Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta alang sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka updated nga browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ipakita ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Ang human gut morphogenesis nagtukod sa crypt-villus nga mga bahin sa 3D epithelial microarchitecture ug spatial nga organisasyon.Kini nga talagsaon nga istruktura gikinahanglan aron sa pagpadayon sa gut homeostasis pinaagi sa pagpanalipod sa stem cell niche sa basal crypt gikan sa exogenous microbial antigens ug sa ilang mga metabolites. mineral, ang paghimo pag-usab sa 3D epithelial nga mga istruktura hinungdanon alang sa pagtukod sa mga in vitro gut nga mga modelo. Labi na, ang organikong mimetic gut-on-a-chip mahimong mag-aghat sa kusog nga 3D morphogenesis sa intestinal epithelium nga adunay gipauswag nga physiological function ug biomechanics. Dinhi, naghatag kami usa ka reproducible nga gut-on-a-chip usa ka Transwell embedded hybrid chip.Among gihubit ang detalyadong mga pamaagi alang sa paggama sa device, culturing sa Caco-2 o intestinal organoid epithelial cells sa conventional settings ingon man sa usa ka microfluidic platform, induction sa 3D morphogenesis, ug characterization sa natukod nga 3D epithelia gamit ang multiple imaging modalities .Kini nga protocol nakab-ot ang pagbag-o sa gut . Ang pamaagi sa ogenesis naggamit sa physiologically related shear stress ug mechanical motion ug wala magkinahanglan ug komplikadong cell engineering o manipulation, nga mahimong mas labaw pa sa uban nga kasamtangan nga mga teknik.Among gilantaw nga ang among gisugyot nga protocol mahimong adunay lapad nga implikasyon alang sa biomedical research community, nga naghatag ug pamaagi sa pag-regenerate sa 3D intestinal epithelial layers in vitro para sa biomedical, clinical, ug pharmaceutical application.
Gipakita sa mga eksperimento nga ang intestinal epithelial Caco-2 nga mga selula nga gi-kultura sa gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o bilayer microfluidic devices6,7 mahimong moagi sa spontaneous 3D morphogenesis in vitro nga walay klaro nga pagsabot sa nagpahiping mekanismo. in vitro, nga gipakita sa Caco-2 ug mga organoids sa intestinal nga nakuha sa pasyente.Ang mga selula sa epithelial gi-validate. Sa kini nga pagtuon, espesipikong gipunting namon ang produksiyon sa cell ug pag-apod-apod sa konsentrasyon sa usa ka kusgan nga Wnt antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), sa gut-on-a-chip ug gibag-o nga mga aparato nga microfluidic nga adunay sulud nga Transwell, gitawag nga "Hybrid Chip". 1, o Soggy-1) sa on-chip gut makapugong sa morphogenesis o makabalda sa prestructured 3D epithelial layer, nga nagsugyot nga ang antagonistic nga stress sa panahon sa kultura maoy responsable sa intestinal morphogenesis in vitro. -on-a-chip o hybrid-on-a-chip nga mga plataporma) o diffusion .Basolateral media (pananglitan, gikan sa Transwell inserts ngadto sa dagkong basolateral reservoir sa mga atabay).
Sa kini nga protocol, naghatag kami usa ka detalyado nga pamaagi alang sa paghimo sa gut-on-a-chip microdevices ug Transwell-insertable hybrid chips (mga lakang 1-5) aron ikultura ang mga intestinal epithelial cells sa polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membranes (mga lakang 6A, 7A, 8, 9) o polyesterBs, 9steps, 8, 9) o polyesterBs, 7 ced 3D morphogenesis in vitro (lakang 10) .Among giila usab ang cellular ug molekular nga mga bahin nga nagpaila sa histogenesis nga piho sa tisyu ug paglainlain sa selula nga nagsalig sa linya pinaagi sa pagpadapat sa daghang mga modalidad sa imaging (mga lakang 11-24) .Giaghat namo ang morphogenesis gamit ang mga selula sa epithelial sa intestinal sa tawo, sama sa Caco-2 o intestinal nga mga detalye sa paglalang sa mga organoids sa nawong, nga adunay duha ka mga teknikal nga pormat sa paglalang 2D monolayers, ug intestinal biochemical ug Reproduction sa biomechanical microenvironment.in vitro.Aron maaghat ang 3D morphogenesis gikan sa 2D epithelial monolayers, gitangtang namo ang morphogen antagonists sa duha ka kultura nga porma pinaagi sa pag-agos sa medium ngadto sa basolateral nga kompartamento sa kultura. Sa kataposan, naghatag kami og representasyon sa 3D nga magamit nga utility nga magamit nga 3 nga nagsalig sa utility. epithelial growth, longhitudinal host-microbiome co-cultures, pathogen infection, inflammatory injury, epithelial barrier dysfunction, ug probiotic-based therapies Example.influences.
Ang among protocol mahimong mapuslanon sa daghang mga siyentipiko sa sukaranan (pananglitan, intestinal mucosal biology, stem cell biology, ug developmental biology) ug gipadapat nga panukiduki (eg, preclinical drug testing, modeling sa sakit, tissue engineering, ug gastroenterology) kaylap nga epekto. ated ngadto sa mga tumatan-aw nga nagtuon sa dynamics sa cell signaling atol sa intestinal development, regeneration o homeostasis .Dugang pa, ang among protocol mapuslanon sa pagsukitsukit sa impeksyon ubos sa nagkalain-laing makatakod nga mga ahente sama sa Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmochonella Typhimuorium.Mapuslanon usab ang mga tumatan-aw sa pathology sa sakit ug pathogenesis.Ang paggamit sa on-chip gut microphysiology system mahimong magtugot sa longitudinal co-culture 10 ug sunod nga pag-assess sa host defense, immune responses ug pathogen-related injury repair sa gastrointestinal (GI) tract 11 .Ubang mga GI disorders nga may kalabutan sa leaky gut syndrome, celiac disease, Crohn's colitis, ulcerative bowelt syndrome, Crohn's colitis, bowelted bowelt. Ang inal epithelial layers giandam gamit ang 3D intestinal epithelial layers sa pasyente, kini nga mga sakit naglakip sa villous atrophy, crypt shortening, mucosal damage, o impaired epithelial barrier.Biopsy o stem cell-derived intestinal organoids12,13.To better model the higher disease-the blood PBMCs), sa mga modelo nga adunay 3D intestinal villus-crypt microarchitectures.tissue-spesipiko nga immune cells, 5.
Tungod kay ang 3D epithelial microstructure mahimo nga ayohon ug mahanduraw nga wala ang proseso sa sectioning, ang mga tumatan-aw nga nagtrabaho sa spatial transcriptomics ug high-resolution o super-resolution imaging mahimong interesado sa among pagmapa sa spatiotemporal dynamics sa mga gene ug protina sa epithelial niches.Interesado sa teknolohiya.Pagtubag sa microbial o immune stimuli.Dugang pa, ang longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 nga nag-coordinate sa gut homeostasis mahimong maestablisar sa 3D intestinal mucosal layer pinaagi sa co-culturing sa nagkalain-laing microbial species, microbial community o fecal microbiota-ona-, ilabi na sa gut-gut.sa plataporma.Kini nga pamaagi labi ka madanihon sa mga tumatan-aw nga nagtuon sa mucosal immunology, gastroenterology, microbiome sa tawo, culturomics ug clinical microbiology nga nagtinguha sa pag-ugmad kaniadto nga wala pa naanad nga gut microbiota sa laboratoryo. Kung ang atong in vitro morphogenesis protocol mahimong ipahiangay sa scalable nga mga format sa kultura, sama sa multiwell inserts sa 24, 496 usab nga padayon nga baso sa lateral protocol, 496 gisabwag ngadto sa mga nagpalambo sa pharmaceutical, biomedical O high-throughput screening o validation nga mga plataporma alang sa industriya sa pagkaon.Isip usa ka pruweba-of-principle, bag-o lang namo gipakita ang posibilidad sa usa ka multiplex high-throughput morphogenesis system nga masukod sa 24-well plate format.Dugang pa, daghang organ-on-a-chip nga mga produkto ang gi-commercialize,18 nga gi-commercialize,18 nga pamaagi sa vi. gipaspasan ug posibleng gisagop sa daghang research laboratories, industriya o gobyerno ug regulatory agencies aron masabtan ang cellular reprogramming sa in vitro gut morphogenesis sa transcriptomic level aron masulayan ang mga tambal o biotherapeutics Ang pagsuyup ug pagdala sa mga kandidato sa droga gi-assess gamit ang 3D gut surrogates o paggamit sa custom o commercial organ-on-a-chip reproducibility sa proseso sa gut.
Ang limitado nga gidaghanon sa mga modelo sa eksperimento nga may kalabotan sa tawo gigamit sa pagtuon sa intestinal epithelial morphogenesis, nag-una tungod sa kakulang sa implementable nga mga protocol aron maaghat ang 3D morphogenesis sa vitro. ly, dili tukma nga pagtino sa mga proseso sa pag-uswag sa tawo. Kini nga mga modelo limitado usab sa ilang abilidad nga masulayan sa usa ka multi-way nga scalable nga paagi. Busa, ang among protocol alang sa pagbag-o sa 3D nga mga istruktura sa tisyu sa vitro milabaw sa vivo nga mga modelo sa hayop ingon man ang uban pang tradisyonal nga static nga 2D nga mga modelo sa kultura sa cell. -villus axis agig tubag sa lain-laing mucosal o immune stimuli.3D epithelial layers makahatag ug luna sa pagtuon kon sa unsang paagi ang microbial cells makigkompetensya sa pagporma sa spatial niches ug ecological evolution agig tubag sa host factors (pananglitan, sulod versus outer mucus layers, secretion sa IgA ug antimicrobial peptides). naghimo ug microbial metabolites (pananglitan, mugbo nga kadena nga mga fatty acid) nga naghulma sa cellular nga organisasyon ug mga stem cell niches sa basal crypts. Kini nga mga bahin mapakita lamang kung ang 3D epithelial layers matukod sa vitro.
Dugang pa sa among pamaagi sa pagmugna og 3D intestinal epithelial structures, adunay ubay-ubay nga in vitro nga mga pamaagi.Ang intestinal organoid culture usa ka state-of-the-art nga tissue engineering technique nga gibase sa kultibasyon sa intestinal stem cells ubos sa piho nga morphogen conditions23,24,25.Bisan pa, ang paggamit sa 3D organoid nga mga modelo alang sa host-culture nga pag-analisa sa lubi sa kasagaran mao ang pag-analisa sa mga organoid-culture sa transport lubi o pag-analisa. gilakip sa sulod sa organoid ug, busa, ang pagpaila sa mga luminal nga sangkap sama sa microbial cells o exogenous antigens limitado.Ang pag-access sa organoid lumens mahimong mapauswag gamit ang microinjector,26,27 apan kini nga pamaagi invasive ug labor-intensive ug nagkinahanglan og espesyal nga kahibalo sa pagbuhat.Dugang pa, ang tradisyonal nga organoid nga mga kultura nga gimintinar sa hydrogel scaffolds ubos sa static nga mga kondisyon dili tukma nga nagpakita sa aktibo sa vivo biomechanics.
Ang uban nga mga pamaagi nga gigamit sa daghang mga grupo sa panukiduki naggamit prestructured 3D hydrogel scaffolds aron masundog ang gut epithelial structure pinaagi sa pag-kultura sa nahilit nga mga selula sa intestinal sa tawo sa ibabaw sa gel. Paghimo ug hydrogel scaffolds gamit ang 3D-printed, micro-milled, o lithographically fabricated molds. gradients, pag-establisar sa usa ka taas nga aspect ratio epithelial structure ug stroma-epithelial crosstalk pinaagi sa paglakip sa stromal cells sa scaffold.Bisan pa, ang kinaiyahan sa prestructured scaffolds mahimong makapugong sa pagpakita sa spontaneous morphogenetic nga proseso mismo.Kini nga mga modelo wala usab maghatag ug dinamikong luminal o interstitial nga mga selyula, nga kulang sa pag-agay sa fluid. Ang pagtuon migamit ug hydrogel scaffolds sa usa ka microfluidic nga plataporma ug may pattern nga intestinal epithelial structures gamit ang laser-etching techniques.Mouse intestinal organoids nagsunod sa etched patterns aron maporma ang intestinal tubular structures, ug ang intraluminal fluid flow mahimong recapitulated gamit ang microfluidics module.Apan, kini nga modelo wala magpakitag mga proseso sa pag-imprinta nga spontaneous3. ang sama nga grupo nakahimo sa paghimo sa gagmay nga mga tubo sa gut nga adunay kusog nga morphogenetic nga mga proseso. Bisan pa sa komplikado nga paghimo sa lainlaing mga bahin sa gut sa sulod sa tubo, kini nga modelo usab kulang sa luminal fluid flow ug mekanikal nga deformation.Dugang pa, ang operability sa modelo mahimong limitado, labi na pagkahuman sa proseso sa bioprinting kompleto, nagsamok sa mga kahimtang sa eksperimento o mga interaksyon sa cell-to-cell. mimic gut motility, accessibility sa independente nga apical ug basolateral compartments, ug re-creation sa komplikadong biological microenvironments of modularity.Busa, ang atong in vitro 3D morphogenesis protocol mahimong maghatag ug complementary approach sa pagbuntog sa mga hagit sa kasamtangan nga mga pamaagi.
Ang among protocol bug-os nga naka-focus sa 3D epithelial morphogenesis, nga adunay mga epithelial cells lamang sa kultura ug walay lain nga mga matang sa naglibot nga mga selula sama sa mesenchymal cells, endothelial cells, ug immune cells.Sama sa gihulagway kaniadto, ang kinauyokan sa among protocol mao ang induction sa epithelial morphogenesis pinaagi sa pagtangtang sa morphogen-inhibitor nga gitago sa basolateral nga bahin sa atong medium nga gut-gut nga bahin sa basolateral nga bahin sa medium nga bahin sa atong basolateral-gut-gut. -on-a-chip nagtugot kanato sa paghimo pag-usab sa undulating 3D epithelial layer, dugang nga biological complexities sama sa epithelial-mesenchymal interactions33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 ug, sa atong modelo, crypt-villus features nga nagpahayag sa stem cell niches sa basal crypts nagpabilin nga gikonsiderar nga dugang pa. s ug regulasyon sa intestinal morphogenesis sa vivo35,37,38. Ang pagdugang sa mesenchymal cells sa atong modelo nagpalambo sa morphogenetic nga proseso ug cell attachment efficiency. quisite kung ang mga modelo sa tisyu gidisenyo aron ipakita ang mga interaksyon sa daghang organo. Busa, ang mga endothelial nga mga selula mahimo’g kinahanglan nga ilakip aron mamodelo ang mas tukma nga mga bahin sa pisyolohikal nga adunay resolusyon sa lebel sa organ. Ang mga selula sa resistensya nga nakuha sa pasyente hinungdanon usab alang sa pagpakita sa mga natural nga tubag sa imyunidad, presentasyon sa antigen, innate adaptive immune crosstalk, ug piho nga resistensya sa tisyu sa konteksto sa milmi.
Ang paggamit sa hybrid chips mas prangka kay sa gut-on-a-chip tungod kay ang setup sa device mas simple ug ang paggamit sa Transwell inserts nagtugot sa scalable nga kultura sa gut epithelium.Apan, ang komersiyal nga available nga Transwell inserts nga adunay polyester membranes dili elastic ug dili makasundog sa peristaltic-like movements. .Klaro, ang static nga mga kabtangan sa apical compartment panagsa ra makapahimo sa long-term nga bacterial co-culture sa hybrid chips.Samtang mahimo natong lig-on nga maaghat ang 3D morphogenesis sa Transwell inserts kung gamiton ang hybrid chips, ang kakulang sa physiologically related biomechanics ug apical fluid flow mahimong limitahan ang posibilidad sa hybrid chip platforms alang sa potensyal nga mga aplikasyon.
Ang bug-os nga pag-rekonstruksyon sa tawhanong crypt-villus axis sa gut-on-a-chip ug hybrid-on-a-chip nga mga kultura wala pa hingpit nga natukod. Tungod kay ang morphogenesis nagsugod gikan sa usa ka epithelial monolayer, ang 3D microarchitectures dili kinahanglan nga maghatag og morphological nga pagkaparehas sa mga crypts sa vivo. thelium, ang crypt ug villous nga mga rehiyon dili tin-aw nga gimarkahan. Bisan tuod ang mas taas nga mga kanal sa ibabaw sa chip mosangpot sa dugang nga gitas-on sa microengineered epithelium, ang maximum nga gitas-on limitado gihapon sa ~300-400 µm. maoy ~600 µm41.
Gikan sa usa ka panglantaw sa imaging, in situ super-resolution imaging sa 3D microarchitectures mahimong limitado sa gut sa usa ka chip, tungod kay ang gikinahanglan nga pagtrabaho nga gilay-on gikan sa tumong lens ngadto sa epithelial layer anaa sa han-ay sa pipila ka milimetro. layer-by-layer microfabrication sa gut sa usa ka chip naglakip sa permanente adhesion sa taliwala sa matag layer, kini mao ang hilabihan mahagiton sa pag-abli o sa pagtangtang sa ibabaw nga layer sa pagsusi sa ibabaw nga gambalay sa epithelial layer.Pananglitan, pinaagi sa paggamit sa scanning electron mikroskopyo (SEM).
Ang hydrophobicity sa PDMS nahimong usa ka limiting factor sa microfluidic-based nga mga pagtuon nga naghisgot sa hydrophobic nga gagmay nga mga molekula, tungod kay ang PDMS mahimo nga nonspecifically adsorb sa maong hydrophobic molecules. Ang mga alternatibo sa PDMS mahimong konsiderahon uban sa ubang polymeric nga materyales. Ang pagporma sa hydrophobic molekula.
Sa katapusan, ang among pamaagi dili maayo nga gihulagway sa mga termino sa paghatag sa usa ka high-throughput screening o "usa ka gidak-on-angay-tanan" nga user-friendly nga eksperimento nga plataporma. Ang kasamtangan nga protocol nagkinahanglan og usa ka syringe pump matag microdevice, nga nagkinahanglan og luna sa usa ka CO2 incubator ug makapugong sa dagkong mga eksperimento. Kini nga limitasyon mahimong mapauswag sa kamahinungdanon pinaagi sa scalability sa innovative, well-829 formats mga pagsal-ot nga nagtugot sa padayon nga pagpuno ug pagtangtang sa basolateral media).
Aron maaghat ang 3D morphogenesis sa intestinal epithelium sa tawo in vitro, migamit kami og microfluidic chip intestinal device nga adunay duha ka parallel microchannels ug usa ka elastic porous membrane sa tunga aron makamugna og lumen-capillary interface.Gipakita usab namo ang paggamit sa usa ka single-channel microfluidic device (usa ka hybrid chip) nga naghatag og padayon nga basolarized nga epithel sa epithel nga epithel sa ilawom sa powell nga plataporma. sa lain-laing mga human intestinal epithelial cells mahimong ipakita pinaagi sa paggamit sa direksyon nga manipulasyon sa agos sa pagtangtang sa morphogen antagonists gikan sa basolateral compartment.Ang tibuok eksperimento nga pamaagi (Figure 1) naglangkob sa lima ka bahin: (i) microfabrication sa gut chip o Transwell insertable chip (mga lakang 1-5; Box 1-5; Kahon 1 sa mga selula sa tawhanon), (itestinal) organo nga pag-andam (i) (i) oids;kahon 2-5), (iii) kultura sa intestinal epithelial cells sa intestinal chips o hybrid chips (mga lakang 6-9), (iv) induction sa 3D morphogenesis in vitro (step 10) ug (v) ) aron mahulagway ang 3D epithelial microstructure (mga lakang 11-24). pinaagi sa pagtandi sa epithelial morphogenesis ngadto sa spatial, temporal, conditional, o procedural nga mga kontrol.
Gigamit namo ang duha ka lain-laing kultura nga plataporma: gut-on-a-chip nga adunay tul-id nga mga kanal o nonlinear convoluted channels, o hybrid chips nga adunay Transwell (TW) inserts sa usa ka microfluidic device, nga gigama sama sa gihulagway sa Box 1, ug step 1 -5. organoids) ug pamaagi sa kultura nga gigamit niini nga protocol."In vitro morphogenesis" nagpakita sa kinatibuk-ang mga lakang diin ang Caco-2 o organoid-derived epithelial cells gikultura sa intestinal chip o sa Transwell inserts sa hybrid chip, gisundan sa induction sa 3D morphogenesis ug ang pagporma sa usa ka characterized epithelial structure. gigamit, pananglitan, sa cell differentiation characterization, gut physiology studies, pagtukod sa host-microbiome ecosystems, ug pagmodelo sa sakit. Immunofluorescence nga mga hulagway sa "Cell Differentiation" nga nagpakita sa nuclei, F-actin ug MUC2 nga gipahayag sa 3D Caco-2 epithelial layer nga namugna sa muC2 nga mga selyula sa senyales sa ibabaw nga muco. orescent nga mga hulagway sa Gut Physiology nagpakita sa mucus nga gihimo pinaagi sa pagmantsa alang sa sialic acid ug N-acetylglucosamine residues gamit ang fluorescent wheat germ agglutinin. -2 epithelial cells. Ang tuo nga panel nagpakita sa localization sa GFP E. coli co-cultured uban sa 3D Caco-2 epithelial cells, gisundan sa immunofluorescence staining uban sa F-actin (pula) ug nuclei (asul). Ang pagmodelo sa sakit naghulagway sa himsog nga versus leaky gut sa gut inflammation chips ubos sa physiological nga hagit nga adunay mga selula, PSccharigly ug bacterial nga mga selula sa panghubag sa lawas. PBMC;berde).Ang mga selula sa Caco-2 gikultura aron makatukod ug 3D epithelial layer.Scale bar, 50 µm.Mga hulagway sa ubos nga laray: "Paglainlain sa mga selula" nga gipahaom uban sa pagtugot gikan sa reference.2.Oxford University Press;Giprodyus uban ang pagtugot gikan sa Ref.5.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" nga gipahiangay uban ang pagtugot gikan sa ref.3.NAS;"Pagmodelo sa Sakit" nga gipahiangay nga adunay pagtugot gikan sa pakisayran.5.NAS.
Ang duha ka gut-on-chip ug hybrid chips gihimo gamit ang PDMS replicas nga gi-demold gikan sa silicon molds pinaagi sa soft lithography1,44 ug gisundogan sa SU-8.Ang disenyo sa microchannels sa matag chip gitino pinaagi sa pagkonsiderar sa hydrodynamics sama sa shear stress ug hydrodynamic pressure1,4,12. microchannels, milambo ngadto sa usa ka komplikadong gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) nga naglakip sa usa ka parisan sa curved microchannels aron sa pag-aghat sa Dugang fluid residence time, nonlinear flow patterns, ug multiaxial deformation sa cultured cells (Fig. 2a-f) 12. Sa diha nga mas komplikado ang atong gut-chip kinahanglan nga mahimong biomechanics. nagpakita nga ang convoluted Gut-Chip kusganon usab nga nag-aghat sa 3D morphogenesis sa susama nga time frame nga adunay susama nga ang-ang sa epithelial growth kumpara sa orihinal nga Gut-Chip, bisan unsa pa ang kultura nga cell type.Busa, aron maaghat ang 3D morphogenesis, linear ug komplikado nga on-chip gut nga mga disenyo mabaylo.2a) .Aron paghimo sa gut sa usa ka chip, ang giandam nga ibabaw nga layer sa PDMS sunod-sunod nga gibugkos sa usa ka porous nga PDMS nga pelikula ug dayon gipahiangay sa ubos nga layer sa PDMS pinaagi sa dili mabalik nga bonding gamit ang usa ka corona treater (Fig. 2b-f). ug Extended Data Fig. 2) .Ang proseso sa bonding gihimo pinaagi sa pagtratar sa mga ibabaw sa PDMS replica ug bildo nga adunay oxygen plasma o corona treatment.Human sa sterilization sa microfabricated device nga gilakip sa silicone tube, ang device setup andam na sa paghimo sa 3D morphogenesis sa intestinal epithelium (Figure 2g).
a, Ilustrasyon sa eskematiko sa pag-andam sa mga bahin sa PDMS gikan sa SU-8 patterned silicon molds.Ang uncured PDMS solution gibubo ngadto sa usa ka silicon mold (wala), giayo sa 60 °C (tunga) ug demolded (tuo).Ang demolded PDMS giputol sa mga piraso ug gilimpyohan alang sa dugang nga paggamit.b, Litrato sa silicon PDMS nga agup-op nga gigamit sa pag-andam sa silicon PDMS nga agup-op nga gigamit sa pag-andam sa silicon nga PDMS nga agup-op nga gigamit sa pag-andam sa silicon PDMS mold. porous membrane.d, Usa ka serye sa mga litrato sa ibabaw ug ubos nga mga sangkap sa PDMS ug ang gitigum nga on-chip intestinal device.e, Schematic of the alignment of the upper, membrane, and lower PDMS components.Each layer is irreversibly bonded by plasma or corona treatment.f, Schematic of the fabricated gut-on-a-chip device uban sa gut-on-a-chip device nga adunay superim- gut-up nga device nga adunay gut-on-a-chip nga device nga adunay superim- gut nga chanel ug vacuum gut- -usa ka-chip para sa microfluidic cell culture.Ang fabricated gut sa usa ka chip nga gi-assemble sa silicone tube ug syringe gibutang sa coverslip.Ang chip device gibutang sa taklob sa 150 mm Petri dish para sa pagproseso.Ang binder gigamit sa pagsira sa silicone tube.h, Visual snapshots sa hybrid chip fabrication ug 3D morphogenesis gamit ang mga hybrid nga chips nga giandam sa mga independente nga kultura2DTranslay. gisal-ut ngadto sa hybrid chip aron sa pag-aghat sa intestinal 3D morphogenesis.Ang medium gi-perfused pinaagi sa microchannels ilawom sa cell layer nga gitukod sa Transwell insert.Scale bar, 1 cm.h Gi-reprint nga adunay pagtugot gikan sa reference.4.Elsevier.
Sa niini nga protocol, ang Caco-2 cell line ug intestinal organoids gigamit isip epithelial sources (Fig. 3a). 50) sa T-flasks giani aron sa pag-andam sa dissociated cell suspensions pinaagi sa trypsinization fluid (kahon 2). Human intestinal organoids gikan sa intestinal biopsies o surgical resections gi-culture sa Matrigel scaffold domes sa 24-well plates aron suportahan ang structural microenvironment. ug ang mga growth factor nga giandam sumala sa gihulagway sa Kahon 3 gidugangan kada adlaw hangtod nga ang mga organoids mitubo ngadto sa ~500 µm ang diyametro. Ang bug-os nga mitubo nga mga organoids giani ug gibahin ngadto sa usa ka selula alang sa pagpugas ngadto sa gut o Transwell nga mga pagsal-ot sa usa ka chip (Kahon 5). Sama sa ato nang gitaho, kini mahimong lainlainon sumala sa sakit, 13 nga sakit (13 nga sakit sa kolor, croectal, normal nga colitis, 13 nga matang sa kanser). donor), lesion site (eg, lesion versus non-lesioned area) ug gastrointestinal nga lokasyon sa tract (eg, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, o rectum).Naghatag kami og usa ka optimized nga protocol sa Box 5 alang sa pag-culture sa colonic organoids (coloids) nga kasagaran nagkinahanglan og mas taas nga konsentrasyon sa morphogens nga organoids kay sa gagmay nga mga intestinal.
a, Workflow para sa induction sa gut morphogenesis sa gut chip.Caco-2 human intestinal epithelium ug intestinal organoids gigamit niini nga protocol aron ipakita ang 3D morphogenesis.Ang nahilit nga epithelial cells gipugas sa giandam nga gut-on-a-chip device (chip preparation) . Ang cal (AP) nga agos gisugdan ug gimintinar sa unang 2 ka adlaw (agos, AP, D0-D2). Basolateral (BL) nga agos gisugdan usab uban sa cyclic stretching motions (stretch, flow, AP ug BL) sa diha nga ang usa ka kompleto nga 2D monolayer naporma. Intestinal 3D morphogenesis nahitabo spontaneously human sa 5 ka adlaw sa microsemorphic-depresentatives nga mga selyula sa morphofluogenesis nga nagpakita sa 5 nga mga kontrasedyik sa morpho-D. sa matag eksperimento nga lakang o punto sa oras (bar graph, 100 µm).Upat ka schematic diagram nga naghulagway sa katugbang nga mga cascades sa gut morphogenesis (ibabaw sa tuo). ang 3D Caco-2 layer (tuo).c, Horizontal frontal view sa natukod nga Caco-2 3D, claudin (ZO-1, pula) ug padayon nga brush border lamad nga gimarkahan F-actin (berde) ug nuclei (asul) Immunofluorescence confocal visualization sa epithelial mga selula sa intestinal chips.Arrows schematic nga nagpunting sa kurso nga nagpunting sa lokasyon sa tunga-tunga nga plano sa confocal. mga kausaban sa morphological sa mga organoids nga gi-culture sa usa ka chip nga nakuha pinaagi sa phase contrast microscopy sa mga adlaw nga 3, 7, 9, 11, ug 13. Ang inset (ibabaw sa tuo) nagpakita sa taas nga pagpadako sa gihatag nga imahe.e, DIC photomicrograph sa organoid 3D epithelium nga natukod sa gut sa slice nga gikuha sa adlaw nga 7.f, Overlaid nga mga hulagway sa immunofluorescence (L nga mga stem cell nga nagpakita sa mga immunofluorescence;magenta), goblet cells (MUC2; green), F-actin (grey) ug nuclei (cyan) nga mitubo sa gut chips sulod sa 3 ka adlaw, matag usa (Left) ug 13-day (tunga-tunga) nga mga organoids sa epithelial layer.Tan-awa usab ang Extended Data Figure 3, nga nagpasiugda sa LGR5 nga pagsenyas sa tuo nga mga hulagway nga walay MUC3oreence nga estruktura nga signaling. organoid epithelium nga naestablisar sa gut sa usa ka chip pinaagi sa pagmantsa sa plasma membrane sa CellMask dye (tuo) sa adlaw nga 13 sa kultura.Scale bar mao ang 50 μm gawas kon gipahayag.b Gi-imprinta pag-usab uban sa pagtugot gikan sa reference.2.Oxford University Press;c Gipahiangay uban sa pagtugot gikan sa Reference.2.Oxford University Press;e ug f gipahiangay uban sa pagtugot pinaagi sa pakisayran.12 Ubos sa Creative Commons License CC BY 4.0.
Sa gut sa usa ka chip, gikinahanglan nga usbon ang hydrophobic nga nawong sa PDMS porous membrane alang sa malampuson nga ECM coating. Sa kini nga protocol, gigamit namon ang duha ka lainlaing mga pamaagi aron mabag-o ang hydrophobicity sa mga lamad sa PDMS. Ang idic nga kultura sa organoid epithelium nanginahanglan chemical-based surface functionalization aron makab-ot ang episyente nga deposition sa ECM proteins pinaagi sa sunodsunod nga paggamit sa polyethyleneimine (PEI) ug glutaraldehyde ngadto sa PDMS microchannels. perfusing lamang ang medium ngadto sa ibabaw nga microchannel hangtud nga ang mga selula maporma nga usa ka kompleto nga monolayer, samtang ang ubos nga microchannel nagmintinar sa static nga mga kondisyon.Kini nga optimized nga pamaagi alang sa pagpaaktibo sa ibabaw ug ECM coating makahimo sa attachment sa organoid epithelium sa pag-aghat sa 3D morphogenesis sa ibabaw sa PDMS.
Ang mga kultura sa Transwell nagkinahanglan usab ug ECM coating sa wala pa ang cell seeding;bisan pa, ang mga kultura sa Transwell wala magkinahanglan og komplikadong mga lakang sa pretreatment aron ma-activate ang nawong sa porous nga mga pagsal-ot.Alang sa pagtubo sa Caco-2 nga mga selula sa mga pagsal-ot sa Transwell, ang ECM coating sa porous nga mga pagsal-ot nagpadali sa pagdugtong sa mga dissociated nga Caco-2 nga mga selula (<1 ka oras) ug hugot nga junction barrier formation (<1-2 ka adlaw). gilakip sa ibabaw sa lamad (<3 h) ug gipadayon hangtud nga ang mga organoids maporma nga usa ka kompleto nga monolayer nga adunay barrier integrity .Transwell nga mga kultura gihimo sa 24-well plate nga walay paggamit sa hybrid chips.
Ang in vitro 3D morphogenesis mahimong masugdan pinaagi sa pagpadapat sa fluid flow ngadto sa basolateral nga aspeto sa usa ka natukod nga epithelial layer.Sa gut sa usa ka chip, ang epithelial morphogenesis nagsugod sa diha nga ang medium nga perfused ngadto sa ibabaw ug sa ubos nga microchannels (Fig. 3a) sustansiya ug serum sa mga selula nga gigapos sa porous lamad ug makamugna luminal shear stress, kita sa kasagaran mag-aplay dual dagan sa gut sa usa ka chip.Sa hybrid chips, Transwell pagsal-ot nga adunay sulod epithelial monolayers gisal-ut ngadto sa hybrid chips.Dayon, ang medium gipadapat sa ilalum sa basolateral nga bahin sa porous Transwell insert pinaagi sa microchannel.Intestinal dagan sa morph-morphic nga mga adlaw sa duha ka adlaw sa kultura.
Ang morphological features sa microengineered 3D epithelial layers mahimong analisahon pinaagi sa paggamit sa nagkalain-laing imaging modalities, lakip na ang phase contrast microscopy, differential interference contrast (DIC) microscopy, SEM, o immunofluorescence confocal microscopy (Figures 3 ug 4) .Phase contrast o DIC imaging sa panahon sa protrusion sa bisan unsang panahon sa pag-monitor sa DIC ug sa protrusion DIC mahimong dali nga ma-monitor sa bisan unsang panahon sa epithelial. sa optical transparency sa PDMS ug polyester nga mga pelikula, ang gut-on-a-chip ug hybrid chip nga mga plataporma makahatag og real-time nga in situ imaging nga dili na kinahanglan ang sectioning o disassembly sa device. Sa diha nga nagpahigayon og immunofluorescence imaging (Figures 1, 3c, f ug 4b, c), ang mga cell kasagarang gi-fix sa Xton/hyl 0, ug ang mga selyula kasagarang gi-fix sa parade / hyd1% 0 ug 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), sa han-ay.Depende sa tipo sa selula, lain-laing fixatives, permeabilizers, ug blocking agents mahimong gamiton.Primary antibodies nga nag-target sa lineage-dependent nga cell o rehiyon marker gigamit sa pag-highlight sa mga selula nga immobilized in situ sa chip, gisundan sa secondary antibodies, bisan sa nuphe-dinog-diam ′ nga target, nupheny-diam ′ ) indole, DAPI) o F-actin (eg, fluorescently nga gimarkahan nga phalloidin).1, "Cell differentiation" ug "Gut physiology"), random colonization sa microbial cells (Fig. 1, "Host-microbe co-culture"), ang recruitment sa immune cells (Fig. 1, 'Disease Modeling') o ang mga contours sa 3D epithelial morphology (Fig. 3c, ang ubos nga lut-od sa microc, f ug gut sa pagbulag). nnel layer, sama sa gihulagway sa ref.Sama sa gipakita sa Fig. 2, ang 3D epithelial morphology ingon man ang microvilli sa apical brush border mahimong makita sa SEM (Fig. 3b). ization ug unya gigamit alang sa molecular o genetic analysis.
a, Workflow para sa induction sa intestinal morphogenesis sa hybrid chip.Caco-2 ug intestinal organoids gigamit niini nga protocol aron ipakita ang 3D morphogenesis sa hybrid chip platform.Dissociated epithelial cells ang gisabod sa giandam nga Transwell inserts (TW prep; tan-awa ang figure sa ubos).Sa dihang ang mga selula gisabwag (seededed) ug gilakip sa tanang mga selula sa Transwell (seeded) ug gilakip sa tanang mga selula sa Transwell. Human sa 7 ka adlaw, ang usa ka Transwell insert nga adunay sulod nga 2D monolayer sa epithelial cells ang gi-integrate ngadto sa hybrid chip aron ipaila ang basolateral flow (Flow, BL), nga sa kataposan mitultol sa pagmugna og 3D epithelial layer (morphogenesis). s sa ibabaw nga mga lut-od nag-ilustrar sa eksperimento nga configuration alang sa matag lakang.b, Hybrid chips (wala schematic) mahimong mosangpot ngadto sa 3D morphogenesis sa organoid epithelial cells uban sa top-down confocal microscopy panglantaw nga gikuha sa lain-laing mga posisyon Z (ibabaw, tunga-tunga, ug ubos;tan-awa ang tuo nga eskematiko ug katugbang nga mga tuldok nga linya).nagpakita sa dayag nga morphological nga mga kinaiya.F-actin (cyan), nucleus (grey).c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) sa organoid-derived epithelial cells nga gi-culture sa static nga Transwell (TW; inset sulod sa puti nga dashed box) versus hybrid chip (labing dako nga full shot) nga nagtandi sa 2D versus 3D nga mga cross nga morphology, sa tinagsa-tagsa nga cut sa tuo nga morphology. Z”) nagpakita usab sa 2D ug 3D nga mga feature.Scale bar, 100 µm.c Gi-reprint nga may pagtugot gikan sa reference.4.Elsevier.
Ang mga kontrol mahimong andamon pinaagi sa pag-kultura sa samang mga selula (Caco-2 o intestinal organoid epithelial cells) ngadto sa two-dimensional nga mga monolayer ubos sa conventional static nga kondisyon sa kultura.
Ang proseso sa humok nga lithography kinahanglan nga himuon sa usa ka limpyo nga kwarto. Alang sa matag layer sa chip (ibabaw ug ubos nga mga sapaw ug mga lamad) ug hybrid chips, lain-laing mga photomasks ang gigamit ug gihimo sa separado nga mga wafer sa silicon tungod kay ang mga gitas-on sa mga microchannel lahi. µm.
Ibutang ang usa ka 3-pulgada nga silicon nga wafer sa usa ka pinggan nga adunay acetone. Hinay-hinay nga swirl ang plato sulod sa 30 segundos, dayon pauga sa hangin ang wafer. Ibalhin ang wafer ngadto sa usa ka plato nga adunay IPA, dayon tuyok ang plato sulod sa 30 s aron malimpyo.
Usa ka solusyon sa piranha (mixture sa hydrogen peroxide ug concentrated sulfuric acid, 1:3 (vol/vol)) mahimong opsyonal nga gamiton aron mapadako ang pagtangtang sa mga organikong residue gikan sa silicon wafer surface.
Ang solusyon sa Piranha hilabihan ka makadaot ug makamugna og kainit.Kinahanglan ang dugang nga pag-amping sa kahilwasan.Alang sa paglabay sa basura, tugoti ang solusyon nga mobugnaw ug ibalhin ngadto sa limpyo, uga nga sudlanan sa basura.Gamit ang mga sekondaryang sudlanan ug husto ang label sa mga sudlanan sa basura.Palihug sunda ang mga sumbanan sa kaluwasan sa pasilidad alang sa mas detalyado nga mga pamaagi.
I-dehydrate ang mga wafer pinaagi sa pagbutang niini sa usa ka 200 °C nga init nga plato sulod sa 10 min. Human sa dehydration, ang wafer giuyog lima ka beses sa hangin aron mabugnaw.
Ibubo ang ~10 g sa photoresist SU-8 2100 ngadto sa sentro sa gilimpyohan nga silicon nga wafer.Gamit ang mga sipit aron parehas nga ipakaylap ang photoresist sa wafer. Usahay ibutang ang wafer sa usa ka 65°C nga hot plate aron ang photoresist dili kaayo sticky ug mas sayon ​​nga ipakatap.Ayaw ibutang ang wafer direkta sa hot plate.
Ang SU-8 parehas nga giapod-apod sa wafer pinaagi sa pagpadagan sa spin coating. Programa ang umaabot nga rotation sa SU-8 sulod sa 5-10 s aron mokaylap sa 500 rpm sa usa ka acceleration nga 100 rpm/s. Itakda ang main spin para sa 200 µm nga gibag-on nga patterning sa 1,500 µm 50 nga gibag-on sa 1,500 µm 50 m (makab-ot ang gibag-on nga 500 rpm, o mak ang ibabaw nga layer sa gut sa chip; tan-awa ang "Kritikal nga mga lakang" sa ubos) gibutang sa usa ka acceleration sa 300 rpm/s 30 segundos sa 1,200 rpm.
Ang nag-unang katulin sa pagtuyok mahimong ipasibo sumala sa gibag-on sa target sa SU-8 nga pattern sa silicon wafer.
Aron makahimo og SU-8 nga mga pattern nga 500 µm ang gitas-on alang sa ibabaw nga layer sa gut sa chip, ang spin coating ug soft bake steps niini nga Kahon (mga lakang 7 ug 8) sunod-sunod nga gisubli (tan-awa ang lakang 9) aron makagama og duha ka layer nga 250 µm Usa ka baga nga layer sa SU-8, nga mahimong layered ug dugtongan og 12 µm sa exposure box.
Hinay-hinay nga pagluto sa SU-8 nga adunay sapaw nga mga wafer pinaagi sa maampingong pagbutang sa mga wafer sa usa ka mainit nga plato sa 65 °C sulod sa 5 min, dayon ibalhin ang setting ngadto sa 95 °C ug i-incubate sa dugang nga 40 min.
Aron makab-ot ang 500 μm nga gitas-on sa SU-8 nga sumbanan sa ibabaw nga microchannel, balika ang mga lakang 7 ug 8 aron makamugna og duha ka 250 μm nga baga nga SU-8 nga mga layer.
Gamit ang UV Mask Aligner, paghimo ug lamp test sumala sa instruksyon sa tiggama aron kuwentahon ang oras sa pagkaladlad sa wafer.(oras sa pagkaladlad, ms) = (dosis sa pagkaladlad, mJ/cm2)/(gahom sa lampara, mW/cm2).
Human matino ang oras sa pagkaladlad, ibutang ang photomask sa mask holder sa UV mask aligner ug ibutang ang photomask sa SU-8 coated wafer.
Ibutang ang giimprinta nga nawong sa photomask direkta sa SU-8 nga adunay sapaw nga kilid sa silicon wafer aron mamenosan ang pagkatibulaag sa UV.
Ibutyag ang SU-8 nga adunay sapaw nga wafer ug photomask nga patayo sa 260 mJ/cm2 sa UV nga kahayag alang sa gitakda nang daan nga oras sa pagkaladlad (tan-awa ang lakang 10 niini nga kahon).
Human sa UV exposure, ang SU-8-coated silicon wafers giluto sa 65 °C sulod sa 5 min ug 95 °C sulod sa 15 min sa matag init nga plato aron makagama og mga pattern nga adunay gitas-on nga 200 μm. I-extend ang post-bake nga oras sa 95 °C ngadto sa 30 min sa paghimo og mga pattern nga adunay gitas-on nga 500 μm.
Ang developer gibubo sa usa ka baso nga pinggan, ug ang linuto nga wafer gibutang sa pinggan.Ang gidaghanon sa SU-8 developer mahimong magkalainlain depende sa gidak-on sa bildo nga plato.Siguruha nga mogamit ug igo nga SU-8 developer aron hingpit nga matangtang ang wala mahayag nga SU-8.Pananglitan, kung mogamit usa ka 150 mm nga diyametro nga baso nga pinggan nga adunay kapasidad nga 1 L, gamita ang ~300 mL sa 5 ka minuto nga rotation.
Hugasi ang naugmad nga agup-op gamit ang ~10 mL nga bag-ong developer nga gisundan sa IPA pinaagi sa pag-spray sa solusyon gamit ang pipette.
Ibutang ang wafer sa plasma cleaner ug i-expose sa oxygen plasma (atmospheric gas, target pressure 1 × 10−5 Torr, power 125 W) sulod sa 1.5 min.
Ibutang ang wafer sa usa ka vacuum desiccator nga adunay usa ka glass slide sa sulod.Ang mga wafer ug mga slide mahimong ibutang sa kilid.Kon ang vacuum desiccator gibahin ngadto sa pipila ka mga lut-od pinaagi sa usa ka plato, ibutang ang mga slide sa ubos nga lawak ug ang mga wafer sa ibabaw nga lawak.Ihulog ang 100 μL nga trichloro(1H, 1H, 2H, 2H, 2H, 2H, 2H) nga solusyon sa slide sa silaw. isasyon.
Ibubo ang usa ka panaksan sa frozen nga Caco-2 nga mga selula sa usa ka 37 °C nga kaligoanan sa tubig, dayon ibalhin ang natunaw nga mga selula ngadto sa usa ka T75 flask nga adunay sulod nga 15 mL nga 37 °C nga prewarmed Caco-2 medium.
Aron mapasa ang mga selula sa Caco-2 sa ~90% nga panagtapok, una nga init ang Caco-2 medium, PBS, ug 0.25% trypsin/1 mM EDTA sa usa ka 37°C nga kaligoanan sa tubig.
Aspirate ang medium pinaagi sa vacuum aspiration. Hugasi ang mga cell kaduha gamit ang 5 mL nga mainit nga PBS pinaagi sa pagsubli sa vacuum aspiration ug pagdugang og presko nga PBS.