estacionària. D'altra banda, la porositat total de la columna PMP (100 × 1,8 mm diàmetre interior) és de 0,60. La permeabilitat de les columnes PMP és inferior a la de les columnes plenades de partícules de sílice amb enllaços C18 perquè en les fases estacionàries de tipus C18 els lligands C18 estan units a les partícules de sílice com a cadenes lineals, mentre que en les fases estacionàries de tipus poliestirè, la capa de polímer relativament gruixuda és format al seu voltant. En un experiment típic, la porositat de la columna es calcula com:
Les figures 7A i 7B mostren la columna PMP (100 × 1,8 mm de diàmetre interior) i la columna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm de diàmetre interior) utilitzant les mateixes condicions d'elució (és a dir, 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA) del gràfic de van Deemter. Les mescles de pèptids seleccionades (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) es van preparar en 20 µL. El cabal mínim per a ambdues columnes és de 800 µL/min. Els valors mínims d'HETP al cabal òptim (80 µL/min) per a la columna PMP i la columna Ascentis Express RP-Amide van ser de 2,6 µm i 3,9 µm, respectivament. Els valors d'HETP indiquen que l'eficiència de separació de la columna PMP (100 × 1,8 mm diametre interior) és molt millor que la de la columna Ascentis Express RP-Amide disponible comercialment (100 × 1,8 mm diametre interior). El diagrama de van Deemter de la figura 7(A) mostra que la disminució del valor de N amb l'augment del cabal no és significativa en comparació amb el nostre estudi anterior. La major eficiència de separació de la columna PMP (100 × 1,8 mm diametre interior) en comparació a la columna Ascentis Express RP-Amide es basa en millores en la forma i la mida de les partícules i els procediments complexos d'ompliment de columnes utilitzats en el treball actual34.
(A) Gràfic de van Deemter (HETP versus velocitat lineal de la fase mòbil) obtingut utilitzant una columna PMP (100 × 1,8 mm diametre interior) en 60/40 ACN/H2O amb 0,1% de TFA. (B) Gràfic de van Deemter (HETP versus velocitat lineal de la fase mòbil) obtingut utilitzant una columna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm diametre interior) en 60/40 ACN/H2O amb 0,1% de TFA.
Es va preparar i avaluar una fase estacionària de poliestirè incrustat polarment per a la separació de mescles de pèptids sintètics i digerits de tripsina d'albúmina sèrica humana (HAS) en cromatografia líquida d'alta resolució. El rendiment cromatogràfic de les columnes PMP per a mescles de pèptids és excel·lent en eficiència i resolució de separació. El rendiment de separació millorat de les columnes PMP es deu a diverses raons, com ara la mida de les partícules i la mida dels porus de les partícules de sílice, la síntesi controlada de la fase estacionària i l'ompliment complex de la columna. A més de l'alta eficiència de separació, la baixa pressió posterior de la columna a cabals elevats és un altre avantatge d'aquesta fase estacionària. Les columnes PMP presenten una bona reproductibilitat i es poden utilitzar per a l'anàlisi de mescles de pèptids i la digestió amb tripsina de diverses proteïnes. Tenim la intenció d'utilitzar aquesta columna per a la separació de productes naturals, compostos bioactius de plantes medicinals i extractes de fongs en cromatografia líquida. En el futur, les columnes PMP també s'avaluaran per a la separació de proteïnes i anticossos monoclonals.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Recerca sobre sistemes de separació de pèptids mitjançant cromatografia de fase inversa. Part I: Desenvolupament d'un protocol de caracterització de columnes. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Pèptids actius millorats dissenyats per al tractament de malalties infeccioses. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. i Khrestchatisky, M. Pèptids terapèutics sintètics: ciència i mercat. *drug discovery*. 15 (1-2) avui, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Cromatografia líquida proteòmica avançada. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. La cromatografia líquida avançada amb espectrometria de masses permet la incorporació de metabolòmica i proteòmica d'àmplia elecció. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ El paper de la UHPLC en el desenvolupament de fàrmacs. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. i Clausen, AM Aspectes fonamentals i pràctics de la cromatografia líquida d'ultraalta pressió per a separacions ràpides. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA i Tchelitcheff, P. Aplicació de la cromatografia líquida d'ultraalta resolució en el desenvolupament de fàrmacs. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogels macroporosos monolítics preparats a partir d'emulsions d'alta fase interna d'oli en aigua per a la purificació eficient d'enterovirus. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA. El paper de la cromatografia líquida en la proteòmica. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. i Guillarme, D. Tendències emergents en les separacions per cromatografia líquida en fase inversa de pèptids i proteïnes terapèutics: teoria i aplicacions. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC. Separació bidimensional de pèptids mitjançant un sistema RP-RP-HPLC utilitzant diferents valors de pH en la primera i segona dimensió de separació. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Es van investigar les característiques de transferència de massa i el rendiment cinètic de columnes cromatogràfiques d'alta eficiència empaquetades amb partícules C18 sub-2 μm totalment i superficialment poroses. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tendències recents i reptes analítics en l'aïllament, la identificació i la validació de pèptids bioactius vegetals. anus. anus biological. Chemical. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. El paisatge proteòmic del regne de la vida. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Processament posterior de pèptids terapèutics mitjançant cromatografia líquida preparativa. Molecule (Basel, Suïssa) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. i Geng, X. Cromatografia de mode mixt i la seva aplicació als biopolímers. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. i Sun, Y. Lligands per a cromatografia de proteïnes en mode mixt: principi, caracterització i disseny. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).