Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir el suport continu, renderem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Cal un sistema in vitro fiable que pugui reproduir amb precisió l'entorn fisiològic del cor per a les proves de fàrmacs. La disponibilitat limitada de sistemes de cultiu de teixit cardíac humà ha portat a interpretacions inexactes dels efectes dels fàrmacs cardíacs. Aquí, hem desenvolupat un model de cultiu de teixit cardíac (CTCM) que estimula electromecànicament les seccions de cor i experimenta un estirament fisiològic durant les fases sistòlica i diastòlica del cicle cardíac. Després de 12 dies de cultiu, aquest enfocament va millorar parcialment la viabilitat de les seccions de cor, però no va preservar completament la seva integritat estructural. Per tant, després del cribratge de petites molècules, vam descobrir que l'addició de 100 nM de triiodotironina (T3) i 1 μM de dexametasona (Dex) al nostre medi va mantenir la microestructura de les seccions durant 12 dies. En combinació amb el tractament amb T3/Dex, el sistema CTCM va mantenir els perfils transcripcionals, la viabilitat, l'activitat metabòlica i la integritat estructural al mateix nivell que el teixit cardíac fresc durant 12 dies. A més, l'estirament excessiu del teixit cardíac en cultiu indueix una senyalització cardíaca hipertròfica, cosa que proporciona evidència de la capacitat del CTCM per imitar les condicions hipertròfiques induïdes per l'estirament cardíac. En conclusió, el CTCM pot modelar la fisiologia i la fisiopatologia del cor en cultiu durant llargs períodes de temps, permetent un cribratge fiable de fàrmacs.
Abans de la investigació clínica, es necessiten sistemes in vitro fiables que puguin reproduir amb precisió l'entorn fisiològic del cor humà. Aquests sistemes haurien d'imitar l'estirament mecànic alterat, la freqüència cardíaca i les propietats electrofisiològiques. Els models animals s'utilitzen habitualment com a plataforma de cribratge per a la fisiologia cardíaca amb una fiabilitat limitada a l'hora de reflectir els efectes dels fàrmacs al cor humà1,2. En definitiva, el Model Experimental de Cultiu de Teixit Cardíac Ideal (CTCM) és un model altament sensible i específic per a diverses intervencions terapèutiques i farmacològiques, que reprodueix amb precisió la fisiologia i la fisiopatologia del cor humà3. L'absència d'un sistema d'aquest tipus limita el descobriment de nous tractaments per a la insuficiència cardíaca4,5 i ha portat a la cardiotoxicitat dels fàrmacs com a una de les principals raons per sortir del mercat6.
Durant l'última dècada, vuit fàrmacs no cardiovasculars s'han retirat de l'ús clínic perquè causen una prolongació de l'interval QT que condueix a arrítmies ventriculars i mort sobtada7. Per tant, hi ha una necessitat creixent d'estratègies de cribratge preclínic fiables per avaluar l'eficàcia i la toxicitat cardiovasculars. L'ús recent de cardiomiòcits derivats de cèl·lules pluripotents induïdes per humans (hiPS-CM) en el cribratge de fàrmacs i les proves de toxicitat proporciona una solució parcial a aquest problema. Tanmateix, la naturalesa immadura dels hiPS-CM i la manca de complexitat multicel·lular del teixit cardíac són les principals limitacions d'aquest mètode. Estudis recents han demostrat que aquesta limitació es pot superar parcialment mitjançant l'ús de hiPS-CM primerencs per formar hidrogels de teixit cardíac poc després de l'inici de les contraccions espontànies i augmentant gradualment l'estimulació elèctrica amb el temps. Tanmateix, aquests microteixits hiPS-CM no tenen les propietats electrofisiològiques i contràctils madures del miocardi adult. A més, el teixit cardíac humà té una estructura més complexa, que consisteix en una barreja heterogènia de diferents tipus de cèl·lules, incloent-hi cèl·lules endotelials, neurones i fibroblasts estromals, interconnectats per conjunts específics de proteïnes de la matriu extracel·lular. Aquesta heterogeneïtat de poblacions no cardiomiòcites11,12,13 en el cor de mamífers adults és un obstacle important per modelar el teixit cardíac utilitzant tipus cel·lulars individuals. Aquestes limitacions importants emfatitzen la importància de desenvolupar mètodes per al cultiu de teixit miocardíac intacte en condicions fisiològiques i patològiques.
Les seccions primes (300 µm) cultivades del cor humà han demostrat ser un model prometedor de miocardi humà intacte. Aquest mètode proporciona accés a un sistema multicel·lular 3D complet similar al teixit cardíac humà. Tanmateix, fins al 2019, l'ús de seccions de cor cultivades estava limitat per la curta supervivència del cultiu (24 h). Això es deu a diversos factors, com ara la manca d'estirament físic-mecànic, la interfície aire-líquid i l'ús de medis simples que no donen suport a les necessitats del teixit cardíac. El 2019, diversos grups de recerca van demostrar que la incorporació de factors mecànics als sistemes de cultiu de teixit cardíac pot allargar la vida del cultiu, millorar l'expressió cardíaca i imitar la patologia cardíaca. Dos estudis elegants 17 i 18 mostren que la càrrega mecànica uniaxial té un efecte positiu sobre el fenotip cardíac durant el cultiu. Tanmateix, aquests estudis no van utilitzar la càrrega físic-mecànica tridimensional dinàmica del cicle cardíac, ja que les seccions de cor es van carregar amb forces de tracció isomètriques 17 o càrrega auxotònica lineal 18. Aquests mètodes d'estirament de teixits van provocar la supressió de molts gens cardíacs o la sobreexpressió de gens associats amb respostes anormals d'estirament. Cal destacar que Pitoulis et al. 19 van desenvolupar un bany de cultiu dinàmic de talls de cor per a la reconstrucció del cicle cardíac mitjançant la retroalimentació de transductors de força i accionaments de tensió. Tot i que aquest sistema permet un modelatge in vitro del cicle cardíac més precís, la complexitat i el baix rendiment del mètode limiten l'aplicació d'aquest sistema. El nostre laboratori ha desenvolupat recentment un sistema de cultiu simplificat mitjançant estimulació elèctrica i un medi optimitzat per mantenir la viabilitat de seccions de teixit cardíac porcí i humà fins a 6 dies 20,21.
En aquest manuscrit, descrivim un model de cultiu de teixit cardíac (CTCM) utilitzant seccions del cor porcí que incorpora senyals humorals per recapitular la fisiologia cardíaca tridimensional i la distensió fisiopatològica durant el cicle cardíac. Aquest CTCM pot augmentar la precisió de la predicció preclínica de fàrmacs a un nivell mai abans aconseguit proporcionant un sistema cardíac de rendiment mitjà i rendible que imita la fisiologia/fisiologia del cor dels mamífers per a proves preclíniques de fàrmacs.
Els senyals mecànics hemodinàmics tenen un paper crític en el manteniment de la funció dels cardiomiòcits in vitro 22,23,24. En el manuscrit actual, hem desenvolupat un CTCM (Figura 1a) que pot imitar l'entorn cardíac adult induint estimulació elèctrica i mecànica a freqüències fisiològiques (1,2 Hz, 72 batecs per minut). Per evitar un estirament excessiu del teixit durant la diàstole, es va utilitzar un dispositiu d'impressió 3D per augmentar la mida del teixit en un 25% (Fig. 1b). El marcapassos elèctric induït pel sistema C-PACE es va cronometrar per començar 100 ms abans de la sístole mitjançant un sistema d'adquisició de dades per reproduir completament el cicle cardíac. El sistema de cultiu de teixits utilitza un actuador pneumàtic programable (LB Engineering, Alemanya) per expandir cíclicament una membrana de silicona flexible per provocar l'expansió de les seccions del cor a la cambra superior. El sistema es va connectar a una línia d'aire externa a través d'un transductor de pressió, que va permetre ajustar amb precisió la pressió (± 1 mmHg) i el temps (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Fixeu la secció de teixit a l'anell de suport de 7 mm, que es mostra en blau, dins de la cambra de cultiu del dispositiu. La cambra de cultiu està separada de la cambra d'aire per una fina membrana de silicona flexible. Col·loqueu una junta entre cada cambra per evitar fuites. La tapa del dispositiu conté elèctrodes de grafit que proporcionen estimulació elèctrica. b Representació esquemàtica del dispositiu de teixit gran, l'anell guia i l'anell de suport. Les seccions de teixit (marró) es col·loquen al dispositiu sobredimensionat amb l'anell guia col·locat a la ranura de la vora exterior del dispositiu. Utilitzant la guia, col·loqueu amb cura l'anell de suport recobert amb adhesiu acrílic tissular sobre la secció de teixit cardíac. c Gràfic que mostra el temps d'estimulació elèctrica en funció de la pressió de la cambra d'aire controlada per un actuador pneumàtic programable (PPD). Es va utilitzar un dispositiu d'adquisició de dades per sincronitzar l'estimulació elèctrica mitjançant sensors de pressió. Quan la pressió a la cambra de cultiu arriba al llindar establert, s'envia un senyal de pols al C-PACE-EM per activar l'estimulació elèctrica. d Imatge de quatre CTCM col·locats en un prestatge d'incubadora. Quatre dispositius estan connectats a un PPD mitjançant un circuit pneumàtic, i s'insereixen sensors de pressió a la vàlvula hemostàtica per controlar la pressió del circuit pneumàtic. Cada dispositiu conté sis seccions de teixit.
Utilitzant un únic actuador pneumàtic, vam poder controlar 4 dispositius CTCM, cadascun dels quals podia contenir 6 seccions de teixit (Fig. 1d). En CTCM, la pressió d'aire a la cambra d'aire es converteix en pressió síncrona a la cambra de fluid i indueix una expansió fisiològica de la llesca del cor (Figura 2a i Pel·lícula suplementària 1). L'avaluació de l'estirament del teixit a 80 mm Hg. Art. va mostrar un estirament de les seccions de teixit del 25% (Fig. 2b). S'ha demostrat que aquest percentatge d'estirament correspon a una longitud fisiològica del sarcòmer de 2,2–2,3 µm per a una contractilitat normal de la secció cardíaca17,19,25. El moviment del teixit es va avaluar mitjançant la configuració personalitzada de la càmera (Figura suplementària 1). L'amplitud i la velocitat del moviment del teixit (Fig. 2c, d) corresponien a l'estirament durant el cicle cardíac i al temps durant la sístole i la diàstole (Fig. 2b). L'estirament i la velocitat del teixit cardíac durant la contracció i la relaxació es van mantenir constants durant 12 dies en cultiu (Fig. 2f). Per avaluar l'efecte de l'estimulació elèctrica sobre la contractilitat durant el cultiu, vam desenvolupar un mètode per determinar la deformitat activa mitjançant un algorisme d'ombrejat (Fig. suplementària 2a,b) i vam poder distingir entre deformitats amb i sense estimulació elèctrica. La mateixa secció del cor (Fig. 2f). A la regió mòbil del tall (R6-9), el voltatge durant l'estimulació elèctrica va ser un 20% més alt que en absència d'estimulació elèctrica, la qual cosa indica la contribució de l'estimulació elèctrica a la funció contràctil.
Les mesures representatives de la pressió de la cambra d'aire, la pressió de la cambra de fluid i el moviment del teixit confirmen que la pressió de la cambra canvia la pressió de la cambra de fluid, provocant un moviment corresponent del tall de teixit. b Les traces representatives del percentatge d'estirament (blau) de les seccions de teixit corresponents al percentatge d'estirament (taronja). c El moviment mesurat del tall cardíac és coherent amb la velocitat de moviment mesurada. (d) Trajectòries representatives del moviment cíclic (línia blava) i la velocitat (línia puntejada taronja) en un tall del cor. e Quantificació del temps de cicle (n = 19 talls per grup, de diferents porcs), temps de contracció (n = 19 talls per grup), temps de relaxació (n = 19 talls per grup, de diferents porcs), moviment del teixit (n = 25 talls/grup de diferents porcs), velocitat sistòlica màxima (n = 24(D0), 25(D12) talls/grup de diferents porcs) i taxa de relaxació màxima (n=24(D0), 25(D12) talls/grup de diferents porcs). La prova t de Student bilateral no va mostrar cap diferència significativa en cap paràmetre. f Traces representatives de l'anàlisi de deformació de seccions de teixit amb (vermell) i sense (blau) estimulació elèctrica, deu àrees regionals de seccions de teixit de la mateixa secció. Els panells inferiors mostren la quantificació de la diferència percentual de deformació en seccions de teixit amb i sense estimulació elèctrica en deu àrees de diferents seccions. (n = 8 talls/grup de diferents porcs, es realitza la prova t de Student bilateral; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 talls/grup de diferents porcs, es realitza la prova t de Student bilateral; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,00,
En el nostre sistema de cultiu de talls de cor biomimètic estàtic anterior [20, 21], vam mantenir la viabilitat, la funció i la integritat estructural dels talls de cor durant 6 dies aplicant estimulació elèctrica i optimitzant la composició del medi. Tanmateix, després de 10 dies, aquestes xifres van disminuir dràsticament. Ens referirem a les seccions cultivades en el nostre sistema de cultiu biomimètic estàtic anterior 20, 21 condicions de control (Ctrl) i utilitzarem el nostre medi prèviament optimitzat com a condicions MC i cultiu sota estimulació mecànica i elèctrica simultània (CTCM), anomenat . Primer, vam determinar que l'estimulació mecànica sense estimulació elèctrica era insuficient per mantenir la viabilitat dels teixits durant 6 dies (Fig. suplementària 3a, b). Curiosament, amb la introducció de l'estimulació fisiomecànica i elèctrica mitjançant STCM, la viabilitat de les seccions de cor de 12 dies es va mantenir igual que en les seccions de cor fresc en condicions MS, però no en condicions Ctrl, com es mostra mitjançant l'anàlisi MTT (Fig. 1). 3a). Això suggereix que l'estimulació mecànica i la simulació del cicle cardíac poden mantenir les seccions de teixit viables durant el doble de temps que el que s'ha informat en el nostre sistema de cultiu estàtic anterior. Tanmateix, l'avaluació de la integritat estructural de les seccions de teixit mitjançant la immunomarcatge de la troponina T cardíaca i la connexina 43 va mostrar que l'expressió de la connexina 43 era significativament més alta en els teixits MC el dia 12 que en els controls el mateix dia. Tanmateix, l'expressió uniforme de la connexina 43 i la formació del disc Z no es van mantenir completament (Fig. 3b). Utilitzem un marc d'intel·ligència artificial (IA) per quantificar la integritat estructural del teixit26, un canal d'aprenentatge profund basat en imatges basat en la tinció de troponina-T i connexina43 per quantificar automàticament la integritat estructural i la fluorescència de les llesques de cor en termes de força de localització. Aquest mètode utilitza una xarxa neuronal convolucional (CNN) i un marc d'aprenentatge profund per quantificar de manera fiable la integritat estructural del teixit cardíac de manera automatitzada i imparcial, tal com es descriu a la referència.26. El teixit MC va mostrar una similitud estructural millorada respecte al dia 0 en comparació amb les seccions de control estàtiques. A més, la tinció amb tricrom de Masson va revelar un percentatge significativament menor de fibrosi en condicions de MS en comparació amb les condicions de control el dia 12 de cultiu (Fig. 3c). Tot i que el CTCM va augmentar la viabilitat de les seccions de teixit cardíac el dia 12 a un nivell similar al del teixit cardíac fresc, no va millorar significativament la integritat estructural de les seccions del cor.
Un gràfic de barres mostra la quantificació de la viabilitat MTT de llesques de cor fresc (D0) o cultiu de llesques de cor durant 12 dies, ja sigui en cultiu estàtic (D12 Ctrl) o en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) llesques/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparació amb D0 i **p < 0,01 en comparació amb D12 Ctrl). Un gràfic de barres mostra la quantificació de la viabilitat MTT de rodanxes de cor fresc (D0) o cultiu de rodanxes de cor durant 12 dies, ja sigui en cultiu estàtic (D12 Ctrl) o en CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) rodanxes/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparació amb D0 i **p < 0,01 en comparació amb D12 Ctrl).L'histograma mostra la quantificació de la viabilitat de seccions de cor fresc de MTT (D0) o cultiu de seccions de cor durant 12 dies en cultiu estàtic (control D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12). ) , 12 (D12 MC) seccions/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 en comparació amb D0 i **p < 0,01 en comparació amb D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组葌啛啛化，ANOVA测试；与D0 相比，####p <0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.00001D12不相比，**p。)histograma que mostra la quantificació de la viabilitat de MTT en seccions de cor fresc (D0) o seccions de cor cultivades durant 12 dies en cultiu estàtic (control D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12)), 12 (D12 MC) seccions/grup de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 en comparació amb D0, **p < 0,01 en comparació amb D12 Ctrl).b Troponina-T (verd), connexina 43 (vermell) i DAPI (blau) en seccions de cor recentment aïllades (D0) o seccions de cor cultivades en condicions estàtiques (Ctrl) o condicions CTCM (MC) durant 12 dies) d'imatges d'immunofluorescència representatives (escala en blanc = 100 µm). Quantificació per intel·ligència artificial de la integritat estructural del teixit cardíac (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) talls/grup cadascun de porc diferent, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparació amb D0 i ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). Quantificació per intel·ligència artificial de la integritat estructural del teixit cardíac (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) talls/grup cadascun de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparació amb D0 i ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (D0), 5 77 (D0), C = 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сни сра в сне срав; 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificació de la integritat estructural del teixit cardíac mitjançant intel·ligència artificial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seccions/grups de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional realitzada; ####p < 0,0001 vs. amb D0 i ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) llesques/grup cadascuna de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional <1#0.###0p0;相比，****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) llesques/agrupar cadascun de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional <0####0p0;与D0相比，****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной тка7нl (D12), = (D12) (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. сравнению с D12 Ctrl). Intel·ligència artificial per quantificar la integritat estructural del teixit cardíac (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seccions/grup de porcs diferents, prova ANOVA unidireccional; ####p<0,0001 vs .D0 Per a la comparació ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). c Imatges representatives (esquerra) i quantificació (dreta) per a llesques de cor tenyides amb tinció tricroma de Masson (escala nua = 500 µm) (n = 10 llesques/grup cadascuna de porc diferent, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparació amb D0 i ***p < 0,001 en comparació amb D12 Ctrl). c Imatges representatives (esquerra) i quantificació (dreta) per a llesques de cor tenyides amb tinció tricroma de Masson (escala nua = 500 µm) (n = 10 llesques/grup cadascuna de porcs diferents, es realitza una prova ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparació amb D0 i ***p < 0,001 en comparació amb D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) i количественная оценка (справа) срезов сердца, окличественная (справа) трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разнынх разниным) выполняется односторонний тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по; сравнению с D12 Ctrl). c Imatges representatives (esquerra) i quantificació (dreta) de seccions de cor tenyides amb tinció tricroma de Masson (escala sense recobriment = 500 µm) (n = 10 seccions/grup de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional realitzada; #### p < 0,0001 en comparació amb D0 i ***p < 0,001 en comparació amb D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺（裸尺）（右）（裸尺（10µ=m5）个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比 相比 ，D1 测试；相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 尺度 尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 向 吋## 吋## 向 A### 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) i количественный анализ (справа) срезов сердца, окличественный анализ (справа) трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой другой протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imatges representatives (esquerra) i quantificació (dreta) de seccions de cor tenyides amb tinció tricroma de Masson (blanc = 500 µm) (n = 10 seccions/grup, cadascuna d'un porc diferent, provades mitjançant anàlisi de variància unidireccional; ### # p < 0,0001 en comparació amb D0, ***p < 0,001 en comparació amb D12 Ctrl).Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
Vam plantejar la hipòtesi que, afegint molècules petites al medi de cultiu, es podria millorar la integritat dels cardiomiòcits i reduir el desenvolupament de fibrosi durant el cultiu CTCM. Per tant, vam buscar molècules petites utilitzant els nostres cultius de control estàtic20,21 a causa del petit nombre de factors de confusió. La dexametasona (Dex), la triiodotironina (T3) i el SB431542 (SB) van ser escollits per a aquesta selecció. Aquestes molècules petites s'han utilitzat anteriorment en cultius hiPSC-CM per induir la maduració dels cardiomiòcits augmentant la longitud del sarcòmer, els túbuls T i la velocitat de conducció. A més, se sap que tant el Dex (un glucocorticoide) com el SB suprimeixen la inflamació29,30. Per tant, vam provar si la inclusió d'una o una combinació d'aquestes molècules petites milloraria la integritat estructural de les seccions del cor. Per a la selecció inicial, la dosi de cada compost es va seleccionar en funció de les concentracions que s'utilitzen habitualment en models de cultiu cel·lular (1 μM Dex27, 100 nM T327 i 2,5 μM SB31). Després de 12 dies de cultiu, la combinació de T3 i Dex va donar lloc a una integritat estructural òptima dels cardiomiòcits i una remodelació fibrosa mínima (Figures suplementàries 4 i 5). A més, l'ús del doble o doble d'aquestes concentracions de T3 i Dex va produir efectes nocius en comparació amb les concentracions normals (Fig. suplementària 6a, b).
Després de la selecció inicial, vam realitzar una comparació directa de 4 condicions de cultiu (Figura 4a): Ctrl: seccions de cor cultivades en el nostre cultiu estàtic descrit anteriorment utilitzant el nostre medi optimitzat; 20,21 TD: T3 i Ctrl s amb Dex afegit dimecres; MC: seccions de cor cultivades en CTCM utilitzant el nostre medi optimitzat anteriorment; i MT: CTCM amb T3 i Dex afegits al medi. Després de 12 dies de cultiu, la viabilitat dels teixits MS i MT es va mantenir igual que en els teixits frescos avaluats mitjançant l'assaig MTT (Fig. 4b). Curiosament, l'addició de T3 i Dex als cultius transwell (TD) no va resultar en una millora significativa de la viabilitat en comparació amb les condicions Ctrl, cosa que indica un paper important de l'estimulació mecànica en el manteniment de la viabilitat de les seccions de cor.
Un diagrama de disseny experimental que representa les quatre condicions de cultiu utilitzades per avaluar els efectes de l'estimulació mecànica i la suplementació amb T3/Dex en un medi durant 12 dies. b El gràfic de barres mostra la quantificació de la viabilitat 12 dies després del cultiu en les 4 condicions de cultiu (Ctrl, TD, MC i MT) en comparació amb talls de cor fresc (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) talls/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 en comparació amb D0 i **p < 0,01 en comparació amb D12 Ctrl). b El gràfic de barres mostra la quantificació de la viabilitat 12 dies després del cultiu en les 4 condicions de cultiu (Ctrl, TD, MC i MT) en comparació amb talls de cor fresc (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) talls/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 en comparació amb D0 i **p < 0,01 en comparació amb D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней посленку кулрез всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами срезами серезами серавнению (D1) (D1) (D1) (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 per сравнению с D0 i **p < 0,01 per сравнению с D12 Ctrl). b El gràfic de barres mostra la quantificació de la viabilitat als 12 dies posteriors al cultiu en les 4 condicions de cultiu (control, TD, MC i MT) en comparació amb seccions de cor fresc (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) seccions/grup de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 i **p < 0,01 en comparació amb D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D15)、D12、D12、D12、 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，##D01，0##0p相比，**p <0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по срававнен и сравнения сравнения сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одннос#тороднос#торнос#тора <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma que mostra les 4 condicions de cultiu (control, TD, MC i MT) en comparació amb seccions de cor fresc (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), de diferents porcs, 12 (D12 MC) seccions/grup, prova ANOVA unidireccional; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. control D12). c El gràfic de barres mostra la quantificació del flux de glucosa 12 dies després del cultiu en les 4 condicions de cultiu (Ctrl, TD, MC i MT) en comparació amb talls de cor fresc (D0) (n = 6 talls/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ###p < 0,001, en comparació amb D0 i ***p < 0,001 en comparació amb D12 Ctrl). c El gràfic de barres mostra la quantificació del flux de glucosa 12 dies després del cultiu en les 4 condicions de cultiu (Ctrl, TD, MC i MT) en comparació amb talls de cor fresc (D0) (n = 6 talls/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ###p < 0,001, en comparació amb D0 i ***p < 0,001 en comparació amb D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульвта кульвта 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC i MT) по сравнению со свежими срезами сердца = (D0воп/срению) от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c L'histograma mostra la quantificació del flux de glucosa 12 dies després del cultiu en les 4 condicions de cultiu (control, TD, MC i MT) en comparació amb seccions de cor fresc (D0) (n = 6 seccions/grup de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional realitzada; ###p < 0,001 en comparació amb D0 i ***p < 0,001 en comparació amb D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1囌柯1）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；####p<0.0不同相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切縔扇片片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послетвика всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами серезами сердца (D60) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histograma que mostra la quantificació del flux de glucosa 12 dies després del cultiu per a les 4 condicions de cultiu (control, TD, MC i MT) en comparació amb seccions de cor fresc (D0) (n = 6 seccions/grup, de diferents porcs, unilaterals. Es van realitzar proves ANOVA, ###p < 0,001 en comparació amb D0, ***p < 0,001 en comparació amb D12 (control).d Gràfics d'anàlisi de deformacions de teixits frescos (blau), MC del dia 12 (verd) i MT del dia 12 (vermell) en deu punts de secció regional de teixits (n = 4 talls/grup, prova ANOVA unidireccional; no hi va haver cap diferència significativa entre els grups). e Gràfic del volcà que mostra els gens expressats diferencialment en seccions de cor frescos (D0) en comparació amb seccions de cor cultivades en condicions estàtiques (Ctrl) o en condicions MT (MT) durant 10-12 dies. f Mapa de calor dels gens del sarcòmer per a seccions de cor cultivades en cadascuna de les condicions de cultiu. Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
La dependència metabòlica del canvi de l'oxidació d'àcids grassos a la glucòlisi és un tret distintiu de la desdiferenciació dels cardiomiòcits. Els cardiomiòcits immadurs utilitzen principalment glucosa per a la producció d'ATP i tenen mitocondris hipoplàsics amb poques crestes5,32. Les anàlisis d'utilització de glucosa van mostrar que, en condicions de MC i MT, la utilització de glucosa era similar a la dels teixits del dia 0 (Figura 4c). Tanmateix, les mostres Ctrl van mostrar un augment significatiu en la utilització de glucosa en comparació amb el teixit fresc. Això indica que la combinació de CTCM i T3/Dex millora la viabilitat dels teixits i preserva el fenotip metabòlic de les seccions de cor cultivades durant 12 dies. A més, l'anàlisi de la deformació va mostrar que els nivells de deformació es van mantenir iguals que en el teixit cardíac fresc durant 12 dies en condicions de MT i MS (Fig. 4d).
Per analitzar l'impacte general de CTCM i T3/Dex en el paisatge transcripcional global del teixit cardíac, vam realitzar RNAseq en llesques cardíaques de les quatre condicions de cultiu diferents (Dades suplementàries 1). Curiosament, les seccions MT van mostrar una alta similitud transcripcional amb el teixit cardíac fresc, amb només 16 gens expressats diferencialment de 13.642. Tanmateix, com vam mostrar anteriorment, les llesques Ctrl van mostrar 1229 gens expressats diferencialment després de 10-12 dies de cultiu (Fig. 4e). Aquestes dades es van confirmar mitjançant qRT-PCR de gens cardíacs i de fibroblasts (Fig. suplementàries 7a-c). Curiosament, les seccions Ctrl van mostrar una regulació a la baixa dels gens cardíacs i del cicle cel·lular i l'activació de programes gènics inflamatoris. Aquestes dades suggereixen que la desdiferenciació, que normalment es produeix després d'un cultiu a llarg termini, s'atenua completament en condicions MT (Fig. suplementàries 8a, b). Un estudi acurat dels gens del sarcòmer va mostrar que només en condicions de MT es preserven els gens que codifiquen el sarcòmer (Fig. 4f) i el canal iònic (Fig. suplementària 9), protegint-los de la supressió en condicions Ctrl, TD i MC. Aquestes dades demostren que amb una combinació d'estimulació mecànica i humoral (T3/Dex), el transcriptoma de les lleixes de cor pot romandre similar a les lleixes de cor fresques després de 12 dies de cultiu.
Aquestes troballes transcripcionals es veuen corroborades pel fet que la integritat estructural dels cardiomiòcits en seccions de cor es preserva millor en condicions de MT durant 12 dies, tal com demostra la connexina 43 intacta i localitzada (Fig. 5a). A més, la fibrosi en seccions de cor en condicions de MT es va reduir significativament en comparació amb Ctrl i de manera similar a les seccions de cor fresques (Fig. 5b). Aquestes dades demostren que la combinació d'estimulació mecànica i tractament amb T3/Dex preserva eficaçment l'estructura cardíaca en seccions de cor en cultiu.
Imatges d'immunofluorescència representatives de troponina-T (verd), connexina 43 (vermell) i DAPI (blau) en seccions de cor recentment aïllades (D0) o cultivades durant 12 dies en les quatre condicions de cultiu de seccions de cor (barra d'escala = 100 µm). Quantificació per intel·ligència artificial de la integritat estructural del teixit cardíac (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) talls/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparació amb D0 i *p < 0,05, o ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). Quantificació per intel·ligència artificial de la integritat estructural del teixit cardíac (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) talls/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; #### p < 0,0001 en comparació amb D0 i *p < 0,05, o ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = инта2 (D01) Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA p сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificació de la integritat estructural del teixit cardíac mitjançant intel·ligència artificial (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) seccions/grup de diferents porcs, prova ANOVA unidireccional realitzada; #### p < 0,0001 en comparació amb D0 i *p < 0,05 o ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p ，毌*p < ）切片/组） 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc＼1 （ d12 mc） （d12）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 和*p < 0,05**** p < 0,05 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Quantificació de la integritat estructural del teixit cardíac mitjançant intel·ligència artificial en diferents porcs (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) seccions/grup) amb una prova ANOVA unidireccional;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 en comparació amb D0 i *p < 0,05 o ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). b Imatges representatives i quantificació per a llesques de cor tenyides amb tinció tricroma de Masson (barra d'escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) llesques/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparació amb D0 i ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). b Imatges representatives i quantificació per a llesques de cor tenyides amb tinció tricroma de Masson (barra d'escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) llesques/grup de diferents porcs, es realitza una prova ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 en comparació amb D0 i ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных траственная оценка срезов сердца Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/групапу, срезов/групапу, срезов/грунхпу выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <; 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imatges representatives i quantificació de seccions de cor tenyides amb tinció tricroma de Masson (barra d'escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) seccions/grup de diferents porcs, realitzades amb ANOVA unidireccional; ####p < 0,0001 vs. D0 i ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D12010（D12010 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单因素方#0单同猪的9 切片/组）<1#0.#0.与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm = 500 µmd d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,00 方差分析；####p < 0,00我p*** < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных тросомна тросо (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных сразных свинедипы /-гнудипы способ ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 i ****p < 0,0001; по сравнению с D12 Ctrl). b Imatges representatives i quantificació de seccions de cor tenyides amb tricrom de Masson (barra d'escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) seccions de diferents porcs/grup, un mètode ANOVA; ####p < 0,0001 en comparació amb D0, ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 en comparació amb D12 Ctrl).Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
Finalment, es va avaluar la capacitat del CTCM per imitar la hipertròfia cardíaca augmentant l'estirament del teixit cardíac. En el CTCM, la pressió màxima de la cambra d'aire va augmentar de 80 mmHg a 80 mmHg. Art. (estirament normal) fins a 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Això correspon a un augment del 32% en l'estirament (Fig. 6b), que anteriorment es va mostrar com el percentatge d'estirament corresponent necessari perquè les seccions del cor aconsegueixin una longitud de sarcòmer similar a la que s'observa en la hipertròfia. L'estirament i la velocitat del teixit cardíac durant la contracció i la relaxació es van mantenir constants durant sis dies de cultiu (Fig. 6c). El teixit cardíac de les condicions MT es va sotmetre a estirament normal (MT (Normal)) o condicions de sobreestirament (MT (OS)) durant sis dies. Ja després de quatre dies de cultiu, el biomarcador hipertròfic NT-ProBNP es va elevar significativament en el medi en condicions MT (OS) en comparació amb les condicions MT (normals) (Fig. 7a). A més, després de sis dies de cultiu, la mida cel·lular en MT (OS) (Fig. 7b) va augmentar significativament en comparació amb les seccions de cor MT (normal). A més, la translocació nuclear de NFATC4 va augmentar significativament en teixits sobreestirats (Fig. 7c). Aquests resultats mostren el desenvolupament progressiu de la remodelació patològica després de la hiperdistensió i donen suport al concepte que el dispositiu CTCM es pot utilitzar com a plataforma per estudiar la senyalització d'hipertròfia cardíaca induïda per estirament.
Les traces representatives de les mesures de pressió de la cambra d'aire, pressió de la cambra de fluid i moviment del teixit confirmen que la pressió de la cambra canvia la pressió de la cambra de fluid, provocant un moviment corresponent de la llesca de teixit. b Corbes representatives de percentatge d'estirament i velocitat d'estirament per a seccions de teixit normalment estirades (taronja) i sobreestirades (blau). c Gràfic de barres que mostra el temps de cicle (n = 19 llesca per grup, de diferents porcs), el temps de contracció (n = 18-19 llesca per grup, de diferents porcs), el temps de relaxació (n = 19 llesca per grup, de diferents porcs)), l'amplitud del moviment del teixit (n = 14 llesca/grup, de diferents porcs), la velocitat sistòlica màxima (n = 14 llesca/grup, de diferents porcs) i la taxa de relaxació màxima (n = 14 (D0), 15 (D6)) seccions/grups) de diferents porcs), la prova t de Student bilateral no va mostrar cap diferència significativa en cap paràmetre, cosa que indica que aquests paràmetres es van mantenir constants durant els 6 dies de cultiu amb sobrevoltatge. Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
Quantificació en gràfic de barres de la concentració de NT-ProBNP en medis de cultiu a partir de talls de cor cultivats en condicions d'estirament normal MT (Norm) o de sobreestirament (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) talls/grup de diferents porcs. Es realitza una ANOVA bidireccional; **p < 0,01 en comparació amb l'estirament normal). Quantificació en gràfic de barres de la concentració de NT-ProBNP en medis de cultiu a partir de talls de cor cultivats en condicions d'estirament normal MT (Norm) o de sobreestirament (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) talls/grup de diferents porcs. Es realitza una ANOVA bidireccional; **p < 0,01 en comparació amb l'estirament normal).Histograma quantitatiu de la concentració de NT-ProBNP en el medi de cultiu de llesques de cor cultivades en condicions d'estirament MT normal (norma) o sobreestirament (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4) MTOS) llesques/grup de diferents porcs, es realitza una anàlisi de la variància de dos factors;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 en comparació amb l'estirament normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p <0,01） a Quantificació de la concentració de NT-ProBNP en rodanxes de cor cultivades en condicions d'estirament normal (Norm) o sobreestirament (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) de diferents猪的切片/组，可以双向方方发发动 **en comparació amb l'estirament normal, p < 0,01).histograma Quantificació de les concentracions de NT-ProBNP en talls de cor cultivats en condicions d'estirament MT normal (norma) o sobreestirament (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) i D4 MTOS) talls/grup de diferents porcs, anàlisi de la variància bidireccional;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 en comparació amb l'estirament normal). b Imatges representatives de talls de cor tenyits amb troponina-T i WGA (esquerra) i quantificació de la mida de les cèl·lules (dreta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cèl·lules/grup de 10 talls diferents de diferents porcs, es realitza la prova t de Student bilateral; ****p < 0,0001 en comparació amb l'estirament normal). b Imatges representatives de talls de cor tenyits amb troponina-T i WGA (esquerra) i quantificació de la mida de les cèl·lules (dreta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cèl·lules/grup de 10 talls diferents de diferents porcs, es realitza la prova t de Student bilateral; ****p < 0,0001 en comparació amb l'estirament normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) ичнных определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезных срезных срезных срезных срезных срезных срезных два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imatges representatives de seccions de cor tenyides amb troponina-T i AZP (esquerra) i quantificació de la mida de les cèl·lules (dreta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cèl·lules/grup de 10 seccions diferents de diferents porcs, es va realitzar la prova t de Student bilateral; ****p < 0,0001 en comparació amb la soca normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表倧左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表怏30表怏（（D30 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p <0,0001）. b Imatges representatives de talls de cor tenyits amb calcareïna-T i WGA (esquerra) i mida de les cèl·lules (dreta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 de 10 talls diferents (D6 MTNorm)) Cèl·lules/cm³, prova t de mesurament en temps real; en comparació amb estirament normal, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) ичнтативные оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iз 10 различных срезов от разныей разныей Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным; rastyajeniem). b Imatges representatives de seccions de cor tenyides amb troponina-T i AZP (esquerra) i quantificació de la mida de les cèl·lules (dreta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 seccions diferents de diferents porcs) Cèl·lules/grup, criteri bilateral t de Student; ****p < 0,0001 en comparació amb la soca normal). c Imatges representatives dels dies 0 i 6 de talls de cor MTOS immunomarcats per a troponina-T i NFATC4 i quantificació de la translocació de NFATC4 als nuclis de CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) talls/grup de diferents porcs, es realitza la prova t de Student bilateral; *p < 0,05). c Imatges representatives dels dies 0 i 6 de talls de cor MTOS immunomarcats per a troponina-T i NFATC4 i quantificació de la translocació de NFATC4 als nuclis dels CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) talls/grup de diferents porcs, es realitza la prova t de Student bilateral; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 i 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропон и трозентативные количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезных пузнозных клеток свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Imatges representatives de seccions de cor a 0 i 6 dies MTOS, immunomarcades per a troponina-T i NFATC4, i quantificació de la translocació de NFATC4 al nucli de cèl·lules cavernoses (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) talls/grup de diferents porcs) van realitzar una prova t de Student bilateral; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 （D0) 〖（D0 。切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0,05)。 c Imatges representatives de la immunomarcació de calcanina-T i NFATC4 第0天和第6天MTOS rodanxes de cor i NFATC4 de diferents quantitats de nuclis de cèl·lules NFATC4 易位至CM化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS, 爇礼)时间双尾学生et 电影；*p <0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромуномаркировки тром поТ 4 количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезных/грутай свиней t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Imatges representatives de talls de cor MTOS els dies 0 i 6 per a la immunomarcatge de troponina-T i NFATC4 i la quantificació de la translocació de NFATC4 al nucli de CM de diferents porcs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) talls/grup, criteri t bilateral de Student; *p < 0,05).Les barres d'error representen la mitjana ± desviació estàndard.
La recerca cardiovascular translacional requereix models cel·lulars que reprodueixin amb precisió l'entorn cardíac. En aquest estudi, es va desenvolupar i caracteritzar un dispositiu CTCM que pot estimular seccions ultrafines del cor. El sistema CTCM inclou estimulació electromecànica fisiològicament sincronitzada i enriquiment amb fluids T3 i Dex. Quan les seccions de cor porcí van ser exposades a aquests factors, la seva viabilitat, integritat estructural, activitat metabòlica i expressió transcripcional es van mantenir iguals que en el teixit cardíac fresc després de 12 dies de cultiu. A més, l'estirament excessiu del teixit cardíac pot causar hipertròfia del cor causada per hiperextensió. En general, aquests resultats donen suport al paper crític de les condicions de cultiu fisiològiques en el manteniment d'un fenotip cardíac normal i proporcionen una plataforma per al cribratge de fàrmacs.
Molts factors contribueixen a crear un entorn òptim per al funcionament i la supervivència dels cardiomiòcits. Els més evidents d'aquests factors estan relacionats amb (1) les interaccions intercel·lulars, (2) l'estimulació electromecànica, (3) els factors humorals i (4) els substrats metabòlics. Les interaccions fisiològiques entre cèl·lules requereixen xarxes tridimensionals complexes de múltiples tipus de cèl·lules suportades per una matriu extracel·lular. Aquestes interaccions cel·lulars complexes són difícils de reconstruir in vitro mitjançant el cocultiu de tipus de cèl·lules individuals, però es poden aconseguir fàcilment utilitzant la naturalesa organotípica de les seccions de cor.
L'estirament mecànic i l'estimulació elèctrica dels cardiomiòcits són fonamentals per mantenir el fenotip cardíac33,34,35. Tot i que l'estimulació mecànica s'ha utilitzat àmpliament per al condicionament i la maduració de la hiPSC-CM, diversos estudis elegants han intentat recentment l'estimulació mecànica de talls de cor en cultiu mitjançant càrrega uniaxial. Aquests estudis mostren que la càrrega mecànica uniaxial 2D té un efecte positiu sobre el fenotip del cor durant el cultiu. En aquests estudis, es van carregar seccions del cor amb forces de tracció isomètriques17, càrrega auxotònica lineal18, o es va recrear el cicle cardíac mitjançant retroalimentació de transductors de força i accionaments de tensió. Tanmateix, aquests mètodes utilitzen l'estirament tissular uniaxial sense optimització ambiental, cosa que resulta en la supressió de molts gens cardíacs o la sobreexpressió de gens associats amb respostes d'estirament anormals. El CTCM descrit aquí proporciona un estímul electromecànic 3D que imita el cicle cardíac natural pel que fa al temps de cicle i l'estirament fisiològic (25% d'estirament, 40% de sístole, 60% de diàstole i 72 batecs per minut). Tot i que aquesta estimulació mecànica tridimensional per si sola no és suficient per mantenir la integritat dels teixits, cal una combinació d'estimulació humoral i mecànica mitjançant T3/Dex per mantenir adequadament la viabilitat, la funció i la integritat dels teixits.
Els factors humorals tenen un paper important en la modulació del fenotip del cor adult. Això es va destacar en estudis de HiPS-CM en què es van afegir T3 i Dex a medis de cultiu per accelerar la maduració cel·lular. La T3 pot influir en el transport d'aminoàcids, sucres i calci a través de les membranes cel·lulars36. A més, la T3 promou l'expressió de MHC-α i la regulació a la baixa de MHC-β, promovent la formació de miofibril·les de contracció ràpida en cardiomiòcits madurs en comparació amb les miofibril·les de contracció lenta en la CM fetal. La deficiència de T3 en pacients hipotiroïds provoca la pèrdua de bandes miofibril·lars i una taxa reduïda de desenvolupament del to37. La Dex actua sobre els receptors de glucocorticoides i s'ha demostrat que augmenta la contractilitat miocardíaca en cors perfosos aïllats;38 es creu que aquesta millora està relacionada amb l'efecte sobre l'entrada impulsada per dipòsits de calci (SOCE)39,40. A més, la Dex s'uneix als seus receptors, provocant una àmplia resposta intracel·lular que suprimeix la funció immunitària i la inflamació30.
Els nostres resultats indiquen que l'estimulació física mecànica (MS) va millorar el rendiment general del cultiu en comparació amb Ctrl, però no va aconseguir mantenir la viabilitat, la integritat estructural i l'expressió cardíaca durant 12 dies de cultiu. En comparació amb Ctrl, l'addició de T3 i Dex als cultius CTCM (MT) va millorar la viabilitat i va mantenir perfils de transcripció, integritat estructural i activitat metabòlica similars amb teixit cardíac fresc durant 12 dies. A més, controlant el grau d'estirament del teixit, es va crear un model d'hipertròfia cardíaca induïda per hiperextensió mitjançant STCM, que il·lustra la versatilitat del sistema STCM. Cal tenir en compte que, tot i que la remodelació cardíaca i la fibrosi solen implicar òrgans intactes les cèl·lules circulants dels quals poden proporcionar les citocines adequades, així com la fagocitosi i altres factors de remodelació, les seccions del cor encara poden imitar el procés fibròtic en resposta a l'estrès i el trauma en miofibroblasts. Això s'ha avaluat prèviament en aquest model de tall cardíac. Cal tenir en compte que els paràmetres CTCM es poden modular canviant la pressió/amplitud elèctrica i la freqüència per simular moltes condicions com ara taquicàrdia, bradicàrdia i suport circulatori mecànic (cor descarregat mecànicament). Això converteix el sistema en un sistema de rendiment mitjà per a les proves de fàrmacs. La capacitat del CTCM per modelar la hipertròfia cardíaca induïda per sobreesforç obre el camí per provar aquest sistema per a una teràpia personalitzada. En conclusió, el present estudi demostra que l'estirament mecànic i l'estimulació humoral són fonamentals per mantenir el cultiu de seccions de teixit cardíac.
Tot i que les dades presentades aquí suggereixen que el CTCM és una plataforma molt prometedora per modelar el miocardi intacte, aquest mètode de cultiu té algunes limitacions. La principal limitació del cultiu CTCM és que imposa tensions mecàniques dinàmiques contínues sobre les llesques, cosa que impedeix la capacitat de monitoritzar activament les contraccions de les llesques cardíaques durant cada cicle. A més, a causa de la petita mida de les seccions cardíaques (7 mm), la capacitat d'avaluar la funció sistòlica fora dels sistemes de cultiu mitjançant sensors de força tradicionals és limitada. En el manuscrit actual, superem parcialment aquesta limitació avaluant el voltatge òptic com a indicador de la funció contràctil. Tanmateix, aquesta limitació requerirà més treball i es pot abordar en el futur introduint mètodes per a la monitorització òptica de la funció de les llesques de cor en cultiu, com ara el mapatge òptic mitjançant colorants sensibles al calci i al voltatge. Una altra limitació del CTCM és que el model de treball no manipula l'estrès fisiològic (precàrrega i postcàrrega). En el CTCM, es va induir pressió en direccions oposades per reproduir un estirament fisiològic del 25% en diàstole (estirament complet) i sístole (durada de la contracció durant l'estimulació elèctrica) en teixits molt grans. Aquesta limitació s'hauria d'eliminar en futurs dissenys de CTCM mitjançant una pressió adequada sobre el teixit cardíac des d'ambdós costats i aplicant les relacions exactes de pressió-volum que es produeixen a les cambres del cor.
La remodelació induïda per sobreestirament descrita en aquest manuscrit es limita a imitar senyals d'hiperestirament hipertròfic. Per tant, aquest model pot ajudar en l'estudi de la senyalització hipertròfica induïda per estirament sense la necessitat de factors humorals o neurals (que no existeixen en aquest sistema). Calen més estudis per augmentar la multiplicitat de CTCM, per exemple, el cocultiu amb cèl·lules immunitàries, els factors humorals circulants del plasma i la innervació quan es cocultiva amb cèl·lules neuronals millorarà les possibilitats de modelització de malalties amb CTCM.
En aquest estudi es van utilitzar tretze porcs. Tots els procediments amb animals es van dur a terme d'acord amb les directrius institucionals i van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals de la Universitat de Louisville. Es va subjecciór l'arc aòrtic i es va perfondre el cor amb 1 L de cardioplegia estèril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL d'heparina, pH fins a 7,4); Els cors es van conservar en una solució cardioplègica freda amb gel fins que es van transportar al laboratori sobre gel, que normalment és <10 min. Els cors es van conservar en una solució cardioplègica freda amb gel fins que es van transportar al laboratori sobre gel, que normalment és <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчытон на занимает <10 мин. Els cors es van emmagatzemar en una solució cardioplègica freda amb gel fins al transport al laboratori sobre gel, que normalment triga <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычмно <10 Mantenir els cors en gel per cardioplegia fins al transport al laboratori en gel, normalment <10 min.
El dispositiu CTCM es va desenvolupar amb el programari de disseny assistit per ordinador (CAD) SolidWorks. Les cambres de cultiu, els divisors i les cambres d'aire estan fets de plàstic acrílic transparent CNC. L'anell de suport de 7 mm de diàmetre està fet de polietilè d'alta densitat (HDPE) al centre i té una ranura per a la junta tòrica per allotjar la junta tòrica de silicona que s'utilitza per segellar el medi a sota. Una fina membrana de sílice separa la cambra de cultiu de la placa de separació. La membrana de silicona està tallada amb làser a partir d'una làmina de silicona de 0,02″ de gruix i té una duresa de 35A. Les juntes de silicona inferior i superior estan tallades amb làser a partir d'una làmina de silicona d'1/16″ de gruix i tenen una duresa de 50A. Per fixar el bloc i crear un segellat hermètic s'utilitzen cargols i femelles de papallona d'acer inoxidable 316L.
Una placa de circuit imprès (PCB) dedicada està dissenyada per integrar-se amb el sistema C-PACE-EM. Els connectors de la màquina suïssa de la PCB estan connectats a elèctrodes de grafit mitjançant cables de coure platejats i cargols de bronze 0-60 cargolats als elèctrodes. La placa de circuit imprès es col·loca a la coberta de la impressora 3D.
El dispositiu CTCM està controlat per un actuador pneumàtic programable (PPD) que crea una pressió circulatòria controlada similar a un cicle cardíac. A mesura que augmenta la pressió dins de la cambra d'aire, la membrana flexible de silicona s'expandeix cap amunt, forçant el medi a passar per sota del teixit. L'àrea de teixit s'estirarà per aquesta expulsió de fluid, imitant l'expansió fisiològica del cor durant la diàstole. En el pic de relaxació, es va aplicar estimulació elèctrica a través d'elèctrodes de grafit, que van reduir la pressió a la cambra d'aire i van provocar la contracció de les seccions de teixit. Dins del tub hi ha una vàlvula hemostàtica amb un sensor de pressió per detectar la pressió al sistema d'aire. La pressió detectada pel sensor de pressió s'aplica a un col·lector de dades connectat a l'ordinador portàtil. Això permet un seguiment continu de la pressió dins de la cambra de gas. Quan s'assolia la pressió màxima de la cambra (estàndard 80 mmHg, 140 mmHg OS), es va ordenar al dispositiu d'adquisició de dades que enviés un senyal al sistema C-PACE-EM per generar un senyal de voltatge bifàsic durant 2 ms, ajustat a 4 V.
Es van obtenir seccions de cor i es van realitzar les condicions de cultiu en 6 pous de la manera següent: transferir els cors recollits del recipient de transferència a una safata que contenia cardioplegia freda (4 °C). El ventricle esquerre es va aïllar amb una fulla estèril i es va tallar en trossos d'1-2 cm3. Aquests blocs de teixit es van fixar a suports de teixit amb adhesiu tissular i es van col·locar en un bany de teixit de microtom vibrant que contenia solució de Tyrode i es va oxigenar contínuament (3 g/L de 2,3-butanodiona monooxima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucosa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml de solució 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml de solució 1 M), fins a 1 L ddH2O). El micròtom vibrador es va configurar per tallar llesques de 300 µm de gruix a una freqüència de 80 Hz, una amplitud de vibració horitzontal de 2 mm i una velocitat d'avanç de 0,03 mm/s. El bany de teixit es va envoltar de gel per mantenir la solució freda i la temperatura es va mantenir a 4 °C. Transferiu les seccions de teixit del bany del microtom a un bany d'incubació que contenia una solució Tyrode oxigenada contínuament sobre gel fins que s'obtinguessin prou seccions per a una placa de cultiu. Per als cultius transwell, les seccions de teixit es van fixar a suports de poliuretà estèrils de 6 mm d'amplada i es van col·locar en 6 ml de medi optimitzat (medi 199, suplement ITS 1x, FBS al 10%, VEGF 5 ng/ml, FGF-alcalí 10 ng/ml i antibiòtic-antifúngic 2X). Es va aplicar estimulació elèctrica (10 V, freqüència 1,2 Hz) a les seccions de teixit a través del C-Pace. Per a les condicions TD, es van afegir T3 i Dex frescos a 100 nM i 1 μM a cada canvi de medi. El medi es satura amb oxigen abans de ser reemplaçat 3 vegades al dia. Les seccions de teixit es van cultivar en una incubadora a 37 °C i un 5% de CO2.
Per als cultius CTCM, les seccions de teixit es van col·locar en una impressora 3D feta a mida en una placa de Petri que contenia una solució de Tyrode modificada. El dispositiu està dissenyat per augmentar la mida de la llesca del cor en un 25% de l'àrea de l'anell de suport. Això es fa perquè les seccions del cor no s'estirin després de ser transferides de la solució de Tyrode al medi i durant la diàstole. Utilitzant cola histoacrílica, es van fixar seccions de 300 µm de gruix en un anell de suport de 7 mm de diàmetre. Després de fixar les seccions de teixit a l'anell de suport, es van tallar les seccions de teixit sobrants i es van tornar a col·locar les seccions de teixit fixades al bany de solució de Tyrode sobre gel (4 °C) fins que s'hagin preparat prou seccions per a un dispositiu. El temps total de processament per a tots els dispositius no ha de superar les 2 hores. Després de fixar 6 seccions de teixit als seus anells de suport, es va muntar el dispositiu CTCM. La cambra de cultiu CTCM està preomplerta amb 21 ml de medi preoxigenat. Transferiu les seccions de teixit a la cambra de cultiu i elimineu amb cura les bombolles d'aire amb una pipeta. A continuació, es guia la secció de teixit dins del forat i es pressiona suaument fins que estigui al seu lloc. Finalment, col·loqueu la tapa de l'elèctrode al dispositiu i transferiu el dispositiu a la incubadora. A continuació, connecteu el CTCM al tub d'aire i al sistema C-PACE-EM. L'actuador pneumàtic s'obre i la vàlvula d'aire obre el CTCM. El sistema C-PACE-EM es va configurar per subministrar 4 V a 1,2 Hz durant la estimulació bifàsica durant 2 ms. El medi es va canviar dues vegades al dia i els elèctrodes es van canviar un cop al dia per evitar l'acumulació de grafit als elèctrodes. Si cal, les seccions de teixit es poden treure dels seus pous de cultiu per expulsar qualsevol bombolla d'aire que hagi pogut caigut a sota. Per a les condicions de tractament MT, es va afegir T3/Dex fresc amb cada canvi de medi amb 100 nM de T3 i 1 μM de Dex. Els dispositius CTCM es van cultivar en una incubadora a 37 °C i 5% de CO2.
Per obtenir trajectòries estirades de talls de cor, es va desenvolupar un sistema de càmera especial. Es va utilitzar una càmera rèflex (Canon Rebel T7i, Canon, Tòquio, Japó) amb un objectiu macro Navitar Zoom 7000 de 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). La visualització es va realitzar a temperatura ambient després de substituir el medi per un medi nou. La càmera es posiciona en un angle de 51° i el vídeo es grava a 30 fotogrames per segon. Primer, es va utilitzar programari de codi obert (MUSCLEMOTION43) amb Image-J per quantificar el moviment dels talls de cor. La màscara es va crear mitjançant MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EUA) per definir regions d'interès per als talls de cor bategant per evitar soroll. S'apliquen màscares segmentades manualment a totes les imatges d'una seqüència de fotogrames i després es passen al complement MUSCLEMOTION. Muscle Motion utilitza la intensitat mitjana dels píxels de cada fotograma per quantificar el seu moviment en relació amb el fotograma de referència. Les dades es van registrar, filtrar i utilitzar per quantificar el temps de cicle i avaluar l'estirament del teixit durant el cicle cardíac. El vídeo gravat es va postprocessar mitjançant un filtre digital de fase zero de primer ordre. Per quantificar l'estirament del teixit (pic a pic), es va realitzar una anàlisi pic a pic per distingir entre pics i valls en el senyal gravat. A més, la detrending es realitza mitjançant un polinomi de sisè ordre per eliminar la deriva del senyal. El codi del programa es va desenvolupar a MATLAB per determinar el moviment global del teixit, el temps de cicle, el temps de relaxació i el temps de contracció (Codi de programa suplementari 44).
Per a l'anàlisi de deformació, utilitzant els mateixos vídeos creats per a l'avaluació de l'estirament mecànic, primer vam traçar dues imatges que representaven els pics de moviment (els punts de moviment més alts (superior) i més baixos (inferiors)) segons el programari MUSCLEMOTION. A continuació, vam segmentar les regions del teixit i vam aplicar una mena d'algoritme d'ombrejat al teixit segmentat (Fig. suplementària 2a). El teixit segmentat es va dividir en deu subsuperfícies, i la tensió a cada superfície es va calcular mitjançant l'equació següent: Deformació = (Sup-Sdown)/Sdown, on Sup i Sdown són les distàncies de la forma des de les ombres superior i inferior del teixit, respectivament (Fig. suplementària 2b).
Les seccions de cor es van fixar en paraformaldehid al 4% durant 48 hores. Els teixits fixats es van deshidratar en sacarosa al 10% i al 20% durant 1 h, i després en sacarosa al 30% durant la nit. A continuació, les seccions es van incrustar en un compost de temperatura òptima de tall (compost OCT) i es van congelar gradualment en un bany d'isopentà/gel sec. Emmagatzemar els blocs d'incrustació OCT a -80 °C fins a la separació. Els portaobjectes es van preparar com a seccions amb un gruix de 8 μm.
Per eliminar l'OCT de les seccions del cor, escalfeu els portaobjectes en un bloc calefactor a 95 °C durant 5 minuts. Afegiu 1 ml de PBS a cada portaobjectes i incubeu-los durant 30 minuts a temperatura ambient i, a continuació, permeeu les seccions establint Triton-X al 0,1% en PBS durant 15 minuts a temperatura ambient. Per evitar que els anticossos no específics s'uneixin a la mostra, afegiu 1 ml de solució de BSA al 3% als portaobjectes i incubeu-los durant 1 hora a temperatura ambient. A continuació, es va eliminar la BSA i es van rentar els portaobjectes amb PBS. Marqueu cada mostra amb un llapis. Es van afegir anticossos primaris (diluïts 1:200 en BSA a l'1%) (connexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) i troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) durant 90 minuts, i després es van afegir anticossos secundaris (diluïts 1:200 en BSA a l'1%) contra Alexa Fluor 488 de ratolí (Thermo Scientific; #A16079) i contra Alexa Fluor 594 de conill (Thermo Scientific; #T6391) durant 90 minuts més. Es van rentar 3 vegades amb PBS. Per distingir la tinció de la diana del fons, només vam utilitzar l'anticòs secundari com a control. Finalment, es va afegir tinció nuclear DAPI i els portaobjectes es van col·locar en un Vectashield (Vector Laboratories) i es van segellar amb esmalt d'ungles. (augment de -x) i un microscopi Keyence amb un augment de 40x.
Per a la tinció de WGA es va utilitzar WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml en PBS i es va aplicar a seccions fixades durant 30 minuts a temperatura ambient. A continuació, es van rentar els portaobjectes amb PBS i es va afegir negre del Sudan a cada portaobjectes i es van incubar durant 30 minuts. A continuació, es van rentar els portaobjectes amb PBS i es va afegir medi d'inclusió Vectashield. Els portaobjectes es van visualitzar en un microscopi Keyence amb un augment de 40x.
L'OCT es va treure de les mostres tal com s'ha descrit anteriorment. Després de treure l'OCT, submergiu els portaobjectes en la solució de Bouin durant la nit. A continuació, els portaobjectes es van esbandir amb aigua destil·lada durant 1 hora i després es van col·locar en una solució d'àcid d'àloe i fucsina de Bibrich durant 10 minuts. A continuació, els portaobjectes es van rentar amb aigua destil·lada i es van col·locar en una solució de fosfomolibdè al 5%/àcid fosfotúngstic al 5% durant 10 minuts. Sense esbandir, transferiu els portaobjectes directament a la solució de blau d'anilina durant 15 minuts. A continuació, els portaobjectes es van rentar amb aigua destil·lada i es van col·locar en una solució d'àcid acètic a l'1% durant 2 minuts. Els portaobjectes es van assecar en etanol 200 N i es van transferir a xilè. Els portaobjectes tenyits es van visualitzar mitjançant un microscopi Keyence amb un objectiu de 10x. El percentatge d'àrea de fibrosi es va quantificar mitjançant el programari Keyence Analyzer.
Assaig de viabilitat cel·lular CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), número de catàleg V13154, segons el protocol del fabricant amb algunes modificacions. En particular, es va utilitzar un punxó quirúrgic amb un diàmetre de 6 mm per garantir una mida uniforme del teixit durant l'anàlisi MTT. Els teixits es van col·locar individualment als pous d'una placa de 12 pous que contenia substrat MTT segons el protocol del fabricant. Les seccions s'incuben a 37 °C durant 3 hores i el teixit viu metabolitza el substrat MTT per formar un compost de formazan porpra. Substituïu la solució MTT per 1 ml de DMSO i incubeu a 37 °C durant 15 minuts per extreure el formazan porpra de les seccions del cor. Les mostres es van diluir 1:10 en DMSO en plaques de fons transparent de 96 pous i la intensitat del color porpra es va mesurar a 570 nm mitjançant un lector de plaques Cytation (BioTek). Les lectures es van normalitzar al pes de cada llesca del cor.
El medi de tall de cor es va substituir per un medi que contenia 1 μCi/ml de [5-3H]-glucosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EUA) per a l'assaig d'utilització de glucosa, tal com s'ha descrit anteriorment. Després de 4 hores d'incubació, afegiu 100 µl de medi a un tub de microcentrífuga obert que contenia 100 µl de HCl 0,2 N. A continuació, es va col·locar el tub en un tub de centelleig que contenia 500 μl de dH2O per evaporar [3H]2O durant 72 hores a 37 °C. A continuació, retireu el tub de microcentrífuga del tub de centelleig i afegiu 10 ml de líquid de centelleig. Els recomptes de centelleig es van realitzar mitjançant un analitzador de centelleig líquid Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, EUA). La utilització de glucosa es va calcular tenint en compte l'activitat específica de la [5-3H]-glucosa, l'equilibri incomplet i el fons, la dilució de [5-3H]-glucosa no marcada i l'eficiència del comptador de centelleig. Les dades es normalitzen a la massa de les seccions del cor.
Després de l'homogeneïtzació dels teixits en Trizol, l'ARN es va aïllar de seccions de cor utilitzant el kit Qiagen miRNeasy Micro #210874 segons el protocol del fabricant. La preparació, la seqüenciació i l'anàlisi de dades de la biblioteca RNAsec es van dur a terme de la manera següent:
Es va utilitzar 1 μg d'ARN per mostra com a material de partida per a la preparació de la biblioteca d'ARN. Les biblioteques de seqüenciació es van generar mitjançant el kit de preparació de biblioteques d'ARN NEBNext UltraTM per a Illumina (NEB, EUA) seguint les recomanacions del fabricant, i es van afegir codis d'índex a les seqüències d'atributs per a cada mostra. Breument, l'ARNm es va purificar a partir de l'ARN total mitjançant perles magnètiques unides amb oligonucleòtids poli-T. La fragmentació es duu a terme mitjançant cations divalents a alta temperatura en tampó de reacció de síntesi de primera cadena NEBNext (5X). El cDNA de la primera cadena es va sintetitzar mitjançant encebadors hexàmers aleatoris i transcriptasa inversa M-MuLV (RNasa H-). El cDNA de la segona cadena es sintetitza mitjançant ADN polimerasa I i RNasa H. Els voladissos restants es converteixen en extrems roms mitjançant l'activitat exonucleasa/polimerasa. Després de l'adenilació de l'extrem 3' del fragment d'ADN, s'hi uneix un adaptador NEBNext amb una estructura de bucle de forquilla per preparar-lo per a la hibridació. Per a la selecció de fragments de cDNA de longitud preferida de 150-200 pb. Els fragments de la biblioteca es van purificar mitjançant el sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EUA). A continuació, es van utilitzar 3 μl d'enzim USER (NEB, EUA) amb cDNA seleccionat per mida lligat amb un adaptador durant 15 minuts a 37 °C i després durant 5 minuts a 95 °C abans de la PCR. A continuació, es va realitzar la PCR mitjançant l'ADN polimerasa Phusion High-Fidelity, encebadors universals de PCR i encebadors Index (X). Finalment, es van purificar els productes de PCR (sistema AMPure XP) i es va avaluar la qualitat de la biblioteca en un sistema Agilent Bioanalyzer 2100. La biblioteca de cDNA es va seqüenciar mitjançant un seqüenciador Novaseq. Els fitxers d'imatges en brut d'Illumina es van convertir en lectures en brut mitjançant CASAVA Base Calling. Les dades en brut s'emmagatzemen en fitxers en format FASTQ(fq) que contenen seqüències de lectura i les qualitats de base corresponents. Seleccioneu HISAT2 per fer coincidir les lectures de seqüenciació filtrades amb el genoma de referència de Sscrofa11.1. En general, HISAT2 admet genomes de qualsevol mida, inclosos genomes de més de 4.000 milions de bases, i s'estableixen valors per defecte per a la majoria dels paràmetres. Les lectures d'empalmament de dades de seqüència d'ARN es poden alinear de manera eficient mitjançant HISAT2, el sistema més ràpid disponible actualment, amb la mateixa o millor precisió que qualsevol altre mètode.
L'abundància de transcrits reflecteix directament el nivell d'expressió gènica. Els nivells d'expressió gènica s'avaluen mitjançant l'abundància de transcrits (recompte de seqüenciació) associats amb el genoma o els exons. El nombre de lectures és proporcional als nivells d'expressió gènica, la longitud del gen i la profunditat de seqüenciació. Es van calcular els FPKM (fragments per mil parells de bases de transcrit seqüenciat per milió de parells de bases) i es van determinar els valors P de l'expressió diferencial mitjançant el paquet DESeq2. A continuació, vam calcular la taxa de descobriment fals (FDR) per a cada valor P mitjançant el mètode de Benjamini-Hochberg9 basat en la funció R integrada "p.adjust".
L'ARN aïllat de seccions de cor es va convertir en ADNc a una concentració de 200 ng/μl utilitzant la barreja SuperScript IV Vilo Master de Thermo (Thermo, núm. cat. 11756050). La RT-PCR quantitativa es va realitzar utilitzant una placa de reacció transparent Applied Biosystems Endura Plate Microamp de 384 pous (Thermo, núm. cat. 4483319) i un adhesiu òptic microamp (Thermo, núm. cat. 4311971). La barreja de reacció consistia en 5 µl de barreja Taqman Fast Advanced Master (Thermo, núm. cat. 4444557), 0,5 µl de Taqman Primer i 3,5 µl d'H2O barrejats per pou. Es van executar cicles estàndard de qPCR i es van mesurar els valors de CT utilitzant un instrument de PCR en temps real Applied Biosystems Quantstudio 5 (mòdul de 384 pous; núm. de producte A28135). Els encebadors Taqman es van comprar de Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Els valors de CT de totes les mostres es van normalitzar al gen de manteniment GAPDH.
L'alliberament del medi de NT-ProBNP es va avaluar mitjançant el kit NT-ProBNP (pig) (núm. de cat. MBS2086979, MyBioSource) segons el protocol del fabricant. Breument, es van afegir 250 µl de cada mostra i estàndard per duplicat a cada pou. Immediatament després d'afegir la mostra, afegiu 50 µl de reactiu d'assaig A a cada pou. Agiteu suaument la placa i segelleu-la amb segellador. A continuació, els comprimits es van incubar a 37 °C durant 1 hora. A continuació, aspireu la solució i renteu els pous 4 vegades amb 350 µl de solució de rentat 1X, incubant la solució de rentat durant 1-2 minuts cada vegada. A continuació, afegiu 100 µl de reactiu d'assaig B per pou i segelleu-lo amb segellador de placa. El comprimit es va agitar suaument i es va incubar a 37 °C durant 30 minuts. Aspireu la solució i renteu els pous 5 vegades amb 350 µl de solució de rentat 1X. Afegiu 90 µl de solució de substrat a cada pou i segelleu la placa. Incubeu la placa a 37 °C durant 10-20 minuts. Afegiu 50 µl de solució de parada a cada pou. La placa es va mesurar immediatament amb un lector de plaques Cytation (BioTek) configurat a 450 nm.
Es van dur a terme anàlisis de potència per triar les mides de grup que proporcionaran una potència >80% per detectar un canvi absolut del 10% en el paràmetre amb una taxa d'error de tipus I del 5%. Es van dur a terme anàlisis de potència per triar les mides de grup que proporcionaran una potència >80% per detectar un canvi absolut del 10% en el paràmetre amb una taxa d'error de tipus I del 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощноя тобеспечат 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Es va dur a terme una anàlisi de potència per seleccionar mides de grup que proporcionessin una potència superior al 80% per detectar un canvi de paràmetres absolut del 10% amb una taxa d'error de tipus I del 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощнлоя обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Es va dur a terme una anàlisi de potència per seleccionar una mida de grup que proporcionés una potència >80% per detectar un canvi absolut de paràmetres del 10% i una taxa d'error de tipus I del 5%.Les seccions de teixit es van seleccionar aleatòriament abans de l'experiment. Totes les anàlisis van ser cegues a les condicions i les mostres es van descodificar només després que s'haguessin analitzat totes les dades. Es va utilitzar el programari GraphPad Prism (San Diego, CA) per realitzar totes les anàlisis estadístiques. Per a totes les estadístiques, els valors de p es van considerar significatius a valors <0,05. Per a totes les estadístiques, els valors de p es van considerar significatius per a valors <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Per a totes les estadístiques, els valors de p es van considerar significatius per a valors <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Per a totes les estadístiques, els valors de p es van considerar significatius per a valors <0,05.Es va realitzar la prova t de Student bilateral sobre les dades amb només 2 comparacions. Es va utilitzar ANOVA unidireccional o bidireccional per determinar la significació entre múltiples grups. Quan es van realitzar proves post hoc, es va aplicar la correcció de Tukey per tenir en compte les comparacions múltiples. Les dades de RNAsec tenen consideracions estadístiques especials a l'hora de calcular la FDR i l'ajust p, tal com es descriu a la secció Mètodes.
Per obtenir més informació sobre el disseny de l'estudi, consulteu el resum de Nature Research Report enllaçat a aquest article.
Data de publicació: 28 de setembre de 2022
