Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Naggamit ka usa ka bersyon sa browser nga adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Dugang pa, aron masiguro ang padayon nga suporta, gipakita namon ang site nga wala’y mga istilo ug JavaScript.
Nagpakita sa usa ka carousel sa tulo ka mga slide sa usa ka higayon.Gamita ang Kaniadto ug Sunod nga mga buton sa paglihok sa tulo ka mga slide sa usa ka higayon, o gamita ang mga buton sa slider sa katapusan aron sa paglihok sa tulo ka mga slide sa usa ka higayon.
Ang babag sa dugo-utok ug ang babag sa utok sa dugo nagpugong sa mga ahente sa biotherapeutic nga maabot ang ilang mga target sa sentral nga sistema sa nerbiyos, sa ingon nakababag sa epektibo nga pagtambal sa mga sakit sa neurological.Aron madiskubre ang mga nobela nga mga transporter sa utok sa vivo, gipaila namon ang usa ka librarya sa T7 phage peptide ug serye nga nakolekta nga dugo ug cerebrospinal fluid (CSF) gamit ang usa ka cannulated conscious large pool model sa mga ilaga.Ang piho nga mga clone sa phage gipadato pag-ayo sa CSF pagkahuman sa upat ka hugna sa pagpili.Ang pagsulay sa indibidwal nga mga peptide sa kandidato nagpadayag labaw pa sa 1000 ka pilo nga pagpauswag sa CSF.Ang bioactivity sa peptide-mediated delivery sa utok gipamatud-an sa 40% nga pagkunhod sa lebel sa amyloid-β sa cerebrospinal fluid gamit ang BACE1 peptide inhibitor nga nalambigit sa giila nga nobela transit peptide.Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang mga peptide nga giila sa mga pamaagi sa pagpili sa vivo phage mahimong mapuslanon nga mga sakyanan alang sa sistematikong paghatod sa mga macromolecules ngadto sa utok nga adunay therapeutic effect.
Ang panukiduki sa terapiya nga gipunting sa sentral nga sistema sa nerbiyos (CNS) labi nga nakapunting sa pag-ila sa mga na-optimize nga tambal ug mga ahente nga nagpakita sa mga kabtangan nga nagpunting sa CNS, nga adunay gamay nga paningkamot sa pagdiskobre sa mga mekanismo nga nagduso sa aktibo nga paghatud sa tambal sa utok.Nagsugod na kini sa pagbag-o karon tungod kay ang paghatud sa tambal, labi na ang dagkong mga molekula, usa ka hinungdanon nga bahin sa modernong neuroscience nga pag-uswag sa tambal.Ang palibot sa sentral nga sistema sa nerbiyos maayo nga gipanalipdan sa cerebrovascular barrier system, nga gilangkuban sa blood-brain barrier (BBB) ​​​​ug ang blood-brain barrier (BCBB)1, nga naghimo niini nga mahagiton sa paghatod sa mga droga ngadto sa utok1,2.Gibanabana nga halos tanang dagkong molekula nga mga tambal ug labaw pa sa 98% sa gagmayng molekula nga mga tambal giwagtang gikan sa utok3.Mao nga hinungdanon kaayo ang pag-ila sa mga bag-ong sistema sa transportasyon sa utok nga naghatag episyente ug piho nga paghatud sa mga tambal nga therapeutic sa CNS 4,5.Bisan pa, ang BBB ug BCSFB nagpresentar usab usa ka maayo kaayo nga oportunidad alang sa paghatud sa droga samtang sila motuhop ug mosulod sa tanan nga mga istruktura sa utok pinaagi sa daghang mga ugat niini.Busa, ang kasamtangan nga mga paningkamot sa paggamit sa non-invasive nga mga pamaagi sa paghatod ngadto sa utok kadaghanan gibase sa mekanismo sa receptor-mediated transport (PMT) gamit ang endogenous BBB6 receptor.Bisan pa sa bag-o nga mga yawe nga pag-uswag gamit ang transferrin receptor pathway7,8, gikinahanglan ang dugang nga pag-uswag sa mga bag-ong sistema sa paghatod nga adunay gipaayo nga mga kabtangan.Sa kini nga katuyoan, ang among katuyoan mao ang pag-ila sa mga peptide nga makahimo sa pagpataliwala sa transportasyon sa CSF, tungod kay kini sa prinsipyo magamit sa paghatud sa mga macromolecule sa CNS o sa pag-abli sa bag-ong mga agianan sa receptor.Sa partikular, ang mga piho nga receptor ug transporter sa cerebrovascular system (BBB ug BSCFB) mahimong magsilbing potensyal nga target alang sa aktibo ug piho nga paghatud sa mga biotherapeutic nga tambal.Ang cerebrospinal fluid (CSF) usa ka sekreto nga produkto sa choroid plexus (CS) ug direktang kontak sa interstitial fluid sa utok pinaagi sa subarachnoid space ug ventricular space4.Bag-ohay lang gipakita nga ang subarachnoid cerebrospinal fluid nagsabwag sa hilabihan ngadto sa interstitium sa utok9.Kami naglaum nga ma-access ang parenchymal space gamit kining subarachnoid inflow tract o direkta pinaagi sa BBB.Aron makab-ot kini, gipatuman namo ang usa ka lig-on nga estratehiya sa pagpili sa vivo phage nga labing maayo nga nagpaila sa mga peptide nga gidala sa bisan hain niining duha ka managlahi nga mga agianan.
Gihubit namon karon ang usa ka sunud-sunod nga pamaagi sa screening sa vivo phage nga adunay CSF sampling inubanan sa taas nga throughput sequencing (HTS) aron ma-monitor ang mga inisyal nga hugna sa pagpili nga adunay labing kataas nga pagkalainlain sa librarya.Gipahigayon ang screening sa mga conscious nga ilaga nga adunay permanente nga gitanum nga large cisterna (CM) cannula aron malikayan ang kontaminasyon sa dugo.Importante, kini nga pamaagi nagpili sa pag-target sa utok ug mga peptide nga adunay kalihokan sa transportasyon latas sa cerebrovascular barrier.Gigamit namo ang T7 phages tungod sa ilang gamay nga gidak-on (~ 60 nm) 10 ug gisugyot nga kini angay alang sa pagdala sa mga vesicle nga nagtugot sa transcellular crossing sa endothelial ug / o epithelial-medulla barrier.Pagkahuman sa upat ka hugna sa panning, ang mga populasyon sa phage gilain nga nagpakita nga kusog sa vivo CSF ​​​​enrichment ug asosasyon sa cerebral microvessel.Importante, nakahimo kami sa pagkumpirma sa among mga nahibal-an pinaagi sa pagpakita nga ang gipalabi ug chemically synthesized nga labing maayo nga mga peptide sa kandidato makahimo sa pagdala sa mga kargamento sa protina ngadto sa cerebrospinal fluid.Una, ang mga epekto sa pharmacodynamic sa CNS natukod pinaagi sa paghiusa sa usa ka nanguna nga transit peptide sa usa ka inhibitor sa BACE1 peptide.Agi og dugang sa pagpakita nga sa vivo functional screening nga mga estratehiya makaila sa nobela nga utok nga transport peptides isip epektibo nga mga cargo carriers sa protina, gilauman namo nga ang susama nga mga pamaagi sa pagpili sa pagpaandar mahimong importante usab sa pag-ila sa mga bag-ong agianan sa transportasyon sa utok.
Base sa plaque-forming units (PFU), human sa phage packaging step, usa ka librarya sa random 12-mer linear T7 phage peptides nga adunay diversity nga gibana-bana nga 109 ang gidesinyo ug gimugna (tan-awa ang Materials and Methods).Mahinungdanon nga timan-an nga among gisusi pag-ayo kini nga librarya sa wala pa sa vivo panning.Ang PCR amplification sa phage library samples gamit ang modified primers nga nakamugna og mga amplicons nga direktang magamit sa HTS (Supplementary Fig. 1a).Tungod sa a) HTS11 sequencing errors, b) epekto sa kalidad sa primers (NNK)1-12, ug c) ang presensya sa wild-type (wt) phage (skeleton inserts) sa standby library, usa ka sequence filtering procedure ang gipatuman aron makuha lamang ang verified sequence information (Supplementary Fig. 1b).Kini nga mga lakang sa pagsala magamit sa tanang HTS sequencing library.Para sa standard library, total nga 233,868 reads ang nakuha, diin 39% ang nakapasar sa filter criteria ug gigamit para sa library analysis ug selection para sa sunod nga rounds (Supplementary Figure 1c-e).Ang mga gibasa kasagaran mga multiple sa 3 base nga mga pares ang gitas-on nga adunay peak sa 36 nucleotides (Supplementary Fig. 1c), nga nagpamatuod sa disenyo sa library (NNK) 1-12.Mamatikdan, gibana-bana nga 11% sa mga miyembro sa librarya adunay sulud nga 12-dimensional wild-type (wt) backbone nga PAGISRELVDKL insert, ug hapit katunga sa mga sequence (49%) adunay sulud nga pagsal-ot o pagtangtang.Ang HTS sa librarya sa librarya nagpamatuod sa taas nga diversity sa peptides sa librarya: labaw pa sa 81% sa peptide sequences nakit-an kausa lamang ug 1.5% lamang ang nahitabo sa ≥4 nga mga kopya (Supplementary Fig. 2a).Ang mga frequency sa amino acids (aa) sa tanan nga 12 nga mga posisyon sa repertoire maayo nga may kalabutan sa mga frequency nga gipaabot alang sa gidaghanon sa mga codon nga namugna sa degenerate NKK repertoire (Supplementary Fig. 2b).Ang naobserbahan nga frequency sa aa residues nga gi-encode niini nga mga pagsal-ot maayo nga nakig-uban sa kalkulado nga frequency (r = 0.893) (Supplementary Fig. 2c).Ang pag-andam sa mga librarya sa phage alang sa indeyksiyon naglakip sa mga lakang sa pagpadako ug pagtangtang sa endotoxin.Gipakita kini kaniadto nga posibleng makunhuran ang pagkalainlain sa mga librarya sa phage12,13.Busa, among gisunod-sunod ang usa ka plate-amplified phage library nga miagi sa pagtangtang sa endotoxin ug gitandi kini sa orihinal nga librarya aron mabanabana ang frequency sa AA.Ang usa ka lig-on nga correlation (r = 0.995) naobserbahan tali sa orihinal nga pool ug sa amplified ug purified pool (Supplementary Fig. 2d), nga nagpakita nga ang kompetisyon tali sa mga clone nga gipadako sa mga plato gamit ang T7 phage wala magpahinabog dagkong bias.Kini nga pagtandi gibase sa frequency sa tripeptide motifs sa matag library, tungod kay ang diversity sa mga library (~109) dili hingpit nga makuha bisan sa HTS.Ang pag-analisa sa frequency sa aa sa matag posisyon nagpadayag sa usa ka gamay nga bias nga nagsalig sa posisyon sa katapusang tulo ka posisyon sa gisulod nga repertoire (Supplementary Fig. 2e).Sa konklusyon, nakahinapos kami nga ang kalidad ug pagkalainlain sa librarya madawat ug gamay ra nga pagbag-o sa pagkalainlain ang naobserbahan tungod sa pagpadako ug pag-andam sa mga librarya sa phage tali sa daghang mga hugna sa pagpili.
Ang serial cerebrospinal fluid sampling mahimo pinaagi sa surgically implanting sa usa ka cannula ngadto sa CM sa conscious rats aron mapadali ang pag-ila sa T7 phage nga gi-injected intravenously (iv) pinaagi sa BBB ug/o BCSFB (Fig. 1a-b).Gigamit namo ang duha ka independent selection nga mga bukton (mga bukton A ug B) sa unang tulo ka hugna sa in vivo nga pagpili (Fig. 1c).Anam-anam namong gipadako ang kahigpit sa pagpili pinaagi sa pagkunhod sa kinatibuk-ang gidaghanon sa phage nga gipaila sa unang tulo ka hugna sa pagpili.Alang sa ikaupat nga hugna sa panning, gihiusa namo ang mga sampol gikan sa mga sanga A ug B ug gihimo ang tulo ka dugang nga independente nga mga pagpili.Aron matun-an ang mga kabtangan sa vivo sa mga partikulo sa T7 phage sa kini nga modelo, ang wild-type nga phage (PAGISRELVDKL master insert) gi-inject sa mga ilaga pinaagi sa ugat sa ikog.Ang pagbawi sa mga phages gikan sa cerebrospinal fluid ug dugo sa lain-laing mga punto sa panahon nagpakita nga medyo gamay nga T7 icosahedral phages adunay paspas nga pasiunang clearance phase gikan sa kompartamento sa dugo (Supplementary Fig. 3).Base sa mga titer nga gihatag ug ang gidaghanon sa dugo sa mga ilaga, among gikalkulo nga gibana-bana lang nga 1% wt.phage gikan sa gipangalagad nga dosis namatikdan sa dugo 10 minutos human sa intravenous indeyksiyon.Pagkahuman niining inisyal nga paspas nga pagkunhod, ang usa ka hinay nga panguna nga clearance gisukod nga adunay tunga nga kinabuhi nga 27.7 minuto.Importante, gamay ra kaayo nga mga phage ang nakuha gikan sa CSF compartment, nga nagpakita sa usa ka ubos nga background alang sa wild-type nga phage migration ngadto sa CSF compartment (Supplementary Fig. 3).Sa aberids, mga 1 x 10-3% ra nga titer sa T7 phage sa dugo ug 4 x 10-8% sa una nga na-infuse nga mga phage ang nakit-an sa cerebrospinal fluid sa tibuuk nga panahon sa sampling (0-250 min).Ilabi na, ang katunga sa kinabuhi (25.7 min) sa wild-type nga phage sa cerebrospinal fluid parehas sa nakita sa dugo.Gipakita niini nga mga datos nga ang babag nga nagbulag sa kompartamento sa CSF gikan sa dugo wala’y labot sa mga ilaga nga na-cannulated sa CM, nga gitugotan sa vivo nga pagpili sa mga librarya sa phage aron mahibal-an ang mga clone nga dali nga gidala gikan sa dugo ngadto sa kompartamento sa CSF.
(a) Pag-set up ug pamaagi para sa re-sampling cerebrospinal fluid (CSF) gikan sa dako nga pool.(b) Diagram nga nagpakita sa cellular nga lokasyon sa central nervous system (CNS) barrier ug ang estratehiya sa pagpili nga gigamit sa pag-ila sa mga peptide nga motabok sa blood-brain barrier (BBB) ​​​​ug sa blood-brain barrier.(c) In vivo phage display screening flowchart.Sa matag hugna sa pagpili, ang mga phage (mga tigpaila sa hayop sa sulod sa mga pana) gi-inject sa intravenously.Duha ka independente nga alternatibo nga mga sanga (A, B) ang gitipigan nga gilain hangtod sa 4th round sa pagpili.Alang sa mga round sa pagpili 3 ug 4, ang matag clone sa phage nga gikuha gikan sa CSF manual nga gisunod.(d) Kinetics sa phage nga nahimulag gikan sa dugo (pula nga mga lingin) ug cerebrospinal fluid (green triangles) atol sa unang hugna sa pagpili sa duha ka cannulated nga mga ilaga human sa intravenous injection sa T7 peptide library (2 x 1012 phages / animal).Ang asul nga mga kwadro nagpakita sa kasagaran nga inisyal nga konsentrasyon sa phage sa dugo, nga gikalkulo gikan sa gidaghanon sa gi-injected nga phage, nga gikonsiderar ang kinatibuk-ang gidaghanon sa dugo.Ang itom nga mga kwadro nagpakita sa punto sa intersection sa y line nga extrapolated gikan sa blood phage concentrations.(e, f) Ipresentar ang relatibong frequency ug pag-apod-apod sa tanang posibleng nagsapaw-sapaw nga tripeptide motifs nga makita sa peptide.Gipakita ang gidaghanon sa mga motif nga makita sa 1000 nga pagbasa.Mahinungdanon (p <0.001) ang gipadato nga mga motibo gimarkahan og pula nga mga tulbok.(e) Correlation scatterplot nga nagtandi sa relatibong frequency sa tripeptide motif sa gi-injected nga librarya nga adunay phage nga nakuha sa dugo gikan sa mga mananap #1.1 ug #1.2.(f) Correlation scatterplot nga nagtandi sa mga paryente nga frequency sa animal phage tripeptide motifs #1.1 ug #1.2 nga nahimulag sa dugo ug cerebrospinal fluid.(g, h) Sequence ID nga representasyon sa phage nga gipadato sa dugo (g) versus injected library ug phage enriched sa CSF (h) versus blood human sa usa ka hugna sa in vivo nga pagpili sa duha ka mananap.Ang gidak-on sa usa ka letra nga kodigo nagpakita kon unsa ka subsob nga ang amino acid mahitabo sa maong posisyon.Berde = polar, purpura = neyutral, asul = sukaranan, pula = acidic ug itom = hydrophobic amino acids.Ang Figure 1a, b gidesinyo ug gihimo ni Eduard Urich.
Gi-inject namo ang usa ka phage peptide library ngadto sa duha ka CM instrument rats (clades A ug B) ug gilain nga phage gikan sa cerebrospinal fluid ug dugo (Figure 1d).Ang una nga paspas nga clearance sa librarya dili kaayo gipahayag kung itandi sa wild-type phage.Ang kasagaran nga katunga sa kinabuhi sa gi-injected nga librarya sa duha ka mga mananap mao ang 24.8 ka minuto sa dugo, susama sa wild-type nga phage, ug 38.5 ka minuto sa CSF.Ang mga sample sa phage sa dugo ug cerebrospinal fluid gikan sa matag hayop gipailalom sa HTS ug ang tanan nga giila nga mga peptide gisusi alang sa presensya sa usa ka mubo nga tripeptide motif.Gipili ang mga motibo sa tripeptide tungod kay naghatag kini usa ka gamay nga sukaranan alang sa pagporma sa istruktura ug mga interaksyon sa peptide-protein14,15.Nakaplagan namo ang usa ka maayong correlation sa pag-apod-apod sa mga motif tali sa gi-injected phage library ug mga clone nga gikuha gikan sa dugo sa duha ka mananap (Fig. 1e).Gipakita sa datos nga ang komposisyon sa librarya gamay ra nga gipadato sa kompartamento sa dugo.Ang mga frequency sa amino acid ug consensus sequences dugang gisusi sa matag posisyon gamit ang adaptation sa Weblogo16 software.Makapainteres, nakit-an namon ang usa ka kusog nga pagpauswag sa mga residu sa glycine sa dugo (Fig. 1g).Kung ang dugo gitandi sa mga clone nga gipili gikan sa CSF, ang lig-on nga pagpili ug ang pipila nga pagtangtang sa mga motif naobserbahan (Fig. 1f), ug ang pipila nga mga amino acid labi nga naa sa gitakda nang daan nga mga posisyon sa 12-member (Fig. 1h).Talagsaon, ang indibidwal nga mga hayop lahi kaayo sa cerebrospinal fluid, samtang ang pagpauswag sa glycine sa dugo nakita sa duha nga mga hayop (Supplementary Fig. 4a-j).Human sa hugot nga pagsala sa sequence data sa cerebrospinal fluid sa mga mananap # 1.1 ug # 1.2, usa ka kinatibuk-an nga 964 ug 420 nga talagsaon nga 12-mer peptides ang nakuha (Supplementary Fig. 1d-e).Ang nahilit nga mga clone sa phage gipadako ug gipailalom sa ikaduhang hugna sa pagpili sa vivo.Ang Phage nga gikuha gikan sa ikaduhang hugna sa pagpili gipailalom sa HTS sa matag mananap ug ang tanan nga giila nga mga peptide gigamit isip input sa usa ka programa sa pag-ila sa motif aron pag-analisar sa panghitabo sa tripeptide motifs (Fig. 2a, b, ef).Kung itandi sa unang siklo sa phage nga nakuha gikan sa CSF, among naobserbahan ang dugang nga pagpili ug pagtangtang sa daghang mga motif sa CSF sa mga sanga A ug B (Fig. 2).Usa ka algorithm sa pag-ila sa network gigamit aron mahibal-an kung kini nagrepresentar sa lainlaing mga sumbanan sa makanunayon nga pagkasunod-sunod.Ang usa ka tin-aw nga pagkaparehas naobserbahan tali sa 12-dimensional nga mga han-ay nga nakuha sa CSF sa alternatibong clade A (Fig. 2c, d) ug clade B (Fig. 2g, h).Ang pooled analysis sa matag sanga nagpadayag sa lain-laing mga profile sa pagpili alang sa 12-mer peptides (Supplementary Fig. 5c, d) ug usa ka pagtaas sa CSF / blood titer ratio sa paglabay sa panahon alang sa pooled clones human sa ikaduhang hugna sa pagpili kon itandi sa unang hugna sa pagpili (Supplementary Fig. 5e).).
Pagpalambo sa mga motif ug peptides sa cerebrospinal fluid pinaagi sa duha ka sunud-sunod nga hugna sa in vivo functional phage display selection.
Ang tanan nga cerebrospinal fluid phages nga nakuha gikan sa unang hugna sa matag mananap (hayop #1.1 ug #1.2) gipundok, gipadako, HT-sequenced ug reinjected sa tingub (2 x 1010 phages/animal) 2 SM cannulated ilaga (#1.1 → #).2.1 ug 2.2, 1.2 → 2.3 ug 2.4).(a, b, e, f) Correlation scatterplots nga nagtandi sa relatibong frequency sa tripeptide motifs sa tanang CSF-derived phages sa una ug ikaduhang selection rounds.Relatibo nga frequency ug pag-apod-apod sa mga motif nga nagrepresentar sa tanan nga posible nga nagsapaw-sapaw nga mga tripeptide nga nakit-an sa mga peptide sa parehas nga mga oryentasyon.Gipakita ang gidaghanon sa mga motif nga makita sa 1000 nga pagbasa.Ang mga motibo nga makahuluganon (p <0.001) gipili o wala iapil sa usa sa gitandi nga mga librarya gipasiugda sa pula nga mga tulbok.(c, d, g, h) Sequence logo representation sa tanang CSF-rich 12 amino acid long sequences base sa rounds 2 ug 1 sa in vivo selection.Ang gidak-on sa usa ka letra nga kodigo nagpakita kon unsa ka subsob nga ang amino acid mahitabo sa maong posisyon.Aron irepresentar ang logo, ang frequency sa CSF sequences nga gikuha gikan sa indibidwal nga mga mananap tali sa duha ka selection rounds gitandi ug ang enriched sequences sa ikaduhang hugna gipakita: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ug (h) #1.2–#2.4.Ang labing gipadato nga amino acid sa usa ka gihatag nga posisyon sa (c, d) mga hayop no.2.1 ug no.2.2 o (g, h) sa mga mananap no.2.3 ug no.2.4 gipakita sa kolor.Berde = polar, purpura = neyutral, asul = sukaranan, pula = acidic ug itom = hydrophobic amino acids.
Human sa ikatulong hugna sa pagpili, among giila ang 124 ka talagsaong peptide sequence (#3.1 ug #3.2) gikan sa 332 CSF-reconstituted phage clones nga nahimulag gikan sa duha ka mananap (Supplementary Fig. 6a).Ang han-ay sa LGSVS (18.7%) adunay pinakataas nga paryente nga proporsiyon, gisundan sa mga wild-type nga pagsal-ot PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ug SARGSWREIVSLS (2.2%).Sa kataposang ikaupat nga hugna, among gitigom ang duha ka independenteng pinili nga mga sanga gikan sa tulo ka managlahing mananap (Fig. 1c).Sa 925 nga sequenced phage clones nga nakuha gikan sa CSF, sa ikaupat nga hugna nakit-an namo ang 64 ka talagsaon nga peptide sequences (Supplementary Fig. 6b), diin ang paryente nga proporsyon sa wild-type nga phage nahulog sa 0.8%.Ang kasagarang mga clone sa CSF sa ikaupat nga hugna mao ang LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ug RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Ang gitas-on nga han-ay sa mga pinili nga peptides tungod sa nucleotide insertions/deletions o premature stop codons sa library primers sa diha nga ang paggamit sa degenerate codons alang sa NNK library design.Ang ahat nga paghunong nga mga codon makamugna og mas mugbo nga mga peptide ug gipili tungod kay kini adunay paborableng aa motif.Ang mas taas nga mga peptide mahimong moresulta gikan sa pagsal-ot/pagtangtang sa mga primer sa sintetikong librarya.Gibutang niini ang gidesinyo nga stop codon sa gawas sa frame ug gibasa kini hangtod nga adunay bag-ong stop codon nga makita sa ubos.Sa kinatibuk-an, among gikalkulo ang mga hinungdan sa pagpauswag alang sa tanan nga upat ka mga hugna sa pagpili pinaagi sa pagtandi sa data sa input sa datos sa sampol nga output.Para sa unang hugna sa screening, migamit mig wild-type phage titers isip non-specific background reference.Makapainteres, ang pagpili sa negatibo nga phage kusog kaayo sa unang siklo sa CSF, apan dili sa dugo (Fig. 3a), nga mahimong tungod sa ubos nga kalagmitan sa passive diffusion sa kadaghanan sa mga miyembro sa peptide library ngadto sa CSF compartment o relative phages lagmit nga mas episyente nga gipabilin o gikuha gikan sa bloodstream kay sa bacteriophage.Bisan pa, sa ikaduhang hugna sa panning, ang lig-on nga pagpili sa mga phages sa CSF naobserbahan sa duha ka clades, nga nagsugyot nga ang miaging hugna gipadato sa mga phages nga nagpakita sa mga peptide nga nagpasiugda sa CSF uptake (Fig. 3a).Pag-usab, nga walay mahinungdanon nga pagpadato sa dugo.Usab sa ikatulo ug ikaupat nga hugna, ang mga clone sa phage labi nga gipadato sa CSF.Ang pagtandi sa relatibong frequency sa matag talagsaon nga pagkasunod-sunod sa peptide tali sa katapusang duha ka hugna sa pagpili, among nakita nga ang mga han-ay labi pa nga napauswag sa ikaupat nga hugna sa pagpili (Fig. 3b).Usa ka kinatibuk-an nga 931 tripeptide motifs ang nakuha gikan sa tanan nga 64 ka talagsaon nga peptide sequence gamit ang duha ka peptide orientation.Ang labing gipadato nga mga motif sa ikaupat nga hugna mas gisusi pag-ayo alang sa ilang mga profile sa pagpauswag sa tanan nga mga hugna kumpara sa gi-injected nga librarya (giputol: 10% nga pagpauswag) (Supplementary Fig. 6c).Ang kinatibuk-ang mga sumbanan sa pagpili nagpakita nga kadaghanan sa gitun-an nga mga motibo gipadato sa tanan nga nangaging mga hugna sa duha ka mga sanga sa pagpili.Bisan pa, ang pipila nga mga motif (eg SGL, VSG, LGS GSV) kasagaran gikan sa alternatibong clade A, samtang ang uban (eg FGW, RTN, WGF, NTR) gipadato sa alternatibong clade B.
Pag-validate sa CSF nga transportasyon sa CSF-enriched phage-displayed peptides ug biotinylated leader peptides nga gihugpong sa streptavidin payloads.
(a) Enrichment ratios kalkulado sa tanang upat ka rounds (R1-R4) base sa injected (input = I) phage (PFU) titers ug determinado CSF ​​phage titers (output = O).Ang mga hinungdan sa pagpauswag sa katapusang tulo ka hugna (R2-R4) gikalkulo pinaagi sa pagtandi sa miaging hugna ug sa unang hugna (R1) nga adunay datos sa gibug-aton.Ang mga bukas nga bar mao ang cerebrospinal fluid, ang mga shaded bar mao ang plasma.(***p<0.001, base sa t-test sa Estudyante).(b) Listahan sa pinakadaghang phage peptides, nga giranggo sumala sa ilang paryente nga proporsiyon sa tanang phage nga nakolekta sa CSF human sa round 4 sa pagpili.Ang unom ka kasagarang mga clone sa phage gipasiugda sa kolor, gi-numero ug ang ilang mga hinungdan sa pagpalambo tali sa mga hugna 3 ug 4 sa pagpili (inset).(c, d) Ang unom ka labing gipadato nga phage clones, walay sulod nga phage ug parental phage peptide nga mga librarya gikan sa round 4 gisusi sa tagsa-tagsa sa usa ka CSF sampling model.Ang CSF ug mga sample sa dugo gikolekta sa gipakita nga mga punto sa oras.(c) Parehas nga kantidad sa 6 ka kandidato phage clone (2 x 1010 phages/hayop), walay sulod nga phages (#1779) (2 x 1010 phages/animals) ug stock phage peptide libraries (2 x 1012 phages/animals) I-inject ang labing menos 3 CM nga ipangalagad pinaagi sa linain nga mananap.Ang CSF pharmacokinetics sa matag gi-injected nga phage clone ug phage peptide library sa paglabay sa panahon gipakita.(d) nagpakita sa kasagaran nga ratio sa CSF/dugo para sa tanang nabawi nga phages/mL sa panahon sa sampling.(e) Upat ka synthetic leader peptides ug usa ka scrambled control ang nalambigit sa biotin ngadto sa streptavidin pinaagi sa ilang N-terminus (tetramer display) nga gisundan sa injection (tail vein iv, 10 mg streptavidin/kg).Labing menos tulo ka intubated nga ilaga (N = 3).).Ang mga sampol sa CSF gikolekta sa gipakita nga mga punto sa oras ug ang mga konsentrasyon sa streptavidin gisukod sa CSF anti-streptavidin ELISA (nd = wala makit-an).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, base sa ANOVA test).(f) Pagtandi sa han-ay sa amino acid sa labing gipadato nga phage peptide clone #2002 (purple) uban sa ubang pinili nga phage peptide clone gikan sa 4th round sa pagpili.Ang parehas ug parehas nga mga tipik sa amino acid adunay kolor nga code.
Sa tanan nga enriched phages sa ikaupat nga hugna (Fig. 3b), unom ka kandidato nga clone ang gipili alang sa dugang nga indibidwal nga pagtuki sa CSF sampling model.Ang patas nga kantidad sa unom ka kandidato nga phage, walay sulod nga phage (walay insert) ug prophage peptide nga mga librarya gi-injected ngadto sa tulo ka cannulated CM nga mga mananap, ug ang mga pharmacokinetics gitino sa CSF (Fig. 3c) ug dugo (Supplementary Fig. 7) assays.Ang tanan nga phage clones nga gisulayan gipunting ang CSF compartment sa lebel nga 10-1000 ka pilo nga mas taas kaysa sa walay sulod nga control phage (#1779).Pananglitan, ang mga clone #2020 ug #2077 adunay mga 1000 ka beses nga mas taas nga titer sa CSF kaysa control phage.Ang pharmacokinetic profile sa matag pinili nga peptide lahi, apan silang tanan adunay taas nga CSF homing nga abilidad.Naobserbahan namon ang kanunay nga pagkunhod sa paglabay sa panahon alang sa mga clone #1903 ug #2011, samtang alang sa mga clone #2077, #2002 ug #2009 ang pagtaas sa una nga 10 minuto mahimong magpakita sa aktibo nga transportasyon apan kinahanglan nga mapamatud-an.Ang mga clone #2020, #2002, ug #2077 nag-stabilize sa taas nga lebel, samtang ang konsentrasyon sa CSF sa clone #2009 hinayhinay nga mikunhod pagkahuman sa una nga pagtaas.Gikumpara dayon namo ang relatibong frequency sa matag kandidato sa CSF nga adunay konsentrasyon sa dugo niini (Fig. 3d).Ang correlation sa mean titer sa matag kandidato sa CSF uban sa titer sa dugo niini sa tanang panahon sa sampling nagpakita nga tulo sa unom ka mga kandidato ang gipadato pag-ayo sa CSF sa dugo.Makapainteres, ang clone #2077 nagpakita sa mas taas nga kalig-on sa dugo (Supplementary Figure 7).Aron mapamatud-an nga ang mga peptide mismo makahimo sa aktibong pagdala sa mga kargamento gawas sa mga partikulo sa phage ngadto sa kompartamento sa CSF, among gi-synthesize ang upat ka mga lider nga peptides nga nakuha sa biotin sa N-terminus diin ang mga peptide nagtapot sa partikulo sa phage.Ang biotinylated peptides (nos. 2002, 2009, 2020 ug 2077) gi-conjugated sa streptavidin (SA) aron makakuha og multimeric nga mga porma nga medyo nagsundog sa phage geometry.Kini nga format nagtugot usab kanamo sa pagsukod sa SA exposure sa dugo ug cerebrospinal fluid isip cargo-transporting protein peptides.Importante, ang datos sa phage kanunay nga makopya kung ang mga sintetikong peptide gipangalagad niining SA-conjugated format (Fig. 3e).Ang mga scrambled peptides adunay gamay nga inisyal nga pagkaladlad ug mas paspas nga CSF clearance nga dili mamatikdan nga lebel sulod sa 48 ka oras.Aron makakuha og pagsabot sa mga agianan sa paghatod niining mga peptide phage clones ngadto sa CSF space, among gi-analisa ang localization sa tagsa-tagsa nga phage peptide hits gamit ang immunohistochemistry (IHC) aron direktang makit-an ang mga partikulo sa phage 1 ka oras human sa intravenous injection sa vivo.Ilabi na, ang mga clone #2002, #2077, ug #2009 mahimong makit-an pinaagi sa kusog nga pagmantsa sa mga capillary sa utok, samtang ang control phage (#1779) ug clone #2020 wala makit-an (Supplementary Figure 8).Kini nagsugyot nga kini nga mga peptide nakatampo sa epekto sa utok nga tukma pinaagi sa pagtabok sa BBB.Ang dugang nga detalyado nga pagtuki gikinahanglan aron masulayan kini nga pangagpas, tungod kay ang ruta sa BSCFB mahimo usab nga maapil.Kung itandi ang pagkasunod-sunod sa amino acid sa labing gipaayo nga clone (#2002) sa ubang mga pinili nga peptides, namatikdan nga ang uban niini adunay parehas nga mga extension sa amino acid, nga mahimo’g magpakita sa parehas nga mekanismo sa transportasyon (Fig. 3f).
Tungod sa talagsaon nga profile sa plasma niini ug mahinungdanon nga pag-uswag sa CSF sa paglabay sa panahon, ang phage display clone #2077 dugang nga gisusi sa mas taas nga 48-oras nga panahon ug nakahimo sa pagkopya sa paspas nga pagtaas sa CSF nga naobserbahan uban sa padayon nga lebel sa SA (Fig. 4a).Mahitungod sa uban pang giila nga mga clone sa phage, ang #2077 nahugawan pag-ayo alang sa mga capillary sa utok ug nagpakita sa mahinungdanong colocalization nga adunay capillary marker lectin kung gitan-aw sa mas taas nga resolusyon ug posible nga pipila nga pagmantsa sa parenchymal space (Figure 4b).Aron masusi kung ang peptide-mediated pharmacological effects mahimong makuha sa CNS, naghimo kami usa ka eksperimento diin ang biotinylated nga mga bersyon sa i) ang #2077 transit peptide ug ii) ang BACE1 inhibitor peptide gisagol sa SA sa duha ka lainlaing ratios.Alang sa usa ka kombinasyon gigamit ra namon ang BACE1 peptide inhibitor ug alang sa lain gigamit namon ang 1: 3 nga ratio sa BACE1 peptide inhibitor sa #2077 peptide.Ang duha nga mga sample gipangalagad sa intravenously ug ang lebel sa dugo ug cerebrospinal fluid sa beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) gisukod sa paglabay sa panahon.Ang Abeta40 gisukod sa CSF tungod kay kini nagpakita sa BACE1 nga pagdili sa parenchyma sa utok.Sama sa gipaabut, ang duha nga mga komplikado labi nga nakunhuran ang lebel sa dugo sa Abeta40 (Fig. 4c, d).Bisan pa, ang mga sample lamang nga adunay sulud nga peptide no.2077 ug usa ka inhibitor sa BACE1 peptide conjugated sa SA hinungdan sa usa ka mahinungdanon nga pagkunhod sa Abeta40 sa cerebrospinal fluid (Fig. 4c).Gipakita sa datos nga ang peptide no.Ang 2077 makahimo sa pagdala sa 60 kDa SA nga protina ngadto sa CNS ug usab nag-aghat sa mga epekto sa pharmacological sa SA-conjugated inhibitors sa BACE1 peptide.
(a) Clonal injection (2 × 10 phages / animal) sa T7 phage nga nagpakita sa long-term pharmacokinetic profiles sa CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLLSGC) ug uninjected control phage (#1779) sa labing menos tulo ka CM-intubated nga mga ilaga.(b) Confocal microscopic nga hulagway sa representante nga cortical microvessels sa phage-injected nga mga ilaga (2 × 10 10 phages / animal) nga nagpakita sa counterstaining sa peptide #2077 ug mga sudlanan (lectin).Kini nga mga clone sa phage gihatag sa 3 nga mga ilaga ug gitugotan nga mag-circulate sulod sa 1 ka oras sa wala pa ang perfusion.Ang mga utok gibahin ug gimantsa sa polyclonal FITC-labeled antibodies batok sa T7 phage capsid.Napulo ka minuto sa wala pa ang perfusion ug ang sunod nga pag-ayo, ang DyLight594 nga adunay label nga lectin gipadapat sa intravenously.Fluorescent nga mga hulagway nga nagpakita sa lectin staining (pula) sa luminal nga bahin sa microvessels ug phages (berde) sa lumen sa mga capillaries ug perivascular nga tisyu sa utok.Ang scale bar katumbas sa 10 µm.(c, d) Ang Biotinylated BACE1 inhibitory peptide nga nag-inusara o sa kombinasyon sa biotinylated transit peptide #2077 giubanan sa streptavidin nga gisundan sa intravenous injection sa labing menos tulo ka cannulated CM rats (10 mg streptavidin / kg).Ang BACE1 peptide inhibitor-mediated reduction sa Aβ40 gisukod sa Aβ1-40 ELISA sa dugo (pula) ug cerebrospinal fluid (orange) sa gipakita nga mga punto sa oras.Alang sa mas maayong katin-awan, usa ka tuldok-tuldok nga linya ang gilaraw sa graph sa sukod nga 100%.(c) Porsiyento nga pagkunhod sa Aβ40 sa dugo (pula nga triangles) ug cerebrospinal fluid (orange triangles) sa mga ilaga nga gitambalan sa streptavidin conjugated sa transit peptide #2077 ug BACE1 inhibitory peptide sa 3: 1 ratio.(d) Porsiyento nga pagkunhod sa dugo Aβ40 (pula nga mga lingin) ug cerebrospinal fluid (orange nga mga sirkulo) sa mga ilaga nga gitambalan sa streptavidin inubanan sa BACE1 inhibitory peptide lamang.Ang konsentrasyon sa Aβ sa kontrol mao ang 420 pg / ml (standard deviation = 101 pg / ml).
Ang pagpasundayag sa Phage malampusong nagamit sa daghang mga bahin sa biomedical nga panukiduki17.Kini nga pamaagi gigamit alang sa vivo vascular diversity studies18,19 ingon man sa mga pagtuon nga nagtumong sa cerebral vessels20,21,22,23,24,25,26.Sa kini nga pagtuon, gipalapdan namon ang aplikasyon sa kini nga pamaagi sa pagpili dili lamang sa direkta nga pag-ila sa mga peptide nga nagpunting sa mga cerebral vessel, apan usab sa pagdiskobre sa mga kandidato nga adunay aktibo nga mga kabtangan sa transportasyon aron makatabok sa babag sa dugo-utok.Gihubit na namo karon ang pagpalambo sa usa ka pamaagi sa pagpili sa vivo sa CM intubated nga mga ilaga ug gipakita ang potensyal niini sa pag-ila sa mga peptide nga adunay CSF homing properties.Gamit ang T7 phage nga nagpakita sa usa ka librarya sa 12-mer random peptides, among napakita nga ang T7 phage gamay ra (gibana-bana nga 60 nm ang diyametro)10 nga ipahiangay sa babag sa utok sa dugo, sa ingon direkta nga makatabok sa babag sa dugo-utok o choroid plexus.Naobserbahan namon nga ang pag-ani sa CSF gikan sa cannulated CM rats usa ka maayo nga kontrolado sa vivo functional screening nga pamaagi, ug nga ang gikuha nga phage dili lamang gigapos sa vasculature apan naglihok usab isip transporter tabok sa blood-brain barrier.Dugang pa, pinaagi sa dungan nga pagkolekta sa dugo ug pag-apply sa HTS sa CSF ​​ug mga phage nga nakuha sa dugo, among gipamatud-an nga ang among pagpili sa CSF wala maimpluwensyahan sa pagpauswag sa dugo o kaarang sa pagpalapad tali sa mga hugna sa pagpili.Bisan pa, ang kompartamento sa dugo usa ka bahin sa pamaagi sa pagpili, tungod kay ang mga phage nga makahimo sa pagkab-ot sa kompartamento sa CSF kinahanglan nga mabuhi ug mag-circulate sa agos sa dugo nga igo na aron mapauswag ang ilang kaugalingon sa utok.Aron makuha ang kasaligan nga kasayuran sa pagkasunod-sunod gikan sa hilaw nga datos sa HTS, gipatuman namon ang mga pagsala nga gipahiangay sa mga sayup sa pagkasunod-sunod nga piho sa platform sa pag-analisa sa workflow.Pinaagi sa pag-apil sa mga kinetic parameter sa pamaagi sa screening, among gikumpirma ang paspas nga mga pharmacokinetics sa wild-type nga T7 phages (t½ ~ 28 min) sa dugo24, 27, 28 ug gitino usab ang ilang katunga sa kinabuhi sa cerebrospinal fluid (t½ ~ 26 min) matag minuto).Bisan pa sa parehas nga mga profile sa pharmacokinetic sa dugo ug CSF, 0.001% ra sa konsentrasyon sa dugo sa phage ang makit-an sa CSF, nga nagpaila sa ubos nga paglihok sa background sa wild-type nga T7 phage tabok sa babag sa dugo-utok.Gipasiugda sa kini nga trabaho ang kahinungdanon sa una nga hugna sa pagpili kung gigamit ang mga estratehiya sa panning sa vivo, labi na alang sa mga sistema sa phage nga paspas nga natangtang gikan sa sirkulasyon, tungod kay pipila ka mga clone ang makaabut sa kompartamento sa CNS.Busa, sa unang hugna, ang pagkunhod sa pagkalain-lain sa librarya dako kaayo, tungod kay limitado ra nga gidaghanon sa mga clone ang nakolekta sa katapusan niining estrikto kaayo nga modelo sa CSF.Kini sa vivo panning nga estratehiya naglakip sa pipila ka mga lakang sa pagpili sama sa aktibong pagtipon sa CSF compartment, clone survival sa blood compartment, ug paspas nga pagtangtang sa T7 phage clones gikan sa dugo sulod sa unang 10 minutos (Fig. 1d ug Supplementary Fig. 4M).).Busa, human sa unang hugna, lain-laing mga clone sa phage ang giila sa CSF, bisan tuod ang samang inisyal nga pool gigamit alang sa tagsa-tagsa nga mga mananap.Kini nagsugyot nga daghang higpit nga mga lakang sa pagpili alang sa gigikanan nga mga librarya nga adunay daghang mga miyembro sa librarya nga nagresulta sa usa ka hinungdanon nga pagkunhod sa pagkalainlain.Busa, ang mga random nga panghitabo mahimong usa ka bahin sa inisyal nga proseso sa pagpili, nga makaimpluwensya sa resulta.Lagmit nga daghan sa mga clone sa orihinal nga librarya adunay susama kaayo nga CSF enrichment propensity.Bisan pa, bisan sa ilawom sa parehas nga mga kondisyon sa eksperimento, ang mga resulta sa pagpili mahimong magkalainlain tungod sa gamay nga gidaghanon sa matag partikular nga clone sa una nga pool.
Ang mga motibo nga gipadato sa CSF lahi sa mga naa sa dugo.Makapainteres, among namatikdan ang una nga pagbalhin padulong sa glycine-rich peptides sa dugo sa indibidwal nga mga hayop.(Fig. 1g, Supplementary Fig. 4e, 4f).Ang Phage nga adunay sulod nga glycine peptides mahimong mas lig-on ug dili kaayo makuha gikan sa sirkulasyon.Bisan pa, kini nga mga peptide nga puno sa glycine wala makit-an sa mga sample sa cerebrospinal fluid, nga nagsugyot nga ang mga na-curate nga librarya miagi sa duha ka lainlaing mga lakang sa pagpili: usa sa dugo ug ang lain gitugotan nga magtigum sa cerebrospinal fluid.Ang mga clone nga gipadato sa CSF nga resulta sa ikaupat nga hugna sa pagpili kay gisulayan pag-ayo.Halos tanan nga mga indibidwal nga gisulayan nga mga clone gikumpirma nga gipadato sa CSF kumpara sa blangko nga control phage.Usa ka peptide hit (#2077) gisusi sa mas detalyado.Nagpakita kini og mas taas nga tunga sa kinabuhi sa plasma kumpara sa ubang mga hit (Figure 3d ug Supplementary Figure 7), ug makapaikag, kini nga peptide adunay usa ka cysteine ​​​​residue sa C-terminus.Bag-o lang gipakita nga ang pagdugang sa cysteine ​​​​sa peptides makapauswag sa ilang mga kabtangan sa pharmacokinetic pinaagi sa pagbugkos sa albumin 29.Wala pa kini nahibal-an karon alang sa peptide #2077 ug nanginahanglan dugang nga pagtuon.Ang ubang mga peptide nagpakita sa usa ka valence-dependency sa CSF enrichment (data nga wala gipakita), nga mahimong may kalabutan sa gipakita nga surface geometry sa T7 capsid.Ang T7 nga sistema nga among gigamit nagpakita sa 5-15 ka kopya sa matag peptide kada phage nga partikulo.Ang IHC gihimo sa mga kandidato nga lead phage clone nga gi-inject sa intravenously ngadto sa cerebral cortex sa mga ilaga (Supplementary Fig. 8).Ang datos nagpakita nga labing menos tulo ka clone (No. 2002, No. 2009 ug No. 2077) ang nakig-interact sa BBB.Nagpabilin kini aron mahibal-an kung kini nga interaksyon sa BBB nagresulta sa pagtipon sa CSF o ang paglihok sa kini nga mga clone direkta sa BCSFB.Importante, gipakita namo nga ang mga pinili nga peptide nagpabilin sa ilang kapasidad sa transportasyon sa CSF kung gi-synthesize ug gigapos sa kargamento sa protina.Ang pagbugkos sa N-terminal biotinylated peptides ngadto sa SA esensya nagsubli sa mga resulta nga nakuha sa ilang tagsa-tagsa ka phage clones sa dugo ug cerebrospinal fluid (Fig. 3e).Sa katapusan, gipakita namo nga ang lead peptide #2077 makahimo sa pagpalambo sa utok nga aksyon sa usa ka biotinylated peptide inhibitor sa BACE1 conjugated sa SA, hinungdan sa paglitok pharmacodynamic epekto sa CNS pinaagi sa kamahinungdanon pagkunhod sa Abeta40 nga lebel sa CSF (Fig. 4).Wala kami makaila sa bisan unsang mga homologue sa database pinaagi sa paghimo sa usa ka peptide sequence homology search sa tanan nga mga hit.Mahinungdanon nga matikdan nga ang gidak-on sa librarya sa T7 gibana-bana nga 109, samtang ang gidak-on sa teoretikal nga librarya alang sa 12-mers mao ang 4 x 1015. Busa, gipili lamang namo ang usa ka gamay nga tipik sa diversity space sa 12-mer peptide library, nga mahimong magpasabot nga ang mas na-optimize nga mga peptide mahimong mailhan pinaagi sa pagtimbang-timbang sa mga kasikbit nga han-ay niini.Sa hypothetically, usa sa mga hinungdan ngano nga wala kami nakit-an nga bisan unsang natural nga mga homologue sa kini nga mga peptide mahimo nga pagtangtang sa pagpili sa panahon sa ebolusyon aron mapugngan ang dili makontrol nga pagsulod sa pipila nga mga motibo sa peptide sa utok.
Gihiusa, ang among mga resulta naghatag usa ka sukaranan alang sa umaabot nga trabaho aron mahibal-an ug mailhan ang mga sistema sa transportasyon sa babag sa cerebrovascular sa vivo sa mas detalyado.Ang sukaranan nga pag-setup niini nga pamaagi gibase sa usa ka functional nga estratehiya sa pagpili nga dili lamang nagpaila sa mga clone nga adunay mga kabtangan sa pagbugkos sa cerebral vascular, apan naglakip usab sa usa ka kritikal nga lakang diin ang malampuson nga mga clone adunay intrinsic nga kalihokan aron makatabok sa biolohikal nga mga babag sa vivo ngadto sa CNS compartment.mao ang pagpatin-aw sa mekanismo sa pagdala niini nga mga peptide ug ang ilang gusto sa pagbugkos sa microvasculature nga espesipiko sa rehiyon sa utok.Kini mahimong mosangpot sa pagkadiskobre sa bag-ong mga agianan alang sa transportasyon sa BBB ug mga receptor.Gipaabut namon nga ang giila nga mga peptide mahimong direkta nga magbugkos sa mga cerebrovascular receptor o sa mga naglibot nga ligand nga gidala pinaagi sa BBB o BCSFB.Ang mga peptide vector nga adunay kalihokan sa transportasyon sa CSF nga nadiskubre sa kini nga trabaho dugang nga imbestigahan.Gisusi namon karon ang espesipiko sa utok niini nga mga peptide alang sa ilang abilidad sa pagtabok sa BBB ug / o BCSFB.Kini nga mga bag-ong peptides mahimong labi ka bililhon nga mga himan alang sa potensyal nga pagdiskobre sa bag-ong mga receptor o mga agianan ug alang sa pagpauswag sa bag-ong labi ka episyente nga mga plataporma alang sa paghatud sa mga macromolecule, sama sa biologics, sa utok.
Cannulate ang dako nga cisterna (CM) gamit ang usa ka pagbag-o sa gihulagway kaniadto nga pamaagi.Ang gi-anesthetized nga Wistar nga mga ilaga (200-350 g) gibutang sa usa ka stereotaxic apparatus ug usa ka median incision ang gihimo sa ibabaw sa gikiskisan ug giandam nga aseptiko nga panit sa bagulbagol aron ibutyag ang bagolbagol.Pag-drill sa duha ka mga lungag sa lugar sa ibabaw nga sash ug ihigot ang mga screw sa mga lungag.Usa ka dugang nga lungag ang gibansay sa lateral occipital crest alang sa stereotactic nga giya sa usa ka stainless steel cannula ngadto sa CM.Ibutang ang semento sa ngipon sa palibot sa cannula ug i-secure gamit ang mga screw.Human sa photo-curing ug pagpagahi sa semento, ang samad sa panit gisirhan gamit ang 4/0 supramid suture.Ang husto nga pagbutang sa cannula gipamatud-an sa kusog nga pagtulo sa cerebrospinal fluid (CSF).Kuhaa ang ilaga gikan sa stereotaxic apparatus, makadawat og tukma nga postoperative nga pag-atiman ug pagdumala sa kasakit, ug tugoti kini nga maulian sulod sa labing menos usa ka semana hangtud nga makita ang mga timailhan sa dugo sa cerebrospinal fluid.Ang mga ilaga sa Wistar (Crl:WI/Han) nakuha gikan sa Charles River (France).Ang tanan nga mga ilaga gitipigan ubos sa piho nga kondisyon nga walay pathogen.Ang tanan nga mga eksperimento sa mananap giaprobahan sa Veterinary Office sa Lungsod sa Basel, Switzerland, ug gihimo sumala sa Animal License No. 2474 (Assessment of Active Brain Transport by Measuring Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat).
Hinayhinay nga itago ang ilaga nga mahunahunaon sa CM cannula sa kamot.Kuhaa ang Datura gikan sa cannula ug kolektaha ang 10 µl nga kusog nga nagaagay nga cerebrospinal fluid.Tungod kay ang patency sa cannula sa katapusan nakompromiso, ang tin-aw nga cerebrospinal fluid sample nga walay ebidensya sa kontaminasyon sa dugo o pagkausab sa kolor ang gilakip niini nga pagtuon.Sa susama, gibana-bana nga 10-20 μl nga dugo gikuha gikan sa usa ka gamay nga incision sa tumoy sa ikog ngadto sa mga tubo nga adunay heparin (Sigma-Aldrich).Ang CSF ug dugo nakolekta sa lainlaing mga punto sa oras pagkahuman sa intravenous injection sa T7 phage.Gibana-bana nga 5-10 μl sa fluid ang gilabay sa wala pa ang matag sample sa CSF nga nakolekta, nga katumbas sa patay nga gidaghanon sa catheter.
Ang mga librarya gihimo gamit ang T7Select 10-3b vector nga gihulagway sa T7Select system manual (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Sa laktod, usa ka random nga 12-mer DNA insert ang gi-synthesize sa mosunod nga format:
Ang NNK codon gigamit sa paglikay sa double stop codons ug amino acid overexpression sa insert.Ang N usa ka manually mixed equimolar ratio sa matag nucleotide, ug ang K usa ka manually mixed equimolar ratio sa adenine ug cytosine nucleotides.Ang mga single stranded nga rehiyon nakabig ngadto sa double stranded DNA pinaagi sa dugang nga paglumlum sa dNTP (Novagen) ug Klenow enzyme (New England Biolabs) sa Klenow buffer (New England Biolabs) sulod sa 3 ka oras sa 37 ° C.Human sa reaksyon, ang double-stranded DNA nakuha pinaagi sa EtOH precipitation.Ang resulta nga DNA natunaw sa mga restriction enzymes EcoRI ug HindIII (parehong gikan sa Roche).Ang cleaved ug purified (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligase, New England Biolabs) dayon gi-ligated in-frame ngadto sa pre-cleaved T7 vector human sa amino acid 348 sa 10B capsid gene.Ang mga reaksyon sa ligation gilumlum sa 16 ° C. sulod sa 18 ka oras sa wala pa ang in vitro packaging.Ang pagputos sa Phage sa vitro gihimo sumala sa mga instruksyon nga gihatag sa T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) ug ang solusyon sa pagputos gipadako sa makausa sa lysis gamit ang Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Ang mga lysates gi-centrifuged, titrated ug frozen sa -80° C. isip stock solution sa glycerol.
Direkta nga PCR amplification sa phage variable nga mga rehiyon nga gipadako sa sabaw o plato gamit ang proprietary 454/Roche-amplicon fusion primers.Ang forward fusion primer naglangkob sa mga han-ay nga nag-flanking sa variable region (NNK) 12 (template-specific), GS FLX Titanium Adapter A, ug usa ka four-base library key sequence (TCAG) (Supplementary Figure 1a):
Ang reverse fusion primer naglangkob usab sa biotin nga gilakip aron makuha ang mga beads ug ang GS FLX Titanium Adapter B nga gikinahanglan alang sa clonal amplification atol sa emulsion PCR:
Ang mga amplicon gipailalom dayon sa 454/Roche pyrosequencing sumala sa 454 GS-FLX Titanium protocol.Para sa manwal nga Sanger sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ang T7 phage DNA gipadako pinaagi sa PCR ug gisunod-sunod sa mosunod nga mga pares sa primer:
Ang mga insert gikan sa indibidwal nga mga plake gipailalom sa PCR amplification gamit ang Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (sumala sa mga instruksyon sa tiggama).Paghimo og init nga pagsugod (10 min sa 95 °C) ug 35 boost cycles (50 s sa 95 °C, 1 min sa 50 °C, ug 1 min sa 72 °C).
Ang Phage gikan sa mga librarya, wild-type nga phage, phage nga naluwas gikan sa CSF ug dugo, o indibidwal nga mga clone gipadako sa Escherichia coli BL5615 sa sabaw sa TB (Sigma Aldrich) o sa 500 cm2 nga mga pinggan (Thermo Scientific) sulod sa 4 ka oras sa 37 ° C.Ang Phage gikuha gikan sa mga plato pinaagi sa paghugas sa mga plato gamit ang Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) o pinaagi sa pagkolekta sa mga plake nga adunay sterile pipette tip.Ang Phage gilain gikan sa supernatant sa kultura o extraction buffer nga adunay usa ka hugna sa polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) ug gisuspinde sa Tris-EDTA buffer.
Ang amplified phage gipailalom sa 2-3 rounds sa endotoxin removal gamit ang endotoxin removal beads (Miltenyi Biotec) sa wala pa ang intravenous (IV) injection (500 μl/animal).Sa unang hugna, ang 2 × 1012 phages gipaila;sa ikaduha, 2 × 1010 phages;sa ikatulo ug ikaupat nga round sa pagpili, 2 × 109 phages matag mananap.Ang sulud sa Phage sa CSF ug mga sample sa dugo nga nakolekta sa gipakita nga mga punto sa oras gitino pinaagi sa pag-ihap sa plake sumala sa mga panudlo sa tiggama (T7Select system manual).Ang pagpili sa Phage gihimo pinaagi sa intravenous injection sa giputli nga mga librarya ngadto sa tail vein o pinaagi sa re-injection sa phage nga gikuha gikan sa CSF gikan sa miaging selection round, ug ang sunod nga pag-ani gihimo sa 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, ug 240 min sample sa dugo.Kinatibuk-ang upat ka hugna sa in vivo panning ang gihimo diin ang duha ka pinili nga mga sanga gilain nga gitipigan ug gianalisa sa unang tulo ka hugna sa pagpili.Ang tanan nga pagsal-ot sa phage nga gikuha gikan sa CSF gikan sa unang duha ka hugna sa pagpili gipailalom sa 454/Roche pyrosequencing, samtang ang tanang mga clone nga gikuha gikan sa CSF gikan sa katapusang duha ka hugna sa pagpili gisunod-sunod.Ang tanang blood phages gikan sa unang hugna sa pagpili gipailalom usab sa 454/Roche pyrosequencing.Alang sa pag-injection sa mga clone sa phage, ang pinili nga mga phage gipadako sa E. coli (BL5615) sa 500 cm2 nga mga plato sa 37 ° C sulod sa 4 ka oras.Ang tagsa-tagsa nga pinili ug mano-mano nga pagkasunodsunod nga mga clone gipakaylap sa TB medium.Human sa phage extraction, pagputli ug pagtangtang sa endotoxin (sama sa gihulagway sa ibabaw), 2 × 1010 phages/hayop sa 300 μl gi-injected intravenously ngadto sa usa ka ikog ugat.
Preprocessing ug qualitative filtering sa sequence data.Ang Raw 454/Roche nga datos gi-convert gikan sa binary standard stream map format (sff) ngadto sa Pearson human readable format (fasta) gamit ang vendor software.Ang dugang nga pagproseso sa han-ay sa nucleotide gihimo gamit ang proprietary C nga mga programa ug mga script (wala pa gipagawas nga software package) sama sa gihulagway sa ubos.Ang pagtuki sa panguna nga datos naglakip sa estrikto nga multi-stage nga mga pamaagi sa pagsala.Aron ma-filter ang mga basahon nga wala'y sulod nga balido nga 12mer insert DNA sequence, ang mga pagbasa sunod-sunod nga gi-align sa pagsugod sa label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop label (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ug background insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) gamit ang global Needleman-Wunsch test.pag-align nga nagtugot sa hangtod sa 2 nga mga inconsistencies matag alignment31.Busa, ang mga pagbasa nga walay pagsugod ug paghunong sa mga tag ug mga basahon nga adunay sulod nga background inserts, ie, alignment nga milapas sa gitugot nga gidaghanon sa mismatches, gikuha gikan sa librarya.Mahitungod sa nahabilin nga mga pagbasa, ang N-mer DNA sequence nga nagsugod gikan sa pagsugod nga marka ug natapos sa wala pa ang stop mark gikuha gikan sa orihinal nga pagkasunod-sunod sa pagbasa ug giproseso pa (gitawag nga "insert").Human sa paghubad sa insert, ang bahin human sa first stop codon sa 5′ end sa primer gikuha gikan sa insert.Dugang pa, ang mga nucleotide nga nagdala ngadto sa dili kompleto nga mga codon sa 3′ nga katapusan sa primer gikuha usab.Aron dili iapil ang mga pagsal-ot nga adunay sulod lamang nga mga han-ay sa background, ang gihubad nga mga pagsal-ot nga nagsugod sa pattern sa amino acid nga "PAG" gikuha usab.Ang mga peptide nga adunay post-translational nga gitas-on nga ubos sa 3 ka amino acid gikuha gikan sa librarya.Sa katapusan, kuhaa ang redundancy sa insert pool ug tinoa ang frequency sa matag talagsaon nga insert.Ang mga resulta niini nga pagtuki naglakip sa usa ka lista sa mga nucleotide sequence (inserts) ug ang ilang (read) frequency (Supplementary Figures 1c ug 2).
Grupo ang N-mer DNA nga pagsal-ot pinaagi sa pagkaparehas sa han-ay: Aron mawagtang ang 454/Roche-specific sequencing errors (sama sa mga problema sa sequencing homopolymer extensions) ug tangtangon ang dili kaayo importante nga redundancies, ang nasala kaniadto nga N-mer DNA sequence inserts (inserts) gihan-ay sumala sa pagkaparehas.insertions (hangtod sa 2 non-matching bases gitugot) gamit ang iterative algorithm nga gihubit sama sa mosunod: insertions is sorted first by their frequency (highest to lower), ug kon sila parehas, sa ilang secondary sort by length (labing taas ngadto sa pinakamubo) ).Busa, ang labing kanunay ug labing taas nga pagsal-ot naghubit sa unang "grupo".Ang frequency sa grupo gitakda sa key frequency.Dayon, ang matag insertion nga nahibilin sa sorted list gisulayan nga idugang sa grupo pinaagi sa pairwise Needleman-Wunsch alignment.Kung ang gidaghanon sa mga dili pagtugma, pagsal-ot, o pagtangtang sa usa ka paglinya dili molapas sa sukdanan sa 2, usa ka pagsal-ot idugang sa grupo, ug ang kinatibuk-ang frequency sa grupo madugangan kung unsa ka subsob ang pagsal-ot gidugang.Ang mga insert nga gidugang sa usa ka grupo gimarkahan nga gigamit ug wala iapil sa dugang nga pagproseso.Kung ang insert sequence dili madugang sa usa na ka na nga grupo, ang insert sequence gigamit sa paghimo og bag-ong grupo nga adunay tukma nga insert frequency ug gimarkahan nga gigamit.Ang pag-uli matapos kung ang matag insertion sequence gigamit na aron maporma ang usa ka bag-ong grupo o mahimong maapil sa usa na nga grupo.Human sa tanan, gigrupo nga mga pagsal-ot nga gilangkoban sa mga nucleotides sa ngadtongadto gihubad ngadto sa peptide sequence (peptide libraries).Ang resulta niini nga pagtuki mao ang usa ka hugpong sa mga pagsal-ot ug ang ilang katugbang nga mga frequency nga naglangkob sa gidaghanon sa sunod-sunod nga mga pagbasa (Supplementary Fig. 2).
Motif Generation: Base sa usa ka lista sa talagsaon nga mga peptide, usa ka librarya ang gihimo nga adunay tanan nga posible nga amino acid patterns (aa) sama sa gipakita sa ubos.Ang matag posible nga sumbanan sa gitas-on nga 3 gikuha gikan sa peptide ug ang kabaliktaran nga sumbanan niini gidugang kauban ang usa ka sagad nga librarya sa motif nga adunay tanan nga mga pattern (tripeptides).Ang mga librarya sa nagbalik-balik nga mga motibo gisunod-sunod ug gitangtang ang redundancy.Dayon, alang sa matag tripeptide sa motif library, among gisusi ang presensya niini sa library gamit ang computational tools.Sa kini nga kaso, ang frequency sa peptide nga adunay nakit-an nga motif tripeptide gidugang ug gi-assign sa motif sa motif library ("gidaghanon sa mga motif").Ang resulta sa motif generation usa ka two-dimensional array nga naglangkob sa tanang panghitabo sa tripeptides (motifs) ug sa ilang tagsa-tagsa ka bili, nga mao ang gidaghanon sa sequencing reads nga moresulta sa katugbang nga motif sa dihang ang mga basahon gisala, gigrupo, ug gihubad.Sukatan sama sa gihulagway sa detalye sa ibabaw.
Pag-normalize sa gidaghanon sa mga motif ug katugbang nga mga scatterplots: Ang gidaghanon sa mga motif alang sa matag sample gi-normalize gamit ang
diin ang ni mao ang gidaghanon sa mga basahon nga adunay topiko i.Busa, ang vi nagrepresentar sa porsyento nga frequency sa mga pagbasa (o peptides) nga adunay motif i sa sample.Ang mga P-values ​​alang sa dili normal nga gidaghanon sa mga motif gikalkulo gamit ang eksaktong pagsulay ni Fisher.Mahitungod sa correlograms sa gidaghanon sa mga motibo, ang mga correlasyon ni Spearman gikalkulo gamit ang normalized nga gidaghanon sa mga motibo nga adunay R.
Aron mahanduraw ang sulod sa mga amino acid sa matag posisyon sa peptide library, ang web logograms 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) gihimo.Una, ang sulod sa amino acids sa matag posisyon sa 12-mer peptide gitipigan sa usa ka 20 × 12 matrix.Dayon, ang usa ka set sa 1000 ka peptide nga adunay parehas nga relatibong amino acid content sa matag posisyon gihimo sa fasta-sequence format ug gihatag isip input sa web-logo 3, nga nagmugna og graphical nga representasyon sa relative amino acid content sa matag posisyon.alang sa gihatag nga librarya sa peptide.Aron mahanduraw ang multidimensional nga mga dataset, ang mga mapa sa init gihimo gamit ang usa ka internal nga naugmad nga himan sa R ​​(biosHeatmap, usa ka wala pa ipagawas nga R nga pakete).Ang mga dendrogram nga gipresentar sa mga mapa sa kainit gikalkulo gamit ang hierarchical clustering method ni Ward gamit ang Euclidean distance metric.Para sa statistical analysis sa motif scoring data, P values ​​para sa unnormalized scoring gikalkulo gamit ang eksaktong test ni Fisher.Ang mga P-values ​​alang sa ubang mga dataset gikalkulo sa R ​​gamit ang Student's t-test o ANOVA.
Ang pinili nga phage clones ug phages nga walay mga insert gi-inject sa intravenously pinaagi sa tail vein (2×1010 phages/animal sa 300 μl PBS).Napulo ka minuto sa wala pa ang perfusion ug sunud nga pag-ayo, ang parehas nga mga hayop gi-injected sa intravenously nga adunay 100 μl sa DyLight594-label nga lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 ka minuto pagkahuman sa phage injection, ang mga ilaga gipahid sa kasingkasing nga adunay 50 ml PBS nga gisundan sa 50 ml 4% PFA / PBS.Ang mga sampol sa utok dugang nga gitakda sa tibuok gabii sa 4% PFA/PBS ug gituslob sa 30% nga sucrose sa tibuok gabii sa 4°C.Ang mga sample kay flash frozen sa OCT mixture.Ang immunohistochemical analysis sa mga frozen nga sample gihimo sa temperatura sa lawak sa 30 µm cryosections nga gibabagan sa 1% BSA ug gilumlom sa polyclonal FITC-labeled antibodies batok sa T7 phage (Novus NB 600-376A) sa 4 °C.Paglumlom sa tibuok gabii.Sa katapusan, ang mga seksyon gihugasan 3 beses sa PBS ug gisusi gamit ang confocal laser microscope (Leica TCS SP5).
Ang tanan nga mga peptide nga adunay minimum nga kaputli sa 98% gi-synthesize sa GenScript USA, biotinylated ug lyophilized.Ang biotin gigapos pinaagi sa dugang triple glycine spacer sa N-terminus.Susiha ang tanang peptides gamit ang mass spectrometry.
Ang Streptavidin (Sigma S0677) gisagol sa 5-fold equimolar nga sobra sa biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, o kombinasyon (3: 1 ratio) sa biotinylated BACE1 inhibitory peptide ug BACE1 inhibitory peptide sa 5-10% DMSO/incubated sa PBSO.1 ka oras sa temperatura sa kwarto sa wala pa indeyksiyon.Ang Streptavidin-conjugated peptides gi-injected intravenously sa usa ka dosis nga 10 mg/kg ngadto sa usa sa mga ugat sa ikog sa mga ilaga nga adunay cerebral cavity.
Ang konsentrasyon sa streptavidin-peptide complexes gisusi sa ELISA.Ang Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) gitabonan sa tibuok gabii sa 4 ° C nga adunay 1.5 μg / ml nga mouse anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011).Human sa pag-block (blocking buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) sa temperatura sa lawak sulod sa 2 ka oras, hugasi ang plato nga adunay 0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) sa 3 Second, CSF ug plasma bufferluted nga mga sample1 (mga sampol sa 0.05 nga buffer) nga gidugang sa maayo nga CSF, plasma00 nga gidugang1. CSF 1:115).Ang plato dayon gilumlom sa tibuok gabii sa 4 ° C nga adunay detection antibody (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Pagkahuman sa tulo ka mga lakang sa paghugas, ang streptavidin nakit-an pinaagi sa paglumlum sa TMB substrate solution (Roche) hangtod sa 20 min.Human sa paghunong sa pagpalambo sa kolor sa 1M H2SO4, sukda ang absorbance sa 450 nm.
Ang function sa streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex gisusi sa Aβ(1-40) ELISA sumala sa protocol sa tiggama (Wako, 294-64701).Sa laktud, ang mga sample sa CSF gitunaw sa standard diluent (1:23) ug gilumlum sa tibuok gabii sa 4 ° C sa 96-well plates nga adunay sapaw sa BNT77 capture antibody.Human sa lima ka mga lakang sa paghugas, ang HRP-conjugated nga BA27 nga antibody gidugang ug gilumlum sulod sa 2 ka oras sa 4 ° C., gisundan sa lima ka mga lakang sa paghugas.Ang Aβ(1-40) nakit-an pinaagi sa paglumlum sa TMB solution sulod sa 30 minutos sa temperatura sa lawak.Human mahunong ang paglambo sa kolor gamit ang stop solution, sukda ang absorbance sa 450 nm.Ang mga sample sa plasma gipailalom sa solid phase extraction sa wala pa ang Aβ (1-40) ELISA.Ang Plasma gidugang sa 0.2% DEA (Sigma) sa 96-well plates ug gilumlom sa temperatura sa kwarto sulod sa 30 minutos.Human sa sunodsunod nga paghugas sa mga plato sa SPE (Oasis, 186000679) sa tubig ug 100% nga methanol, ang mga sample sa plasma gidugang sa mga plato sa SPE ug ang tanang likido gikuha.Ang mga sample gihugasan (una sa 5% nga methanol unya 30% nga methanol) ug gi-eluted sa 2% NH4OH/90% nga methanol.Human sa pagpauga sa eluate sa 55 ° C alang sa 99 min sa kanunay nga N2 nga kasamtangan, ang mga sample gipakunhod sa standard diluents ug ang Aβ (1-40) gisukod sama sa gihulagway sa ibabaw.
Giunsa pagkutlo kining artikuloha: Urich, E. et al.Paghatud sa mga kargamento sa utok gamit ang mga transit peptides nga giila sa vivo.ang siyensya.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ug Moos T. Paghatud sa mga tambal nga macromolecular sa utok gamit ang gipunting nga therapy.Journal sa Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ug Martinez-Martinez, P. Paghatud sa peptide ug protina nga mga tambal latas sa babag sa dugo-utok.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Ang babag sa dugo-utok: usa ka bottleneck sa pagpalambo sa tambal sa utok.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ug Byrd, A. Mga prospect alang sa pagpalambo sa paghatod sa droga ug pag-target sa utok pinaagi sa choroid plexus-CSF nga agianan.Pagpanukiduki sa Pharmaceutical 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisasyon sa mga biopharmaceutical nga adunay molekula nga Trojan nga mga kabayo alang sa paghatod sa utok.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor-mediated peptide transport sa babag sa dugo-utok.Endocr Pin. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Dugangi ang pagsulod sa utok ug kaepektibo sa mga therapeutic antibodies gamit ang monovalent molecular shuttles.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. ug uban pa.Ang transportasyon sa Transferrin receptor (TfR) nagtino sa pag-uptake sa utok sa mga variant sa affinity sa TfR antibodies.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).