Gràcies per visitar Nature.com. La versió del navegador que esteu utilitzant té compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). Mentrestant, per garantir el suport continu, renderem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Nous mètodes immunològics i d'espectrometria de masses per a l'anàlisi complexa d'oligosacàrids persistents en palla de blat de moro pretractada amb AFEX. La biomassa lignocel·lulòsica és una alternativa sostenible als combustibles fòssils i s'utilitza àmpliament per desenvolupar biotecnologies per a la producció de productes com ara aliments, pinsos, combustibles i productes químics. La clau d'aquestes tecnologies és el desenvolupament de processos competitius en termes de costos per convertir els carbohidrats complexos presents a les parets cel·lulars de les plantes en sucres simples com la glucosa, la xilosa i l'arabinosa. Com que la biomassa lignocel·lulòsica és molt tossuda, s'ha de sotmetre a tractaments termoquímics (per exemple, exfoliació de fibra d'amoníac (AFEX), àcids diluïts (DA), líquids iònics (IL)) i tractaments biològics (per exemple, hidròlisi enzimàtica i fermentació microbiana) en combinació per obtenir el producte desitjat. Tanmateix, quan s'utilitzen enzims fúngics comercials en el procés d'hidròlisi, només el 75-85% dels sucres solubles formats són monosacàrids, i el 15-25% restant són oligosacàrids solubles i intractables, que no sempre estan disponibles per als microorganismes. Anteriorment, hem aïllat i purificat amb èxit oligosacàrids tossuts solubles mitjançant una combinació de separació per carboni i terra de diatomees i cromatografia d'exclusió de mida, i també hem investigat les seves propietats inhibidores d'enzims. Hem descobert que els oligosacàrids que contenen substitucions d'àcid urònic metilat amb un grau més alt de polimerització (DP) són més difícils de processar amb mescles d'enzims comercials que els oligosacàrids de baix DP i neutres. Aquí informem de l'ús de diversos mètodes addicionals, incloent-hi el perfilat de glicans mitjançant anticossos monoclonals (mAbs) específics per als glicans de biomassa vegetal per caracteritzar els enllaços de glicans a les parets cel·lulars vegetals i hidrolizats enzimàtics, ionització per desorció làser assistida per matriu, espectrometria de masses de temps de vol. MALDI-TOF-MS) utilitza pics de diagnòstic informatius sobre l'estructura obtinguts per espectroscòpia després de la desintegració secundària d'ions negatius, cromatografia de gasos i espectrometria de masses (GC-MS) per caracteritzar enllaços d'oligosacàrids amb i sense derivatització. A causa de la petita mida dels oligosacàrids (DP 4-20), aquestes molècules són difícils d'utilitzar per a la unió i caracterització d'anticòs monoclonals. Per superar aquest problema, vam aplicar un nou mètode d'immobilització d'oligosacàrids basat en la conjugació de biotina que va marcar amb èxit la majoria dels oligosacàrids solubles de baix DP a la superfície de la microplaca, que després es va utilitzar en un sistema d'anticòs monoclonals d'alt rendiment per a l'anàlisi de lligadura específica. Aquest nou mètode facilitarà el desenvolupament d'assajos de glicoma d'alt rendiment més avançats en el futur que es puguin utilitzar per aïllar i caracteritzar oligosacàrids presents en biomarcadors amb finalitats diagnòstiques.
La biomassa lignocel·lulòsica, composta de materials agrícoles, forestals, herbacis i llenyosos, és una matèria primera potencial per a la producció de productes biològics, incloent-hi aliments, pinsos, combustibles i precursors químics per produir productes de més valor1. Els carbohidrats (com la cel·lulosa i l'hemicel·lulosa) presents a les parets cel·lulars de les plantes es despolimeritzen en monosacàrids mitjançant processament químic i biotransformació (com ara la hidròlisi enzimàtica i la fermentació microbiana). Els pretractaments habituals inclouen l'expansió de fibra d'amoníac (AFEX), l'àcid diluït (DA), el líquid iònic (IL) i l'explosió de vapor (SE), que utilitzen una combinació de productes químics i calor per reduir la producció de lignocel·lulosa obrint les parets cel·lulars de les plantes3,4. tossuderia de la matèria, 5. La hidròlisi enzimàtica es duu a terme amb una càrrega de sòlids elevada utilitzant enzims comercials que contenen carbohidrats actius (CAZymes) i fermentació microbiana utilitzant llevats o bacteris transgènics per produir combustibles i productes químics biològics6.
Els CAZims dels enzims comercials estan compostos per una barreja complexa d'enzims que trenquen sinèrgicament enllaços complexos entre carbohidrats i sucre per formar monosacàrids2,7. Com ja hem informat anteriorment, la complexa xarxa de polímers aromàtics de la lignina amb els carbohidrats els fa altament intractables, cosa que condueix a una conversió incompleta del sucre, acumulant entre un 15 i un 25% d'oligosacàrids sexuals que no es produeixen durant la hidròlisi enzimàtica de la biomassa pretractada. Aquest és un problema comú amb diversos mètodes de pretractament de biomassa. Algunes de les raons d'aquest coll d'ampolla inclouen la inhibició enzimàtica durant la hidròlisi o l'absència o els baixos nivells d'enzims essencials essencials que es necessiten per trencar els enllaços de sucre a la biomassa vegetal. Comprendre la composició i les característiques estructurals dels sucres, com ara els enllaços de sucre dels oligosacàrids, ens ajudarà a millorar la conversió del sucre durant la hidròlisi, fent que els processos biotecnològics siguin competitius en termes de costos amb els productes derivats del petroli.
Determinar l'estructura dels carbohidrats és un repte i requereix una combinació de mètodes com la cromatografia líquida (LC)11,12, l'espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN)13, l'electroforesi capil·lar (CE)14,15,16 i l'espectrometria de masses (MS)17., divuit. Els mètodes de MS com l'espectrometria de masses de temps de vol amb desorció i ionització làser mitjançant una matriu (MALDI-TOF-MS) són un mètode versàtil per identificar estructures de carbohidrats. Recentment, la MS en tàndem de dissociació induïda per col·lisió (CID) d'adductes d'ions de sodi s'ha utilitzat més àmpliament per identificar empremtes dactilars corresponents a posicions d'unió d'oligosacàrids, configuracions anomèriques, seqüències i posicions de ramificació20, 21.
L'anàlisi de glicans és una eina excel·lent per a la identificació en profunditat dels enllaços de carbohidrats22. Aquest mètode utilitza anticossos monoclonals (mAbs) dirigits al glicà de la paret cel·lular vegetal com a sondes per comprendre els enllaços complexos de carbohidrats. Hi ha més de 250 mAbs disponibles a tot el món, dissenyats contra diversos oligosacàrids lineals i ramificats utilitzant diversos sacàrids24. Diversos mAbs s'han utilitzat àmpliament per caracteritzar l'estructura, la composició i les modificacions de la paret cel·lular vegetal, ja que hi ha diferències significatives segons el tipus de cèl·lula vegetal, l'òrgan, l'edat, l'etapa de desenvolupament i l'entorn de creixement25,26. Més recentment, aquest mètode s'ha utilitzat per comprendre les poblacions de vesícules en sistemes vegetals i animals i els seus respectius papers en el transport de glicans determinats per marcadors subcel·lulars, etapes de desenvolupament o estímuls ambientals, i per determinar l'activitat enzimàtica. Algunes de les diferents estructures de glicans i xilans que s'han identificat inclouen pectina (P), xilà (X), manà (M), xiloglucans (XylG), glucans d'enllaços mixtos (MLG), arabinoxilà (ArbX), galactomanà (GalG), àcid glucurònic-arabinoxilà (GArbX) i arabino-galactà (ArbG)29.
Tanmateix, malgrat tots aquests esforços de recerca, només uns quants estudis s'han centrat en la naturalesa de l'acumulació d'oligosacàrids durant la hidròlisi amb alta càrrega de sòlids (HSL), incloent-hi l'alliberament d'oligosacàrids, els canvis en la longitud de la cadena oligomèrica durant la hidròlisi, diversos polímers de baixa DP i les seves corbes. distribucions 30,31,32. Mentrestant, tot i que l'anàlisi de glicans ha demostrat ser una eina útil per a una anàlisi completa de l'estructura dels glicans, és difícil avaluar els oligosacàrids de baixa DP solubles en aigua mitjançant mètodes d'anticossos. Els oligosacàrids de DP més petits amb un pes molecular inferior a 5-10 kDa no s'uneixen a les plaques ELISA 33, 34 i es renten abans de l'addició d'anticossos.
Aquí, per primera vegada, demostrem un assaig ELISA en plaques recobertes d'avidina utilitzant anticossos monoclonals, combinant un procediment de biotinilació d'un sol pas per a oligosacàrids refractaris solubles amb anàlisi de glicoma. El nostre enfocament per a l'anàlisi de glicoma es va validar mitjançant anàlisi basada en MALDI-TOF-MS i GC-MS d'enllaços d'oligosacàrids complementaris utilitzant la derivatització de trimetilsilil (TMS) de composicions de sucre hidrolitzades. Aquest enfocament innovador es pot desenvolupar com a mètode d'alt rendiment en el futur i trobar una aplicació més àmplia en la recerca biomèdica35.
Les modificacions posttraduccionals dels enzims i els anticossos, com la glicosilació,36 afecten la seva activitat biològica. Per exemple, els canvis en la glicosilació de les proteïnes sèriques tenen un paper important en l'artritis inflamatòria, i els canvis en la glicosilació s'utilitzen com a marcadors diagnòstics37. A la literatura s'ha descrit que diversos glicans apareixen fàcilment en una varietat de malalties, com ara malalties inflamatòries cròniques del tracte gastrointestinal i el fetge, infeccions víriques, càncers d'ovari, mama i pròstata38,39,40. Comprendre l'estructura dels glicans mitjançant mètodes ELISA de glicans basats en anticossos proporcionarà una confiança addicional en el diagnòstic de malalties sense l'ús de mètodes complexos de MS.
El nostre estudi anterior va demostrar que els oligosacàrids tossuts romanien sense hidrolitzar després del pretractament i la hidròlisi enzimàtica (Figura 1). En el nostre treball publicat anteriorment, vam desenvolupar un mètode d'extracció en fase sòlida amb carbó activat per aïllar oligosacàrids de l'hidrolitzat de palla de blat de moro pretractat amb AFEX (ACSH)8. Després de l'extracció i separació inicials, els oligosacàrids es van fraccionar encara més mitjançant cromatografia d'exclusió per mida (SEC) i es van recollir per ordre de pes molecular. Els monòmers i oligòmers de sucre alliberats de diversos pretractaments es van analitzar mitjançant l'anàlisi de la composició del sucre. En comparar el contingut d'oligòmers de sucre obtinguts per diversos mètodes de pretractament, la presència d'oligosacàrids tossuts és un problema comú en la conversió de biomassa a monosacàrids i pot conduir a una reducció del rendiment del sucre d'almenys el 10-15% i fins i tot fins al 18%. Aquest mètode s'utilitza per a la producció a gran escala de fraccions d'oligosacàrids. L'ACH resultant i les seves fraccions posteriors amb diferents pesos moleculars es van utilitzar com a material experimental per a la caracterització d'oligosacàrids en aquest treball.
Després del pretractament i la hidròlisi enzimàtica, els oligosacàrids persistents van romandre sense hidrolitzar. Aquí (A) es mostra un mètode de separació d'oligosacàrids en què els oligosacàrids s'aïllen de l'hidrolizat de palla de blat de moro pretractada amb AFEX (ACSH) utilitzant un llit compactat de carbó activat i terra de diatomees; (B) Mètode per a la separació d'oligosacàrids. Els oligosacàrids es van separar addicionalment mitjançant cromatografia d'exclusió per mida (SEC); (C) Monòmers i oligòmers de sacàrids alliberats de diversos pretractaments (àcid diluït: DA, líquid iònic: IL i AFEX). Condicions d'hidròlisi enzimàtica: càrrega de sòlids elevada del 25% (p/p) (aproximadament un 8% de càrrega de glucà), hidròlisi de 96 hores, càrrega d'enzim comercial de 20 mg/g (relació Ctec2:Htec2:MP-2:1:1) i (D) Monòmers i oligòmers de sucre de glucosa, xilosa i arabinosa alliberats de palla de blat de moro pretractada amb AFEX (ACS).
L'anàlisi de glicans ha demostrat ser una eina útil per a una anàlisi estructural completa dels glicans en extractes aïllats de residus de biomassa sòlida. Tanmateix, els sacàrids solubles en aigua estan infrarepresentats mitjançant aquest mètode tradicional41 perquè els oligosacàrids de baix pes molecular són difícils d'immobilitzar en plaques ELISA i es renten abans de l'addició d'anticossos. Per tant, per a la unió i caracterització d'anticossos, es va utilitzar un mètode de biotinilació d'un sol pas per recobrir oligosacàrids solubles i no conformes en plaques ELISA recobertes d'avidina. Aquest mètode es va provar utilitzant el nostre ACSH produït anteriorment i una fracció basada en el seu pes molecular (o grau de polimerització, DP). Es va utilitzar biotinilació d'un sol pas per augmentar l'afinitat d'unió d'oligosacàrids afegint biotina-LC-hidrazida a l'extrem reductor del carbohidrat (Fig. 2). En solució, el grup hemiacetal a l'extrem reductor reacciona amb el grup hidrazida de la biotina-LC-hidrazida per formar un enllaç hidrazona. En presència de l'agent reductor NaCNBH3, l'enllaç hidrazona es redueix a un producte final biotinilat estable. Amb la modificació de l'extrem reductor de sucre, va ser possible la unió d'oligosacàrids de baix DP a les plaques ELISA, i en el nostre estudi això es va fer en plaques recobertes d'avidina utilitzant mAbs dirigits a glicans.
Cribratge d'anticossos monoclonals basat en ELISA per a oligosacàrids biotinilats. Aquí (A) es combina la biotinilació d'oligosacàrids i el cribratge ELISA posterior amb anticorps monoclonals dirigits a glicans en plaques recobertes de NeutrAvidina i (B) es mostra un procediment d'un sol pas per a la biotinilació de productes de reacció.
A continuació, es van afegir plaques recobertes d'avidina amb anticossos conjugats amb oligosacàrids als anticossos primaris i secundaris i es van rentar en un medi sensible a la llum i al temps. Un cop completada la unió dels anticossos, s'hi va afegir el substrat TMB per incubar la placa. Finalment, la reacció es va aturar amb àcid sulfúric. Les plaques incubades es van analitzar mitjançant un lector ELISA per determinar la força d'unió de cada anticòs per detectar l'enllaç creuat específic de l'anticossos. Per obtenir més informació i paràmetres de l'experiment, vegeu la secció corresponent "Materials i mètodes".
Demostrem la utilitat d'aquest mètode recentment desenvolupat per a aplicacions específiques caracteritzant els oligosacàrids solubles presents en l'ACSH, així com en fraccions d'oligosacàrids crus i purificats aïllats d'hidrolizats lignocel·lulòsics. Com es mostra a la Figura 3, els xilans substituïts per epítops més comuns identificats en l'ACSH mitjançant mètodes d'assaig de glicoma bioacilat solen ser arabinogalactans urònics (U) o metilurònics (MeU) i pèctics. La majoria també es van trobar en el nostre estudi anterior sobre l'anàlisi de glicans de sòlids no hidrolitzats (UHS)43.
Detecció d'epítops d'oligosacàrids recalcitrants mitjançant un anticòs monoclonal dirigit al glicà de la paret cel·lular. La fracció "neutral" és la fracció ACN i la fracció "àcida" és la fracció FA. Els vermells més brillants del mapa de calor indiquen un contingut d'epítops més alt, i els blaus més brillants indiquen un fons en blanc. Els valors de color a l'escala es basen en valors OD en brut per a formulacions N=2. Els principals epítops reconeguts pels anticossos es mostren a la dreta.
Aquestes estructures no cel·luloses no van poder ser escindides per les cel·lulases i hemicel·lulases més comunes de la mescla d'enzims comercials provades, que inclou els enzims comercials més utilitzats. Per tant, es necessiten nous enzims auxiliars per a la seva hidròlisi. Sense els enzims accessoris no cel·lulosos necessaris, aquests enllaços no cel·lulosos impedeixen la conversió completa en monosacàrids, fins i tot si els seus polímers de sucre originals s'hidrolitzen àmpliament en fragments més curts i es dissolen mitjançant mescles d'enzims comercials.
Un estudi més detallat de la distribució del senyal i la seva força d'unió va mostrar que els epítops d'unió eren més baixos en les fraccions de sucre amb alt DP (A, B, C, DP fins a 20+) que en les fraccions amb baix DP (D, E, F, DP) en dímers (Fig. 1). Els fragments àcids són més comuns en epítops no cel·lulosos que en fragments neutres. Aquests fenòmens són consistents amb el patró observat en el nostre estudi anterior, on els grups àcids i amb DP alt eren més resistents a la hidròlisi enzimàtica. Per tant, la presència d'epítops de glicans no cel·lulosos i les substitucions d'U i MeU poden contribuir en gran mesura a l'estabilitat dels oligosacàrids. Cal tenir en compte que l'eficiència d'unió i detecció pot ser problemàtica per als oligosacàrids amb baix DP, especialment si l'epítop és un oligosacàrid dimèric o trimèric. Això es pot provar utilitzant oligosacàrids comercials de diferents longituds, cadascun dels quals conté només un epítop que s'uneix a un anticorp monoclonal específic.
Així, l'ús d'anticossos específics d'estructura va revelar certs tipus d'enllaços recalcitrants. Depenent del tipus d'anticòs utilitzat, el patró de lligació adequat i la força del senyal que produeix (el més i el menys abundant), es poden identificar nous enzims i afegir-los semiquantitativament a la barreja enzimàtica per a una glicoconversió més completa. Prenent com a exemple l'anàlisi dels oligosacàrids ACSH, podem crear una base de dades d'enllaços glicànics per a cada material de biomassa. Cal destacar aquí que s'ha de tenir en compte la diferent afinitat dels anticossos, i si la seva afinitat és desconeguda, això crearà certes dificultats a l'hora de comparar els senyals de diferents anticossos. A més, la comparació d'enllaços glicànics pot funcionar millor entre mostres per al mateix anticòs. Aquests enllaços tossuts es poden vincular a la base de dades CAZyme, des de la qual podem identificar enzims, seleccionar enzims candidats i provar enzims que trenquen enllaços, o desenvolupar sistemes microbians per expressar aquests enzims per al seu ús en biorefineries44.
Per avaluar com els mètodes immunològics complementen mètodes alternatius per caracteritzar oligosacàrids de baix pes molecular presents en hidrolitzats lignocel·lulòsics, vam realitzar MALDI (Fig. 4, S1-S8) i una anàlisi de sacàrids derivats de TMS basada en GC-MS en el mateix panell (Fig. 5) d'oligosacàrids. MALDI s'utilitza per comparar si la distribució de massa de les molècules d'oligosacàrids coincideix amb l'estructura prevista. A la figura 4 es mostra la MC dels components neutres ACN-A i ACN-B. L'anàlisi ACN-A va confirmar una gamma de sucres pentoses que van des de DP 4-8 (Fig. 4) fins a DP 22 (Fig. S1), els pesos dels quals corresponen a oligosacàrids MeU-xilà. L'anàlisi ACN-B va confirmar la sèrie de pentoses i glucoxilà amb DP 8-15. En material complementari com la Figura S3, els mapes de distribució de massa de la fracció àcida FA-C mostren una gamma de sucres pentoses substituïts amb (Me)U amb un DP de 8-15 que són consistents amb els xilans substituïts que es troben en el cribratge d'anticòs monoclonals basat en ELISA. Els epítops són consistents.
Espectre MALDI-MS d'oligosacàrids solubles no conformes presents en ACS. Aquí, (A) fraccions de baix pes d'ACN-A que contenen oligosacàrids de glucuroxilà substituïts amb àcid urònic metilat (DP 4-8) i (B) oligosacàrids de xilà ACN-B i àcid urònic metilat substituïts amb glucuroxilà (DP 8-15).
Anàlisi de la composició del residu de glicà d'oligosacàrids refractaris. Aquí (A) Composició de sacàrids TMS de diverses fraccions d'oligosacàrids obtingudes mitjançant anàlisi GC-MS. (B) Estructures de diversos sucres derivats de TMS presents en oligosacàrids. ACN: fracció d'acetonitril que conté oligosacàrids neutres i FA: fracció d'àcid ferúlic que conté oligosacàrids àcids.
Una altra conclusió interessant es va extreure de l'anàlisi LC-MS de la fracció d'oligosacàrids, tal com es mostra a la Figura S9 (els mètodes es poden veure al material suplementari electrònic). Es van observar repetidament fragments de grups hexosa i -OAc durant la lligadura de la fracció ACN-B. Aquesta troballa no només confirma la fragmentació observada en l'anàlisi del glicoma i MALDI-TOF, sinó que també proporciona nova informació sobre possibles derivats de carbohidrats en la biomassa lignocel·lulòsica pretractada.
També vam analitzar la composició de sucres de la fracció d'oligosacàrids mitjançant la derivatització de sucres per TMS. Mitjançant GC-MS, vam determinar la composició dels sucres neuronals (no derivats) i àcids (GluA i GalA) a la fracció d'oligosacàrids (Fig. 5). L'àcid glucurònic es troba en els components àcids C i D, mentre que l'àcid galacturònic es troba en els components àcids A i B, tots dos components d'alt contingut en DP dels sucres àcids. Aquests resultats no només confirmen les nostres dades ELISA i MALDI, sinó que també són consistents amb els nostres estudis anteriors sobre l'acumulació d'oligosacàrids. Per tant, creiem que els mètodes immunològics moderns que utilitzen la biotinilació d'oligosacàrids i el posterior cribratge ELISA són suficients per detectar oligosacàrids recalcitrants solubles en diverses mostres biològiques.
Com que els mètodes de cribratge d'anticossos monoclonals basats en ELISA s'han validat mitjançant diversos mètodes diferents, vam voler explorar més a fons el potencial d'aquest nou mètode quantitatiu. Es van comprar i provar dos oligosacàrids comercials, l'oligosacàrid de xilohexasacàrid (XHE) i la 23-α-L-arabinofuranosil-xilotriosa (A2XX), utilitzant un nou enfocament d'anticossos monoclonals dirigit al glicà de la paret cel·lular. La figura 6 mostra una correlació lineal entre el senyal d'unió biotinilat i la concentració logarítmica de la concentració d'oligosacàrids, cosa que suggereix un possible model d'adsorció de Langmuir. Entre els anticorps monoclonals, CCRC-M137, CCRC-M138, CCRC-M147, CCRC-M148 i CCRC-M151 es van correlacionar amb XHE, i CCRC-M108, CCRC-M109 i LM11 es van correlacionar amb A2XX en un rang d'1 nm a 100 nano. A causa de la disponibilitat limitada d'anticossos durant l'experiment, es van realitzar experiments limitats amb cada concentració d'oligosacàrids. Cal destacar aquí que alguns anticossos reaccionen de manera molt diferent al mateix oligosacàrid com a substrat, presumiblement perquè s'uneixen a epítops lleugerament diferents i poden tenir afinitats d'unió molt diferents. Els mecanismes i les implicacions de la identificació precisa d'epítops seran molt més complexos quan el nou enfocament mAb s'apliqui a mostres reals.
Es van utilitzar dos oligosacàrids comercials per determinar el rang de detecció de diversos anticorps monoclonals dirigits a glicans. Aquí, les correlacions lineals amb la concentració logarítmica de la concentració d'oligosacàrids indiquen patrons d'adsorció de Langmuir per a (A) XHE amb anticorp monoclonal i (B) A2XX amb anticorp monoclonal. Els epítops corresponents indiquen les estructures dels oligosacàrids comercials utilitzats com a substrats en l'assaig.
L'ús d'anticossos monoclonals dirigits a glicans (anàlisi glicòmica o cribratge d'anticòs monoclonals basat en ELISA) és una eina potent per a la caracterització en profunditat de la majoria dels principals glicans de la paret cel·lular que componen la biomassa vegetal. Tanmateix, l'anàlisi clàssica de glicans només caracteritza els glicans més grans de la paret cel·lular, ja que la majoria dels oligosacàrids no s'immobilitzen eficaçment en plaques ELISA. En aquest estudi, la palla de blat de moro pretractada amb AFEX es va hidrolitzar enzimàticament amb un alt contingut de sòlids. L'anàlisi de sucres es va utilitzar per determinar la composició dels carbohidrats recalcitrants de la paret cel·lular a l'hidrolizat. Tanmateix, l'anàlisi d'anticòs monoclonals d'oligosacàrids més petits en hidrolizats s'infraestima i es necessiten eines addicionals per immobilitzar eficaçment els oligosacàrids a les plaques ELISA.
Aquí presentem un mètode nou i eficient d'immobilització d'oligosacàrids per al cribratge d'anticòs monoclonals combinant la biotinilació d'oligosacàrids seguida del cribratge ELISA en plaques recobertes de NeutrAvidin™. Els oligosacàrids biotinilats immobilitzats van mostrar una afinitat suficient per l'anticòs per permetre una detecció ràpida i eficient d'oligosacàrids recalcitrants. L'anàlisi de la composició d'aquests oligosacàrids tossuts basada en l'espectrometria de masses va confirmar els resultats d'aquest nou enfocament per a la immunocribratge. Així, aquests estudis demostren que la combinació de biotinilació d'oligosacàrids i cribratge ELISA amb anticossos monoclonals dirigits a glicans es pot utilitzar per detectar enllaços creuats en oligosacàrids i es pot aplicar àmpliament en altres estudis bioquímics que caracteritzen l'estructura dels oligosacàrids.
Aquest mètode de perfilat de glicans basat en biotina és el primer informe capaç d'investigar els enllaços de carbohidrats recalcitrants dels oligosacàrids solubles en la biomassa vegetal. Això ajuda a entendre per què algunes parts de la biomassa són tan tossudes quan es tracta de la producció de biocombustibles. Aquest mètode omple un buit important en els mètodes d'anàlisi de glicoma i estén la seva aplicació a una gamma més àmplia de substrats més enllà dels oligosacàrids vegetals. En el futur, podríem utilitzar la robòtica per a la biotinilació i utilitzar el mètode que hem desenvolupat per a l'anàlisi d'alt rendiment de mostres mitjançant ELISA.
La palla de blat de moro (CS) cultivada a partir de llavors híbrides Pioneer 33A14 es va collir el 2010 a Kramer Farms a Ray, Colorado. Amb el permís del propietari del terreny, aquesta biomassa es pot utilitzar per a la investigació. Les mostres es van emmagatzemar en bosses amb tancament hermètic a temperatura ambient, amb una humitat inferior al 6%. Les mostres es van emmagatzemar en bosses amb tancament hermètic a temperatura ambient, amb una humitat inferior al 6%. Образцы хранились сухими при влажности < 6% в пакетах с застежкой-молнией при комтности при комтности. Les mostres es van emmagatzemar en sec a una humitat inferior al 6% en bosses amb cremallera a temperatura ambient.样品在室温下以干燥< 6% 的水分储存在自封袋中。样品在室温下以干燥< 6% Образцы хранят в пакетах с застежкой-молнией при комнатной температуре с влажностью < 6%. Les mostres s'emmagatzemen en bosses amb tancament de cremallera a temperatura ambient amb una humitat < 6%.L'estudi va complir amb les directrius locals i nacionals. L'anàlisi de la composició es va dur a terme mitjançant el protocol NREL. Es va trobar que la composició contenia un 31,4% de glucà, un 18,7% de xilà, un 3,3% d'arabinan, un 1,2% de galactà, un 2,2% d'acetil, un 14,3% de lignina, un 1,7% de proteïnes i un 13,4% de cendres.
Cellic® CTec2 (138 mg de proteïna/ml, lot VCNI 0001) és una barreja complexa de cel·lulasa, β-glucosidasa i Cellic® HTec2 (157 mg de proteïna/ml, lot VHN00001) de Novozymes (Franklinton, NC, EUA)). Multifect Pectinase® (72 mg de proteïna/mL), una barreja complexa d'enzims degradants de pectina, va ser donada per DuPont Industrial Biosciences (Palo Alto, CA, EUA). Les concentracions de proteïnes enzimàtiques es van determinar estimant el contingut de proteïnes (i restant la contribució del nitrogen no proteic) mitjançant l'anàlisi de nitrogen Kjeldahl (mètode AOAC 2001.11, Dairy One Cooperative Inc., Ithaca, NY, EUA). La terra de diatomees 545 es va comprar a EMD Millipore (Billerica, MA). El carbó activat (DARCO, grànuls de 100 mesh), Avicel (PH-101), xilan de faig i tots els altres productes químics es van comprar a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
El pretractament amb AFEX es va dur a terme al GLBRC (Biomass Conversion Research Laboratory, MSU, Lansing, MI, EUA). El pretractament es va dur a terme a 140 °C durant 15 minuts. Un temps de residència de 46 a una proporció 1:1 d'amoníac anhidre a biomassa a una càrrega del 60% (p/p) en un reactor discontinu d'acer inoxidable (Parr Instruments Company). Va trigar 30 minuts. El reactor es va portar a 140 °C i l'amoníac es va alliberar ràpidament, permetent que la biomassa tornés ràpidament a la temperatura ambient. La composició de la palla de blat de moro pretractada amb AFEX (ACS) era similar a la de la palla de blat de moro sense tractar (UT-CS).
Es va preparar ACSH d'alt contingut en sòlids al 25% (p/p) (aproximadament un 8% de càrrega de dextran) com a material de partida per a la producció a gran escala d'oligosacàrids. La hidròlisi enzimàtica de l'ACS es va realitzar utilitzant una barreja d'enzims comercial que incloïa Cellic® Ctec2 10 mg de proteïna/g de glucà (en biomassa pretractada), Htec2 (Novozymes, Franklinton, NC), 5 mg de proteïna/g de glucà i Multifect Pectinase (Genencor Inc, EUA). ), 5 mg de proteïna/g de dextran. La hidròlisi enzimàtica es va dur a terme en un bioreactor de 5 litres amb un volum de treball de 3 litres, pH 4,8, 50 °C i 250 rpm. Després de la hidròlisi durant 96 hores, l'hidrolitzat es va recollir per centrifugació a 6000 rpm durant 30 minuts i després a 14000 rpm durant 30 minuts per eliminar els sòlids no hidrolitzats. L'hidrolitzat es va sotmetre a filtració estèril a través d'un vas de precipitats de 0,22 mm. L'hidrolitzat filtrat es va emmagatzemar en ampolles estèrils a 4 °C i després es va fraccionar sobre carbó.
Anàlisi de la composició de mostres de biomassa basades en extractes segons els procediments d'anàlisi de laboratori del NREL: preparació de mostres per a l'anàlisi de la composició (NREL/TP-510-42620) i determinació dels carbohidrats estructurals i la lignina en la biomassa (NREL/TP-510-42618)47.
L'anàlisi d'oligosacàrids del corrent d'hidrolitzat es va realitzar a una escala de 2 ml utilitzant un mètode d'hidròlisi àcida basat en autoclau. Barregeu la mostra d'hidrolitzat amb 69,7 µl d'àcid sulfúric al 72% en un tub de cultiu amb tap de rosca de 10 ml i incubeu durant 1 h en un taulell a 121 °C, refredeu-ho sobre gel i filtreu-ho en un vial de cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC). La concentració d'oligosacàrids es va determinar restant la concentració de monosacàrids a la mostra no hidrolitzada de la concentració total de sucre a la mostra hidrolitzada amb àcid.
Les concentracions de glucosa, xilosa i arabinosa a la biomassa hidrolitzada amb àcid es van analitzar mitjançant un sistema HPLC Shimadzu equipat amb un mostrejador automàtic, un escalfador de columna, una bomba isocràtica i un detector d'índex de refracció en una columna Bio-Rad Aminex HPX-87H. La columna es va mantenir a 50 °C i es va eluir amb 0,6 ml/min de H2SO4 5 mM en flux d'aigua.
El sobrenedant de l'hidrolitzat es va diluir i es va analitzar per al contingut de monòmers i oligosacàrids. Els sucres monomèrics obtinguts després de la hidròlisi enzimàtica es van analitzar mitjançant HPLC equipada amb una columna Bio-Rad (Hercules, CA) Aminex HPX-87P i una columna de protecció de cendres. La temperatura de la columna es va mantenir a 80 °C, i es va utilitzar aigua com a fase mòbil amb un cabal de 0,6 ml/min. Els oligosacàrids es van determinar mitjançant hidròlisi en àcid diluït a 121 °C segons els mètodes descrits a les refs. 41, 48, 49.
L'anàlisi de sacàrids es va realitzar en residus de biomassa crus, pretractats amb AFEX i tots els residus de biomassa no hidrolitzats (inclosa la producció d'extractes en sèrie de la paret cel·lular i el seu cribratge d'anticòs monoclonals) utilitzant procediments descrits anteriorment 27, 43, 50, 51. Per a l'anàlisi del glicoma, els residus insolubles en alcohol del material de la paret cel·lular vegetal es preparen a partir de residus de biomassa i se sotmeten a una extracció en sèrie amb reactius cada cop més agressius com ara oxalat d'amoni (50 mM), carbonat de sodi (50 mM i 0,5% p/v), CON. (1M i 4M, tots dos amb 1% p/v de borohidrur de sodi) i clorit àcid, tal com s'ha descrit anteriorment 52,53. Els extractes es van sotmetre a ELISA contra un panell complex de mAb50 dirigits al glicà de la paret cel·lular, i les reaccions d'unió a mAb es van presentar com un mapa de calor. Els mAb dirigits al glicà de la paret cel·lular vegetal es van comprar d'estocs de laboratori (sèries CCRC, JIM i MAC).
Biotinilació d'oligosacàrids en un sol pas. La conjugació d'hidrats de carboni amb biotina-LC-hidrazida es va dur a terme mitjançant el procediment següent. La biotina-LC-hidrazida (4,6 mg/12 μmol) es va dissoldre en dimetilsulfòxid (DMSO, 70 μl) mitjançant agitació vigorosa i escalfament a 65 °C durant 1 minut. Es va afegir àcid acètic glacial (30 µl) i la barreja es va abocar sobre cianoborohidrur de sodi (6,4 mg/100 µmol) i es va dissoldre completament després d'escalfar a 65 °C durant aproximadament 1 minut. A continuació, es van afegir de 5 a 8 μl de la barreja de reacció a l'oligosacàrid sec (1-100 nmol) per obtenir un excés molar de 10 vegades o més del marcador sobre l'extrem reductor. La reacció es va dur a terme a 65 °C durant 2 h, després de les quals les mostres es van purificar immediatament. No es va utilitzar cianoborohidrur de sodi en els experiments de marcatge sense reducció, i les mostres van reaccionar a 65 °C durant 2,5 hores.
Recobriment ELISA i rentat de mostres d'oligosacàrids biotinilats. Es van afegir 25 μl de mostres biotinilades (100 μl de cada mostra concentrada diluïda en 5 ml de solució tampó Tris 0,1 M (TBS)) a cada pou de la placa recoberta d'avidina. Els pous de control es van recobrir amb 50 μl de biotina a una concentració de 10 μg/ml en TBS 0,1 M. Es va utilitzar aigua desionitzada com a recobriment per a les mesures en blanc. El comprimit es va incubar durant 2 hores a temperatura ambient a les fosques. Rentar la placa 3 vegades amb llet desnatada al 0,1% en TBS 0,1 M utilitzant el programa núm. 11 per a Grenier flat 3A.
Addició i rentat dels anticossos primaris. Afegiu 40 µl d'anticòs primari a cada pou. Incubeu la microplaca durant 1 hora a temperatura ambient i a les fosques. A continuació, es van rentar les plaques 3 vegades amb llet al 0,1% en TBS 0,1M utilitzant el programa de rentat núm. 11 per a Grenier Flat 3A.
Afegiu l'anticòs secundari i renteu-lo. Afegiu 50 µl d'anticòs secundari de ratolí/rata (diluït 1:5000 en llet al 0,1% en TBS 0,1 M) a cada pou. Incubeu la microplaca durant 1 hora a temperatura ambient a les fosques. A continuació, es van rentar les microplaques 5 vegades amb llet al 0,1% en TBS 0,1 M utilitzant el programa de rentat de plaques Grenier Flat 5A núm. 12.
Afegir un substrat. Afegiu 50 µl de 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) al substrat base (afegint 2 gotes de tampó, 3 gotes de TMB, 2 gotes de peròxid d'hidrogen a 15 ml d'aigua desionitzada). Prepareu el substrat TMB i remeneu-lo amb el vòrtex abans d'utilitzar-lo). Incubeu la microplaca a temperatura ambient durant 30 minuts. A les fosques.
Completeu el pas i llegiu la pastilla. Afegiu 50 µl d'àcid sulfúric 1 N a cada pou i registreu l'absorbància de 450 a 655 nm utilitzant un lector ELISA.
Prepareu solucions d'1 mg/ml d'aquests analits en aigua desionitzada: arabinosa, ramnosa, fucosa, xilosa, àcid galacturònic (GalA), àcid glucurònic (GlcA), manosa, glucosa, galactosa, lactosa, N-acetilmannosamina (manNAc), N-acetilglucosamina (glcNAc), N-acetilgalactosamina (galNAc), inositol (estàndard intern). Es van preparar dos estàndards afegint les solucions de sucre d'1 mg/ml que es mostren a la Taula 1. Les mostres es congelen i es liofilitzen a -80 °C fins que s'elimina tota l'aigua (normalment unes 12-18 hores).
Afegiu de 100 a 500 µg de mostra a tubs amb tap de rosca en una balança analítica. Anoteu la quantitat afegida. El millor és dissoldre la mostra en una concentració específica de dissolvent i afegir-la al tub com a alíquota líquida. Utilitzeu 20 µl d'inositol d'1 mg/ml com a estàndard intern per a cada tub de mostra. La quantitat d'estàndard intern afegida a la mostra ha de ser la mateixa que la quantitat d'estàndard intern afegida al tub estàndard.
Afegiu 8 ml de metanol anhidre a un vial amb tap de rosca. A continuació, afegiu-hi 4 ml de solució metanòlica 3 N d'HCl, tapeu-lo i agiteu-lo. Aquest procés no utilitza aigua.
Afegiu 500 µl de solució de metanol HCl 1 M a les mostres d'oligosacàrids i als tubs TMS estàndard. Les mostres es van incubar durant la nit (168 hores) a 80 °C en un bloc tèrmic. Assequeu el producte de metanolisi a temperatura ambient utilitzant un col·lector d'assecat. Afegiu 200 µl de MeOH i assequeu de nou. Aquest procés es repeteix dues vegades. Afegiu 200 µl de metanol, 100 µl de piridina i 100 µl d'anhídrid acètic a la mostra i barregeu bé. Les mostres es van incubar a temperatura ambient durant 30 minuts i es van assecar. Afegiu 200 µl de metanol i assequeu de nou.
Afegiu 200 µl de Tri-Sil i escalfeu el tub tapat durant 20 minuts a 80 °C i després refredeu-lo a temperatura ambient. Utilitzeu un col·lector d'assecat per assecar encara més la mostra fins a un volum d'aproximadament 50 µl. És important tenir en compte que no vam deixar que les mostres s'assequessin completament.
Afegiu 2 ml d'hexà i barregeu bé amb vòrtex. Ompliu les puntes de les pipetes Pasteur (5-8 mm) amb un tros de llana de vidre inserint la llana de vidre a sobre d'una pipeta de 5-3/4 polzades de diàmetre. Les mostres es van centrifugar a 3000 g durant 2 minuts. Qualsevol residu insoluble es precipita. Assequeu la mostra a 100-150 µl. Es va injectar un volum d'aproximadament 1 μl al GC-MS a una temperatura inicial de 80 °C i un temps inicial de 2,0 minuts (Taula 2).