Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ihatag ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Adunay panginahanglan alang sa usa ka kasaligan nga in vitro nga sistema nga tukma nga makahimo sa pisyolohikal nga palibot sa kasingkasing alang sa pagsulay sa droga.Ang limitado nga pagkaanaa sa mga sistema sa kultura sa tisyu sa kasingkasing sa tawo nagdala sa dili tukma nga paghubad sa mga epekto sa tambal sa kasingkasing.Dinhi, nakahimo kami usa ka modelo sa kultura sa tisyu sa kasingkasing (CTCM) nga electromechanically nagpukaw sa mga hiwa sa kasingkasing ug nag-agi sa physiological stretch sa panahon sa systolic ug diastolic nga mga hugna sa siklo sa kasingkasing.Human sa 12 ka adlaw nga kultura, kini nga pamaagi partially miuswag sa viability sa kasingkasing nga mga seksyon, apan wala sa bug-os nga pagpreserbar sa ilang structural integridad.Busa, human sa gamay nga screening sa molekula, among nakita nga ang pagdugang sa 100 nM triiodothyronine (T3) ug 1 μM dexamethasone (Dex) sa among medium nagmintinar sa microstructure sa mga seksyon sulod sa 12 ka adlaw.Sa kombinasyon sa T3 / Dex nga pagtambal, ang sistema sa CTCM nagmintinar sa transcriptional profiles, viability, metabolic activity, ug structural integrity sa samang lebel sa presko nga tisyu sa kasingkasing sulod sa 12 ka adlaw.Dugang pa, ang sobra nga pag-inat sa tisyu sa kasingkasing sa kultura nag-aghat sa hypertrophic cardiac signaling, nga naghatag ebidensya sa katakus sa CTCM sa pagsundog sa hypertrophic nga mga kondisyon nga gipahinabo sa cardiac stretch.Sa konklusyon, ang CTCM mahimong mag-modelo sa pisyolohiya ug pathophysiology sa kasingkasing sa kultura sa taas nga panahon, nga makapahimo sa kasaligan nga pagsusi sa tambal.
Sa wala pa ang pagpanukiduki sa klinika, gikinahanglan ang kasaligan nga mga sistema sa vitro nga tukma nga makagama sa pisyolohikal nga palibot sa kasingkasing sa tawo.Ang ingon nga mga sistema kinahanglan nga magsundog sa giusab nga mekanikal nga pag-inat, rate sa kasingkasing, ug mga kabtangan sa electrophysiological.Ang mga modelo sa mananap kasagarang gigamit isip usa ka screening platform alang sa cardiac physiology nga adunay limitado nga kasaligan sa pagpakita sa mga epekto sa mga droga sa kasingkasing sa tawo1,2.Sa katapusan, ang Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) usa ka modelo nga sensitibo kaayo ug espesipiko alang sa lainlaing mga interbensyon sa terapyutik ug pharmacological, nga tukma nga nagbag-o sa pisyolohiya ug pathophysiology sa kasingkasing sa tawo3.Ang pagkawala sa ingon nga sistema naglimite sa pagkadiskobre sa mga bag-ong pagtambal alang sa pagkapakyas sa kasingkasing4,5 ug misangpot sa cardiotoxicity sa droga isip usa ka dakong rason sa paggawas sa merkado6.
Sulod sa milabay nga dekada, walo ka non-cardiovascular nga tambal ang gi-withdraw gikan sa klinikal nga paggamit tungod kay kini maoy hinungdan sa QT interval prolongation nga mosangpot sa ventricular arrhythmias ug kalit nga kamatayon7.Sa ingon, adunay nagkadako nga panginahanglan alang sa kasaligan nga preclinical screening nga mga estratehiya aron masusi ang pagkaepektibo ug pagkahilo sa cardiovascular.Ang bag-o nga paggamit sa human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) sa drug screening ug toxicity testing naghatag ug partial nga solusyon niini nga problema.Bisan pa, ang immature nga kinaiya sa hiPS-CMs ug ang kakulang sa multicellular complexity sa cardiac tissue mao ang mga mayor nga limitasyon niini nga pamaagi.Gipakita sa bag-ong mga pagtuon nga kini nga limitasyon mahimong mabuntog sa usa ka bahin pinaagi sa paggamit sa sayo nga hiPS-CM aron maporma ang mga hydrogel sa tisyu sa kasingkasing pagkahuman sa pagsugod sa kusog nga mga kontraksyon ug anam-anam nga pagtaas sa elektrikal nga pagpadasig sa paglabay sa panahon.Bisan pa, kini nga mga hiPS-CM microtissues kulang sa hamtong nga electrophysiological ug contractile nga mga kabtangan sa hamtong nga myocardium.Dugang pa, ang tisyu sa kasingkasing sa tawo adunay usa ka labi ka komplikado nga istruktura, nga gilangkuban sa usa ka heterogenous nga pagsagol sa lainlaing mga tipo sa selula, lakip ang mga endothelial nga mga selula, mga neuron, ug mga stromal fibroblast, nga konektado sa piho nga mga set sa extracellular matrix nga mga protina.Kini nga heterogeneity sa mga non-cardiomyocyte nga populasyon11,12,13 sa hamtong nga mammalian nga kasingkasing usa ka dakong babag sa pagmodelo sa tisyu sa kasingkasing gamit ang indibidwal nga mga tipo sa selula.Kini nga mga dagkong limitasyon nagpasiugda sa kamahinungdanon sa pagpalambo sa mga pamaagi alang sa pag-kultura sa intact myocardial tissue ubos sa physiological ug pathological nga mga kondisyon.
Napamatud-an nga usa ka maayong modelo sa intact nga myocardium sa tawo ang gikultura nga nipis (300 µm) nga mga seksyon sa kasingkasing sa tawo.Kini nga pamaagi naghatag og access sa usa ka kompleto nga 3D multicellular system nga susama sa tisyu sa kasingkasing sa tawo.Bisan pa, hangtod sa 2019, ang paggamit sa mga seksyon sa kultura sa kasingkasing limitado sa mubo (24 h) nga pagkaluwas sa kultura.Kini tungod sa daghang mga hinungdan lakip na ang kakulang sa pisikal-mekanikal nga pag-inat, ang air-liquid interface, ug ang paggamit sa yano nga media nga wala makasuporta sa mga panginahanglanon sa tisyu sa kasingkasing.Kaniadtong 2019, daghang mga grupo sa panukiduki ang nagpakita nga ang pag-apil sa mga mekanikal nga hinungdan sa mga sistema sa kultura sa tisyu sa kasingkasing makapalugway sa kinabuhi sa kultura, mapaayo ang ekspresyon sa kasingkasing, ug masundog ang patolohiya sa kasingkasing.Ang duha ka elegante nga mga pagtuon 17 ug 18 nagpakita nga ang uniaxial mechanical loading adunay positibo nga epekto sa cardiac phenotype sa panahon sa kultura.Bisan pa, kini nga mga pagtuon wala maggamit sa dinamikong three-dimensional nga physico-mechanical nga pagkarga sa siklo sa kasingkasing, tungod kay ang mga seksyon sa kasingkasing gikargahan sa isometric tensile forces 17 o linear auxotonic loading 18.Kini nga mga pamaagi sa pag-inat sa tisyu miresulta sa pagsumpo sa daghang mga gene sa kasingkasing o sa sobrang pagpahayag sa mga gene nga may kalabutan sa dili normal nga mga tubag sa pag-inat.Ilabi na, Pitoulis et al.Ang 19 nakamugna og usa ka dinamikong heart slice culture bath alang sa pag-reconstruct sa cardiac cycle gamit ang force transducer feedback ug tension drives.Bisan tuod kini nga sistema nagtugot alang sa mas tukma nga in vitro cardiac cycle modeling, ang pagkakomplikado ug ubos nga throughput sa pamaagi naglimite sa paggamit niini nga sistema.Ang among laboratoryo bag-o lang nakahimo ug usa ka gipasimple nga sistema sa kultura gamit ang electrical stimulation ug usa ka optimized nga medium aron mapadayon ang viability sa mga seksyon sa baboy ug tisyu sa kasingkasing sa tawo hangtod sa 6 ka adlaw20,21.
Sa kasamtangan nga manuskrito, among gihulagway ang usa ka cardiac tissue culture model (CTCM) gamit ang mga seksyon sa porcine heart nga naglakip sa humoral cues sa pag-recapitulate sa three-dimensional nga cardiac physiology ug pathophysiological distension atol sa cardiac cycle.Kini nga CTCM makadugang sa katukma sa pre-clinical nga prediksyon sa tambal ngadto sa lebel nga wala pa makab-ot pinaagi sa paghatag ug cost-effective, mid-throughput cardiac system nga nagsundog sa physiology/pathophysiology sa mammalian heart para sa pre-clinical drug testing.
Ang hemodynamic nga mekanikal nga mga signal adunay hinungdanon nga papel sa pagpadayon sa function sa cardiomyocyte sa vitro 22,23,24.Sa kasamtangan nga manuskrito, nakahimo kami og CTCM (Figure 1a) nga makasundog sa adult cardiac environment pinaagi sa pag-aghat sa electrical ug mechanical stimulation sa physiological frequency (1.2 Hz, 72 beats kada minuto).Aron malikayan ang sobra nga pag-inat sa tisyu sa panahon sa diastole, gigamit ang usa ka 3D printing device aron madugangan ang gidak-on sa tisyu sa 25% (Fig. 1b).Ang electrical pacing nga gipahinabo sa C-PACE system gitakda nga magsugod sa 100 ms sa wala pa ang systole gamit ang data acquisition system aron hingpit nga ma-reproduce ang cardiac cycle.Ang sistema sa tissue culture naggamit sa usa ka programmable pneumatic actuator (LB Engineering, Germany) aron cyclically pagpalapad sa usa ka flexible silicone lamad nga hinungdan sa pagpalapad sa mga hiwa sa kasingkasing sa ibabaw nga lawak.Ang sistema konektado sa usa ka eksternal nga linya sa hangin pinaagi sa usa ka pressure transducer, nga nagpaposible sa tukma nga pag-adjust sa pressure (± 1 mmHg) ug oras (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Ibutang ang seksyon sa tisyu sa 7 mm nga suporta nga singsing, nga gipakita sa asul, sulod sa lawak sa kultura sa device.Ang lawak sa kultura gibulag gikan sa lawak sa hangin pinaagi sa usa ka manipis nga flexible silicone membrane.Ibutang ang gasket sa tunga sa matag lawak aron malikayan ang pagtulo.Ang tabon sa aparato adunay mga graphite nga mga electrodes nga naghatag ug elektrikal nga pagpadasig.b Schematic nga representasyon sa dako nga tissue device, giya singsing ug suporta singsing.Ang mga seksyon sa tisyu (brown) gibutang sa dako kaayo nga aparato nga adunay singsing sa giya nga gibutang sa uka sa gawas nga ngilit sa aparato.Gamit ang giya, ibutang pag-ayo ang singsing sa suporta nga adunay sapaw sa tisyu nga acrylic adhesive ibabaw sa seksyon sa tisyu sa kasingkasing.c Graph nga nagpakita sa oras sa electrical stimulation isip function sa air chamber pressure nga kontrolado sa usa ka programmable pneumatic actuator (PPD).Ang data acquisition device gigamit sa pag-synchronize sa electrical stimulation gamit ang pressure sensors.Kung ang presyur sa lawak sa kultura makaabot sa gitakda nga threshold, usa ka signal sa pulso ang ipadala sa C-PACE-EM aron ma-trigger ang electrical stimulation.d Imahe sa upat ka CTCM nga gibutang sa estante sa incubator.Upat ka mga himan ang konektado sa usa ka PPD pinaagi sa pneumatic circuit, ug ang mga sensor sa presyur gisal-ot sa hemostatic valve aron mamonitor ang presyur sa pneumatic circuit.Ang matag aparato adunay unom ka mga seksyon sa tisyu.
Pinaagi sa paggamit sa usa ka pneumatic actuator, nakontrol namo ang 4 ka CTCM nga mga himan, nga ang matag usa makakupot sa 6 ka mga seksyon sa tisyu (Fig. 1d).Sa CTCM, ang presyur sa hangin sa air chamber nakabig ngadto sa dungan nga presyur sa fluid chamber ug nag-aghat sa physiological nga pagpalapad sa heart slice (Figure 2a ug Supplementary Movie 1).Pag-evaluate sa tissue stretch sa 80 mm Hg.Art.nagpakita sa pag-inat sa mga seksyon sa tisyu sa 25% (Fig. 2b).Kini nga porsyento nga pag-inat gipakita nga katumbas sa usa ka pisyolohikal nga sarcomere nga gitas-on nga 2.2-2.3 µm alang sa normal nga pagkontrata sa seksyon sa kasingkasing17,19,25.Ang paglihok sa tisyu gisusi gamit ang mga setting sa kostumbre sa camera (Supplementary Figure 1).Ang amplitude ug velocity sa tissue movement (Fig. 2c, d) katumbas sa pag-inat sa panahon sa cardiac cycle ug sa panahon sa systole ug diastole (Fig. 2b).Ang stretch ug velocity sa cardiac tissue atol sa contraction ug relaxation nagpabilin nga makanunayon sulod sa 12 ka adlaw sa kultura (Fig. 2f).Sa pagtimbang-timbang sa epekto sa electrical stimulation sa contractility sa panahon sa kultura, naghimo kami og usa ka pamaagi sa pagtino sa aktibo nga deformity gamit ang shading algorithm (Supplementary Fig. 2a, b) ug nakahimo sa pag-ila tali sa deformities nga adunay ug walay electrical stimulation.Ang sama nga seksyon sa kasingkasing (Fig. 2f).Sa movable region sa cut (R6-9), ang boltahe sa panahon sa electrical stimulation mao ang 20% ​​nga mas taas kay sa pagkawala sa electrical stimulation, nga nagpakita sa kontribusyon sa electrical stimulation ngadto sa contractile function.
Ang mga timailhan sa presyur sa hangin chamber, presyur sa fluid chamber, ug mga pagsukod sa paglihok sa tisyu nagpamatuod nga ang presyur sa chamber nagbag-o sa presyur sa fluid chamber, hinungdan sa katugbang nga paglihok sa tissue slice.b Representante nga mga timailhan sa porsyento nga pag-inat (asul) sa mga seksyon sa tisyu nga katumbas sa porsyento nga pag-inat (orange).c Ang gisukod nga paglihok sa hiwa sa kasingkasing nahiuyon sa gisukod nga katulin sa paglihok.(d) Representante nga mga trajectory sa cyclic motion (asul nga linya) ug velocity (orange dotted line) sa usa ka slice sa kasingkasing.e Quantification sa cycle time (n = 19 slices kada grupo, gikan sa lain-laing mga baboy), contraction time (n = 19 slices kada grupo), relaxation time (n = 19 slices kada grupo, gikan sa lain-laing mga baboy), tissue kalihukan (n = 25).slices)/grupo gikan sa lain-laing mga baboy), peak systolic velocity (n = 24(D0), 25(D12) hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy) ug peak relaxation rate (n=24(D0), 25(D12) hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy).Ang two-tailed Student's t-test nagpakita nga walay mahinungdanong kalainan sa bisan unsang parametro.f Representative strain analysis nagsubay sa mga seksyon sa tisyu nga adunay (pula) ug walay (asul) nga electrical stimulation, napulo ka rehiyonal nga mga dapit sa mga seksyon sa tisyu gikan sa samang seksyon.Ang ubos nga mga panel nagpakita sa gidaghanon sa porsyento nga kalainan sa strain sa mga seksyon sa tisyu nga adunay ug walay electrical stimulation sa napulo ka mga dapit gikan sa lain-laing mga seksyon. (n = 8 hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, Two-tailed Student t-test ang gihimo; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, Two-tailed Student t-test ang gihimo; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 ka seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, duha ka ikog nga t-test sa Estudyante; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, gikan sa разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 nga mga seksyon/grupo, gikan sa lainlaing mga baboy, duha ka ikog nga t-test sa Estudyante; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
Sa among miaging static biomimetic heart slice culture system [20, 21], among gipadayon ang viability, function, ug structural integrity sa heart slices sulod sa 6 ka adlaw pinaagi sa pagpadapat sa electrical stimulation ug pag-optimize sa medium nga komposisyon.Bisan pa, pagkahuman sa 10 ka adlaw, kini nga mga numero mikunhod pag-ayo.Atong hisgotan ang mga seksyon nga gikultura sa atong miaging static biomimetic culture system 20, 21 control conditions (Ctrl) ug atong gamiton ang atong na-optimize nga medium isip MC nga kondisyon ug kultura ubos sa dungan nga mekanikal ug elektrikal nga stimulation (CTCM).gitawag .Una, among nahibal-an nga ang mekanikal nga pagpadasig nga walay electrical stimulation dili igo aron sa pagpadayon sa tissue viability alang sa 6 nga mga adlaw (Supplementary Fig. 3a, b).Makapainteres, sa pagpaila sa physio-mechanical ug electrical stimulation gamit ang STCM, ang viability sa 12-day heart section nagpabilin nga pareho sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing ubos sa MS nga mga kondisyon, apan dili ubos sa Ctrl nga kondisyon, ingon sa gipakita sa MTT analysis (Fig. 1).3a).Kini nagsugyot nga ang mekanikal nga stimulation ug simulation sa siklo sa kasingkasing makapadayon sa mga seksyon sa tisyu nga mabuhi sa doble nga kadugay nga gitaho sa among miaging static nga sistema sa kultura.Bisan pa, ang pagsusi sa integridad sa istruktura sa mga seksyon sa tisyu pinaagi sa immunolabeling sa cardiac troponin T ug connexin 43 nagpakita nga ang ekspresyon sa connexin 43 labi ka taas sa mga tisyu sa MC sa adlaw nga 12 kaysa sa mga kontrol sa parehas nga adlaw.Bisan pa, ang uniporme nga connexin 43 nga ekspresyon ug pagporma sa Z-disc wala hingpit nga gipadayon (Fig. 3b).Gigamit namo ang artificial intelligence (AI) framework aron ma-quantify ang tissue structural integrity26, usa ka image-based deep learning pipeline base sa troponin-T ug connexin staining43 aron awtomatik nga ma-quantify ang structural integrity ug fluorescence sa heart slices sa mga termino sa kalig-on sa localization.Kini nga pamaagi naggamit sa usa ka Convolutional Neural Network (CNN) ug usa ka lawom nga balangkas sa pagkat-on aron masaligan ang pag-ihap sa integridad sa istruktura sa tisyu sa kasingkasing sa usa ka awtomatiko ug dili mapihigon nga paagi, ingon nga gihulagway sa pakisayran.26. Ang tisyu sa MC nagpakita sa gipaayo nga pagkaparehas sa estruktura sa adlaw nga 0 kumpara sa mga static control section.Dugang pa, ang trichrome staining ni Masson nagpadayag sa usa ka mas ubos nga porsyento sa fibrosis ubos sa MS nga kondisyon kumpara sa pagkontrol sa mga kondisyon sa adlaw nga 12 sa kultura (Fig. 3c).Samtang ang CTCM nagdugang sa viability sa mga seksyon sa tisyu sa kasingkasing sa adlaw nga 12 ngadto sa usa ka lebel nga susama sa presko nga tisyu sa kasingkasing, kini wala kaayo makapauswag sa integridad sa istruktura sa mga seksyon sa kasingkasing.
Ang usa ka Bar graph nagpakita sa quantification sa MTT viability sa presko nga heart slices (D0) o heart slices culture sulod sa 12 ka adlaw bisan sa static culture (D12 Ctrl) o sa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) slices/group nga gihimo; **p <0.01 kumpara sa D12 Ctrl). Ang usa ka Bar graph nagpakita sa quantification sa MTT viability sa presko nga heart slices (D0) o heart slices culture sulod sa 12 ka adlaw bisan sa static culture (D12 Ctrl) o sa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) nga mga hiwa/grupo nga gihimo sa usa ka paagi gikan sa D12 MC nga mga hiwa/grupo gikan sa D##0. ug **p <0.01 kumpara sa D12 Ctrl).ang histogram nagpakita sa quantification sa viability sa MTT fresh heart sections (D0) o kultura sa heart sections sulod sa 12 ka adlaw sa static culture (D12 control) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control). ) ), 12 (D12 MC) sections/group;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 kumpara sa D0 ug **p <0.01 kumpara sa D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 幇(D12 MC) 幇(D0) 幇(D0) 12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 ， tr000 D0.相比，**p < 0.01). usa ka 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D12 Ctrl) 猇(D0)片12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogram nga nagpakita sa quantification sa MTT viability sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) o mga seksyon sa kasingkasing nga gi-culture sulod sa 12 ka adlaw sa static nga kultura (D12 control) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control)), 12 (D12 MC) nga mga seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga ANOVA test, one-way ANOVA test;####p < 0,0001 sa сравнению с D0, **p < 0,01 sa сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 kumpara sa D0, **p <0.01 kumpara sa D12 Ctrl).b Troponin-T (berde), connexin 43 (pula) ug DAPI (asul) sa bag-ong nahimulag nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) o mga seksyon sa kasingkasing nga gi-culture ubos sa static nga kondisyon (Ctrl) o CTCM nga kondisyon (MC) sulod sa 12 ka adlaw) sa representatibo nga immunofluorescence nga mga hulagway (blangko nga sukdanan = 100 µm). Ang artificial intelligence quantification sa heart tissue structural integrity (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) mga hiwa/grupo matag usa gikan sa lain-laing baboy, one-way ANOVA test ang gihimo; ####p <0.0001 kumpara sa D0 ug ****p <0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). Ang artificial intelligence quantification sa heart tissue structural integrity (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) mga hiwa/grupo matag usa gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test ang gihimo; ####p <0.0001 kumpara sa D0 ug ****p <0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной тпкани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl ру2), 7 (D12 Ctrl2) зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению Ctrlс D12). Ang quantification sa structural integrity sa cardiac tissue pinaagi sa artificial intelligence (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) nga mga seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test nga gihimo; ####p <0.0001 kumpara sa D0 ug ****p <0.0001 kumpara sa D0 ug ****p <0.0001).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hiwa/grupo matag usa sa lain-laing baboy, one-way ANOVA test;####p0 ， ####p 0 ，0.****p0 ，0.****p0 ，0.****p0 ，0.****p0 ，0.****p0 ，0.****p0 ，0.****p0 ，0.****p0 ，0.****p0 ， 001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) mga hiwa/grupo matag usa sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test;##p 0 ， ##p 0 ， 0##p 0. 001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0), 7 (D12) Ctrl (D12) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12). Artipisyal nga paniktik aron ma-quantify ang structural integrity sa cardiac tissue (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) nga mga seksyon/grupo matag usa sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test; ####p<0.0001 vs .D0 Para sa pagtandi ****p <0.0001 kumpara sa D). c Representative images (wala) ug quantification (tuo) para sa heart slices nga namansahan sa Masson's trichrome stain (Scale bare = 500 µm) (n = 10 slices/group matag usa gikan sa lain-laing baboy, one-way ANOVA test ang gihimo; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 ug ***p1 <0.000). c Representante nga mga hulagway (wala) ug quantification (tuo) para sa mga hiwa sa kasingkasing nga gimantsa sa Masson's trichrome stain (Scale bare = 500 µm) (n = 10 slices/group matag usa gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test ang gihimo; #### p <0.0001 kumpara sa D0 ug ***ptr <0.0. c Репрезентативные изображения (слева) ug количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным количественная оценка (справа) срезов сердца, ытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по синей, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по синев нию sa D12 Ctrl). c Representante nga mga hulagway (wala) ug quantification (tuo) sa mga seksyon sa kasingkasing nga gimantsa sa Masson's trichrome stain (uncoated scale = 500 µm) (n = 10 sections/group gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test nga gihimo; #### p <0 .0001 kumpara sa D0 ug ***p <0.001 kumpara sa D1 ug ***p <0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度 （裸尺度 （裸尺度 （裸尺度 1片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 Ctrl 紛D1. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测词 ，0*##试 ，0*##试p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красите 5 стер мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсио;## 0 сио ;## нению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representante nga mga hulagway (wala) ug quantitation (tuo) sa mga seksyon sa kasingkasing nga namansahan sa trichrome stain ni Masson (blangko = 500 µm) (n = 10 ka seksyon/grupo, matag usa gikan sa lain-laing baboy, gisulayan pinaagi sa one-way analysis sa variance ;### # p <0.0001 kumpara sa D0, ***ptr <0.1).Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
Gipanghimatuud namon nga pinaagi sa pagdugang sa gagmay nga mga molekula sa medium nga kultura, ang integridad sa cardiomyocyte mahimong mapauswag ug ang pag-uswag sa fibrosis makunhuran sa panahon sa kultura sa CTCM.Busa gisusi namo ang gagmay nga mga molekula gamit ang among static control nga mga kultura20,21 tungod sa gamay nga gidaghanon sa makalibog nga mga hinungdan.Ang Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), ug SB431542 (SB) gipili alang niini nga screen.Kini nga gagmay nga mga molekula gigamit kaniadto sa mga kultura sa hiPSC-CM aron mapukaw ang pagkahinog sa mga cardiomyocytes pinaagi sa pagdugang sa gitas-on sa sarcomere, T-tubules, ug tulin sa pagpadagan.Dugang pa, ang Dex (usa ka glucocorticoid) ug SB nahibal-an nga makapugong sa panghubag29,30.Busa, gisulayan namo kung ang paglakip sa usa o kombinasyon niining gagmay nga mga molekula makapauswag sa integridad sa istruktura sa mga seksyon sa kasingkasing.Alang sa inisyal nga screening, ang dosis sa matag compound gipili base sa mga konsentrasyon nga sagad gigamit sa mga modelo sa cell culture (1 μM Dex27, 100 nM T327, ug 2.5 μM SB31).Human sa 12 ka adlaw nga kultura, ang kombinasyon sa T3 ug Dex miresulta sa kamahinungdanon nga cardiomyocyte structural integrity ug minimal fibrous remodeling (Supplementary Figures 4 ug 5).Dugang pa, ang paggamit sa doble o doble niini nga mga konsentrasyon sa T3 ug Dex nagpatunghag makadaot nga mga epekto kon itandi sa normal nga mga konsentrasyon (Supplementary Fig. 6a, b).
Human sa inisyal nga screening, gihimo namo ang usa ka head-to-head nga pagtandi sa mga kondisyon sa kultura sa 4 (Figure 4a): Ctrl: mga seksyon sa kasingkasing nga gikulto sa among gihulagway kaniadto nga static nga kultura gamit ang among na-optimize nga medium;20.21 TD: T3 ug Ctrl s Gidugang Dex sa Miyerkules;MC: mga seksyon sa kasingkasing nga gi-kultura sa CTCM gamit ang among na-optimize nga medium kaniadto;ug MT: CTCM nga adunay T3 ug Dex nga gidugang sa medium.Human sa 12 ka adlaw nga pagpananom, ang viability sa MS ug MT nga mga tisyu nagpabilin nga pareho sa presko nga mga tisyu nga gisusi sa MTT assay (Fig. 4b).Makapainteres, ang pagdugang sa T3 ug Dex sa transwell cultures (TD) wala magresulta sa usa ka mahinungdanon nga pag-uswag sa viability kumpara sa mga kondisyon sa Ctrl, nga nagpakita sa usa ka importante nga papel sa mekanikal nga stimulation sa pagmintinar sa viability sa mga seksyon sa kasingkasing.
usa ka diagram sa eksperimento nga disenyo nga naghulagway sa upat ka kondisyon sa kultura nga gigamit sa pagtimbang-timbang sa mga epekto sa mekanikal nga stimulation ug T3/Dex supplementation sa medium sulod sa 12 ka adlaw. b Bar graph nagpakita sa quantification sa viability 12 days post culture sa tanang 4 nga kondisyon sa kultura (Ctrl, TD, MC, ug MT) kumpara sa presko nga mga hiwa sa kasingkasing (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ug D12 MT), 12 (D12 MC) nga mga hiwa/grupo nga gihimo, ###0 nga pagsulay/grupo gikan sa lain-laing mga baboy. p <0.001 kumpara sa D0 ug **p <0.01 kumpara sa D12 Ctrl). b Bar graph nagpakita sa quantification sa viability 12 days post culture sa tanang 4 nga kondisyon sa kultura (Ctrl, TD, MC, ug MT) kumpara sa presko nga mga hiwa sa kasingkasing (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ug D12 MT), 12 (D12 MC) nga mga hiwa/grupo nga gihimo, ###0 nga pagsulay/grupo gikan sa lain-laing mga baboy. p <0.001 kumpara sa D0 ug **p <0.01 kumpara sa D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселоникровут роль, TD, MC и MT) pinaagi sa сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) тово й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ##p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Ang bar graph nagpakita sa quantification sa viability sa 12 ka adlaw nga post culture sa tanang 4 nga kondisyon sa kultura (kontrol, TD, MC, ug MT) kumpara sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ug D12 MT), 12 (D12 MC, MC) nga mga seksyon / grupo, 12 (D12 MC) nga mga seksyon / ##0, ##0 nga mga seksyon sa baboy / ##0. p <0.001 kumpara sa D0 ug **p <0.01 kumpara sa D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5) 、 12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与 D0 ， D0 ， D0 ， D0 . ）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими (сежими (сежими) 0 12 Ctrl, D12 TD ug D12 MT), gikan sa разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ####p <0,001 по внению с контролем D12). b Histogram nga nagpakita sa tanang 4 nga kondisyon sa kultura (kontrol, TD, MC ug MT) kon itandi sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ug D12 MT), gikan sa lainlaing mga baboy 12 (D12 MC) nga mga seksyon/grupo, one-way ANOVA test; #####p<0.0. 1 batok sa kontrol D12). c Bar graph nagpakita sa quantification sa glucose flux 12 ka adlaw post kultura sa tanan nga 4 kultura kondisyon (Ctrl, TD, MC, ug MT) itandi sa presko nga kasingkasing slices (D0) (n = 6 hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test gihimo; ###p <0.001, itandi sa D0 ug ***p <0.001). c Bar graph nagpakita sa quantification sa glucose flux 12 ka adlaw post kultura sa tanan nga 4 kultura kondisyon (Ctrl, TD, MC, ug MT) itandi sa presko nga kasingkasing slices (D0) (n = 6 hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test gihimo; ###p <0.001, itandi sa D0 ug ***p <0.001). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 лухникро ь, TD, MC ug MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одностотялнин0, одностотялнин 0 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram nagpakita sa quantification sa glucose flux 12 ka adlaw post-kultura ubos sa tanan nga 4 kultura kondisyon (kontrol, TD, MC ug MT) kumpara sa lab-as nga kasingkasing seksyon (D0) (n = 6 seksyon/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA pagsulay nga gihimo; ###p <0.001 kumpara sa D0 ug ***p <0.001 Ctrl itandi sa D1). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比 ，吹行通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比， 0***p 1.***p 。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 ， 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执 猪单向执，不行向0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для вселькования для вселькования нтроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, одниностро ; ##p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram nga nagpakita sa quantification sa glucose flux sa 12 ka adlaw nga post-culture alang sa tanan nga 4 nga kondisyon sa kultura (kontrol, TD, MC, ug MT) kumpara sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) (n = 6 nga mga seksyon / grupo, gikan sa lain-laing mga baboy, unilateral Ang ANOVA nga mga pagsulay gihimo, ###p <0.001 kumpara sa D0, ***p <0.001 kumpara sa D0, *** p <0.d Strain analysis plots sa presko (asul), adlaw nga 12 MC (berde), ug adlaw nga 12 MT (pula) nga mga tisyu sa napulo ka rehiyonal nga mga punto sa seksyon sa tisyu (n = 4 hiwa / grupo, one-way ANOVA test; walay mahinungdanong kalainan tali sa mga grupo).e Plano sa bulkan nga nagpakita sa lahi nga gipahayag nga mga gene sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) kumpara sa mga seksyon sa kasingkasing nga gikultura ubos sa static nga kondisyon (Ctrl) o ubos sa MT nga kondisyon (MT) sulod sa 10-12 ka adlaw.f Heatmap sa sarcomere genes alang sa mga seksyon sa kasingkasing nga gi-culture ubos sa matag usa sa mga kondisyon sa kultura.Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
Ang pagsalig sa metaboliko sa pagbalhin gikan sa oksihenasyon sa fatty acid hangtod sa glycolysis usa ka timaan sa dedifferentiation sa cardiomyocyte.Ang mga immature cardiomyocytes nag-una nga naggamit sa glucose alang sa produksiyon sa ATP ug adunay hypoplastic mitochondria nga adunay gamay nga cristae5,32.Ang pag-analisar sa paggamit sa glucose nagpakita nga ubos sa mga kondisyon sa MC ug MT, ang paggamit sa glucose susama nianang sa adlaw nga 0 nga mga tisyu (Figure 4c).Bisan pa, ang mga sample sa Ctrl nagpakita usa ka hinungdanon nga pagtaas sa paggamit sa glucose kumpara sa presko nga tisyu.Kini nagpakita nga ang kombinasyon sa CTCM ug T3/Dex makapauswag sa tissue viability ug magpreserbar sa metabolic phenotype sa 12-day cultured heart sections.Dugang pa, ang pag-analisa sa strain nagpakita nga ang lebel sa strain nagpabilin nga pareho sa presko nga tisyu sa kasingkasing sulod sa 12 ka adlaw ubos sa MT ug MS nga kondisyon (Fig. 4d).
Aron ma-analisar ang kinatibuk-ang epekto sa CTCM ug T3 / Dex sa global transcriptional landscape sa cardiac slice tissue, among gihimo ang RNAseq sa mga hiwa sa kasingkasing gikan sa tanang upat ka lain-laing mga kondisyon sa kultura (Supplementary Data 1).Makapainteres, ang mga seksyon sa MT nagpakita sa taas nga pagkaparehas sa transkripsyon sa presko nga tisyu sa kasingkasing, nga adunay 16 nga lahi nga gipahayag gikan sa 13,642 nga mga gene.Bisan pa, sama sa among gipakita sa sayo pa, ang mga hiwa sa Ctrl nagpakita sa 1229 nga lahi nga gipahayag nga mga gene pagkahuman sa 10-12 ka adlaw sa kultura (Fig. 4e).Kini nga mga datos gipamatud-an sa qRT-PCR sa kasingkasing ug fibroblast nga mga gene (Supplementary Fig. 7a-c).Makapainteres, ang mga seksyon sa Ctrl nagpakita sa pagkunhod sa mga gene sa kasingkasing ug cell cycle ug pagpaaktibo sa mga programa sa gene nga makapahubag.Kini nga mga datos nagsugyot nga ang dedifferentiation, nga kasagarang mahitabo human sa dugay nga pag-kultura, hingpit nga nahurot ubos sa mga kondisyon sa MT (Supplementary Fig. 8a, b).Ang maampingong pagtuon sa mga gene sa sarcomere nagpakita nga ubos lamang sa mga kondisyon sa MT ang mga gene nga nag-encode sa sarcomere (Fig. 4f) ug ion channel (Supplementary Fig. 9) gipreserbar, nga nanalipod kanila gikan sa pagsumpo ubos sa Ctrl, TD, ug MC nga mga kondisyon.Gipakita niini nga mga datos nga sa kombinasyon sa mekanikal ug humoral stimulation (T3/Dex), ang heart slice transcriptome mahimong magpabilin nga susama sa lab-as nga mga hiwa sa kasingkasing human sa 12 ka adlaw sa kultura.
Kini nga mga nahibal-an sa transkripsyon gisuportahan sa kamatuoran nga ang integridad sa istruktura sa mga cardiomyocytes sa mga seksyon sa kasingkasing labing maayo nga gipreserbar sa ilawom sa mga kondisyon sa MT sa 12 nga mga adlaw, ingon nga gipakita sa wala’y hunong ug lokal nga connexin 43 (Fig. 5a).Dugang pa, ang fibrosis sa mga seksyon sa kasingkasing ubos sa mga kondisyon sa MT dako nga pagkunhod kon itandi sa Ctrl ug susama sa presko nga mga seksyon sa kasingkasing (Fig. 5b).Gipakita niini nga mga datos nga ang kombinasyon sa mekanikal nga pagpadasig ug pagtambal sa T3 / Dex epektibo nga nagpreserbar sa istruktura sa kasingkasing sa mga seksyon sa kasingkasing sa kultura.
usa ka Representante nga immunofluorescence nga mga hulagway sa troponin-T (berde), connexin 43 (pula), ug DAPI (asul) sa bag-ong nahilit nga mga seksyon sa kasingkasing (D0) o gikulto sulod sa 12 ka adlaw sa tanang upat ka kondisyon sa kultura sa seksyon sa kasingkasing (scale bar = 100 µm).). Ang artificial intelligence quantification sa heart tissue structural integrity (n = 7 (D0 ug D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ug D12 MT) mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA test gihimo; ####p <0.0001 kumpara sa D0 ug *p <0.00tr <1.005, o D0.00. Ang artificial intelligence quantification sa heart tissue structural integrity (n = 7 (D0 ug D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ug D12 MT) mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, ang one-way ANOVA test gihimo; #### p <0.0001 kumpara sa D0 ug *p <0.00tr <1.005, o D0.0001 kon itandi sa D0 ug *p <0.005, o . Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 2 MC TD, D0 2 D15) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,005 ил 2 Ctrl). Pag-ihap sa integridad sa istruktura sa tisyu sa kasingkasing gamit ang artipisyal nga paniktik (n = 7 (D0 ug D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ug D12 MT) nga mga seksyon / grupo gikan sa lainlaing mga baboy, usa ka paagi nga ANOVA nga pagsulay nga gihimo; #### p <0.0001 kumpara sa D0 ug *p <0.000.05 o D0.对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和人和跄盌）智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与缛毀 D12 Ctr。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 2.Pag-ihap sa structural integrity sa cardiac tissue gamit ang artificial intelligence sa lain-laing mga baboy (n = 7 (D0 ug D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ug D12 MT) nga mga seksyon / grupo) nga adunay one-way ANOVA test;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 o ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 kumpara sa D0 ug *p <0.05 o ****p <0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). b Representante nga mga hulagway ug quantification alang sa mga hiwa sa kasingkasing nga gimantsa sa Masson's trichrome stain (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ug D12 MC), 9 (D12 MT) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA nga pagsulay gihimo <0.##0##0 <0. 1, o ****p <0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). b Representante nga mga hulagway ug quantification alang sa mga hiwa sa kasingkasing nga gimantsa sa Masson's trichrome stain (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ug D12 MC), 9 (D12 MT) nga mga hiwa/grupo gikan sa lain-laing mga baboy, one-way ANOVA nga pagsulay gihimo <0.##0##0 <0. 1, o ****p <0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (массона 5) = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний теp01 ,## расский теp ANOVA ,##0; ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Representative images ug quantification of heart sections stained with Masson's trichrome stain (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD and D12 MC), 9 (D12 MT) sections/group gikan sa lain-laing mga baboy, gipahigayon <1-way ANOVA; ##00 ug ***0. p <0.0001 batok sa D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！D = 10）！D = 10（D 10） D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；##****##p < 0.0001 ，*p 与 <0.0001 ，*p*** 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） ） 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 ， 曾001 ， 中文 0.0001 ， 主01 ， 中文 0.001 ****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = 1,0й) 2 Ctrl, D12 TD ug D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; по сравнению с D12 Ctrl). b Representante nga mga hulagway ug quantification sa mga seksyon sa kasingkasing nga namansahan sa Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ug D12 MC), 9 (D12 MT) nga mga seksyon gikan sa lain-laing mga baboy/grupo, usa ka ANOVA nga pamaagi; ####p <0.0. .0001 kumpara sa D12 Ctrl).Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
Sa katapusan, ang abilidad sa CTCM sa pagsundog sa cardiac hypertrophy gisusi pinaagi sa pagdugang sa cardiac tissue stretch.Sa CTCM, ang peak air chamber pressure misaka gikan sa 80 mmHg ngadto sa 80 mmHg.Art.(normal nga pag-inat) hangtod sa 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Kini katumbas sa usa ka 32% nga pagtaas sa pag-inat (Fig. 6b), nga kaniadto gipakita ingon nga katumbas nga porsyento nga pag-inat nga gikinahanglan alang sa mga seksyon sa kasingkasing aron makab-ot ang usa ka sarcomere nga gitas-on nga susama sa nakita sa hypertrophy.Ang stretch ug velocity sa cardiac tissue sa panahon sa contraction ug relaxation nagpabilin nga makanunayon sulod sa unom ka adlaw nga kultura (Fig. 6c).Ang tisyu sa kasingkasing gikan sa mga kondisyon sa MT gipailalom sa normal nga pag-inat (MT (Normal)) o mga kondisyon sa overstretch (MT (OS)) sulod sa unom ka adlaw.Human sa upat ka adlaw sa kultura, ang hypertrophic biomarker nga NT-ProBNP dako nga gipataas sa medium ubos sa MT (OS) nga mga kondisyon kumpara sa MT (normal) nga mga kondisyon (Fig. 7a).Dugang pa, human sa unom ka adlaw nga pag-kultura, ang gidak-on sa selula sa MT (OS) (Fig. 7b) dako nga pagtaas kon itandi sa mga seksyon sa MT nga kasingkasing (normal).Dugang pa, ang NFATC4 nukleyar nga translokasyon nadugangan pag-ayo sa sobra nga mga tisyu (Fig. 7c).Kini nga mga resulta nagpakita sa progresibong pag-uswag sa pathological remodeling human sa hyperdistension ug pagsuporta sa konsepto nga ang CTCM device mahimong gamiton isip plataporma sa pagtuon sa stretch-induced cardiac hypertrophy signaling.
Ang mga timailhan sa presyur sa hangin chamber, presyur sa fluid chamber, ug mga pagsukod sa paglihok sa tisyu nagpamatuod nga ang presyur sa chamber nagbag-o sa presyur sa fluid chamber, hinungdan sa katugbang nga paglihok sa tissue slice.b Representante nga porsyento sa pag-inat ug mga kurba sa rate sa pag-inat alang sa kasagarang gi-inat (orange) ug sobra nga pag-inat (asul) nga mga seksyon sa tisyu.c Bar graph nga nagpakita sa cycle time (n = 19 slices kada grupo, gikan sa lain-laing mga baboy), contraction time (n = 18-19 slices kada grupo, gikan sa lain-laing mga baboy), relaxation time (n = 19 slices kada grupo, gikan sa lain-laing mga baboy) ), amplitude sa tissue movement (n = 14 slices/group, gikan sa lain-laing baboy), peak slices/grupo 1, peak slices/grupo 1, peak systolic rate 1 n = 14 (D0), 15 (D6) ) nga mga seksyon / grupo) gikan sa lainlaing mga baboy), ang t-test sa duha ka ikog nga Estudyante nagpakita nga walay mahinungdanong kalainan sa bisan unsang parameter, nga nagpakita nga kini nga mga parameter nagpabilin nga makanunayon sa panahon sa 6 nga mga adlaw sa kultura nga adunay overvoltage.Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
usa ka Bar graph quantification sa konsentrasyon sa NT-ProBNP sa media sa kultura gikan sa mga hiwa sa kasingkasing nga gi-culture ubos sa MT normal stretch (Norm) o overstretching (OS) nga mga kondisyon (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ug D4 MTOS) mga hiwa/grupo gikan sa lainlaing mga baboy, Two-way ANOVA ang gihimo; **p <0.01 usa ka Bar graph quantification sa konsentrasyon sa NT-ProBNP sa media sa kultura gikan sa mga hiwa sa kasingkasing nga gi-culture ubos sa MT normal stretch (Norm) o overstretching (OS) nga mga kondisyon (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ug D4 MTOS) nga mga hiwa/grupo gikan sa lainlaing mga baboy, Two-way ANOVA ang gihimo; **p <0.01Ang quantitative histogram sa konsentrasyon sa NT-ProBNP sa medium nga kultura gikan sa mga hiwa sa kasingkasing nga gi-culture ubos sa mga kondisyon sa normal nga MT stretch (norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ug D4) .MTOS) mga hiwa /grupo gikan sa lainlaing mga baboy, gihimo ang duha ka hinungdan nga pag-analisar sa kalainan;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 kumpara sa normal nga pag-inat). usa ka 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的2 Norm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正弛**与正伯一与与正帯 a Quantification sa konsentrasyon sa NT-ProBNP sa mga hiwa sa kasingkasing nga na-culture ubos sa MT normal stretch (Norm) o overstretch (OS) nga kondisyon (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) gikan sa lain-laing , p <0.01).histogram Pag-ihap sa mga konsentrasyon sa NT-ProBNP sa mga hiwa sa kasingkasing nga gi-kultura ubos sa mga kondisyon sa normal nga MT stretch (norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ug D4 MTOS) mga hiwa/grupo gikan sa lainlaing mga baboy, duha ka paagi nga pagtuki sa kalainan;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 kumpara sa normal nga pag-inat). b Representante nga mga hulagway alang sa mga hiwa sa kasingkasing nga namansahan sa troponin-T ug WGA (wala) ug cell size quantification (tuo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) nga mga selula/grupo gikan sa 10 ka lain-laing mga hiwa gikan sa lain-laing mga baboy, Two-tailed Student t-test gihimo; **** p <0.0001 kon itandi sa normal nga pag-inat). b Representante nga mga hulagway alang sa mga hiwa sa kasingkasing nga namansahan sa troponin-T ug WGA (wala) ug cell size quantification (tuo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) nga mga selula/grupo gikan sa 10 ka lain-laing mga hiwa gikan sa lain-laing mga baboy, Two-tailed Student t-test gihimo; ****p <0.0001 itandi sa normal nga pag-inat). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опредрак (слева) и количественного опредракор 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-крид **** ; сравнению с нормальным растяжением). b Representante nga mga hulagway sa mga seksyon sa kasingkasing nga namansahan sa troponin-T ug AZP (wala) ug cell size quantification (tuo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mga selula/grupo gikan sa 10 ka lain-laing mga seksyon gikan sa lain-laing mga baboy, two-tailed Student's t-test gihimo; **** p <0.001 kon itandi sa normal nga strain). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（小量化（右）染色的心脏切片的代表性（3图图自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与曉学生t 检验；与曉子0. ）. b Representante nga mga hulagway sa mga hiwa sa kasingkasing nga gimantsa sa calcarein-T ug WGA (wala) ug gidak-on sa selula (tuo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 gikan sa 10 ka lain-laing mga hiwa (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t test；0，0 pared test；0；0. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оцленная оцленка (сленка) 6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента , ****0p Стьюдента; льным растяжением). b Representante nga mga hulagway sa mga seksyon sa kasingkasing nga namansahan sa troponin-T ug AZP (wala) ug quantification sa cell size (tuo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) gikan sa 10 lain-laing mga seksyon gikan sa lain-laing mga baboy) Cells/grupo, two-tailed criterion Student's t;****p <0.0001 kumpara sa normal nga strain). c Representative images para sa day 0 ug day 6 MTOS heart slices immunolabeled for troponin-T and NFATC4 and quantification of the translocation of NFATC4 to the nuclei of CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices/group from different pigs, Two-tailed Student t-test ang gihimo; *p <0.05). c Representative images para sa day 0 ug day 6 MTOS heart slices immunolabeled for troponin-T and NFATC4 and quantification of the translocation of NFATC4 to the nuclei of CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices/group from different pigs , Two-tailed Student t-test gipahigayon; *p <0.00. c. FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двустонюнид двустонюнид * нестороней , выполняется двустонюд 5 * . c Representative images para sa heart sections sa 0 ug 6 days MTOS, immunolabeled para sa troponin-T ug NFATC4, ug quantification sa NFATC4 translocation sa nucleus sa cavernous cells (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices/group gikan sa lain-laing mga baboy) nagpahigayon og two-tailed Student's t-test;*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，中可一切于易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p) < 。 c Representative nga mga hulagway sa calcanin-T ug NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS heart slices, ug NFATC4 gikan sa lain-laing NFATC4 易位至CM cell nucleus的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 德生et 电影；*p < 0.05). c. FATC4 sa ядра CM gikan sa разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Representative images sa MTOS heart slices sa day 0 ug 6 para sa troponin-T ug NFATC4 immunolabeling ug quantification sa NFATC4 translocation sa nucleus sa CM gikan sa lain-laing baboy (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices/group, two-tailed t -criterion Student's; *p <0.05).Ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± standard deviation.
Ang panukiduki sa paghubad sa cardiovascular nanginahanglan mga modelo sa cellular nga tukma nga nagpadaghan sa palibot sa kasingkasing.Sa kini nga pagtuon, usa ka aparato sa CTCM ang gihimo ug gihulagway nga makapukaw sa mga ultrathin nga seksyon sa kasingkasing.Ang sistema sa CTCM naglakip sa physiologically synchronized nga electromechanical stimulation ug T3 ug Dex fluid enrichment.Kung ang mga seksyon sa kasingkasing sa baboy nahayag sa kini nga mga hinungdan, ang ilang kalagsik, integridad sa istruktura, kalihokan sa metaboliko, ug ekspresyon sa transkripsyon nagpabilin nga parehas sa presko nga tisyu sa kasingkasing pagkahuman sa 12 ka adlaw nga kultura.Dugang pa, ang sobra nga pag-inat sa tisyu sa kasingkasing mahimong hinungdan sa hypertrophy sa kasingkasing tungod sa hyperextension.Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsuporta sa kritikal nga papel sa mga kondisyon sa kultura sa pisyolohikal sa pagpadayon sa usa ka normal nga cardiac phenotype ug paghatag og plataporma alang sa drug screening.
Daghang mga hinungdan ang nakatampo sa paghimo sa usa ka kamalaumon nga palibot alang sa pag-obra ug pagkaluwas sa mga cardiomyocytes.Ang labing dayag niini nga mga hinungdan adunay kalabutan sa (1) intercellular nga mga interaksyon, (2) electromechanical stimulation, (3) humoral nga mga hinungdan, ug (4) metabolic substrates.Ang mga interaksyon sa pisyolohikal nga cell-to-cell nanginahanglan komplikado nga three-dimensional nga mga network sa daghang mga tipo sa cell nga gisuportahan sa usa ka extracellular matrix.Ang ingon nga komplikado nga mga interaksyon sa cellular lisud nga matukod pag-usab sa vitro pinaagi sa co-culture sa indibidwal nga mga tipo sa cell, apan dali nga makab-ot gamit ang organotypic nga kinaiya sa mga seksyon sa kasingkasing.
Ang mekanikal nga pag-inat ug elektrikal nga pagpadasig sa mga cardiomyocytes kritikal alang sa pagpadayon sa cardiac phenotype33,34,35.Samtang ang mekanikal nga stimulation kaylap nga gigamit alang sa hiPSC-CM conditioning ug maturation, daghang mga elegante nga pagtuon ang bag-o lang misulay sa mekanikal nga pagpukaw sa mga hiwa sa kasingkasing sa kultura gamit ang uniaxial loading.Gipakita sa kini nga mga pagtuon nga ang 2D uniaxial mechanical loading adunay positibo nga epekto sa phenotype sa kasingkasing sa panahon sa kultura.Sa kini nga mga pagtuon, ang mga seksyon sa kasingkasing mahimo’g puno sa isometric tensile forces17, linear auxotonic loading18, o ang siklo sa kasingkasing gimugna pag-usab gamit ang force transducer feedback ug tension drives.Bisan pa, kini nga mga pamaagi naggamit sa uniaxial tissue stretch nga wala’y pag-optimize sa kalikopan, nga nagresulta sa pagsumpo sa daghang mga gene sa kasingkasing o sobra nga pagpahayag sa mga gene nga may kalabotan sa dili normal nga mga tubag sa pag-inat.Ang CTCM nga gihulagway dinhi naghatag ug 3D electromechanical stimulus nga nagsundog sa natural nga cycle sa kasingkasing sa termino sa cycle time ug physiological stretch (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, ug 72 beats kada minuto).Bisan kung kini nga tulo-ka-dimensional nga mekanikal nga pagpadasig nga nag-inusara dili igo aron mapadayon ang integridad sa tisyu, ang usa ka kombinasyon sa humoral ug mekanikal nga pagpukaw gamit ang T3 / Dex gikinahanglan aron igong mapadayon ang pagkaayo sa tisyu, pag-obra, ug integridad.
Ang humoral nga mga hinungdan adunay importante nga papel sa pag-modulate sa adult heart phenotype.Gipasiugda kini sa mga pagtuon sa HiPS-CM diin ang T3 ug Dex gidugang sa media sa kultura aron mapadali ang pagkahinog sa selula.Mahimong impluwensyahan sa T3 ang pagdala sa mga amino acid, asukal ug calcium tabok sa mga lamad sa selula36.Dugang pa, ang T3 nagpasiugda sa MHC-α nga ekspresyon ug MHC-β nga downregulation, nga nagpasiugda sa pagporma sa paspas nga twitch myofibrils sa hamtong nga cardiomyocytes kumpara sa hinay nga twitch myofibrils sa fetal CM.Ang kakulangan sa T3 sa mga pasyente nga hypothyroid moresulta sa pagkawala sa myofibrillar bands ug pagkunhod sa rate sa paglambo sa tono37.Ang Dex naglihok sa mga glucocorticoid receptor ug gipakita nga nagdugang sa myocardial contractility sa nahilit nga perfused nga mga kasingkasing;38 kini nga kalamboan gituohan nga may kalabutan sa epekto sa calcium deposit-driven entry (SOCE) 39,40.Dugang pa, ang Dex nagbugkos sa mga receptor niini, hinungdan sa usa ka halapad nga tubag sa intracellular nga nagpugong sa immune function ug panghubag30.
Gipakita sa among mga resulta nga ang physical mechanical stimulation (MS) nagpauswag sa kinatibuk-ang pasundayag sa kultura kumpara sa Ctrl, apan napakyas sa pagpadayon sa viability, structural integrity, ug cardiac expression sa 12 nga mga adlaw sa kultura.Kung itandi sa Ctrl, ang pagdugang sa T3 ug Dex sa mga kultura sa CTCM (MT) nagpauswag sa kalagsik ug nagpadayon sa parehas nga mga profile sa transkripsyon, integridad sa istruktura, ug kalihokan sa metaboliko nga adunay presko nga tisyu sa kasingkasing sa 12 nga mga adlaw.Dugang pa, pinaagi sa pagpugong sa lebel sa pag-inat sa tisyu, ang usa ka hyperextension-induced cardiac hypertrophy nga modelo gihimo gamit ang STCM, nga naghulagway sa versatility sa STCM system.Angay nga hinumdoman nga bisan kung ang pagbag-o sa kasingkasing ug fibrosis kasagarang naglangkit sa mga intact nga organo kansang mga sirkulasyon nga mga selula makahatag sa angay nga mga cytokine ingon man ang phagocytosis ug uban pang mga hinungdan sa pagbag-o, ang mga seksyon sa kasingkasing mahimo gihapon nga magsundog sa fibrotic nga proseso agig tubag sa stress ug trauma.ngadto sa myofibroblasts.Kini kaniadto gi-evaluate sa niini nga cardiac slice model.Kinahanglan nga matikdan nga ang mga parameter sa CTCM mahimong modulated pinaagi sa pagbag-o sa pressure/electrical amplitude ug frequency aron masundog ang daghang mga kondisyon sama sa tachycardia, bradycardia, ug mekanikal nga suporta sa sirkulasyon (mechanical unloaded nga kasingkasing).Kini naghimo sa sistema nga usa ka medium throughput alang sa drug testing.Ang katakus sa CTCM sa pag-modelo sa sobra nga pagpaningkamot-induced cardiac hypertrophy naghatag sa dalan alang sa pagsulay niini nga sistema alang sa personal nga terapiya.Sa konklusyon, ang karon nga pagtuon nagpakita nga ang mekanikal nga pag-inat ug humoral stimulation hinungdanon alang sa pagpadayon sa kultura sa mga seksyon sa tisyu sa kasingkasing.
Bisan kung ang datos nga gipresentar dinhi nagsugyot nga ang CTCM usa ka maayo kaayo nga plataporma alang sa pagmodelo sa wala’y sulod nga myocardium, kini nga pamaagi sa kultura adunay pipila nga mga limitasyon.Ang nag-unang limitasyon sa kultura sa CTCM mao nga kini nagpahamtang sa padayon nga dinamikong mekanikal nga kapit-os sa mga hiwa, nga nagpugong sa abilidad sa aktibong pag-monitor sa mga contraction sa kasingkasing sa matag siklo.Dugang pa, tungod sa gamay nga gidak-on sa mga seksyon sa kasingkasing (7 mm), limitado ang abilidad sa pagtimbang-timbang sa systolic function sa gawas sa mga sistema sa kultura gamit ang tradisyonal nga force sensors.Sa kasamtangan nga manuskrito, partially nabuntog namo kini nga limitasyon pinaagi sa pagtimbang-timbang sa optical boltahe isip timailhan sa contractile function.Bisan pa, kini nga limitasyon magkinahanglan ug dugang nga trabaho ug mahimong matubag sa umaabot pinaagi sa pagpaila sa mga pamaagi alang sa optical nga pag-monitor sa function sa mga hiwa sa kasingkasing sa kultura, sama sa optical mapping gamit ang calcium ug boltahe nga sensitibo nga mga tina.Ang laing limitasyon sa CTCM mao nga ang working model wala magmaniobra sa physiological stress (preload ug afterload).Sa CTCM, ang presyur naaghat sa magkaatbang nga direksyon aron mabag-o ang 25% nga physiological stretch sa diastole (full stretch) ug systole (gitas-on sa contraction atol sa electrical stimulation) sa dagkong mga tisyu.Kini nga limitasyon kinahanglang tangtangon sa umaabot nga mga disenyo sa CTCM pinaagi sa igong pressure sa cardiac tissue gikan sa duha ka kilid ug pinaagi sa paggamit sa eksaktong pressure-volume nga mga relasyon nga mahitabo sa mga lawak sa kasingkasing.
Ang overstretch-induced remodeling nga gitaho niini nga manuskrito limitado sa pagsundog sa hypertrophic hyperstretch signal.Busa, kini nga modelo makatabang sa pagtuon sa hypertrophic signaling nga gipahinabo sa pag-inat nga wala kinahanglana ang humoral o neural nga mga hinungdan (nga wala niini nga sistema).Ang dugang nga mga pagtuon gikinahanglan aron madugangan ang multiplicity sa CTCM, pananglitan, co-culturing sa immune cells, circulating plasma humoral factor, ug innervation kung ang co-culturing sa neuronal cells makapauswag sa mga posibilidad sa pagmodelo sa sakit sa CTCM.
Napulog tulo ka baboy ang gigamit niini nga pagtuon.Ang tanan nga mga pamaagi sa hayop gihimo subay sa mga panudlo sa institusyon ug gi-aprubahan sa University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee.Ang aortic arch gi-clamp ug ang kasingkasing gipahumotan sa 1 L nga sterile cardioplegia (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH hangtod sa 7.4); ang mga kasingkasing gipreserbar sa ice-cold cardioplegic solution hangtod madala sa lab sa yelo nga kasagaran <10 min. ang mga kasingkasing gipreserbar sa ice-cold cardioplegic solution hangtod madala sa lab sa yelo nga kasagaran <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10нимает. Ang mga kasingkasing gitipigan sa ice-cold cardioplegic solution hangtod sa pagdala sa laboratoryo sa yelo, nga kasagarang mokabat og <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Ibutang ang mga kasingkasing sa ice cardioplegia hangtod madala sa laboratoryo sa yelo, kasagaran <10 min.
Ang CTCM device gihimo sa SolidWorks computer-aided design (CAD) software.Ang mga lawak sa kultura, mga divider ug mga lawak sa hangin gihimo sa CNC tin-aw nga acrylic nga plastik.Ang 7mm diameter nga back-up nga singsing gihimo sa high density nga polyethylene (HDPE) sa tunga ug adunay usa ka o-ring groove aron ma-accommodate ang silicone o-ring nga gigamit sa pag-seal sa media sa ilawom.Usa ka nipis nga silica membrane ang nagbulag sa lawak sa kultura gikan sa separation plate.Ang silicone membrane kay giputol sa laser gikan sa 0.02″ baga nga silicone sheet ug adunay kagahi nga 35A.Ang ubos ug ibabaw nga silicone gasket kay giputol sa laser gikan sa 1/16 ″ baga nga silicone sheet ug adunay katig-a nga 50A.Ang 316L nga stainless steel nga mga screw ug wing nuts gigamit alang sa pag-fasten sa block ug paghimo og airtight seal.
Ang usa ka dedikado nga printed circuit board (PCB) gidesinyo nga i-integrate sa C-PACE-EM system.Ang swiss machine connector sockets sa PCB konektado sa graphite electrodes pinaagi sa silver-plated copper wires ug bronze 0-60 screws nga gisud sa mga electrodes.Ang giimprinta nga circuit board gibutang sa hapin sa 3D printer.
Ang CTCM device gikontrolar sa usa ka programmable pneumatic actuator (PPD) nga nagmugna og kontroladong circulatory pressure susama sa usa ka cardiac cycle.Samtang ang presyur sa sulod sa air chamber nagdugang, ang flexible silicone membrane molapad pataas, nga nagpugos sa medium sa ilawom sa tissue site.Ang lugar sa tisyu unya ma-inat pinaagi sa pagpalagpot sa likido, nga gisundog ang pisyolohikal nga pagpalapad sa kasingkasing sa panahon sa diastole.Sa kinapungkayan sa pagpahayahay, ang electrical stimulation gipadapat pinaagi sa graphite electrodes, nga nagpamenos sa presyur sa air chamber ug nagpahinabo sa pagkupot sa mga seksyon sa tisyu.Sa sulod sa tubo adunay usa ka hemostatic valve nga adunay pressure sensor aron mahibal-an ang presyur sa sistema sa hangin.Ang pressure nga gibati sa pressure sensor gipadapat sa usa ka data collector nga konektado sa laptop.Gitugotan niini ang padayon nga pag-monitor sa presyur sa sulod sa gas chamber.Sa diha nga ang maximum chamber pressure naabot (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), ang data acquisition device gimandoan nga magpadala ug signal sa C-PACE-EM system aron makamugna ug biphasic voltage signal alang sa 2 ms, set sa 4 V.
Nakuha ang mga seksyon sa kasingkasing ug ang mga kondisyon sa kultura sa 6 ka atabay gihimo sama sa mosunod: Ibalhin ang naani nga mga kasingkasing gikan sa sudlanan sa pagbalhin ngadto sa tray nga adunay bugnaw (4° C.) cardioplegia.Ang wala nga ventricle gilain sa usa ka sterile blade ug giputol sa mga piraso sa 1-2 cm3.Kini nga mga bloke sa tisyu gilakip sa mga suporta sa tisyu nga adunay tissue adhesive ug gibutang sa usa ka vibrating microtome tissue bath nga adunay sulud nga Tyrode's solution ug padayon nga oxygenated (3 g / L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 6 mM KCl (0.447 m. PES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M nga solusyon), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M nga solusyon), hangtod sa 1 L ddH2O).Ang vibrating microtome gitakda nga magputol sa 300 µm nga baga nga mga hiwa sa frequency nga 80 Hz, usa ka horizontal vibration amplitude nga 2 mm, ug usa ka advance rate nga 0.03 mm/s.Ang kaligoanan sa tisyu gilibotan sa yelo aron magpabilin nga bugnaw ang solusyon ug ang temperatura gipadayon sa 4 ° C.Ibalhin ang mga seksyon sa tisyu gikan sa microtome bath ngadto sa incubation bath nga adunay padayon nga oxygenated nga solusyon sa Tyrode sa yelo hangtod makuha ang igo nga mga seksyon alang sa usa ka plato sa kultura.Alang sa transwell nga mga kultura, ang mga seksyon sa tisyu gilakip sa sterile nga 6 mm nga lapad nga polyurethane nga suporta ug gibutang sa 6 ml nga optimized medium (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline ug 2X antibiotic-antifungal ).Ang electric stimulation (10 V, frequency 1.2 Hz) gipadapat sa mga seksyon sa tisyu pinaagi sa C-Pace.Alang sa mga kondisyon sa TD, ang presko nga T3 ug Dex gidugang sa 100 nM ug 1 μM sa matag pagbag-o sa medium.Ang medium saturated sa oxygen sa wala pa ilisan 3 beses sa usa ka adlaw.Ang mga seksyon sa tisyu gi-culture sa usa ka incubator sa 37 ° C ug 5% CO2.
Para sa mga kultura sa CTCM, ang mga seksyon sa tisyu gibutang sa usa ka custom-made 3D printer sa usa ka Petri dish nga adunay giusab nga solusyon sa Tyrode.Gidisenyo ang aparato aron madugangan ang gidak-on sa hiwa sa kasingkasing sa 25% sa lugar sa singsing sa suporta.Gihimo kini aron ang mga seksyon sa kasingkasing dili mag-inat human mabalhin gikan sa solusyon sa Tyrode ngadto sa medium ug sa panahon sa diastole.Gamit ang histoacrylic glue, ang mga seksyon nga 300 µm gibag-on sa usa ka support ring nga 7 mm ang diyametro.Human itaod ang mga seksyon sa tisyu ngadto sa singsing sa suporta, putla ang sobra nga mga seksyon sa tisyu ug ibalik ang gilakip nga mga seksyon sa tisyu ngadto sa kaligoanan sa Tyrode solution sa yelo (4°C) hangtud nga maandam na ang igo nga mga seksyon alang sa usa ka device.Ang kinatibuk-ang oras sa pagproseso alang sa tanan nga mga aparato kinahanglan dili molapas sa 2 ka oras.Pagkahuman sa 6 nga mga seksyon sa tisyu nga gilakip sa ilang mga singsing sa suporta, ang aparato sa CTCM gitigum.Ang lawak sa kultura sa CTCM napuno na sa 21 ml nga pre-oxygenated medium.Ibalhin ang mga seksyon sa tisyu ngadto sa lawak sa kultura ug kuhaa pag-ayo ang bisan unsang mga bula sa hangin gamit ang pipette.Ang seksyon sa tisyu dayon gigiyahan ngadto sa lungag ug hinayhinay nga gipugos sa lugar.Sa katapusan, ibutang ang electrode cap sa device ug ibalhin ang device ngadto sa incubator.Dayon ikonektar ang CTCM sa air tube ug ang C-PACE-EM system.Ang pneumatic actuator moabli ug ang air valve moabli sa CTCM.Ang C-PACE-EM nga sistema gi-configure aron maghatag 4 V sa 1.2 Hz sa panahon sa biphasic pacing alang sa 2 ms.Ang medium giusab kaduha sa usa ka adlaw ug ang mga electrodes giusab kausa sa usa ka adlaw aron malikayan ang pagtipon sa graphite sa mga electrodes.Kung gikinahanglan, ang mga seksyon sa tisyu mahimong makuha gikan sa ilang mga atabay sa kultura aron mapahawa ang bisan unsang mga bula sa hangin nga nahulog sa ilawom niini.Alang sa kondisyon sa pagtambal sa MT, ang T3 / Dex gidugang nga presko sa matag pagbag-o sa medium nga adunay 100 nM T3 ug 1 μM Dex.Ang mga CTCM device gi-culture sa usa ka incubator sa 37°C ug 5% CO2.
Aron makuha ang mga tul-id nga agianan sa mga hiwa sa kasingkasing, usa ka espesyal nga sistema sa kamera ang gihimo.Usa ka SLR camera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) gigamit sa usa ka Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lens (Navitar, San Francisco, CA).Ang pagtan-aw gihimo sa temperatura sa kwarto pagkahuman sa pag-ilis sa medium sa presko nga medium.Ang camera gipahimutang sa 51° nga anggulo ug ang video girekord sa 30 ka mga frame kada segundo.Una, ang open source software (MUSCLEMOTION43) gigamit sa Image-J aron masukod ang lihok sa mga hiwa sa kasingkasing.Ang maskara gimugna gamit ang MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) aron ipasabut ang mga rehiyon nga interesado sa pagpitik sa mga hiwa sa kasingkasing aron malikayan ang kasaba.Ang mga maskara nga gibahin sa mano-mano gigamit sa tanan nga mga imahe sa usa ka han-ay sa frame ug dayon ipasa sa plug-in sa MUSCLEMOTION.Ang Muscle Motion naggamit sa kasagaran nga intensity sa mga pixel sa matag frame aron ma-quantify ang paglihok niini kalabot sa reference frame.Ang mga datos girekord, gisala ug gigamit sa pag-ihap sa cycle sa panahon ug pag-assess sa tissue stretch atol sa cardiac cycle.Ang narekord nga video gi-post-processed gamit ang first-order zero-phase digital filter.Aron ma-quantify ang tissue stretch (peak-to-peak), ang peak-to-peak analysis gihimo aron mailhan ang mga peak ug troughs sa natala nga signal.Dugang pa, ang detrending gihimo gamit ang 6th order polynomial aron mawagtang ang signal drift.Ang program code gimugna sa MATLAB aron mahibal-an ang global tissue motion, cycle time, relaxation time, ug contraction time (Supplementary Program Code 44).
Para sa strain analysis, gamit ang parehas nga mga video nga gihimo para sa mechanical stretch assessment, una namong gisubay ang duha ka hulagway nga nagrepresentar sa motion peaks (ang pinakataas (ibabaw) ug pinakaubos (lower) nga mga punto sa paglihok) sumala sa MUSCLEMOTION software.Dayon among gibahin ang mga rehiyon sa tisyu ug gipadapat ang usa ka porma sa shading algorithm sa gibahin nga tisyu (Supplementary Fig. 2a).Ang gibahin nga tisyu dayon gibahin ngadto sa napulo ka subsurfaces, ug ang stress sa matag nawong gikalkulo gamit ang mosunod nga equation: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, diin ang Sup ug Sdown mao ang mga gilay-on sa porma gikan sa ibabaw ug ubos nga mga anino sa panapton, matag usa (Supplementary Fig. 2b).
Ang mga seksyon sa kasingkasing gitakda sa 4% paraformaldehyde sulod sa 48 ka oras.Ang naayos nga mga tisyu gi-dehydrate sa 10% ug 20% ​​nga sucrose sulod sa 1 ka oras, dayon sa 30% nga sucrose sa tibuok gabii.Dayon ang mga seksyon gisulod sa labing maayo nga cutting temperature compound (OCT compound) ug hinayhinay nga nagyelo sa isopentane/dry ice bath.Tipigi ang OCT embedding blocks sa -80 °C hangtod mabulag.Ang mga slide giandam isip mga seksyon nga adunay gibag-on nga 8 μm.
Aron makuha ang OCT gikan sa mga seksyon sa kasingkasing, ipainit ang mga slide sa usa ka heating block sa 95 °C sulod sa 5 min.Idugang ang 1 ml PBS sa matag slide ug i-incubate sulod sa 30 ka minuto sa temperatura sa lawak, dayon ituslob ang mga seksyon pinaagi sa pagbutang sa 0.1% Triton-X sa PBS sulod sa 15 minutos sa temperatura sa lawak.Aron mapugngan ang dili piho nga mga antibodies gikan sa pagbugkos sa sample, idugang ang 1 ml nga 3% nga BSA nga solusyon sa mga slide ug paglumlum sa 1 ka oras sa temperatura sa kwarto.Gikuha dayon ang BSA ug gihugasan ang mga slide gamit ang PBS.Markahi ang matag sample gamit ang lapis.Panguna nga mga antibodies (natunaw nga 1:200 sa 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ug troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) gidugang sa 90 minuto, dayon gidugang ang mga sekundaryong antibodies sa 1Alexa (%208) (%2000) Thermo Scientific; #A16079), batok sa rabbit Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) alang sa dugang nga 90 ka minuto Gihugasan 3 ka beses gamit ang PBS Aron mailhan ang target nga pagmantsa gikan sa background, gigamit ra namon ang sekondaryang antibody ingon usa ka kontrol. Sa katapusan, ang DAPI nukleyar nga mantsa gidugang ug ang mga slide nga nabutang sa usa ka vector shield. magnification) ug Keyence microscope nga adunay 40x nga pagpadako.
Ang WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) sa 5 μg / ml sa PBS gigamit alang sa pag-stain sa WGA ug gipadapat sa mga fixed nga seksyon sulod sa 30 minutos sa temperatura sa lawak.Ang mga slide dayon gihugasan sa PBS ug ang itom nga Sudan gidugang sa matag slide ug gilumlom sa 30 minuto.Ang mga slide dayon gihugasan gamit ang PBS ug ang vectashield embedding medium gidugang.Ang mga slide gitan-aw sa usa ka Keyence microscope sa 40x nga pagpadako.
Ang OCT gikuha gikan sa mga sample sama sa gihulagway sa ibabaw.Human makuha ang OCT, ituslob ang mga slide sa solusyon ni Bouin sa tibuok gabii.Ang mga slide dayon gihugasan sa distilled water sulod sa 1 ka oras ug dayon gibutang sa usa ka Bibrich aloe acid fuchsin solution sulod sa 10 ka minuto.Dayon ang mga slide gihugasan sa distilled water ug gibutang sa usa ka solusyon sa 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid sulod sa 10 minutos.Kung walay paghugas, ibalhin ang mga slide direkta ngadto sa aniline blue nga solusyon sulod sa 15 minutos.Dayon ang mga slide gihugasan sa distilled water ug gibutang sa usa ka 1% nga acetic acid nga solusyon sulod sa 2 ka minuto.Ang mga slide gipauga sa 200 N ethanol ug gibalhin sa xylene.Ang mga stained slide gitan-aw gamit ang Keyence microscope nga adunay 10x nga tumong.Ang porsyento sa lugar sa fibrosis gi-quantified gamit ang Keyence Analyzer software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numero sa katalogo V13154, sumala sa protocol sa tiggama nga adunay pipila nga mga pagbag-o.Sa partikular, usa ka surgical punch nga adunay diyametro nga 6 mm ang gigamit aron masiguro ang uniporme nga gidak-on sa tisyu sa panahon sa pag-analisar sa MTT.Ang mga tissue tagsa-tagsa nga gibutang sa mga atabay sa usa ka 12-well plate nga adunay MTT substrate sumala sa protocol sa tiggama.Ang mga seksyon gilumlom sa 37 ° C. sulod sa 3 ka oras ug ang buhi nga tisyu nag-metabolize sa MTT substrate aron mahimong usa ka purpura nga formazan compound.Ilisan ang MTT solution og 1 ml DMSO ug i-incubate sa 37 °C sulod sa 15 minutos aron makuha ang purpura nga formazan gikan sa mga seksyon sa kasingkasing.Ang mga sample lasaw 1:10 sa DMSO sa 96-well clear bottom plates ug purple color intensity nga gisukod sa 570 nm gamit ang Cytation plate reader (BioTek).Ang mga pagbasa gi-normalize sa gibug-aton sa matag hiwa sa kasingkasing.
Ang media slice sa kasingkasing gipulihan sa media nga adunay sulod nga 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) alang sa glucose utilization assay sama sa gihulagway kaniadto.Human sa 4 ka oras nga paglumlum, idugang ang 100 µl nga medium sa usa ka bukas nga microcentrifuge tube nga adunay sulod nga 100 µl nga 0.2 N HCl.Dayon ang tubo gibutang sa usa ka scintillation tube nga adunay 500 μl nga dH2O aron moalisngaw [3H]2O sulod sa 72 ka oras sa 37°C.Dayon kuhaa ang microcentrifuge tube gikan sa scintillation tube ug idugang ang 10 ml nga scintillation fluid.Ang mga ihap sa scintillation gihimo gamit ang Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Gikalkulo dayon ang paggamit sa glucose nga gikonsiderar ang piho nga kalihokan sa [5-3H]-glucose, dili kompleto nga balanse ug background, pagtunaw sa [5-3H]-ngadto sa wala’y label nga glucose, ug pagkaepektibo sa scintillation counter.Ang datos na-normalize sa masa sa mga seksyon sa kasingkasing.
Pagkahuman sa homogenization sa tisyu sa Trizol, ang RNA gilain gikan sa mga seksyon sa kasingkasing gamit ang Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 sumala sa protocol sa tiggama.Ang pag-andam sa librarya sa RNAsec, pagkasunud-sunod ug pagtuki sa datos gihimo sama sa mosunod:
Ang 1 μg sa RNA kada sample gigamit isip sugod nga materyal alang sa pag-andam sa RNA library.Ang sequencing nga mga librarya gihimo gamit ang NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit para sa Illumina (NEB, USA) subay sa mga rekomendasyon sa tiggama, ug ang mga index code gidugang sa mga sequence sa attribute alang sa matag sample.Sa mubo, ang mRNA giputli gikan sa kinatibuk-ang RNA gamit ang magnetic beads nga gilakip sa poly-T oligonucleotides.Ang fragmentation gihimo gamit ang divalent cations sa taas nga temperatura sa NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Ang unang strand nga cDNA gi-synthesize gamit ang random hexamer primers ug M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).Ang ikaduha nga strand nga cDNA gi-synthesize gamit ang DNA polymerase I ug RNase H. Ang nahabilin nga mga overhang nakabig ngadto sa blunt nga mga tumoy pinaagi sa exonuclease/polymerase nga kalihokan.Pagkahuman sa adenylation sa 3′ nga tumoy sa tipik sa DNA, usa ka NEBNext Adapter nga adunay istruktura sa hairpin loop ang gilakip niini aron maandam kini alang sa hybridization.Alang sa pagpili sa mga tipik sa cDNA sa gipalabi nga gitas-on 150-200 bp.Ang mga tipik sa librarya giputli gamit ang AMPure XP system (Beckman Coulter, Beverly, USA).Dayon, ang 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) nga adunay gipili nga gidak-on nga cDNA nga gi-ligated sa usa ka adapter gigamit sulod sa 15 minutos sa 37 ° C ug dayon sulod sa 5 minutos sa 95 ° C sa wala pa ang PCR.Gihimo dayon ang PCR gamit ang Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, ug Index (X) primers.Sa katapusan, ang mga produkto sa PCR giputli (AMPure XP system) ug ang kalidad sa librarya gisusi sa usa ka Agilent Bioanalyzer 2100 system.Ang librarya sa cDNA gisunod dayon gamit ang Novaseq sequencer.Ang mga hilaw nga file sa imahe gikan sa Illumina gi-convert sa hilaw nga pagbasa gamit ang CASAVA Base Calling.Ang hilaw nga datos gitipigan sa FASTQ(fq) format nga mga file nga adunay mga read sequence ug katugbang nga base nga mga kalidad.Pilia ang HISAT2 aron ipares ang nasala nga pagkasunodsunod nga pagbasa sa Sscrofa11.1 reference genome.Sa kinatibuk-an, gisuportahan sa HISAT2 ang mga genome sa bisan unsang gidak-on, lakip ang mga genome nga mas dako pa sa 4 bilyon nga base, ug ang mga default nga kantidad gitakda alang sa kadaghanan nga mga parameter.Ang pagsumpay sa mga pagbasa gikan sa datos sa RNA Seq mahimong epektibong i-align gamit ang HISAT2, ang pinakapaspas nga sistema nga anaa karon, nga adunay pareho o mas maayo nga katukma kay sa bisan unsang paagi.
Ang kadagaya sa mga transcript direkta nga nagpakita sa lebel sa ekspresyon sa gene.Ang lebel sa ekspresyon sa gene gisusi pinaagi sa kadagaya sa mga transcript (sequencing count) nga nalangkit sa genome o exon.Ang gidaghanon sa mga pagbasa kay proporsyonal sa lebel sa ekspresyon sa gene, gitas-on sa gene, ug giladmon sa pagkasunodsunod.Ang FPKM (mga tipik kada libong base nga pares sa transcript nga gisunod-sunod kada milyon nga base pairs) gikalkulo ug ang P-values ​​​​sa differential expression gitino gamit ang DESeq2 package.Dayon among gikalkulo ang false discovery rate (FDR) alang sa matag P value gamit ang Benjamini-Hochberg method9 base sa built-in R-function nga "p.adjust".
Ang RNA nga nahimulag gikan sa mga seksyon sa kasingkasing nakabig ngadto sa cDNA sa konsentrasyon nga 200 ng/μl gamit ang SuperScript IV Vilo Master mix gikan sa Thermo (Thermo, cat. no. 11756050).Ang quantitative RT-PCR gihimo gamit ang Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) ug microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971).Ang reaction mixture naglangkob sa 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer ug 3.5 µl H2O nga gisagol kada atabay.Ang standard nga mga siklo sa qPCR gipadagan ug ang mga kantidad sa CT gisukod gamit ang usa ka Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time nga instrumento sa PCR (384-well module; produkto # A28135).Ang mga primer sa Taqman gipalit gikan sa Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss0690_m1) ), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)
Ang pagpagawas sa media sa NT-ProBNP gisusi gamit ang NT-ProBNP kit (baboy) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) sumala sa protocol sa tiggama.Sa makadiyot, 250 µl sa matag sample ug standard ang gidugang nga doble sa matag atabay.Diha-diha dayon human sa pagdugang sa sample, idugang ang 50 µl sa Assay Reagent A sa matag atabay.Hinay-hinay nga i-uyog ang plato ug i-seal gamit ang sealant.Dayon ang mga papan gilumlom sa 37 ° C sulod sa 1 ka oras.Unya aspirate ang solusyon ug hugasan ang mga atabay 4 ka beses gamit ang 350 µl sa 1X nga solusyon sa paghugas, paglumlom sa solusyon sa paghugas sulod sa 1-2 ka minuto matag higayon.Dayon idugang ang 100 µl sa Assay Reagent B kada atabay ug selyohan sa plate sealant.Ang papan hinayhinay nga giuyog ug gilumlom sa 37 ° C sa 30 minuto.Aspirate ang solusyon ug hugasan ang atabay 5 ka beses gamit ang 350 µl sa 1X wash solution.Idugang ang 90 µl nga solusyon sa substrate sa matag atabay ug isira ang plato.Paglumlum sa plato sa 37 ° C sulod sa 10-20 ka minuto.Idugang ang 50 µl Stop Solution sa matag atabay.Gisukod dayon ang plato gamit ang Cytation (BioTek) plate reader nga gitakda sa 450 nm.
Gihimo ang mga pag-analisa sa gahum aron mapili ang mga gidak-on sa grupo nga maghatag> 80% nga gahum aron mahibal-an ang usa ka 10% nga hingpit nga pagbag-o sa parameter nga adunay 5% Type I error rate. Gihimo ang mga pag-analisa sa gahum aron mapili ang mga gidak-on sa grupo nga maghatag> 80% nga gahum aron mahibal-an ang usa ka 10% nga hingpit nga pagbag-o sa parameter nga adunay 5% Type I error rate. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения для обнаружения 10% раметра с 5% частотой ошибок типа I. Ang pag-analisa sa gahum gihimo aron mapili ang mga gidak-on sa grupo nga maghatag> 80% nga gahum aron mahibal-an ang 10% nga pagbag-o sa hingpit nga parameter nga adunay 5% nga rate sa sayup sa Type I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％I型用。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％I型用。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаругожленибность я параметров и 5% частоты ошибок типа I. Gihimo ang usa ka pagtuki sa gahum aron makapili usa ka gidak-on sa grupo nga maghatag> 80% nga gahum aron mahibal-an ang 10% nga pagbag-o sa hingpit nga parameter ug 5% nga rate sa sayup nga tipo I.Ang mga seksyon sa tisyu gipili nga random sa wala pa ang eksperimento.Ang tanan nga pag-analisar kay buta sa kondisyon ug ang mga sampol gi-decode lamang human masusi ang tanang datos.Ang GraphPad Prism software (San Diego, CA) gigamit sa paghimo sa tanang statistical analysis. Alang sa tanan nga estadistika, ang mga p-value giisip nga hinungdanon sa mga kantidad <0.05. Alang sa tanan nga estadistika, ang p-values ​​​​gikonsiderar nga hinungdanon sa mga kantidad <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Alang sa tanan nga estadistika, ang p-values ​​​​gikonsiderar nga hinungdanon sa mga kantidad <0.05.对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Alang sa tanan nga estadistika, ang p-values ​​​​gikonsiderar nga hinungdanon sa mga kantidad <0.05.Ang two-tailed Student's t-test gihimo sa datos nga adunay 2 ra nga pagtandi.Ang one-way o two-way ANOVA gigamit aron mahibal-an ang kamahinungdanon tali sa daghang mga grupo.Kung nagpahigayon mga post hoc nga pagsulay, ang pagtul-id ni Tukey gipadapat sa pag-asoy sa daghang mga pagtandi.Ang datos sa RNAsec adunay espesyal nga istatistikal nga konsiderasyon sa pagkalkula sa FDR ug p.adjust sama sa gihulagway sa seksyon sa Mga Pamaagi.
Alang sa dugang nga kasayuran sa disenyo sa pagtuon, tan-awa ang abstract sa Nature Research Report nga nalambigit niini nga artikulo.