Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
Angustifolius lupin (NLL, Lupinus angustifolius L.) és una planta lleguminosa utilitzada per a la producció d'aliments i la millora del sòl.L'expansió global de la NLL com a cultiu ha atret molts fongs patògens, inclosa l'antracnosi del lupí, que causa la devastadora malaltia de l'antracnosi.Dos al·lels, Lanr1 i AnMan, que confereixen una major resistència, s'han utilitzat en la cria de NLL, però els mecanismes moleculars subjacents segueixen sent desconeguts.En aquest estudi, es van utilitzar els marcadors Lanr1 i AnMan per seleccionar mostres de NLL europees.Les proves de la vacuna en un entorn controlat van confirmar l'eficàcia dels dos donants resistents.Es va realitzar un perfil d'expressió gènica diferencial en línies resistents i susceptibles representatives.La resistència a l'antracnosi es va associar amb la sobreexpressió dels termes d'ontologia gènica "GO:0006952 Defense Response", "GO:0055114 Redox Process" i "GO:0015979 Photosynthesis".A més, la línia Lanr1 (83A:476) va mostrar una reprogramació important del transcriptoma ràpidament després de la inoculació, mentre que les altres línies van mostrar un retard en aquesta resposta d'unes 42 hores.Les respostes de defensa s'associen amb els gens TIR-NBS, CC-NBS-LRR i NBS-LRR, 10 proteïnes implicades en la patogènesi, proteïnes de transferència de lípids, endoglucan-1,3-β-glucosidasa, proteïnes de paret cel·lular riques en glicina i gens del camí reactiu de l'oxigen.Les primeres respostes a 83A:476, inclosa la supressió acurada dels gens associats a la fotosíntesi, van coincidir amb una protecció reeixida durant la fase de creixement vegetatiu de la biologia dels fongs, cosa que suggereix que un efector desencadena la immunitat.La reacció de Mandeloop es ralenteix, igual que l'arrossegament horitzontal global.
El tramuc de fulla estreta (NLL, Lupinus angustifolius L.) és un cereal ric en proteïnes originari de la regió de la Mediterrània occidental1,2.Actualment es conrea com a cultiu alimentari per a animals i humans.També es considera fem verd en sistemes de rotació de cultius a causa de la fixació de nitrogen per bacteris fixadors de nitrogen simbiòtics i la millora general de l'estructura del sòl.L'NLL ha sofert un ràpid procés de domesticació durant el segle passat i encara es troba sota una pressió de cria elevada3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Amb el conreu generalitzat de NLL, la successió de fongs patògens va desenvolupar nous nínxols agrícoles i va provocar noves malalties que destruïen els cultius. El més destacable per als agricultors i criadors de trams va ser l'aparició de l'antracnosi, causada pel fong patògen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. El més destacable per als agricultors i criadors de trams va ser l'aparició de l'antracnosi, causada pel fong patògen, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракнозав антракнозав, паиболее ибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. El més destacat per als agricultors i criadors de trams va ser l'aparició de l'antracnosi causada pel fong patògen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现，它是由眗Borhum腏由真Hum豆目的是炭目的是炭疽病的出现iler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是由眵hum) d。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракнамы горакнозозонеров люпина является грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler i Hagedorn13. El més sorprenent per als agricultors i criadors de trams és l'aparició de l'antracnosi causada pel fong patògen Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.Els primers informes de la malaltia van venir del Brasil i els Estats Units, amb símptomes típics que van aparèixer el 1912 i el 1929, respectivament.Tanmateix, després d'uns 30 anys, el patogen va ser designat com a Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorf de Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .i H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。i H. Schlenk, .El fenotipat preliminar de la malaltia realitzat a mitjans del segle XX va mostrar certa resistència a les accessions de NLL i de trams groc (L. luteus L.), però totes les accessions de trams blanc (L. albus L.) provades eren altament susceptibles15,16.Els estudis han demostrat que el desenvolupament de l'antracnosi s'associa a un augment de la precipitació (humitat de l'aire) i de la temperatura (en el rang de 12-28 °C), donant lloc a una violació de la resistència a temperatures més altes17, 18. De fet, el temps necessari perquè els conídis germinin i comencés la malaltia va ser quatre vegades més curt a 24 °C (4 hores) 12 hores d'humitat (12 hores) 19 °C (12 hores) d'humitat alta.Així, l'escalfament global en curs ha provocat la propagació de l'antracnosi.No obstant això, la malaltia es va observar a França (1982) i Ucraïna (1983) com a presagi d'una amenaça imminent, però aparentment va ser ignorada per la indústria del lupin en aquell moment20,21.Uns anys més tard, aquesta devastadora malaltia es va estendre per tot el món i també va afectar els principals països productors de lupins com Austràlia, Polònia i Alemanya22,23,24.Després d'un brot d'antracnosi a mitjans de la dècada de 1990, un examen exhaustiu va donar lloc a la identificació de diversos donants resistents en mostres de NLL19.La resistència de NLL a l'antracnosi està controlada per dos al·lels dominants separats que es troben en diferents fonts de germoplasma: Lanr1 en el conreu Tanjil i Wonga i AnMan en el conreu.Mandalay 25, 26. Aquests al·lels complementen els marcadors moleculars que donen suport a la selecció de germoplasma resistent en els programes de millora25,26,27,28,29,30.La línia reproductora resistent 83A:476 que porta l'al·lel Lanr1 es va creuar amb la línia salvatge susceptible P27255 per obtenir una població RIL segregada per resistència a l'antracnosi, cosa que va permetre assignar el locus Lanr1 al cromosoma NLL-1131, 32, 33. la ubicació dels tres al·lels al mateix cromosoma (NLL-11), però en posicions diferents29,34,35.Tanmateix, a causa del petit nombre de RIL i la gran distància genètica entre marcadors i al·lels corresponents, no es poden extreure conclusions fiables sobre els seus gens subjacents.D'altra banda, l'ús de la genètica inversa en els tramussos és difícil a causa del seu potencial de regeneració molt baix, la qual cosa fa que la manipulació genètica sigui complicada37.
El desenvolupament de germoplasma domesticat que porta l'al·lel desitjat en estat homozigot, com 83A:476 (Lanr1) i Mandelup (AnMan), ha obert la porta a l'estudi de la resistència a l'antracnosi davant la presència de combinacions oposades d'al·lels en poblacions salvatges.Possibilitats dels mecanismes moleculars.Compareu les respostes de defensa generades per genotips específics.Aquest estudi va avaluar la resposta primerenca del transcriptoma de NLL a la vacunació de C. lupini.En primer lloc, es va examinar un panell de germoplasma NLL europeu que conté 215 línies mitjançant marcadors moleculars que marquen els al·lels Lanr1 i AnMan.A continuació, es va realitzar el fenotipat de l'antracnosi en 50 línies NLL, prèviament seleccionades per a marcadors moleculars, en condicions controlades.A partir d'aquests experiments, es van seleccionar quatre línies diferents en la resistència a l'antracnosi i la composició al·lèlica Lanr1/AnMan per al perfil d'expressió gènica de defensa diferencial mitjançant dos enfocaments complementaris: seqüenciació d'ARN d'alt rendiment i quantificació de PCR en temps real.
El cribratge d'un conjunt de germoplasma NLL (N = 215) amb marcadors Lanr1 (Anseq3 i Anseq4) i AnMan (Anseq4) i AnMan (AnManM1) va mostrar que només una línia (95726, a prop de Salamanca-b) amplifica l'al·lel de "resistència" per a tots els marcadors, mentre que "presencia de 18 al·lels sensibles" ,5%) línies.Tretze línies van produir dos al·lels "resistents" del marcador Lanr1 i 8 línies van produir al·lels "resistents" de Lanr1.marcador.L'al·lel de "resistència" del marcador AnMan (taula suplementària S1).Dues línies eren heterozigotes per al marcador Anseq3 i una heterozigota per al marcador AnManM1.42 línies (19,5%) portaven fases oposades dels al·lels Anseq3 i Anseq4, cosa que indica una alta freqüència de recombinació entre aquests dos loci.Els fenotips d'antracnosi en condicions controlades (taula suplementària S2) van revelar una variabilitat en la resistència dels genotips provats, que es va reflectir en la gravetat de l'antracnosi.Les diferències en les puntuacions mitjanes van oscil·lar entre 1,8 (moderadament resistent) i 6,9 (susceptible) i les diferències de pes de la planta van oscil·lar entre 0,62 (susceptible) i 4,45 g (resistent). Hi va haver una correlació significativa entre els valors observats en dues rèpliques de l'experiment (0, 51 per a les puntuacions de gravetat de la malaltia, P = 0, 00017 i 0, 61 per al pes de la planta, P < 0, 0001), així com entre aquests dos paràmetres (- 0, 59 i - 0, 77, P < 0, 0001). Hi va haver una correlació significativa entre els valors observats en dues rèpliques de l'experiment (0,51 per a les puntuacions de gravetat de la malaltia, P = 0,00017 i 0,61 per al pes de la planta, P <0,0001), així com entre aquests dos paràmetres (−0,59 i -0,77, P <0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями втяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими даву, 7ми пару, 7ми пару, 7ми Р < 0,0001) 0,0001). Es va trobar una correlació significativa entre els valors observats en dues repeticions de l'experiment (0,51 per a les puntuacions de gravetat de la malaltia, P = 0,00017 i 0,61 per al pes de la planta, P <0,0001), així com entre aquests dos paràmetres (-0,59 i -0,77, P <0,00001)).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分度评分度评分度评分在显着相关性（疾病严重程度评分1︺00.物重量为0,61，P <0,0001）以及这两个参数之间（- 0,59 和- 0,77） P <0,0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 在 在 在 相关性 （疾病 严重 程度 诸 丄 丆 丄 予 评1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（（，及 两 个 参数 之间 （（（（（（，及 两 个 参数 之间 （（（（（（，及，90.–59.和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух потцтонка аболевания 0,51, P = 0,00017 i масса растения 0,61, P <0,0001), i между этими двумя параметрамет 0,61, P <0,0001), i между этими двумя параметрами параметрами параметрами параметрами (-0,0,509) . Hi va haver una correlació significativa entre els valors observats per duplicat (puntuació de gravetat de la malaltia 0,51, P = 0,00017 i pes de la planta 0,61, P <0,0001) i entre aquests dos paràmetres (-0,59 i -0,0001) 0,77, P <0,0001. ).Els símptomes típics observats a les plantes susceptibles inclouen la torsió i la torsió de la tija semblant a una estructura d'"arc de pastor", seguida de lesions ovalades amb esporozoïts taronja/rosa (figura suplementària 1).Les accessions australianes que porten els gens Lanr1 (83A:476 i Tanjil) i AnMan (Mandelup) són moderadament resistents, 0,0331 i 0,0036).Algunes línies que també porten al·lels Lanr1 i/o AnMan "resistents" mostren símptomes de la malaltia.
Curiosament, unes quantes línies de NLL que no tenen cap al·lel marcador "resistent" van revelar un alt nivell de resistència a l'antracnosi (comparable o superior al dels genotips Lanr1 o AnMan), com ara Boregine (valor P <0,0001 per als dos paràmetres), Bojar (valor P <0,0001 per a la puntuació i 0,00001 per a la puntuació i el valor de la planta 0,000,040/7 per a la planta) 001 per a la puntuació i no significatiu per al pes). Curiosament, unes quantes línies de NLL que no tenen cap al·lel marcador "resistent" van revelar un alt nivell de resistència a l'antracnosi (comparable o superior al dels genotips Lanr1 o AnMan), com ara Boregine (valor P <0,0001 per als dos paràmetres), Bojar (valor P <0,0001 per a la puntuació i 0,00001 per a la puntuació i el valor de la planta 0,000,040/7 per a la planta) 001 per a la puntuació i no significatiu per al pes). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллонкавы аллонкавы зпалого-либо ь устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), таки0 Boregine, такни0 1 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) i по-549ние B-549ние / пуля оценки и 0,001 ,0001 для оценки и незначимо для массы). Curiosament, diverses línies de NLL que no tenen cap al·lel marcador "resistent" van mostrar un alt nivell de resistència a l'antracnosi (comparable o superior a la dels genotips Lanr1 o AnMan), com ara Boregine (valor P <0,0001 per als dos paràmetres), Bojar (valor P <0,0001 per a l'avaluació i valor B-0,0001 per a la població i <0,0001 per a la població de 90. 0001 per a l'avaluació i no significatiu per al pes).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭疽性AnLanr水平的炭等位基因的NLL基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0,0001）、Bojar（P 值<得分万0.0.0分万0.0.0.0. 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0,0001，重量不显着）. És interessant que alguns sistemes de NLL que no tenen cap marcador "antigènic" mostrin una alta resistència horitzontal (equivalent als gens Lanr1 o AnMan o superior), com ara Boregine (ambdós paràmetres P <0,0001), Bojar (valor P <0,0001, pes de la planta 0,001) i la soca B-549/1, pes no significatiu (pes B-549/190. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентносторые линии NLL", сполосуква стойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (знавнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), 0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значение 0,00001 <0,Їенсание a). Curiosament, algunes línies de NLL que no tenien cap al·lel marcador de "resistència" van mostrar nivells elevats de resistència a l'antracnosi (comparable o superior als genotips Lanr1 o AnMan), com ara Boregine (valor P per als dos paràmetres <0,0001), Bojar (valor P <0,0001, pes de la planta <0,70-549) i valor de la planta <0,70-549 01, pes no significatiu).Aquest fenomen suggereix la possibilitat d'una nova font genètica de resistència, que explica la manca de correlació observada entre els genotips marcadors i els fenotips de la malaltia (valors de P de ~ 0,42 a ~ 0,98).Així, la prova de Kolmogorov-Smirnov va demostrar que les dades sobre la resistència a l'antracnosi es distribuïen aproximadament de manera normal per a puntuacions (valors P 0,25 i 0,11) i massa vegetal (valors P 0,47 i 0,55), cosa que suggereix que hi ha la hipòtesi que hi ha més al·lels que Lanr1 i AnMan.
A partir dels resultats del cribratge de resistència a l'antracnosi, es van seleccionar 4 línies per a l'anàlisi del transcriptoma: 83A:476, Boregine, Mandelup i Population 22660. Aquestes línies es van tornar a provar per a la resistència a l'àntrax en experiments d'inoculació mitjançant seqüenciació d'ARN, sempre que fossin les mateixes que en la prova anterior.Els valors de la puntuació van ser els següents: Boregin (1,71 ± 1,39), 83A: 476 (2,09 ± 1,38), Mandelup (3,82 ± 1,42) i població 22660 (6,11 ± 1,29).
El protocol Illumina NovaSeq 6000 va aconseguir una mitjana de 40,5 parells Mreads per mostra (de 29,7 a 54,4 Mreads) (taula suplementària S3).Les puntuacions d'alineació a la seqüència de referència van oscil·lar entre el 75,5% i el 88,6%.La correlació mitjana de dades de recompte de lectura entre variants experimentals entre rèpliques biològiques va oscil·lar entre 0,812 i 0,997 (mitjana 0,959). Dels 35.170 gens analitzats, 2.917 no van revelar cap expressió, i els altres 4.785 gens es van expressar a un nivell insignificant (mitjana base < 5). Dels 35.170 gens analitzats, 2.917 no van revelar cap expressió, i els altres 4.785 gens es van expressar a un nivell insignificant (mitjana base < 5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов слсинали экспрессии начительном уровне (базовое среднее <5). Dels 35.170 gens analitzats, 2.917 no van mostrar cap expressió, i els 4.785 gens restants es van expressar a un nivell insignificant (mitjana base <5).在分析的35.170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以帜表达，其他因的表达可以帜表达木值< 5）.35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 геннов имелсунч имелись прессию (базовое среднее значение <5). Dels 35.170 gens analitzats, 2.917 no es van expressar i els 4.785 gens restants tenien una expressió insignificant (mitjana base <5).Així, el nombre de gens considerats expressats (mitjana base ≥ 5) durant l'experiment va ser de 27.468 (78,1%) (taula complementària S4).
Des del primer moment, totes les línies de NLL van respondre a la inoculació de C. lupini (cep Col-08) reprogramant el transcriptoma (taula 1), però, es van observar diferències significatives entre les línies.Així, la línia de resistència 83A:476 (que porta el gen Lanr1) va mostrar una reprogramació important del transcriptoma en el primer moment (6 hpi) amb un augment de 31-69 vegades en el nombre de gens aïllats amunt i avall en comparació amb altres punts de temps en aquest moment.A més, aquest pic va ser de curta durada, ja que l'expressió d'uns quants gens es va mantenir significativament alterada en el segon punt temporal (12 hpi).Curiosament, Boregine, que també va mostrar un alt nivell de resistència a la prova d'empelt, no va patir una reprogramació transcripcional tan massiva durant l'experiment.Tanmateix, el nombre de gens expressats de manera diferencial (DEG) va ser el mateix per a Boregine i 83A:476 a 12 HPI.Tant Mandelup com la població 22660 van mostrar pics de DEG en l'últim moment (48 l/s), cosa que indica un retard relatiu en les respostes de defensa.
Com que 83A: 476 es va sotmetre a una reprogramació massiva del transcriptoma en resposta a C. lupini a 6 HPI en comparació amb totes les altres línies, ~ 91% dels DEG observats en aquest moment eren específics del llinatge (Fig. 1).Tanmateix, hi va haver una certa superposició en les primeres respostes entre les línies d'estudi, ja que el 68,5%, el 50,9% i el 52,6% DEG a Boregine, Mandelup i la població 22660, respectivament, es van solapar amb les trobades a 83A:476 en determinats moments.Tanmateix, aquests DEG només representaven una petita fracció (0,97–1,70%) de tots els DEG detectats actualment mitjançant 83A:476.A més, 11 DEG de totes les línies eren coherents en aquest moment (taules suplementàries S4-S6), incloent components comuns de les respostes de defensa de les plantes: proteïna de transferència de lípids (TanjilG_32225), enzim endoglucan-1,3-β-glucòsid (TanjilG_23384), dues proteïnes induïbles per l'estrès (TanjilG_23384). 531), proteïna bàsica de làtex (TanjilG_32352) i dues proteïnes estructurals de paret cel·lular riques en glicina (TanjilG_19701 i TanjilG_19702).També hi va haver una superposició relativament alta en les respostes del transcriptoma entre 83A: 476 i Boregine a 24 HPI (total 16-38% DEG) i entre Mandelup i Població 22660 a 48 HPI (total 14-20% DEG).
Diagrama de Venn que mostra el nombre de gens expressats de manera diferencial (DEG) en línies de tramús de fulla estreta (NLL) inoculades amb Colletotrichum lupini (soca Col-08 obtinguda dels camps de trams de Wierzhenice, Polònia, 1999).Les línies NLL analitzades van ser: 83A:476 (resistent, que porta l'al·lel Lanr1), Boregine (resistent, fons genètic desconegut), Mandelup (moderadament resistent, que porta l'al·lel AnMan) i població 22660 (molt susceptible).L'abreviatura hpi significa hores després de la vacunació.Els valors zero s'han eliminat per simplificar el gràfic.
El conjunt de gens sobreexpressats a 6 hpi es va analitzar per a la presència de dominis canònics del gen R (taula suplementària S7).Aquest estudi va revelar la inducció del transcriptoma de gens clàssics de resistència a la malaltia amb dominis NBS-LRR només a 83A: 476.Aquest conjunt constava d'un gen TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinc gens CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640 i tanjilg_16162), i Quatre (NJ6162) i Quatre NBS-LR6. jilg_16162), així com Quatre NBS-Lrr (tanjilg_16162) i Quatre NBS-LRR (TANJILG_16162).Tots aquests gens tenen dominis canònics disposats en seqüències conservades.A més dels gens del domini NBS-LRR, es van activar diverses RLL cinases a 6 hpi, és a dir, una a Boregine (TanjilG_19877), dues a Mandelup (TanjilG_07141 i TanjilG_19877) i a la població 22660 (TanjilG_09877) i dos a TanjilG_09141 i 2:0614 476.
Els gens amb una expressió significativament alterada en resposta a la inoculació amb C. lupini (soca Col-08) van ser sotmesos a una anàlisi d'enriquiment d'ontologia gènica (GO) (taula suplementària S8). El terme de procés biològic sobrerepresentat amb més freqüència va ser "GO: 0006952 resposta de defensa", que va aparèixer en 6 de les 16 combinacions (temps × línia) amb gran significació (valor P <0, 001) (Fig. 2). El terme de procés biològic sobrerepresentat amb més freqüència va ser "GO: 0006952 resposta de defensa", que va aparèixer en 6 de les 16 combinacions (temps × línia) amb gran significació (valor P <0, 001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 термином биологического процесса был «GO: 0006952 й появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рисокой значимостью). El terme de procés biològic sobrerepresentat amb més freqüència va ser "GO: 0006952 defense response", que va aparèixer en 6 de 16 combinacions (temps × llinatge) amb gran significació (valor P <0, 001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（縶魗（縶魗（时魗（时魗应”个中，具有高显着性（P 值< 0,001）（图2）. El terme de procés biològic més representatiu és "GO:0006952 resposta de defensa", que apareix en 6 de les 16 combinacions (时间×线), amb una gran significació (valor P <0,001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Defense Response процесса» в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). El terme de procés biològic sobrerepresentat amb més freqüència va ser "GO: 0006952 Defense Response", que va aparèixer en 6 de les 16 combinacions (temps × línia) amb gran significació (valor P <0, 001) (Fig. 2).Aquest terme va estar sobrerepresentat en dos moments de l'83A: 476 i Boregine (6 i 24 hpi) i en un moment determinat a Mandelup i la població 22660 (12 i 6 hpi, respectivament).Aquest és un resultat esperat, destacant la resposta antifúngica de les línies resistents.A més, 83A:476 va respondre a C. lupini induint ràpidament gens relacionats amb l'esclat oxidatiu representat pel terme "procés redox GO:0055114", indicant una resposta de defensa específica, mentre que Boregine va revelar respostes de defensa específiques, relacionades amb el terme "GO".:0006950 Resposta a l'estrès”.La població 22660 va activar la resposta de resistència horitzontal que implicava metabòlits secundaris, destacant el nombre excessiu de termes "GO:0016104 Process of triterpene biosynthesis" i "GO:0006722 Process of triterpene metabolism" (ambdós termes pertanyen al mateix conjunt de gens), tenint en compte els resultats de l'anàlisi de l'enriquiment de l'estabilitat i l'enriquiment de la població. 22660. A més, la reacció primerenca 83A:476 (6 hpi) i la reacció retardada Mandelup i la població 22660 inclouen el terme GO:0015979 "fotosíntesi" i altres processos biològics relacionats.
Els termes d'ontologia gènica del bioprocés seleccionats en l'anotació de gens expressats de manera diferencial durant les respostes transcriptomes de llupí de fulla estreta (NLL) inoculats amb el lupí d'àntrax (soca Col-08 obtinguda dels camps de lupins de Wierzhenice, Polònia, el 1999) són molt exagerats.Les línies NLL analitzades van ser: 83A:476 (resistent, que porta l'al·lel homozigot Lanr1), Boregine (resistent, fons genètic desconegut), Mandelup (moderadament resistent, que porta l'al·lel homozigot AnMan) i població 22660 (susceptible).
Com que aquest estudi tenia com a objectiu identificar gens que contribueixen a la resistència a l'antracnosi, els gens assignats als termes GO "GO: 0006952 Defensive responses" i "GO: 0055114 Redox processos" es van analitzar amb talls, ja que la línia de base mitjana ≥ 30 amb almenys una línia.× moment en el temps que combina valors estadísticament significatius de log2 (canvi de vegades).El nombre de gens que compleixen aquests criteris va ser de 65 per a GO:0006952 i de 524 per a GO:0055114.
83A:476 va revelar dos pics DEG anotats amb el terme GO:0006952, el primer a 6 gens per polzada (64 gens, regulació amunt i avall) i el segon a 24 gens per polzada (15 gens, només regulació).Boregine també va demostrar que GO: 0006952 va assolir el màxim al mateix punt temporal, però amb menys DEG (11 i 8) i activació preferencial.Mandeloop va mostrar dos pics de GO:0006952 a 12 i 48 HPI, ambdós portadors de 12 gens (el primer amb gens activadors i el segon només amb gens supressors), mentre que la població de 22660 a 6 HPI (13 gens) va tenir un major predomini del pic d'augment.regulació.Cal tenir en compte que el 96,4% de GO:0006952 DEG en aquests pics van tenir el mateix tipus de resposta (amunt o avall), cosa que indica una superposició significativa en les respostes de defensa malgrat les diferències en el nombre de gens implicats.El grup més gran de seqüències relacionades amb el terme GO:0006952 codifica la proteïna 22 del missatge associada a l'estrès de fam (SAM22-like), que pertany al clade de proteïnes associades a la patogènesi de classe 10 (PR-10) i al làtex proteic central.proteïna similar (similar a MLP) (figura 3).Els dos grups es diferencien en la naturalesa de l'expressió i la direcció de la resposta.Els gens que codificaven proteïnes semblants a SAM22 van mostrar una inducció consistent i significativa en els primers moments (6 o 12 hpi) i generalment no van respondre al final de l'experiment (48 hpi), mentre que les proteïnes semblants a MLP van mostrar una coordinació a 6 hpi.hpi.83A:476 i Mandelup a 48 hp/in, gairebé tots els altres punts de dades no responien.A més, les diferències en els perfils d'expressió dels gens de proteïnes semblants a SAM22 van seguir la variabilitat observada en la resistència a l'antracnosi, ja que les línies més resistents tenien més punts de temps que induïen significativament aquests gens que els gens més susceptibles.Un altre gen PR-10 semblant a LlR18A/B va mostrar un patró d'expressió molt similar al gen de la proteïna semblant a SAM22.
Es van identificar els components principals del terme del procés biològic "GO:0006952 Defense Response" i els patrons d'expressió dels gens candidats dels al·lels Lanr1 i AnMan.L'escala Log2 representa valors log2 (canvi de vegades) entre plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda de camps de trams, Wizhenica, Polònia, 1999) i plantes control (inoculades simulades) al mateix moment.Es van analitzar les següents línies de lupin de fulla estreta: 83A: 476 (resistent, que porta l'al·lel homozigot Lanr1), Boregine (resistent, fons genètic desconegut), Mandelup (moderadament resistent, que porta l'al·lel homozigot AnMan) i Població 22660 (susceptible).
A més, es van avaluar els perfils d'expressió dels gens candidats d'ARN-seq Lanr1 (TanjilG_05042) i AnMan (TanjilG_12861) (Fig. 3).El gen TanjilG_05042 va mostrar una resposta significativa (activació) a 83A:476 només en el primer moment (6 hpi), mentre que TanjilG_12861 va ser significatiu a Mandeloop només en dos moments: 6 hpi (regulació baixa) i 24 hpi (6 hpi).Amb.).ajustable) ).
Els gens més sobreexpressats en el terme GO:0055114 "procés redox" eren gens que codificaven proteïnes del citocrom P450 i peroxidasa (Fig. 4).Per a mostres aïllades de 83A:476 a 6 HPI, es van observar generalment valors de log2 (canvi de vegades) màxim o mínim (per al 86,6% dels gens) entre plantes inoculades i control, destacant l'alta resposta d'aquest genotip al sexe inoculat.83A:476 va mostrar el GO més significatiu: 0055114 DEG a 6 hpi (503 gens), mentre que la resta de línies a 48 hpi (Boregine, 31 gens; Mandelup, 85 gens; i Població 22660, 78 gens)).A la majoria de gens de la família GO:0055114, es van observar dos tipus de respostes a la vacunació (activació i inhibició).Curiosament, fins al 97,6% dels DEG identificats per al terme GO: 0055114 a Mandelupe a 48 hp. Aquestes observacions suggereixen que, malgrat l'escala significativament més petita (és a dir, el nombre de gens redox mutats, 85 versus 503), el patró de les respostes transcriptomes retardades és similar a la resposta primerenca del mandenoseup.A Boregine i a la població 22660, aquesta convergència és inferior al 51,6% i al 75,6%, respectivament.
Es van revelar els patrons d'expressió dels principals components del terme del procés biològic "GO:0055114 Redox process".L'escala Log2 representa valors log2 (canvi de vegades) entre plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda de camps de trams, Wizhenica, Polònia, 1999) i plantes control (inoculades simulades) al mateix moment.Es van analitzar les següents línies de lupin de fulla estreta: 83A: 476 (resistent, que porta l'al·lel homozigot Lanr1), Boregine (resistent, fons genètic desconegut), Mandelup (moderadament resistent, que porta l'al·lel homozigot AnMan) i Població 22660 (susceptible).
83A:476 Les respostes transcriptòmiques a la inoculació amb C. lupini (soca Col-08) també van incloure silenciament coordinat de gens atribuïts al terme GO:0015979 "fotosíntesi" i altres processos biològics relacionats (FIG. 5).Aquest conjunt GO:0015979 DEG contenia 105 gens que es van reprimir significativament a 6 hpi a 83A:476.En aquest subconjunt, també es van reduir 37 gens a Mandelup a 48 HPI i 35 al mateix temps a la població de 22660, inclosos 19 DEG comuns als dos genotips.No es va activar cap DEG relacionat amb el terme GO: 0015979 en cap combinació (línia x temps).
Es van revelar els patrons d'expressió dels components principals del terme del procés biològic "GO:0015979 Fotosíntesi".L'escala Log2 representa valors log2 (canvi de vegades) entre plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda de camps de trams, Wizhenica, Polònia, 1999) i plantes control (inoculades simulades) al mateix moment.Es van analitzar les següents línies de lupin de fulla estreta: 83A: 476 (resistent, que porta l'al·lel homozigot Lanr1), Boregine (resistent, fons genètic desconegut), Mandelup (moderadament resistent, que porta l'al·lel homozigot AnMan) i Població 22660 (susceptible).
A partir dels resultats de l'anàlisi d'expressió diferencial i presumiblement implicat en les respostes de defensa contra fongs patògens, es va seleccionar aquest conjunt de set gens per quantificar els perfils d'expressió mitjançant PCR en temps real (taula suplementària S9).
El gen de proteïna putatiu TanjilG_10657 es va induir significativament en totes les línies i punts de temps estudiats en comparació amb les plantes de control (imitació) (taules suplementàries S10, S11).A més, el perfil d'expressió de TanjilG_10657 va mostrar una tendència creixent al llarg de l'experiment per a totes les línies.La població 22660 va mostrar la sensibilitat més alta de TanjilG_10657 a la inoculació amb una activació de 114 vegades i el nivell d'expressió relativa més alt (4, 4 ± 0, 4) a 24 HPI (Fig. 6a).El gen de la proteïna PR10 LlR18A TanjilG_27015 també va mostrar activació en totes les línies i punts de temps, amb significació estadística en la majoria dels punts de dades (Fig. 6b).De manera similar a TanjilG_10657, el nivell d'expressió relativa més alt de TanjilG_27015 es va observar a la població inoculada de 22660 a 24 HPI (19,5 ± 2,4).El gen de l'endoquitinasa àcida TanjilG_04706 es va incrementar significativament en totes les línies i en tots els punts de temps, excepte per a Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Es va induir fortament en el primer moment (6 HPI) a 83A:476 (en 10,5 vegades) i va augmentar moderadament en altres línies (en 6,6-7,5 vegades).Durant l'experiment, l'expressió de TanjilG_04706 es va mantenir en nivells similars a 83A:476 i Boregine, mentre que a Mandelup i Població 22660 va augmentar significativament, assolint valors relativament alts (5,9 ± 1,5 i 6,2 ± 1,5, respectivament).El gen semblant a l'endoglucan-1,3-β-glucosidasa TanjilG_23384 va mostrar una alta activació en els dos primers moments (6 i 12 hpi) a totes les línies excepte a la població 22660 (Fig. 6d).Els nivells d'expressió relativa més alts de TanjilG_23384 es van observar en el segon punt temporal (12 hpi) a Mandelup (2,7 ± 0,3) i 83A: 476 (1,5 ± 0,1).A 24 HPI, l'expressió de TanjilG_23384 era relativament baixa en totes les línies estudiades (de 0,04 ± 0,009 a 0,44 ± 0,12).
Perfils d'expressió de gens seleccionats (ag) revelats per PCR quantitativa.Els números 6, 12 i 24 representen hores després de la vacunació.Els gens LanDExH7 i LanTUB6 es van utilitzar per a la normalització i LanTUB6 es va utilitzar per al calibratge entre sèries.Les barres d'error representen la desviació estàndard basada en tres rèpliques biològiques, cadascuna de les quals és la mitjana de tres rèpliques tècniques. La significació estadística de les diferències en els nivells d'expressió entre les plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda l'any 1999 del camp de trams de Wierzenica, Polònia) i les plantes control (inoculades simulades) es marca per sobre dels punts de dades (* valor P < 0, 05, ** valor P ≤ 0.01, *** 0.0.0. La significació estadística de les diferències en els nivells d'expressió entre les plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda l'any 1999 del camp de trams de Wierzenica, Polònia) i les plantes control (inoculades simulades) es marca per sobre dels punts de dades (* valor P < 0, 05, ** valor P ≤ 0.01, *** 0.0.0. Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, мнш в прессии 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулирован ными) расчд мными и данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Les diferències estadísticament significatives en els nivells d'expressió entre les plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda l'any 1999 d'un camp de trams a Wierzhenice, Polònia) i les plantes control (inoculades simulades) s'observen per sobre dels punts de dades (* valor P < 0, 05, ** valor P ≤ 0, 0, 0, 0, 0, 0.接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟照（模拟掉模拟掉模拟掉的羽扇豆田获得）水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0,05, **P 值≤ 0,01, ***P 值≤ 〼001)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照簩 波兰 ） 波兰平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001)。 Статистически значимые различия в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini,м пшлированными, пшлированными, пшлутне олей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированы нымито расимы нымтето ме ными) ми данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Les diferències estadísticament significatives en els nivells d'expressió entre les plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda dels camps de trams a Verzhenice, Polònia, l'any 1999) i les plantes control (inoculades simulades) s'observen per sobre dels punts de dades (* valor P < 0, 05, ** valor P ≤ 0.01e, *** 0-0.Les línies NLL analitzades van ser: 83A:476 (resistent, que portava l'al·lel homozigot Lanr1), Mandelup (moderadament resistent, que portava l'al·lel homozigot AnMan), Boregine (resistent, fons genètic desconegut) i població 22660 (susceptible).
El gen candidat TanjilG_05042 al locus Lanr1 va mostrar un patró d'expressió marcadament diferent dels perfils obtinguts dels estudis d'ARN-seq (Fig. 6e).Es va observar una activació significativa d'aquest gen a Mandelup i la població de 22660 (fins a 39,7 i 11,7 vegades, respectivament), donant lloc a nivells d'expressió relativament alts (fins a 1,4 ± 0,14 i 7,2 ± 1,3, respectivament).83A:476 també va revelar una certa regulació del gen TanjilG_05042 (fins a 3,8 vegades), tanmateix, els nivells d'expressió relatius assolits (0,044 ± 0,002) van ser més de 30 vegades inferiors als observats a Mandelup i la població de 22660.analitzat per qPCR va mostrar diferències significatives en els nivells d'expressió entre genotips en variants simulades de vacunació (control), arribant a una diferència de 58 vegades entre les poblacions 22660 i 83A:476, així com entre les poblacions 22660 i 22660. Es va aconseguir una diferència doble entre Boregine i Mandalup.
El gen candidat al locus AnMan, TanjilG_12861, es va activar en resposta a la vacunació a 83A:476 i Mandelup, era neutral a la població de 22660 i es va regular a la baixa a Boregine (Fig. 6f).L'expressió relativa del gen TanjilG_12861 va ser la més alta en 83A inoculat: 476 (0,14±0,01).El gen de proteïna de xoc tèrmic de classe I de 17,4 kDa TanjilG_05080 HSP17.4 va mostrar nivells d'expressió relativa més baixos en totes les soques i punts de temps estudiats (Fig. 6g).El valor més alt es va observar a 24 HPI a la població de 22660 (0,14 ± 0,02, un augment de vuit vegades en resposta a la vacunació).
La comparació dels perfils d'expressió gènica (Fig. 7) va revelar una alta correlació entre TanjilG_10657 i altres quatre gens: TanjilG_27015 (r = 0,89), TanjilG_05080 (r = 0,85), TanjilG_05042 (r = 0,80.80.) i TanjilG_05042 (r = 0,80,_r) i 470,80.Aquests resultats poden indicar la coregulació d'aquests gens durant les respostes de defensa.Els gens TanjilG_12861 i TanjilG_23384 van mostrar diferents perfils d'expressió amb valors de coeficient de correlació de Pearson més baixos (de 0,08 a 0,43 i -0,19 a 0,28, respectivament) en comparació amb altres gens.
Les correlacions entre els perfils d'expressió gènica es van detectar mitjançant PCR quantitativa.Es van analitzar les següents línies de lupin de fulla estreta: 83A: 476 (resistent, que porta l'al·lel homozigot Lanr1), Mandelup (moderadament resistent, que porta l'al·lel homozigot AnMan), Boregine (resistent, fons genètic desconegut) i Població 22660 (susceptible).Es van calcular tres punts de temps (6, 12 i 24 hores després de la inoculació), incloent plantes inoculades (Colletotrichum lupini, soca Col-08, obtinguda de camps de trams a Wierzhenice, Polònia, el 1999) i plantes control (inoculades simulades).L'escala mostra el valor del coeficient de correlació de Pearson.
A partir de les dades obtingudes a 6 cavalls de potència per polzada, es va realitzar WGCNA a 9981 DEG identificats comparant plantes inoculades i control per centrar-se en les primeres respostes de defensa (taula suplementària S12).Es van trobar vint-i-dos mòduls de gens (clústers) amb perfils d'expressió correlacionats (positius o negatius) entre genotips i variants experimentals. De mitjana, els nivells d'expressió gènica estaven baixant en ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 (en ambdues variants, però, aquesta tendència era més forta a les plantes control). De mitjana, els nivells d'expressió gènica estaven baixant en ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 (en ambdues variants, però, aquesta tendència era més forta a les plantes control). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22.660 нденция была сильнее у контрольных растений). De mitjana, els nivells d'expressió gènica van disminuir en l'ordre 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 (en ambdues variants, però, aquesta tendència era més forta a les plantes control).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 的顺序下降（然而，在两缌䜨两罍两罌而言，基因表达水平按势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> població 22660 的 顺序 下降 （， ， 在 筌 在 筏 在在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。... В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 ция была сильнее у контрольных растений). De mitjana, els nivells d'expressió gènica van disminuir a la sèrie 83A:476 > Mandelup > Boregine > Població 22660 (no obstant això, en ambdues variants, aquesta tendència va ser més forta a les plantes control).La vacunació va donar lloc a una regulació positiva de l'expressió gènica, especialment als mòduls 18, 19, 14, 6 i 1 (en ordre decreixent d'efecte), regulació negativa (per exemple, mòduls 9 i 20) o amb efectes neutres (per exemple, mòduls 11, 22, 8 i 13).L'anàlisi d'enriquiment del terme GO (taula suplementària S13) va revelar "GO: 0006952 Respostes protectores" per al mòdul inoculat (18) amb la màxima activació, inclosos els gens analitzats per qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i la majoria de fotos suprimides) s mòduls (9).El concentrador del mòdul 18 (Fig. 8) es va identificar com el gen TanjilG_26536 que codifica la proteïna LlR18B semblant a PR-10, i el concentrador del mòdul 9 es va identificar com el gen TanjilG_28955 que codifica la proteïna PsbQ del fotosistema II.Un gen candidat de resistència a l'antracnosi Lanr1, TanjilG_05042, es va trobar al mòdul 22 (Fig. 9) i està associat amb els termes "GO:0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" i "GO:0006355 Transcriptional regulation, DNA Templating" que porta el concentrador TanjilG_01212.el gen codifica el factor de transcripció de l'estrès tèrmic A-4a (HSFA4a).
Anàlisi de xarxa ponderada de la coexpressió gènica de mòduls amb termes de procés biològic sobrerepresentats "GO: 0006952 Respostes de defensa".La lligadura es va simplificar per destacar els quatre gens analitzats per qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 i TanjilG_27015).
Anàlisi de xarxa ponderada de la coexpressió gènica d'un mòdul amb un terme de procés biològic sobrerepresentat "GO: 0006355: Regulació transcripcional, plantilla d'ADN" i que porta un gen candidat de resistència a l'antracnosi Lanr1 TanjilG_05042.La lligadura es va simplificar per aïllar el gen TanjilG_05042 i el gen central TanjilG_01212.
L'anàlisi de resistència a l'antracnosi recollida a Austràlia va mostrar que la majoria de les varietats alliberades primerenques eren susceptibles;Kalya, Coromup i Mandelup s'han descrit com a moderadament resistents, mentre que Wonga, Tanjil i 83A:476 s'han descrit com a altament resistents26,27,31.tenia el mateix al·lel de resistència, designat Lanr1, i Coromup i Mandelup tenien un al·lel diferent, designat AnMan10, 26, 39, mentre que Kalya va transmetre un al·lel diferent., Lanr2.El cribratge de la resistència a l'antracnosi a Alemanya va donar lloc a la identificació d'una línia resistent Bo7212 amb un al·lel candidat diferent a Lanr1, designat LanrBo36.
El nostre estudi va revelar una freqüència molt baixa (al voltant del 6%) de l'al·lel Lanr1 al germoplasma provat.Aquesta observació és coherent amb els resultats del cribratge del germoplasma d'Europa de l'Est mitjançant els marcadors Anseq3 i Anseq4, que van demostrar que l'al·lel Lanr1 només està present en dues línies bielorusses.Això suggereix que l'al·lel Lanr1 encara no és àmpliament utilitzat pels programes de cria locals, a diferència d'Austràlia, on és un dels al·lels clau per a la cria assistida per marcadors.Això pot ser degut al menor nivell de resistència proporcionat per l'al·lel Lanr1 en condicions de camp europeus en comparació amb l'informe australià.A més, els estudis sobre l'antracnosi a les zones de pluja alta a Austràlia han demostrat que les respostes de resistència mediades per l'al·lel Lanr1 poden no ser efectives en condicions meteorològiques que afavoreixen el creixement i el desenvolupament ràpid del patogen19,42.De fet, en el present estudi, també es van observar alguns símptomes d'antracnosi en genotips portadors de l'al·lel Lanr1, cosa que suggereix que la resistència pot desaparèixer en condicions òptimes per al desenvolupament de C. lupini.A més, són possibles interpretacions falses positives de la presència de marcadors Anseq3 i Anseq4, que es troben aproximadament a 1 cM del locus Lanr1 28,30,43.
El nostre estudi va demostrar que 83A:476, que portava l'al·lel Lanr1, responia a la inoculació de C. lupini amb una reprogramació del transcriptoma a gran escala en el primer moment analitzat (6 hpi), mentre que a Mandelup, que portava l'al·lel AnMan, es van observar respostes transcriptòmiques molt més tard.(de 24 a 48 CV).Aquestes variacions temporals en les respostes de defensa s'associen a diferències en els símptomes de la malaltia, posant de manifest la importància del reconeixement precoç dels patògens per a una resposta exitosa a la resistència.Per infectar el teixit vegetal, les espores d'àntrax han de passar per diverses etapes de desenvolupament a la superfície de l'hoste, incloent la germinació, la divisió cel·lular i la formació d'un apressori.Un apèndix és una estructura infecciosa que s'uneix a la superfície de l'hoste i facilita la penetració als teixits hoste.Així, les espores de C. gloeosporioides a l'extracte de pèsols van mostrar la primera divisió del nucli després de 75-90 minuts d'incubació, la formació d'un tub germinal després de 90-120 minuts i la supressió després de 4 hores 45 .Mango C. gloeosporioides va mostrar més del 40% de germinació conidial després de 3 hores d'incubació i aproximadament un 20% de formació d'apressors després de 4 hores.El gen CAP20 associat a la virulència de C. gloeosporioides va mostrar activitat transcripcional en conidis formadors d'epífits després de 3,5 h d'incubació en cera de superfície d'alvocat amb altes concentracions de proteïna CAP20 després de 4 h 46 min.De la mateixa manera, l'activitat dels gens de biosíntesi de melanina a C. trifolii es va induir durant una incubació de 2 hores seguida de la formació d'un apressori després d'1 hora.Els estudis de teixits foliars han demostrat que les maduixes inoculades amb C. acutatum tenen una primera supressió a 8 hpi, mentre que els tomàquets inoculats amb C. coccodes tenen una primera supressió a 4 hpi48,49.en gran mesura coherent amb l'escala temporal de Colletotrichum spp.procés infecciós.Les respostes ràpides de defensa a 83A:476 suggereixen la implicació de gens de resistència vegetal i immunitat activada per efector (ETI) en aquesta línia, mentre que les respostes retardades de Mandelup donen suport a la hipòtesi 50 de la immunitat activada per patrons moleculars microassociats (MTI). Respostes primerenques a 83A:476 i Mandelup.La superposició parcial entre els gens regulats a l'alça o a la baixa en la resposta retardada també dóna suport a aquest concepte, ja que sovint es considera que l'ETI és una resposta MTI accelerada i millorada que culmina amb la mort cel·lular programada al lloc de la infecció, coneguda com a xoc anafilàctic 51,52.
La majoria dels gens atribuïts al terme sobrerepresentat Gene Ontology GO: 0006952 "Defense Response" són els 11 homòlegs de la proteïna 22 del missatge de dejuni induït per l'estrès (semblant a SAM22) i els set principals tipus de proteïnes del làtex (MLP).-com les proteïnes 31, 34, 43 i 423 van mostrar una semblança de seqüències.Els gens semblants a SAM22 van mostrar una activació significativa que va durar més temps, mostrant un augment dels nivells de resistència a l'antracnosi (83A:476 i Boregine).Tanmateix, els gens semblants a MLP només es van regular a la baixa en línies que portaven l'al·lel de resistència candidat (83A: 476/Lanr1 a 6 hpi i Mandelup/AnMan a 24 hpi).Cal tenir en compte que tots els homòlegs semblants a SAM22 identificats s'originen a partir d'un clúster de gens que abasta aproximadament 105 kb, mentre que els gens semblants a MLP s'originen en regions separades del genoma.L'activació coordinada d'aquests gens semblants a SAM22 també es va trobar en el nostre estudi anterior de la resistència de NLL a la inoculació de Diaporthetoxica, cosa que suggereix que estan implicats en els components horitzontals de la resposta de defensa.Aquesta conclusió també es recolza en informes d'una resposta positiva de gens semblants a SAM22 a lesions o tractament amb àcid salicílic, inductors de fongs o peròxid d'hidrogen.
S'ha demostrat que els gens semblants a MLP responen a diverses tensions abiòtiques i biòtiques, incloses les infeccions bacterianes, virals i patògenes per fongs en moltes espècies vegetals55.Les direccions de resposta a determinades interaccions entre plantes i patògens van anar des d'un fort augment (és a dir, durant la infestació del cotó amb Verticillium dahliae) fins a una disminució significativa (és a dir, després de la infecció de la pomer amb Alternaria spp.)56,57.S'ha observat una disminució significativa del gen 423 semblant a MLP durant les defenses de l'alvocat davant la infecció per F. niger i durant la infecció de la pomer Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola i Alternaria alternata són patotips de poma58,59.A més, els calls de poma que sobreexpressaven el gen 423 semblant a MLP tenien una expressió més baixa de gens associats a la resistència i eren més susceptibles a la infecció per fongs59.Després de Fusarium oxysporum f, el gen 423 semblant a MLP també es va suprimir en el germoplasma de mongetes comuns resistents.cn.Infecció de fesols 60.
Altres membres de la família PR-10 identificats al nostre estudi RNA-seq van ser els gens LlR18A i LlR18B en resposta a la regulació a l'alça, així com el gen regulat a l'alça (1 gen) o a la baixa (3 gens) per a la proteïna de transferència de lípids DIR1..A més, WGCNA destaca el gen LlR18B com a centre d'aquest mòdul, que és molt susceptible a la vacunació i porta diversos gens de resposta protectora.Els gens LlR18A i LlR18B van ser induïts en fulles grogues de llupí com a resposta a bacteris patògens, així com en tiges de NLL després de la inoculació de D. toxica, mentre que l'homòleg d'arròs d'aquests gens, RSOsPR10, va ser induït ràpidament per una infecció per fongs presumiblement implicada en la via de senyalització de la proteïna no específica de l'àcid jasmònic. s que són necessàries per a l'aparició de la resistència sistèmica adquirida (SAR).Amb el desenvolupament de reaccions protectores, la proteïna DIR1 es transporta des del focus d'infecció a través del floema per induir SAR en òrgans llunyans.Curiosament, el gen TanjilG_02313 DIR1 es va induir significativament en el primer moment a les línies 84A:476 i la població 22660, però la resistència a l'antracnosi només es va desenvolupar amb èxit a la línia 84A:476.Això pot indicar una certa subfuncionalització del gen DIR1 a NLL, ja que els tres homòlegs restants van respondre a la inoculació només a la línia 83A:476 a 6 hpi, i aquesta resposta es va dirigir cap avall.
En el nostre estudi, els components més comuns corresponents al procés biològic anomenat "procés Redox GO:0055114" van ser la proteïna del citocrom P450, la peroxidasa, l'àcid linoleic 9S-/13S-lipoxigenasa i l'àcid 1-aminociclopropan-1-carboxílic oxidasa.A més, el nostre WGCNA defineix l'homòleg HSFA4a com un concentrador que porta mòduls com el candidat del gen de resistència Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a és un component de la regulació dependent de redox de la transcripció nuclear a les plantes.
Les proteïnes del citocrom P450 són oxidorreductases que catalitzen reaccions d'hidroxilació dependents de NADPH i/o O2 en el metabolisme primari i secundari, inclòs el metabolisme dels xenobiòtics, així com les hormones, els àcids grassos, els esterols, els components de la paret cel·lular, els biopolímers i la biosíntesi de la funció protectora. d de -10,6 log2 (canvi de vegades) a 5,7 a causa d'un gran nombre d'homòlegs alterats (37) i diferències en els patrons de resposta entre gens específics, que reflecteixen una revisió a l'alça..Utilitzar només dades d'ARN-seq per dilucidar la funció biològica putativa dels gens NLL en una superfamília de proteïnes tan gran seria molt especulatiu.No obstant això, val la pena assenyalar que alguns gens del citocrom P450 estan associats amb una major resistència als fongs o bacteris patògens, inclosa una contribució a les reaccions al·lèrgiques69,70,71.
Les peroxidases de classe III són enzims vegetals multifuncionals implicats en una àmplia gamma de processos metabòlics durant el creixement i desenvolupament de les plantes, així com en resposta a estrès ambientals com la salinitat, la sequera, l'alta intensitat de llum i l'atac de patògens72.Les peroxidases estan implicades en la interacció de diverses espècies vegetals amb Anthracis, incloent Stylosanthes humilis i C. gloeosporioides, Lens culinaris i C. truncatum, Phaseolus vulgaris i C. lindemuthianum, Cucumis sativus i C. lagenarium73,74,75,76.La resposta és molt ràpida, de vegades fins i tot a 4 HPI, abans que el fong penetri al teixit vegetal73.El gen de la peroxidasa també va respondre a la inoculació de D. toxica NLL.A més de les seves funcions típiques per regular l'esclat oxidatiu o eliminar l'estrès oxidatiu, les peroxidases poden interferir amb el creixement dels patògens creant barreres físiques basades en el reforç de la paret cel·lular durant la lignificació, la subunitat o la reticulació de compostos específics.Aquesta funció es pot atribuir in silico al gen TanjilG_03329 que codifica una putativa peroxidasa d'anió formadora de lignina que es va regular significativament en el nostre estudi a la línia resistent 83A:476 a 6 HPI, però no en altres soques i punts de temps que no van respondre.
La 9S-/13S-lipoxigenasa de l'àcid linoleic és el primer pas en la via oxidativa de la biosíntesi de lípids78.Els productes d'aquesta via tenen múltiples funcions en la defensa de les plantes, inclòs l'enfortiment de la paret cel·lular mitjançant la formació de dipòsits de callosa i pectina i la regulació de l'estrès oxidatiu mitjançant la producció d'espècies reactives d'oxigen79,80,81,82,83.En el present estudi, l'expressió de l'àcid linoleic 9S-/13S-lipoxigenasa es va alterar en totes les soques, però a la població susceptible 22660, la regulació va prevaldre en diferents moments, mentre que en les soques que portaven resistents Lanr1 i l'al·lel AnMan, emfatitza la diversificació de la capa d'oxilipina entre aquestes reaccions de genotips protectors.
L'homòleg de l'1-aminociclopropan-1-carboxilat oxidasa (ACO) es va regular significativament a l'alça (9 gens) o a la baixa (2 gens) quan es va inocular amb tramús.Amb dues excepcions, totes aquestes respostes es van produir a 6 CV.a 83A:476.La reacció enzimàtica mediada per les proteïnes ACO és el pas limitant de la velocitat en la producció d'etilè i, per tant, està altament regulada84.L'etilè és una hormona vegetal que juga una varietat de papers en la regulació del desenvolupament de les plantes i la resposta a les condicions d'estrès abiòtic i biòtic.La inducció de la transcripció ACO i l'activació de la via de senyalització de l'etilè estan implicades en l'augment de la resistència de l'arròs al fong hemibiotròfic oryzae oryzae mitjançant la regulació de la producció d'espècies reactives d'oxigen i fitoalexines.Un procés d'infecció de fulles molt similar trobat entre M. oryzae i C. lupini88,89, en el context d'una regulació significativa dels homòlegs d'ACO a la línia 83A:476 reportada en aquest estudi, canvia la possibilitat de conferir resistència a l'antracnosi NLL Etilè un pas central de senyalització en les vies moleculars.
En el present estudi, es va observar la supressió a gran escala de molts gens associats a la fotosíntesi a 6 hpi a 83A: 476 i a 48 hpi a Mandeloop i la població de 22660.L'abast i la progressió d'aquests canvis és proporcional al nivell.En aquest experiment es va observar resistència a l'antracnosi.Recentment, s'ha informat d'una repressió forta i primerenca de transcripcions relacionades amb la fotosíntesi en diversos models d'interaccions planta-patògen, inclosos bacteris i fongs patògens.La pressa (a partir de 2 HPI en algunes interaccions) i la supressió global dels gens associats a la fotosíntesi en resposta a la infecció poden desencadenar la immunitat vegetal basada en el desplegament d'espècies reactives d'oxigen i la seva interacció amb la via de l'àcid salicílic per mediar reaccions al·lèrgiques 90,94.
En conclusió, els mecanismes de resposta de defensa proposats per al llinatge més resistent (83A:476) inclouen el reconeixement ràpid de patògens pel gen R (presumiblement TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) i la senyalització d'àcid salicílic i etilè mediada per resposta al·lèrgica, seguida de l'establiment de SAR de llarg abast.L'acció està recolzada per la proteïna DIR-1.Cal tenir en compte que el període biotròfic de la infecció per C. lupini és molt curt (aproximadament 2 dies), seguit d'un creixement necròtic95.La transició entre aquestes etapes pot estar associada amb la necrosi i l'expressió de proteïnes induïbles per etilè que actuen com a desencadenants de reaccions d'hipersensibilitat a les plantes hostes.Per tant, la finestra de temps per a la captura amb èxit de C. lupini en l'etapa biotròfica és molt estreta.La reprogramació de gens associats amb redox i fotosíntesi observada a 83A:476 a 6 hpi és coherent amb la progressió de les hifes fúngiques i anuncia el desenvolupament d'una resposta protectora reeixida a l'etapa biotròfica.Les respostes transcriptòmiques de Mandelup i la població 22660 poden ser massa retardades per capturar el fong abans de canviar al creixement necròtic, però, Mandelup pot ser més eficaç que la població 22660 perquè la regulació relativament ràpida de la proteïna PR-10 promou la resistència horitzontal.
L'ETI, impulsada pel gen canònic R, sembla ser un mecanisme comú per a la resistència dels fesols a l'antracnosi.Així, en el model de llegum Medicago truncatula, la resistència a l'antracnosi la confereix el gen RCT1, membre de la classe del gen R de la planta TIR-NBS-LRR97.Aquest gen també confereix resistència a l'antracnosi d'ampli espectre a l'alfals quan es transfereix a plantes susceptibles.A la mongeta comuna (P. vulgaris) s'han identificat fins ara més de dues dotzenes de gens de resistència a l'antracnosi.Alguns d'aquests gens es troben a regions que no tenen cap gen canònic R, però molts altres es troben a les vores dels cromosomes que porten el clúster de gens NBS-LRR, inclòs TIR-NBS-LRRs99.L'estudi SSR a tot el genoma també va confirmar l'associació del gen NBS-LRR amb la resistència a l'antracnosi en el fesol comú.El gen R canònic també es va trobar a la regió genòmica que portava el principal lloc de resistència a l'antracnosi en el lupí blanc 101.
El nostre treball demostra que una reacció de resistència immediata, activada en una fase inicial de la infecció de les plantes (preferiblement no més tard de 12 hpi), protegeix eficaçment el tramús de fulla estreta de l'antracnosi causada pel fong patògen Collelotrichum lupini.Utilitzant una seqüenciació d'alt rendiment, vam demostrar perfils d'expressió diferencial de gens de resistència a l'antracnosi en plantes NLL mediades pels gens de resistència Lanr1 i AnMan.L'èxit de la defensa implica dissenyar acuradament els gens de les proteïnes implicades en la redox, la fotosíntesi i la patogènesi poques hores després del primer contacte de la planta amb un patogen.Reaccions protectores similars, però retardades en el temps, són molt menys efectives per protegir les plantes de malalties.La resistència a l'àntrax mediada pel gen Lanr1 s'assembla a la resposta ràpida típica del gen R (immunitat activada per l'efector), mentre que el gen AnMan probablement proporciona una resposta horitzontal (immunitat desencadenada per un patró molecular associat a microbis), proporcionant un nivell moderat de sostenibilitat.
Les 215 línies NLL utilitzades per detectar marcadors d'antracnosi constaven de 74 cultivars, 60 línies obtingudes per encreuament o cria, 5 mutants i 76 germoplasmes salvatges o originals.Les línies provenien de 17 països, principalment de Polònia (58), Espanya (47), Alemanya (27), Austràlia (26), Rússia (19), Bielorússia (7), Itàlia (5) i altres línies.de 10 països.El conjunt també inclou línies resistents de referència: 83A:476, Tanjil, Wonga que porta l'al·lel Lanr1 i Mandelup que porta l'al·lel AnMan.Les línies es van obtenir a partir de la base de dades de recursos genètics europeus de lupins mantinguda per Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Polònia (taula suplementària S1).
Les plantes es van cultivar en condicions controlades (fotoperíode 16 hores, temperatura 25 °C durant el dia i 18 °C a la nit).Es van analitzar dues rèpliques biològiques.L'ADN es va aïllar de fulles de tres setmanes amb el DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanya) segons el protocol.La qualitat i la concentració de l'ADN aïllat es va avaluar mitjançant mètodes espectrofotomètrics (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).Es van analitzar el marcador AnManM1 que marca el gen de resistència a l'antracnosi AnMan (derivat de cv. Mandelup) i els marcadors Anseq3 i Anseq4 que flanquegen el gen Lanr1 (derivat de cv. Tanjil) 11,26,28.Els homozigots per a l'al·lel resistent es van puntuar com a "1", susceptibles - com "0" i heterozigots - com 0,5.
A partir dels resultats del cribratge dels marcadors AnManM1, AnSeq3 i AnSeq4 i de la disponibilitat de llavors per als experiments de seguiment finals, es van seleccionar 50 línies NLL per al fenotipat de resistència a l'antracnosi.L'anàlisi es va realitzar per duplicat en un hivernacle controlat per ordinador amb un fotoperíode de 14 hores amb un rang de temperatura de 22 °C durant el dia i 19 °C a la nit.Les llavors es ratllen (tallant la coberta de la llavor al costat oposat de l'embrió amb una fulla afilada) abans de sembrar per evitar la latència de les llavors perquè la capa de la llavor és massa dura i per garantir una germinació uniforme.Les plantes es van cultivar en tests (11 × 11 × 21 cm) amb terra estèril (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsòvia, Polònia).La inoculació es va dur a terme amb la soca Colletotrichum lupini Col-08, cultivada l'any 1999 a partir de les tiges de plantes de trams de fulla estreta cultivades en un camp de Verzhenitsa, Gran Polònia (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E).Aconsegueix una àrea.Els aïllats es van cultivar en medi SNA a 20 °C sota llum negra durant 21 dies per induir l'esporulació.Quatre setmanes després de la sembra, quan les plantes havien arribat a l'etapa de 4-6 fulles, es va dur a terme la inoculació per polvorització amb una suspensió de conídis a una concentració de 0,5 x 106 conídis per ml.Després de la inoculació, les plantes es van mantenir a la foscor durant 24 hores a una humitat d'aproximadament el 98% i una temperatura de 25°C per facilitar la germinació dels conídis i el procés d'infecció.A continuació, les plantes es van cultivar sota un fotoperíode de 14 hores a 22 °C dia/19 °C a la nit i un 70% d'humitat.La puntuació de la malaltia es va fer 22 dies després de la inoculació i oscil·lava entre 0 (immune) i 9 (molt susceptible) depenent de la presència o absència de lesions necròtiques a les tiges i fulles.A més, després de puntuar, es va mesurar el pes de les plantes.Les relacions entre els genotips marcadors i els fenotips de la malaltia es van calcular com a correlacions puntuals de dues seqüències (absència de marcadors heterozigots en el conjunt de línies per a l'anàlisi del fenotip de resistència a l'antracnosi).