Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta alang sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka updated nga browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ipakita ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Ang human gut morphogenesis nagtukod sa crypt-villus features sa 3D epithelial microarchitecture ug spatial organization.Kini nga talagsaon nga istruktura gikinahanglan aron mamentinar ang gut homeostasis pinaagi sa pagpanalipod sa stem cell niche sa basal crypt gikan sa exogenous microbial antigens ug sa ilang mga metabolites. mucosal surface.Busa, ang pag-recreate sa 3D epithelial structures mahinungdanon alang sa pagtukod sa in vitro gut models.Notably, ang organic mimetic gut-on-a-chip makahimo sa pag-aghat sa spontaneous 3D morphogenesis sa intestinal epithelium nga adunay gipalambo nga physiological functions ug biomechanics. gut sa usa ka microfluidic chip ingon man usab sa usa ka Transwell embedded hybrid chip.Among gihulagway ang detalyadong mga pamaagi alang sa paggama sa device, pag-kultura sa Caco-2 o intestinal organoid epithelial cells sa conventional settings ingon man sa usa ka microfluidic platform, induction sa 3D morphogenesis, ug characterization sa natukod nga 3D epithelia gamit ang multiple imaging protocol nga nakab-ot ang mga pamaagi sa pag-andar sa gut. pagkontrol sa basolateral fluid flow alang sa 5 d.Ang among in vitro morphogenesis nga pamaagi naggamit sa physiologically relevant shear stress ug mechanical motion ug wala magkinahanglan og komplikadong cell engineering o manipulation, nga mahimong mas labaw pa sa uban nga kasamtangan nga mga teknik.Kami naghanduraw nga ang among gisugyot nga protocol mahimong adunay lapad nga implikasyon alang sa biomedical research community, nga naghatag og pamaagi sa pag-regenerate sa 3D intestinal epithelial, biomedical layer sa vitroutical ug biomedical layer. mga aplikasyon.
Gipakita sa mga eksperimento nga ang intestinal epithelial Caco-2 nga mga selula nga gi-kultura sa gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o bilayer microfluidic devices6,7 mahimong moagi sa spontaneous 3D morphogenesis in vitro nga walay klaro nga pagsabot sa nagpahiping mekanismo. epithelial morphogenesis in vitro, nga gipakita sa Caco-2 ug pasyente nga nakuha sa intestinal organoids. Ang mga selula sa epithelial gi-validate. Sa kini nga pagtuon, espesipikong gipunting namon ang produksiyon sa cell ug pag-apod-apod sa konsentrasyon sa usa ka kusgan nga Wnt antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), sa gut-on-a-chip ug gibag-o nga mga aparato nga microfluidic nga adunay sulud nga Transwell, gitawag nga "Hybrid Chip". frizzled-related nga protina 1, o Soggy-1) sa on-chip gut makapugong sa morphogenesis o makabalda sa prestructured 3D epithelial layer, nga nagsugyot nga ang antagonistic nga stress sa panahon sa kultura maoy responsable sa intestinal morphogenesis in vitro. pinaagi sa aktibong pag-flush (pananglitan, sa gut-on-a-chip o hybrid-on-a-chip nga mga plataporma) o pagsabwag .Basolateral media (pananglitan, gikan sa Transwell inserts ngadto sa dagkong basolateral reservoir sa mga atabay).
Sa kini nga protocol, naghatag kami usa ka detalyado nga pamaagi alang sa paghimo sa gut-on-a-chip microdevices ug Transwell-insertable hybrid chips (mga lakang 1-5) aron ikultura ang mga intestinal epithelial cells sa polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membranes (mga lakang 6A, 7A, 8, 9) o polyesterBs, 7 9) ug giaghat ang 3D morphogenesis in vitro (lakang 10). Gipaila usab namo ang mga bahin sa cellular ug molekula nga nagpaila sa histogenesis nga piho sa tisyu ug paglainlain sa selula nga nagsalig sa linya pinaagi sa pagpadapat sa daghang mga modalidad sa imaging (mga lakang 11-24) .Giaghat namo ang morphogenesis gamit ang human intestinal epithelial nga mga selula, o sa mga detalye sa teknikal nga mga epithelial nga bahin sa lawas sa tawo, o sa mga detalye sa Catinol nga bahin sa lawas. pagbag-o sa porous membranes, pagmugna sa 2D monolayers, ug intestinal biochemical ug Reproduction sa biomechanical microenvironment.in vitro.Aron maaghat ang 3D morphogenesis gikan sa 2D epithelial monolayers, gitangtang namo ang mga morphogen antagonist sa duha ka kultura nga porma pinaagi sa pag-agas sa medium ngadto sa basolateral nga kompartamento sa usa ka utility nga girepresentahan sa usa ka 3D regener sa kultura. epithelial layer nga magamit sa pagmodelo sa morphogen-dependent epithelial growth, longitudinal host-microbiome co-cultures, pathogen infection, inflammatory injury, epithelial barrier dysfunction, ug probiotic-based nga mga terapiya Example.influences.
Ang among protocol mahimong mapuslanon sa daghang mga siyentipiko sa sukaranan (pananglitan, intestinal mucosal biology, stem cell biology, ug developmental biology) ug gipadapat nga panukiduki (eg, preclinical drug testing, modeling sa sakit, tissue engineering, ug gastroenterology) kaylap nga epekto. mahimong ipakaylap ngadto sa mga tumatan-aw nga nagtuon sa dynamics sa cell signaling atol sa intestinal development, regeneration o homeostasis .Dugang pa, ang among protocol mapuslanon alang sa pagsukitsukit sa impeksyon ubos sa nagkalain-laing makatakod nga mga ahente sama sa Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhoae, Salmonella . Mapuslanon usab ang mga tumatan-aw sa pathology sa sakit ug pathogenesis.Ang paggamit sa on-chip gut microphysiology system mahimong magtugot sa longitudinal co-culture 10 ug sunod nga pag-assess sa host defense, immune responses ug pathogen-related injury repair sa gastrointestinal (GI) tract 11 .Ubang mga GI disorders nga may kalabutan sa leaky gut syndrome, celiac disease, Crohn's irritable, ulcerative nga sakit, Crohn's colitis, ulcerative bowel. Ang 3D intestinal epithelial layers giandam gamit ang 3D intestinal epithelial layers sa pasyente, kini nga mga sakit naglakip sa villous atrophy, crypt shortening, mucosal damage, o impaired epithelial barrier.Biopsy o stem cell-derived intestinal organoids12,13. pasyente nga peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), ngadto sa mga modelo nga adunay 3D intestinal villus-crypt microarchitectures. tissue-spesipiko nga immune cells, 5.
Tungod kay ang 3D epithelial microstructure mahimo nga ayohon ug mahanduraw nga wala ang proseso sa pag-section, ang mga tumatan-aw nga nagtrabaho sa spatial transcriptomics ug high-resolution o super-resolution imaging mahimong interesado sa among pagmapa sa spatiotemporal dynamics sa mga gene ug protina sa epithelial niches. Interesado sa teknolohiya.Pagtubag sa microbial o immune stimuli.Dugang pa, ang longhitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 nga nag-coordinate sa gut homeostasis mahimong maestablisar sa 3D intestinal mucosal layer pinaagi sa co-culturing sa nagkalain-laing microbial species, microbial community o fecal microbiota-ona-, ilabi na sa gut-gut. sa plataporma.Kini nga pamaagi labi ka madanihon sa mga tumatan-aw nga nagtuon sa mucosal immunology, gastroenterology, microbiome sa tawo, culturomics ug clinical microbiology nga nagtinguha sa pag-ugmad kaniadto nga wala'y kultura nga gut microbiota sa laboratoryo. ang protocol mahimo usab nga ipakaylap ngadto sa mga nag-develop sa pharmaceutical, biomedical O high-throughput screening o validation platforms para sa food industry.Isip usa ka pruweba-of-principle, bag-o lang namo gipakita ang posibilidad sa usa ka multiplex high-throughput morphogenesis system scalable ngadto sa 24-well plate format.Dugang pa, daghang organ-on-a-a-chip18 nga mga produkto ang gi-commercialized,18. ang atong in vitro morphogenesis nga pamaagi mahimong mapadali ug posibleng madawat sa daghang research laboratories, industriya o gobyerno ug regulatory agencies aron masabtan ang cellular reprogramming sa in vitro gut morphogenesis sa transcriptomic level aron masulayan ang mga droga o biotherapeutics Ang pagsuyup ug pagdala sa mga kandidato sa droga gisusi gamit ang 3D gut surrogates o paggamit sa custom-custom o commercial nga reprogutibility model. proseso sa morphogenesis.
Usa ka limitado nga gidaghanon sa mga modelo sa eksperimento nga may kalabotan sa tawo ang gigamit sa pagtuon sa intestinal epithelial morphogenesis, nag-una tungod sa kakulang sa implementable nga mga protocol aron maaghat ang 3D morphogenesis sa vitro. Sa tinuud, kadaghanan sa karon nga kahibalo bahin sa gut morphogenesis gibase sa mga pagtuon sa hayop (pananglitan, zebrafish20, mice21 o mga manok, mahimo’g gasto sa bisan unsang paagi). kwestyonable, ug labing importante, dili tukma nga pagtino sa tawhanong mga proseso sa kalamboan.Kini nga mga modelo limitado usab sa ilang abilidad nga masulayan sa usa ka multi-way scalable nga paagi.Busa, ang atong protocol alang sa pagbag-o sa 3D tissue structures in vitro outperforms in vivo animal models ingon man ang uban nga tradisyonal nga static 2D cell culture models. localization sa differentiated cells sa crypt-villus axis agig tubag sa nagkalain-laing mucosal o immune stimuli.3D epithelial layers makahatag ug luna sa pagtuon kon sa unsang paagi ang microbial cells makigkompetensya sa pagporma sa spatial niches ug ecological evolution agig tubag sa host factors (eg, inner versus outer mucus layers, secretion of IgA ug antimicrobial epithelial peptides, us 3. kon sa unsang paagi ang gut microbiota nagtukod sa iyang mga komunidad ug nag-synergistically og microbial metabolites (pananglitan, short-chain fatty acids) nga naghulma sa cellular organization ug stem cell niches sa basal crypts.Kini nga mga feature mapakita lamang kung ang 3D epithelial layers matukod sa vitro.
Dugang pa sa among pamaagi sa pagmugna og 3D intestinal epithelial structures, adunay ubay-ubay nga in vitro nga mga pamaagi.Ang intestinal organoid nga kultura usa ka state-of-the-art nga tissue engineering technique nga gibase sa kultibasyon sa intestinal stem cells ubos sa piho nga morphogen conditions23,24,25.Apan, ang paggamit sa 3D organoid nga mga modelo alang sa mga host-culture nga challenging kasagaran mao ang pag-analisa sa transport o collen. Ang intestinal lumen gilakip sa sulod sa organoid ug, busa, ang pagpaila sa mga luminal nga sangkap sama sa microbial cells o exogenous antigens limitado. Ang pag-access sa organoid lumens mahimong mapauswag gamit ang microinjector,26,27 apan kini nga pamaagi invasive ug labor-intensive ug nagkinahanglan og espesyal nga kahibalo sa pagbuhat.Dugang pa, ang tradisyonal nga organoid nga mga kultura nga gimintinar sa hydrogel scaffolds ubos sa static nga mga kondisyon dili tukma nga nagpakita sa aktibo sa vivo biomechanics.
Ang uban nga mga pamaagi nga gigamit sa daghang mga grupo sa panukiduki naggamit prestructured 3D hydrogel scaffolds aron masundog ang gut epithelial structure pinaagi sa pag-kultura sa nahilit nga mga selula sa intestinal sa tawo sa ibabaw sa gel. Paghimo ug hydrogel scaffolds gamit ang 3D-printed, micro-milled, o lithographically fabricated molds. morphogen gradients, pag-establisar og taas nga aspect ratio epithelial structure ug stroma-epithelial crosstalk pinaagi sa paglakip sa stromal cells sa scaffold.Apan, ang kinaiya sa prestructured scaffolds mahimong makapugong sa pagpakita sa spontaneous morphogenetic nga proseso mismo.Kini nga mga modelo wala usab maghatag ug dynamic nga luminal o interstitial fluid nga dagan sa shelogenesis, nga gikinahanglan sa interstitial fluid nga shelogenesis. ug makaangkon og physiological function.Usa pa ka bag-o nga pagtuon migamit sa hydrogel scaffolds sa usa ka microfluidic platform ug patterned intestinal epithelial structures gamit ang laser-etching techniques.Mouse intestinal organoids nagsunod sa etched patterns aron maporma ang intestinal tubular structures, ug intraluminal fluid flow mahimong recapitulated gamit ang microfluidics modules. mechanobiological movements.3D printing techniques from the same group was able to create miniature gut tubes with spontaneous morphogenetic process.Bisan pa sa komplikadong fabrication sa lain-laing gut segments sulod sa tube, kini nga modelo kulang usab sa luminal fluid flow ug mechanical deformation.Dugang pa, ang model operability mahimong limitado, ilabina human ang bioprinting nga proseso kompleto o ang atong mga kondisyon sa pag-eksperimento sa cellturbing. gut morphogenesis, physiologically related shear stress, biomechanics nga nagsundog sa gut motility, accessibility sa independente nga apical ug basolateral compartments, ug re-creation sa complex biological microenvironments of modularity.
Ang among protocol bug-os nga naka-focus sa 3D epithelial morphogenesis, nga adunay mga epithelial cells lamang sa kultura ug walay lain nga mga matang sa naglibot nga mga selula sama sa mesenchymal cells, endothelial cells, ug immune cells.Sama sa gihulagway kaniadto, ang kinauyokan sa among protocol mao ang induction sa epithelial morphogenesis pinaagi sa pagtangtang sa morphogen inhibitors nga gitago sa atong basolateral nga bahin sa robust nga bahin sa gipaila nga robusity. Ang gut-on-a-chip ug hybrid-on-a-chip nagtugot kanato sa paghimo pag-usab sa undulating 3D epithelial layer, dugang nga biological complexities sama sa epithelial-mesenchymal interactions33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 ug, sa atong modelo, crypt-villus features nga nagpahayag sa stem cell niches nga magpabilin sa basal blasts nga mga niches. ang mesenchyme adunay importante nga papel sa paghimo sa ECM nga mga protina ug regulasyon sa intestinal morphogenesis sa vivo35,37,38. Ang pagdugang sa mesenchymal cells sa atong modelo nagpalambo sa morphogenetic process ug cell attachment efficiency. microenvironment.Dugang pa, ang mga sangkap sa vasculature nga mahimong konektado tali sa mga modelo sa tisyu usa ka kinahanglanon kung ang mga modelo sa tisyu gidisenyo aron ipakita ang mga interaksyon sa multi-organ.Busa, ang mga endothelial nga mga selyula mahimo’g kinahanglan nga ilakip aron mamodelo ang labi ka tukma nga mga bahin sa pisyolohikal nga adunay resolusyon sa lebel sa organ.Ang mga selula sa resistensya nga nakuha sa pasyente hinungdanon usab alang sa pagpakita sa kinaiyanhon, mga tubag sa resistensya sa resistensya, ug antigen nga pagpresentar sa resistensya. imyunidad sa konteksto sa pagsundog sa sakit sa tinai.
Ang paggamit sa hybrid chips mas prangka kay sa gut-on-a-chip tungod kay ang setup sa device mas simple ug ang paggamit sa Transwell inserts nagtugot sa scalable nga kultura sa gut epithelium.Apan, ang komersiyal nga magamit nga Transwell inserts nga adunay polyester membranes dili elastic ug dili makasundog sa peristaltic-like movements. sa apical side.Klaro, ang static nga mga kabtangan sa apical compartment panagsa ra makapahimo sa long-term nga bacterial co-culture sa hybrid chips.Samtang mahimo natong lig-on nga maaghat ang 3D morphogenesis sa Transwell inserts kung mogamit ug hybrid chips, ang kakulang sa physiologically relevant biomechanics ug apical fluid flow mahimong limitahan ang posibilidad sa hybrid chips platforms.
Ang bug-os nga pag-rekonstruksyon sa human crypt-villus axis sa gut-on-a-chip ug hybrid-on-a-chip nga mga kultura wala pa hingpit nga natukod. Tungod kay ang morphogenesis nagsugod gikan sa usa ka epithelial monolayer, ang 3D microarchitectures dili kinahanglan nga maghatag og morphological nga pagkaparehas sa mga crypts sa vivo. Ang 3D epithelium, ang crypt ug villous nga mga rehiyon dili tin-aw nga gimarkahan. Bisan tuod ang mas taas nga mga kanal sa ibabaw sa chip mosangpot sa pagtaas sa gitas-on sa microengineered epithelium, ang maximum nga gitas-on limitado gihapon sa ~300-400 µm. gitas-on sa gamay nga intestinal villi mao ang ~600 µm41.
Gikan sa usa ka panglantaw sa imaging, in situ super-resolution imaging sa 3D microarchitectures mahimong limitado sa gut sa usa ka chip, tungod kay ang gikinahanglan nga pagtrabaho nga gilay-on gikan sa tumong lens ngadto sa epithelial layer anaa sa han-ay sa pipila ka milimetro. PDMS.Dugang pa, tungod kay ang layer-by-layer microfabrication sa gut sa usa ka chip naglakip sa permanente nga adhesion sa taliwala sa matag layer, kini mao ang hilabihan mahagiton sa pag-abli o sa pagtangtang sa ibabaw nga layer sa pagsusi sa ibabaw nga gambalay sa epithelial layer.Pananglitan, pinaagi sa paggamit sa scanning electron mikroskopyo (SEM).
Ang hydrophobicity sa PDMS nahimong usa ka limiting factor sa microfluidic-based nga mga pagtuon nga naghisgot sa hydrophobic nga gagmay nga mga molekula, tungod kay ang PDMS mahimo nga nonspecifically adsorb sa maong hydrophobic molecules. Ang mga alternatibo sa PDMS mahimong isipon uban sa ubang polymeric nga mga materyales. pagpakunhod sa adsorption sa hydrophobic molekula.
Sa katapusan, ang among pamaagi dili maayo nga gihulagway sa mga termino sa paghatag sa usa ka high-throughput screening o "usa ka gidak-on-angay-tanan" user-friendly nga eksperimento nga plataporma. Ang kasamtangan nga protocol nagkinahanglan og usa ka syringe pump matag microdevice, nga nagkinahanglan og luna sa usa ka CO2 incubator ug magpugong sa dinagkong mga eksperimento. Kini nga limitasyon mahimong mapauswag pag-ayo pinaagi sa scalability sa innovative, 92 formats (maayo, 92 formats) 384-well porous inserts nga nagtugot sa padayon nga pagpuno ug pagtangtang sa basolateral media).
Aron maaghat ang 3D morphogenesis sa human intestinal epithelium in vitro, migamit kami ug microfluidic chip intestinal device nga adunay duha ka parallel microchannels ug usa ka elastic porous membrane sa tunga aron makamugna ug lumen-capillary interface.Gipakita usab namo ang paggamit sa usa ka single-channel microfluidic device (usa ka hybrid chip) nga naghatag ug padayon nga basolarized nga epithel sa ubos sa powell layer. plataporma, morphogenesis sa lain-laing mga tawo intestinal epithelial mga selula mahimong gipakita pinaagi sa paggamit sa direksyon manipulasyon sa dagan sa pagtangtang morphogen antagonists gikan sa basolateral compartment.Ang tibuok nga eksperimento nga pamaagi (Figure 1) naglangkob sa lima ka bahin: (i) microfabrication sa gut chip o Transwell insertable hybrid chip (mga lakang 1-5; Box test epidemya sa pag-andam sa mga selula sa 1-5; (Caco-2 cells) o mga organo sa tinai sa tawo; kahon 2-5), (iii) kultura sa intestinal epithelial cells sa intestinal chips o hybrid chips (mga lakang 6-9), (iv) induction sa 3D morphogenesis in vitro (step 10) ug (v) ) aron mailhan ang 3D epithelial microstructure (mga lakang 11-24). vitro morphogenesis pinaagi sa pagtandi sa epithelial morphogenesis ngadto sa spatial, temporal, conditional, o procedural nga mga kontrol.
Gigamit namo ang duha ka lain-laing plataporma sa kultura: gut-on-a-chip nga adunay tul-id nga mga kanal o nonlinear convoluted channels, o hybrid chips nga adunay Transwell (TW) inserts sa usa ka microfluidic device, nga gigama sama sa gihulagway sa Box 1, ug step 1 -5. human intestinal organoids) ug pamaagi sa kultura nga gigamit niini nga protocol."In vitro morphogenesis" nagpakita sa kinatibuk-ang mga lakang diin ang Caco-2 o organoid-derived epithelial cells gikulata sa intestinal chip o sa Transwell inserts sa hybrid chip, gisundan sa induction sa 3D morphogenesis ug ang pagporma sa usa ka characterized nga epithelial nga estraktura. Ang intestinal epithelial layers mahimong gamiton, pananglitan, sa cell differentiation characterization, gut physiology studies, pagtukod sa host-microbiome ecosystems, ug pagmodelo sa sakit. Immunofluorescence nga mga hulagway sa "Cell Differentiation" nga nagpakita sa nuclei, F-actin ug MUC2 nga gipahayag sa 3D Caco-2 nga signal nga gipahayag sa 3D Caco-2 e nga gipahayag sa gut signal sa gut signal. goblet cells ug mucus nga gitago gikan sa mucosal surfaces. Ang fluorescent nga mga hulagway sa Gut Physiology nagpakita sa mucus nga gihimo pinaagi sa pagmantsa alang sa sialic acid ug N-acetylglucosamine residues gamit ang fluorescent wheat germ agglutinin. coli nga nagpahayag sa green fluorescent protein (GFP) uban sa microengineered 3D Caco-2 epithelial cells. Ang tuo nga panel nagpakita sa localization sa GFP E. coli co-cultured uban sa 3D Caco-2 epithelial cells, gisundan sa immunofluorescence staining uban sa F-actin (pula) ug nuclei (asul). nga adunay bacterial antigens (eg, lipopolysaccharide, LPS) ug immune cells (eg, PBMC; green) .Caco-2 nga mga selula gi-culture aron magtukod og 3D epithelial layer.Scale bar, 50 µm.Mga hulagway sa ubos nga laray: "Paglainlain sa mga selula" nga gipahaum uban sa pagtugot gikan sa reference.2. Oxford University Press; Giprodyus uban ang pagtugot gikan sa Ref.5. NAS; "Host-Microbe Co-Culture" nga gipahiangay uban ang pagtugot gikan sa ref.3. NAS; "Pagmodelo sa Sakit" nga gipahiangay nga adunay pagtugot gikan sa pakisayran.5. NAS.
Ang duha ka gut-on-chip ug hybrid chips gigama gamit ang PDMS replicas nga gi-demold gikan sa silicon molds pinaagi sa soft lithography1,44 ug gi-pattern sa SU-8.Ang disenyo sa microchannels sa matag chip gitino pinaagi sa pagkonsiderar sa hydrodynamics sama sa shear stress ug hydrodynamic pressure1,4,12. gi-juxtaposed parallel straight microchannels, nahimong usa ka komplikadong gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) nga naglakip sa usa ka parisan sa curved microchannels aron maaghat ang Dugang nga fluid residence time, nonlinear flow patterns, ug multiaxial deformation sa cultured cells (Fig. 2a–fhenchanics) 12 kinahanglan nga mas komplikado nga biomechanics. Ang gut-on-a-chips mahimong mapili.Among gipakita nga ang convoluted Gut-Chip kusganon usab nga nag-aghat sa 3D morphogenesis sa susamang time frame nga adunay susama nga ang-ang sa epithelial growth kumpara sa orihinal nga Gut-Chip, bisan unsa pa ang kultura nga cell type.Busa, aron maaghat ang 3D morphogenesis, linear ug complex nga mga disenyo nga on-chip moplicas nga interchanged moPD nga adunay mga interchanged nga moplicas. Ang SU-8 nga mga sumbanan naghatag og negatibo nga mga bahin human sa pag-demolding (Fig. 2a).Aron paghimo sa gut sa usa ka chip, ang giandam nga ibabaw nga layer sa PDMS sunod-sunod nga gibugkos ngadto sa usa ka porous nga PDMS nga pelikula ug dayon gipahiangay sa ubos nga PDMS layer pinaagi sa dili mausab nga bonding gamit ang corona treater (Fig. 2b-f). nga maka-accommodate sa Transwell inserts (Fig. 2h ug Extended Data Fig. 2). Ang proseso sa bonding gihimo pinaagi sa pagtambal sa mga ibabaw sa PDMS replica ug bildo nga adunay oxygen plasma o corona treatment.Human sa sterilization sa microfabricated device nga gilakip sa silicone tube, ang device setup andam na sa paghimo sa 3D morphogenesis epithelium2g intestinag).
a, Ilustrasyon sa eskematiko sa pag-andam sa mga bahin sa PDMS gikan sa SU-8 patterned silicon molds.Ang uncured PDMS solution gibubo ngadto sa silicon mold (wala), giayo sa 60 °C (tunga-tunga) ug demolded (tuo).Ang demolded PDMS giputol sa mga piraso ug gilimpyohan alang sa dugang nga paggamit.b, Litrato sa silicon PDMS nga agup-op nga gigamit sa pag-andam sa silicon PDMS nga agup-op nga gigamit sa pag-andam. paghimo sa PDMS porous membrane.d, Usa ka serye sa mga litrato sa ibabaw ug ubos nga mga sangkap sa PDMS ug ang gitigum nga on-chip intestinal device.e, Schematic sa pag-align sa ibabaw, lamad, ug ubos nga mga sangkap sa PDMS.Ang matag layer dili na mabalik nga gigapos sa plasma o corona treatment.f, Schematic of the fabricated gut-on-a-a-channel device chambers.g, Setup sa gut-on-a-chip para sa microfluidic cell culture.Ang hinimo nga gut sa usa ka chip nga gitigom sa usa ka silicone tube ug syringe gibutang sa usa ka coverslip.Ang chip device gibutang sa taklob sa usa ka 150 mm Petri dish para sa pagproseso.Ang binder gigamit sa pagsira sa silicone tube.h, Visual nga giandam nga snapshots sa 3D hybrids chipmorphs nga giandam nga independente. sa kultura 2D monolayers sa intestinal epithelial mga selula gisal-ut ngadto sa hybrid chip sa intestinal 3D morphogenesis.Ang medium mao ang perfused pinaagi sa microchannels sa ilalum sa cell layer nga gitukod sa Transwell insert.Scale bar, 1 cm.h Reprinted uban sa pagtugot gikan sa reference.4. Elsevier.
Niini nga protocol, ang Caco-2 cell line ug intestinal organoids gigamit isip epithelial sources (Fig. 3a) . 10 ug 50) sa T-flasks giani aron sa pag-andam sa dissociated cell suspensions pinaagi sa trypsinization fluid (kahon 2). Human intestinal organoids gikan sa intestinal biopsies o surgical resections gi-culture sa Matrigel scaffold domes sa 24-well plates aron pagsuporta sa structural microenviringment. R-spondin, ug Noggin) ug mga growth factor nga giandam sama sa gihulagway sa Kahon 3 gidugangan kada adlaw hangtod nga ang mga organoids motubo ngadto sa ~500 µm ang diyametro. Ang bug-os nga mitubo nga mga organoids giani ug gibahin ngadto sa mga single cell para sa pagpugas ngadto sa gut o Transwell inserts sa usa ka chip (Kahon 5). colitis, Crohn's disease, colorectal cancer, o normal nga donor), lesion site (eg, lesion versus non-lesioned area) ug gastrointestinal nga lokasyon sa tract (eg, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, o rectum).Naghatag kami og usa ka optimized nga protocol sa Kahon 5 alang sa pag-kultura sa colonic organoids (coloidsgens mas taas nga konsentrasyon) mga organo.
a, Workflow para sa induction sa gut morphogenesis sa gut chip.Caco-2 human intestinal epithelium ug intestinal organoids gigamit niini nga protocol aron ipakita ang 3D morphogenesis.Ang nahilit nga epithelial cells gipugas sa giandam nga gut-on-a-chip device (chip preparation) . (D0), apical (AP) nga agos gisugdan ug gipadayon sa unang 2 ka adlaw (pag-agos, AP, D0-D2). Basolateral (BL) nga agos gisugdan usab uban sa cyclic stretching motions (stretch, flow, AP ug BL) sa diha nga ang usa ka kompleto nga 2D monolayer naporma. Intestinal 3D morphhaogenesis nga mga hulagway nahitabo sa mga microphogenesis nga 3D nga mga adlaw nga spontaneously human sa 5 nga contraidic nga kultura. representante nga morphology sa Caco-2 cells sa matag eksperimento nga lakang o time point (bar graph, 100 µm).Upat ka schematic diagrams nga naghulagway sa katugbang nga cascades sa gut morphogenesis (ibabaw sa tuo). (puti nga dashed box) nagpakita sa nabag-o nga microvilli sa 3D Caco-2 layer (tuo).c, Horizontal frontal view sa natukod nga Caco-2 3D, claudin (ZO-1, pula) ug padayon nga brush border lamad nga gimarkahan F-actin (berde) ug nuclei (asul) Immunofluorescence confocal cell visualization sa epithell point sa tunga-tunga nga chips visualization sa epithell chip ipakita ang lokasyon sa focal plane alang sa matag confocal view.d, Panahon sa kurso sa morphological nga mga pagbag-o sa mga organoid nga gikulata sa usa ka chip nga nakuha pinaagi sa phase contrast microscopy sa mga adlaw nga 3, 7, 9, 11, ug 13. Ang inset (ibabaw sa tuo) nagpakita sa taas nga pagpadako sa gihatag nga imahe.e, DIC photomicrograph sa organoid slice 3D epithelium nga natukod sa adlaw nga gutthelium. immunofluorescence nga mga hulagway nga nagpakita sa mga marker alang sa stem cells (LGR5; magenta), goblet cells (MUC2; green), F-actin (grey) ug nuclei (cyan) nga gipatubo sa gut chips sulod sa 3 ka adlaw, matag usa (Left) ug 13-day (tunga-tunga) nga mga organoids sa epithelial layer.Tan-awa usab ang Extended LGR5 Data Figure. signaling.Fluorescence images nga nagpakita sa epithelial microstructure (tuo) sa 3D organoid epithelium nga naestablisar sa gut sa usa ka chip pinaagi sa pagmantsa sa plasma membrane sa CellMask dye (tuo) sa adlaw nga 13 sa kultura.Scale bar mao ang 50 μm gawas kon ipahayag.b Gi-reprint nga may pagtugot gikan sa reference.2. Oxford University Press; c Gipahiangay uban sa pagtugot gikan sa Reference.2. Oxford University Press; e ug f gipahiangay uban sa pagtugot pinaagi sa pakisayran.12 Ubos sa Creative Commons License CC BY 4.0.
Sa gut sa usa ka chip, gikinahanglan nga usbon ang hydrophobic nga nawong sa porous membrane sa PDMS alang sa malampuson nga ECM coating. Sa kini nga protocol, gigamit namon ang duha ka lainlaing mga pamaagi aron mabag-o ang hydrophobicity sa mga lamad sa PDMS. lamad.Bisan pa, ang microfluidic nga kultura sa organoid epithelium nanginahanglan chemical-based surface functionalization aron makab-ot ang episyente nga pagdeposito sa ECM proteins pinaagi sa sunud-sunod nga paggamit sa polyethyleneimine (PEI) ug glutaraldehyde sa PDMS microchannels.Pagkahuman sa pagbag-o sa nawong, ang mga protina sa ECM gideposito aron matabonan ang functionalized nga PDMS epilium sa ibabaw ug dayon gipaila ang organo sa epilium. gilakip, ang microfluidic cell kultura magsugod pinaagi sa perfusing lamang sa medium ngadto sa ibabaw nga microchannel hangtud nga ang mga selula maporma sa usa ka bug-os nga monolayer, samtang ang ubos nga microchannel nagmintinar static nga mga kondisyon.Kini nga optimized nga pamaagi alang sa nawong pagpaaktibo ug ECM sapaw makapahimo sa attachment sa organoid epithelium sa pagduso 3D morphogenesis sa PDMS nawong.
Ang mga kultura sa Transwell nagkinahanglan usab ug ECM coating sa wala pa ang cell seeding; bisan pa, ang mga kultura sa Transwell wala magkinahanglan og komplikado nga mga lakang sa pretreatment aron ma-aktibo ang nawong sa mga porous nga pagsal-ot.Alang sa pagtubo sa Caco-2 nga mga selula sa mga pagsal-ot sa Transwell, ang ECM coating sa porous nga mga pagsal-ot nagpadali sa pagdugtong sa mga dissociated nga Caco-2 nga mga selula (<1 ka oras) ug hugot nga junction barrier formation (<1-2 ka adlaw). Ang mga pagsal-ot nga adunay sapaw sa ECM, nga gilakip sa ibabaw sa lamad (<3 h) ug gipadayon hangtud nga ang mga organoids maporma nga usa ka kompleto nga monolayer nga adunay barrier integrity .Ang mga kultura sa Transwell gihimo sa 24-well plate nga walay paggamit sa hybrid chips.
Ang in vitro 3D morphogenesis mahimong masugdan pinaagi sa pagpadapat sa fluid flow ngadto sa basolateral nga aspeto sa usa ka natukod nga epithelial layer.Sa gut sa usa ka chip, ang epithelial morphogenesis nagsugod sa diha nga ang medium nga perfused ngadto sa ibabaw ug sa ubos nga microchannels (Fig. 3a) inhibitors.Aron makahatag og igong sustansya ug serum sa mga selula nga gigapos sa porous nga mga lamad ug makamugna og luminal shear stress, kasagaran atong i-apply ang dual flow sa gut sa usa ka chip.Sa hybrid chips, ang Transwell inserts nga adunay epithelial monolayers gisulod sa hybrid chips.Dayon, ang medium gipadapat sa ilawom sa basolateral nga bahin sa porous Transwell insert nga mga adlaw human sa microchannel3ti morph nga pagsal-ot sa mga adlaw sa microchannel. basolateral nga pag-agos sa duha ka plataporma sa kultura.
Ang morphological features sa microengineered 3D epithelial layers mahimong analisahon pinaagi sa paggamit sa nagkalain-laing imaging modalities, lakip na ang phase contrast microscopy, differential interference contrast (DIC) microscopy, SEM, o immunofluorescence confocal microscopy (Figures 3 ug 4) . lut-od.Tungod sa optical transparency sa PDMS ug polyester nga mga pelikula, ang gut-on-a-chip ug hybrid chip nga mga plataporma makahatag og real-time in situ imaging nga wala kinahanglana ang sectioning o disassembly sa device.Sa diha nga nagpahigayon sa immunofluorescence imaging (Figures 1, 3c, f ug 4b, c), ang mga selula kay paratypically fixed (paratypically fixed) (PFA), gisundan sa Triton X-100 ug 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), sa han-ay.Depende sa tipo sa selula, lain-laing fixatives, permeabilizers, ug blocking agents mahimong gamiton.Primary antibodies nga nagpunting sa lineage-dependent cell o rehiyon marker gigamit sa pag-highlight sa mga selyula nga dili mapalihok sa lugar nga gisundan sa mga antibody nga gisundan sa usa ka sekundaryong nukleyar sa chip, (pananglitan, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) o F-actin (eg, fluorescently nga gimarkahan nga phalloidin). co-culture") , ang recruitment sa immune cells (Fig. 1, 'Disease Modeling') o ang contours sa 3D epithelial morphology (Fig. 3c,f ug 4b,c) .Sa diha nga ang pag-usab sa gut sa chip aron sa pagbulag sa ibabaw nga layer gikan sa ubos nga microchannel layer, ingon sa gihulagway sa ref.Sama sa gipakita sa Fig3D emorphology. ang apical brush border mahimong makita sa SEM (Fig. 3b).
a, Workflow para sa induction sa intestinal morphogenesis sa hybrid chip.Caco-2 ug intestinal organoids gigamit niini nga protocol aron ipakita ang 3D morphogenesis sa hybrid chip platform.Dissociated epithelial cells ang gisabod sa giandam nga Transwell inserts (TW prep; tan-awa ang numero sa ubos).Sa dihang ang mga selula gisabod (seededed) ug gilakip sa tanang mga cell sa Transwell, gilakip sa tanang mga selula sa Transwell. kondisyon (kultura sa TW).Pagkahuman sa 7 ka adlaw, usa ka Transwell insert nga adunay sulod nga 2D monolayer sa mga epithelial cells ang gi-integrate ngadto sa hybrid chip aron ipaila ang basolateral flow (Flow, BL), nga sa kataposan mitultol sa pagmugna og 3D epithelial layer (morphogenesis). eksperimento nga lakang o punto sa oras.Ang mga eskema sa ibabaw nga mga lut-od nag-ilustrar sa eksperimento nga configuration alang sa matag lakang.b, Hybrid chips (wala nga eskematiko) mahimong mosangpot sa 3D morphogenesis sa organoid epithelial cells nga adunay top-down nga confocal microscopy nga mga panglantaw nga gikuha sa lain-laing mga posisyon sa Z (ibabaw, tunga-tunga, ug ubos; tan-awa ang tuo nga eskematiko ug katugbang nga mga linya sa tuldok). nagpakita sa dayag nga morphological nga mga kinaiya.F-actin (cyan), nucleus (grey).c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) sa organoid-derived epithelial cells nga gi-culture sa static nga Transwell (TW; inset sulod sa puti nga dashed box) versus hybrid chip (labing dako nga full shot) nga nagtandi sa 2D versus 3D nga taas nga morphology. tuo nga suok; “XZ”) nagpakita usab sa 2D ug 3D nga mga bahin.Scale bar, 100 µm.c Gi-print pag-usab nga adunay pagtugot gikan sa reference.4. Elsevier.
Ang mga kontrol mahimong andamon pinaagi sa pag-kultura sa parehas nga mga selula (Caco-2 o intestinal organoid epithelial cells) ngadto sa duha ka dimensyon nga monolayer ubos sa conventional static nga kondisyon sa kultura. itandi.
Ang proseso sa humok nga lithography kinahanglan nga himuon sa usa ka limpyo nga kwarto. Alang sa matag layer sa chip (ibabaw ug ubos nga mga sapaw ug mga lamad) ug hybrid chips, lain-laing mga photomasks ang gigamit ug gihimo sa separado nga mga wafer sa silicon tungod kay ang mga gitas-on sa microchannels lahi. Ang target nga gitas-on sa ibabaw ug ubos nga microchannel sa gut sa chip mao ang 500 µm. 200 µm.
Ibutang ang usa ka 3-pulgada nga silicon nga wafer sa usa ka pinggan nga adunay acetone. Hinay-hinay nga swirl ang plato sulod sa 30 segundos, dayon pauga sa hangin ang wafer. Ibalhin ang wafer ngadto sa usa ka plato nga adunay IPA, dayon tuyok ang plato sulod sa 30 s aron malimpyo.
Usa ka solusyon sa piranha (mixture sa hydrogen peroxide ug concentrated sulfuric acid, 1:3 (vol/vol)) mahimong opsyonal nga gamiton aron mapadako ang pagtangtang sa mga organikong residue gikan sa silicon wafer surface.
Ang solusyon sa Piranha hilabihan ka makadaot ug makamugna og kainit.Kinahanglan ang dugang nga pag-amping sa kahilwasan.Alang sa paglabay sa basura, tugoti ang solusyon nga mobugnaw ug ibalhin ngadto sa limpyo, uga nga sudlanan sa basura.Gamit ang mga sekondaryang sudlanan ug husto ang label sa mga sudlanan sa basura.Palihug sunda ang mga sumbanan sa kaluwasan sa pasilidad alang sa mas detalyado nga mga pamaagi.
I-dehydrate ang mga wafer pinaagi sa pagbutang niini sa usa ka 200 °C nga init nga plato sulod sa 10 min. Human sa dehydration, ang wafer giuyog lima ka beses sa hangin aron mabugnaw.
Ibubo ang ~10 g sa photoresist SU-8 2100 ngadto sa sentro sa gilimpyohan nga silicon nga wafer.Gamit ang mga sipit aron parehas nga ipakaylap ang photoresist sa wafer. Usahay ibutang ang wafer sa usa ka 65°C nga hot plate aron ang photoresist dili kaayo sticky ug mas sayon ​​nga ipakatap.Ayaw ibutang ang wafer direkta sa hot plate.
Ang SU-8 parehas nga giapod-apod sa wafer pinaagi sa pagpadagan sa spin coating. Programa ang umaabot nga rotation sa SU-8 sulod sa 5-10 s aron mokaylap sa 500 rpm sa acceleration nga 100 rpm/s. I-set ang main spin para sa 200 µm nga gibag-on nga patterning sa 1,500 rpm 50 (mak acceleration) µm gitas-on alang sa ibabaw nga layer sa gut sa chip; tan-awa ang "Kritikal nga mga lakang" sa ubos) gibutang sa usa ka acceleration sa 300 rpm/s 30 segundos sa 1,200 rpm.
Ang nag-unang katulin sa pagtuyok mahimong ipasibo sumala sa gibag-on sa target sa SU-8 nga pattern sa silicon wafer.
Sa paghimo sa SU-8 nga mga pattern sa 500 µm nga gitas-on alang sa ibabaw nga layer sa gut sa chip, ang spin coating ug soft bake nga mga lakang niini nga Kahon (mga lakang 7 ug 8) sunod-sunod nga gisubli (tan-awa ang lakang 9) aron makahimo og duha ka mga layer nga 250 µm Usa ka baga nga layer sa SU-8, nga mahimong layered ug dugtongan sa 10 µm nga kahon sa exposure sa UV. taas.
Hinay-hinay nga pagluto sa SU-8 nga adunay sapaw nga mga wafer pinaagi sa maampingong pagbutang sa mga wafer sa usa ka mainit nga plato sa 65 °C sulod sa 5 min, dayon ibalhin ang setting ngadto sa 95 °C ug i-incubate sa dugang nga 40 min.
Aron makab-ot ang 500 μm nga gitas-on sa SU-8 nga sumbanan sa ibabaw nga microchannel, balika ang mga lakang 7 ug 8 aron makamugna og duha ka 250 μm nga baga nga SU-8 nga mga layer.
Gamit ang UV Mask Aligner, paghimo ug lamp test sumala sa instruksyon sa tiggama aron kuwentahon ang oras sa pagkaladlad sa wafer.(oras sa pagkaladlad, ms) = (dosis sa pagkaladlad, mJ/cm2)/(gahom sa lampara, mW/cm2).
Human matino ang oras sa pagkaladlad, ibutang ang photomask sa mask holder sa UV mask aligner ug ibutang ang photomask sa SU-8 coated wafer.
Ibutang ang giimprinta nga nawong sa photomask direkta sa SU-8 nga adunay sapaw nga kilid sa silicon wafer aron mamenosan ang pagkatibulaag sa UV.
Ibutyag ang SU-8 nga adunay sapaw nga wafer ug photomask nga patayo sa 260 mJ/cm2 sa UV nga kahayag alang sa gitakda nang daan nga oras sa pagkaladlad (tan-awa ang lakang 10 niini nga kahon).
Human sa UV exposure, ang SU-8-coated silicon wafers giluto sa 65 ° C alang sa 5 min ug 95 ° C alang sa 15 min sa matag init nga plato aron makahimo og mga pattern nga adunay gitas-on nga 200 μm. I-extend ang post-bake nga oras sa 95 ° C ngadto sa 30 min sa paghimo og mga pattern nga adunay gitas-on nga 500 μm.
Ang developer gibubo sa usa ka baso nga pinggan, ug ang linuto nga wafer gibutang sa pinggan.Ang gidaghanon sa SU-8 developer mahimong magkalainlain depende sa gidak-on sa bildo nga plato.Siguruha nga mogamit ug igo nga SU-8 developer aron hingpit nga matangtang ang wala mahayag nga SU-8.Pananglitan, kung mogamit usa ka 150 mm diameter nga baso nga pinggan nga adunay kapasidad nga 1 L, gamita ang ~300 mL sa 5 ka minuto nga rotation.
Hugasi ang naugmad nga agup-op nga adunay ~10 mL nga bag-ong developer nga gisundan sa IPA pinaagi sa pag-spray sa solusyon gamit ang pipette.
Ibutang ang wafer sa plasma cleaner ug i-expose sa oxygen plasma (atmospheric gas, target pressure 1 × 10−5 Torr, power 125 W) sulod sa 1.5 min.
Ibutang ang wafer sa usa ka vacuum desiccator nga adunay glass slide sa sulod. Ang mga wafer ug mga slide mahimong ibutang sa kilid.Kon ang vacuum desiccator gibahin ngadto sa pipila ka mga layer pinaagi sa usa ka plato, ibutang ang mga slide sa ubos nga lawak ug ang mga wafer sa ibabaw nga lawak.Ihulog ang 100 μL nga trichloro(1H, 1H, 2H, 2H, 2H, 2H) nga solusyon sa slide vacuum alang sa silanization.
Ibubo ang usa ka panaksan sa frozen nga Caco-2 nga mga selula sa usa ka 37 °C nga kaligoanan sa tubig, dayon ibalhin ang natunaw nga mga selula ngadto sa usa ka T75 flask nga adunay sulod nga 15 mL nga 37 °C nga prewarmed Caco-2 medium.
Aron mapasa ang mga selula sa Caco-2 sa ~90% nga panagtapok, una nga init ang Caco-2 medium, PBS, ug 0.25% trypsin/1 mM EDTA sa usa ka 37°C nga kaligoanan sa tubig.
Aspirate ang medium pinaagi sa vacuum aspiration. Hugasi ang mga cell kaduha gamit ang 5 mL nga mainit nga PBS pinaagi sa pagsubli sa vacuum aspiration ug pagdugang og presko nga PBS.