Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ihatag ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Ang liquid biopsy (LB) usa ka konsepto nga paspas nga nahimong popular sa biomedical field.Ang konsepto nag-una nga gibase sa pagkakita sa mga tipik sa nagpalibot nga extracellular DNA (ccfDNA), nga kasagarang gibuhian isip gagmay nga mga tipik human sa pagkamatay sa selula sa lainlaing mga tisyu.Ang gamay nga bahin niini nga mga tipik naggikan sa langyaw (langyaw) nga mga tisyu o mga organismo.Sa kasamtangan nga trabaho, among gigamit kini nga konsepto sa mga amahong, usa ka espisye sa sentinel nga nailhan tungod sa ilang taas nga kapasidad sa pagsala sa tubig sa dagat.Gigamit namo ang abilidad sa mga amahong nga molihok isip natural nga mga filter aron makuha ang mga tipik sa DNA sa kinaiyahan gikan sa lain-laing tinubdan aron makahatag og impormasyon mahitungod sa biodiversity sa marine coastal ecosystem.Gipakita sa among mga resulta nga ang mussel hemolymph adunay mga tipik sa DNA nga lainlain ang gidak-on, gikan sa 1 hangtod 5 kb.Ang pagsunud sa shotgun nagpakita nga daghang mga tipik sa DNA gikan sa langyaw nga gigikanan sa microbial.Taliwala niini, among nakit-an ang mga tipik sa DNA gikan sa bakterya, archaea, ug mga virus, lakip ang mga virus nga nahibal-an nga makahawa sa lainlaing mga host nga sagad makita sa mga ekosistema sa dagat sa baybayon.Sa konklusyon, gipakita sa among pagtuon nga ang konsepto sa LB nga gigamit sa mga amahong nagrepresentar sa usa ka adunahan apan wala pa masusi nga tinubdan sa kahibalo bahin sa microbial diversity sa marine coastal ecosystems.
Ang epekto sa pagbag-o sa klima (CC) sa biodiversity sa marine ecosystem usa ka paspas nga nagtubo nga lugar sa panukiduki.Ang pag-init sa kalibutan dili lamang hinungdan sa hinungdanon nga mga kapit-os sa pisyolohikal, apan nagduso usab sa mga limitasyon sa ebolusyon sa kalig-on sa kainit sa mga organismo sa dagat, nga nakaapekto sa puy-anan sa daghang mga espisye, nga nag-aghat kanila sa pagpangita alang sa labi ka paborableng kahimtang [1, 2].Dugang sa pag-apektar sa biodiversity sa metazoans, gibalda sa CC ang delikadong balanse sa mga interaksyon sa host-microbial.Kini nga microbial dysbacteriosis naghatag usa ka seryoso nga hulga sa mga ekosistema sa dagat tungod kay kini naghimo sa mga organismo sa dagat nga labi ka dali nga makuha sa makatakod nga mga pathogen [3, 4].Gituohan nga ang SS adunay hinungdanon nga papel sa mga pagkamatay sa masa, nga usa ka seryoso nga problema alang sa pagdumala sa mga global nga ekosistema sa dagat [5, 6].Kini usa ka importante nga isyu tungod sa ekonomikanhon, ekolohikal ug nutritional nga mga epekto sa daghang mga marine species.Tinuod kini ilabi na sa mga bivalve nga nagpuyo sa mga polar nga rehiyon, diin ang mga epekto sa CK mas dali ug grabe [6, 7].Sa pagkatinuod, ang mga bivalve sama sa Mytilus spp.kaylap nga gigamit sa pagmonitor sa mga epekto sa CC sa marine ecosystem.Dili ikatingala, ang usa ka medyo dako nga gidaghanon sa mga biomarker naugmad aron sa pagmonitor sa ilang panglawas, nga kasagaran naggamit sa usa ka duha ka lebel nga pamaagi nga naglakip sa functional biomarkers base sa enzymatic nga kalihokan o cellular functions sama sa cell viability ug phagocytic nga kalihokan [8].Kini nga mga pamaagi naglakip usab sa pagsukod sa konsentrasyon sa piho nga mga timailhan sa presyur nga natipon sa humok nga mga tisyu pagkahuman sa pagsuyup sa daghang tubig sa dagat.Bisan pa, ang taas nga kapasidad sa pagsala ug semi-open nga sistema sa sirkulasyon sa mga bivalve naghatag usa ka higayon nga makahimo og bag-ong mga hemolymph biomarker gamit ang konsepto sa liquid biopsy (LB), usa ka yano ug minimally invasive nga pamaagi sa pagdumala sa pasyente.mga sample sa dugo [9, 10].Bisan tuod daghang matang sa circulating molecules ang makit-an sa LB sa tawo, kini nga konsepto nag-una base sa DNA sequencing analysis sa circulating extracellular DNA (ccfDNA) fragments sa plasma.Sa pagkatinuod, ang presensya sa circulating DNA sa plasma sa tawo nahibal-an sukad pa sa tunga-tunga sa ika-20 nga siglo [11], apan sa bag-ohay lang nga mga tuig nga ang pag-abut sa high-throughput sequencing nga mga pamaagi misangpot sa clinical diagnosis base sa ccfDNA.Ang presensya niining naglibot nga mga tipik sa DNA tungod sa usa ka bahin sa passive release sa genomic DNA (nukleyar ug mitochondrial) pagkahuman sa pagkamatay sa cell. Sa himsog nga mga indibidwal, ang konsentrasyon sa ccfDNA kasagaran ubos (<10 ng/mL) apan mahimong madugangan sa 5-10 ka beses sa mga pasyente nga nag-antos sa lain-laing mga pathologies o gipailalom sa stress, nga moresulta sa kadaot sa tissue. Sa himsog nga mga indibidwal, ang konsentrasyon sa ccfDNA kasagaran ubos (<10 ng/mL) apan mahimong madugangan sa 5-10 ka beses sa mga pasyente nga nag-antos sa lain-laing mga pathologies o gipailalom sa stress, nga moresulta sa kadaot sa tissue. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться в 5–10 раз у хличой или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. Sa himsog nga mga tawo, ang konsentrasyon sa cccDNA kasagaran ubos (<10 ng/mL), apan kini mahimong motaas sa 5-10 ka beses sa mga pasyente nga adunay lain-laing mga pathologies o ubos sa stress nga mosangpot sa kadaot sa tissue.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压受受压力从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 承受 或 承受加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличены в 5-10 раз у плица ями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Ang mga konsentrasyon sa ccfDNA kasagaran ubos (<10 ng/ml) sa himsog nga mga indibidwal, apan mahimong madugangan 5-10 ka pilo sa mga pasyente nga adunay lainlaing mga pathologies o stress, nga moresulta sa kadaot sa tisyu.Ang gidak-on sa mga tipik sa ccfDNA lainlain kaayo, apan kasagaran gikan sa 150 hangtod 200 bp.[12].Ang pag-analisar sa kaugalingon nga nakuha nga ccfDNA, ie, ccfDNA gikan sa normal o nabag-o nga mga selula sa host, mahimong magamit aron mahibal-an ang genetic ug epigenetic nga mga pagbag-o nga naa sa nukleyar ug / o mitochondrial genome, sa ingon nagtabang sa mga clinician sa pagpili sa piho nga mga terapiya nga gipunting sa molekula [13].Bisan pa, ang ccfDNA mahimong makuha gikan sa mga langyaw nga gigikanan sama sa ccfDNA gikan sa mga selyula sa fetus sa panahon sa pagmabdos o gikan sa mga gibalhin nga organo [14,15,16,17].Ang ccfDNA usa usab ka importante nga tinubdan sa impormasyon alang sa pag-ila sa presensya sa mga nucleic acid sa usa ka makatakod nga ahente (langyaw), nga nagtugot sa non-invasive detection sa kaylap nga mga impeksyon nga wala mailhi sa mga kultura sa dugo, paglikay sa invasive biopsy sa nataptan nga tissue [18].Gipakita sa bag-o nga mga pagtuon nga ang dugo sa tawo adunay daghang tinubdan sa kasayuran nga magamit sa pag-ila sa mga virus ug bakterya nga mga pathogen, ug mga 1% sa ccfDNA nga nakit-an sa plasma sa tawo gikan sa langyaw nga gigikanan [19].Kini nga mga pagtuon nagpakita nga ang biodiversity sa circulating microbiome sa usa ka organismo mahimong masusi gamit ang ccfDNA analysis.Bisan pa, hangtod karon, kini nga konsepto gigamit nga eksklusibo sa mga tawo ug, sa gamay nga sukod, sa ubang mga vertebrates [20, 21].
Sa karon nga papel, gigamit namon ang potensyal sa LB sa pag-analisar sa ccfDNA sa Aulacomya atra, usa ka habagatang espisye nga sagad makit-an sa subantarctic nga Kerguelen Islands, usa ka grupo sa mga isla sa ibabaw sa usa ka dako nga talampas nga naporma 35 milyon ka tuig ang milabay.pagbuto sa bulkan.Gamit ang in vitro experimental system, among nakita nga ang mga tipik sa DNA sa tubig-dagat dali nga makuha sa mga amahong ug mosulod sa hemolymph compartment.Gipakita sa pagsunud-sunod sa shotgun nga ang mussel hemolymph ccfDNA adunay mga tipik sa DNA sa kaugalingon ug dili-kaugalingon nga gigikanan, lakip ang symbiotic nga bakterya ug mga tipik sa DNA gikan sa mga biome nga kasagaran sa bugnaw nga bulkan nga marine coastal ecosystem.Ang Hemolymph ccfDNA usab adunay mga viral sequence nga nakuha gikan sa mga virus nga adunay lain-laing mga host range.Nakit-an usab namo ang mga tipik sa DNA gikan sa multicellular nga mga mananap sama sa bony fish, sea anemone, algae ug mga insekto.Sa konklusyon, gipakita sa among pagtuon nga ang konsepto sa LB mahimong malampuson nga magamit sa mga invertebrate sa dagat aron makamugna og usa ka dato nga genomic repertoire sa marine ecosystem.
Ang mga hamtong (55-70 mm ang gitas-on) Mytilus platensis (M. platensis) ug Aulacomya atra (A. atra) gikolekta gikan sa intertidal nga batoon nga baybayon sa Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.).Kerguelen Islands niadtong Disyembre 2018. Ang ubang hamtong nga blue mussels (Mytilus spp.) Nakuha gikan sa commercial supplier (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) ug gibutang sa temperatura nga kontrolado (4°C) aerated tank nga adunay 10–20 L nga 32‰ artificial brine.(artipisyal nga asin sa dagat Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Alang sa matag eksperimento, gisukod ang gitas-on ug gibug-aton sa indibidwal nga mga kabhang.
Usa ka libre nga open access protocol alang niini nga programa anaa online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Sa daklit, ang LB hemolymph nakolekta gikan sa abductor muscles sama sa gihulagway [22].Ang hemolymph gipatin-aw pinaagi sa centrifugation sa 1200 × g sulod sa 3 ka minuto, ang supernatant gi-frozen (-20 ° C) hangtod magamit.Alang sa pag-inusara ug pagputli sa cfDNA, ang mga sample (1.5-2.0 ml) gitunaw ug giproseso gamit ang NucleoSnap cfDNA kit (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) sumala sa mga panudlo sa tiggama.Ang ccfDNA gitipigan sa -80 ° C hangtod sa dugang nga pagtuki.Sa pipila ka mga eksperimento, ang ccfDNA gilain ug giputli gamit ang QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).Gi-quantified ang purified DNA gamit ang standard PicoGreen assay.Ang pag-apod-apod sa tipik sa nahilit nga ccfDNA gisusi pinaagi sa capillary electrophoresis gamit ang usa ka Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) gamit ang usa ka High Sensitivity DNA Kit.Ang assay gihimo gamit ang 1 µl sa ccfDNA sample sumala sa instruksyon sa tiggama.
Para sa pagkasunodsunod sa mga tipik sa hemolymph ccfDNA, si Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) nag-andam og mga librarya sa shotgun gamit ang Illumina DNA Mix kit sa Illumina MiSeq PE75 kit.Usa ka standard adapter (BioO) ang gigamit.Ang mga file sa hilaw nga datos magamit gikan sa NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 ug SRR8924809).Ang sukaranan nga kalidad sa pagbasa gisusi gamit ang FastQC [23].Ang Trimmomatic [24] gigamit alang sa mga clipping adapter ug dili maayo nga kalidad nga mga pagbasa.Ang gibasa sa shotgun nga adunay gipares nga mga tumoy gisagol sa FLASH ngadto sa mas taas nga single reads nga adunay minimum nga overlap nga 20 bp aron malikayan ang mga mismatches [25]. Ang gihiusa nga mga pagbasa gi-annotate sa BLASTN gamit ang bivalve NCBI Taxonomy database (e value <1e−3 ug 90% homology), ug ang masking sa mga low-complexity sequence gihimo gamit ang DUST [26]. Ang gihiusa nga mga pagbasa gi-annotate sa BLASTN gamit ang bivalve NCBI Taxonomy database (e value <1e−3 ug 90% homology), ug ang masking sa mga low-complexity sequence gihimo gamit ang DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных таксономии двустворчорчатылюх 1 3 ug 90% гомологии), ug маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием ABOG [26]. Ang mga pooled reads gi-annotate sa BLASTN gamit ang NCBI bivalve taxonomy database (e value <1e-3 ug 90% homology), ug ang ubos nga pagkakomplikado nga pagkasunod-sunod nga masking gihimo gamit ang DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的读敽，并使，平低，年年复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 ， 使并 读数 ，复杂度 序列 的。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономической базы данных двозленичермча <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Ang mga pooled reads gi-annotate sa BLASTN gamit ang NCBI bivalve taxonomic database (e value <1e-3 ug 90% homology), ug ang ubos nga pagkakomplikado nga pagkasunod-sunod nga masking gihimo gamit ang DUST [26].Ang mga pagbasa gibahin ngadto sa duha ka grupo: may kalabutan sa bivalve sequence (gitawag dinhi nga self-reads) ug walay kalabotan (non-self-reads).Duha ka grupo ang gilain nga gitigum gamit ang MEGAHIT aron makamugna mga contigs [27].Samtang, ang taxonomic distribution sa alien microbiome reads giklasipikar gamit ang Kraken2 [28] ug graphic nga girepresentahan sa Krona pie chart sa Galaxy [29, 30].Ang labing maayo nga mga kmer gitino nga kmers-59 gikan sa among pasiuna nga mga eksperimento. Giila dayon ang mga contig sa kaugalingon pinaagi sa pag-align sa BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e−10 ug 60% homology) alang sa katapusang anotasyon. Giila dayon ang mga contig sa kaugalingon pinaagi sa pag-align sa BLASTN (bivalve NCBI database, e value <1e−10 ug 60% homology) alang sa katapusang anotasyon. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (база данных двустворчатых моллюгиск, 1 ология 60%) для окончательной аннотации. Ang mga self-contigs dayon giila pinaagi sa pagpares batok sa BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ug 60% homology) para sa final annotation.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识庫量识终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем сопоставления с BLASTN (базал дхдмун оллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). Ang mga self-contigs dayon giila alang sa katapusang annotation pinaagi sa pagpares batok sa BLASTN (NCBI bivalve database, e value <1e-10 ug 60% homology). Sa susama, ang nonself group contigs gi-annotate sa BLASTN (nt NCBI database, e value <1e−10 ug 60% homology). Sa susama, ang nonself group contigs gi-annotate sa BLASTN (nt NCBI database, e value <1e−10 ug 60% homology). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база данных nt NCBI, значение e <1e-10 м. Sa susama, ang mga langyaw nga grupo contigs gi-annotate sa BLASTN (NT NCBI database, e value <1e-10 ug 60% homology).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组重叠群。 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью BLASTN (база данныгых nt 1 og 60%). Sa susama, ang non-self group contigs gi-annotate sa BLASTN (nt NCBI database, e value <1e-10 ug 60% homology). Ang BLASTX gihimo usab sa nonself contigs gamit ang nr ug RefSeq protein NCBI databases (e value <1e−10 ug 60% homology). Ang BLASTX gihimo usab sa nonself contigs gamit ang nr ug RefSeq protein NCBI databases (e value <1e−10 ug 60% homology). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение лио <1e%)-10 e <1e. Ang BLASTX gihimo usab sa mga non-self contigs gamit ang nr ug RefSeq NCBI protein databases (e value <1e-10 ug 60% homology).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 同 。还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和） 同 。 BLASTX также выполняли sa несамостоятельных контигах с использованием баз данных белка nr и RefSeq NCBI (значение e <1e-10 %) Ang BLASTX gihimo usab sa mga non-self contigs gamit ang nr ug RefSeq NCBI protein databases (e value <1e-10 ug 60% homology).Ang BLASTN ug BLASTX pool nga dili self-contigs nagrepresentar sa katapusang mga contigs (tan-awa ang Supplementary file).
Ang mga primer nga gigamit alang sa PCR gilista sa Talaan S1.Ang Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) gigamit sa pagpadako sa ccfDNA target nga mga gene.Ang mosunod nga mga kondisyon sa reaksyon gigamit: denaturation sa 95°C sulod sa 3 minutos, 95°C sulod sa 1 minuto, itakda ang annealing temperature sulod sa 1 minuto, elongation sa 72°C sulod sa 1 minuto, 35 cycle, ug sa kataposan 72°C sulod sa 10 minutos..Ang mga produkto sa PCR gibulag pinaagi sa electrophoresis sa agarose gels (1.5%) nga adunay sulud nga SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) sa 95 V.
Ang mga amahong (Mytilus spp.) gi-acclimatize sa 500 ml nga oxygenated seawater (32 PSU) sulod sa 24 ka oras sa 4°C.Ang plasmid DNA nga adunay sulud nga pag-encode sa human galectin-7 cDNA sequence (NCBI accession number L07769) gidugang sa vial sa katapusang konsentrasyon nga 190 μg / μl.Ang mga amahong nalumlom ubos sa samang mga kondisyon nga walay pagdugang sa DNA mao ang kontrol.Ang ikatulo nga control tank adunay DNA nga walay tahong.Aron mamonitor ang kalidad sa DNA sa tubig-dagat, ang mga sampol sa tubig-dagat (20 μl; tulo ka pagbalik-balik) gikuha gikan sa matag tangke sa gitakdang oras.Para sa plasmid DNA traceability, ang LB mussels giani sa gitakdang oras ug gi-analisa sa qPCR ug ddPCR.Tungod sa taas nga asin nga sulod sa tubig-dagat, ang mga alikuot gitunaw sa kalidad nga tubig sa PCR (1:10) sa wala pa ang tanang PCR assays.
Ang digital droplet PCR (ddPCR) gihimo gamit ang BioRad QX200 protocol (Mississauga, Ontario, Canada).Gamita ang profile sa temperatura aron mahibal-an ang labing taas nga temperatura (Table S1).Ang mga tinulo gihimo gamit ang QX200 drop generator (BioRad).Ang ddPCR gihimo ingon sa mosunod: 95 ° C sa 5 min, 50 cycle sa 95 ° C sa 30 s ug usa ka gihatag nga annealing temperature alang sa 1 min ug 72 ° C sa 30 s, 4 ° C sa 5 min ug 90 ° C sulod sa 5 minutos.Ang gidaghanon sa mga tulo ug positibo nga mga reaksyon (gidaghanon sa mga kopya/µl) gisukod gamit ang QX200 drop reader (BioRad).Ang mga sample nga adunay ubos sa 10,000 nga mga tinulo gisalikway.Ang pagkontrol sa pattern wala gihimo sa matag higayon nga ang ddPCR gipadagan.
Ang qPCR gihimo gamit ang Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) ug LGALS7 nga piho nga primers.Ang tanan nga quantitative PCRs gihimo sa 20 µl gamit ang QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).Ang qPCR gisugdan sa usa ka 15 min nga paglumlum sa 95 ° C gisundan sa 40 nga mga siklo sa 95 ° C sulod sa 10 segundos ug sa 60 ° C sulod sa 60 segundos nga adunay usa ka pagkolekta sa datos.Ang pagtunaw nga mga kurba gihimo gamit ang sunud-sunod nga mga pagsukod sa 95 ° C sa 5 s, 65 ° C sa 60 s, ug 97 ° C sa katapusan sa qPCR.Ang matag qPCR gihimo sa triplicate, gawas sa control sample.
Tungod kay ang mga amahong nailhan tungod sa ilang taas nga filtration rate, una namo nga gisusi kung mahimo ba nila ang pagsala ug pagpabilin sa mga tipik sa DNA nga anaa sa tubig sa dagat.Interesado usab kami kung kini nga mga tipik natipon sa ilang semi-open lymphatic system.Nasulbad namo kini nga isyu pinaagi sa pag-eksperimento pinaagi sa pagsubay sa dangatan sa matunaw nga mga tipik sa DNA nga nadugang sa mga tangke nga asul nga amahong.Aron mapadali ang pagsubay sa mga tipik sa DNA, gigamit namo ang langyaw (dili kaugalingon) nga plasmid DNA nga adunay sulod nga gene sa tawo nga galectin-7.Gisubay sa ddPCR ang mga tipik sa plasmid DNA sa tubig sa dagat ug mga amahong.Gipakita sa among mga resulta nga kung ang gidaghanon sa mga tipik sa DNA sa tubig sa dagat nagpabilin nga medyo kanunay sa paglabay sa panahon (hangtod sa 7 ka adlaw) kung wala ang mga amahong, nan sa presensya sa mga amahong kini nga lebel hapit hingpit nga nawala sa sulod sa 8 ka oras (Fig. 1a, b).Ang mga tipik sa exogenous DNA dali nga nakit-an sulod sa 15 min sa intravalvular fluid ug hemolymph (Fig. 1c).Kini nga mga tipik mahimo pa nga makit-an hangtod sa 4 ka oras pagkahuman sa pagkaladlad.Kini nga kalihokan sa pagsala kalabot sa mga tipik sa DNA ikatandi sa kalihokan sa pagsala sa bakterya ug algae [31].Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang mga amahong makasala ug makatigom ug langyaw nga DNA sa ilang mga pluwido nga mga lawak.
Relatibo nga konsentrasyon sa plasmid DNA sa tubig sa dagat sa presensya (A) o pagkawala (B) sa mga amahong, gisukod sa ddPCR.Sa A, ang mga resulta gipahayag ingon nga mga porsyento, nga ang mga utlanan sa mga kahon nagrepresentar sa ika-75 ug ika-25 nga porsyento.Ang gipaangay nga logarithmic curve gipakita sa pula, ug ang lugar nga gi-shade sa gray nagrepresentar sa 95% nga agwat sa pagsalig.Sa B, ang pula nga linya nagrepresentar sa mean ug ang asul nga linya nagrepresentar sa 95% nga agwat sa pagsalig alang sa konsentrasyon.C Pagtipon sa plasmid DNA sa hemolymph ug valvular fluid sa mussels sa lain-laing mga panahon human sa pagdugang sa plasmid DNA.Ang mga resulta gipresentar isip hingpit nga mga kopya nga nakita/mL (± SE).
Sunod, among gisusi ang gigikanan sa ccfDNA sa mga tahong nga nakolekta gikan sa mga tahong nga higdaanan sa Kerguelen Islands, usa ka hilit nga grupo sa mga isla nga adunay limitado nga impluwensya sa anthropogenic.Alang niini nga katuyoan, ang cccDNA gikan sa mussel hemolymphs gilain ug giputli pinaagi sa mga pamaagi nga sagad gigamit sa pagputli sa tawo nga cccDNA [32, 33].Among nakit-an nga ang kasagaran nga hemolymph ccfDNA nga konsentrasyon sa mga amahong anaa sa ubos nga micrograms kada ml hemolymph range (tan-awa ang Table S2, Supplementary Information).Kini nga han-ay sa mga konsentrasyon mas dako kay sa himsog nga mga tawo (ubos nga nanograms kada milliliter), apan sa talagsaon nga mga kaso, sa mga pasyente sa kanser, ang lebel sa ccfDNA mahimong moabot sa pipila ka micrograms kada milliliter [34, 35].Ang pagtuki sa gidak-on sa pag-apod-apod sa hemolymph ccfDNA nagpakita nga kini nga mga tipik lainlain kaayo sa gidak-on, gikan sa 1000 bp ngadto sa 1000 bp.hangtod sa 5000 bp (Fig. 2).Ang susamang mga resulta nakuha gamit ang QIAamp Investigator Kit nga nakabase sa silica, usa ka pamaagi nga sagad gigamit sa forensic science aron paspas nga ihimulag ug putli ang genomic DNA gikan sa ubos nga konsentrasyon nga mga sample sa DNA, lakip ang ccfDNA [36].
Representante nga ccfDNA electrophoregram sa mussel hemolymph.Gikuha gamit ang NucleoSnap Plasma Kit (ibabaw) ug QIAamp DNA Investigator Kit.B Violin plot nga nagpakita sa pag-apod-apod sa hemolymph ccfDNA concentrations (± SE) sa tahong.Ang itom ug pula nga mga linya nagrepresentar sa median ug ang una ug ikatulo nga kwartil, matag usa.
Gibana-bana nga 1% sa ccfDNA sa mga tawo ug mga primata adunay langyaw nga gigikanan [21, 37].Tungod sa semi-open circulatory system sa bivalves, microbial-rich seawater, ug ang gidak-on nga distribution sa mussel ccfDNA, among hypothesized nga mussel hemolymph ccfDNA mahimong adunay daghan ug lain-laing pool sa microbial DNA.Aron sulayan kini nga pangagpas, among gisunod-sunod ang hemolymph ccfDNA gikan sa mga sample sa Aulacomya atra nga nakolekta gikan sa Kerguelen Islands, nga naghatag og kapin sa 10 ka milyon nga mga pagbasa, 97.6% niini ang nakapasar sa pagkontrol sa kalidad.Ang mga pagbasa dayon giklasipikar sumala sa kaugalingon ug dili-kaugalingon nga mga tinubdan gamit ang BLASTN ug NCBI bivalve databases (Fig. S1, Supplementary Information).
Sa mga tawo, ang nukleyar ug mitochondrial DNA mahimong buhian ngadto sa agos sa dugo [38].Bisan pa, sa kasamtangan nga pagtuon, dili posible nga ihulagway sa detalye ang nukleyar nga genomic DNA sa mga amahong, tungod kay ang A. atra genome wala pa masunod o gihulagway.Bisan pa, nahibal-an namon ang daghang mga tipik sa ccfDNA sa among kaugalingon nga gigikanan gamit ang bivalve library (Fig. S2, Supplementary Information).Gipamatud-an usab namo ang presensya sa mga tipik sa DNA sa among kaugalingong gigikanan pinaagi sa gitumong nga PCR amplification niadtong A. atra nga mga gene nga gisunod-sunod (Fig. 3).Sa susama, tungod kay ang mitochondrial genome sa A. atra anaa sa publikong mga database, ang usa makakita og ebidensya sa presensya sa mitochondrial ccfDNA nga mga tipik sa hemolymph sa A. atra.Ang presensya sa mga tipik sa mitochondrial DNA gipamatud-an sa PCR amplification (Fig. 3).
Nagkalainlain nga mitochondrial genes ang anaa sa hemolymph sa A. atra (pula nga tulbok – stock number: SRX5705969) ug M. platensis (asul nga tuldok – stock number: SRX5705968) nga gipadako sa PCR.Figure nga gipahiangay gikan sa Breton et al., 2011 B Pagpadako sa hemolymph supernatant gikan sa A. atra Gitipigan sa FTA nga papel.Gamit ug 3 mm nga suntok aron idugang direkta sa PCR tube nga adunay sulod nga PCR mix.
Tungod sa abunda nga microbial content sa seawater, una mi nagtutok sa characterization sa microbial DNA sequences sa hemolymph.Aron mahimo kini, gigamit namon ang duha nga lainlaing mga estratehiya.Ang unang estratehiya migamit sa Kraken2, usa ka algorithm-based sequence classification program nga makaila sa mga microbial sequence nga adunay tukma nga ikatandi sa BLAST ug uban pang mga himan [28].Labaw pa sa 6719 nga mga pagbasa ang determinado nga gigikanan sa bakterya, samtang ang 124 ug 64 gikan sa archaea ug mga virus, matag usa (Fig. 4).Ang pinakaabunda nga bacterial DNA fragment mao ang Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%), ug Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Kini nga pag-apod-apod nahiuyon sa nangaging mga pagtuon sa marine blue mussel microbiome [39, 40].Ang Gammaproteobacteria mao ang nag-unang klase sa Proteobacteria (44%), lakip ang daghang Vibrionales (Fig. 4b).Ang pamaagi sa ddPCR nagpamatuod sa presensya sa mga tipik sa Vibrio DNA sa ccfDNA sa A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].Aron makakuha og dugang nga kasayuran mahitungod sa bakterya nga gigikanan sa ccfDNA, usa ka dugang nga pamaagi ang gikuha (Fig. S2, Supplementary Information). Sa kini nga kaso, ang mga mabasa nga nag-overlap gitigum ingon nga gipares-katapusan nga mga pagbasa ug giklasipikar ingon sa kaugalingon (bivalves) o dili kaugalingon nga gigikanan gamit ang BLASTN ug usa ka kantidad nga 1e−3 ug usa ka cutoff nga adunay> 90% homology. Sa kini nga kaso, ang mga mabasa nga nag-overlap gitigum ingon nga gipares-katapusan nga mga pagbasa ug giklasipikar ingon sa kaugalingon (bivalves) o dili kaugalingon nga gigikanan gamit ang BLASTN ug usa ka kantidad nga 1e−3 ug usa ka cutoff nga adunay> 90% homology. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были классифицированы каквлуныстости юски) o чужие по происхождению с использованием BLASTN и значения e 1e-3 и отсечения с гомологией> 90%. Sa kini nga kaso, ang nagsapaw-sapaw nga mga pagbasa gikolekta ingon gipares nga natapos nga mga pagbasa ug giklasipikar nga lumad (bivalve) o dili orihinal gamit ang BLASTN ug e nga kantidad sa 1e-3 ug cutoff nga adunay> 90% homology.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值咐>90% 我們和>90%为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 使用 的 9 和 1 % 和同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классифицированы как собствоственский и) o несобственные по происхождению с использованием значений e BLASTN и 1e-3 и порога гомологии> 90%. Sa kini nga kaso, ang nagsapaw-sapaw nga mga pagbasa gikolekta ingon gipares nga natapos nga mga pagbasa ug giklasipikar nga kaugalingon (bivalves) o dili orihinal gamit ang e BLASTN ug 1e-3 nga mga kantidad ug usa ka threshold sa homology> 90%.Tungod kay ang A. atra genome wala pa masunod, among gigamit ang de novo assembly strategy sa MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS) assembler.Adunay kinatibuk-ang 147,188 ka contigs ang giila nga dependent (bivalves) nga gigikanan.Kini nga mga contig gipabuto sa mga e-values ​​​​sa 1e-10 gamit ang BLASTN ug BLASTX.Kini nga estratehiya nagtugot kanamo sa pag-ila sa 482 nga dili bivalve nga mga tipik nga anaa sa A. atra ccfDNA.Kapin sa katunga (57%) niini nga mga tipik sa DNA nakuha gikan sa bakterya, nag-una gikan sa gill symbionts, lakip ang sulfotrophic symbionts, ug gikan sa gill symbionts Solemya velum (Fig. 5).
Relatibo nga kadagaya sa lebel sa tipo.B Microbial diversity sa duha ka nag-unang phyla (Firmicutes ug Proteobacteria).Representante nga pagpadako sa ddPCR C Vibrio spp.A. Mga tipik sa 16S rRNA gene (asul) sa tulo ka atra hemolymphs.
Usa ka kinatibuk-an nga 482 nga nakolekta nga mga contigs ang gisusi.Kinatibuk-ang profile sa taxonomic distribution sa metagenomic contig annotation (prokaryotes ug eukaryotes).B Detalyadong pag-apod-apod sa mga tipik sa DNA sa bakterya nga giila sa BLASTN ug BLASTX.
Gipakita usab sa pag-analisa sa Kraken2 nga ang mussel ccfDNA adunay mga archaeal nga mga tipik sa DNA, lakip ang mga tipik sa DNA sa Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%), ug Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).Ang presensya sa mga tipik sa DNA nga nakuha gikan sa Euryarchaeota ug Crenarchaeota, nga kaniadto nakit-an sa microbial nga komunidad sa mga amahong sa California, dili kinahanglan nga usa ka katingala [42].Bisan kung ang Euryarchaeota kanunay nga adunay kalabotan sa grabe nga mga kahimtang, nahibal-an na karon nga ang Euryarchaeota ug Crenarcheota usa sa labing kasagaran nga mga prokaryote sa marine cryogenic nga palibot [43, 44].Ang presensya sa methanogenic microorganisms sa mussels dili ikatingala, tungod sa bag-o nga mga taho sa halapad nga methane leaks gikan sa ubos nga pagtulo sa Kerguelen Plateau [45] ug posible nga microbial methane production naobserbahan sa baybayon sa Kerguelen Islands [46].
Ang among atensyon dayon nabalhin sa mga pagbasa gikan sa mga virus sa DNA.Sa labing maayo sa among kahibalo, kini ang una nga wala gipunting nga pagtuon sa sulud sa virus sa mga amahong.Sama sa gipaabot, among nakit-an ang mga tipik sa DNA sa mga bacteriophage (Caudovirales) (Fig. 6b).Bisan pa, ang labing komon nga viral DNA naggikan sa usa ka phylum sa nucleocytoviruses, nailhan usab nga nuclear cytoplasmic large DNA virus (NCLDV), nga adunay pinakadako nga genome sa bisan unsang virus.Sulod niini nga phylum, kadaghanan sa mga sequence sa DNA iya sa mga pamilya nga Mimimidoviridae (58%) ug Poxviridae (21%), kansang natural nga mga host naglakip sa vertebrates ug arthropods, samtang ang gamay nga proporsyon niini nga mga sequence sa DNA iya sa nailhan nga virological algae.Makatakod sa marine eukaryotic algae.Ang mga sequence nakuha usab gikan sa Pandora virus, ang higanteng virus nga adunay pinakadako nga genome nga gidak-on sa bisan unsang nailhan nga viral genera.Makapainteres, ang sakup sa mga host nga nahibal-an nga nataptan sa virus, ingon nga gitino sa hemolymph ccfDNA sequencing, medyo dako (Figure S3, Supplementary Information).Naglakip kini sa mga virus nga makasakit sa mga insekto sama sa Baculoviridae ug Iridoviridae, ingon man mga virus nga makasakit sa amoeba, algae ug vertebrates.Nakit-an usab namo ang mga han-ay nga katumbas sa Pithovirus sibericum genome.Ang mga Pitovirus (nailhan usab nga "mga virus sa zombie") una nga nahimulag gikan sa 30,000 ka tuig nga permafrost sa Siberia [47].Busa, ang among mga resulta nahiuyon sa nangaging mga taho nga nagpakita nga dili tanang modernong espisye niini nga mga virus napuo [48] ug nga kini nga mga virus mahimong anaa sa hilit nga subarctic marine ecosystem.
Sa kataposan, gisulayan namo kon makakita ba mig mga tipik sa DNA gikan sa ubang multicellular nga mananap.Usa ka kinatibuk-an nga 482 nga langyaw nga contig ang giila sa BLASTN ug BLASTX nga adunay nt, nr ug RefSeq nga mga librarya (genomic ug protina).Gipakita sa among mga resulta nga taliwala sa mga langyaw nga tipik sa ccfDNA sa mga multicellular nga hayop nga DNA sa bukog nga bukog nag-una (Fig. 5).Nakit-an usab ang mga tipik sa DNA gikan sa mga insekto ug uban pang mga espisye.Ang usa ka medyo dako nga bahin sa mga tipik sa DNA wala mahibal-an, lagmit tungod sa kakulang sa representasyon sa daghang mga espisye sa dagat sa genomic database kung itandi sa mga terrestrial species [49].
Sa karon nga papel, among gipadapat ang konsepto sa LB sa mga amahong, nga nangatarungan nga ang hemolymph ccfDNA shot sequencing makahatag ug pagsabot sa komposisyon sa marine coastal ecosystems.Sa partikular, among nakita nga ang 1) mussel hemolymph adunay medyo taas nga konsentrasyon (microgram nga lebel) sa medyo dako (~1-5 kb) nga nagpalibot nga mga tipik sa DNA;2) kini nga mga tipik sa DNA pareho nga independente ug dili independente 3) Taliwala sa mga langyaw nga gigikanan sa kini nga mga tipik sa DNA, nakit-an namon ang bakterya, archaeal ug viral nga DNA, ingon man ang DNA sa ubang mga hayop nga multicellular;4) Ang pagtipon niining mga langyaw nga ccfDNA nga mga tipik sa hemolymph paspas nga mahitabo ug makatampo sa internal nga pagsala nga kalihokan sa mga amahong.Sa konklusyon, gipakita sa among pagtuon nga ang konsepto sa LB, nga hangtod karon gipadapat labi na sa natad sa biomedicine, nag-encode sa usa ka adunahan apan wala pa masusi nga gigikanan sa kahibalo nga magamit aron mas masabtan ang interaksyon tali sa mga species sa sentinel ug sa ilang palibot.
Gawas pa sa mga unggoy, ang pag-inusara sa ccfDNA gitaho sa mga mammal, lakip ang mga ilaga, iro, iring, ug kabayo [50, 51, 52].Bisan pa, sa among nahibal-an, ang among pagtuon ang una nga nagreport sa pagkakita ug pagsunud sa ccfDNA sa mga espisye sa dagat nga adunay bukas nga sistema sa sirkulasyon.Kining anatomical feature ug abilidad sa pagsala sa mga amahong mahimong, sa labing menos sa bahin, makapatin-aw sa lain-laing gidak-on nga mga kinaiya sa naglibot nga mga tipik sa DNA kon itandi sa ubang mga espisye.Sa mga tawo, kadaghanan sa mga tipik sa DNA nga naglibot sa dugo mga gagmay nga mga tipik nga adunay gidak-on gikan sa 150 hangtod 200 bp.nga adunay kinatas-ang peak nga 167 bp [34, 53].Ang usa ka gamay apan mahinungdanon nga bahin sa mga tipik sa DNA anaa sa taliwala sa 300 ug 500 bp ang gidak-on, ug mga 5% mas taas kay sa 900 bp.[54].Ang hinungdan sa kini nga gidak-on sa pag-apod-apod mao nga ang panguna nga gigikanan sa ccfDNA sa plasma mahitabo ingon usa ka sangputanan sa pagkamatay sa cell, tungod sa pagkamatay sa selyula o tungod sa necrosis sa nagpalibot nga mga selula sa hematopoietic sa himsog nga mga indibidwal o tungod sa apoptosis sa mga selula sa tumor sa mga pasyente sa kanser (nailhan nga naglibot nga tumor DNA)., ctDNA).Ang gidak-on sa pag-apod-apod sa hemolymph ccfDNA nga among nakit-an sa mga amahong gikan sa 1000 hangtod 5000 bp, nagsugyot nga ang amahong ccfDNA adunay lahi nga gigikanan.Kini usa ka lohikal nga pangagpas, tungod kay ang mga amahong adunay semi-open vascular system ug nagpuyo sa marine aquatic environment nga adunay taas nga konsentrasyon sa microbial genomic DNA.Sa tinuud, ang among mga eksperimento sa laboratoryo gamit ang exogenous DNA nagpakita nga ang mga amahong nagtigum sa mga tipik sa DNA sa tubig sa dagat, labing menos pagkahuman sa pipila ka oras nga kini nadaot pagkahuman sa cellular uptake ug / o gipagawas ug / o gitipigan sa lainlaing mga organisasyon.Tungod sa panagsa ra sa mga selula (prokaryotic ug eukaryotic), ang paggamit sa intravalvular compartments makapakunhod sa gidaghanon sa ccfDNA gikan sa kaugalingon nga tinubdan ingon man gikan sa langyaw nga mga tinubdan.Sa pagkonsiderar sa kamahinungdanon sa bivalve innate immunity ug sa kadaghan sa mga circulating phagocytes, among dugang nga hypothesize nga bisan ang langyaw nga ccfDNA gipadato sa circulating phagocytes nga nagtigum sa langyaw nga DNA sa dihang natulon ang mga microorganism ug/o cellular debris.Gikuha sa tingub, ang among mga resulta nagpakita nga ang bivalve hemolymph ccfDNA usa ka talagsaon nga repository sa molekular nga impormasyon ug nagpalig-on sa ilang status isip usa ka sentinel species.
Gipakita sa among datos nga ang pagsunud-sunod ug pagtuki sa mga tipik sa hemolymph ccfDNA nga nakuha sa bakterya makahatag hinungdanon nga kasayuran bahin sa host bacterial flora ug ang bakterya nga naa sa palibot nga ekosistema sa dagat.Ang mga teknik sa pagsunud sa shot nagpadayag sa mga han-ay sa commensal bacteria nga A. atra gill nga masipyat unta kung gigamit ang naandan nga mga pamaagi sa pag-ila sa 16S rRNA, tungod sa usa ka bahin sa bias sa reference library.Sa tinuud, ang among paggamit sa datos sa LB nga nakolekta gikan sa M. platensis sa parehas nga layer sa tahong sa Kerguelen nagpakita nga ang komposisyon sa gill-associated bacterial symbionts parehas alang sa duha nga species sa amahong (Fig. S4, Supplementary Information).Kini nga pagkaparehas sa duha ka genetically lainlain nga amahong mahimong magpakita sa komposisyon sa mga komunidad sa bakterya sa bugnaw, sulfur, ug mga deposito sa bulkan sa Kerguelen [55, 56, 57, 58].Ang mas taas nga lebel sa sulfur-reducing microorganism maayo nga gihulagway sa dihang nag-ani ug mussels gikan sa bioturbated coastal areas [59], sama sa baybayon sa Port-au-France.Ang laing posibilidad mao nga ang commensal mussel flora mahimong maapektuhan sa horizontal transmission [60, 61].Dugang nga panukiduki ang gikinahanglan aron mahibal-an ang correlation tali sa marine environment, seafloor surface, ug ang komposisyon sa symbiotic bacteria sa mussels.Kini nga mga pagtuon nagpadayon karon.
Ang gitas-on ug konsentrasyon sa hemolymph ccfDNA, ang kasayon ​​niini sa pagputli, ug taas nga kalidad aron tugotan ang paspas nga pagsunud sa shotgun mao ang pipila sa daghang mga bentaha sa paggamit sa mussel ccfDNA aron masusi ang biodiversity sa marine coastal ecosystem.Kini nga pamaagi labi ka epektibo alang sa pagkilala sa mga viral nga komunidad (mga virome) sa usa ka gihatag nga ekosistema [62, 63].Dili sama sa bacteria, archaea, ug eukaryotes, ang mga viral genome walay phylogenetically conserved genes sama sa 16S sequence.Gipakita sa among mga resulta nga ang mga likido nga biopsies gikan sa mga espisye sa timailhan sama sa mga amahong mahimong magamit aron mahibal-an ang medyo daghang mga tipik sa ccfDNA virus nga nahibal-an nga makahawa sa mga host nga kasagarang nagpuyo sa mga ekosistema sa dagat sa baybayon.Naglakip kini sa mga virus nga nahibal-an nga makahawa sa protozoa, mga arthropod, mga insekto, mga tanum, ug mga virus nga bakterya (pananglitan, mga bacteriophage).Usa ka susama nga pag-apod-apod nakit-an sa dihang among gisusi ang hemolymph ccfDNA virome sa asul nga amahong (M. platensis) nga nakolekta sa parehas nga mussel layer sa Kerguelen (Table S2, Supplementary Information).Ang pagsunud sa shotgun sa ccfDNA sa tinuud usa ka bag-ong pamaagi nga nakakuha og momentum sa pagtuon sa virome sa mga tawo o uban pang mga espisye [21, 37, 64].Kini nga pamaagi labi ka mapuslanon alang sa pagtuon sa double-stranded nga mga virus sa DNA, tungod kay walay usa nga gene ang gitipigan taliwala sa tanang double-stranded nga mga virus sa DNA, nga nagrepresentar sa labing lainlain ug lapad nga klase sa mga virus sa Baltimore [65].Bisan tuod ang kadaghanan niini nga mga virus nagpabilin nga wala maklasipikar ug mahimong maglakip sa mga virus gikan sa hingpit nga wala mailhi nga bahin sa viral nga kalibutan [66], among nakita nga ang mga virome ug host range sa amahong A. atra ug M. platensis nahulog taliwala sa duha ka espisye.susama (tan-awa ang hulagway S3, dugang nga impormasyon).Kini nga pagkaparehas dili katingad-an, tungod kay mahimo’g kini magpakita sa kakulang sa pagkapili sa pagkuha sa DNA nga naa sa palibot.Ang umaabot nga mga pagtuon gamit ang purified RNA gikinahanglan karon aron mailhan ang RNA virome.
Sa among pagtuon, gigamit namo ang usa ka higpit kaayo nga pipeline nga gipahaum gikan sa trabaho ni Kowarski ug mga kauban [37], nga migamit sa duha ka lakang nga pagtangtang sa mga pooled reads ug contigs sa wala pa ug pagkahuman sa pag-assemble sa lumad nga ccfDNA, nga miresulta sa taas nga proporsiyon sa wala ma-map nga mga pagbasa.Busa, dili nato isalikway nga ang pipila niining wala ma-mapa nga mga basahon mahimong aduna pa'y kaugalingong gigikanan, ilabina tungod kay wala kitay reperensiya nga genome alang niining espisye sa tahong.Gigamit usab namo kini nga pipeline tungod kay nabalaka kami bahin sa mga chimeras tali sa kaugalingon ug dili-kaugalingon nga pagbasa ug ang mga gitas-on sa pagbasa nga gihimo sa Illumina MiSeq PE75.Ang laing rason alang sa kadaghanan sa wala pa mabasa nga mga pagbasa mao nga kadaghanan sa mga mikrobyo sa dagat, ilabi na sa hilit nga mga dapit sama sa Kerguelen, wala ma-annotate.Gigamit namo ang Illumina MiSeq PE75, nga nagtuo nga ang ccfDNA fragment lengths susama sa ccfDNA sa tawo.Alang sa umaabot nga mga pagtuon, nga gihatag sa among mga resulta nga nagpakita nga ang hemolymph ccfDNA mas taas nga pagbasa kaysa mga tawo ug/o mammal, among girekomendar ang paggamit sa usa ka sequencing nga plataporma nga mas angay alang sa mas taas nga ccfDNA nga mga tipik.Kini nga praktis makapasayon ​​sa pag-ila sa dugang nga mga timailhan alang sa mas lawom nga pagtuki.Ang pag-angkon sa kasamtangan nga dili magamit nga kompleto nga A. atra nuclear genome sequence makapadali usab sa diskriminasyon sa ccfDNA gikan sa kaugalingon ug dili-kaugalingon nga mga tinubdan.Gihatag nga ang among panukiduki naka-focus sa posibilidad sa paggamit sa konsepto sa liquid biopsy sa mga amahong, nanghinaut kami nga samtang kini nga konsepto gigamit sa umaabot nga panukiduki, ang mga bag-ong himan ug mga linya sa tubo maugmad aron madugangan ang potensyal niini nga pamaagi aron matun-an ang pagkalainlain sa microbial sa mga amahong.ekosistema sa dagat.
Ingon nga usa ka non-invasive clinical biomarker, ang taas nga lebel sa plasma sa tawo sa ccfDNA nalangkit sa nagkalain-laing mga sakit, kadaot sa tisyu, ug mga kondisyon sa stress [67,68,69].Kini nga pagtaas nalangkit sa pagpagawas sa mga tipik sa DNA sa kaugalingon nga gigikanan niini pagkahuman sa kadaot sa tisyu.Among gitubag kini nga isyu gamit ang acute heat stress, diin ang mga amahong na-expose sa makadiyot sa temperatura nga 30 °C.Among gihimo kini nga pagtuki sa tulo ka lain-laing matang sa amahong sa tulo ka independenteng mga eksperimento.Bisan pa, wala kami nakit-an nga pagbag-o sa lebel sa ccfDNA pagkahuman sa grabe nga stress sa kainit (tan-awa ang Figure S5, dugang nga kasayuran).Kini nga pagkadiskobre mahimong magpatin-aw, labing menos sa bahin, ang kamatuoran nga ang mga amahong adunay semi-open circulatory system ug nagtigom ug daghang langyaw nga DNA tungod sa ilang taas nga kalihokan sa pagsala.Sa laing bahin, ang mga amahong, sama sa daghang mga invertebrates, mahimong mas makasugakod sa kadaot sa tisyu nga gipahinabo sa stress, sa ingon naglimite sa pagpagawas sa ccfDNA sa ilang hemolymph [70, 71].
Sa pagkakaron, ang DNA analysis sa biodiversity sa aquatic ecosystem nag-una nga naka-focus sa environmental DNA (eDNA) metabarcoding.Bisan pa, kini nga pamaagi kasagaran limitado sa pagtuki sa biodiversity kung gigamit ang mga primer.Ang paggamit sa shotgun sequencing naglikay sa mga limitasyon sa PCR ug ang mapihigong pagpili sa mga primer set.Busa, sa usa ka diwa, ang atong pamaagi mas duol sa bag-o lang nga gigamit nga high-throughput eDNA Shotgun sequencing nga pamaagi, nga makahimo sa direktang pagkasunod-sunod sa tipik nga DNA ug pag-analisar sa halos tanang organismo [72, 73].Bisan pa, adunay daghang mga sukaranan nga mga isyu nga nagpalahi sa LB gikan sa standard nga mga pamaagi sa eDNA.Siyempre, ang nag-unang kalainan tali sa eDNA ug LB mao ang paggamit sa mga natural nga filter host.Ang paggamit sa mga espisye sa dagat sama sa mga espongha ug bivalve (Dresseina spp.) isip usa ka natural nga filter alang sa pagtuon sa eDNA gitaho [74, 75].Apan, ang pagtuon ni Dreissena migamit ug tissue biopsyes diin gikuha ang DNA.Ang pag-analisa sa ccfDNA gikan sa LB wala magkinahanglan og tissue biopsy, espesyal ug usahay mahal nga kagamitan ug logistics nga may kalabutan sa eDNA o tissue biopsy.Sa tinuud, bag-o lang namon nga gitaho nga ang ccfDNA gikan sa LB mahimong tipigan ug analisahon uban ang suporta sa FTA nga wala magpadayon ang usa ka bugnaw nga kadena, nga usa ka dakong hagit alang sa panukiduki sa hilit nga mga lugar [76].Ang pagkuha sa ccfDNA gikan sa mga likido nga biopsies yano ra usab ug naghatag taas nga kalidad nga DNA alang sa pagsunud sa shotgun ug pagtuki sa PCR.Kini usa ka dako nga bentaha nga gihatag sa pipila sa mga teknikal nga limitasyon nga may kalabutan sa pagtuki sa eDNA [77].Ang kayano ug mubu nga gasto sa pamaagi sa sampling labi nga angay alang sa mga programa sa pag-monitor sa dugay nga panahon.Dugang pa sa ilang taas nga abilidad sa pagsala, ang laing ilado nga bahin sa bivalves mao ang kemikal nga mucopolysaccharide nga komposisyon sa ilang mucus, nga nagpasiugda sa pagsuyup sa mga virus [78, 79].Gihimo niini ang mga bivalve nga usa ka sulundon nga natural nga filter alang sa pag-ila sa biodiversity ug ang epekto sa pagbag-o sa klima sa usa ka ecosystem sa tubig.Bisan kung ang presensya sa mga tipik sa DNA nga nakuha sa host makita nga usa ka limitasyon sa pamaagi kung itandi sa eDNA, ang gasto nga nalangkit sa pagbaton sa ingon nga lumad nga ccfDNA kumpara sa eDNA dungan nga masabtan alang sa daghang kasayuran nga magamit alang sa mga pagtuon sa kahimsog.offset nga host.Naglakip kini sa presensya sa mga sequence sa viral nga gisagol sa genome sa host host.Importante kini ilabina alang sa mga amahong, tungod sa presensya sa horizontally transmitted leukemic retroviruses sa bivalves [80, 81].Ang laing bentaha sa LB kay sa eDNA mao nga gipahimuslan niini ang phagocytic nga kalihokan sa nagpalibot nga mga selula sa dugo sa hemolymph, nga naglamoy sa mga mikroorganismo (ug sa ilang mga genome).Ang phagocytosis mao ang nag-unang gimbuhaton sa mga selula sa dugo sa mga bivalve [82].Sa katapusan, ang pamaagi nagpahimulos sa taas nga kapasidad sa pagsala sa mga amahong (aberids nga 1.5 l/h nga tubig sa dagat) ug duha ka adlaw nga sirkulasyon, nga nagdugang sa pagsagol sa lain-laing mga lut-od sa tubig-dagat, nga nagtugot sa pagdakop sa heterologous nga eDNA.[83, 84].Busa, ang pag-analisa sa mussel ccfDNA usa ka makaiikag nga paagi nga gihatag ang mga epekto sa nutrisyon, ekonomiya, ug kalikupan sa mga amahong.Sama sa pag-analisar sa LB nga nakolekta gikan sa mga tawo, kini nga pamaagi nagbukas usab sa posibilidad sa pagsukod sa genetic ug epigenetic nga mga pagbag-o sa host DNA agig tubag sa mga exogenous substance.Pananglitan, ang mga teknolohiya sa pagsunud sa ikatulo nga henerasyon mahimong mahunahuna aron mahimo ang pag-analisa sa genome-wide methylation sa lumad nga ccfDNA gamit ang nanopore sequencing.Kini nga proseso kinahanglan nga mapadali sa kamatuoran nga ang gitas-on sa mga tipik sa mussel ccfDNA mao ang labing maayo nga compatible uban sa dugay na pagbasa sequencing platform nga nagtugot genome-wide DNA methylation analysis gikan sa usa ka sequencing run nga walay panginahanglan alang sa kemikal nga mga kausaban.85,86] Kini mao ang usa ka makapaikag nga posibilidad, ingon nga kini gipakita nga ang DNA methylation patterns ug nagapakita sa usa ka tubag sa many environmental stress gene.Busa, makahatag kini og bililhong pagsabot sa nagpahiping mga mekanismo nga nagdumala sa tubag human sa pagkaladlad sa kausaban sa klima o mga hugaw [87].Bisan pa, ang paggamit sa LB dili walay mga limitasyon.Dili na kinahanglan isulti, kini nanginahanglan sa presensya sa mga espisye sa timailhan sa ekosistema.Sama sa nahisgutan sa ibabaw, ang paggamit sa LB aron masusi ang biodiversity sa usa ka ekosistema nanginahanglan usab usa ka higpit nga pipeline sa bioinformatics nga gikonsiderar ang presensya sa mga tipik sa DNA gikan sa gigikanan.Ang laing dakong problema mao ang pagkaanaa sa mga reference genome alang sa marine species.Gilauman nga ang mga inisyatibo sama sa Marine Mammal Genomes Project ug ang bag-o lang natukod nga Fish10k nga proyekto [88] makapadali sa maong pagtuki sa umaabot.Ang paggamit sa konsepto sa LB ngadto sa marine filter-feeding organisms nahiuyon usab sa pinakabag-o nga mga pag-uswag sa sequencing technology, nga naghimo niini nga haum kaayo alang sa pagpalambo sa multi-ohm biomarkers aron paghatag og importante nga impormasyon mahitungod sa kahimsog sa marine habitats agig tubag sa stress sa kinaiyahan.
Ang datos sa pagkasunod-sunod sa genome nadeposito sa NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 ubos sa Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Epekto sa pagbag-o sa klima sa kinabuhi sa dagat ug ekosistema.Cole Biology.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, ug uban pa.Hunahunaa ang hiniusang epekto sa pagbag-o sa klima ug uban pang mga lokal nga stressor sa kalikopan sa dagat.kinatibuk-ang siyentipikanhong palibot.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P, et al.).Siyensiya sa una sa Marso.2020;7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Ang pagkunhod sa pag-agwanta sa kainit ubos sa balik-balik nga mga kondisyon sa stress sa kainit nagpatin-aw sa taas nga kamatayon sa ting-init sa mga blue mussels.Scientific report 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER, ug uban pa.Bag-o nga mga pagbag-o sa kasubsob, hinungdan ug gidak-on sa pagkamatay sa mga hayop.Proc Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mugheti D, Cerruti F, Hosseini S, ug uban pa.Daghang dili espesipiko nga mga pathogen ang mahimong hinungdan sa daghang pagkamatay sa Pinna nobilis.Kinabuhi.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potensyal nga epekto sa pagbag-o sa klima sa Arctic zoonotic nga mga sakit.Panglawas sa Int J Circumpolar.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. et al.Blue mussels (Mytilus edulis spp.) isip signal nga mga organismo sa pagmonitor sa polusyon sa baybayon: usa ka pagrepaso.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Paghiusa sa liquid biopsy sa pagtambal sa kanser.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C, ug uban pa.Liquid biopsy maturation: Nagtugot sa tumor DNA sa pag-circulate.Nat Rev Kanser.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nucleic acids sa plasma sa tawo.Mga minuto sa miting sa mga subsidiary sa Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Usa ka bag-ong papel alang sa cell-free nga DNA isip usa ka molekular nga marka alang sa pagtambal sa kanser.Pag-ihap sa biomolar analysis.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Liquid biopsy misulod sa klinika - mga isyu sa pagpatuman ug umaabot nga mga hagit.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW ug uban pa.Ang DNA sa fetus anaa sa plasma ug serum sa inahan.Lancet.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Pagtuon sa kurso sa pagmabdos ug ang mga komplikasyon niini gamit ang circulating extracellular RNA sa dugo sa mga babaye sa panahon sa pagmabdos.Dopediatrics.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J, ug uban pa.Liquid biopsy: ang donor cell-free DNA gigamit sa pag-detect sa allogeneic lesions sa kidney graft.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Innovations sa prenatal diagnostics: maternal plasma genome sequencing.Anna MD.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, ug uban pa.Paspas nga pathogen detection uban sa sunod nga henerasyon nga metagenomic sequencing sa nataptan nga mga likido sa lawas.Nat Medicine.2021;27:115-24.