Gràcies per visitar Nature.com.La versió del navegador que utilitzeu té un suport CSS limitat.Per obtenir la millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o desactiveu el mode de compatibilitat a Internet Explorer).Mentrestant, per garantir un suport continuat, renderitzarem el lloc sense estils ni JavaScript.
Es necessita un sistema in vitro fiable que pugui reproduir amb precisió l'entorn fisiològic del cor per a les proves de fàrmacs.La disponibilitat limitada dels sistemes de cultiu de teixit cardíac humà ha donat lloc a interpretacions inexactes dels efectes dels fàrmacs cardíacs.Aquí, hem desenvolupat un model de cultiu de teixit cardíac (CTCM) que estimula electromecànicament les rodanxes del cor i experimenta un estirament fisiològic durant les fases sistòlica i diastòlica del cicle cardíac.Després de 12 dies de cultiu, aquest enfocament va millorar parcialment la viabilitat de les seccions del cor, però no va preservar completament la seva integritat estructural.Per tant, després del cribratge de molècules petites, vam trobar que l'addició de 100 nM de triiodotironina (T3) i 1 μM de dexametasona (Dex) al nostre medi va mantenir la microestructura de les seccions durant 12 dies.En combinació amb el tractament T3/Dex, el sistema CTCM va mantenir els perfils transcripcionals, la viabilitat, l'activitat metabòlica i la integritat estructural al mateix nivell que el teixit cardíac fresc durant 12 dies.A més, l'estirament excessiu del teixit cardíac en cultiu indueix una senyalització cardíaca hipertròfica, proporcionant proves de la capacitat del CTCM per imitar les condicions hipertròfiques induïdes per l'estirament cardíac.En conclusió, el CTCM pot modelar la fisiologia i la fisiopatologia del cor en cultiu durant llargs períodes de temps, permetent un cribratge fiable de fàrmacs.
Abans de la investigació clínica, es necessiten sistemes in vitro fiables que puguin reproduir amb precisió l'entorn fisiològic del cor humà.Aquests sistemes haurien d'imitar l'estirament mecànic alterat, la freqüència cardíaca i les propietats electrofisiològiques.Els models animals s'utilitzen habitualment com a plataforma de cribratge per a la fisiologia cardíaca amb una fiabilitat limitada per reflectir els efectes dels fàrmacs al cor humà1,2.En definitiva, el Model Experimental de Cultiu de Teixit Cardíac Ideal (CTCM) és un model molt sensible i específic per a diverses intervencions terapèutiques i farmacològiques, reproduint amb precisió la fisiologia i fisiopatologia del cor humà3.L'absència d'aquest sistema limita el descobriment de nous tractaments per a la insuficiència cardíaca4,5 i ha portat a la cardiotoxicitat dels fàrmacs com a motiu principal per sortir del mercat6.
Durant l'última dècada, vuit fàrmacs no cardiovasculars s'han retirat de l'ús clínic perquè provoquen una prolongació de l'interval QT que condueix a arítmies ventriculars i mort sobtada7.Per tant, hi ha una necessitat creixent d'estratègies de cribratge preclíniques fiables per avaluar l'eficàcia i la toxicitat cardiovascular.L'ús recent de cardiomiòcits derivats de cèl·lules mare pluripotents induïdes per humans (hiPS-CM) en el cribratge de fàrmacs i les proves de toxicitat proporciona una solució parcial a aquest problema.Tanmateix, la naturalesa immadura dels hiPS-CM i la manca de complexitat multicel·lular del teixit cardíac són les principals limitacions d'aquest mètode.Estudis recents han demostrat que aquesta limitació es pot superar en part utilitzant hiPS-CM primerenc per formar hidrogels de teixit cardíac poc després de l'aparició de contraccions espontànies i augmentant gradualment l'estimulació elèctrica amb el temps.Tanmateix, aquests microteixits hiPS-CM no tenen les propietats electrofisiològiques i contràctils madures del miocardi adult.A més, el teixit cardíac humà té una estructura més complexa, que consisteix en una barreja heterogènia de diferents tipus de cèl·lules, incloses cèl·lules endotelials, neurones i fibroblasts estromals, interconnectades per conjunts específics de proteïnes de la matriu extracel·lular.Aquesta heterogeneïtat de poblacions no cardiomiòcites11,12,13 al cor dels mamífers adults és una barrera important per modelar el teixit cardíac mitjançant tipus de cèl·lules individuals.Aquestes limitacions principals posen l'accent en la importància de desenvolupar mètodes per cultivar teixit miocàrdic intacte en condicions fisiològiques i patològiques.
Les seccions primes cultivades (300 µm) del cor humà han demostrat ser un model prometedor de miocardi humà intacte.Aquest mètode proporciona accés a un sistema multicel·lular 3D complet similar al teixit cardíac humà.Tanmateix, fins al 2019, l'ús de seccions de cor cultivades estava limitat per la supervivència curta (24 h) del cultiu.Això es deu a una sèrie de factors, com ara la manca d'estirament físic-mecànic, la interfície aire-líquid i l'ús de mitjans senzills que no donen suport a les necessitats del teixit cardíac.El 2019, diversos grups de recerca van demostrar que la incorporació de factors mecànics als sistemes de cultiu de teixit cardíac pot allargar la vida del cultiu, millorar l'expressió cardíaca i imitar la patologia cardíaca.Dos estudis elegants 17 i 18 mostren que la càrrega mecànica uniaxial té un efecte positiu sobre el fenotip cardíac durant el cultiu.Tanmateix, aquests estudis no van utilitzar la càrrega fisico-mecànica tridimensional dinàmica del cicle cardíac, ja que les seccions del cor es van carregar amb forces de tracció isomètriques 17 o amb càrrega auxotònica lineal 18 .Aquests mètodes d'estirament dels teixits van donar com a resultat la supressió de molts gens cardíacs o la sobreexpressió de gens associats a respostes d'estirament anormals.En particular, Pitoulis et al.19 va desenvolupar un bany de cultiu de talls de cor dinàmic per a la reconstrucció del cicle cardíac mitjançant la retroalimentació del transductor de força i les unitats de tensió.Tot i que aquest sistema permet un modelatge més precís del cicle cardíac in vitro, la complexitat i el baix rendiment del mètode limiten l'aplicació d'aquest sistema.El nostre laboratori ha desenvolupat recentment un sistema de cultiu simplificat mitjançant estimulació elèctrica i un medi optimitzat per mantenir la viabilitat de seccions de teixit cardíac porcí i humà fins a 6 dies20,21.
En el manuscrit actual, es descriu un model de cultiu de teixit cardíac (CTCM) utilitzant seccions del cor porcí que incorpora indicis humorals per recapitular la fisiologia cardíaca tridimensional i la distensió fisiopatològica durant el cicle cardíac.Aquest CTCM pot augmentar la precisió de la predicció preclínica de fàrmacs a un nivell mai s'havia aconseguit proporcionant un sistema cardíac rendible i de rendiment mitjà que imita la fisiologia/fisiopatologia del cor dels mamífers per a les proves preclíniques de fàrmacs.
Els senyals mecànics hemodinàmics tenen un paper crític en el manteniment de la funció dels cardiomiòcits in vitro 22,23,24.En el manuscrit actual, hem desenvolupat un CTCM (figura 1a) que pot imitar l'entorn cardíac adult induint estimulació elèctrica i mecànica a freqüències fisiològiques (1, 2 Hz, 72 batecs per minut).Per evitar un estirament excessiu del teixit durant la diàstole, es va utilitzar un dispositiu d'impressió 3D per augmentar la mida del teixit en un 25% (Fig. 1b).El ritme elèctric induït pel sistema C-PACE es va programar per començar 100 ms abans de la sístole mitjançant un sistema d'adquisició de dades per reproduir completament el cicle cardíac.El sistema de cultiu de teixits utilitza un actuador pneumàtic programable (LB Engineering, Alemanya) per expandir cíclicament una membrana de silicona flexible per provocar l'expansió de les rodanxes del cor a la cambra superior.El sistema es va connectar a una línia d'aire externa mitjançant un transductor de pressió, que va permetre ajustar amb precisió la pressió (± 1 mmHg) i el temps (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Connecteu la secció de teixit a l'anell de suport de 7 mm, mostrat en blau, dins de la cambra de cultiu del dispositiu.La cambra de cultiu està separada de la cambra d'aire per una fina membrana flexible de silicona.Col·loqueu una junta entre cada cambra per evitar fuites.La tapa del dispositiu conté elèctrodes de grafit que proporcionen estimulació elèctrica.b Representació esquemàtica del dispositiu de teixit gran, anell de guia i anell de suport.Les seccions de teixit (marrons) es col·loquen al dispositiu de gran mida amb l'anell guia col·locat a la ranura de la vora exterior del dispositiu.Utilitzant la guia, col·loqueu amb cura l'anell de suport recobert amb adhesiu acrílic de teixit sobre la secció de teixit cardíac.c Gràfic que mostra el temps d'estimulació elèctrica en funció de la pressió de la cambra d'aire controlada per un actuador pneumàtic programable (PPD).Es va utilitzar un dispositiu d'adquisició de dades per sincronitzar l'estimulació elèctrica mitjançant sensors de pressió.Quan la pressió a la cambra de cultiu arriba al llindar establert, s'envia un senyal de pols al C-PACE-EM per activar l'estimulació elèctrica.d Imatge de quatre CTCM col·locats a la prestatgeria d'una incubadora.Quatre dispositius estan connectats a un PPD mitjançant un circuit pneumàtic i s'insereixen sensors de pressió a la vàlvula hemostàtica per controlar la pressió al circuit pneumàtic.Cada dispositiu conté sis seccions de teixit.
Mitjançant un únic actuador pneumàtic, vam poder controlar 4 dispositius CTCM, cadascun dels quals podia contenir 6 seccions de teixit (Fig. 1d).En CTCM, la pressió de l'aire a la cambra d'aire es converteix en pressió sincrònica a la cambra de fluid i indueix l'expansió fisiològica de la rodanxa del cor (figura 2a i pel·lícula suplementària 1).Avaluació de l'estirament del teixit a 80 mm Hg.Art.va mostrar un estirament de les seccions de teixit en un 25% (Fig. 2b).S'ha demostrat que aquest estirament percentual correspon a una longitud de sarcòmer fisiològica de 2,2-2,3 µm per a la contractilitat de la secció cardíaca normal17,19,25.El moviment del teixit es va avaluar mitjançant la configuració personalitzada de la càmera (figura suplementària 1).L'amplitud i la velocitat del moviment del teixit (Fig. 2c, d) corresponien a l'estirament durant el cicle cardíac i al temps durant la sístole i la diàstole (Fig. 2b).L'estirament i la velocitat del teixit cardíac durant la contracció i la relaxació es van mantenir constants durant 12 dies en cultiu (Fig. 2f).Per avaluar l'efecte de l'estimulació elèctrica sobre la contractilitat durant el cultiu, vam desenvolupar un mètode per determinar la deformitat activa mitjançant un algorisme d'ombrejat (figura suplementària 2a, b) i vam poder distingir entre deformitats amb i sense estimulació elèctrica.La mateixa secció del cor (Fig. 2f).A la regió mòbil del tall (R6-9), la tensió durant l'estimulació elèctrica va ser un 20% més alta que en absència d'estimulació elèctrica, la qual cosa indica la contribució de l'estimulació elèctrica a la funció contràctil.
Els rastres representatius de la pressió de la cambra d'aire, la pressió de la cambra de fluids i les mesures del moviment del teixit confirmen que la pressió de la cambra canvia la pressió de la cambra del fluid, provocant un moviment corresponent de la porció de teixit.b Traces representatives del percentatge d'estirament (blau) de les seccions de teixit corresponents al percentatge d'estirament (taronja).c El moviment mesurat del tall cardíac és coherent amb la velocitat de moviment mesurada.( d ) Trajectòries representatives de moviment cíclic (línia blava) i velocitat (línia de punts taronja) en una rodanxa del cor.e Quantificació del temps de cicle (n = 19 rodanxes per grup, de diferents porcs), temps de contracció (n = 19 rodanxes per grup), temps de relaxació (n = 19 rodanxes per grup, de diferents porcs), moviment del teixit (n = 25 ).rodanxes)/grup de diferents porcs), velocitat sistòlica màxima (n = 24(D0), 25(D12) llesques/grup de diferents porcs) i velocitat màxima de relaxació (n=24(D0), 25(D12) llesques/grup de diferents porcs).La prova t de Student de dues cues no va mostrar cap diferència significativa en cap paràmetre.f Traces d'anàlisi de soques representatives de seccions de teixit amb estimulació elèctrica (vermell) i sense (blau), deu àrees regionals de seccions de teixit de la mateixa secció.Els panells inferiors mostren la quantificació de la diferència percentual de tensió en seccions de teixit amb i sense estimulació elèctrica en deu àrees de diferents seccions. (n = 8 llesques/grup de diferents porcs, es realitza la prova t Student de dues cues; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 llesques/grup de diferents porcs, es realitza la prova t Student de dues cues; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,00,<p<0,0,**p). (n = 8 seccions/grup de diferents porcs, prova t de Student de dues cues; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p < 0,0001， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p < 0,0001， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,01, *). (n = 8 seccions/grup, de diferents porcs, prova t de Student de dues cues; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
En el nostre sistema de cultiu de llesques de cor biomimètic estàtic anterior [20, 21], vam mantenir la viabilitat, la funció i la integritat estructural de les llesques de cor durant 6 dies aplicant estimulació elèctrica i optimitzant la composició del mitjà.No obstant això, després de 10 dies, aquestes xifres van baixar bruscament.Ens referirem a les seccions cultivades en el nostre sistema de cultiu biomimètic estàtic anterior 20, 21 condicions de control (Ctrl) i utilitzarem el nostre medi prèviament optimitzat com a condicions de MC i cultiu sota estimulació mecànica i elèctrica simultània (CTCM).va trucar .Primer, vam determinar que l'estimulació mecànica sense estimulació elèctrica era insuficient per mantenir la viabilitat del teixit durant 6 dies (figura suplementària 3a, b).Curiosament, amb la introducció de l'estimulació fisio-mecànica i elèctrica mitjançant STCM, la viabilitat de les seccions de cor de 12 dies es va mantenir igual que en les seccions de cor fresc en condicions de MS, però no en condicions de Ctrl, tal com mostra l'anàlisi MTT (Fig. 1).3a).Això suggereix que l'estimulació mecànica i la simulació del cicle cardíac poden mantenir viables les seccions de teixit durant el doble de temps que es va informar al nostre sistema de cultiu estàtic anterior.Tanmateix, l'avaluació de la integritat estructural de les seccions de teixit mitjançant l'immunomarcació de la troponina T cardíaca i la connexina 43 va mostrar que l'expressió de la connexina 43 era significativament més alta als teixits MC el dia 12 que als controls el mateix dia.Tanmateix, l'expressió uniforme de la connexina 43 i la formació del disc Z no es van mantenir completament (Fig. 3b).Utilitzem un marc d'intel·ligència artificial (IA) per quantificar la integritat estructural dels teixits26, un pipeline d'aprenentatge profund basat en imatges basat en troponina-T i tinció de connexina43 per quantificar automàticament la integritat estructural i la fluorescència de les rodanxes del cor en termes de força de localització.Aquest mètode utilitza una xarxa neuronal convolucional (CNN) i un marc d'aprenentatge profund per quantificar de manera fiable la integritat estructural del teixit cardíac de manera automatitzada i imparcial, tal com es descriu a la referència.26. El teixit MC va mostrar una semblança estructural millorada amb el dia 0 en comparació amb les seccions de control estàtiques.A més, la tinció de tricrom de Masson va revelar un percentatge significativament menor de fibrosi en condicions d'EM en comparació amb les condicions de control el dia 12 de cultiu (Fig. 3c).Si bé el CTCM va augmentar la viabilitat de les seccions de teixit cardíac el dia 12 a un nivell similar al del teixit cardíac fresc, no va millorar significativament la integritat estructural de les seccions del cor.
un gràfic de barres mostra la quantificació de la viabilitat MTT de rodanxes de cor frescos (D0) o cultiu de rodanxes de cor durant 12 dies, ja sigui en cultiu estàtic (D12 Ctrl) o en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC/Ctrl) d'una manera diferent; 0,0001 en comparació amb D0 i **p <0,01 en comparació amb D12 Ctrl). un gràfic de barres mostra la quantificació de la viabilitat MTT de rodanxes de cor frescos (D0) o cultiu de rodanxes de cor durant 12 dies, ja sigui en cultiu estàtic (D12 Ctrl) o en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl / grup es realitza d'una manera diferent de #pilices / grup NOVA) <0,0001 en comparació amb D0 i **p <0,01 en comparació amb D12 Ctrl).l'histograma mostra la quantificació de la viabilitat de seccions de cor fresc MTT (D0) o cultiu de seccions de cor durant 12 dies en cultiu estàtic (control D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0,0001 en comparació amb D0 i **p <0,01 en comparació amb D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刿片刿爇牄刿爇爇切爇爇)养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 来自不同猪的0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p <0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刌新鲜心脏刌搇琇片片刌片)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0,0001，与D12 Ctrl ，**p.histograma que mostra la quantificació de la viabilitat MTT en seccions de cor fresc (D0) o seccions de cor cultivades durant 12 dies en cultiu estàtic (control D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12)), 12 (D12 MC) seccions/grup de diferents proves ANOVA de porcs unidireccionals;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0,0001 en comparació amb D0, **p <0,01 en comparació amb D12 Ctrl).b Troponina-T (verd), connexina 43 (vermell) i DAPI (blau) en seccions de cor recentment aïllades (D0) o seccions de cor cultivades en condicions estàtiques (Ctrl) o condicions CTCM (MC) durant 12 dies) d'imatges d'immunofluorescència representatives (escala en blanc = 100 µm). Quantificació d'intel·ligència artificial de la integritat estructural del teixit cardíac (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) llesques/grup cadascuna de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p <0,0001 en comparació amb D0 i ****p <0,00012 C). Quantificació d'intel·ligència artificial de la integritat estructural del teixit cardíac (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) llesques/grup cadascuna de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p <0,0001 en comparació amb D0 i ****p <0,001 C en comparació amb D001). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектой целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (D0), (n = D1), (D02), (D1), (D1) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненей, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненится однофакторный тест ANOVA; ию с D12 Ctrl). Quantificació de la integritat estructural del teixit cardíac mitjançant intel·ligència artificial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seccions/grups de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional realitzada; ####p <0,0001 vs. amb D0 i ****p <0,0001 C en comparació amb D).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) llesques/grup cadascuna de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional <1 人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rodanxes/agrupar cadascun de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional 0 人####0 曔. ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной тканL (D12), (D12), =77нl (D12), MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сран0 вне1 сран0вне 1 с D12 Ctrl). Intel·ligència artificial per quantificar la integritat estructural del teixit cardíac (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seccions/grup cadascuna de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional; ####p<0,0001 vs .D0 Per a la comparació ****p <0,0001 C en comparació amb D). c Imatges representatives (esquerra) i quantificació (dreta) per a rodanxes de cor tacades amb la tinció de tricrom de Masson (escala nua = 500 µm) (n = 10 llesques/grup cadascuna de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p <0,0001 en comparació amb D0 i D0,0001 en comparació amb D0 i ***01). c Imatges representatives (esquerra) i quantificació (dreta) per a rodanxes de cor tacades amb la tinció de tricrom de Masson (escala nua = 500 µm) (n = 10 llesques/grup cadascuna de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; #### p <0,0001 en comparació amb C0 i D0,0001 en comparació amb D0 i D0. c Репрезентативные изображения (слева) i количественная оценка (справа) срезов сердца сердца, окричественная (справа) сителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиных свинтей, выпстоня вестоной ANOVA; #### p < 0,0001 per сравнению с D0 i ***p < 0,001 per сравнению с D12 Ctrl). c Imatges representatives (esquerra) i quantificació (dreta) de seccions del cor tacades amb la tinció de tricrom de Masson (escala sense recobrir = 500 µm) (n = 10 seccions/grup de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional realitzada; #### p < 0,0001 en comparació amb D0 i *** 2 C <0. c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺化（右）（裸尸（裸尪（10µ=m （裸尺010µ=m切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比 与D0 相比，D***1 测试４，D***1 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 心脏 切片 的 左 左）度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 单向##0 浛#0#0 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova ．#0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца сердца, окричественный анализ (справа) срезов сердца, окрынца сителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, просод свиньи, просод свиньи, просод протов факторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению Crсl D). c Imatges representatives (esquerra) i quantificació (dreta) de les seccions del cor tacades amb la tinció de tricrom de Masson (en blanc = 500 µm) (n = 10 seccions/grup, cadascuna d'un porc diferent, provada mitjançant anàlisi unidireccional de la variància; ### # p <0,0001 en comparació amb D0, 10 *** 2 C < 0, 1 *** 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 1, 0, 1, 2, 2, 3, 4, 4, 5, 5, 7, 8, 8, 8, 8, 8, 8).Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
Vam plantejar la hipòtesi que afegint petites molècules al medi de cultiu, es podria millorar la integritat dels cardiomiòcits i reduir el desenvolupament de la fibrosi durant el cultiu CTCM.Per tant, vam cercar molècules petites utilitzant els nostres cultius de control estàtic20,21 a causa del petit nombre de factors de confusió.Per a aquesta pantalla es van escollir dexametasona (Dex), triiodotironina (T3) i SB431542 (SB).Aquestes petites molècules s'han utilitzat prèviament en cultius hiPSC-CM per induir la maduració dels cardiomiòcits augmentant la longitud del sarcòmer, els túbuls T i la velocitat de conducció.A més, se sap que tant Dex (un glucocorticoide) com SB suprimeixen la inflamació29,30.Per tant, vam provar si la inclusió d'una o una combinació d'aquestes petites molècules milloraria la integritat estructural de les seccions del cor.Per al cribratge inicial, es va seleccionar la dosi de cada compost en funció de les concentracions que s'utilitzen habitualment en els models de cultiu cel·lular (1 μM Dex27, 100 nM T327 i 2,5 μM SB31).Després de 12 dies de cultiu, la combinació de T3 i Dex va donar lloc a una integritat estructural òptima dels cardiomiòcits i una remodelació fibrosa mínima (figures suplementàries 4 i 5).A més, l'ús del doble o el doble d'aquestes concentracions de T3 i Dex va produir efectes nocius en comparació amb les concentracions normals (figura suplementària 6a, b).
Després del cribratge inicial, vam realitzar una comparació cap a cap de 4 condicions de cultiu (figura 4a): Ctrl: seccions de cor cultivades al nostre cultiu estàtic descrit anteriorment amb el nostre medi optimitzat;20.21 TD: T3 i Ctrl s Added Dex el dimecres;MC: seccions de cor cultivades en CTCM utilitzant el nostre medi prèviament optimitzat;i MT: CTCM amb T3 i Dex afegits al medi.Després de 12 dies de cultiu, la viabilitat dels teixits MS i MT es va mantenir igual que en els teixits frescos avaluats per l'assaig MTT (Fig. 4b).Curiosament, l'addició de T3 i Dex als cultius transwell (TD) no va donar lloc a una millora significativa de la viabilitat en comparació amb les condicions Ctrl, cosa que indica un paper important de l'estimulació mecànica en el manteniment de la viabilitat de les seccions del cor.
un diagrama de disseny experimental que representa les quatre condicions de cultiu utilitzades per avaluar els efectes de l'estimulació mecànica i la suplementació de T3/Dex en medi durant 12 dies. b El gràfic de barres mostra la quantificació de la viabilitat 12 dies després del cultiu en les 4 condicions de cultiu (Ctrl, TD, MC i MT) en comparació amb les llesques de cor fresc (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC / grup) d'una manera diferent; 0,0001, ###p <0,001 en comparació amb D0 i **p <0,01 en comparació amb D12 Ctrl). b El gràfic de barres mostra la quantificació de la viabilitat 12 dies després del cultiu en les 4 condicions de cultiu (Ctrl, TD, MC i MT) en comparació amb les llesques de cor fresc (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC / grup) d'una manera diferent; 0,0001, ###p <0,001 en comparació amb D0 i **p <0,01 en comparació amb D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней послественную оценку жизнеспособности через 12 дней послетвенную кулсова ви4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (D0) (Dr2, D18) (D01, D18) 12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,00001 по,###p < 0,000001 посню D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b El gràfic de barres mostra la quantificació de la viabilitat als 12 dies posteriors al cultiu en les 4 condicions de cultiu (control, TD, MC i MT) en comparació amb les seccions de cor fresc (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) seccions / grup de proves ANOVA, #-0 de diferents sentits; 1, ###p <0,001 enfront de D0 i **p <0,01 en comparació amb D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D15) 、D12、D12、D12、D12和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，#，，，##0.p 01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнения сравнения сравнения ца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, однопа, одно,##0нторо,##0н0 p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma que mostra les 4 condicions de cultiu (control, TD, MC i MT) en comparació amb les seccions de cor fresc (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), de diferents porcs 12 (D12 MC) seccions/grup, prova ANOVA unidireccional <; ##0.<0, ###0. **p<0,01 vs control D12). c El gràfic de barres mostra la quantificació del flux de glucosa 12 dies després del cultiu en les 4 condicions de cultiu (Ctrl, TD, MC i MT) en comparació amb llesques de cor fresc (D0) (n = 6 llesques/grup de diferents porcs, es realitza la prova ANOVA unidireccional; ###p <0,001, en comparació amb D0.0 i ***0p <0.001, comparació amb D0. c El gràfic de barres mostra la quantificació del flux de glucosa 12 dies després del cultiu en les 4 condicions de cultiu (Ctrl, TD, MC i MT) en comparació amb llesques de cor fresc (D0) (n = 6 llesques/grup de diferents porcs, es realitza la prova ANOVA unidireccional; ###p <0,001, en comparació amb D0.0 i ***0p <0.001, comparació amb D0. c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после ственную оценку потока глюкозы через 12 дней после курьсле курьвоста овиях культивирования (контроль, TD, MC i MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 правнению свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению C. D0. c L'histograma mostra la quantificació del flux de glucosa 12 dies després del cultiu en les 4 condicions de cultiu (control, TD, MC i MT) en comparació amb seccions de cor fresc (D0) (n = 6 seccions/grup de diferents porcs, prova d'ANOVA unidireccional realitzada; ###p <0,001 en comparació amb D0 i ***p < 0,102 en comparació amb D0). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1＄囌柯1）糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试; l 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片片片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 定量 ， ， 啵 ， ， 啵 ， ， 来自 猪 ， NOVA试；###p <0,001，与D0 相比，***p <0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послетви курьвя венную оценку потока глюкозы через 4 условий культивирования (контроль, TD, MC i MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) / по сравнению со свежими срезами сердца (D0)/пра Сравнению ных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сниро по снл2). c Histograma que mostra la quantificació del flux de glucosa als 12 dies posteriors al cultiu per a les 4 condicions de cultiu (control, TD, MC i MT) en comparació amb les seccions de cor fresc (D0) (n = 6 seccions/grup, de diferents porcs, es van realitzar proves ANOVA unilaterals, ###p <0,001 en comparació amb el control de 0,0,101).d Anàlisi de soques de teixits frescos (blau), MC del dia 12 (verd) i del dia 12 MT (vermell) en deu punts de secció de teixit regional (n = 4 llesques/grup, prova ANOVA unidireccional; no hi va haver cap diferència significativa entre grups).e Gràfic del volcà que mostra gens expressats de manera diferent en seccions de cor fresc (D0) en comparació amb seccions de cor cultivades en condicions estàtiques (Ctrl) o en condicions MT (MT) durant 10-12 dies.f Mapa de calor dels gens del sarcòmer per a seccions de cor cultivades sota cadascuna de les condicions de cultiu.Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
La dependència metabòlica del canvi de l'oxidació d'àcids grassos a la glucòlisi és un segell distintiu de la desdiferenciació dels cardiomiòcits.Els cardiomiòcits immadurs utilitzen principalment glucosa per a la producció d'ATP i tenen mitocondris hipoplàstics amb poques cristades5,32.Les anàlisis d'utilització de glucosa van mostrar que en condicions de MC i MT, la utilització de la glucosa era similar a la dels teixits del dia 0 (figura 4c).Tanmateix, les mostres de Ctrl van mostrar un augment significatiu de la utilització de glucosa en comparació amb el teixit fresc.Això indica que la combinació de CTCM i T3/Dex millora la viabilitat dels teixits i preserva el fenotip metabòlic de les seccions del cor de cultiu de 12 dies.A més, l'anàlisi de soca va mostrar que els nivells de soca es van mantenir els mateixos que en el teixit cardíac fresc durant 12 dies en condicions de MT i MS (Fig. 4d).
Per analitzar l'impacte global de CTCM i T3/Dex en el paisatge transcripcional global del teixit de llesca cardíaca, vam realitzar RNAseq en rodanxes cardíaques de les quatre condicions de cultiu diferents (dades suplementàries 1).Curiosament, les seccions de MT van mostrar una gran similitud transcripcional amb el teixit cardíac fresc, amb només 16 expressats de manera diferencial de 13.642 gens.Tanmateix, com vam mostrar anteriorment, les rodanxes Ctrl mostraven 1229 gens expressats de manera diferent després de 10-12 dies en cultiu (Fig. 4e).Aquestes dades es van confirmar mitjançant qRT-PCR dels gens del cor i dels fibroblasts (figura suplementària 7a-c).Curiosament, les seccions Ctrl van mostrar una regulació a la baixa dels gens cardíacs i del cicle cel·lular i l'activació de programes de gens inflamatoris.Aquestes dades suggereixen que la desdiferenciació, que normalment es produeix després del cultiu a llarg termini, s'atenua completament en condicions de MT (figura suplementària 8a, b).Un estudi acurat dels gens del sarcòmer va demostrar que només en condicions MT es conserven els gens que codifiquen el sarcòmer (Fig. 4f) i el canal iònic (Fig. 9 suplementària), protegint-los de la supressió en condicions Ctrl, TD i MC.Aquestes dades demostren que amb una combinació d'estimulació mecànica i humoral (T3/Dex), el transcriptoma de la llesca cardíaca pot romandre similar a les rodanxes de cor fresques després de 12 dies en cultiu.
Aquestes troballes transcripcionals es recolzen en el fet que la integritat estructural dels cardiomiòcits a les seccions del cor es conserva millor en condicions de MT durant 12 dies, tal com mostra la connexina 43 intacta i localitzada (Fig. 5a).A més, la fibrosi a les seccions del cor en condicions de MT es va reduir significativament en comparació amb Ctrl i similar a les seccions del cor fresc (Fig. 5b).Aquestes dades demostren que la combinació d'estimulació mecànica i tractament amb T3/Dex preserva eficaçment l'estructura cardíaca en seccions del cor en cultiu.
a Imatges d'immunofluorescència representatives de troponina-T (verd), connexina 43 (vermell) i DAPI (blau) en seccions de cor recentment aïllades (D0) o cultivades durant 12 dies en les quatre condicions de cultiu de seccions de cor (barra d'escala = 100 µm).). Quantificació d'intel·ligència artificial de la integritat estructural del teixit cardíac (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) llesques/grup de diferents porcs, es realitza la prova ANOVA unidireccional; ####p <0,0001 en comparació amb D0 i *p0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0 p trl). Quantificació d'intel·ligència artificial de la integritat estructural del teixit cardíac (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) llesques/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; #### p <0,0001 en comparació amb D0 i *p0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0 trl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = интого = инт2 (D7) 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0 пен0 сра 0 пен 0 0 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificació de la integritat estructural del teixit cardíac mitjançant la intel·ligència artificial (n = 7 (D0 i D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) seccions/grup de diferents porcs, una prova ANOVA d’un-via realitzada; #### p <0,0001 en comparació amb D0 i*P <0,05 o***** p <0,0001 comparat amb D12 CTRL).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和/D12 和廿艺廿艺廿艺廿MT工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p 或****p < 0,000001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,000001 或对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 td 、 d12 mc（ 和 d12 mc） 和 d12 ctrl）智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相 0,05 相 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0相比）.Quantificació de la integritat estructural del teixit cardíac mitjançant intel·ligència artificial en diferents porcs (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) seccions/grup) amb una prova ANOVA unidireccional;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0,0001 en comparació amb D0 i *p <0,05 o ****p <0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). b Imatges representatives i quantificació per a rodanxes de cor tacades amb la tinció de tricrom de Masson (barra d'escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) rodanxes/grup de diferents porcs, es realitza unidireccionalment la prova ANOVA ##0. <0,001, o ****p <0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). b Imatges representatives i quantificació per a rodanxes de cor tacades amb la tinció de tricrom de Masson (barra d'escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) rodanxes/grup de diferents porcs, es realitza unidireccionalment la prova ANOVA ##0. <0,001, o ****p <0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных траственная оценка срезов сердца а (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от раснно витхння вит разновя сторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению сl D12 Ct). b Imatges representatives i quantificació de seccions de cor tacades amb tinció de tricrom de Masson (barra d'escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) seccions/grup de diferents porcs, realitzades ANOVA unidireccional <; ##.#0.0.0.0.0. ****p <0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼉（D1010（D10 Cd100（D1 。和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个析； 个 析； 个 析； 个 析； 缔 0. 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） 10 （ 0 （ 500 µm d （ 10 （ （ （ （ （ （ （ ） rl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 不同 切片 切片 切片 切片 切片 爇片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析＇ 分析， 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析，分析， 析 01 分析 析 析 攸#0p0 < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных тросо ая линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней 01 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imatges representatives i quantificació de seccions de cor tacades amb tricrom de Masson (barra d'escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) seccions de diferents porcs/grup, un mètode ANOVA; ####p; ####p < *** 0, < 0, < 0, < 0, 0, < 0, 0, 0, 1, 1, 1, 1, 1, 1. 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl).Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
Finalment, es va avaluar la capacitat del CTCM per imitar la hipertròfia cardíaca augmentant l'estirament del teixit cardíac.En CTCM, la pressió màxima de la cambra d'aire va augmentar de 80 mmHg a 80 mmHg.Art.(estirament normal) fins a 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Això correspon a un augment del 32% de l'estirament (Fig. 6b), que anteriorment es mostrava com el percentatge d'estirament corresponent requerit per a les seccions del cor per aconseguir una longitud de sarcòmer similar a la observada a la hipertròfia.L'estirament i la velocitat del teixit cardíac durant la contracció i la relaxació es van mantenir constants durant sis dies de cultiu (Fig. 6c).El teixit cardíac de les condicions de MT va ser sotmès a condicions d'estirament normal (MT (Normal)) o d'excés d'estirament (MT (OS)) durant sis dies.Ja després de quatre dies de cultiu, el biomarcador hipertròfic NT-ProBNP es va elevar significativament al medi en condicions MT (OS) en comparació amb condicions MT (normals) (Fig. 7a).A més, després de sis dies de cultiu, la mida de les cèl·lules a MT (OS) (Fig. 7b) va augmentar significativament en comparació amb les seccions del cor de MT (normal).A més, la translocació nuclear de NFATC4 va augmentar significativament en teixits sobreestirats (Fig. 7c).Aquests resultats mostren el desenvolupament progressiu de la remodelació patològica després de la hiperdistensió i donen suport al concepte que el dispositiu CTCM es pot utilitzar com a plataforma per estudiar la senyalització de la hipertròfia cardíaca induïda per estiraments.
Els rastres representatius de la pressió de la cambra d'aire, la pressió de la cambra de fluids i les mesures del moviment del teixit confirmen que la pressió de la cambra canvia la pressió de la cambra del fluid, provocant un moviment corresponent de la porció de teixit.b Corbes representatives de percentatge d'estirament i velocitat d'estirament per a seccions de teixit normalment estirats (taronja) i sobreestirats (blau).c Gràfic de barres que mostra el temps de cicle (n = 19 llesques per grup, de diferents porcs), el temps de contracció (n = 18-19 llesques per grup, de diferents porcs), el temps de relaxació (n = 19 llesques per grup, de diferents porcs) ), l'amplitud del moviment del teixit (n = 14 llesques per grup), velocitat de peak = 1 piles/grup, 4 velocitats diferents de diferents porcs) i la taxa de relaxació màxima (n = 14 (D0), 15 (D6) ) seccions/grups) de diferents porcs), la prova t de Student de dues cues no va mostrar cap diferència significativa en cap paràmetre, cosa que indica que aquests paràmetres es van mantenir constants durant 6 dies de cultiu amb sobretensió.Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
a Quantificació gràfica de barres de la concentració de NT-ProBNP en medis de cultiu a partir de rodanxes de cor cultivades en condicions d'estirament normal (Norm) o sobreestirament (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) llesques/grup de diferents porcs, es realitza ANOVA bidireccional < 0 normal; **1p. a Quantificació gràfica de barres de la concentració de NT-ProBNP en medis de cultiu a partir de rodanxes de cor cultivades en condicions d'estirament normal (Norm) o sobreestirament (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) llesques/grup de diferents porcs, es realitza ANOVA bidireccional <0; **1p es compara amb normal.Histograma quantitatiu de la concentració de NT-ProBNP en medi de cultiu a partir de rodanxes de cor cultivades en condicions d'estirament MT normal (norma) o sobreestirament (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4).MTOS) llesques / grup de diferents porcs, es realitza una anàlisi de la variància en dos factors;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0,01 en comparació amb l'estirament normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡閼度齄坡閼坡培养的心脏切片培养基中(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析方差分析）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；丣丣；攸析；攸攛攸攛攛0,01）。 a Quantificació de la concentració de NT-ProBNP en rodanxes de cor cultivades en condicions d'estirament normal (Norm) o sobreestirament (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) a partir de diferents comparat amb l'estirament normal, p <0,01).histograma Quantificació de concentracions de NT-ProBNP en rodanxes de cor cultivades en condicions d'estirament MT normal (norma) o sobreestirament (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) i D4 MTOS) llesques/grup de diferents porcs, anàlisi bidireccional de la variància;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0,01 en comparació amb l'estirament normal). b Imatges representatives per a rodanxes de cor tacades amb troponina-T i WGA (esquerra) i quantificació de la mida de les cèl·lules (dreta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cèl·lules/grup de 10 rodanxes diferents de diferents porcs, es realitza la prova t Student de dues cues; ****p0 < 0 en comparació amb 0. b Imatges representatives per a rodanxes de cor tacades amb troponina-T i WGA (esquerra) i quantificació de la mida de les cèl·lules (dreta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cèl·lules/grup de 10 rodanxes diferents de diferents porcs, es realitza la prova t de Student de dues cues; ****p <10 en comparació amb normal. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) АЗП (слестова) пичнных тропонином-Т ения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезов от срезов от вория тся хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imatges representatives de seccions del cor tacades amb troponina-T i AZP (esquerra) i quantificació de la mida de les cèl·lules (dreta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cèl·lules/grup de 10 seccions diferents de diferents porcs, es va realitzar la prova t de Student de dues cues; ****p < 0 en comparació amb la normal. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表的代表性30（（（（（（（） （右）染色的心脏切片的代表怏，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生切片的369 （D6 MTNorm） ，****p <0,0001）。 b Imatges representatives de rodanxes de cor tacades amb calcareïna-T i WGA (esquerra) i mida cel·lular (dreta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 de 10 rodanxes diferents (D6 MTNorm)) ). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестнава ичнных) размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свируней пи, Крунет пи, Курнеток критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imatges representatives de seccions del cor tacades amb troponina-T i AZP (esquerra) i quantificació de la mida cel·lular (dreta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 seccions diferents de diferents porcs) Cèl·lules/grup, criteri de dues cues t de l'estudiant;****p <0,0001 en comparació amb la soca normal). c Imatges representatives per a rodanxes de cor MTOS del dia 0 i del dia 6 immunomarcades per a troponina-T i NFATC4 i quantificació de la translocació de NFATC4 als nuclis de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rodanxes/grup de diferents porcs, es realitza la prova t-p Student de dues cues. c Imatges representatives per a rodanxes de cor MTOS del dia 0 i del dia 6 immunomarcades per a troponina-T i NFATC4 i quantificació de la translocació de NFATC4 als nuclis de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) llesques/grup de diferents porcs, * es realitza la prova t-p d'estudiant de dues cues. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропон и тропон и трозов тропо и 6 енная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу срезов/группу осви нырта озных клеток я двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imatges representatives per a seccions del cor a 0 i 6 dies MTOS, immunomarcades per a troponina-T i NFATC4, i quantificació de la translocació de NFATC4 al nucli de cèl·lules cavernoses (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) llesques/grup de diferents porcs) van realitzar dues cues;*p <0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏的廣表怏，标记的第天和第6的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生双尾学的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生双尾学生t 05锟t 0. c Imatges representatives de la immunomarcació de calcanina-T i NFATC4 第0天和第6天MTOS rodanxes de cor i NFATC4 de diferents quantitats de nuclis de cèl·lules NFATC4 易位至CM (n = 4 (D0), 3 (D6 天和), 3 (D6 MTOS,) 易位至CM学生et 电影；*p <0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки трозов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромуномаркировки тром поТи тром по 4 енная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два-стати срез/группа, два-статрей свиней юдента; *p <0,05). c Imatges representatives de llesques de cor MTOS els dies 0 i 6 per a l'immunomarcació de troponina-T i NFATC4 i quantificació de la translocació de NFATC4 al nucli de CM de diferents porcs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) llesques/grup, criteri t de dues cues.Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
La investigació cardiovascular translacional requereix models cel·lulars que reprodueixin amb precisió l'entorn cardíac.En aquest estudi, es va desenvolupar i caracteritzar un dispositiu CTCM que pot estimular seccions ultrafines del cor.El sistema CTCM inclou estimulació electromecànica sincronitzada fisiològicament i enriquiment amb fluids T3 i Dex.Quan les seccions de cor porcí es van exposar a aquests factors, la seva viabilitat, integritat estructural, activitat metabòlica i expressió transcripcional es van mantenir iguals que en el teixit cardíac fresc després de 12 dies de cultiu.A més, l'estirament excessiu del teixit cardíac pot provocar una hipertròfia del cor causada per la hiperextensió.En general, aquests resultats donen suport al paper crític de les condicions de cultiu fisiològic en el manteniment d'un fenotip cardíac normal i proporcionen una plataforma per al cribratge de fàrmacs.
Molts factors contribueixen a crear un entorn òptim per al funcionament i la supervivència dels cardiomiòcits.Els més evidents d'aquests factors estan relacionats amb (1) interaccions intercel·lulars, (2) estimulació electromecànica, (3) factors humorals i (4) substrats metabòlics.Les interaccions fisiològiques cèl·lula a cèl·lula requereixen xarxes tridimensionals complexes de múltiples tipus de cèl·lules suportades per una matriu extracel·lular.Aquestes interaccions cel·lulars complexes són difícils de reconstruir in vitro mitjançant el cocultiu de tipus cel·lulars individuals, però es poden aconseguir fàcilment mitjançant la naturalesa organotípica de les seccions del cor.
L'estirament mecànic i l'estimulació elèctrica dels cardiomiòcits són fonamentals per mantenir el fenotip cardíac33,34,35.Si bé l'estimulació mecànica s'ha utilitzat àmpliament per al condicionament i la maduració d'hiPSC-CM, diversos estudis elegants han intentat recentment l'estimulació mecànica de rodanxes de cor en cultiu mitjançant càrrega uniaxial.Aquests estudis mostren que la càrrega mecànica uniaxial 2D té un efecte positiu sobre el fenotip del cor durant el cultiu.En aquests estudis, les seccions del cor es van carregar amb forces de tracció isomètriques17, càrrega auxotònica lineal18 o es va recrear el cicle cardíac mitjançant retroalimentació del transductor de força i impulsos de tensió.Tanmateix, aquests mètodes utilitzen l'estirament del teixit uniaxial sense optimització ambiental, donant lloc a la supressió de molts gens cardíacs o a la sobreexpressió de gens associats a respostes d'estirament anormals.El CTCM descrit aquí proporciona un estímul electromecànic 3D que imita el cicle cardíac natural en termes de temps de cicle i estirament fisiològic (estirament del 25%, sístole del 40%, diàstole del 60% i 72 batecs per minut).Tot i que aquesta estimulació mecànica tridimensional per si sola no és suficient per mantenir la integritat del teixit, es requereix una combinació d'estimulació humoral i mecànica amb T3/Dex per mantenir adequadament la viabilitat, la funció i la integritat del teixit.
Els factors humorals tenen un paper important en la modulació del fenotip del cor adult.Això es va destacar en estudis HiPS-CM en què es van afegir T3 i Dex als medis de cultiu per accelerar la maduració cel·lular.La T3 pot influir en el transport d'aminoàcids, sucres i calci a través de les membranes cel·lulars36.A més, T3 promou l'expressió de MHC-α i la regulació a la baixa de MHC-β, afavorint la formació de miofibrils de contracció ràpida en cardiomiòcits madurs en comparació amb les miofibrils de contracció lenta en CM fetal.La deficiència de T3 en pacients amb hipotiroides provoca la pèrdua de bandes miofibril·lars i una taxa reduïda de desenvolupament del to37.Dex actua sobre els receptors de glucocorticoides i s'ha demostrat que augmenta la contractilitat del miocardi en cors perfusos aïllats;38 Es creu que aquesta millora està relacionada amb l'efecte sobre l'entrada impulsada per dipòsits de calci (SOCE) 39,40.A més, Dex s'uneix als seus receptors, provocant una àmplia resposta intracel·lular que suprimeix la funció immune i la inflamació30.
Els nostres resultats indiquen que l'estimulació física mecànica (EM) va millorar el rendiment global del cultiu en comparació amb Ctrl, però no va poder mantenir la viabilitat, la integritat estructural i l'expressió cardíaca durant 12 dies en cultiu.En comparació amb Ctrl, l'addició de T3 i Dex als cultius CTCM (MT) va millorar la viabilitat i va mantenir perfils de transcripció similars, integritat estructural i activitat metabòlica amb teixit cardíac fresc durant 12 dies.A més, controlant el grau d'estirament del teixit, es va crear un model d'hipertròfia cardíaca induïda per hiperextensió mitjançant STCM, que il·lustra la versatilitat del sistema STCM.Cal tenir en compte que, tot i que la remodelació cardíaca i la fibrosi solen implicar òrgans intactes les cèl·lules circulants dels quals poden proporcionar les citocines adequades, així com la fagocitosi i altres factors de remodelació, seccions del cor encara poden imitar el procés fibròtic en resposta a l'estrès i el trauma.als miofibroblasts.Això s'ha avaluat prèviament en aquest model de tall cardíac.Cal tenir en compte que els paràmetres CTCM es poden modular canviant la pressió/amplitud elèctrica i la freqüència per simular moltes condicions com ara taquicàrdia, bradicàrdia i suport circulatori mecànic (cor descarregat mecànic).Això fa que el sistema sigui un rendiment mitjà per a les proves de drogues.La capacitat del CTCM per modelar la hipertròfia cardíaca induïda pel sobreesforç obre el camí per provar aquest sistema per a una teràpia personalitzada.En conclusió, el present estudi demostra que l'estirament mecànic i l'estimulació humoral són fonamentals per mantenir el cultiu de seccions de teixit cardíac.
Tot i que les dades que es presenten aquí suggereixen que CTCM és una plataforma molt prometedora per modelar el miocardi intacte, aquest mètode de cultiu té algunes limitacions.La principal limitació del cultiu CTCM és que imposa tensions mecàniques dinàmiques contínues a les rodanxes, la qual cosa impedeix la possibilitat de controlar activament les contraccions del tall cardíac durant cada cicle.A més, a causa de la petita mida de les seccions cardíaques (7 mm), la capacitat d'avaluar la funció sistòlica fora dels sistemes de cultiu mitjançant sensors de força tradicionals és limitada.En el manuscrit actual, superem parcialment aquesta limitació avaluant la tensió òptica com a indicador de la funció contràctil.Tanmateix, aquesta limitació requerirà més treballs i es pot abordar en el futur mitjançant la introducció de mètodes per al control òptic de la funció de les rodanxes del cor en cultiu, com ara el mapeig òptic amb colorants sensibles al calci i al voltatge.Una altra limitació del CTCM és que el model de treball no manipula l'estrès fisiològic (precàrrega i postcàrrega).En CTCM, la pressió es va induir en direccions oposades per reproduir un estirament fisiològic del 25% en diàstole (estirament complet) i sístole (durada de la contracció durant l'estimulació elèctrica) en teixits molt grans.Aquesta limitació s'hauria d'eliminar en futurs dissenys de CTCM mitjançant una pressió adequada sobre el teixit cardíac des d'ambdós costats i aplicant les relacions exactes pressió-volum que es produeixen a les cambres del cor.
La remodelació induïda per l'excés d'estirament informada en aquest manuscrit es limita a imitar senyals hipertròfics d'hiperestirament.Així, aquest model pot ajudar en l'estudi de la senyalització hipertròfica induïda per estiraments sense necessitat de factors humorals o neuronals (que no existeixen en aquest sistema).Es necessiten més estudis per augmentar la multiplicitat de CTCM, per exemple, el co-cultiu amb cèl·lules immunitàries, els factors humorals del plasma circulant i la innervació quan el co-cultiu amb cèl·lules neuronals millorarà les possibilitats de modelització de malalties amb CTCM.
En aquest estudi es van utilitzar tretze porcs.Tots els procediments amb animals es van realitzar d'acord amb les directrius institucionals i van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Louisville.Es va fixar l'arc aòrtic i es va perfondre el cor amb 1 L de cardioplegia estèril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL d'heparina, pH fins a 7,4); els cors es van conservar en una solució cardioplègica gelada fins que es van transportar al laboratori sobre gel que sol ser <10 min. els cors es van conservar en una solució cardioplègica gelada fins que es van transportar al laboratori sobre gel que sol ser <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчдон на ет <10 мин. els cors es van emmagatzemar en una solució cardioplègica gelada fins al seu transport al laboratori sobre gel, que sol trigar <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычмно <10 Mantenir els cors en gel cardioplegia fins al seu transport al laboratori sobre gel, normalment <10 min.
El dispositiu CTCM es va desenvolupar amb el programari de disseny assistit per ordinador (CAD) SolidWorks.Les cambres de cultiu, els divisors i les cambres d'aire estan fetes de plàstic acrílic transparent CNC.L'anell de seguretat de 7 mm de diàmetre està fet de polietilè d'alta densitat (HDPE) al centre i té una ranura per a l'anell tòric per acomodar l'anell tòric de silicona que s'utilitza per segellar el suport a sota.Una fina membrana de sílice separa la cambra de cultiu de la placa de separació.La membrana de silicona està tallada amb làser a partir de làmina de silicona de 0,02 polzades de gruix i té una duresa de 35A.Les juntes de silicona inferior i superior estan tallades amb làser a partir de làmina de silicona d'1/16 "de gruix i tenen una duresa de 50A.Els cargols i les femelles d'acer inoxidable 316L s'utilitzen per subjectar el bloc i crear un segell hermètic.
Una placa de circuit imprès (PCB) dedicada està dissenyada per integrar-se amb el sistema C-PACE-EM.Els connectors de la màquina suïssa del PCB estan connectats als elèctrodes de grafit mitjançant cables de coure platejats i cargols de bronze 0-60 cargolats als elèctrodes.La placa de circuit imprès es col·loca a la coberta de la impressora 3D.
El dispositiu CTCM està controlat per un actuador pneumàtic programable (PPD) que crea una pressió circulatòria controlada similar a un cicle cardíac.A mesura que augmenta la pressió dins de la cambra d'aire, la membrana flexible de silicona s'expandeix cap amunt, forçant el medi sota el lloc del teixit.L'àrea del teixit s'estirarà després amb aquesta expulsió de líquid, imitant l'expansió fisiològica del cor durant la diàstole.En el punt àlgid de la relaxació, es va aplicar estimulació elèctrica mitjançant elèctrodes de grafit, que van reduir la pressió a la cambra d'aire i van provocar la contracció de les seccions de teixit.Dins de la canonada hi ha una vàlvula hemostàtica amb un sensor de pressió per detectar la pressió en el sistema d'aire.La pressió detectada pel sensor de pressió s'aplica a un col·lector de dades connectat a l'ordinador portàtil.Això permet un seguiment continu de la pressió dins de la cambra de gas.Quan es va assolir la pressió màxima de la cambra (estàndard 80 mmHg, 140 mmHg OS), es va ordenar al dispositiu d'adquisició de dades que enviés un senyal al sistema C-PACE-EM per generar un senyal de tensió bifàsica durant 2 ms, establert a 4 V.
Es van obtenir seccions de cor i es van realitzar les condicions de cultiu en 6 pous de la següent manera: Transferir els cors collits del recipient de transferència a una safata que contenia cardioplegia freda (4 °C).El ventricle esquerre es va aïllar amb una fulla estèril i es va tallar en trossos d'1-2 cm3.Aquests blocs de teixit es van unir als suports de teixit amb adhesiu de teixit i es van col·locar en un bany de teixit de micròtom vibrant que contenia la solució de Tyrode i es van oxigenar contínuament (3 g/L de 2,3-butanedione monooxima (BDM), 140 mM de NaCl (8,18 g) ), (6 mM-14M de glucosa) ), HEPES 10 mM (2,38 g), MgCl2 1 mM (1 ml solució 1 M), CaCl2 1,8 mM (solució 1 M 1,8 ml), fins a 1 L ddH2O).El micròtom vibrant es va configurar per tallar rodanxes de 300 µm de gruix a una freqüència de 80 Hz, una amplitud de vibració horitzontal de 2 mm i una velocitat d'avanç de 0,03 mm/s.El bany de teixit es va envoltar de gel per mantenir la solució fresca i la temperatura es va mantenir a 4 ° C.Transferiu seccions de teixit del bany de micròtoms a un bany d'incubació que conté solució de Tyrode oxigenada contínuament sobre gel fins que s'obtinguin suficients seccions per a una placa de cultiu.Per als cultius transwell, les seccions de teixit es van connectar a suports de poliuretà estèrils de 6 mm d'ample i es van col·locar en 6 ml de medi optimitzat (199 medi, 1x suplement ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcalí i 2X antibiòtic-antifúngic).Es va aplicar estimulació elèctrica (10 V, freqüència 1,2 Hz) a les seccions de teixit mitjançant el C-Pace.Per a les condicions de TD, es van afegir T3 i Dex frescos a 100 nM i 1 μM a cada canvi de medi.El medi està saturat d'oxigen abans de substituir-lo 3 vegades al dia.Les seccions de teixit es van cultivar en una incubadora a 37 ° C i un 5% de CO2.
Per als cultius CTCM, es van col·locar seccions de teixit en una impressora 3D personalitzada en una placa de Petri que contenia la solució de Tyrode modificada.El dispositiu està dissenyat per augmentar la mida de la llesca del cor en un 25% de l'àrea de l'anell de suport.Això es fa perquè les seccions del cor no s'estirin després de ser transferides de la solució de Tyrode al medi i durant la diàstole.Amb cola histoacrílica, es van fixar seccions de 300 µm de gruix sobre un anell de suport de 7 mm de diàmetre.Després d'unir les seccions de teixit a l'anell de suport, talleu les seccions de teixit en excés i torneu a col·locar les seccions de teixit connectades al bany de solució de Tyrode sobre gel (4 ° C) fins que s'hagin preparat prou seccions per a un dispositiu.El temps total de processament per a tots els dispositius no ha de superar les 2 hores.Després de connectar 6 seccions de teixit als seus anells de suport, es va muntar el dispositiu CTCM.La cambra de cultiu CTCM s'omple prèviament amb 21 ml de medi pre-oxigenat.Transferiu les seccions de teixit a la cambra de cultiu i elimineu amb cura les bombolles d'aire amb una pipeta.A continuació, la secció de teixit es guia al forat i es pressiona suaument al seu lloc.Finalment, col·loqueu la tapa de l'elèctrode al dispositiu i transferiu el dispositiu a la incubadora.A continuació, connecteu el CTCM al tub d'aire i al sistema C-PACE-EM.L'actuador pneumàtic s'obre i la vàlvula d'aire obre el CTCM.El sistema C-PACE-EM es va configurar per oferir 4 V a 1, 2 Hz durant l'estimulació bifàsica durant 2 ms.El medi es va canviar dues vegades al dia i els elèctrodes es van canviar una vegada al dia per evitar l'acumulació de grafit als elèctrodes.Si cal, es poden extreure seccions de teixit dels seus pous de cultiu per expulsar les bombolles d'aire que hi hagin caigut.Per a les condicions de tractament amb MT, es va afegir T3/Dex fresc amb cada canvi de medi amb 100 nM T3 i 1 μM Dex.Els dispositius CTCM es van cultivar en una incubadora a 37 ° C i un 5% de CO2.
Per obtenir trajectòries estirades de rodanxes de cor, es va desenvolupar un sistema de càmeres especial.Es va utilitzar una càmera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tòquio, Japó) amb un objectiu macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).La visualització es va realitzar a temperatura ambient després de substituir el medi per mitjà fresc.La càmera es col·loca en un angle de 51° i el vídeo es grava a 30 fotogrames per segon.Primer, es va utilitzar programari de codi obert (MUSCLEMOTION43) amb Image-J per quantificar el moviment de les rodanxes del cor.La màscara es va crear mitjançant MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EUA) per definir regions d'interès per bategar les rodanxes del cor per evitar el soroll.Les màscares segmentades manualment s'apliquen a totes les imatges en una seqüència de fotogrames i després es passen al connector MUSCLEMOTION.Muscle Motion utilitza la intensitat mitjana dels píxels de cada fotograma per quantificar el seu moviment en relació amb el fotograma de referència.Les dades es van registrar, es van filtrar i es van utilitzar per quantificar el temps del cicle i avaluar l'estirament del teixit durant el cicle cardíac.El vídeo gravat es va processar posteriorment mitjançant un filtre digital de fase zero de primer ordre.Per quantificar l'estirament del teixit (pic a pic), es va realitzar una anàlisi de pic a pic per distingir entre pics i valles en el senyal enregistrat.A més, la detendència es realitza utilitzant un polinomi de 6è ordre per eliminar la deriva del senyal.El codi del programa es va desenvolupar a MATLAB per determinar el moviment global del teixit, el temps de cicle, el temps de relaxació i el temps de contracció (Codi de programa suplementari 44).
Per a l'anàlisi de tensió, utilitzant els mateixos vídeos creats per a l'avaluació de l'estirament mecànic, primer vam traçar dues imatges que representen pics de moviment (els punts de moviment més alt (superior) i més baix (inferior) segons el programari MUSCLEMOTION.A continuació, vam segmentar les regions del teixit i vam aplicar una forma d'algoritme d'ombrejat al teixit segmentat (figura suplementària 2a).A continuació, el teixit segmentat es va dividir en deu subsuperfícies i es va calcular la tensió a cada superfície mitjançant l'equació següent: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, on Sup i Sdown són les distàncies de la forma des de les ombres superior i inferior del teixit, respectivament (figura suplementària .2b).
Les seccions del cor es van fixar en paraformaldehid al 4% durant 48 hores.Els teixits fixos es van deshidratar al 10% i al 20% de sacarosa durant 1 h, i després al 30% de sacarosa durant la nit.A continuació, les seccions es van incrustar en un compost de temperatura de tall òptima (compost OCT) i es van congelar gradualment en un bany d'isopenta/gel sec.Emmagatzemeu els blocs d'incrustació d'OCT a -80 ° C fins a la separació.Les diapositives es van preparar com a seccions amb un gruix de 8 μm.
Per eliminar l'OCT de les seccions del cor, escalfeu les diapositives en un bloc de calefacció a 95 ° C durant 5 min.Afegiu 1 ml de PBS a cada portaobjectes i incubeu durant 30 minuts a temperatura ambient i, a continuació, impregneu les seccions configurant el 0,1% de Triton-X en PBS durant 15 minuts a temperatura ambient.Per evitar que els anticossos no específics s'uneixin a la mostra, afegiu 1 ml de solució de BSA al 3% a les diapositives i s'incube durant 1 hora a temperatura ambient.A continuació, es va eliminar el BSA i es van rentar les diapositives amb PBS.Marqueu cada mostra amb un llapis.Els anticossos primaris (diluïts 1:200 en 1% de BSA) (connexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) i troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) es van afegir durant 90 minuts, després es van afegir anticossos secundaris contra 1% BSAdilu ratolí 1 (BSA200) (Thermo Scientific; #A16079), contra el conill Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) durant 90 minuts addicionals Rentat 3 vegades amb PBS Per distingir la tinció diana del fons, només vam utilitzar l'anticossos secundari com a control. Finalment, es va afegir la tinció nuclear DAPI i les diapositives es van col·locar en un magnificat i polit amb laboratori de magnificació i poliment. i microscopi Keyence amb augment de 40x.
Es va utilitzar WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; # W32464) a 5 μg/ml en PBS per a la tinció de WGA i es va aplicar a seccions fixes durant 30 minuts a temperatura ambient.A continuació, es van rentar les diapositives amb PBS i es va afegir negre de Sudan a cada diapositiva i es va incubar durant 30 minuts.A continuació, es van rentar les diapositives amb PBS i es va afegir el medi d'incorporació de vectashield.Les diapositives es van visualitzar en un microscopi Keyence amb un augment de 40x.
L'OCT es va eliminar de les mostres tal com es descriu anteriorment.Després d'eliminar l'OCT, submergiu les diapositives a la solució de Bouin durant la nit.Les diapositives es van esbandir amb aigua destil·lada durant 1 hora i després es van col·locar en una solució de fucsina d'àloe Bibrich durant 10 minuts.A continuació, es van rentar les diapositives amb aigua destil·lada i es van col·locar en una solució de 5% fosfomolibdè/5% àcid fosfotúngstic durant 10 minuts.Sense esbandir, transferiu les diapositives directament a la solució de blau d'anilina durant 15 minuts.A continuació, es van rentar les diapositives amb aigua destil·lada i es van col·locar en una solució d'àcid acètic a l'1% durant 2 minuts.Les diapositives es van assecar en etanol 200 N i es van transferir a xilè.Les diapositives tacades es van visualitzar mitjançant un microscopi Keyence amb un objectiu 10x.El percentatge d'àrea de fibrosi es va quantificar mitjançant el programari Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), número de catàleg V13154, segons el protocol del fabricant amb algunes modificacions.En particular, es va utilitzar un punxó quirúrgic amb un diàmetre de 6 mm per garantir una mida uniforme del teixit durant l'anàlisi MTT.Els teixits es van xapar individualment als pous d'una placa de 12 pous que contenia substrat MTT segons el protocol del fabricant.Les seccions s'incuben a 37°C durant 3 hores i el teixit viu metabolitza el substrat MTT per formar un compost de formazà morat.Substituïu la solució MTT amb 1 ml de DMSO i s'incube a 37 ° C durant 15 minuts per extreure el formazà morat de les seccions del cor.Les mostres es van diluir 1:10 en DMSO en plaques de fons transparents de 96 pous i es va mesurar la intensitat del color porpra a 570 nm mitjançant un lector de plaques Cytation (BioTek).Les lectures es van normalitzar al pes de cada porció del cor.
Els mitjans de rodanxes de cor es van substituir per mitjans que contenien 1 μCi/ml [5-3H]-glucosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EUA) per a l'assaig d'utilització de glucosa tal com es va descriure anteriorment.Després de 4 hores d'incubació, afegiu 100 µl de medi a un tub de microcentrífuga obert que conté 100 µl de HCl 0,2 N.A continuació, el tub es va col·locar en un tub de centelleig que contenia 500 μl de dH2O per evaporar [3H]2O durant 72 hores a 37 °C.A continuació, traieu el tub de microcentrífuga del tub de centelleig i afegiu 10 ml de líquid de centelleig.Els recomptes de centelleig es van realitzar mitjançant un analitzador de centelleig líquid Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, EUA).A continuació, es va calcular la utilització de glucosa tenint en compte l'activitat específica de la [5-3H]-glucosa, l'equilibri incomplet i el fons, la dilució de [5-3H]-a glucosa sense etiquetar i l'eficiència del comptador de centelleig.Les dades es normalitzen a la massa de seccions del cor.
Després de l'homogeneïtzació dels teixits a Trizol, l'ARN es va aïllar de les seccions del cor mitjançant el Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 segons el protocol del fabricant.La preparació, la seqüenciació i l'anàlisi de dades de la biblioteca RNAsec es van realitzar de la següent manera:
Es va utilitzar 1 μg d'ARN per mostra com a material de partida per a la preparació de la biblioteca d'ARN.Les biblioteques de seqüenciació es van generar mitjançant el kit de preparació de biblioteques d'ARN NEBNext UltraTM per Illumina (NEB, EUA) seguint les recomanacions del fabricant i es van afegir codis d'índex a les seqüències d'atributs per a cada mostra.Breument, l'ARNm es va purificar de l'ARN total mitjançant perles magnètiques unides amb oligonucleòtids poli-T.La fragmentació es realitza utilitzant cations divalents a alta temperatura en el tampó de reacció de síntesi de la primera cadena NEBNext (5X).L'ADNc de la primera cadena es va sintetitzar mitjançant cebadors hexàmers aleatoris i transcriptasa inversa M-MuLV (RNasa H-).A continuació, la segona cadena d'ADNc es sintetitza utilitzant l'ADN polimerasa I i la RNasa H. Els voladissos restants es converteixen en extrems roms mitjançant l'activitat exonucleasa/polimerasa.Després de l'adenilació de l'extrem 3' del fragment d'ADN, s'hi connecta un adaptador NEBNext amb una estructura de bucle de forquilla per preparar-lo per a la hibridació.Per a la selecció de fragments d'ADNc de longitud preferida 150-200 pb.els fragments de la biblioteca es van purificar mitjançant el sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EUA).A continuació, es van utilitzar 3 μl d'enzim USER (NEB, EUA) amb ADNc seleccionat per la mida lligat amb un adaptador durant 15 minuts a 37 ° C i després durant 5 minuts a 95 ° C abans de la PCR.A continuació, es va realitzar la PCR mitjançant l'ADN polimerasa d'alta fidelitat Phusion, cebadors universals de PCR i cebadors Index (X).Finalment, es van purificar els productes de PCR (sistema AMPure XP) i es va avaluar la qualitat de la biblioteca en un sistema Agilent Bioanalyzer 2100.A continuació, es va seqüenciar la biblioteca d'ADNc mitjançant un seqüenciador Novaseq.Els fitxers d'imatge en brut d'Illumina es van convertir en lectures en brut mitjançant CASAVA Base Calling.Les dades en brut s'emmagatzemen en fitxers de format FASTQ(fq) que contenen seqüències de lectura i qualitats base corresponents.Seleccioneu HISAT2 per fer coincidir les lectures de seqüenciació filtrades amb el genoma de referència Sscrofa11.1.En general, HISAT2 admet genomes de qualsevol mida, inclosos genomes de més de 4.000 milions de bases, i s'estableixen valors per defecte per a la majoria dels paràmetres.Les lectures de splicing de les dades d'ARN Seq es poden alinear de manera eficient mitjançant HISAT2, el sistema més ràpid disponible actualment, amb la mateixa precisió o millor que qualsevol altre mètode.
L'abundància de transcripcions reflecteix directament el nivell d'expressió gènica.Els nivells d'expressió gènica s'avaluen per l'abundància de transcripcions (recompte de seqüenciació) associades amb el genoma o els exons.El nombre de lectures és proporcional als nivells d'expressió gènica, la longitud del gen i la profunditat de seqüenciació.Es van calcular FPKM (fragments per mil parells de bases de transcripció seqüenciades per milió de parells de bases) i es van determinar els valors P d'expressió diferencial mitjançant el paquet DESeq2.A continuació, vam calcular la taxa de descobriment fals (FDR) per a cada valor P mitjançant el mètode Benjamini-Hochberg9 basat en la funció R integrada "p.adjust".
L'ARN aïllat de les seccions del cor es va convertir en ADNc a una concentració de 200 ng/μl mitjançant la barreja SuperScript IV Vilo Master de Thermo (Thermo, núm. cat. 11756050).La RT-PCR quantitativa es va realitzar mitjançant una placa de reacció transparent de 384 pous d'Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, núm. cat. 4483319) i un adhesiu òptic microamp (Thermo, núm. cat. 4311971).La barreja de reacció constava de 5 µl de Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl de Taqman Primer i 3,5 µl d'H2O barrejats per pou.Es van executar cicles estàndard de qPCR i es van mesurar els valors de CT mitjançant un instrument de PCR en temps real Applied Biosystems Quantstudio 5 (mòdul de 384 pous; producte # A28135).Els primers Taqman es van comprar a Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss0686_mS90), (Ss06900188_m1) GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) es van normalitzar el valor de manteniment de les mostres de tots els CTDH.
L'alliberament mediàtic de NT-ProBNP es va avaluar mitjançant el kit NT-ProBNP (porc) (núm. cat. MBS2086979, MyBioSource) segons el protocol del fabricant.Breument, es van afegir 250 µl de cada mostra i estàndard per duplicat a cada pou.Immediatament després d'afegir la mostra, afegiu 50 µl de reactiu d'assaig A a cada pou.Agitar suaument el plat i segellar amb segellador.A continuació, les pastilles es van incubar a 37 ° C durant 1 hora.A continuació, aspireu la solució i renteu els pous 4 vegades amb 350 µl de solució de rentat 1X, incubant la solució de rentat durant 1-2 minuts cada vegada.A continuació, afegiu 100 µl de reactiu d'assaig B per pou i segellar amb un segellador de plaques.La pastilla es va agitar suaument i es va incubar a 37 ° C durant 30 minuts.Aspirar la solució i rentar els pous 5 vegades amb 350 µl de solució de rentat 1X.Afegiu 90 µl de solució de substrat a cada pou i tanqueu la placa.Incubar la placa a 37 °C durant 10-20 minuts.Afegiu 50 µl de solució de parada a cada pou.La placa es va mesurar immediatament mitjançant un lector de plaques Cytation (BioTek) establert a 450 nm.
Es van realitzar anàlisis de potència per triar les mides de grup que proporcionaran una potència >80% per detectar un canvi absolut del 10% en el paràmetre amb una taxa d'error de tipus I del 5%. Es van realitzar anàlisis de potència per triar les mides de grup que proporcionaran una potència >80% per detectar un canvi absolut del 10% en el paràmetre amb una taxa d'error de tipus I del 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощноя ти10 Анализ мощности солютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Es va realitzar una anàlisi de potència per seleccionar mides de grups que proporcionessin una potència superior al 80% per detectar un canvi de paràmetres absolut del 10% amb una taxa d'error de tipus I del 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的的玥检参进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的的玥检参 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мостон 10% мозмера группы абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Es va realitzar una anàlisi de potència per seleccionar una mida de grup que proporcionés més del 80% de potència per detectar un canvi de paràmetres absolut del 10% i una taxa d'error de tipus I del 5%.Les seccions de teixit es van seleccionar aleatòriament abans de l'experiment.Totes les anàlisis eren cegues en condicions i les mostres es van descodificar només després d'haver analitzat totes les dades.Es va utilitzar el programari GraphPad Prism (San Diego, CA) per realitzar totes les anàlisis estadístiques. Per a totes les estadístiques, els valors p es van considerar significatius a valors <0, 05. Per a totes les estadístiques, els valors p es van considerar significatius a valors <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Per a totes les estadístiques, els valors p es van considerar significatius a valors <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Per a totes les estadístiques, els valors p es van considerar significatius a valors <0,05.Es va realitzar la prova t de Student de dues cues a les dades amb només 2 comparacions.Es va utilitzar ANOVA unidireccional o bidireccional per determinar la importància entre diversos grups.Quan es van realitzar proves post hoc, es va aplicar la correcció de Tukey per tenir en compte múltiples comparacions.Les dades de RNAsec tenen consideracions estadístiques especials a l'hora de calcular FDR i p.adjust tal com es descriu a la secció Mètodes.
Per obtenir més informació sobre el disseny de l'estudi, consulteu el resum de l'Informe de recerca sobre la natura enllaçat a aquest article.