Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Naggamit ka usa ka bersyon sa browser nga adunay limitado nga suporta sa CSS. Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Dugang pa, aron masiguro ang padayon nga suporta, gipakita namon ang site nga wala’y mga istilo ug JavaScript.
Nagpakita sa usa ka carousel sa tulo ka mga slide sa usa ka higayon. Gamita ang Kaniadto ug Sunod nga mga buton sa paglihok sa tulo ka mga slide sa usa ka higayon, o gamita ang mga buton sa slider sa katapusan aron sa paglihok sa tulo ka mga slide sa usa ka higayon.
Ang self-assembling neural organelles nagrepresentar sa usa ka promising in vitro nga plataporma alang sa pagmodelo sa kalamboan ug sakit sa tawo. Bisan pa, ang mga organoids kulang sa koneksyon nga naa sa vivo, nga naglimite sa pagkahinog ug nagpugong sa paghiusa sa ubang mga sirkito nga nagkontrol sa pamatasan. Dinhi gipakita namon nga ang mga cortical organoids nga nakuha sa stem cell sa tawo nga gibalhin sa somatosensory cortex sa mga neonatal nga hubo nga mga ilaga nagpalambo sa mga hamtong nga tipo sa cell nga naghiusa sa mga sirkito nga may kalabotan sa sensory ug motibasyon. Gipadayag sa MRI ang post-transplant nga pagtubo sa organoid sa daghang mga linya sa stem cell ug mga hayop, samtang ang pag-analisar sa single-core nagpadayag sa pag-uswag sa corticogenesis ug ang pagtunga sa usa ka programa sa transkripsyon nga nagsalig sa kalihokan. Sa tinuud, ang gibalhin nga mga cortical neuron nagpakita sa labi ka komplikado nga morphological, synaptic, ug internal nga mga kabtangan sa lamad kaysa sa ilang mga in vitro nga katugbang, nga nagtugot sa pag-ila sa mga depekto sa neuronal sa mga pasyente nga adunay Timothy's syndrome. Anatomical ug functional nga pagsubay nagpakita nga ang transplanted organelles makadawat thalamocortical ug corticocortical inputs, ug sa vivo recording sa neural nga kalihokan nagsugyot nga kini nga mga input makamugna sensory mga tubag sa mga selula sa tawo. Sa katapusan, ang mga cortical organoids nagpalapad sa mga axon sa tibuuk nga utok sa ilaga, ug ang ilang optogenetic nga pagpaaktibo nagdala sa pamatasan nga nangita ganti. Busa, ang gi-transplant nga human cortex neurons mohamtong ug moapil sa mga sirkito sa host nga nagkontrol sa kinaiya. Gipaabut namon nga kini nga pamaagi aron mapadali ang pag-ila sa mga strand-level phenotypes sa mga selula nga nakuha sa pasyente nga dili mahibal-an sa ubang mga paagi.
Ang nag-uswag nga utok sa tawo usa ka talagsaon nga proseso sa pag-organisar sa kaugalingon diin ang mga selyula modaghan, magkalainlain, molalin, ug magkonektar aron maporma ang functional neuronal circuits nga labi nga gipino pinaagi sa sensory nga kasinatian. Usa ka mahinungdanong problema sa pagsabot sa kalamboan sa utok sa tawo, ilabina sa konteksto sa sakit, mao ang kakulang sa access sa tisyu sa utok. Ang mga organel nga nag-organisar sa kaugalingon, lakip ang mga organoid sa cortex sa tawo (hCO; nailhan usab nga sphere sa cortex sa tawo), makamugna og 2,3,4,5,6. Bisan pa, daghang mga limitasyon ang naglimite sa ilang mas lapad nga aplikasyon aron masabtan ang pag-uswag ug pag-obra sa mga neural circuit. Sa partikular, dili klaro kung ang pagkahinog sa hCO limitado sa pagkawala sa pipila nga microenvironmental ug sensory input nga naa sa vivo. Dugang pa, tungod kay ang mga hCO wala gisagol sa mga sirkito nga makamugna og mga resulta sa pamatasan, ang ilang gamit sa pagmodelo sa genetically complex ug behavioral neuropsychiatric disorders limitado karon.
Ang pagbalhin sa hCO ngadto sa usa ka buhi nga utok mahimong makabuntog niini nga mga limitasyon. Gipakita sa nangaging mga pagtuon nga ang mga neuron sa tawo nga gi-transplant ngadto sa rodent cortex makahimo nga mabuhi, magproyekto, ug makigkomunikar sa mga rodent cells7,8,9,10,11,12. Bisan pa, kini nga mga eksperimento kasagaran gihimo sa mga hamtong nga hayop, nga mahimong limitahan ang synaptic ug axonal integration. Dinhi, gihubit namon ang usa ka paradigm sa pagbalhin diin among gibalhin ang 3D hCO nga nakuha gikan sa mga selula sa hiPS sa panguna nga somatosensory cortex (S1) sa immunodeficient nga mga ilaga sa sayo nga yugto sa pag-uswag sa plastik. Ang gibalhin nga hCO (t-hCO) nga mga neuron nag-agi sa igo nga pagkahinog, nakadawat thalamocortical ug cortical-cortical inputs nga nagkuha sa sensory nga mga tubag, ug nagpalapad sa axonal projection ngadto sa utok sa ilaga aron sa pagduso sa pagpangitag ganti nga kinaiya. Ang dugay nga pagkahinog sa t-hCO nagpadayag sa mga depekto sa neuronal sa mga pasyente nga adunay Timothy's syndrome (TS), usa ka grabe nga genetic disorder nga gipahinabo sa mutasyon sa sensitibo sa boltahe nga L-type nga CaV1.2 calcium channel (gi-encode sa CACNA1C).
Aron matun-an ang mga cortical neuron sa tawo sa mga sirkito sa vivo, among gibalhin sa stereotactically ang intact 3D hCO ngadto sa S1 sa sayo nga postnatal athymic rats (mga adlaw 3-7 postnatally) (Fig. 1a ug gipalapdan nga datos sa Fig. 1a-c). Niini nga punto, ang thalamocortical ug corticocortical axonal projection wala pa makompleto ang ilang S1 innervation (ref. 13). Busa, kini nga pamaagi gidisenyo aron mapadako ang t-hCO integration samtang gipamenos ang epekto sa endogenous circuits. Aron mahanduraw ang lokasyon sa t-hCO sa buhi nga mga hayop, among gihimo ang T2-weighted MRI brain reconstructions sa mga ilaga 2-3 ka bulan human sa transplantation (Fig. 1b ug extended data, Fig. 1d). Ang t-hCO dali nga naobserbahan ug ang mga pagsukod sa gidaghanon sa t-hCO parehas sa mga gikalkula gikan sa mga gitakda nga mga hiwa (Extended Data Fig. 1d, e; P> 0.05). Ang t-hCO dali nga naobserbahan ug ang mga pagsukod sa gidaghanon sa t-hCO parehas sa mga gikalkula gikan sa mga gitakda nga mga hiwa (Extended Data Fig. 1d, e; P> 0.05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (рассид срезов) 1d, e; P> 0,05). Ang t-hCO dali nga naobserbahan, ug ang mga pagsukod sa volumetric nga t-hCO parehas sa gikalkula alang sa mga naayos nga seksyon (gipadako nga datos, Fig. 1d, e; P> 0.05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0.05）。很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанным для фиксированных срезов (рассид срезов) 1d, e; P> 0,05). Ang t-hCO dali nga naobserbahan, ug ang mga pagsukod sa volumetric nga t-hCO parehas sa gikalkula alang sa mga naayos nga seksyon (gipadako nga datos, Fig. 1d, e; P> 0.05).Gitino namon ang t-hCO sa 81% sa mga gi-transplant nga mga hayop mga 2 ka bulan pagkahuman sa pagbalhin (n = 72 nga mga hayop; hCO gikan sa 10 hiPS cell lines; hiPS cell lines sa Supplementary Table 1). Niini, ang 87% nahimutang sa cerebral cortex (Fig. 1c). Pinaagi sa paghimo sa serial MRI scan sa daghang mga punto sa oras sa parehas nga gibalhin nga ilaga, nakit-an namon ang siyam ka pilo nga pagtaas sa gidaghanon sa t-hCO sulod sa 3 ka bulan (Fig. 1d ug gipalapdan nga datos, Fig. 1f). Ang gibalhin nga mga mananap adunay taas nga survival rate (74%) sa 12 ka bulan nga post-transplantation (expanded data, Fig. 1g ug Supplementary Table 2), ug walay nakit-an nga motor o memory impairments, gliosis, o electroencephalogram (EEG). Data Fig. 1g ug supplementary table 2). 1h–m ug 3e).
a, Eskematiko sa eksperimento nga disenyo. Ang hCO nga nakuha gikan sa mga selula sa hiPS gibalhin ngadto sa S1 sa bag-ong natawo nga hubo nga mga ilaga sa mga adlaw nga 30-60 sa pagkalahi. b, T2-weighted coronal ug horizontal MRI nga mga hulagway nga nagpakita sa t-hCO sa S1 2 ka bulan human sa transplantation. Scale bar, 2 mm. c, Pag-ihap sa mga rate sa kalampusan sa engraftment nga gipakita alang sa matag hiPS cell line (n = 108, ang mga numero sa sulod sa mga bar nagpaila sa kantidad sa t-hCO matag linya sa hIPS cell) ug lokasyon sa cortical o subcortical (n = 88). d, MRI nga imahe sa usa ka coronary artery (wala; scale bar, 3 mm) ug katugbang nga 3D volumetric reconstruction (scale bar, 3 mm) nga nagpakita sa pagtaas sa t-hCO sa 3 ka bulan. e, Pagrepaso sa t-hCO patterns sa rat cerebral cortex. Scale bar, 1 mm. f, Representative immunocytochemical nga mga hulagway sa t-hCO nga gipakita gikan sa ibabaw sa wala ngadto sa tuo (sa panahon sa pagkalahi): PPP1R17 (4 ka bulan ang edad), NeuN (8 ka bulan ang edad), SOX9 ug GFAP (8 ka bulan ang edad), PDGFRα; (8 ka bulan), MAP2 (8 ka bulan) ug IBA1 (8 ka bulan). Scale bar, 20 µm. Ang co-expression sa HNA nagpaila sa mga selula nga gigikanan sa tawo. g, snRNA-seq: Unified manifold ug projection (UMAP) dimensionality reduction imaging sa tanang taas nga kalidad nga t-hCO nuclei human sa Seurat integration (n=3 t-hCO samples, n=2 hiPS cell lines). Astrocytes, mga selula sa linya sa astrocyte; cyc prog, circulating progenitors; GluN DL, lawom nga glutamatergic neuron; GluN DL/SP, lawom ug sublamellar glutamatergic neuron; GluN UL, ibabaw nga layer nga glutamatergic neuron; oligodendrocytes, oligodendrocytes; OPC, oligodendrocyte progenitor cells; RELN, reelin neurons. h, Gene Ontology (GO) termino enrichment analysis sa mga gene nga kamahinungdanon upregulated (adjust P <0.05, fold change> 2, gipahayag sa labing menos 10% sa nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons itandi sa hCO glutamatergic neurons. h, Gene Ontology (GO) termino enrichment analysis sa mga gene nga kamahinungdanon upregulated (adjust P <0.05, fold change> 2, gipahayag sa labing menos 10% sa nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons itandi sa hCO glutamatergic neurons. h, Анализ обогащения терминов Gene Ontology (GO) для генов со значительной активацией (скорректированный P <0,05, кратмость иять > экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическироми . h, Gene Ontology (GO) termino enrichment analysis alang sa mga gene nga adunay mahinungdanong pagpaaktibo (adjust P <0.05, fold change> 2, ekspresyon sa labing menos 10% nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons kumpara sa hCO glutamatergic neurons. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（调整后P ， 0.5 P 2，在至少10% 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语富集分析。 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 上调 （后 后 后变化> 2 ， 至少 10% 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的, GO术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность изменения> 2, экспрессируется по крайне в 1% глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO Онтологический (GO) анаглиз тебяониа. h, ang mga gene makahuluganon nga na-upregulated (gipasibo P <0.05, fold change> 2, gipahayag sa labing menos 10% sa nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons kumpara sa hCO glutamatergic neurons Ontological (GO) nga pagtuki sa termino sa pagpadato.Ang tuldok nga linya nagpaila sa aq nga kantidad nga 0.05. i, UMAP imaging sa GluN cell type sa t-hCO gamit ang label nga pagbalhin gikan sa usa ka reference 22 snRNA-seq adult motor cortex dataset. CT - corticothalamic cells, ET - extracerebral cells, IT - internal telencephalic cells, NP - duol sa projection.
Dayon among gisusi ang cytoarchitecture ug ang kinatibuk-ang komposisyon sa cellular sa t-hCO. Ang antibody staining sa rat endothelial cells nagpadayag sa vascularization sa t-hCO, samtang ang IBA1 staining nagpadayag sa presensya sa rat microglia sa tibuok graft (Fig. 1f ug expanded data, Fig. 3c, d). Ang immunostaining nagpadayag sa human nuclear antigen (HNA) nga positibo nga mga selula nga nagpahayag sa PPP1R17 (cortical progenitors), NeuN (neurons), SOX9 ug GFAP (glial-derived cells) o PDGFRα (oligodendrocyte progenitors) (Figure 1f). Aron matun-an ang cellular nga komposisyon sa t-hCO sa usa ka resolusyon sa cell, gihimo namon ang pagsunud sa single-core RNA (snRNA-seq) pagkahuman sa gibana-bana nga 8 ka bulan nga pagkalainlain. Ang daghan nga pagsala ug pagtangtang sa nuclei sa ilaga naghatag ug 21,500 ka taas nga kalidad nga mga mapa sa tawo nga mononukleyar (Fig. 1g ug gipalapdan nga datos, Fig. 4a, b). Ang mga pattern sa ekspresyon sa tipikal nga cell-type marker nagpaila sa mga pungpong sa mga mayor nga cortical cell classes, lakip ang lawom ug taphaw nga glutamatergic neurons, circulating progenitors, oligodendrocytes, ug astrocyte lineage (Fig. 1g, expanded data, Fig. 4c, ug Supplementary Table 3). Ang immunostaining alang sa SATB2 ug CTIP2 nagpakita nga bisan pa sa presensya sa cortical subtypes, ang t-hCO wala magpakita sa tin-aw nga anatomical stratification (expanded data, Fig. 3a). stage-matched snRNA-seq hCO nagpatunghag lapad nga susama nga mga klase sa selula, nga adunay pipila ka mga eksepsiyon, lakip na ang pagkawala sa oligodendrocytes ug ang presensya sa GABAergic neurons, nga mahimong magpakita sa kaniadto nga gitaho nga paborable sa vitro nga mga kondisyon alang sa lateral progenitor cells15 (gipadako nga datos, Fig. 4f - i ug Supplementary Table 4). Ang differential gene expression analysis nagpadayag sa mahinungdanong mga kalainan sa glutamatergic neurons tali sa t-hCO ug hCO (Supplementary Table 5), lakip ang pagpaaktibo sa mga set sa mga gene nga may kalabutan sa neuronal maturation sama sa synaptic signaling, dendritic localization, ug voltage-gated channel activity (Figure 1h ug Supplementary Table 5). lamesa 6). Tungod niini, ang cortical glutamatergic t-hCO neurons nagpakita sa gipadali nga transcriptional maturation.
Aron mapatin-aw kung kini nga mga pagbag-o sa transkripsyon sa t-hCO adunay kalabotan sa mga kalainan sa morphological tali sa hCO in vitro ug t-hCO sa vivo, among gitukod pag-usab ang yugto nga gipares sa biocytin nga puno sa hCO ug hCO sa mga mahait nga seksyon pagkahuman sa 7-8 nga mga bulan nga pagkalainlain. hCO neurons (Fig. 2a). Ang t-hCO neurons mas dako kaayo, adunay 1.5 ka pilo sa soma diameter, doble sa gidaghanon sa mga dendrite, ug usa ka kinatibuk-an nga unom ka pilo nga pagtaas sa kinatibuk-ang gitas-on sa dendritic kon itandi sa in vitro hCO (Fig. 2b). Dugang pa, among naobserbahan ang usa ka mas taas nga densidad sa dendritic spines sa t-hCO neurons kay sa hCO neurons (Fig. 2c). Kini nagsugyot nga ang t-hCO neurons moagi sa halapad nga dendritic elongation ug branching, nga, inubanan sa padayon nga pagdaghan sa cell, mahimong makatampo sa intensive nga pagtubo sa t-hCO human sa transplantation (Fig. 1d ug Extended Data Fig. 1f). Kini nag-aghat kanamo sa pagsusi sa mga kabtangan sa electrophysiological. Ang kapasidad sa membrana mao ang walo ka pilo nga mas taas (gipadako nga datos, Fig. 8d), ang potensyal sa pagpahulay-estado nga lamad mas hyperpolarized (gibana-bana nga 20 mV), ug ang kasamtangan nga indeyksiyon nagpahinabo sa mas taas nga maximum nga excitation rate sa t-hCO neurons kay sa hCO neurons. in vitro (Fig. 2d), e), nga nahiuyon sa mas dako ug mas komplikado nga morphological features sa t-hCO. Dugang pa, ang frequency sa spontaneous excitatory postsynaptic current events (EPSC) mas taas sa t-hCO neurons (Fig. 2f), nga nagsugyot nga ang dugang nga densidad sa dendritic spines nga naobserbahan sa t-hCO neurons nalangkit sa functional excitability. seksuwal nga synapse. Among gipamatud-an ang immature nga kinaiya sa hCO neurons in vitro pinaagi sa pagrekord sa gimarkahan nga glutamatergic neurons (expanded data, Fig. 6a-c).
a, 3D nga pagtukod pag-usab sa biocytin-filled hCO ug t-hCO neurons human sa 8 ka bulan nga pagkalahi. b, Pag-ihap sa mga bahin sa morphological (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 ug *** P <0.0001). b, Pag-ihap sa mga bahin sa morphological (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179 ug *** P <0.0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, pag-ihap sa mga bahin sa morphological (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, ug *** P <0.0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 和 。 b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0.0084，*P = 0.0179 和 。 б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов t-hCO; ** P = 0,0084, * P = 0,001). b, pag-ihap sa mga bahin sa morphological (n = 8 hCO neuron, n = 6 t-hCO neuron; ** P = 0.0084, * P = 0.0179, ug *** P <0.0001).c, 3D nga pagtukod pag-usab sa hCO ug t-hCO dendritic nga mga sanga human sa 8 ka bulan nga pagkalahi. Ang pula nga mga asterisk nagpaila sa putative dendritic spines. Dendritic spine density quantification (n = 8 hCO neurons, n = 6 t-hCO neurons; ** P = 0.0092). d, Pag-ihap sa potensyal sa pagpahulay sa lamad (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). d, Pag-ihap sa potensyal sa pagpahulay sa lamad (n = 25 hCO neuron, n = 16 t-hCO neuron; *** P <0.0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, pagpahulay sa potensyal nga quantification sa lamad (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). d, pagpahulay sa potensyal nga quantification sa lamad (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e, Ang nagbalikbalik nga aksyon nga potensyal nga pagpabuto sa hCO ug t-hCO nga gipahinabo pinaagi sa pagdugang sa kasamtangan nga mga indeyksiyon, ug pag-ihap sa labing taas nga rate sa pagpabuto (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e, Ang nagbalikbalik nga aksyon nga potensyal nga pagpabuto sa hCO ug t-hCO nga gipahinabo pinaagi sa pagdugang sa kasamtangan nga mga indeyksiyon, ug pag-ihap sa labing taas nga rate sa pagpabuto (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e. возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, ang potensyal nga aksyon nga pagpabuto pag-usab sa hCO ug t-hCO nga gipahinabo sa kasamtangan nga pagtaas ug pag-ihap sa maximum nga rate sa pagpabuto (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最大放电率的量区 = CO2神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0.0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 大 的 量化 （n（n（2（n ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0.0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO и t-hCO, вызванное увеличением подачи тока, и количественка мальценка скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). e, balik-balik nga pagpabuto sa hCO ug t-hCO nga mga potensyal nga aksyon nga gipahinabo sa dugang nga kasamtangan nga suplay ug pag-ihap sa maximum firing rate (n = 25 hCO neurons, n = 16 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) sa hCO ug t-hCO neurons sa 8 nga mga bulan sa pagkalahi, ug pag-ihap sa frequency sa synaptic nga mga panghitabo (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) sa hCO ug t-hCO neurons sa 8 nga mga bulan sa pagkalahi, ug pag-ihap sa frequency sa synaptic nga mga panghitabo (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) sa нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синтич нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) sa hCO ug t-hCO neurons sa 8 nga mga bulan sa pagkalahi ug pag-quantification sa synaptic event rates (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量化5（n CO=n 17 t-hCO 神经元；***P < 0.0001） . f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率的量匼2（n CO =2（n神率的量匼（n = 25 hCO 神率的量匼（n = 25hCO P < 0.0001） . f, спонтанные EPSC (sEPSC) sa нейронах hCO и t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественная оценка частотыч синтич нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001). f, Spontaneous EPSCs (sEPSCs) sa hCO ug t-hCO neurons sa 8 nga mga bulan sa pagkalahi ug pag-quantification sa synaptic event rates (n = 25 hCO neurons, n = 17 t-hCO neurons; *** P <0.0001).Alang sa bf, hCO ug t-hCO sa linya 1208-2 gikuha gikan sa parehas nga batch sa pagkalainlain nga gipadayon nga managsama. g, Gene set enrichment analysis (one-sided Fisher's exact test) sa mga gene nga makahuluganon nga upregulated (adjusted P <0.05, fold change> 2, gipahayag sa labing menos 10% sa nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons kumpara sa hCO glutamatergic nga mga neuron nga adunay gene sets sa sayo nga-response-response nga gene (ERG) ug sa ulahi nga pagtubag sa gene (ERG) mouse study16 ug human-specific LRGs gikan sa in vitro neurons17. g, Gene set enrichment analysis (one-sided Fisher's exact test) sa mga gene nga makahuluganon nga upregulated (adjusted P <0.05, fold change> 2, gipahayag sa labing menos 10% sa nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons kumpara sa hCO glutamatergic nga mga neuron nga adunay gene sets sa sayo nga-response-response nga gene (ERG) ug sa ulahi nga pagtubag sa gene (ERG) mouse study16 ug human-specific LRGs gikan sa in vitro neurons17. g. изменения > 2, экспрессия по меньшей мере в 10% ядер) в глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению по сравнению стеримича с глутаматергических hCO наборы генов как раннего (ERG), так и позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированных в иваных в иснисла и специфических для человека LRG из нейронов in vitro17. g, pag-analisa sa gene set enrichment (one-tailed Fisher's exact test) sa mga gene nga adunay mahinungdanong activation (adjusted P<0.05, fold change>2, expression sa labing menos 10% sa nuclei) sa t-hCO glutamatergic neurons kumpara sa hCO glutamatergic neurons sets sa duha ka sayo (ERG) ug late (LRG) nga gi-identify nga kalihokan sa tawo (LRG) ug late (LRG) nga midepende sa gene-ci6 nga kalihokan- LRGs gikan sa mga neuron sa vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0.05，倍数变化>2，在至少10%的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应(ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类特异性LRG。 g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 上调 元 上调0. ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10%的 细胞 核中 表达） 的 集富集 分析 （单侧 mangingisda 精确）研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活性 基因 的 基因 的 基因 璌 6神经元 17 中 中 17 17的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированы по сравнению с глутаматергическими нейсронами hCO P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10% Анализ обогащения набора генов (односторонний точный тест Фишего) позднего гены, зависящие от активности ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях на мышах in vivo16 и in vivo16 и нейиефсч для человека. g, t-hCO glutamatergic neurons kay kamahinungdanon upregulated kon itandi sa hCO glutamatergic neurons (adjust P<0.05, fold change>2, labing menos 10% Early response (ERG) ug late response gene enrichment analysis (one-tailed Fisher's exact test) response activity dependent genes (LRGs) nga giila sa vivo vitro mice16 neuron.Ang tuldok nga linya nagpakita sa usa ka Bonferroni-corrected P value nga 0.05. h, GluN gene expression (pseudo-package ug scaling sa matag gene) kamahinungdanon upregulated sa snRNA-seq replicas sa LRG genes sa t-hCO glutamatergic neurons. i, immunostaining nga nagpakita sa SCG2 nga ekspresyon sa t-hCO (ibabaw) ug hCO (ubos) nga mga neuron. Ang puti nga mga pana nagpunting sa mga selula sa SCG2+. Scale bar, 25 µm. Ang datos gipahayag isip mean ± standard deviation.
Base sa dugang nga kalihokan sa t-hCO nga naobserbahan sa ex vivo nga mga hiwa, ang snRNA-seq nagpadayag sa usa ka kalihokan nga nagsalig sa pag-upregulation sa mga transcript sa gene sa t-hCO kumpara sa hCO sa vitro. Ang glutamatergic t-hCO neurons nagpahayag sa mas taas nga lebel sa mga gene nga nag-regulate sa late response nga kalihokan (Fig. 2g, h), nga nakit-an sa miaging mga pagtuon sa mouse ug human neurons16,17. Pananglitan, ang BDNF18, SCG2, ug OSTN, usa ka gene nga nag-regulate sa kalihokan nga piho nga primate, nagpakita sa dugang nga ekspresyon sa t-hCO neuron kumpara sa hCO neuron (Fig. 2g-i). Sa ingon, ang mga t-hCO neuron nagpakita sa gipaayo nga mga kinaiya sa pagkahinog kumpara sa hCO neuron pinaagi sa transcriptional, morphological, ug functional analysis.
Aron sa dugang pagtimbang-timbang sa asosasyon sa t-hCO maturation uban sa utok sa tawo kalamboan, naghimo kami transcriptomic pagtandi sa fetal ug hamtong nga cortical cell type19,20 ug adult21,22 ingon man usab sa halapad nga data sa cortical gene expression23 sa panahon sa kalamboan (gipadako data, Fig. 5). ). uban sa miaging trabaho 24, ang global hCO ug t-hCO transcriptome maturation status sa 7-8 ka bulan sa pagkalahi kaylap nga nahiuyon sa panahon sa vivo development ug mao ang labing katumbas sa ulahing bahin sa kinabuhi sa fetus (Extended Data Fig. 5a). Ilabi na, among naobserbahan ang dugang nga transcriptome maturity sa t-hCO kumpara sa edad nga gipares nga hCO, ingon man usab sa transcriptome activation nga may kalabutan sa synaptogenesis, astroogenesis, ug myelination (expanded data, Fig. 5b-d). Sa lebel sa cellular, nakit-an namon ang ebidensya sa usa ka nipis nga cortex subtype sa t-hCO, nga adunay mga pungpong sa glutamatergic neuron nga nagsapaw sa hamtong nga L2 / 3, L5, ug L6 nga mga subtype sa neuron (Figure 1i). Sa kasukwahi, ang cluster overlap tali sa glutamatergic t-hCO neurons ug fetal cortical neurons mas limitado sa tunga-tunga sa pagmabdos (gipadako nga datos, Figure 5e-j). Aron mahibal-an kung ang mga t-hCO nga mga neuron parehas ba sa human postnatal neocortical neurons, among gihimo ang mga electrophysiological recording ug anatomical reconstructions sa tawhanong L2 / 3 pyramidal neurons sa hait nga mga seksyon sa human postnatal cortex (expanded data, Fig. 7a). Ang electrophysiological properties sa L2 / 3 pyramidal neurons susama sa t-hCO pyramidal neurons (expanded data, Fig. 7e). Sa morphologically, ang L2 / 3 neurons gikan sa postnatal human sample mas susama sa t-hCO kay sa hCO, bisan tuod ang L2 / 3 cells mas taas, adunay mas daghang sanga sa kinatibuk-an, ug adunay mas taas nga spine density (Fig. 3g ug gipalapdan nga datos, Fig. 7b-). G).
a, pagbalhin sa hCO nga gihimo sa kontrol ug TS hiPS nga mga linya sa cell ngadto sa neonatal nga mga ilaga. b, 3D nga pagtukod pag-usab sa biocytin-filled t-hCO neurons human sa 8 ka bulan nga pagkalahi. c, pag-ihap sa mean dendritic nga gitas-on (n = 19 control neurons, n = 21 TS neurons; ** P = 0.0041). d, 3D-reconstructed dendritic nga mga sanga gikan sa control ug TS t-hCO sa 8 nga mga bulan sa pagkalahi, ug quantification sa dendritic spine density (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, 3D-reconstructed dendritic nga mga sanga gikan sa control ug TS t-hCO sa 8 nga mga bulan sa pagkalahi, ug quantification sa dendritic spine density (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количествентка стоцлоция дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D nga pagtukod pag-usab sa dendritic nga mga sanga gikan sa kontrol ug t-hCO TS sa 8 nga mga bulan sa pagkalahi ug dendritic spine density quantification (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化（n = 16 个度21 个TS 神经元，***P < 0.0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 以及 树突棘 密度 量化 ／化 （n元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p <0.0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля и TS t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и количественныписти отденка шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS нейронов, *** P <0,0001). d, 3D nga pagtukod pag-usab sa control dendritic nga mga sanga ug TS t-hCO sa 8 nga mga bulan sa pagkalahi ug dendritic spine density quantification (n = 16 control neurons, n = 21 TS neurons, *** P <0.0001).Ang pula nga mga asterisk nagpaila sa putative dendritic spines. e, kusog nga EPSCs sa kontrol ug TS t-hCO neurons human sa 8 ka bulan sa pagkalahi. f, cumulative frequency plot ug quantification sa frequency ug amplitude sa synaptic nga mga panghitabo (n = 32 control neurons, n = 26 TS neurons; ** P = 0.0076 ug P = 0.8102). g, Pagtuki sa Scholl sa TS ug pagkontrol sa mga neuron sa hCO ug t-hCO. Ang mga linya nga giputol nagpakita sa tawhanong L2 / 3 postnatal pyramidal neurons alang sa pagtandi (n = 24 control t-hCO neurons, n = 21 TS t-hCO neurons, n = 8 control hCO neurons, ug n = 7 TS hCO neurons). Ang datos gipahayag isip mean ± standard deviation
Ang katakus sa t-hCO sa pagkopya sa morphological ug functional nga mga bahin sa mga neuron sa cortex sa tawo sa taas nga lebel nag-aghat kanamo sa pagsusi kung ang t-hCO mahimong magamit aron mahibal-an ang mga sakit nga phenotypes. Nagtutok kami sa TS, usa ka grabe nga sakit sa neurodevelopmental nga gipahinabo sa mutation sa gain-of-function sa gene nga nag-encode sa CaV1.2, nga nagpasiugda sa transkripsyon sa gene nga nagsalig sa kalihokan sa mga neuron. Nakuha namo ang hCO gikan sa tulo ka mga pasyente sa TS nga nagdala sa labing komon nga substitution (p.G406R) ug tulo ka mga kontrol (Fig. 3a). Human sa transplantation, among nakita nga ang dendritic morphology giusab sa TS neurons kumpara sa mga kontrol (Fig. 3b ug expanded data, Fig. 8a, b), nga adunay duha ka pilo nga pagtaas sa gidaghanon sa mga primary dendrites ug usa ka kinatibuk-ang pagtaas sa mean ug kinatibuk-ang pagkunhod sa dendritic length (Fig. 3c ug extended data, Fig. 8c). Kini nalangkit sa usa ka dugang nga densidad sa mga tunok ug usa ka dugang nga frequency sa mga spontaneous EPSCs sa TS kumpara sa pagkontrolar sa mga neuron (Fig. 3d-f ug gipalapdan nga datos, Fig. 8g). Ang dugang nga pagtuki nagpadayag sa mga sumbanan sa abnormal nga dendritic branching sa t-hCO TS kumpara sa mga kontrol, apan dili sa in vitro TS hCO sa susama nga yugto sa pagkalahi (Fig. 3g). Nahiuyon kini sa among nangaging mga taho sa pag-us-os sa dendritic nga nagsalig sa kalihokan sa TS ug gipasiugda ang katakus sa kini nga platform sa transplant aron mahibal-an ang mga sakit nga phenotypes sa vivo.
Gipangutana dayon namo kung unsa nga gidak-on ang mga t-hCO nga mga selula nga magamit sa ilaga S1. Ang S1 sa mga rodent nakadawat og lig-on nga synaptic inputs gikan sa ipsilateral ventral basal ug posterior thalamic nuclei, ingon man ang ipsilateral motor ug secondary somatosensory cortices, ug contralateral S1 (Fig. 4a). Aron mapasig-uli ang innervation pattern, nataptan namo ang hCO sa rabies virus-dG-GFP/AAV-G ug gi-transplant ang hCO ngadto sa S1 nga ilaga paglabay sa 3 ka adlaw. Naobserbahan namon ang dasok nga ekspresyon sa GFP sa mga neuron sa ipsilateral S1 ug ventral basal ganglia 7-14 ka adlaw pagkahuman sa pagbalhin (Fig. 4b, c). Dugang pa, ang antibody staining sa thalamic marker netrin G1 nagpadayag sa presensya sa thalamic endings sa t-hCO (Fig. 4d, e). Aron mahibal-an kung kini nga mga afferent projection mahimo’g makuha ang mga tubag sa synaptic sa mga t-hCO nga mga selula, gihimo namon ang tibuuk nga mga pagrekord sa cell gikan sa mga selula sa tawo sa hait nga mga seksyon sa thalamocortical layer. Electrical stimulation sa rat S1, internal capsule, white matter, fibers duol sa t-hCO o optogenetic activation sa opsin-expressing thalamic endings sa t-hCO-induced short-latency EPSCs sa t-hCO neurons nga naladlad sa AMPA receptor antagonist NBQX. (Fig. 4f, g ug extended data, Fig. 9a-g). Gipakita niini nga mga datos nga ang t-hCO kay anatomically gisagol sa utok sa ilaga ug mahimo nga ma-activate sa tisyu sa host sa ilaga.
a, Schematic diagram sa eksperimento sa pagsubay sa rabies. b, GFP ug espesipiko sa tawo nga STEM121 nga ekspresyon tali sa t-hCO ug rat cerebral cortex (ibabaw nga panel). Gipakita usab ang ekspresyon sa GFP sa ilaga nga ipsilateral ventral basal nucleus (VB) (ubos nga wala) ug ipsilateral S1 (ubos nga tuo). Scale bar, 50 µm. Ang pula nga mga kwadro nagrepresentar sa mga bahin sa utok diin gikuha ang mga imahe. c, pag-ihap sa mga selula nga nagpahayag sa GFP (n = 4 nga mga ilaga). d, e - Netrin G1 + thalamic terminal sa t-hCO. d nagpakita sa usa ka coronal nga seksyon nga adunay t-hCO ug VB nuclei. Scale bar, 2 mm. e nagpakita sa Netrin G1 ug STEM121 nga ekspresyon sa t-hCO (wala) ug VB (tuo) nga mga neuron. Scale bar, 50 µm. Ang orange nga tuldok nga linya nagpaila sa utlanan sa t-hCO. f, g, Current traces sa t-hCO neurons human sa electrical stimulation sa S1 rat (f) o internal capsule (g), nga adunay (purple) o walay (itom) NBQX (wala). EPSC amplitudes nga adunay ug walay NBQX (n = 6 S1 neurons, * P = 0.0119; ug n = 6 internal capsule neurons, ** P = 0.0022) (sentro). Porsiyento sa t-hCO neurons nga nagpakita sa EPSC isip tubag sa electrical stimulation sa ilaga S1 (f) o internal capsule (g) (tuo). aCSF, artipisyal nga cerebrospinal fluid. h, schematic diagram sa 2P imaging experiment (wala). Pagpahayag sa GCaMP6s sa t-hCO (tunga). Scale bar, 100 µm. Fluorescence time lapse sa GCaMP6s (tuo). i, Z-score sa kusog nga kalihokan sa fluorescence. j, eskematiko nga ilustrasyon sa pagpukaw sa bigote. k, z-scored 2P fluorescence trajectories sa usa ka pagsulay, aligned with whisker deviation sa time zero (dashed line) sa mga cell cell. l, populasyon-average nga z-score nga mga tubag sa tanan nga mga selula nga nahiuyon sa whisker deviation sa oras nga zero (dashed line) (pula) o randomly generated timestamps (grey). m. Schematic diagram sa eksperimento sa optical marking. n, Raw nga kurba sa boltahe gikan sa usa ka pananglitan nga t-hCO cell atol sa blue laser stimulation o whisker deflection. Ang pula nga mga pana nagpakita sa unang mga spike tungod sa kahayag (ibabaw) o tungod sa whisker deflection (ubos). Ang grey shading nagpaila sa mga panahon sa pagtipas sa whisker. o, Peak light waveforms ug whisker deflection nga mga tubag. p, mga spike sa usa ka pagsulay, nga nahiuyon sa pagtipas sa mga bungot sa mga selula sa panig-ingnan. Ang 0 nagpaila sa whisker deviation (giputol nga linya). q, populasyon-average nga z-score firing rate para sa tanang photosensitive nga mga selula, aligned sa whisker deviation sa oras nga zero (dashed line) (pula) o randomly generated timestamps (grey). r, Proporsyon sa mga photosensitive nga yunit nga mahinungdanon nga modulated sa whisker deviation (n = 3 nga mga ilaga) (wala). Ang peak z-score latency (n = 3 nga mga ilaga; n = 5 (light green), n = 4 (dark green), ug n = 4 (cyan) whisker deflection modulation units kada ilaga) (tuo). Ang datos gipahayag isip mean ± standard deviation
Gipangutana dayon namo kung ang t-hCO mahimong ma-activate sa sensory stimuli sa vivo. Gi-transplant namo ang hCO nga nagpahayag sa genetically encoded calcium indicators GCaMP6 ngadto sa S1 nga mga ilaga. Human sa 150 ka adlaw, naghimo kami og fiber photometry o two-photon calcium imaging (Fig. 4h ug expanded data, Fig. 10a). Nakita namon nga ang mga t-hCO nga mga selula nagpakita sa dungan nga ritmo nga kalihokan (Figure 4i, Expanded Data, Figure 10b ug Supplementary Video 1). Aron mahibal-an ang peak nga kalihokan sa t-hCO, among gihimo ang extracellular electrophysiological recording sa anesthetized transplant nga mga ilaga (gipadako nga datos, Fig. 10c-f). Nakahimo kami og mga stereotaxic coordinates gikan sa mga imahe sa MRI; sa ingon, kini nga mga natala nga mga yunit nagrepresentar sa putative nga mga neuron sa tawo, bisan kung ang electrophysiology lamang wala magtugot sa usa ka espisye sa gigikanan nga matino. Among naobserbahan ang gi-synchronize nga mga pagbuto sa kalihokan (gipadako nga datos, Fig. 10d). Ang mga pagbuto milungtad mga 460 ms ug gibulag sa mga panahon sa kahilom nga mga 2 s (gipadako nga datos, Fig. 10d, e). Ang indibidwal nga mga yunit nagpabuto sa kasagaran nga mga tulo ka round kada pagbuto, nga gibana-bana nga 73% sa mga rehistradong yunit matag pagbuto. Ang mga kalihokan sa tagsa-tagsa nga mga yunit hilabihan nga may kalabutan, ug kini nga mga correlasyon mas taas kay sa mga yunit nga giila sa wala mabakunahan nga mga mananap nga natala ubos sa sama nga mga kondisyon (gipadako nga datos, Fig. 10f). Aron mas mailhan ang spike nga mga tubag sa giila nga mga neuron nga nakuha sa tawo, naghimo kami og mga eksperimento sa light-tagging sa mga anesthetized nga ilaga nga gibalhin sa hCO nga nagpahayag sa light-sensitive cation channel rhodopsin 2 (hChR2), diin ang t-hCO neurons short-latency recognition (ubos sa 10 ms) agig tubag sa blue light stimuli (Fig.4m-Fig). Ang t-hCO neurons nagpakita sa mga pagbuto sa kusog nga kalihokan sa mga frequency nga susama sa naobserbahan sa calcium imaging, ingon man ang mga electrophysiological recording nga gihimo sa t-hCO sa walay light marking (expanded data, Fig. 10c-g). Wala’y kusog nga kalihokan nga naobserbahan sa katugbang nga mga yugto sa hCO nga natala sa vitro. Aron mahibal-an kung ang t-hCO mahimong ma-aktibo pinaagi sa sensory stimuli, among gipahilayo ang mga balbas sa ilaga gikan sa t-hCO (Fig. 4j, m ug gipalapdan nga datos, Fig. 10h, k). Sumala sa nangaging mga pagtuon8,10, ang usa ka subset sa t-hCO nga mga selula nagpakita sa dugang nga kalihokan isip tubag sa whisker deflection, nga wala maobserbahan kung ang datos gitandi sa random time stamps (Fig. 4k-q ug gipalapdan nga datos, Fig. 10h-q). Sa pagkatinuod, mahitungod sa 54% sa opto-labeled single units nagpakita sa usa ka kamahinungdanon misaka arousal rate human sa whisker stimulation, peaking sa mahitungod sa 650 ms (Fig. 4r). Gihiusa, kini nga mga datos nagsugyot nga ang t-hCO makadawat sa angay nga mga input sa pag-andar ug mahimong ma-aktibo sa mga stimuli sa kalikopan.
Gisusi dayon namo kung ang t-hCO maka-aktibo sa mga sirkito sa mga ilaga aron makontrol ang pamatasan. Una namong gisusi kung ang mga axon sa t-hCO neurons nag-proyekto sa palibot nga mga tisyu sa ilaga. Among nataptan ang hCO sa usa ka lentivirus nga nag-encode sa hChR2 nga gisagol sa EYFP (hChR2-EYFP). Human sa 110 ka adlaw, among naobserbahan ang ekspresyon sa EYFP sa ipsilateral cortical nga mga rehiyon, lakip ang auditory, motor, ug somatosensory cortices, ingon man sa subcortical nga mga rehiyon, lakip ang striatum, hippocampus, ug thalamus (Fig. 5a). Aron mahibal-an kung kini nga mga efferent projection mahimo’g makuha ang mga tubag sa synaptic sa mga selyula sa ilaga, gi-aktibo namon ang mga t-hCO nga mga selula nga nagpahayag sa hChR2-EYFP pinaagi sa pagrekord sa mga selyula sa cerebral cortex sa ilaga sa mga hait nga seksyon sa utok. Ang pagpaaktibo sa mga t-hCO axon nga adunay asul nga kahayag nga gipahinabo sa mubo nga latency nga mga EPSC sa rat pyramidal cortex neurons, nga gibabagan sa NBQX (Fig. 5b-g). Dugang pa, kini nga mga tubag mahimong babagan sa tetrodotoxin (TTX) ug gipahiuli sa 4-aminopyridine (4-AP), nga nagsugyot nga kini tungod sa monosynaptic koneksyon (Fig. 5e).
a, Schematic diagram sa axon tracking (wala). t-hCO EYFP nga ekspresyon (tuo). Scale bar, 100 µm. A1, auditory cortex, ACC, anterior cingulate cortex, d. striatum, dorsal striatum, HPC, hippocampus; Diaphragm, lateral septum, mPFC, medial prefrontal cortex, piri, piriform cortex, v. striatum, ventral striatum, VPM, ventropostomedial nucleus sa thalamus, VTA, ventral tegmental nga rehiyon. Ang pula nga mga kwadro nagrepresentar sa mga bahin sa utok diin gikuha ang mga imahe. b, Schematic diagram sa eksperimento sa stimulation. c, d, Mga pananglitan sa tubag sa blue light-induced photocurrent (ibabaw) ug boltahe (ubos) sa tawo (c) EYFP + t-hCO o ilaga (d) EYFP- cells. e, f, Kasamtangang pagsubay sa mga neuron sa ilaga human sa blue light stimulation sa t-hCO axons nga adunay TTX ug 4-AR (berde), TTX (grey) o aCSF (itom) (e), nga adunay (violet) o wala (itom) ) ) NBQX (e). g, latency sa mga tubag nga gipahinabo sa asul nga kahayag sa mga selula sa ilaga (n = 16 nga mga selula); Ang pinahigda nga mga bar nagpakita sa kasagaran nga latency (7.13 ms) (wala). Amplitude sa light-evoked EPSCs nga natala nga adunay o walay NBQX (n = 7 cells; *** P <0.0001) (tunga). Amplitude sa light-evoked EPSCs nga natala nga adunay o walay NBQX (n = 7 cells; *** P <0.0001) (tunga). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с o без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (sa центре). Amplitude sa light-induced EPSCs nga natala nga adunay o walay NBQX (n = 7 cells; *** P <0.0001) (sentro).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0.0001）（中）。 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с o без NBQX (n = 7 клеток; ***P <0,0001) (sa центре). Amplitude sa light-induced EPSCs nga natala nga adunay o walay NBQX (n = 7 cells; *** P <0.0001) (sentro).Porsiyento sa mga selula sa ilaga nga nagpakita sa mga EPSC nga motubag sa asul nga kahayag (tuo). h, Schematic diagram sa usa ka buluhaton sa pamatasan. d0, adlaw 0. i. Pagpasundayag sa maayong mga mananap sa adlaw 1 (wala) o adlaw 15 (tuo) sa pagbansay. Ang kasagaran nga gidaghanon sa mga licks nga gihimo sa adlaw nga 1 (wala) o adlaw nga 15 (tuo nga sentro) (n = 150 asul nga kahayag nga mga pagsulay, n = 150 pula nga kahayag nga pagsulay; *** P <0.0001). Ang kasagaran nga gidaghanon sa mga licks nga gihimo sa adlaw nga 1 (wala) o adlaw nga 15 (tuo nga sentro) (n = 150 asul nga kahayag nga mga pagsulay, n = 150 pula nga kahayag nga pagsulay; *** P <0.0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) o день 15 (sa центре справа) (n = 150 испытаний с = сито5м, n = сито5м испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Ang gipasabot nga gidaghanon sa mga licks nga gihimo sa adlaw nga 1 (wala) o adlaw nga 15 (tunga sa tuo) (n = 150 blue light trials, n = 150 red light trials; *** P <0.0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150次红光试验；***P < 0.001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (слева) o день 15 (sa центре справа) (n = 150 испытаний с = сито5м, n = сито5м испытаний с красным светом; ***P <0,0001). Ang gipasabot nga gidaghanon sa mga licks nga gihimo sa adlaw nga 1 (wala) o adlaw nga 15 (tunga sa tuo) (n = 150 blue light trials, n = 150 red light trials; *** P <0.0001).Kumulative licks para sa pula ug asul nga kahayag nga pagsulay sa adlaw 1 (sa wala sa tunga) o adlaw 15 (tuo). NS, dili mahinungdanon. j, k, Mga kinaiya sa pamatasan sa tanan nga mga hayop nga gibalhin sa t-hCO nga nagpahayag sa hChR2-EYFP (j) o pagkontrol sa fluorophore (k) sa adlaw nga 1 o 15 (hChR2-EYFP: n = 9 nga ilaga, ** P = 0.0049; kontrol: n = 9, P = 0.1497). l, Ebolusyon sa marka sa gusto (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Ebolusyon sa marka sa gusto (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; ** P <0.001, *** P <0.0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Ebolusyon sa marka sa gusto (n = 9 hChR2, n = 9 nga mga kontrol; ** P <0.001, *** P <0.0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0.001，***P < 0.0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Ebolusyon sa mga marka sa gusto (n = 9 hChR2, n = 9 nga mga kontrol; ** P <0.001, *** P <0.0001).m, ekspresyon sa FOS agig tubag sa optogenetic activation sa t-hCO sa S1. Ang mga hulagway sa ekspresyon sa FOS (wala), ug quantification (n = 3 kada grupo; *P <0.05, **P <0.01 ug ***P <0.001) (tuo) gipakita. Ang mga hulagway sa ekspresyon sa FOS (wala), ug quantification (n = 3 kada grupo; *P <0.05, **P <0.01 ug ***P <0.001) (tuo) gipakita. Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01, и *** P <0,01,001) Ang mga hulagway sa ekspresyon sa FOS (wala) ug quantification (n = 3 matag grupo; * P <0.05, ** P <0.01, ug *** P <0.001) gipakita (tuo).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾）。显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0.05、**P < 0.01 和***P < 0.001）（叾）。 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) и количественного определения (n = 3 на группу; * P <0,05, ** P <0,01, и *** P <0,01,001) Ang mga hulagway sa ekspresyon sa FOS (wala) ug quantification (n = 3 matag grupo; * P <0.05, ** P <0.01, ug *** P <0.001) gipakita (tuo).Scale bar, 100 µm. Ang mga datos gipahayag isip mean ± standard error sa BLA, basolateral tonsil, MDT, dorsomedial thalamic nucleus, PAG, periaqueductal grey.
Sa katapusan, nangutana kami kung ang t-hCO maka-modulate sa pamatasan sa ilaga. Aron masulayan kini, among gi-transplant ang hChR2-EYFP-expressing hCO ngadto sa S1, ug 90 ka adlaw ang milabay, among gi-implant ang optical fibers ngadto sa t-hCO para sa light delivery. Gibansay dayon namo ang mga ilaga nga adunay giusab nga operant conditioning paradigm (Fig. 5h). Gibutang namon ang mga hayop sa usa ka lawak sa pagsulay sa pamatasan ug random nga gigamit ang 5 segundo nga asul (473 nm) ug pula (635 nm) laser stimuli. Ang mga mananap nakadawat og ganti sa tubig kon sila motila atol sa blue light stimulation apan dili motila atol sa red light stimulation. Sa unang adlaw sa pagbansay-bansay, ang mga mananap nagpakita nga walay kalainan sa pagdila kon stimulated sa asul o pula nga kahayag. Bisan pa, sa adlaw nga 15, ang mga hayop nga gi-transplant nga adunay hCO nga nagpahayag sa hChR2-EYFP nagpakita nga labi ka aktibo nga pagdila kung gipukaw sa asul nga kahayag kumpara sa red light stimulation. Kini nga mga pagbag-o sa pamatasan sa pagdila wala naobserbahan sa mga kontrol nga hayop nga gibalhin sa hCO nga nagpahayag sa control fluorophore (rate sa kalampusan sa pagkat-on: hChR2 89%, EYFP 0%, Figure 5i-1 ug Supplementary Video 2). Kini nga mga datos nagsugyot nga ang mga t-hCO nga mga selula maka-aktibo sa mga neuron sa ilaga aron mapukaw ang pamatasan nga nangitag ganti. Aron mahibal-an kung unsang mga rat t-hCO neural circuits ang mahimong maapil sa kini nga mga pagbag-o sa pamatasan, gi-aktibo namon nga optogenetically ang t-hCO sa nabansay nga mga hayop ug mga ani nga tisyu pagkahuman sa 90 minuto. Gipadayag sa immunohistochemistry ang pagpahayag sa protina nga nagsalig sa kalihokan nga FOS sa daghang mga rehiyon sa utok nga nalambigit sa nadasig nga pamatasan, lakip ang medial prefrontal cortex, medial thalamus, ug periaqueductal gray nga butang, nga gipahayag sa wala’y stimulated control nga mga hayop o sa mga hayop. bugas. 5m). Gihiusa, kini nga mga datos nagsugyot nga ang t-hCO mahimo’g modulate ang kalihokan sa neuronal sa ilaga aron magmaneho sa pamatasan.
Ang mga neural organoids nagrepresentar sa usa ka maayong sistema alang sa pagtuon sa kalamboan sa tawo ug sakit sa vitro, apan kini limitado sa kakulang sa mga koneksyon tali sa mga sirkito nga anaa sa vivo. Naghimo kami og usa ka nobela nga plataporma diin among gibalhin ang hCO ngadto sa S1 sa immunocompromised nga sayo nga postnatal nga mga ilaga aron tun-an ang pagpalambo sa selula sa tawo ug pag-obra sa vivo. Gipakita namo nga ang t-hCO nagpalambo sa hamtong nga mga tipo sa selula nga wala makita sa vitro28 ug nga ang t-hCO kay anatomically ug functionally nga gisagol sa utok sa ilaga. Ang pag-integrate sa t-hCO ngadto sa rodent neural circuits nagtugot kanamo sa pag-establisar og usa ka sumpay tali sa kalihokan sa selula sa tawo ug pagtuon sa kinaiya sa mananap, nga nagpakita nga ang t-hCO neurons mahimong modulate sa rat neuronal nga kalihokan aron sa pagduso sa mga tubag sa pamatasan.
Ang plataporma nga among gihulagway adunay daghang mga bentaha kaysa sa miaging panukiduki bahin sa pagbalhin sa mga selula sa tawo ngadto sa utok sa ilaga. Una, gibalhin namo ang hCO ngadto sa nag-uswag nga cortex sa sayo nga postnatal nga mga ilaga, nga mahimong mapadali ang anatomical ug functional integration. Ikaduha, ang pag-monitor sa t-hCO MRI nagtugot kanamo sa pagtuon sa posisyon sa graft ug pagtubo sa buhi nga mga hayop, nga nagtugot kanamo sa pagpahigayon sa dugay nga mga pagtuon sa multi-hayop ug pag-establisar sa pagkakasaligan sa daghang linya sa hiPS cell. Sa katapusan, among gi-transplant ang mga intact organoids, imbes nga nahimulag nga single cell suspensions, nga dili kaayo makadaot sa mga selula sa tawo ug makapasiugda sa paghiusa ug pagmugna sa human cortex neurons sa utok sa ilaga.
Giila namo nga bisan pa sa mga pag-uswag niini nga plataporma, ang temporal, spatial, ug cross-species nga mga pagpugong makapugong sa pagporma sa mga neural circuit sa tawo nga adunay taas nga pagkamatinud-anon, bisan human sa pagbalhin sa sayo nga yugto sa kalamboan. Pananglitan, dili klaro kung ang kusog nga kalihokan nga naobserbahan sa t-hCO nagrepresentar sa usa ka phenotype sa pag-uswag nga susama sa ritmikong kalihokan nga naobserbahan sa panahon sa pag-uswag sa cortical, o kung kini tungod sa pagkawala sa mga suppressive nga tipo sa cell nga naa sa t-hCO. Sa susama, dili klaro kung unsa kadako ang pagkawala sa lamination sa t-hCO makaapekto sa koneksyon sa kadena30. Ang umaabot nga trabaho mag-focus sa pag-integrate sa ubang mga tipo sa selula sama sa microglia sa tawo, human endothelial cells, ug lain-laing mga proporsiyon sa GABAergic interneurons sama sa gipakita gamit ang assembly 6 in vitro, ingon man ang pagsabot kung giunsa ang neural integration ug pagproseso mahimong mahitabo sa giusab nga t-hCO. transcriptional, synaptic ug behavioral nga lebel sa mga selula nga nakuha gikan sa mga pasyente.
Sa kinatibuk-an, kini nga in vivo nga plataporma nagrepresentar sa usa ka kusgan nga kapanguhaan nga makadugang sa in vitro nga pag-uswag sa utok sa tawo ug panukiduki sa sakit. Gipaabut namon nga kini nga plataporma magtugot kanamo sa pagdiskubre sa mga bag-ong strand-level phenotypes sa kung dili makit-an nga mga selula nga nakuha sa pasyente ug pagsulay sa bag-ong mga estratehiya sa pagtambal.
Naghimo kami og hCO2.5 gikan sa mga selula sa HiPS sama sa gihulagway kaniadto. Aron masugdan ang produksiyon sa hCO gikan sa mga selula sa hiPS nga gi-kultura sa mga layer sa feeder, ang wala’y sulod nga mga kolonya sa mga selula sa hiPS gikuha gikan sa mga pinggan sa kultura gamit ang dispase (0.35 mg / mL) ug gibalhin sa mga ultra-low attachment nga plastik nga kultura nga adunay sulud nga mga pinggan nga adunay medium nga kultura sa hiPS cell. (Corning) nga gidugangan sa duha ka SMAD inhibitors dorsomorphine (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ug SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) ug ROCK inhibitor Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Sa unang 5 ka adlaw, ang hiPS cell medium giusab kada adlaw ug gidugang ang dorsomorphine ug SB-431542. Sa ikaunom nga adlaw sa pagsuspinde, ang mga neural spheroid gibalhin ngadto sa neural medium nga adunay neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement nga walay bitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin ug streptomycin (1: 100, Life Technologies) ug gidugangan sa e (100 ml; R&D Systems) ug fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) hangtod sa adlaw nga 24. Gikan sa adlaw nga 25 hangtod sa adlaw nga 42, ang medium gidugangan sa utok nga nakuha nga neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ug neurotrophin 3 (NT3; 20 nga lain nga mga pagbag-o sa ml nga adlaw) Sa ikaunom nga adlaw sa pagsuspinde, ang mga neural spheroid gibalhin ngadto sa neural medium nga adunay neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement nga walay bitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin ug streptomycin (1: 100, Life Technologies) ug gidugangan sa e (100 ml; R&D Systems) ug fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) hangtod sa adlaw nga 24. Gikan sa adlaw nga 25 hangtod sa adlaw nga 42, ang medium gidugangan sa utok nga nakuha nga neurotrophic factor (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) ug neurotrophin 3 (NT3; 20 nga lain nga mga pagbag-o sa ml nga adlaw)Sa ikaunom nga adlaw sa pagsuspinde, ang mga neural spheroid gibalhin sa usa ka neural medium nga adunay Neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement nga walay bitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) ug дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нг/мл; R&D Systems) ug фактором роста фиг; 2мста фиброб R&D Systems) hangtod sa 24-gо дня. ug streptomycin (1:100, Life Technologies) ug gidugangan sa epidermal growth factor (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) ug fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) hangtod sa adlaw nga 24.Gikan sa mga adlaw nga 25 ngadto sa 42, ang neurotrophic factor nga nakuha sa utok (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ug neurotrophin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) gidugang sa medium, nga nag-usab sa medium kada adlaw.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobosal-A（10888，Life Technologies）、不含维生素A 的B-27补充剂（12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉素（1:10（1:10 Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF ngR2；；20 Sistema）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神经 球体 转移 含有 含有 neurobasal-a （10888 ， Life Technologies） 不 含 的索2补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的 神经 培养 基 中 链霉素 （1（素 （1（素 （1（素 （1（素 （1（素生长 因子 （（（20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R&D System＇4至；笛国至。 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую нейробазал-А (10888, Life Technologies), добизав7 А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализованный стрептомицин (1:100, Life Technologies) с добавлением эпидермальактор нг мл-1; R&D Systems) ug фактора роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг мл-1) 1; Sa adlaw nga 6, ang mga suspensyon sa neurosphere gibalhin ngadto sa usa ka suplemento nga adunay neurobasal-A (10888, Life Technologies), B-27 supplement nga walay bitamina A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1: 100, Life Technologies), penicillin-neutralized streptomycin (1: 100, Life Technologies) nga gidugangan sa epidermal 1; R0; fibroblast growth factor 2 (FGF2; 20 ng ml-1) 1; R&D Systems) hangtod sa 24-gо дня. Mga Sistema sa R&D) hangtod sa adlaw nga 24.Gikan sa mga adlaw nga 25 hangtod 42, ang neurotrophic factor nga nakuha sa utok (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) ug neurotrophic factor 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech) gidugang sa medium nga kultura matag adlaw. Medium nga pagbag-o kausa.Sugod sa adlaw nga 43, ang hCO gipadayon sa wala’y dugang nga neurobasal-A medium (NM; 1088022, Thermo Fisher) nga adunay medium nga pagbag-o matag 4-6 ka adlaw. Aron makuha ang hCO gikan sa mga selula sa hiPS nga gi-kultura ubos sa mga kondisyon nga walay feeder, ang mga selula sa hiPS gilusok sa Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) sa 37 ° C sulod sa 7 ka minuto, gibahin ngadto sa mga single nga mga selula, ug gibutang sa AggreWell 800 nga mga plato (34815, STEMCELL Technologies) sa usa ka densidad sa 3 × 106 nga mga selyula nga suplemento sa ROCK nga medium nga medium. Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Pagkahuman sa 24 ka oras, ang media sa mga atabay gipipet pataas ug paubos sa media nga adunay sulud nga Essential 6 media (A1516401, Life Technologies) nga gidugangan sa dorsomorphine (2.5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) ug SB-431542 (10 μM; 1614). , Tocrida). Gikan sa mga adlaw nga 2 hangtod 6, ang Essential 6 medium gipulihan adlaw-adlaw sa dorsomorphine ug suplemento sa SB-431542. Gikan sa ikaunom nga adlaw, ang mga suspensyon sa neurosphere gibalhin ngadto sa neurobasal medium ug gipadayon sama sa gihulagway sa ibabaw.
Ang tanan nga mga pamaagi sa hayop gihimo subay sa mga panudlo sa pag-atiman sa hayop nga gi-aprubahan sa Stanford University Laboratory Animal Care Administrative Committee (APLAC). Ang mga mabdos nga euthymic RNU (rnu/+) nga mga ilaga gipalit (Charles River Laboratories) o gipapuyo. Ang mga mananap gitipigan sa 12-oras nga light-dark nga siklo nga adunay pagkaon ug tubig ad libitum. Ang hubo (FOXN1–/–) nga mga itoy sa ilaga nga nag-edad og tulo ngadto sa pito ka adlaw giila pinaagi sa pagtubo sa dili pa hamtong nga mga bungot sa wala pa i-culling. Ang mga itoy (lalaki ug babaye) gi-anesthetize sa 2-3% isoflurane ug gibutang sa stereotaxic frame. Ang usa ka trepanation sa kalabera nga adunay diyametro nga gibana-bana nga 2-3 mm sa ibabaw sa S1 gihimo samtang nagmintinar sa integridad sa dura mater. Dayon gamita ang 30-G nga dagom (gibana-bana nga 0.3 mm) sa gawas lang sa craniotomy aron tusok ang dura. Dayon ibutang ang HCO sa usa ka nipis nga 3 × 3 cm nga parafilm ug kuhaa ang sobra nga medium. Gamit ang Hamilton syringe nga gitaod sa 23 G, 45° nga dagom, hinayhinay nga kuhaa ang hCO ngadto sa kinalay-ang tumoy sa dagom. Dayon i-install ang syringe sa syringe pump nga konektado sa stereotaxic device. Dayon ibutang ang tumoy sa dagom sa usa ka kaniadto nga gihimo nga 0.3 mm ang gilapdon nga puncture hole sa dura (z = 0 mm) ug pig-ot ang syringe 1-2 mm (z = gibana-bana nga –1.5 mm) hangtud nga ang dagom anaa sa taliwala sa dura mater A. usa ka dasok nga selyo ang naporma. Dayon ipataas ang syringe sa tunga sa cortical surface sa z = -0.5 mm ug i-inject ang hCO sa gikusgon nga 1-2 µl kada minuto. Pagkahuman sa pag-injection sa hCO, ang dagom gibawi sa rate nga 0.2-0.5 mm matag minuto, ang panit gitahi, ug ang itoy gibutang dayon sa usa ka mainit nga pad sa pagpainit hangtod sa hingpit nga pagkaayo. Ang ubang mga mananap gi-transplant bilaterally.
Ang tanan nga mga pamaagi sa hayop gihimo subay sa mga panudlo sa pag-atiman sa hayop nga giaprubahan sa Stanford University APLAC. Ang mga ilaga (labaw pa sa 60 ka adlaw human sa pagbalhin) giaghat sa 5% nga isoflurane anesthesia ug gi-anesthetize sa 1-3% nga isoflurane atol sa imaging. Alang sa visualization, ang usa ka 7 Tesla nga aktibong nanalipod sa horizontal borehole scanner Bruker (Bruker Corp.) nga adunay usa ka International Electric Company (IECO) gradient drive, usa ka shielded gradient insert nga adunay internal diameter nga 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) gigamit gamit ang AVANCE. III, walo ka channel nga multi-coil RF ug multi-core nga kapabilidad, ug ang kauban nga Paravision 6.0.1 nga plataporma. Ang pagrekord gihimo gamit ang aktibong decoupled volumetric RF coil nga adunay internal diameter nga 86 mm ug upat ka channel nga cryo-cooled RF coil para lang makadawat. Axial 2D Turbo-RARE (panahon sa pagbalik-balik = 2500 ms, oras sa echo = 33 ms, 2 aberids) nga adunay 16 nga mga pagdakop sa slice, gibag-on sa slice 0.6-0.8 mm, nga adunay 256 × 256 nga mga sample. Ang mga signal nadawat gamit ang quadrature transceiver volumetric RF coil nga adunay internal diameter nga 2 cm (Rapid MR International, LLC). Sa katapusan, gamita ang built-in nga Imaris (BitPlane) nga mga function sa pagtantiya sa ibabaw para sa 3D rendering ug volume analysis. Ang usa ka malampuson nga transplant gihubit nga usa diin ang mga lugar sa padayon nga T2-weighted nga MRI signal naporma sa transplanted hemisphere. Ang pagsalikway sa graft gihubit isip usa ka graft nga wala makahimo og mga lugar nga padayon nga T2-weighted nga MRI signal sa transplanted hemisphere. Ang subcortical t-hCO wala iapil sa sunod nga pagtuki.
Aron lig-on nga ipahayag ang GCaMP6s sa hCO alang sa duha ka photon calcium imaging, ang mga selula sa hiPS nataptan sa pLV [Exp] -EF1a :: GcaMP6s-WPRE-Puro nga gisundan sa pagpili sa mga antibiotics. Sa laktud, ang mga selula gibulag sa EDTA ug gisuspinde sa 1 ml sa Essential 8 medium sa usa ka densidad nga gibana-bana nga 300,000 ka mga selula sa presensya sa polybrene (5 μg / ml) ug 15 μl sa virus. Ang mga selyula dayon gilumlom sa suspensyon sulod sa 60 ka minuto ug gisabod sa densidad nga 50,000 ka mga selula matag atabay. Human sa panagtagbo, ang mga selula gitambalan sa 5-10 μg ml-1 puromycin sulod sa 5-10 ka adlaw o hangtud nga makita ang mga stable nga kolonya. Ang mahait nga impeksyon sa hCO gihimo sama sa gihulagway kaniadto5 nga adunay pipila nga mga pagbag-o. Sa daklit, ibalhin ang adlaw nga 30-45 hCO ngadto sa 1.5 ml nga Eppendorf microcentrifuge tubes nga adunay sulod nga 100 µl nga nerve medium. Dayon gibana-bana nga 90 µl sa medium ang gikuha, 3-6 µl nga high titer lentivirus (gikan sa 0.5 x 108 ngadto sa 1.2 x 109) idugang sa tubo, ug ang hCO ibalhin ngadto sa incubator sulod sa 30 minutos. Dayon idugang ang 90-100 µl nga medium sa matag tubo ug ibalik ang mga tubo sa incubator sa tibuok gabii. Sa sunod nga adlaw, ibalhin ang hCO ngadto sa presko nga nerve medium sa ubos nga attachment plates. Human sa 7 ka adlaw, ang hCO gibalhin ngadto sa 24-well glass bottom plates para sa visualization ug evaluation sa infection quality. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE ug pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE gimugna sa VectorBuilder. Ang Lentivirus gigamit sa kadaghanan sa mga eksperimento tungod kay kini gisagol sa host genome, nga nagtugot sa reporter nga ekspresyon sa gene sa mga nataptan nga mga linya sa selula. Para sa rabies follow-up, adlaw 30-45 hCO co-infected sa rabies-ΔG-eGFP ug AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plasmid #67528, Addgene), gihugasan pag-ayo sulod sa 3 ka adlaw, ug gi-transplant ngadto sa mga ilaga sa S1 ug gi-maintain sa 7-14 nga mga adlaw.
Alang sa immunocytochemistry, ang mga hayop gi-anesthetize ug gi-transcardially perfused sa PBS nga gisundan sa 4% paraformaldehyde (PFA sa PBS; Electron Microscopy Sciences). Ang mga utok gitakda sa 4% PFA sulod sa 2 ka oras o tibuok gabii sa 4 ° C, cryopreserved sa 30% nga sucrose sa PBS sulod sa 48-72 ka oras, ug gisukip sa 1: 1, 30% sucrose: OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583 , Sakura Finetek) ug ang coronal nga seksyon 30s stat. Alang sa immunohistochemistry sa mabaga nga mga seksyon, ang mga hayop gi-perfuse sa PBS, ug ang utok gi-dissect ug gi-section sa coronally sa 300-400 µm gamit ang vibratome (Leica) ug ang mga seksyon gi-fix sa 4% PFA sulod sa 30 minutos. Dayon ang mga cryosection o baga nga mga seksyon gihugasan sa PBS, gibabagan sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa lawak (10% normal nga asno nga serum (NDS) ug 0.3% Triton X-100 nga lasaw sa PBS) ug gibabagan sa blocking solution sa 4 ° C. - Ang mga Cryosection sa Incubation gilumlum sa tibuok gabii ug ang baga nga mga seksyon gilumlum sulod sa 5 ka adlaw. Ang mga nag-unang antibodies nga gigamit mao ang: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1,000; Z0334, Dako), anti-GFP: 1,100 Genes anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (rabbit, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (rabbit, 1:2478; HPA0, Atlasbo1; HPA0, Atlasbo1) anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kanding, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1AF: 100; 16, R&D Systems anti-STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) ug anti-IBA1 (goat, ab5: ab5). Ang mga nag-unang antibodies nga gigamit mao ang: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1,000; Z0334, Dako), anti -GFP: 1,1Tex, Gene, GTX anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (rabbit, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (rabbit, 1:2478; HPA0, Atlasbo1; HPA0, Atlasbo1) anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (rabbit , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kanding, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin AF: 10, R&D Systems, Netrin G1a: 10,6 anti-STEM121 (mouse , 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) ug anti-IBA1 (goat, 6, a10b). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, abcam), анти-CTIP2 (крысиные; 5:1b, 6; анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), анти-HNA (мышь, 1:200; ab191181, нтиклик), 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круз), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, 1нти-RECA-5, Atlas; ab9774, abcam), анти-SCG2 (кролик , 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, AF10), нетрин G1a (козий, AF3075, AF10, R&D) анти-STEM121 (мышиный , 1:200; Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:4040; Miliore; (коза, 1:100; аб5076, абкам). Ang mga nag-unang antibodies nga gigamit mao ang: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP1009; anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( koneho, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (rabbit, 1:2478; HPA, Atlas908; HPA9078; HPA9078; anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (rabbit, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kanding, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1AF: 100; R&D10, R&D1A: 106; STEM121 (mouse, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) ug anti-IBA1 (kanding, 1:507).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab1911 81，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore），抗PDGFRA（兔， 1:200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Sistema），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako），抗-GFP（鸡，1:1,000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab191181，abcam），抗NeuN（兔，1:500；ABN 7 200；sc-338，Santa Cruz），抗PPP1R17（兔，1:200；HPA047819，Atlas 抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，ab9774，2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075，R&D Systems），Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D 1:2:Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (mouse, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore) ug anti-IBA1 (kanding, 1:100; ab5076, abcam).Ang mga nag-unang antibodies nga gigamit mao ang: anti-NeuN (mouse, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (rat, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (rabbit, 1:1000; Z0334, Dako) . , anti-GFP (manok, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (mouse, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (rabbit, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA ( koneho, 1:2308) (rabbit, 1:200; HPA047819, Atlas antibody), anti-RECA-1 (mouse, 1:50; ab9774, abcam), anti- SCG2 (rabbit), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems), Нетрин G1a (коза, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти -STEM121 (1:40, Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) ug анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, аб5076). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (kanding, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (kanding, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (mouse, 1:200; TaBkara Bio, 500; Tabkara Bio, 500; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (rabbit, 1:400; ABN904, Millipore), ug anti-IBA1 (kanding, 1:100; ab5076, abkam).Ang mga seksyon gihugasan dayon sa PBS ug gilumlom sa secondary antibody sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa lawak (frozen nga mga seksyon) o tibuok gabii sa 4 ° C (baga nga mga seksyon). Alexa Fluor secondary antibody (Life Technologies) lasaw 1:1000 sa blocking solusyon gigamit. Human sa paghugas sa PBS, ang nuclei makita sa usa ka Hoechst 33258 (Life Technologies). Sa katapusan, ang mga slide gibutang sa usa ka mikroskopyo nga adunay mga coverlips (Fisher Scientific) gamit ang usa ka Aquamount (Polysciences) ug gisusi sa usa ka Keyence fluorescent microscope (BZ-X analyzer) o usa ka Leica TCS SP8 confocal microscope (Las-X) sa imahe. Ang mga hulagway giproseso gamit ang ImageJ program (Fiji). Aron ma-ihap ang proporsyon sa mga neuron sa tawo sa t-hCO ug ang cortex sa ilaga, ang 387.5 μm nga lapad nga rectangular nga mga imahe gikuha sa sentro sa t-hCO, sa o duol sa ngilit sa cortex sa ilaga. Ang mga margin sa graft gitino pinaagi sa pagsusi sa mga pagbag-o sa transparency sa tisyu, HNA + nuclei, ug / o ang presensya sa autofluorescence sa tisyu. Sa matag hulagway, ang kinatibuk-ang gidaghanon sa mga selula sa NeuN+ ug HNA+ gibahin sa kinatibuk-ang gidaghanon sa mga selula sa NeuN+ sa samang dapit. Aron maseguro nga ang mga selula lamang nga adunay nuclei sa hulagway nga eroplano ang maihap, ang mga selula lamang nga Hoechst+ ang gilakip sa kalkulasyon. Duha ka mga imahe nga gibulag sa labing menos 1 mm ang gi-average aron makunhuran ang sayup sa istatistika.
Usa ka semana sa dili pa ang pagkolekta sa sampol, ibutang ang hCO transplant nga mga hayop (gibana-bana nga 8 ka bulan nga kalainan) sa usa ka ngitngit nga lawak nga adunay mga bungot nga giputol aron mamenosan ang sensory stimulation. Ang pag-inusara sa nuclei gihimo sama sa gihulagway kaniadto, nga adunay pipila nga mga pagbag-o. Sa mubo, ang t-hCO ug hCO gilaglag gamit ang detergent-mechanical cell lysis ug usa ka 2 ml glass tissue grinder (D8938, Sigma-Aldrich / KIMBLE). Ang krudo nga nuclei dayon gisala gamit ang 40 µm filter ug gi-centrifuged sa 320 g sulod sa 10 minutos sa 4 °C sa wala pa magbuhat og sucrose density gradient. Human sa centrifugation step (320 g alang sa 20 min sa 4 ° C), ang mga sample gisuspinde pag-usab sa 0.04% BSA / PBS uban ang pagdugang sa 0.2 units sa µl-1 RNase inhibitor (40 u µl-1, AM2682, Ambion) ug gipasa sa 40 µm flow filter. Ang dissociated nuclei dayon gisuspinde sa PBS nga adunay sulod nga 0.02% BSA ug gikarga sa usa ka Chromium Single Cell 3′ chip (gibana-bana nga pagbawi sa 8,000 ka mga selula kada lane). Ang mga librarya sa snRNA-seq giandam gamit ang Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ang mga librarya sa snRNA-seq giandam gamit ang Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ang mga librarya sa snRNA-seq giandam gamit ang Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Ang librarya sa snRNA-seq giandam gamit ang Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Ang mga librarya gikan sa lainlaing mga sampol gipundok ug gisunod-sunod sa Admera Health sa NovaSeq S4 (Illumina).
Ang lebel sa ekspresyon sa gene alang sa matag putative nuclear barcode gi-quantified gamit ang 10x Genomics CellRanger analysis software package (bersyon 6.1.2). Sa espesipiko, ang mga gibasa gipares sa kombinasyon sa tawo (GRCh38, Ensemble, version 98) ug ilaga (Rnor_6.0, Ensemble, version 100) reference genome nga gimugna gamit ang mkref command ug gamit ang count sa –include-introns=TRUE command sa quantitation naglakip sa mga pagbasa nga gimapa sa intron nga mga rehiyon. Alang sa mga sample sa t-hCO, ang mga nuclei sa tawo giila base sa konserbatibo nga kinahanglanon nga labing menos 95% sa tanan nga gibasa nga mapa nga katumbas sa genome sa tawo. Ang tanan nga misunod nga pagtuki gihimo sa usa ka nasala nga barcode array output gikan sa CellRanger gamit ang R package (bersyon 4.1.2) Seurat (bersyon 4.1.1)32.
Aron masiguro nga ang taas nga kalidad nga nuclei lamang ang gilakip sa sunod nga pag-analisar, usa ka proseso sa pagsala sa iterative ang gipatuman alang sa matag sample. Una, ang ubos nga kalidad nga nuclei nga adunay ubos sa 1000 ka talagsaon nga mga gene nga nakit-an ug labaw pa sa 20% sa kinatibuk-ang mitochondria ang giila ug gikuha. Pagkahuman, ang hilaw nga gene number matrix gi-normalize pinaagi sa regular nga negatibo nga binomial regression gamit ang sctransform(vst.flavor=”v2″) function, nga nagpaila usab sa 3000 most variable genes gamit ang default parameters. Pag-inspeksyon sa mga dapit sa tuhod ug gigamit alang sa tanan nga mga sample ug pag-analisar sa ensemble). (nagpasabot nga DoubletFinder score sa ibabaw sa 95th percentile).
Human makuha ang ubos nga kalidad nga mga kernel, ang integrated dataset gi-grupo (resolution = 0.5) ug gi-embed para sa UMAP34 visualization purposes. Ang mga marker genes alang sa matag cluster gitino gamit ang FindMarkers function nga adunay default nga mga parameter nga kalkulado gikan sa normalized gene expression data. Among giila ug giklasipikar ang dagkong mga klase sa selula pinaagi sa paghiusa sa fetal ug adult cortical reference datasets nga adunay marker gene expression 19,20,21,35 ug annotation. Sa partikular, ang nagpalibot nga mga pasiuna giila sa ekspresyon sa MKI67 ug TOP2A. Ang mga kumpol sa progenitor gihubit pinaagi sa pagkawala sa mga mitotic transcript, taas nga pagsapaw sa daghang mga glial progenitor cluster nga gihulagway sa ulahing metaphase fetal cortex, ug EGFR ug OLIG1 nga ekspresyon. Gigamit namo ang termino nga astrocyte aron ilakip ang pipila ka mga estado sa pagkalahi sa astrocyte, gikan sa ulahing radial glia ngadto sa pagkahinog sa mga astrocyte. Ang mga cluster sa Astrocyte nagpahayag sa taas nga lebel sa SLC1A3 ug AQP4 ug gipakita nga mapa nga adunay mga subtype sa fetal radial glia ug / o hamtong nga mga astrocytes. Ang mga OPC nagpahayag sa PDGFRA ug SOX10 samtang ang mga oligodendrocytes nagpahayag sa myelination markers (MOG ug MYRF). Ang mga glutamatergic neuron giila pinaagi sa presensya sa neuronal transcripts (SYT1 ug SNAP25), ang pagkawala sa GABAergic marker (GAD2), ug ang ekspresyon sa NEUROD6, SLC17A7, BCL11B, o SATB2. Ang mga neuron sa GluN dugang nga gibahin sa taas (SATB2 nga ekspresyon ug pagkawala sa BCL11B) ug lawom (BCL11B nga ekspresyon) nga mga subclass. Ang Putative subplate (SP) nga mga neuron nagpahayag sa nailhan nga SP18 marker sama sa ST18 ug SORCS1 dugang sa lawom nga GluN marker. Ang mga selula nga sama sa choroid plexus giila pinaagi sa ekspresyon sa TTR, ug ang mga selula nga sama sa meningeal nagpahayag sa mga gene nga nalangkit sa fibroblast ug gimapa ang pial/vascular nga mga selula sa reference data set.
Ang differential analysis sa gene expression tali sa t-hCO ug hCO subclasses gihimo gamit ang bag-ong naugmad nga pseudo-batch nga pamaagi nga giprodyus sa mga sample nga gipatuman gamit ang Libra R package (bersyon 1.0.0). Sa piho, ang edgeR log-likelihood tests (bersyon 3.36.0, package R) gihimo alang sa mga grupo pinaagi sa pagsumada sa gidaghanon sa mga gene sa mga selula alang sa gihatag nga klase sa selula alang sa matag sample nga replikasyon. Para sa heatmap visualization, ang normalized per million (CPM) values ​​​​computed gamit ang edgeR (cpm() function) ug gi-scale (aron makab-ot ang mean = 0, standard deviation = 1). Gene Ontology (GO) enrichment analysis sa kamahinungdanon upregulated t-hCO GluN genes gihimo (Benjamini-Hochberg gitul-id P value nga ubos pa kay sa 0.05 gipahayag sa labing menos 10% sa t-hCO GluN mga selula ug usa ka pilo nga pagtaas sa kausaban sa labing menos 2 ka beses). gihimo gamit ang ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Gigamit namon ang ToppFun app nga adunay default nga mga parameter ug ireport ang Benjamini-Hochberg-corrected P-values ​​​​nga kalkulado gikan sa GO-annotated hypergeometric nga mga pagsulay.
Aron ipares ang among snRNA-seq clusters nga adunay annotated cell clusters gikan sa reference studies sa primary single-cell RNA-seq o adult snRNA-seq19,20,21,22, among gi-apply ang gipares nga dataset integration approach. Gigamit namo ang SCTransform (v2) normalization workflow sa Seurat aron i-integrate ug itandi ang cluster overlaps tali sa mga dataset (gamit ang parehas nga mga parameter sama sa ibabaw). Ang mga indibidwal nga mga dataset random nga gi-subset hangtod sa 500 ka mga cell o mga core kada orihinal nga cluster para sa computational efficiency. Gamit ang parehas nga pamaagi sama sa gihulagway kaniadto, ang cluster overlap gihubit ingon ang proporsyon sa mga cell o nuclei sa matag pooled cluster nga nagsapaw sa label sa reference cluster. Para sa dugang nga pagklasipikar sa mga GluN, gigamit namo ang Seurat's TransferData workflow para sa GluN subset data para mag-assign ug reference dataset labels sa among GluN cells.
Aron masusi ang kahimtang sa pagkahinog sa global transcriptome sa t-hCO ug hCO nga mga sample, among gitandi ang among pseudo-bulk nga mga sample sa BrainSpan / psychENCODE23, nga naglangkob sa usa ka dako nga pagkasunod-sunod sa RNA nga naglangkob sa pag-uswag sa utok sa tawo. Gihimo namo ang PCA sa usa ka hiniusa nga pattern-normalized gene expression matrix gikan sa cortical sample 10 ka semana human sa pagpanamkon ug sa ulahi, sa 5567 nga mga gene (uban sa among data) nga kaniadto giila nga aktibo sa BrainSpan cortical samples (gihubit nga labaw pa sa 50% sa developmental variance nga gipatin-aw sa edad gamit ang cubic model)38. Dugang pa, nakuha namon ang mga gene nga may kalabutan sa mga mayor nga transcriptome nga pirma sa neurodevelopment gamit ang non-negative matrix factorization sama sa gihulagway kaniadto. Ang sample nga gibug-aton nga gikalkulo gamit ang non-negative matrix factorization nga pamaagi giplano sa Fig. 5b nga adunay gipalapdan nga datos alang sa matag usa sa lima ka pirma nga gihulagway ni Zhu et al.38. Pag-usab, ang nagsalig sa kalihokan nga mga marka sa transkripsyon nakuha gikan sa nauna nga gipatik nga mga pagtuon. Sa partikular, ang ERG ug LRG dako nga na-upregulated sa glutamatergic neurons nga giila sa mouse visual cortex snRNA-seq collection human sa visual stimulation gikan sa Supplementary Table 3 Hrvatin et al.16. Ang mga LRG nga gipadato sa tawo nakuha gikan sa KCl-activated human fetal brain cultures ug nag-ani sa 6 nga mga oras nga post-stimulation, ug ang mga sinala nga mga gene nadugangan pag-ayo sa mga tawo apan dili sa mga ilaga (Supplementary Table 4). Ang pagtuki sa gene set enrichment gamit kining mga gene set gihimo gamit ang one-way Fisher's exact test.
Pag-anesthetize sa mga ilaga nga adunay isoflurane, kuhaa ang utok ug ibutang sa bugnaw (gibana-bana nga 4 ° C) oxygenated (95% O2 ug 5% CO2) sucrose solution alang sa mga seksyon nga adunay: 234 mM sucrose, 11 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM. NaH2PO4, 10 mM MgSO4 ug 0.5 mM CaCl2 (mga 310 mOsm). Ang mga seksyon sa coronal sa utok sa ilaga (300-400 µm) nga adunay t-hCO gihimo gamit ang Leica VT1200 vibratome sama sa gihulagway kaniadto39. Ang mga seksyon dayon gibalhin sa usa ka sectioning chamber nga adunay padayon nga room temperature oxygenation nga adunay sulod nga aCSF nga giandam gikan sa: 10 mM glucose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 ug 126 mM NaCl (298 mM). labing menos 45 ka minuto sa wala pa ang pagrekord. Ang mga seksyon girekord sa usa ka immersed chamber diin sila padayon nga gipahid sa aCSF (95% O2 ug 5% CO2 vial). Ang tanan nga datos girekord sa temperatura sa kwarto. Ang t-hCO neurons gitapos sa usa ka borosilicate glass pipette nga puno sa usa ka solusyon nga adunay sulod nga 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, ug 0.6 mM EGTA, pH 7.2, internal nga solusyon nga gi-adjust sa KOH290 m. Aron mabawi, ang biocytin (0.2%) gidugang sa solusyon sa pagrekord.
Nakuha ang datos gamit ang MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) ug Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), low-pass nga nasala sa 2 kHz, gi-digitize sa 20 kHz, ug gi-analisa gamit ang Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab). ug custom nga MATLAB functions (Mathworks). Ang potensyal sa junction gikalkula gamit ang JPCalc ug ang mga entries gipasibo sa kalkulado nga kantidad nga -14 mV. Ang Operation IV naglangkob sa usa ka serye sa kasamtangan nga mga lakang sa 10-25 pA nga mga lakang, gikan sa -250 ngadto sa 750 pA.
Ang thalamus, puti nga butang, ug S1 afferents kay electrically stimulated sa thalamocortical slices atol sa patch-clamp recording sa hCO neurons, sama sa gihulagway kaniadto. Sa mubo, ang utok gibutang sa usa ka 3D printing table nga gikiling sa 10° nga anggulo, ug ang atubangan sa utok giputol sa 35° nga anggulo. Ang utok dayon gipapilit sa giputol nga nawong ug gibahin, nagpreserbar sa thalamocortical protruding axons. Ang bipolar tungsten electrodes (0.5 MΩ) gi-mount sa usa ka ikaduha nga micromanipulator ug estratehikong gipahimutang aron mapukaw ang upat ka mga rehiyon matag cell (sulod nga kapsula, puti nga butang, S1 ug hCO). Irekord ang mga tubag sa synaptic pagkahuman sa 300 µA phasic stimulation sa 0.03-0.1 Hz.
Ang hChR2-expressing hCO neurons gi-activate sa 480 nm ug ang light pulses nga gihimo sa usa ka LED (Prizmatix) gipadapat pinaagi sa usa ka ×40 nga tumong (0.9 NA; Olympus) aron irekord ang hChR2 nga ekspresyon duol sa mga selula. Ang nagdan-ag nga field diametro mao ang gibana-bana nga 0.5 mm ug ang kinatibuk-ang gahum mao ang 10-20 mW. Ang gilapdon sa pulso gitakda sa 10 ms, nga katumbas sa pulso nga gihatag sa panahon sa eksperimento sa pagkat-on sa pamatasan. Ang lainlaing mga frequency sa pagpadasig gigamit, gikan sa 1 hangtod 20 Hz, apan ang una nga pulso sa serye gigamit alang sa pag-ihap. Ang mga agwat sa taliwala sa mga tren kasagaran mas taas kaysa 30 s aron maminusan ang epekto sa pagpugong sa synaptic o pagpadali sa mga agianan. Aron masulayan kung ang tubag sa hChR2 monosynaptic, gipadapat namon ang TTX (1 μM) sa kaligoanan hangtod nawala ang reaksyon sa EPSC, ug dayon gipadapat ang 4-aminopyridine (4-AP; 100 μM). Kasagaran, ang usa ka tubag gibalik sa sulod sa pipila ka minuto, nga adunay gamay nga paglangan tali sa pagpabuto sa LED ug henerasyon sa EPSC. Ang NBQX (10 μM) gigamit aron masulayan kung ang tubag gimaneho sa mga receptor sa AMPA.
Ang mahait nga mga seksyon sa hCO gihimo sama sa gihulagway kaniadto. Sa laktod, ang mga seksyon sa hCO gisulod sa 4% nga agarose ug gibalhin sa mga selula nga adunay 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ug 10 mM d-(+) -0glucose sa Seksyon 0 - µm sa temperatura sa kwarto gamit ang Leica VT1200 vibrator ug gitipigan sa ASF sa temperatura sa kwarto. Dayon, ang pagrekord sa patch-camp sa tibuok nga mga selula gihimo sa mga seksyon sa hCO ubos sa direktang SliceScope microscope (Scientifica). Ang mga seksyon gi-perfused sa aCSF (95% O2 ug 5% CO2) ug ang mga signal sa cell natala sa temperatura sa lawak. Ang mga hCO neuron gipadapat gamit ang borosilicate glass pipette nga puno sa solusyon nga adunay 127 mM potassium gluconate, 8 mM NaCl, 4 mM magnesium ATP, 0.3 mM sodium GTP, 10 mM HEPES, ug 0.6 mM EGTA, internal pH 7, 2, adjust sa KOH (osmolarity). Alang sa mga katuyoan sa pagbawi, idugang ang 0.2% Biocytin sa sulud nga solusyon.
Nakuha ang datos sa Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) gamit ang MultiClamp 700B amplifier (Molecular Devices) ug usa ka Digidata 1550B digitizer (Molecular Devices), low-pass nga nasala sa 2 kHz, gi-digitize sa 20 kHz, ug gi-analisa gamit ang Clampfit (bersyon para sa 10 MAT) nga mga himan. (MATLAB 2019b, Mathworks). Ang potensyal sa junction gikalkula gamit ang JPCalc ug ang mga entries gipasibo sa kalkulado nga potensyal sa junction nga -14 mV. Ang Operation IV naglangkob sa usa ka serye sa kasamtangan nga mga lakang sa 5-10 pA nga mga lakang gikan sa -50 ngadto sa 250 pA.
Alang sa morphological reconstruction sa pinched neurons, ang 0.2% biocytin (Sigma-Aldrich) gidugang sa internal nga solusyon. Ang mga selyula giandam sa labing menos 15 ka minuto pagkahuman sa pag-hack. Ang pipette hinay-hinay nga giguyod sulod sa 1-2 ka minuto hangtud nga ang rehistradong lamad hingpit nga natakpan. Pagsunod sa pamaagi sa physiology sa seksyon, ang mga seksyon gitakda sa tibuok gabii sa 4 ° C. sa 4% PFA, gihugasan sa PBS X3, ug lasaw sa 1: 1000 nga adunay streptavidin-conjugated DyLight 549 o DyLight 405 (Vector Labs). Ang mga selula nga puno sa biocytin (2%; Sigma-Aldrich) gimarkahan atol sa pagrekord sa patch clamp sa temperatura sa lawak sulod sa 2 ka oras. Ang mga seksyon dayon gi-mount sa mga slide sa mikroskopya gamit ang usa ka Aquamount (Thermo Scientific) ug gitan-aw sa sunod nga adlaw sa usa ka Leica TCS SP8 confocal mikroskopyo gamit ang usa ka katuyoan sa pagpaunlod sa lana nga adunay usa ka numerical aperture × 40 1.3, pagpadako × 0.9-1.0, xy. Ang sampling rate mao ang gibana-bana nga 7 pixels kada micron. Ang mga Z-stack sa 1 µm interval nakuha nga serially, ug ang z-stack mosaics ug Leica-based nga auto-stitching gihimo aron matabonan ang tibuok dendritic nga kahoy sa matag neuron. Ang mga neuron dayon gisubay nga semi-manual gamit ang neuTube 40 interface ug ang mga file sa SWC namugna. Ang mga file dayon gi-upload sa SimpleNeuriteTracer41 Fiji plugin (ImageJ, version 2.1.0; NIH).
Ang tisyu sa cortical sa tawo nakuha nga adunay nahibal-an nga pagtugot sumala sa usa ka protocol nga gi-aprubahan sa Institutional Review Board sa Stanford University. Duha ka sample sa human postpartum tissue (3 ug 18 anyos) nakuha pinaagi sa resection sa frontal cortex (middle frontal gyrus) isip bahin sa operasyon alang sa refractory epilepsy. Human sa resection, ani nga tisyu sa ice-cold NMDG-aCSF nga adunay: 92 mM NMDG, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glucose, 2 mM thiourea, 5 mM thiourea, sodium 0.5 mM CaCl2 4H2O ug 10 mM MgSO4 7H2O. Titrate sa pH 7.3-7.4 nga adunay konsentrado nga hydrochloric acid. Ang mga tisyu gihatud sa laboratoryo sa sulod sa 30 minuto ug ang mga seksyon sa korona gikuha sumala sa pamaagi nga gihulagway sa ibabaw.
Ang tanan nga mga pamaagi sa hayop gihimo subay sa mga panudlo sa pag-atiman sa hayop nga giaprubahan sa Stanford University APLAC. Ang mga ilaga (labaw pa sa 140 ka adlaw human sa transplantasyon) giaghat sa 5% nga isoflurane anesthesia ug gi-anesthetize sa 1-3% nga isoflurane intraoperatively. Ang mga mananap gibutang sa usa ka stereotaxic frame (Kopf) ug ang sustained release buprenorphine (SR) gi-injected subcutaneously. Ang bagolbagol gibutyag, gilimpyohan ug 3-5 ka mga screw sa bukog gisal-ut. Aron ma-target ang t-hCO, nakamugna kami mga stereotaxic coordinates gikan sa mga imahe sa MRI. Usa ka burr hole ang gi-drill sa dapit sa interes ug ang mga lanot (400 µm diametro, NA 0.48, Doric) gipaubos sa 100 µm ubos sa hCO surface ug gi-secure sa kalabera gamit ang UV-curable dental cement (Relyx).
Ang mga pagrekord sa fiber photometric gihimo sama sa gihulagway kaniadto42. Aron marekord ang kusog nga kalihokan, ang mga ilaga gibutang sa usa ka limpyo nga hawla ug usa ka 400 µm diameter nga fiber optic patch cable (Doric) nga konektado sa usa ka fiber optic photometric data acquisition system ang konektado sa gitanum nga fiber optic cable. Atol sa 10-minutos nga pagrekord sa kalihokan sa motor, ang mga hayop gawasnon sa pagsuhid sa hawla. Aron marekord ang gipukaw nga kalihokan, ang mga ilaga (labaw sa 140 ka adlaw pagkahuman sa pagbalhin) gi-anesthetize nga adunay 5% isoflurane alang sa induction ug 1-3% isoflurane alang sa pagpadayon. Ibutang ang mananap sa usa ka stereotactic frame (Kopf) ug ang mga whisker sa atbang nga bahin sa t-hCO giputol sa mga 2 cm ug gipaagi sa usa ka mata nga konektado sa piezoelectric actuator (PI). Usa ka 400 µm fiber optic patch cable (Doric) ang konektado sa gitanom nga fiber ug konektado sa data acquisition system. Ang mga whisker sa atbang nga bahin sa t-hCO dayon gitipas 50 ka beses (2 mm sa 20 Hz, 2 s kada presentasyon) sa random nga mga panahon pinaagi sa piezoelectric drive sulod sa 20 minutos nga recording period. Gamita ang Arduino MATLAB Support Package aron makontrol ang oras sa deflection gamit ang custom MATLAB code. Ang mga panghitabo gi-synchronize sa data acquisition software gamit ang transistor-transistor logic (TTL) pulses.
Ang mga ilaga (labaw pa sa 140 ka adlaw human sa transplantasyon) giaghat sa 5% nga isoflurane anesthesia ug gi-anesthetize sa 1-3% nga isoflurane intraoperatively. Ang mga mananap gibutang sa usa ka stereotaxic frame (Kopf) ug buprenorphine SR ug dexamethasone gi-injected subcutaneously. Ang bagolbagol gibutyag, gilimpyohan ug 3-5 ka mga screw sa bukog gisal-ut. Aron ma-target ang t-hCO, nakamugna kami mga stereotaxic coordinates gikan sa mga imahe sa MRI. Ang usa ka circular craniotomy (gibana-bana nga 1 cm ang diyametro) gihimo gamit ang high speed drill direkta sa ibabaw sa gitanum nga hCO. Sa higayon nga ang bukog ingon ka nipis kutob sa mahimo, apan sa dili pa mag-drill sa tibuok bukog, gamita ang mga forceps aron makuha ang nahabilin nga wala'y sulod nga pelvic disc aron makita ang nagpahiping t-hCO. Ang craniotomy napuno sa sterile saline, ug usa ka coverslip ug usa ka espesyal nga head pin ang gitaod sa kalabera nga adunay UV-cured dental cement (Relyx).
Ang two-photon imaging gihimo gamit ang Bruker multiphoton microscope nga adunay tumong sa Nikon LWD (×16, 0.8 NA). Ang GCaMP6 imaging gihimo sa 920 nm nga adunay 1.4x single z-plane magnification ug 8x average nga 7.5 fps. Ang mga ilaga giaghat sa 5% isoflurane anesthesia ug gipadayon sa 1-3% isoflurane. Ang mga ilaga gibutang sa usa ka custom made head fixture ug gibutang sa ilawom sa lente. Nakuha ang 3-minutos nga pagrekord sa background sa kalihokan sa motor. Sulod sa 20 minutos nga pagrekord, 50 ka puffs (matag presentasyon 100 ms ang gitas-on) random nga gihatud ngadto sa whisker pad atbang sa t-hCO gamit ang picospricer. Gamita ang Arduino MATLAB Support Package para makontrol ang burst time gamit ang custom MATLAB code. I-synchronize ang mga panghitabo gamit ang data acquisition software (PrairieView 5.5) gamit ang TTL pulses. Para sa pagtuki, ang mga hulagway gitul-id para sa xy motion gamit ang affine correction sa MoCo program nga gilusad sa Fiji. Pagkuha sa fluorescent traces gikan sa indibidwal nga mga selula gamit ang CNMF-E43. Ang fluorescence gikuha alang sa matag rehiyon sa interes, nakabig ngadto sa dF/F nga mga kurba, ug dayon nakabig ngadto sa z-scores.
Ang mga ilaga (labaw pa sa 140 ka adlaw human sa transplantasyon) giaghat sa 5% nga isoflurane anesthesia ug gi-anesthetize sa 1-3% nga isoflurane intraoperatively. Ang mga mananap gibutang sa usa ka stereotaxic frame (Kopf) ug buprenorphine SR ug dexamethasone gi-injected subcutaneously. Ang mga whisker sa atbang nga bahin sa t-hCO giputol sa mga 2 cm ug gihigot sa usa ka mata nga konektado sa usa ka piezoelectric actuator. Ang bagolbagol gibutyag ug gilimpyohan. Ang usa ka stainless steel ground screw gilakip sa bagolbagol. Aron ma-target ang t-hCO, nakamugna kami mga stereotaxic coordinates gikan sa mga imahe sa MRI. Paghimo og circular craniotomy (gibana-bana nga 1 cm ang diyametro) nga adunay high speed drill nga labaw sa t-hCO. Sa higayon nga ang bukog ingon ka nipis kutob sa mahimo, apan sa dili pa mag-drill sa tibuok bukog, gamita ang mga forceps aron makuha ang nahabilin nga wala'y sulod nga pelvic disc aron makita ang nagpahiping t-hCO. Ang mga indibidwal nga mga selyula natala gamit ang 32-channel o 64-channel nga high-density silicon probes (Cambridge Neurotech) nga gi-ground sa ground screws ug pre-amplified sa RHD amplifier (Intan). Gamita ang manipulator aron ipaubos ang mga electrodes sa target site pinaagi sa craniotomy, nga puno sa sterile saline. Ang pagkolekta sa datos gihimo sa frequency nga 30 kHz gamit ang Open Ephys data acquisition system. Ang pagrekord nagpadayon lamang sa dihang among namatikdan ang taas nga correlated rhythmic spontaneous nga kalihokan sa labaw pa sa 10 ka mga channel, nga nagsugyot nga ang mga electrodes nahimutang sa graft (base sa duha ka photon calcium imaging data). Nakuha ang 10-minutos nga pagrekord sa background sa kalihokan sa motor. Ang mga whisker sa atbang nga bahin sa t-hCO dayon gitipas 50 ka beses (2 mm sa 20 Hz, 2 s kada presentasyon) sa random nga mga panahon pinaagi sa piezoelectric drive sulod sa 20 minutos nga recording period. Gamit ang MATLAB Support Package para sa Arduino (MATLAB 2019b), kontrola ang oras sa deflection gamit ang custom MATLAB code. Gamita ang mga pulso sa TTL aron i-synchronize ang mga panghitabo sa software sa pagkuha sa datos.
Alang sa mga eksperimento sa pagmarka sa optical, usa ka 200 µm optical patch cord (Doric) nga konektado sa usa ka 473 nm laser (Omicron) konektado sa usa ka 200 µm optical fiber nga gibutang sa ibabaw sa craniotomy. Diha-diha dayon sa wala pa kini, i-adjust ang jumper power ngadto sa 20 mW. Gamita ang manipulator aron ipaubos ang mga electrodes sa target site pinaagi sa craniotomy, nga puno sa sterile saline. Sa sinugdanan sa pagrekord, napulo ka pulso sa kahayag 473 nm (frequency 2 Hz, gidugayon sa pulso 10 ms) ang gipagawas. Ang mga photosensitive nga mga selula gihubit isip mga selula nga nagpakita sa usa ka spike nga tubag sulod sa 10 ms sa kahayag sa 70% o labaw pa sa mga pagsulay.