Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta alang sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka updated nga browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ipakita ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Ang mga gene vectors alang sa pagtambal sa cystic fibrosis nga sakit sa baga kinahanglan nga mag-target sa mga agianan sa hangin tungod kay ang peripheral lung transduction dili makahatag og therapeutic benefit.Viral transduction efficiency direktang may kalabutan sa vector residence time.Apan, ang delivery fluids sama sa gene carriers natural nga mokatap ngadto sa alveoli atol sa inspirasyon, ug therapeutic particles sa bisan unsa nga porma paspas nga matangtang pinaagi sa mucociliary nga carrier sa panahon sa transportasyon. importante pero lisod makab-ot.Gene carrier-conjugated magnetic particles nga mahimong idirekta sa ibabaw sa mga agianan sa hangin makapauswag sa rehiyonal nga targeting.Tungod sa mga hagit sa in vivo visualization, ang kinaiya sa maong gagmay nga magnetic particles sa ibabaw nga agianan sa hangin sa presensya sa usa ka gigamit nga magnetic field dili kaayo masabtan. gi-anesthetized nga mga ilaga aron masusi ang dynamics ug patterns sa indibidwal ug bulk particle behavior sa vivo.Among gisusi usab kung ang paghatod sa lentiviral magnetic particle sa presensya sa magnetic field makadugang sa transduction efficiency sa rat trachea. magnets, apan sa panahon sa transportasyon, ang mga deposito gikonsentrar sa natad sa panglantaw diin ang magnetic field mao ang pinakalig-on.Transduction efficiency usab misaka unom ka pilo sa diha nga lentiviral magnetic particles gihatag sa atubangan sa usa ka magnetic field.Together, kini nga mga resulta nagsugyot nga lentiviral magnetic particles ug magnetic field mahimong bililhon nga mga pamaagi sa pagpalambo sa gene vector targeting ug sa pagdugang sa transduction nga lebel sa pagpahigayon sa mga agianan sa hangin sa vivo.
Ang cystic fibrosis (CF) kay tungod sa kausaban sa usa ka gene nga gitawag ug CF transmembrane conductance regulator (CFTR). makadaut sa abilidad sa mucociliary transport (MCT) nga sistema sa paghawan sa inhaled nga mga partikulo ug mga pathogens gikan sa mga agianan sa hangin.Ang among tumong mao ang paghimo og lentiviral (LV) gene therapy aron sa paghatag sa husto nga kopya sa CFTR gene ug pagpalambo sa ASL, MCT, ug sa panglawas sa baga, ug sa pagpadayon sa pagpalambo sa bag-ong mga teknolohiya nga makahimo sa pagsukod niini nga mga parameter sa vivo1.
Ang LV vectors usa sa mga nag-unang kandidato alang sa CF airway gene therapy, nag-una tungod kay mahimo nilang permanente nga i-integrate ang therapeutic gene ngadto sa airway basal cells (airway stem cells).Importante kini tungod kay mahimo nilang mapasig-uli ang normal nga hydration ug mucus clearance pinaagi sa paglainlain ngadto sa functional gene-corrected CF-associated airway surface cells, nga moresulta sa tibuok kinabuhi nga mga benepisyo sa hangin batok sa LV. magsugod.Ang paghatud sa vector nga mas lawom sa baga mahimong moresulta sa alveolar transduction, apan kini walay therapeutic benefit sa CF.Apan, ang mga pluwido sama sa gene carriers natural nga molalin ngadto sa alveoli sa inspirasyon human sa delivery3,4 ug ang mga partikulo sa terapyutik paspas nga gihaw-as ngadto sa oral cavity pinaagi sa MCT.LV transduction nga efficiency ang pag-target sa mga selula direkta nga may kalabutan sa gitas-on sa mga selula sa sunod nga panahon. oras”5 – nga daling mapakunhod pinaagi sa tipikal nga regional airflow ingon man ang coordinated particle mucus capture ug MCT.Alang sa CF, ang abilidad sa pagpalugway sa panahon sa pagpuyo sa LV sulod sa agianan sa hangin importante aron makab-ot ang taas nga lebel sa transduction niini nga rehiyon, apan sa pagkakaron mahagiton.
Aron mabuntog kini nga babag, among gisugyot nga ang LV magnetic particles (MPs) mahimong makatabang sa duha ka komplementaryong mga paagi.Una, sila mahimong magiyahan sa magnetically ngadto sa ibabaw sa agianan sa hangin aron sa pagpalambo sa pag-target ug pagtabang sa mga partikulo sa gene carrier nga nagpuyo sa gitinguha nga rehiyon sa agianan sa hangin; ug ASL) sa pagbalhin ngadto sa cell layer 6.MPs kaylap nga gigamit ingon nga gipunting nga mga sakyanan sa paghatod sa droga sa diha nga sila nagbugkos sa mga antibodies, chemotherapeutic nga mga tambal, o uban pang gagmay nga mga molekula nga motapot sa cell lamad o mogapos sa may kalabutan nga cell surface receptors ug magtigum sa tumor sites sa presensya sa static nga kuryente. Magnetic Fields alang sa Pagtambal sa Kanser 7. Ang ubang mga "hyperthermal" nga mga teknik nagtumong sa pagpainit sa mga MP sa diha nga sila naladlad sa oscillating magnetic field, sa ingon makaguba sa mga selula sa tumor. natukod na ang magnetotransfection, nga adunay in vitro nga paghatod sa LV-MPs sa usa ka human bronchial epithelial cell line sa presensya sa usa ka static magnetic field, nagdugang sa transduction efficiency sa 186-fold kon itandi sa LV vector nga nag-inusara. Ang LV-MP gipadapat usab sa usa ka in vitro CF nga modelo, diin ang magnetic transfection nagdugang sa LV transduction sa air-liquid-fold nga kultura sa presensya sa 20, CFHoever interface cultures sa 20. vivo magnetotransfection sa mga organo nakadawat og medyo gamay nga pagtagad ug gi-evaluate lamang sa pipila ka mga pagtuon sa hayop11,12,13,14,15, ilabi na sa baga16,17. Bisan pa niana, ang mga oportunidad alang sa magnetic transfection sa CF lung therapy klaro. Tan et al. Mga estratehiya sa inhalasyon sa CFTR aron mapauswag ang mga sangputanan sa klinikal sa mga pasyente sa CF"6.
Ang pamatasan sa gagmay nga mga magnetic particle sa mga agianan sa hangin sa presensya sa usa ka gipadapat nga magnetic field lisud nga mahanduraw ug matun-an, ug sa ingon dili kaayo masabtan.Sa ubang mga pagtuon, naghimo kami usa ka synchrotron-propagation-based phase-contrast X-ray imaging (PB-PCXI) nga pamaagi sa noninvasively visualize ug quantify minute in vivo nga mga pagbag-o sa ASL depth nga sukod18 ug MCT nga panggawi direkta nga sukod18 ug MCT nga sukod18 ug MCT nga kinaiya. ug gigamit isip usa ka sayo nga timailhan sa kaepektibo sa pagtambal.Dugang pa, ang atong MCT evaluation nga pamaagi naggamit sa 10-35 µm diameter nga mga partikulo nga gilangkuban sa alumina o taas nga refractive index nga bildo ingon nga MCT marker nga makita gamit ang PB-PCXI21.Ang duha ka mga teknik angay alang sa visualization sa usa ka lain-laing mga matang sa partikulo, lakip ang MP.
Tungod sa taas nga spatial ug temporal nga resolusyon niini, ang among PB-PCXI nga nakabase sa ASL ug MCT nga mga teknik sa pag-analisa angay alang sa pagsusi sa mga dinamika ug mga pattern sa single ug bulk particle nga kinaiya sa vivo aron matabangan kami nga masabtan ug ma-optimize ang mga pamaagi sa paghatud sa gene sa MP. pulmonary airways sa mga ilaga aron makatabang sa pagpatin-aw sa atong Non-uniform gene expression patterns nga nakita sa atong gene carrier dose animal studies 3,4.
Ang tumong niini nga pagtuon mao ang paggamit sa synchrotron PB-PCXI aron mahanduraw ang in vivo nga mga lihok sa usa ka serye sa mga MP sa trachea sa buhi nga mga ilaga. sa pag-ila sa magnet configurations nga maximize ang gidaghanon sa mga partikulo nga gipabilin sa trachea human sa deposition.Sa ikaduha nga serye sa mga pagtuon, kami nagtinguha sa paggamit niini nga labing maayo nga configuration sa pagpakita sa transduction pattern nga resulta gikan sa in vivo paghatod sa LV-MPs ngadto sa ilaga airway, base sa pangagpas nga ang paghatod sa LV-MPs sa konteksto sa airway targeting moresulta sa mas maayo nga LV pag-target.
Ang tanang pagtuon sa mananap gihimo sumala sa mga protocol nga gi-aprobahan sa University of Adelaide (M-2019-060 ug M-2020-022) ug sa SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Ang mga eksperimento gihimo sumala sa ARRIVE nga mga giya.
Ang tanan nga X-ray imaging gihimo sa BL20XU beamline sa SPring-8 synchrotron sa Japan, gamit ang setup nga susama sa gihulagway kaniadto21,22. Sa mubo, ang experimental box nahimutang 245 m gikan sa synchrotron storage ring. Ang sample-to-detector nga gilay-on nga 0.6 m gigamit alang sa vivo imaging nga mga pagtuon sa 0.3 mst para sa mga pagtuon sa vimaging nga bahin sa vivo. Epekto. Usa ka monochromatic beam energy nga 25 keV ang gigamit. Ang mga hulagway gikuha gamit ang high-resolution X-ray converter (SPring-8 BM3) inubanan sa sCMOS detector. Ang converter nag-convert sa X-ray ngadto sa makitang kahayag gamit ang 10 µm nga gibag-on nga scintillator (Gd3Al2Ga3O12) gamit ang usa ka 0. (NA 0.3).Ang sCMOS detector mao ang Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) nga adunay array size nga 2048 × 2048 pixels ug usa ka raw pixel size nga 6.5 × 6.5 µm. Kini nga setup makahatag og epektibong isotropic pixel size nga 0.51 µm ×1 nga exposure sa gibana-bana nga 0.51 µm × 1. Gipili ang 100 ms aron ma-maximize ang ratio sa signal-to-noise sa mga magnetic particle sa sulod ug gawas sa agianan sa hangin samtang gipamubu ang mga artifact sa paglihok nga gipahinabo sa pagginhawa. Alang sa mga pagtuon sa vivo, usa ka paspas nga X-ray shutter ang gibutang sa agianan sa X-ray aron limitahan ang dosis sa radiation pinaagi sa pag-ali sa X-ray beam taliwala sa mga exposure.
Ang LV carrier wala gigamit sa bisan unsang SPring-8 PB-PCXI imaging studies tungod kay ang BL20XU imaging chamber dili Biosafety Level 2 certified. Hinunoa, gipili namo ang usa ka lain-laing mga maayo nga kinaiya nga MPs gikan sa duha ka komersyal nga mga suppliers-nga naglangkob sa usa ka lain-laing mga gidak-on, mga materyales, puthaw konsentrasyon, ug mga aplikasyon-una nga makasabut sa unsa nga paagi sa MP motions ug magnetic field nga buhi nga mga capries makaapekto sa sulod sa hangin capries ug magnetic field. sa ibabaw.Ang mga MP adunay gidak-on gikan sa 0.25 ngadto sa 18 μm ug gihimo gikan sa nagkalain-laing mga materyales (tan-awa ang Talaan 1), apan ang komposisyon sa matag sample, lakip ang gidak-on sa magnetic nga mga partikulo sa sulod sa MP, wala mahibal-i. Base sa among halapad nga MCT nga mga pagtuon 19, 20, 21, 23, 24, atong gipaabut nga ang MPs nga gamay nga agianan sa hangin mahimo nga gamay sama sa 5 μm. pag-ubos sa sunud-sunod nga mga bayanan aron makita ang gipausbaw nga visibility sa MP motion.Usa ka 0.25 μm-sized nga MP mas gamay kay sa resolusyon sa imaging device, apan ang PB-PCXI gilauman nga makamatikod sa ilang volume contrast ug sa motion sa surface fluid diin kini gibutang human sa deposition.
Ang mga sample alang sa matag MP sa Table 1 giandam sa 20 μl glass capillaries (Drummond Microcaps, PA, USA) nga adunay sulod nga diametro nga 0.63 mm.Ang mga partikulo sa corpuscular anaa sa tubig, samtang ang mga partikulo sa CombiMag anaa sa proprietary fluid sa pabrika. Ang matag tubo katunga nga puno sa likido (gibana-bana nga 11 μl nga mga cap holder) ug (tan-awa ang sample nga mga cap 1) gibutang horizontally sa sample stage sa imaging kahon, sa tinagsa, ug gibutang ang mga ngilit sa fluid.A 19 mm diametro (28 mm ang gitas-on) nickel shell rare earth neodymium iron boron (NdFeB) magnet (N35, iring. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) uban sa usa ka residual magnetization sa 1.17 nga gilakip sa iyang Tesla sa hilit nga posisyon sa paghubad sa yugto sa Pagbag-o sa usa ka Tesla. imaging.X-ray image acquisition magsugod sa diha nga ang magnet nahimutang sa gibana-bana nga 30 mm sa ibabaw sa sample, ug ang mga hulagway makuha sa gikusgon nga 4 ka mga frame kada segundo. Atol sa imaging, ang magnet gidala duol sa bildo nga capillary tube (mga 1 mm ang gilay-on) ug dayon gihubad ubay sa tubo aron masusi ang mga epekto sa kusog sa uma ug posisyon.
In vitro imaging setup nga adunay sulod nga MP sample sa glass capillaries sa sample xy translation stage.Ang agianan sa X-ray beam gimarkahan og pula nga dashed line.
Sa dihang natukod na ang in vitro visibility sa mga MP, usa ka subset niini ang gisulayan sa vivo sa wild-type nga babaye nga albino Wistar nga mga ilaga (~ 12 ka semana ang edad, ~ 200 g). Seika) Ang mga ilaga gi-anesthetize sa usa ka sinagol nga Pharma), Japan) pinaagi sa intraperitoneal injection. Human sa anesthesia, giandam sila alang sa imaging pinaagi sa pagtangtang sa balhibo sa palibot sa trachea, pagsal-ot sa usa ka endotracheal tube (ET; 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) ug pag-immobilize kanila nga naghigda sa usa ka custom-made nga imaging nga plato sa lawas nga adunay sulod nga thermal2 nga plate nga adunay temperatura nga lawas. gilakip sa sample nga yugto sa paghubad sa kahon sa imaging sa usa ka gamay nga anggulo aron ipahiangay ang trachea nga pinahigda sa imahe sa X-ray, ingon sa gipakita sa Figure 2a.
(a) Sa vivo imaging setup sa SPring-8 imaging box, ang agianan sa X-ray beam gimarkahan og pula nga dashed line.(b,c) Ang magnet localization sa trachea gihimo sa layo gamit ang duha ka orthogonally mounted IP cameras.Sa wala nga bahin sa screen image, ang wire loop nga nagkupot sa ulo makita sa lugar, ug ang delivery sa cannula.
Usa ka remote-controlled syringe pump system (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) gamit ang 100 μl glass syringe gikonektar sa PE10 tubing (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) pinaagi sa 30 Ga needle. Markahi ang tubo aron masiguro nga ang tumoy naa sa saktong posisyon sa trachea sa dihang gisulod ang ET tube. Gi-withdraw samtang ang tumoy sa tubo giunlod sa MP sample nga ihatod.Ang gikarga nga delivery tube dayon gisulod sa endotracheal tube, nga nagbutang sa tumoy sulod sa pinakalig-on nga bahin sa atong gipaabot nga magnetic field.Ang pagkuha sa hulagway gikontrol gamit ang respiration detector nga konektado sa atong Arduino based timing box, ug ang tanang signal (pananglitan sa temperatura, respiration, ug shutter opening nga rekord sa Lab. (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Sa diha nga imaging Sa diha nga ang enclosure dili ma-access, duha ka IP camera (Panasonic BB-SC382) gipahimutang sa gibana-bana nga 90 ° sa usag usa ug gigamit sa pagmonitor sa posisyon sa magnet nga may kalabotan sa trachea sa panahon sa imaging (Fig. 2b, c).
Usa ka magnet ang gilakip sa ikaduhang yugto nga mahimutang sa layo gikan sa gawas sa imaging housing. Lain-laing mga posisyon sa magnet ug mga kumpigurasyon ang gisulayan, lakip ang: Gi-mount sa usa ka anggulo nga gibana-bana nga 30° ibabaw sa trachea (mga configuration nga gipakita sa Figures 2a ug 3a); usa ka magnet sa ibabaw sa mananap ug ang lain sa ubos, nga adunay mga poste nga gibutang aron madani (Figure 3b); ang usa ka magnet sa ibabaw sa mananap ug ang lain sa ubos, nga ang mga poste gibutang sa pagsalikway (Figure 3c); ug usa ka magnet sa ibabaw ug tul-id sa trachea (Figure 3d). Sa higayon nga ang mananap ug magnet ma-configure ug ang MP nga pagasulayan makarga ngadto sa syringe pump, maghatod ug 50 μl nga dosis sa gikusgon nga 4 μl/sec samtang nagkuhag mga hulagway. Ang magnet dayon ibalhin balik-balik subay o lateral sa trachea samtang nagpadayon ang mga hulagway.
Konfigurasyon sa magnet alang sa in vivo imaging (a) usa ka magnet sa ibabaw sa trachea sa anggulo nga gibana-bana nga 30°, (b) duha ka magnet nga gitakda sa pagdani, (c) duha ka magnet nga gitakda sa pag-repel, (d) usa ka magnet sa ibabaw ug perpendicular sa trachea. Ang tigpaniid mitan-aw gikan sa baba ngadto sa baga pinaagi sa trachea, ug ang kilid sa kilid sa tuo miagi sa X-ray'. Ang magnet mahimong ibalhin subay sa gitas-on sa agianan sa hangin o wala ug tuo sa ibabaw sa trachea sa direksyon sa X-ray beam.
Gitinguha usab namon nga mahibal-an ang panan-aw ug pamatasan sa mga partikulo sa mga agianan sa hangin kung wala’y makalibog nga pagginhawa ug paglihok sa kasingkasing. Busa, sa katapusan sa panahon sa imaging, ang mga hayop tawhanon nga gipatay tungod sa overdose sa pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg / kg ip) Ang ubang mga hayop sa pagginhawa ug pagginhawa gihunong sa kausa sa paghunong sa imag. Ang proseso gisubli, pagdugang og dugang nga dosis sa MP kung walay MP nga makita sa ibabaw sa agianan sa hangin.
Ang nakuha nga mga hulagway kay flat-field ug dark-field gitul-id ug dayon gi-assemble ngadto sa usa ka salida (20 frames per second; 15-25 × normal speed depende sa respiratory rate) gamit ang custom script nga gisulat sa MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ang tanan nga mga pagtuon sa paghatud sa LV gene vector gihimo sa Laboratory Animal Research Facility sa University of Adelaide ug gitumong nga gamiton ang mga resulta sa eksperimento sa SPring-8 aron masusi kung ang paghatud sa LV-MP sa presensya sa magnetic field makapauswag sa pagbalhin sa gene sa vivo.
Ang LV gene vectors namugna gamit ang gihulagway na nga mga pamaagi 25, 26 .Ang LacZ vector nagpahayag sa nuclear-localized beta-galactosidase gene nga gimaneho sa constitutive MPSV promoter (LV-LacZ), nga nagpatunghag asul nga reaksyon nga produkto sa transduced nga mga selula, nga makita sa mga atubangan sa tissue sa baga ug mga seksyon sa tisyu. titer sa TU/ml. Ang mga carrier gi- cryopreserve sa -80 °C, natunaw sa wala pa gamiton, ug gigapos sa CombiMag pinaagi sa pagsagol sa 1: 1 nga ratio ug paglumlum sa yelo sulod sa labing menos 30 ka minuto sa wala pa ipadala.
Ang normal nga Sprague Dawley nga mga ilaga (n = 3/grupo, ~ 2-3 gi-anesthetize sa intraperitoneally nga adunay sinagol nga 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) ug 60 mg/kg ketamine (Ilium, Australia) nga bulan) ip) nga ip) injection ug non-surgical oral cannulation nga adunay 16 Ga ivduction. kini gikondisyon gamit ang among gihulagway kaniadto nga mekanikal nga perturbation protocol, diin ang tracheal airway surface gihaplasan sa axially sa wire basket (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28.Tracheal nga administrasyon sa LV-MP dayon gihimo sa gibana-bana nga 10 ka minuto sa kaluwasan human sa usa ka biological nga safety cabinet.
Ang magnetic field nga gigamit niini nga eksperimento gi-configure sa susama nga paagi sa in vivo X-ray imaging study, nga adunay parehas nga mga magnet nga gihuptan sa ibabaw sa trachea gamit ang distillation stent clips (Figure 4). Usa ka 50 μl volume (2 × 25 μl aliquots) sa LV-MP ang gitugyan ngadto sa trachea (n = 3 nga mga mananap nga gihubit sa miaging mga tip) 3 ka mga mananap) nakadawat sa samang LV-MPs nga walay paggamit sa magnet.Human makompleto ang pagpuga, ang cannula gikuha gikan sa ET tube ug ang mananap gi-extubated.Ang magnet nagpabilin sa lugar sulod sa 10 minutos, dayon kini gikuha.Ang mga ilaga nakadawat og subcutaneous dose sa meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) nga gisundan sa ip-injection sa mg/kg hydropamazole sa anesthesia. (Antisedan, Zoetis, Australia) Ang mga ilaga gipainit ug gibantayan hangtod sa hingpit nga pagkaayo gikan sa anesthesia.
LV-MP delivery device sa usa ka biological safety cabinet.Ang light gray nga Luer hub sa ET tube makita nga nagtuybo gikan sa baba ug ang gel tip sa pipette nga gipakita sa hulagway gisal-ot pinaagi sa ET tube ngadto sa gitinguha nga giladmon ngadto sa trachea.
Usa ka semana human sa LV-MP dosing procedure, ang mga mananap tawhanon nga gipatay pinaagi sa 100% CO2 inhalation ug ang LacZ nga ekspresyon gi-assess gamit ang among standard X-gal treatment.Ang tulo ka caudal most cartilaginous rings gikuha aron maseguro nga ang bisan unsang mekanikal nga kadaot o fluid retention gikan sa endotracheal tube placement wala gilakip sa pagtuki.Ang matag trachea giputol sa longitudinally aron makamugna og duha ka goma nga giputol aron sa pag-analisa sa duha ka bahin. (Sylgard, Dow Inc) gamit ang Minutien needle (Fine Science Tools) aron mahanduraw ang luminal surface.Ang pag-apod-apod ug pattern sa transduced cells gipamatud-an sa frontal photography gamit ang Nikon microscope (SMZ1500) nga adunay DigiLite camera ug TCapture software (Tucsen Photonics, China). gitas-on sa trachea nga gihulagway sa sunod-sunod nga lakang, pagsiguro nga adunay igo nga pagsapaw tali sa matag imahe aron tugotan ang "pagtahi" sa imahe. Ang mga imahe gikan sa matag trachea dayon gi-assemble sa usa ka composite nga imahe gamit ang Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) nga naggamit sa usa ka planar motion algorithm.LacZ expression nga mga lugar sa composite nga mga imahe sa usa ka hayop nga gi-trachea gikan sa matag MAT script nga gi-trachea gikan sa matag hayop. (R2020a, MathWorks) sama sa gihulagway kaniadto, gamit ang mga setting sa 0.35 0.15, ug Value <0.7.Pinaagi sa pagsubay sa mga contours sa tissue, usa ka maskara ang mano-mano nga namugna sa GIMP v2.10.24 alang sa matag composite nga imahe aron mapugngan ang bisan unsang mga lugar nga nakit-an sa tisyu gikan sa gawas. Ang mga composite nga mga hulagway gikan sa matag mananap gisumada aron makamugna sa kinatibuk-ang namansahan nga dapit alang sa maong mananap.Ang namansahan nga dapit gibahin dayon sa kinatibuk-ang mask area aron makamugna sa normalized nga lugar.
Ang matag trachea gisulod sa paraffin ug ang 5 μm nga mga seksyon giputol. Ang mga seksyon gi-counterstain nga adunay neutral fast red alang sa 5 min ug ang mga hulagway nakuha gamit ang Nikon Eclipse E400 microscope, DS-Fi3 camera ug NIS element capture software (bersyon 5.20.00).
Ang tanan nga pag-analisar sa istatistika gihimo sa GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) Ang kahulogan sa istatistika gitakda sa p ≤ 0.05. Ang normalidad gipamatud-an gamit ang Shapiro-Wilk test, ug ang mga kalainan sa LacZ staining gi-assess gamit ang unpaired t-test.
Ang unom ka MPs nga gihulagway sa Table 1 gisusi gamit ang PCXI, ug ang visibility gihulagway sa Table 2. Duha ka polystyrene MPs (MP1 ug MP2; 18 μm ug 0.25 μm, matag usa) dili makita ubos sa PCXI, apan ang nahabilin nga mga sample mailhan (mga pananglitan gipakita sa FeeMP3 ug MP5 5). Ang 0.25 μm ug 0.9 μm, matag usa) hinay nga makita. Bisag adunay pipila sa pinakagamay nga mga partikulo nga gisulayan, ang MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) mao ang labing gipahayag. Ang produkto sa CombiMag MP6 lisud nga makita. magnet mibalhin gikan sa capillary, ang mga partikulo gipalapad sa taas nga mga kuwerdas, apan samtang ang mga magnet nagkaduol ug ang magnetic field kusog misaka, ang mga partikulo kuwerdas gipamub-an samtang ang mga partikulo migrate paingon sa ibabaw nga nawong sa capillary (tan-awa ang Supplementary Video S1: MP4), pagdugang Ang particle density sa nawong. capillary (tan-awa ang Supplementary Video S2: MP4) .Human mohunong ang magnet sa paglihok, ang mga partikulo magpadayon sa paglihok sulod sa mubo nga panahon human sa pagkab-ot sa posisyon sa panimbang.Samtang ang MP naglihok padulong ug palayo gikan sa ibabaw nga bahin sa capillary, ang mga magnetic particle kasagarang moguyod sa mga tinumpag pinaagi sa fluid.
Ang visibility sa MP ubos sa PCXI magkalahi kaayo tali sa mga sample.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ug (d) MP6. Ang tanan nga mga hulagway nga gipakita dinhi gikuha gamit ang magnet nga nahimutang gibana-bana nga 10 mm direkta sa ibabaw sa capillary. Pagpadako.Timan-i nga ang mga diametro sa magnet schematics sa tanan nga mga numero dili sukdon ug gibana-bana nga 100 ka pilo nga mas dako kaysa gipakita.
Samtang ang magnet gihubad sa wala ug tuo ubay sa ibabaw sa capillary, ang anggulo sa MP string mausab aron ipahiangay sa magnet (tan-awa ang Figure 6), sa ingon naghulagway sa magnetic field lines.Alang sa MP3-5, human ang chord makaabot sa usa ka anggulo sa threshold, ang mga partikulo giguyod sa ibabaw nga bahin sa capillary. Kini kasagaran moresulta sa MPs clustering ngadto sa mas dagkong mga grupo sa Supple nga duol sa magnetic field. S3:MP5).Kini usab ilabinang dayag sa diha nga imaging duol sa capillary katapusan, nga maoy hinungdan sa MPs sa aggregate ug concentrate sa fluid-hangin interface.Particles sa MP6, nga mas lisud nga sa pag-ila kay sa MP3-5, wala giguyod samtang ang magnet mibalhin sa daplin sa capillary, apan ang MP strings dissociated sa mga Supplementaryo sa natad sa Video (mga partikulo sa S4). mga kaso, sa dihang ang gipadapat nga magnetic field gipakunhod pinaagi sa pagbalhin sa magnet sa usa ka dako nga gilay-on gikan sa lokasyon sa imaging, ang bisan unsang nahabilin nga mga MP hinayhinay nga nanaog sa ilawom nga bahin sa tubo pinaagi sa grabidad samtang nagpabilin sa hilo (tan-awa ang Supplementary Video S5: MP3).
Ang anggulo sa MP string nausab samtang ang magnet gihubad ngadto sa tuo sa ibabaw sa capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ug (d) MP6. Ang pula nga kahon naglangkob sa contrast-enhancing magnification. Timan-i nga ang mga supplementary video kay informative samtang kini nagpadayag sa importante nga particle structure ug dynamic nga impormasyon nga dili makita niining static nga mga hulagway.
Gipakita sa among mga pagsulay nga ang paglihok sa magnet nga hinay-hinay nga pabalik-balik subay sa trachea nagpadali sa pagtan-aw sa MP sa konteksto sa komplikado nga paglihok sa vivo.In vivo nga pagsulay wala gihimo ingon nga polystyrene beads (MP1 ug MP2) dili makita sa capillary.Ang matag usa sa nahabilin nga upat ka mga MP gisulayan sa vivo nga adunay magnet nga taas nga axis nga gi-configure sa ibabaw sa mga anggulo sa 3 nga tan-awon ug gi-configure sa ibabaw sa Figure 3. 3a), tungod kay kini miresulta sa mas taas nga mga kadena sa MP ug mas epektibo kay sa magnet configuration nga natapos. Ang MP3, MP4 ug MP6 wala makita sa trachea sa bisan unsang buhi nga mga mananap. Sa diha nga ang mga agianan sa hangin sa ilaga gihulagway human ang mga mananap gipatay, ang mga partikulo nagpabilin nga dili makita bisan kung ang dugang nga volume gidugang gamit ang usa ka syringe pump. vivo kinaiya sa MP.
Ang pagbutang sa magnet ibabaw sa trachea sa panahon sa paghatud sa MP miresulta sa daghan, apan dili tanan, ang mga MP nga nakonsentrar sa natad sa panglantaw.Ang mga partikulo nga mosulod sa trachea labing maayo nga naobserbahan sa mga mananap nga gisakripisyo sa tawo.Figure 7 ug Supplementary Video S6: Ang MP5 nagpakita sa paspas nga magnetic capture ug alignment sa mga partikulo sa ibabaw sa ventral trachea nga gitinguha nga rehiyon, nga nagpakita nga ang trachea nga rehiyon mahimong idirekta sa MP5. pagpangita sa mas distally ubay sa trachea human sa MP delivery, ang pipila ka MPs nakit-an nga mas duol sa carina, nga nagsugyot nga ang magnetic field kusog dili igo sa pagkolekta ug pagpabilin sa tanan nga mga MPs, tungod kay sila gihatud pinaagi sa rehiyon sa maximum magnetic field kusog sa panahon sa fluid proseso. Bisan pa niana, postpartum MP konsentrasyon mao ang mas taas sa palibot sa imaged nga dapit, nga nagsugyot nga daghang mga MPs ang nagpabilin sa pinakataas nga magnetic field nga rehiyon.
Mga hulagway gikan sa (a) sa wala pa ug (b) human sa paghatud sa MP5 ngadto sa trachea sa bag-o lang na-euthanized nga ilaga nga adunay magnet nga nakaposisyon direkta sa ibabaw sa imaging area. Ang gilarawan nga lugar nahimutang taliwala sa duha ka cartilage rings. Sa wala pa ang MP delivery, adunay pipila ka fluid sa agianan sa hangin. Ang pula nga kahon naglangkob sa contrast-enhancing nga pagpadako.
Ang paghubad sa magnet subay sa trachea sa vivo hinungdan nga ang kadena sa MP nagbag-o sa anggulo sa sulud sa agianan sa hangin sa paagi nga susama sa nakita sa mga capillary (tan-awa ang Figure 8 ug Supplementary Video S7: MP5). particle string makita sa pag-usab sa giladmon sa nawong fluid layer sa diha nga ang magnet gibalhin longitudinally sa daplin sa trachea, ug molapad sa diha nga ang magnet gibalhin direkta sa ibabaw ug ang partikulo hilo gipatuyok ngadto sa usa ka bertikal nga posisyon (tan-awa ang Supplementary Video S7). : MP5 sa 0:09, ubos sa tuo).Ang kinaiya nga pattern sa paglihok nausab sa dihang ang magnet gihubad tabok sa ibabaw sa trachea laterally (nga mao, ngadto sa wala o tuo sa mananap kay sa ubay sa gitas-on sa trachea). nahiuyon sa pamatasan sa MP nga among nakita sa ilawom sa usa ka gigamit nga magnetic field sa usa ka baso nga capillary.
Pananglitan nga mga hulagway nga nagpakita sa MP5 sa trachea sa usa ka buhi nga anesthetized nga ilaga.(a) Ang magnet gigamit sa pagkuha og mga hulagway sa ibabaw ug sa wala sa trachea, unya (b) human ang magnet ibalhin sa tuo. Ang pula nga kahon naglangkob sa contrast-enhancing nga pagpadako.Kini nga mga hulagway gikan sa video nga gipakita sa Supplementary Video S7:MP5.
Sa diha nga ang duha ka mga poste gi-configure sa usa ka amihanan-habagatan nga orientasyon sa ibabaw ug sa ubos sa trachea (ie pagdani; Fig. 3b), ang mga MP chords nagpakita nga mas dugay ug nahimutang sa sidewall sa trachea kay sa ibabaw sa dorsal tracheal surface (tan-awa ang Supplementary Video S9: MP5). usa ka dual-magnet device ang gigamit, nga kasagaran mahitabo sa diha nga ang usa ka single-magnet device ang gigamit. Unya sa diha nga ang usa ka magnet gi-configure aron sa pag-repel sa mga pole nga gibaliktad (Fig. 3c), ang gidaghanon sa mga partikulo nga makita sa field of view dili makita nga modaghan human sa delivery. ngadto sa agianan sa hangin apan moagi sa agianan sa hangin sa 90 degrees aron ang mga linya sa uma mitabok sa tracheal wall orthogonally (Fig. 3d), usa ka orientation nga gidesinyo aron mahibal-an kung ang partikulo sa aggregation sa kilid nga bungbong mahimong maobserbahan .Apan, niini nga configuration, walay mailhan nga paglihok sa MP accumulation o magnet nga kalihukan.Base sa tanan niini nga mga resulta, orientation-magnet0. 3a) gipili alang sa mga pagtuon sa vivo gene carrier.
Sa diha nga ang mananap balik-balik nga gihulagway diha-diha dayon human sa tawhanon nga pagpatay, ang pagkawala sa makalibog nga paglihok sa tisyu nagpasabot nga ang mas maayo ug mas mugbo nga mga linya sa partikulo mahimong mailhan sa tin-aw nga interchondral field, "wobbly" subay sa translational motion sa magnet. Bisan pa, dili gihapon klaro nga makita ang presensya ug paglihok sa mga partikulo sa MP6.
Ang titer sa LV-LacZ mao ang 1.8 × 108 TU / ml, ug pagkahuman sa 1: 1 nga pagsagol sa CombiMag MP (MP6), ang mga hayop nakadawat usa ka 50 μl nga tracheal nga dosis sa 9 × 107 TU / ml LV nga awto (ie 4.5 × 106 TU / ilaga). ).Sa kini nga mga pagtuon, imbes nga hubaron ang magnet sa panahon sa paghago, among giayo ang magnet sa usa ka posisyon aron mahibal-an kung ang LV transduction (a) mahimong mapauswag kung itandi sa paghatud sa vector kung wala ang magnetic field, ug (b) mahimong ipunting ang mga selyula sa Airway gibalhin sa magnetic target nga mga rehiyon sa taas nga agianan sa hangin.
Ang presensya sa mga magnet ug ang paggamit sa CombiMag inubanan sa LV vectors dili makita nga adunay dili maayo nga mga epekto sa kahimsog sa hayop, sama sa among standard nga LV vector delivery protocol. Ang atubangan nga mga hulagway sa tracheal nga rehiyon nga gipailalom sa mekanikal nga perturbation (Supplementary Fig. 1) nagpakita nga adunay mas taas nga lebel sa transduction sa grupo sa mga mananap nga gitambalan nga adunay LV-MP nga gamay nga magnet (Fig. pagmantsa anaa sa kontrol nga grupo (Fig. 9b). Ang gidaghanon sa normalized X-Gal namansahan nga mga dapit nagpakita nga ang administrasyon sa LV-MP sa atubangan sa usa ka magnetic field naghimo sa usa ka gibana-bana nga 6-pilo nga kalamboan (Fig. 9c).
Pananglitan nga composite nga mga hulagway nga nagpakita sa tracheal transduction pinaagi sa LV-MP (a) sa presensya sa magnetic field ug (b) sa pagkawala sa usa ka magnet. (c) Statistically mahinungdanon nga pag-uswag sa normalized LacZ transduction area sulod sa trachea sa dihang naggamit sa magnet (* p = 0.029, t-test, n = 3 matag grupo, mean ± SEM).
Ang neyutral nga paspas nga pula nga pula nga mga seksyon (pananglitan gipakita sa Supplementary Fig. 2) nagpakita sa LacZ-stained cells nga anaa sa susama nga pattern ug lokasyon sama sa gitaho kaniadto.
Usa ka mahinungdanong hagit alang sa airway gene therapy nagpabilin nga tukma nga localization sa carrier particle ngadto sa mga rehiyon nga interesado ug pagkab-ot sa taas nga lebel sa transduction efficiency sa paglihok sa baga sa presensya sa airflow ug aktibong mucus clearance. Ang transduction adunay mga bentaha kumpara sa ubang mga pamaagi sa paghatod sa gene sama sa electroporation, tungod kay kini makakombinar sa kayano, cost-effectiveness, delivery localization, increase efficiency, ug mas mubo nga incubation times , ug posibleng mas gamay nga carrier dose10. Apan, ang in vivo deposition ug behavior sa magnetic particles sa mga agianan sa hangin ubos sa impluwensya sa external magnetic forces sa vivo wala pa gayud mahulagway sa tinuod nga pagpakita sa abilidad sa gene sa vivo. sa intact buhi nga mga agianan sa hangin.
Ang among in vitro synchrotron PCXI nga mga eksperimento nagpakita nga ang tanan nga mga partikulo nga among gisulayan, gawas sa polystyrene MP, makita sa imaging setup nga among gigamit. Sa presensya sa usa ka magnetic field, ang mga MP nagporma og mga kuwerdas kansang mga gitas-on adunay kalabutan sa tipo sa partikulo ug kusog sa magnetic field (ie kaduol ug paglihok sa magnet). field.Kining mga managlahi nga mga natad maoy hinungdan sa uban nga susama nga mga partikulo sa pagtipon ug pagkonektar, uban sa grupo nga sama sa kuwerdas nga mga lihok tungod sa mga lokal nga pwersa gikan sa lokal nga madanihon ug salawayon nga pwersa sa ubang mga partikulo.
Ang eskematiko nga nagpakita sa (a,b) nga mga partikulo nga mga tren nga namugna sulod sa fluid-filled capillaries ug (c,d) air-filled trachea.Timan-i nga ang mga capillaries ug trachea wala madani sa sukdanan.Ang panel (a) adunay usab usa ka paghulagway sa MP, nga adunay Fe3O4 nga mga partikulo nga gihan-ay sa mga kuwerdas.
Sa diha nga ang magnet gibalhin sa ibabaw sa capillary, ang anggulo sa particle string nakaabot sa usa ka kritikal nga threshold alang sa MP3-5 nga adunay Fe3O4, pagkahuman ang particle string wala na magpabilin sa orihinal nga posisyon, apan mibalhin sa ibabaw sa usa ka bag-ong posisyon. mas gamay, adunay lain-laing mga coating o surface charges, o usa ka proprietary carrier fluid nakaapekto sa ilang abilidad sa paglihok. Ang kalainan sa hulagway sa CombiMag particles usab mas huyang, nga nagsugyot nga ang fluid ug ang mga partikulo mahimong adunay susama nga mga densidad ug busa dili dali nga mobalhin ngadto sa usag usa. Ang mga partikulo mahimo usab nga ma-stuck kung ang magnet molihok nga kusog kaayo, nga nagpakita nga ang magnetic field nga kusog dili kanunay makabuntog sa kalig-on sa magnetic field. ang kalig-on sa magnetic field ug ang gilay-on tali sa magnet ug sa target nga lugar Importante kaayo.Gikuha sa tingub, kini nga mga resulta nagsugyot usab nga, samtang ang mga magnet makadakop sa daghang mga MPs nga modagayday sa target nga lugar, dili tingali nga ang mga magnet mahimong masaligan sa paglihok sa mga partikulo sa CombiMag ubay sa nawong sa trachea.
Kung ang mga partikulo ihatud sa lawas, lisud kini mailhan sa konteksto sa komplikado nga paglihok sa tisyu sa lawas, apan ang abilidad sa pag-ila niini gipauswag pinaagi sa paghubad sa magnet nga pinahigda sa ibabaw sa trachea aron "pag-uyog" ang mga kuwerdas sa MP. trachea. Sukwahi sa in vitro nga mga pagtuon, ang mga partikulo dili maguyod subay sa trachea pinaagi sa paghubad sa magnet. Kini nga pagpangita nahiuyon sa kon sa unsang paagi ang mucus nga nagsapot sa nawong sa trachea kasagarang nagproseso sa inhaled nga mga partikulo, nga nagbitik niini diha sa mucus ug human niana gihawiran sa mucociliary clearance mechanism.
Gipanghimatuud namo nga ang paggamit sa mga magnet alang sa atraksyon sa ibabaw ug sa ubos sa trachea (Fig. 3b) mahimong moresulta sa usa ka mas uniporme nga magnetic field, kay sa usa ka magnetic field nga gikonsentrar pag-ayo sa usa ka punto, nga posibleng motultol ngadto sa usa ka mas uniporme nga pag-apod-apod sa mga partikulo. Bisan pa, ang among pasiuna nga pagtuon wala makakita og tin-aw nga ebidensya sa pagsuporta niini nga hypothesis. deposition sa imaged area.Kining duha ka mga findings nagpakita nga ang dual-magnet setup wala makapauswag sa lokal nga kontrol sa MP targeting, ug nga ang resulta nga lig-on nga magnetic forces lisud i-configure, nga naghimo niini nga pamaagi nga dili kaayo praktikal. Sa susama, ang pag-orient sa magnet sa ibabaw ug pinaagi sa trachea (Fig. 3d) wala usab makadugang sa gidaghanon sa mga partikulo nga gipabilin sa mga resulta sa magnetic field nga dili magmalampuson tungod kay kini nga mga alternatibo nga magnetic field dili malampuson. sulod sa deposition area.Busa, ang single 30-degree angle magnet configuration (Figure 3a) gikonsiderar nga pinakasayon ​​ug pinakaepisyente nga pamaagi para sa in vivo testing.
Gipakita sa pagtuon sa LV-MP nga sa dihang ang LV vectors gihiusa uban sa CombiMag ug gihatag human sa physical perturbation sa presensya sa magnetic field, ang transduction level mitaas pag-ayo sa trachea kumpara sa controls. Base sa synchrotron imaging studies ug LacZ results, ang magnetic field dayag nga makahimo sa pagpreserbar sa LV sulod sa trachea ug makapakunhod sa gidaghanon sa natusok nga mga partikulo ngadto sa lawom nga mga partikulo sa lung. modala ngadto sa mas taas nga kaepektibo samtang ang pagkunhod sa gihatud nga titers, off-target transduction, makapahubag ug immune side effects, ug gene carrier gasto.Importante, sumala sa manufacturer, CombiMag mahimong gamiton inubanan sa uban nga gene transfer nga mga pamaagi, lakip na sa uban nga viral vectors (sama sa AAV) ug nucleic acids.