Gràcies per visitar Nature.com. Esteu utilitzant una versió del navegador amb compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). A més, per garantir una assistència contínua, mostrem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositives alhora. Feu servir els botons Anterior i Següent per moure's per tres diapositives alhora o feu servir els botons lliscants del final per moure's per tres diapositives alhora.
Es van preparar partícules de sílice porosa mitjançant el mètode sol-gel amb algunes modificacions per obtenir partícules de porus amples. Aquestes partícules es van derivatitzar amb N-fenilmaleimida-metilvinil isocianat (PMI) i estirè mitjançant polimerització de fragmentació de transferència de cadena inversa (RAFT) per produir poliamides intercalades amb N-fenilmaleimida. Fase estacionària d'estirè (PMP). Les columnes d'acer inoxidable de diàmetre estret (100 × 1,8 mm de diàmetre interior) es van omplir amb un farciment de suspensió. Es va avaluar el rendiment cromatogràfic de la columna PMP per separar una barreja de pèptids sintètics que consistia en cinc pèptids (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminoàcid encefalina) i hidrolitzat tríptic d'albúmina sèrica humana (HAS). En condicions d'elució òptimes, el nombre teòric de plaques amb una barreja de pèptids va arribar a 280.000 plaques/m². En comparar el rendiment de separació de la columna desenvolupada amb la columna comercial Ascentis Express RP-Amide, es va observar que l'eficiència de separació de la columna PMP era superior a la columna comercial pel que fa a l'eficiència i la resolució de separació.
La indústria biofarmacèutica s'ha convertit en un mercat global en expansió amb un augment significatiu de la quota de mercat en els darrers anys. Amb el creixement explosiu de la indústria biofarmacèutica1,2,3 hi ha una gran necessitat d'anàlisi de pèptids i proteïnes. A més del pèptid diana, es formen diverses impureses durant la síntesi de pèptids, per la qual cosa es requereix una purificació cromatogràfica per obtenir la puresa desitjada del pèptid. L'anàlisi i la caracterització de proteïnes en fluids corporals, teixits i cèl·lules és una tasca extremadament difícil a causa del gran nombre d'espècies potencialment detectables presents en una sola mostra. Tot i que l'espectrometria de masses és una eina eficaç per seqüenciar pèptids i proteïnes, si aquestes mostres s'introdueixen directament a l'espectròmetre de masses, la separació no serà satisfactòria. Aquest problema es pot resoldre realitzant cromatografia líquida (LC) abans de l'anàlisi MS, cosa que reduirà la quantitat d'anàlits que entren a l'espectròmetre de masses en un moment determinat4,5,6. A més, els anàlits es poden concentrar en una regió estreta durant la separació en fase líquida, concentrant així aquests anàlits i augmentant la sensibilitat de la detecció MS. La cromatografia líquida (LC) ha avançat significativament durant l'última dècada i s'ha convertit en un mètode àmpliament utilitzat per a l'anàlisi proteòmica7,8,9,10.
La cromatografia líquida de fase inversa (RP-LC) s'utilitza àmpliament per purificar i separar mescles de pèptids utilitzant sílice modificada amb octadecil (ODS) com a fase estacionària11,12,13. Tanmateix, a causa de la seva estructura complexa i naturalesa amfòtera,14,15 les fases estacionàries RP no poden proporcionar una separació satisfactòria de pèptids i proteïnes. Per tant, l'anàlisi de pèptids i proteïnes amb fragments polars i no polars requereix fases estacionàries especialment dissenyades per interactuar i retenir aquests analits16. La cromatografia mixta, que ofereix interaccions multimodals, pot ser una alternativa a la RP-LC per separar pèptids, proteïnes i altres mescles complexes. Es van preparar diverses fases estacionàries de tipus mixt i es van utilitzar columnes omplides amb aquestes fases estacionàries per separar pèptids i proteïnes17,18,19,20,21. A causa de la presència de grups polars i no polars, les fases estacionàries de mode mixt (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalació polar/RPLC) són adequades per a la separació de pèptids i proteïnes22,23,24,25,26,27,28. , les fases estacionàries intercalades polars amb grups polars units covalentment mostren bones capacitats de separació i una selectivitat única per a analits polars i no polars, ja que la separació depèn de la interacció entre l'analit i la fase estacionària. Interaccions multimodals29,30,31,32. Recentment, Zhang et al.30 van obtenir fases estacionàries de poliamines acabades en behenil i van separar amb èxit hidrocarburs, antidepressius, flavonoides, nucleòsids, estrògens i alguns altres analits. El material estacionari incrustat polar té grups polars i no polars, de manera que es pot utilitzar per separar pèptids i proteïnes en parts hidrofòbiques i hidrofíliques. Les columnes polars en línia (per exemple, columnes C18 amb amida en línia) estan disponibles amb el nom comercial de columnes Ascentis Express RP-Amide, però aquestes columnes només s'han utilitzat per a l'anàlisi de l'amina 33.
En l'estudi actual, es va preparar una fase estacionària d'incrustació polar (N-fenilmaleimida, poliestirè d'incrustació) i es va avaluar per a la separació de pèptids i l'escissió de HSA tríptica. Es va utilitzar la següent estratègia per preparar la fase estacionària. Les partícules de sílice porosa es van preparar segons els procediments descrits a les nostres publicacions anteriors, amb alguns canvis en els esquemes de preparació 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Es van ajustar les proporcions d'urea, polietilenglicol (PEG), TMOS i àcid aquós-acètic per obtenir partícules de sílice amb porus de grans mides. En segon lloc, es va sintetitzar un nou lligand fenilmaleimida-metilvinil isocianat i les seves partícules de sílice derivatitzades es van utilitzar per preparar fases estacionàries incrustades polars. La fase estacionària obtinguda es va empaquetar en una columna d'acer inoxidable (diàmetre interior 100 × 1,8 mm) segons un esquema d'empaquetament optimitzat. L'empaquetament de la columna s'ajuda mitjançant vibració mecànica per garantir una capa uniforme dins de la columna. La columna empaquetada es va avaluar per a la separació d'una barreja de pèptids que consistia en cinc pèptids (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, pèptid de leucina-encefalina) i hidrolitzats tríptics d'albúmina sèrica humana (HSA). Es va observar que la barreja de pèptids i el digest tríptic d'HSA es van separar amb bona resolució i eficiència. L'eficiència de separació de la columna PMP es va comparar amb la de la columna Ascentis Express RP-Amide. Es va observar que els pèptids i les proteïnes tenen una bona resolució i una alta eficiència de separació a la columna PMP, i l'eficiència de separació de la columna PMP és superior a la de la columna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicol), urea, àcid acètic, trimetoxiortosilicat (TMOS), trimetilclorosilà (TMCS), tripsina, albúmina sèrica humana (HSA), clorur d'amoni, urea, hexametilmetacriloildisilazà (HMDS), clorur de metacriloil (MC), estirè, 4-hidroxi-TEMPO, peròxid de benzoil (BPO), acetonitril (ACN) per a HPLC, metanol, 2-propanol i acetona. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, EUA).
Es va agitar durant 10 minuts una barreja d'urea (8 g), polietilenglicol (8 g) i 8 ml d'àcid acètic 0,01 N, i s'hi van afegir 24 ml de TMOS refredant amb gel. La barreja de reacció es va escalfar a 40 °C durant 6 hores i després a 120 °C durant 8 hores en un autoclau d'acer inoxidable. L'aigua es va decantar i el residu es va assecar a 70 °C durant 12 hores. Els blocs tous assecats es van moldre suaument i es van calcinar en un forn a 550 °C durant 12 hores. Es van preparar i caracteritzar tres lots per provar la reproductibilitat de les mides de partícula, la mida dels porus i la superfície.
Grup polar i fase estacionària per a cadenes de poliestirè. El procediment de preparació es descriu a continuació.
Es van dissoldre N-fenilmaleimida (200 mg) i isocianat de metilvinil (100 mg) en toluè anhidre i, a continuació, es van afegir 0,1 ml de 2,2′-azoisobutironitril (AIBN) al matràs de reacció per obtenir un copolímer de fenilmaleimida i isocianat de metilvinil (PMCP). La mescla es va escalfar a 60 °C durant 3 hores, es va filtrar i es va assecar en un forn a 40 °C durant 3 hores.
Les partícules de sílice seques (2 g) es van dispersar en toluè sec (100 ml), es van agitar i es van sonicar durant 10 min en un matràs de fons rodó de 500 ml. El PMCP (10 mg) es va dissoldre en toluè i es va afegir gota a gota al matràs de reacció mitjançant un embut d'addició. La mescla es va refluir a 100 °C durant 8 hores, es va filtrar, es va rentar amb acetona i es va assecar a 60 °C durant 3 hores. A continuació, les partícules de sílice associades amb el PMCP (100 g) es van dissoldre en toluè (200 ml) i s'hi va afegir 4-hidroxi-TEMPO (2 ml) en presència de 100 μl de dilaurat de dibutilenyó com a catalitzador. La mescla es va agitar a 50 °C durant 8 hores, es va filtrar i es va assecar a 50 °C durant 3 hores.
L'estirè (1 ml), el peròxid de benzoil BPO (0,5 ml) i les partícules de sílice unides a TEMPO-PMCP (1,5 g) es van dispersar en toluè i es van purgar amb nitrogen. La polimerització de l'estirè es va dur a terme a 100 °C durant 12 hores. El producte resultant es va rentar amb metanol i es va assecar durant la nit a 60 °C. L'esquema general de la reacció es mostra a la figura 1.
Les mostres es van desgasificar a 393 K durant 1 h fins que es va obtenir una pressió residual inferior a 10–3 Torr. La quantitat de N2 adsorbida a la pressió relativa P/P0 = 0,99 es va utilitzar per determinar el volum total de porus. La morfologia de les partícules de sílice pura i unides a lligands es va examinar mitjançant un microscopi electrònic de rastreig (Hitachi High Technologies, Tòquio, Japó). Les mostres seques (sílice pura i partícules de sílice unides a lligands) es van col·locar sobre barres d'alumini mitjançant cinta de carboni. Es va dipositar or sobre la mostra mitjançant un dispositiu de pulverització catòdica Q150T i es va dipositar una capa d'Au de 5 nm de gruix sobre la mostra. Això millora l'eficiència del procés de baix voltatge i proporciona una polvorització en fred fina. L'anàlisi elemental es va realitzar mitjançant un analitzador de composició elemental Flash EA1112 de Thermo Electron (Waltham, MA, EUA). Es va utilitzar un analitzador de mida de partícules de Malvern (Worcestershire, Regne Unit) Mastersizer 2000 per obtenir la distribució de la mida de les partícules. Les partícules de sílice sense recobriment i les partícules de sílice unides a lligands (5 mg cadascuna) es van dispersar en 5 ml d'isopropanol, es van sonicar durant 10 minuts, es van agitar durant 5 minuts i es van col·locar en un banc òptic Mastersizer. L'anàlisi termogravimètrica es duu a terme a una velocitat de 5 °C per minut en el rang de temperatura de 30 a 800 °C.
Es van omplir columnes d'acer inoxidable de diàmetre estret amb revestiment de fibra de vidre i dimensions (ID 100 × 1,8 mm) mitjançant el mètode d'ompliment de suspensió seguint el mateix procediment que a la referència 31. Una columna d'acer inoxidable (amb revestiment de vidre, ID 100 × 1,8 mm) i una sortida que contenia una frita d'1 µm es van connectar a una màquina d'ompliment de suspensió (Alltech Deerfield, IL, EUA). Es va preparar una suspensió de la fase estacionària suspenent 150 mg de la fase estacionària en 1,2 ml de metanol i alimentant-la a una columna de dipòsit. Es va utilitzar metanol com a dissolvent de suspensió i dissolvent de control. Ompliu la columna aplicant una seqüència de pressió de 100 MP durant 10 min, 80 MP durant 15 min i 60 MP durant 30 min. El procés d'ompliment va utilitzar dos vibradors de columna de cromatografia de gasos (Alltech, Deerfield, IL, EUA) per a la vibració mecànica per garantir un ompliment uniforme de la columna. Tanqueu l'omplidor de suspensió i allibereu la pressió lentament per evitar danys a la cadena. La columna es va desconnectar de la boquilla de suspensió i es va connectar un altre accessori a l'entrada i al sistema LC per provar-ne el funcionament.
Es va construir un MLC personalitzat utilitzant una bomba LC (10AD Shimadzu, Japó), un mostrejador amb un bucle d'injecció de 50 nL (Valco (EUA) C14 W.05), un desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A) i una finestra capil·lar UV-VIS. Dispositiu detector (UV-2075) i microcolumna esmaltada. Utilitzeu tubs de connexió molt estrets i curts per minimitzar l'efecte de l'expansió addicional de la columna. Després d'omplir la columna, instal·leu un capil·lar (50 µm de diàmetre interior 365) a la sortida de la unió reductora d'1/16″ i instal·leu un capil·lar (50 µm) de la unió reductora. La recollida de dades i el processament del cromatograma es realitzen mitjançant el programari Multichro 2000. A 254 nm, l'absorbància UV dels analits subjectes es va controlar a 0. Les dades cromatogràfiques es van analitzar mitjançant OriginPro8 (Northampton, MA).
Albúmina sèrica humana, pols liofilitzada, ≥ 96% (electroforesi en gel d'agarosa) 3 mg barrejada amb tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 ml) i bicarbonat d'amoni 0,2 M (1 ml). La solució es va agitar durant 10 min i es va mantenir en un bany d'aigua a 37 °C durant 6 h, i després es va apagar amb 1 ml de TFA al 0,1%. Es va filtrar la solució i es va emmagatzemar per sota de 4 °C.
La separació d'una mescla de pèptids i HSA de digestió tríptica en una columna PMP es va avaluar per separat. Comproveu la hidròlisi tríptica d'una mescla de pèptids i HSA separats per una columna PMP i compareu els resultats amb una columna Ascentis Express RP-Amide. El nombre de plats teòrics es calcula mitjançant l'equació següent:
Les imatges SEM de partícules de sílice pura i partícules de sílice unides al lligand es mostren a la Figura 2. Les imatges SEM de partícules de sílice pura (A, B) mostren una forma esfèrica en què les partícules són allargades o tenen simetria irregular en comparació amb els nostres estudis anteriors. La superfície de les partícules de sílice unides pel lligand (C, D) és més llisa que la de les partícules de sílice pura, cosa que pot ser deguda a les cadenes de poliestirè que recobreixen la superfície de les partícules de sílice.
Micrografies electròniques de rastreig de partícules de sílice pura (A, B) i partícules de sílice unides a lligands (C, D).
La distribució de la mida de les partícules de sílice pura i de les partícules de sílice unides a lligands es mostra a la figura 2.3(A). Les corbes de distribució de la mida de les partícules volumètriques van mostrar que la mida de les partícules de sílice va augmentar després de la modificació química (figura 3A). Les dades de distribució de la mida de les partícules de sílice de l'estudi actual i de l'estudi anterior es comparen a la taula 1(A). La mida de les partícules volumètriques d(0,5) de PMP va ser de 3,36 µm, en comparació amb el valor ad(0,5) de 3,05 µm del nostre estudi anterior (partícules de sílice unides a poliestirè)34. A causa del canvi en la proporció de PEG, urea, TMOS i àcid acètic a la mescla de reacció, la distribució de la mida de les partícules d'aquest lot va ser més estreta en comparació amb el nostre estudi anterior. La mida de les partícules de la fase PMP és lleugerament més gran que la de la fase de partícules de sílice unides a poliestirè que vam estudiar anteriorment. Això significa que la funcionalització superficial de partícules de sílice amb estirè va dipositar només una capa de poliestirè (0,97 µm) sobre la superfície de sílice, mentre que en la fase PMP el gruix de la capa era d'1,38 µm.
Distribució de la mida de les partícules (A) i distribució de la mida dels porus (B) de partícules de sílice pura i partícules de sílice unides a lligands.
La mida dels porus, el volum dels porus i la superfície de les partícules de sílice utilitzades en aquest estudi es mostren a la Taula 1 (B). Els perfils de PSD de les partícules de sílice pura i les partícules de sílice unides a lligands es mostren a les Figs. 3 (B). Els resultats van ser comparables al nostre estudi anterior34. Les mides dels porus de les partícules de sílice pura i unides a lligands van ser de 310 Å i 241 Å, respectivament, cosa que indica que després de la modificació química, la mida dels porus va disminuir en 69 Å, com es mostra a la Taula 1 (B), i la corba de desplaçament es mostra a la Fig. La superfície específica de les partícules de sílice en l'estudi actual és de 116 m2/g, cosa que és comparable al nostre estudi anterior (124 m2/g). Com es mostra a la Taula 1 (B), la superfície (m2/g) de les partícules de sílice després de la modificació química també va disminuir de 116 m2/g a 105 m2/g.
Els resultats de l'anàlisi elemental de la fase estacionària es presenten a la Taula 2. El contingut de carboni de la fase estacionària actual és del 6,35%, que és inferior al del nostre estudi anterior (partícules de sílice associades amb poliestirè, 7,93%35 i 10,21%, respectivament)42. El contingut de carboni de la fase estacionària actual es mostra a continuació, ja que alguns lligands polars com el metilvinil isocianat de fenilmaleimida (PCMP) i el 4-hidroxi-TEMPO s'han utilitzat a més de l'estirè en la preparació de SP. El percentatge en pes de nitrogen en la fase estacionària actual és del 2,21% en comparació amb el 0,1735 i el 0,85% en estudis anteriors42. Això significa que la fase estacionària actual té un alt percentatge en pes de nitrogen a causa de la fenilmaleimida. De la mateixa manera, els productes (4) i (5) tenen un contingut de carboni del 2,7% i el 2,9%, respectivament, mentre que el producte final (6) té un contingut de carboni del 6,35%, tal com es mostra a la Taula 2. Es va utilitzar una anàlisi termogravimètrica (TGA) a la fase estacionària de PMP per provar la pèrdua de pes, i la corba TGA es mostra a la Figura 4. La corba TGA mostra una pèrdua de pes del 8,6%, que concorda amb el contingut de carboni (6,35%), ja que els lligands contenen no només C, sinó també N, O i H.
El lligand fenilmaleimida-metilvinil isocianat es va escollir per modificar la superfície de les partícules de sílice a causa dels seus grups polars fenilmaleimida i vinilisocianat. Els grups isocianat de vinil poden reaccionar encara més amb l'estirè mitjançant la polimerització radicalària viva. El segon motiu és inserir un grup que tingui interaccions moderades amb l'analit i no hi hagi interaccions electrostàtiques fortes entre l'analit i la fase estacionària, ja que la fracció fenilmaleimida no té càrrega virtual a pH normal. La polaritat de la fase estacionària es pot controlar mitjançant la quantitat òptima d'estirè i el temps de reacció de la polimerització radicalària. El pas final de la reacció (polimerització radicalària) és crític, ja que canvia la polaritat de la fase estacionària. Es va dur a terme una anàlisi elemental per comprovar el contingut de carboni en aquestes fases estacionàries. S'ha observat que augmentar la quantitat d'estirè i el temps de reacció augmenta el contingut de carboni de la fase estacionària i viceversa. Els SP preparats amb diferents concentracions d'estirè tenen diferents càrregues de carboni. De la mateixa manera, aquestes fases estacionàries es van col·locar en columnes d'acer inoxidable i es van comprovar les seves característiques cromatogràfiques (selectivitat, resolució, valor N, etc.). A partir d'aquests experiments, es va triar una composició optimitzada per a la preparació de la fase estacionària PMP per proporcionar una polaritat controlada i una bona retenció de l'analit.
La columna PMP també es va avaluar per a l'anàlisi de cinc mescles de pèptids (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina-encefalina) utilitzant la capacitat de la fase mòbil. 60/40 (v/v) ACN/aigua (0,1% TFA) a un cabal de 80 µl/min. En condicions d'elució òptimes (200.000 plaques/m), el nombre de plaques teòriques (N) per columna (100 × 1,8 mm) és de 20.000 ± 100. Els valors de N per a les tres columnes PMP es mostren a la Taula 3 i els cromatogrames es mostren a la Figura 5A. Anàlisi ràpida a un cabal elevat (700 µl/min) en una columna PMP, cinc pèptids eluïts en un minut, excel·lent valor de N de 13.500 ± 330 per columna (100 x 1,8 mm de diàmetre), equivalent a 135.000 plaques/m (Fig. 5B). Es van omplir tres columnes de la mateixa mida (diàmetre interior 100 x 1,8 mm) amb tres lots diferents de fase estacionària PMP per comprovar la reproductibilitat. Els analits es van registrar per a cada columna separant la mateixa barreja de prova a cada columna utilitzant condicions d'elució òptimes, nombre de plaques teòriques N i temps de retenció. Les dades de reproductibilitat per a les columnes PMP es mostren a la Taula 4. La reproductibilitat de la columna PMP es va correlacionar bé amb valors de %RSD molt baixos, com es mostra a la Taula 3.
Separació de mescles de pèptids en una columna PMP (B) i una columna Ascentis Express RP-Amide (A), fase mòbil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensions de la columna PMP (100 x 1,8 mm diàmetre interior), anàlisi Ordre d'elució dels compostos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (encefalina de l'àcid leucic).
Es va avaluar una columna PMP (diàmetre interior 100 x 1,8 mm) per a la separació de l'hidrolitzat tríptic de l'albúmina sèrica humana mitjançant HPLC. El cromatograma de la Figura 6 mostra que les mostres estan ben separades amb molt bona resolució. Les solucions d'HSA es van analitzar utilitzant un cabal de 100 μl/min, una fase mòbil de 70/30 acetonitril/aigua i 0,1% de TFA. L'escissió de l'HSA es va dividir en 17 pics, tal com es mostra al cromatograma (Fig. 6), corresponents a 17 pèptids. Es van calcular les eficiències de separació dels pics individuals de l'hidrolitzat d'HSA i els valors es mostren a la Taula 5.
Els hidrolitzats tríptics d'HSA es van separar en una columna PMP (diàmetre interior 100 x 1,8 mm), cabal (100 μl/min), fase mòbil 60/40 acetonitril/aigua i 0,1% de TFA.
on L és la longitud de la columna, η és la viscositat de la fase mòbil, ΔP és la contrapressió de la columna i u és la velocitat lineal de la fase mòbil. La permeabilitat de la columna PMP era de 2,5 × 10–14 m2, el cabal era de 25 µl/min, i es va utilitzar ACN/aigua 60/40 v/v. La permeabilitat de la columna PMP (ID 100 × 1,8 mm) era similar a la del nostre estudi anterior Ref.34. La permeabilitat d'una columna plena de partícules superficialment poroses és d'1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 per a partícules de 5 µm43. Per tant, la permeabilitat de la fase PMP és similar a la permeabilitat de les partícules de nucli-escorça amb una mida de 5 μm.
on Wx és la massa de la columna plena de cloroform, Wy és la massa de la columna plena de metanol i ρ és la densitat del dissolvent. Densitat del metanol (ρ = 0,7866) i del cloroform (ρ = 1,484). La porositat total de la columna de partícules de sílice-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 i la nostra columna C18-urea31 estudiada anteriorment va ser de 0,63 i 0,55, respectivament. Això significa que la presència de lligands d'urea redueix la permeabilitat de la fase estacionària. D'altra banda, la porositat total de la columna PMP (diàmetre interior 100 × 1,8 mm) és de 0,60. Les columnes PMP són menys permeables que les columnes plenes de partícules de sílice unides a C18 perquè en les fases estacionàries de tipus C18 els lligands C18 estan units a les partícules de sílice en cadenes lineals, mentre que en les fases estacionàries de tipus poliestirè es forma un polímer relativament gruixut al voltant de les partícules. capa A. En un experiment típic, la porositat de la columna es calcula de la manera següent:
A la figura 7A i B es mostren els diagrames de Van Deemter per a una columna PMP (diàmetre interior 100 x 1,8 mm) i una columna Ascentis Express RP-Amide (diàmetre interior 100 x 1,8 mm) sota les mateixes condicions d'elució, 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA de 20 µl/min a 800 µl/min en ambdues columnes. Els valors mínims d'HETP al cabal òptim (80 µl/min) van ser de 2,6 µm i 3,9 µm per a la columna PMP i la columna Ascentis Express RP-Amide, respectivament. Els valors d'HETP mostren que l'eficiència de separació de la columna PMP (100 x 1,8 mm diàmetre interior) és molt més alta que la de la columna Ascentis Express RP-Amide disponible comercialment (100 x 1,8 mm diàmetre interior). El gràfic de van Deemter de la figura 7(A) mostra que la disminució del valor de N no és significativament més alta amb l'augment del flux en comparació amb el nostre estudi anterior. La major eficiència de separació de la columna PMP (id 100 × 1,8 mm) en comparació amb la columna Ascentis Express RP-Amide es basa en la millora de la forma i la mida de les partícules i el sofisticat procediment d'ompliment de la columna utilitzat en el treball actual34.
(A) Gràfic de Van Deemter (HETP vs. velocitat lineal de la fase mòbil) obtingut en una columna PMP (id 100 x 1,8 mm) en 60/40 ACN/H2O amb 0,1% de TFA. (B) Gràfic de Van Deemter (HETP vs. velocitat lineal de la fase mòbil) obtingut en una columna Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) en 60/40 ACN/H2O amb 0,1% de TFA.
Es va preparar i avaluar una fase estacionària polar de poliestirè intercalat per a la separació d'una barreja de pèptids sintètics i hidrolitzat tríptic d'albúmina sèrica humana (HSA) en cromatografia líquida d'alta resolució. El rendiment cromatogràfic de les columnes PMP per a mescles de pèptids és excel·lent pel que fa a l'eficiència i la resolució de separació. La millora de l'eficiència de separació de les columnes PMP es deu a diverses raons, com ara la mida de les partícules de sílice i la mida dels porus, la síntesi controlada de fases estacionàries i els materials de farciment de la columna complexos. A més de l'alta eficiència de separació, un altre avantatge d'aquesta fase estacionària és la baixa contrapressió de la columna a cabals elevats. Les columnes PMP són altament reproduïbles i es poden utilitzar per analitzar mescles de pèptids i la digestió tríptica de diverses proteïnes. Tenim la intenció d'utilitzar aquesta columna per a la separació de compostos bioactius de productes naturals, extractes de plantes medicinals i bolets en cromatografia líquida. En el futur, les columnes PMP també s'avaluaran per a la separació de proteïnes i anticossos monoclonals.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Investigació sobre sistemes de separació de pèptids per cromatografia de fase inversa, part I: Desenvolupament d'un protocol per a la caracterització de columnes. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Investigació sobre sistemes de separació de pèptids per cromatografia de fase inversa, part I: Desenvolupament d'un protocol per a la caracterització de columnes.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., i Petersson, P. Investigació de sistemes de separació de pèptids mitjançant cromatografia de fase inversa, part I: desenvolupament d'un protocol per a la caracterització de columnes. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Investigació sobre sistemes de separació de pèptids per cromatografia de fase inversa, part I: Desenvolupament d'un protocol per a les característiques de la columna. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Investigació sobre sistemes de separació de pèptids per cromatografia de fase inversa, part I: Desenvolupament d'un protocol per a les característiques de la columna.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., i Petersson, P. Investigació de sistemes de separació de pèptids mitjançant cromatografia de fase inversa, part I: desenvolupament d'un protocol per a la caracterització de columnes.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Mètodes per crear pèptids actius millorats per al tractament de malalties infeccioses. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. i Khrestchatisky, M. Pèptids terapèutics sintètics: ciència i mercat. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. i Khrestchatisky, M. Pèptids terapèutics sintètics: ciència i mercat.Vliege P, Lisowski V, Martinez J i Chreschatyski M. Pèptids terapèutics sintètics: ciència i mercat.Vliege P, Lisowski V, Martinez J i Khreschatsky M. Pèptids terapèutics sintètics: ciència i mercat. Descobriment de fàrmacs. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Cromatografia líquida proteòmica avançada. Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Cromatografia líquida proteòmica avançada.Vegeu F., Smith RD i Shen Yu. Cromatografia líquida proteòmica avançada. Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Composició avançada de proteïnes 液相色谱。Vegeu F., Smith RD i Shen Yu. Cromatografia líquida proteòmica avançada.J. Cromatografia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. La cromatografia líquida avançada amb espectrometria de masses és capaç de combinar metabolòmica i proteòmica d'àmplia base. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ El paper de la UHPLC en el desenvolupament farmacèutic. Chesnut, SM i Salisbury, JJ El paper de la UHPLC en el desenvolupament farmacèutic.Chesnut, SM i Salisbury, JJ El paper de la UHPLC en el desenvolupament farmacèutic.Chesnut, SM i Salisbury, JJ El paper de la UHPLC en el desenvolupament de fàrmacs. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. i Clausen, AM Aspectes fonamentals i pràctics de la cromatografia líquida d'ultraalta pressió per a separacions ràpides. Wu, N. i Clausen, AM Aspectes fonamentals i pràctics de la cromatografia líquida d'ultraalta pressió per a separacions ràpides.Wu, N. i Clausen, AM Aspectes fonamentals i pràctics de la cromatografia líquida d'alta pressió per a la separació ràpida. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. i Clausen, AM Aspectes bàsics i pràctics de la cromatografia líquida d'ultraalta pressió per a la separació ràpida.Wu, N. i Clausen, AM Aspectes fonamentals i pràctics de la cromatografia líquida d'alta pressió per a la separació ràpida.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA i Tchelitcheff, P. Ús de la cromatografia líquida d'ultra rendiment en el desenvolupament farmacèutic. Wren, SA i Tchelitcheff, P. Ús de la cromatografia líquida d'ultra rendiment en el desenvolupament farmacèutic.Ren, SA i Chelischeff, P. L'ús de la cromatografia líquida d'ultra alta resolució en el desenvolupament farmacèutic. Wren, SA i Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA i Tchelitcheff, P.Ren, SA i Chelischeff, P. Aplicació de la cromatografia líquida d'ultra rendiment en el desenvolupament de fàrmacs.J. Cromatografia. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Un hidrogel macroporós monolític derivat d'una emulsió d'oli en aigua amb una fase interna alta per a la purificació eficient de l'enterovirus 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA El paper de la cromatografia líquida en la proteòmica. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA El paper de la cromatografia líquida en la proteòmica.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. i Wilkins, JA El paper de la cromatografia líquida en la proteòmica. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. i Wilkins, JA El paper de la cromatografia líquida en la proteòmica.J. Cromatografia. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Noves tendències en separacions cromatogràfiques líquides en fase inversa de pèptids i proteïnes terapèutics: teoria i aplicacions. & Guillarme, D. Noves tendències en separacions cromatogràfiques líquides en fase inversa de pèptids i proteïnes terapèutics: teoria i aplicacions. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жомощью жромадкосогостроих с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Noves tendències en la separació de pèptids i proteïnes terapèutics mitjançant cromatografia líquida de fase inversa: teoria i aplicacions. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.i Guillarmé, D. Noves tendències en la separació de pèptids i proteïnes terapèutics mitjançant cromatografia líquida de fase inversa: teoria i aplicacions.J. Pharm. Ciència Biomèdica. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Separació bidimensional de pèptids mitjançant el sistema RP-RP-HPLC amb diferents pH en la primera i segona dimensions de separació. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Separació bidimensional de pèptids mitjançant el sistema RP-RP-HPLC amb diferents pH en la primera i segona dimensions de separació.Gilar M., Olivova P., Dali AE i Gebler JK Separació bidimensional de pèptids mitjançant el sistema RP-RP-HPLC amb diferents pH en la primera i segona dimensió de separació.Gilar M., Olivova P., Dali AE i Gebler JK Separació bidimensional de pèptids utilitzant diferents valors de pH en la primera i segona dimensió de separació mitjançant el sistema RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Investigació de la transferència de massa i les característiques cinètiques de columnes de cromatografia d'alta resolució empaquetades amb partícules C18 totalment poroses i superficialment poroses més petites de 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tendències recents i reptes analítics en l'aïllament, la identificació i la validació de pèptids bioactius vegetals. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Paisatge proteòmic del regne de la vida. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Posttractament de pèptids terapèutics mitjançant cromatografia líquida preparativa. Molecules (Basel, Suïssa) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. i Geng, X. Cromatografia de mode mixt i les seves aplicacions als biopolímers. Yang, Y. i Geng, X. Cromatografia de mode mixt i les seves aplicacions als biopolímers.Yang, Yu. i Geng, X. Cromatografia de mode mixt i la seva aplicació als biopolímers. Yang, Y. i Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. i Geng, X. Cromatografia de mode mixt i la seva aplicació en biopolímers.Yang, Yu. i Gene, X. Cromatografia en mode mixt i la seva aplicació als biopolímers.J. Cromatografia. A 1218(49), 8813–8825 (2011).