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A morfogenesi intestinale umana stabilisce e caratteristiche cripta-villose di a microarchitettura epiteliale 3D è di l'urganizazione spaziale. Questa struttura unica hè necessaria per mantene l'omeostasi intestinale pruteggendu a nicchia di e cellule staminali in a cripta basale da l'antigeni microbici esogeni è i so metaboliti. Inoltre, i villi intestinali è u mucus secretore presentanu cellule epiteliali funzionalmente differenziate cù una barriera protettiva nantu à a superficia di a mucosa intestinale. Dunque, a ricreazione di strutture epiteliali 3D hè cruciale per a custruzione di mudelli intestinali in vitro. In particulare, u gut-on-a-chip mimeticu organicu pò induce a morfogenesi 3D spontanea di l'epiteliu intestinale cù funzioni fisiologiche è biomeccanica migliorate. Quì, furnimu un protocolu riproducibile per induce robustamente a morfogenesi intestinale in l'intestinu nantu à un chip microfluidicu è ancu in un chip ibridu integratu Transwell. Descrivemu metudi dettagliati per a fabricazione di dispositivi, a cultura di cellule epiteliali organoidi Caco-2 o intestinali in ambienti convenzionali è ancu nantu à una piattaforma microfluidica, l'induzione di a morfogenesi 3D è a caratterizazione di epiteli 3D stabiliti. Utilizendu parechje modalità d'imaghjini. Stu protocolu permette a rigenerazione di a microarchitettura intestinale funzionale cuntrullendu u flussu di fluidu basolaterale per 5 ghjorni. U nostru metudu di morfogenesi in vitro impiega stress di taglio fisiologicamente pertinenti è muvimentu meccanicu è ùn richiede micca ingegneria cellulare cumplessa o manipulazione, chì pò superà altre tecniche esistenti. Imaginemu chì u nostru protocolu prupostu puderia avè ampie implicazioni per a cumunità di ricerca biomedica, furnendu un metudu per rigenerà strati epiteliali intestinali 3D in vitro per applicazioni biomediche, cliniche è farmaceutiche.
L'esperimenti dimustranu chì e cellule epiteliali intestinali Caco-2 cultivate in gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o dispositivi microfluidichi a doppio strato6,7 ponu subisce una morfogenesi 3D spontanea in vitro senza una chiara comprensione di u mecanismu sottostante. In u nostru studiu recente, avemu trovu chì a rimozione di antagonisti morfogeni secreti basolateralmente da i dispositivi di cultura hè necessaria è sufficiente per induce a morfogenesi epiteliale 3D in vitro, ciò chì hè statu dimustratu da Caco-2 è organoidi intestinali derivati ​​da i pazienti. E cellule epiteliali sò state validate. In questu studiu, ci simu cuncentrati specificamente nantu à a pruduzzione cellulare è a distribuzione di a cuncentrazione di un putente antagonista Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), in gut-on-a-chip è dispositivi microfluidichi mudificati chì cuntenenu inserti Transwell, chjamati "Hybrid Chip". Dimostremu chì l'aghjunta di antagonisti Wnt esogeni (cum'è DKK-1, repressore Wnt 1, proteina secreta frizzled-related 1, o Soggy-1) à l'intestinu on-chip inibisce a morfogenesi o interrompe u stratu epiteliale 3D prestrutturatu, suggerendu chì u stress antagonisticu durante a cultura hè rispunsevule di a morfogenesi intestinale in vitro. Dunque, un approcciu praticu per ottene una morfogenesi robusta à l'interfaccia epiteliale hè di rimuovere o mantene minimamente i livelli di antagonisti Wnt in u compartimentu basolaterale per mezu di un lavaggio attivu (per esempiu, in piattaforme gut-on-a-chip o hybrid-on-a-chip) o diffusione. Mezzi basolaterali (per esempiu, da inserti Transwell in grandi reservoir basolaterali in pozzi).
In questu protocolu, furnimu un metudu dettagliatu per a fabricazione di microdispositivi gut-on-a-chip è chip ibridi inseribili Transwell (passi 1-5) per cultivà cellule epiteliali intestinali nantu à membrane porose à basa di polidimetilsilossanu (PDMS) (passi 6A, 7A, 8, 9) o membrane di poliestere di inserti Transwell (passi 6B, 7B, 8, 9) è morfogenesi 3D indotta in vitro (passu 10). Avemu ancu identificatu caratteristiche cellulari è moleculari indicative di istogenesi specifica di tessuti è differenziazione cellulare dipendente da lignaggi applicendu modalità di imaging multiple (passi 11-24). Inducemu a morfogenesi utilizendu cellule epiteliali intestinali umane, cum'è Caco-2 o organoidi intestinali, in dui furmati di cultura cù dettagli tecnichi cumpresi a mudificazione superficiale di membrane porose, a creazione di monostrati 2D è a biochimica intestinale è a ripruduzzione di u microambiente biomeccanicu in vitro. Per induce a morfogenesi 3D da monostrati epiteliali 2D, avemu eliminatu antagonisti di morfogeni in entrambe e culture. si forma facendu scorrere u mezu in u compartimentu basolaterale di a cultura. Infine, furnimu una rapprisentazione di l'utilità di un stratu epiteliale 3D rigenerabile chì pò esse adupratu per mudellà a crescita epiteliale dipendente da u morfogenu, co-culture longitudinali ospite-microbioma, infezzione da patogeni, lesioni infiammatorie, disfunzione di barriera epiteliale è terapie basate nantu à i probiotici Esempiu. influenze.
U nostru protocolu pò esse utile à una larga gamma di scientifichi in a ricerca basica (per esempiu, biologia di a mucosa intestinale, biologia di e cellule staminali è biologia di u sviluppu) è applicata (per esempiu, test preclinichi di farmaci, modellisazione di e malatie, ingegneria tissutale è gastroenterologia) di grande impattu. Per via di a riproducibilità è a robustezza di u nostru protocolu per induce a morfogenesi 3D di l'epiteliu intestinale in vitro, prevedemu chì a nostra strategia tecnica pò esse diffusa à u publicu chì studia a dinamica di a segnalazione cellulare durante u sviluppu intestinale, a rigenerazione o l'omeostasi. Inoltre, u nostru protocolu hè utile per interrogà l'infezzione sottu à diversi agenti infettivi cum'è Norovirus 8, Sindrome Respiratoria Acuta Severa Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae. U publicu di a patologia è a patogenesi di e malatie hè ancu utile. L'usu di un sistema di microfisiologia intestinale in chip pò permette a co-cultura longitudinale 10 è a successiva valutazione di a difesa di l'ospite, e risposte immunitarie è a riparazione di ferite legate à i patogeni in u trattu gastrointestinale (GI) 11. Altri disordini GI assuciati à a sindrome di l'intestinu permeabile, a celiachia, a malatia di Crohn, a colite ulcerosa, a pouchite o a sindrome di l'intestinu irritabile ponu esse simulati quandu i strati epiteliali intestinali 3D sò preparati utilizendu i strati epiteliali intestinali 3D di u paziente, queste malatie includenu atrofia villosa, accorciamentu di e cripte, danni mucosali o barriera epiteliale alterata. Biopsia o organoidi intestinali derivati ​​da cellule staminali 12,13. Per mudellà megliu a più alta cumplessità di l'ambiente di a malatia, i lettori ponu cunsiderà l'aghjunghje di tipi di cellule pertinenti à a malatia, cum'è e cellule mononucleari di u sangue perifericu di u paziente (PBMC), à i mudelli chì cuntenenu microarchitetture 3D di villi-cripte intestinali. cellule immunitarie specifiche di i tessuti, 5.
Siccomu a microstruttura epiteliale 3D pò esse fissata è visualizata senza u prucessu di sezionamentu, i spettatori chì travaglianu nantu à a trascrittomica spaziale è l'imaghjini à alta risoluzione o super-risoluzione puderanu esse interessati à a nostra mappatura di a dinamica spatiotempurale di geni è proteine ​​​​​​nantu à nicchie epiteliali. Interessatu à a tecnulugia. Risposta à stimuli microbici o immunitari. Inoltre, a diafonia longitudinale ospite-microbioma 10, 14 chì coordina l'omeostasi intestinale pò esse stabilita in u stratu mucosale intestinale 3D cocultivendu varie spezie microbiche, cumunità microbiche o microbiota fecale, in particulare in u gut-on-a-chip. in a piattaforma. Questu approcciu hè particularmente attraente per u publicu chì studia l'immunologia mucosa, a gastroenterologia, u microbioma umanu, a culturomica è a microbiologia clinica chì cerca di cultivà microbiota intestinale prima micca cultivata in u laburatoriu. Se u nostru protocolu di morfogenesi in vitro pò esse adattatu à furmati di cultura scalabili, cum'è inserti multipozzetti in piastre à 24, 96 o 384 pozzetti chì riforniscenu continuamente i compartimenti basolaterali, u protocolu pò ancu esse diffusu à quelli chì sviluppanu piattaforme di screening o validazione farmaceutiche, biomediche o à altu rendimentu per l'industria alimentaria. Cum'è prova di principiu, avemu recentemente dimustratu a fattibilità di un sistema di morfogenesi multiplex à altu rendimentu scalabile à un furmatu di piastra à 24 pozzetti. Inoltre, sò stati cummercializati parechji prudutti organ-on-a-chip16,17,18. Dunque, a validazione di u nostru metudu di morfogenesi in vitro pò esse accelerata è potenzialmente aduttata da parechji laboratori di ricerca, industria o agenzie guvernamentali è regulatorie per capisce a riprogrammazione cellulare di a morfogenesi intestinale in vitro à u livellu trascrittomicu per testà droghe o bioterapeutiche L'assorbimentu è u trasportu di i candidati à i farmaci sò stati valutati aduprendu surrogati intestinali 3D o aduprendu mudelli organi-nant'à-chip persunalizati o cummerciali per valutà a riproducibilità di u prucessu di morfogenesi intestinale.
Un numeru limitatu di mudelli sperimentali pertinenti per l'omu sò stati utilizati per studià a morfogenesi epiteliale intestinale, principalmente per via di a mancanza di protokolli implementabili per induce a morfogenesi 3D in vitro. In fatti, gran parte di e cunniscenze attuali nantu à a morfogenesi intestinale sò basate nantu à studii animali (per esempiu, zebrafish20, topi21 o polli22). Tuttavia, sò intensivi in ​​termini di travagliu è di costi, ponu esse eticamente discutibili, è soprattuttu, ùn determinanu micca precisamente i prucessi di sviluppu umanu. Questi mudelli sò ancu assai limitati in a so capacità di esse testati in modu scalabile multi-via. Dunque, u nostru protokollu per rigenerà strutture tissutali 3D in vitro supera i mudelli animali in vivo è ancu altri mudelli tradiziunali di cultura cellulare statica 2D. Cum'è descrittu prima, l'usu di strutture epiteliali 3D ci hà permessu di esaminà a lucalizazione spaziale di e cellule differenziate in l'asse cripta-villu in risposta à vari stimuli mucosali o immunitari. I strati epiteliali 3D ponu furnisce un spaziu per studià cumu e cellule microbiche competenu per furmà nicchie spaziali è l'evoluzione ecologica in risposta à i fattori di l'ospite (per esempiu, strati di mucus interni versus esterni, secrezione di IgA è peptidi antimicrobici). Inoltre, a morfologia epiteliale 3D ci pò permette di capisce cumu a microbiota intestinale struttura e so cumunità è produce sinergisticamente metaboliti microbici (per esempiu, acidi grassi à catena corta) chì formanu l'urganizazione cellulare è e nicchie di e cellule staminali in e cripte basali. Queste caratteristiche ponu esse dimustrate solu quandu i strati epiteliali 3D sò stabiliti in vitro.
In più di u nostru metudu di creazione di strutture epiteliali intestinali 3D, ci sò parechji metudi in vitro. A cultura di organoidi intestinali hè una tecnica d'ingegneria tissutale d'avanguardia basata annantu à a cultura di cellule staminali intestinali in cundizioni morfogene specifiche23,24,25. Tuttavia, l'usu di mudelli di organoidi 3D per l'analisi di u trasportu o co-culture ospite-microbioma hè spessu difficiule perchè u lume intestinale hè chjusu in l'organoide è, dunque, l'introduzione di cumpunenti luminali cum'è cellule microbiche o antigeni esogeni hè limitata. L'accessu à i lumen organoidi pò esse migliuratu aduprendu un microiniettore,26,27 ma questu metudu hè invasivu è richiede assai travagliu è richiede cunniscenze specializate per esse realizatu. Inoltre, e culture tradiziunali di organoidi mantenute in scaffold di idrogel in cundizioni statiche ùn riflettenu micca accuratamente a biomeccanica attiva in vivo.
Altri approcci impiegati da parechji gruppi di ricerca utilizanu scaffold di idrogel 3D prestrutturati per imità a struttura epiteliale intestinale cultivendu cellule intestinali umane isolate nantu à a superficia di u gel. Fabbricate scaffold di idrogel utilizendu stampi stampati in 3D, microfresati o fabbricati litograficamente. Stu metudu mostra a disposizione autoorganizzata di cellule epiteliali isolate in vitro cù gradienti morfogeni fisiologicamente pertinenti, stabilendu una struttura epiteliale à altu rapportu d'aspettu è una diafonia stroma-epiteliale includendu cellule stromali in u scaffold. Tuttavia, a natura di i scaffold prestrutturati pò impedisce a visualizazione di u prucessu morfogeneticu spontaneu stessu. Questi mudelli ùn furniscenu ancu un flussu luminale o interstiziale dinamicu, mancendu u stress di taglio di fluidu chì e cellule intestinali anu bisognu per subisce a morfogenesi è acquistà una funzione fisiologica. Un altru studiu recente hà utilizatu scaffold di idrogel in una piattaforma microfluidica è hà modellatu strutture epiteliali intestinali utilizendu tecniche di incisione laser. L'organoidi intestinali di u topu seguitanu mudelli incisi per furmà strutture tubulari intestinali, è u flussu di fluidu intraluminale pò esse ricapitulatu utilizendu un modulu microfluidico. Tuttavia, questu mudellu nè ùn presenta prucessi morfogenetichi spontanei nè include movimenti meccanobiologichi intestinali. E tecniche di stampa 3D di u listessu gruppu sò state capace di creà tubi intestinali in miniatura cù prucessi morfogenetichi spontanei. Malgradu a fabbricazione cumplessa di diversi segmenti intestinali in u tubu, questu mudellu manca ancu di flussu di fluidu luminale è deformazione meccanica. Inoltre, l'operabilità di u mudellu pò esse limitata, soprattuttu dopu chì u prucessu di biostampa hè cumpletu, perturbendu e cundizioni sperimentali o l'interazzione cellula-cellula. Invece, u nostru protocolu prupostu furnisce una morfogenesi intestinale spontanea, una tensione di taglio fisiologicamente pertinente, una biomeccanica chì imita a motilità intestinale, l'accessibilità di compartimenti apicali è basolaterali indipendenti, è a ricreazione di microambienti biologichi cumplessi di modularità. Dunque, u nostru protocolu di morfogenesi 3D in vitro pò furnisce un approcciu cumplementare per superà e sfide di i metudi esistenti.
U nostru protocolu hè interamente focalizatu nantu à a morfogenesi epiteliale 3D, cù solu cellule epiteliali in cultura è senza altri tipi di cellule circundanti cum'è cellule mesenchimali, cellule endoteliali è cellule immunitarie. Cum'è descrittu prima, u core di u nostru protocolu hè l'induzione di a morfogenesi epiteliale eliminendu l'inibitori di morfogeni secreti da u latu basolaterale di u mezu introduttu. Mentre a robusta modularità di u nostru gut-on-a-chip è hybrid-on-a-chip ci permette di ricreà u stratu epiteliale 3D ondulante, cumplessità biologiche supplementari cum'è l'interazioni epiteliale-mesenchimali33,34, a deposizione di Matrice extracellulare (ECM)35 è, in u nostru mudellu, e caratteristiche cripta-villo chì trasmettenu nicchie di cellule staminali in cripte basali restanu da cunsiderà ulteriormente. E cellule stromali (per esempiu, fibroblasti) in u mesenchima ghjocanu un rolu chjave in a produzzione di proteine ​​ECM è a regulazione di a morfogenesi intestinale in vivo35,37,38. L'aggiunta di cellule mesenchimali à u nostru mudellu hà miglioratu u prucessu morfogeneticu. è l'efficienza di l'attaccamentu cellulare. U stratu endoteliale (vale à dì, capillari o linfatici) ghjoca un rolu impurtante in a regulazione di u trasportu moleculare39 è u recrutamentu di cellule immunitarie40 in u microambiente intestinale. Inoltre, i cumpunenti di a vasculatura chì ponu esse cunnessi trà i mudelli di tessuti sò un prerequisitu quandu i mudelli di tessuti sò cuncepiti per dimustrà l'interazzione multi-organi. Dunque, e cellule endoteliali puderanu avè bisognu di esse incluse per mudellà caratteristiche fisiologiche più precise cù risoluzione à livellu d'organu. E cellule immunitarie derivate da i pazienti sò ancu essenziali per visualizà risposte immunitarie innate, presentazione di l'antigeni, diafonia immunitaria adattativa innata è immunità specifica di i tessuti in u cuntestu di l'imitazione di e malatie intestinali.
L'usu di chip ibridi hè più simplice chè gut-on-a-chip perchè a cunfigurazione di u dispusitivu hè più simplice è l'usu di inserti Transwell permette una cultura scalabile di l'epiteliu intestinale. Tuttavia, l'inserti Transwell dispunibili in cummerciu cù membrane di poliestere ùn sò micca elastici è ùn ponu micca simulà movimenti peristaltici. Inoltre, u compartimentu apicale di l'insertu Transwell piazzatu in u chip ibridu hè restatu stazionariu senza stress di taglio da u latu apicale. Chiaramente, e proprietà statiche in u compartimentu apicale raramente permettenu a co-cultura batterica à longu andà in chip ibridi. Mentre pudemu induce robustamente a morfogenesi 3D in inserti Transwell quandu si utilizanu chip ibridi, a scarsità di biomeccanica fisiologicamente pertinente è di flussu di fluidu apicale pò limità a fattibilità di e piattaforme di chip ibridi per applicazioni potenziali.
E ricustruzzioni à scala piena di l'asse cripta-villu umanu in e culture gut-on-a-chip è hybrid-on-a-chip ùn sò state cumpletamente stabilite. Siccomu a morfogenesi principia da un monostrato epiteliale, e microarchitetture 3D ùn furniscenu micca necessariamente similitudini morfologiche à e cripte in vivo. Ancu s'è no avemu carattarizatu a pupulazione cellulare proliferante vicinu à u duminiu cripta basale in l'epiteliu 3D microingegnerizatu, e regioni cripte è villuse ùn eranu micca chjaramente demarcate. Ancu s'è i canali superiori più alti nantu à u chip portanu à una maggiore altezza di l'epiteliu microingegnerizatu, l'altezza massima hè sempre limitata à ~300-400 µm. A prufundità attuale di e cripte intestinali umane in l'intestinu tenue è grossu hè ~135 µm è ~400 µm, rispettivamente, è l'altezza di i villi intestinali tenui hè ~600 µm41.
Da un puntu di vista di l'imaghjini, l'imaghjini in situ à super-risoluzione di microarchitetture 3D pò esse limitata à l'intestinu nantu à un chip, postu chì a distanza di travagliu necessaria da a lente obiettiva à u stratu epiteliale hè di l'ordine di pochi millimetri. Per superà stu prublema, pò esse necessariu un obiettivu luntanu. Inoltre, fà sezioni sottili per a preparazione di campioni d'imaghjini hè difficiule per via di l'alta elasticità di u PDMS. Inoltre, postu chì a microfabbricazione stratu per stratu di l'intestinu nantu à un chip implica un'adesione permanente trà ogni stratu, hè estremamente difficiule apre o rimuovere u stratu superiore per esaminà a struttura superficiale di u stratu epiteliale. Per esempiu, aduprendu un microscopiu elettronicu à scansione (SEM).
L'idrofobicità di u PDMS hè stata un fattore limitante in i studii basati nantu à a microfluidica chì trattanu di piccule molecule idrofobe, postu chì u PDMS pò adsorbe in modu non specificu tali molecule idrofobe. L'alternative à u PDMS ponu esse cunsiderate cù altri materiali polimerichi. In alternativa, a mudificazione superficiale di u PDMS (per esempiu, u rivestimentu cù materiali lipofili 42 o poli(etilenglicole) 43) pò esse cunsiderata per minimizà l'adsorbimentu di molecule idrofobe.
Infine, u nostru metudu ùn hè statu bè caratterizatu in termini di furnisce un screening à altu rendimentu o una piattaforma sperimentale "taglia unica" faciule da aduprà. U protocolu attuale richiede una pompa à siringa per microdispositivu, chì occupa spaziu in un incubatore di CO2 è impedisce esperimenti à grande scala. Questa limitazione pò esse significativamente migliorata da a scalabilità di furmati di cultura innovativi (per esempiu, inserti porosi à 24 pozzetti, 96 pozzetti o 384 pozzetti chì permettenu u rifornimentu è a rimozione cuntinui di i mezi basolaterali).
Per induce a morfogenesi 3D di l'epiteliu intestinale umanu in vitro, avemu utilizatu un dispositivu intestinale à chip microfluidicu chì cuntene dui microcanali paralleli è una membrana porosa elastica trà di elli per creà una interfaccia lume-capillare. Dimostremu ancu l'usu di un dispositivu microfluidicu à canale unicu (un chip ibridu) chì furnisce un flussu basolaterale cuntinuu sottu à i strati epiteliali polarizzati cresciuti nantu à inserti Transwell. In entrambe e piattaforme, a morfogenesi di varie cellule epiteliali intestinali umane pò esse dimustrata applicendu a manipulazione direzionale di u flussu per rimuovere l'antagonisti di u morfogenu da u compartimentu basolaterale. L'intera prucedura sperimentale (Figura 1) si compone di cinque parti: (i) microfabbricazione di u chip intestinale o di u chip ibridu inseribile Transwell (passi 1-5; Casella 1), (ii) preparazione di cellule epiteliali intestinali (cellule Caco-2) o organoidi intestinali umani; caselle 2-5), (iii) cultura di cellule epiteliali intestinali nantu à chip intestinali o chip ibridi (passi 6-9), (iv) induzione di morfogenesi 3D in vitro (passu 10) è (v)) per caratterizà a microstruttura epiteliale 3D (passi 11-24). Infine, un gruppu di cuntrollu adattatu (discussu più in dettagliu quì sottu) hè statu cuncipitu per validà l'efficacità di a morfogenesi in vitro paragunendu a morfogenesi epiteliale à cuntrolli spaziali, temporali, cundiziunali o procedurali.
Avemu utilizatu duie piattaforme di cultura diverse: gut-on-a-chip cù canali dritti o canali cunvoluti non lineari, o chip ibridi chì cuntenenu inserti Transwell (TW) in un dispositivu microfluidicu, fabbricatu cum'è descrittu in a Casella 1, è u passu 1-5. "Fabbricazione di Dispositivi" mostra i passi principali per fà un chip unicu o un chip ibridu. "Cultura di Cellule Epiteliali Intestinali Umane" spiega a fonte cellulare (Caco-2 o organoidi intestinali umani) è a prucedura di cultura utilizata in questu protocolu. "Morfogenesi in vitro" mostra i passi generali in i quali e cellule epiteliali derivate da Caco-2 o organoidi sò cultivate nantu à un chip intestinale o nantu à inserti Transwell di un chip ibridu, seguita da l'induzione di a morfogenesi 3D è a furmazione di una struttura epiteliale caratterizata. U numeru di passu di u prugramma o u numeru di casella hè visualizatu sottu à ogni freccia. L'applicazione furnisce esempi di cume i strati epiteliali intestinali stabiliti ponu esse aduprati, per esempiu, in a caratterizazione di a differenziazione cellulare, studii di fisiologia intestinale, stabilimentu di ecosistemi ospite-microbioma è modellisazione di e malatie. Immagini di immunofluorescenza in "Cell "Differenziazione" chì mostra nuclei, F-actina è MUC2 espressi in u stratu epiteliale 3D Caco-2 generatu nantu à u chip intestinale. A segnalazione MUC2 hè presente in e cellule caliciformi è u mucus secretu da e superfici mucose. L'imagine fluorescenti in Gut Physiology mostranu u mucus pruduttu da a culurazione per l'acidu sialicu è i residui di N-acetilglucosamina utilizendu l'agglutinina fluorescente di germe di granu. E duie imagine sovrapposte in "Host-Microbe Co-Cultures" mostranu co-culture rappresentative di u microbioma ospite in l'intestinu nantu à un chip. U pannellu di manca mostra a co-cultura di E. coli chì esprime a proteina fluorescente verde (GFP) cù cellule epiteliali 3D Caco-2 microingegnerizzate. U pannellu di diritta mostra a lucalizazione di GFP E. coli co-cultivata cù cellule epiteliali 3D Caco-2, seguita da a culurazione di immunofluorescenza cù F-actina (rossu) è nuclei (blu). A modellazione di e malatie illustra l'intestinu sanu versus permeabile in chips di inflammazione intestinale sottu sfida fisiologica cù antigeni batterici (per esempiu, lipopolisaccaride, LPS) è cellule immune (per esempiu, PBMC; verde). E cellule Caco-2 sò state cultivate per stabilisce un stratu epiteliale 3D. Barra di scala, 50 µm. Immagini in a fila inferiore: "Differenziazione di e cellule" adattata cù u permessu di a riferenza. 2. Oxford University Press; Ripruduttu cù u permessu di Ref. 5. NAS; "Co-cultura ospite-microbu" adattatu cù u permessu di ref. 3. NAS; "Modelizazione di e malatie" adattatu cù u permessu di a riferenza. 5. NAS.
I chip gut-on-chip è ibridi sò stati fabbricati aduprendu repliche di PDMS chì sò state smodellate da stampi di silicone per litografia dolce1,44 è modellate cù SU-8. U disignu di i microcanali in ogni chip hè determinatu cunsiderendu l'idrodinamica cum'è a tensione di taglio è a pressione idrodinamica1,4,12. U disignu originale di gut-on-a-chip (Dati Estesi Fig. 1a), chì cunsistia in dui microcanali dritti paralleli ghjustapposti, s'hè evolutu in un gut-on-a-chip cumplessu (Dati Estesi Fig. 1b) chì include una coppia di microcanali curvi per induce un aumentu di u tempu di residenza di u fluidu, mudelli di flussu non lineari è deformazione multiassiale di e cellule cultivate (Fig. 2a-f)12. Quandu hè necessariu ricreà una biomeccanica intestinale più cumplessa, si ponu sceglie gut-on-a-chip cumplessi. Avemu dimustratu chì u Gut-Chip cunvolutu induce ancu fortemente a morfogenesi 3D in un quadru di tempu simile cù un gradu simile di crescita epiteliale paragunatu à l'uriginale. Gut-Chip, indipendentemente da u tipu di cellula cultivata. Dunque, per induce a morfogenesi 3D, i disinni di l'intestinu in chip lineari è cumplessi sò intercambiabili. E repliche di PDMS curate nantu à stampi di silicone cù mudelli SU-8 anu furnitu caratteristiche negative dopu a deformazione (Fig. 2a). Per fabricà l'intestinu nantu à un chip, u stratu superiore di PDMS preparatu hè statu ligatu sequenzialmente à un film PDMS porosu è poi allineatu cù u stratu inferiore di PDMS per ligame irreversibile utilizendu un trattatore corona (Fig. 2b-f). Per fabricà chip ibridi, e repliche di PDMS curate sò state ligate à vetrini per creà dispositivi microfluidichi à canale unicu chì puderanu accoglie inserti Transwell (Fig. 2h è Dati Estesi Fig. 2). U prucessu di ligame hè realizatu trattendu e superfici di a replica di PDMS è di u vetru cù plasma d'ossigenu o trattamentu corona. Dopu a sterilizazione di u dispositivu microfabbricatu attaccatu à u tubu di silicone, a cunfigurazione di u dispositivu era pronta per realizà a morfogenesi 3D di l'epiteliu intestinale (Figura 2g).
a, Illustrazione schematica di a preparazione di pezzi PDMS da stampi di silicone modellati SU-8. A suluzione PDMS micca polimerizzata hè stata versata nantu à un stampu di silicone (à manca), polimerizzata à 60 °C (in mezu) è smodellata (à diritta). U PDMS smodellatu hè statu tagliatu in pezzi è pulitu per un usu ulteriore. b, Fotografia di u stampu di silicone utilizatu per preparà u stratu superiore di PDMS. c, Fotografia di u stampu di silicone utilizatu per fabricà a membrana porosa di PDMS. d, Una seria di fotografie di i cumpunenti PDMS superiori è inferiori è di u dispositivu intestinale on-chip assemblatu. e, Schema di l'allineamentu di i cumpunenti PDMS superiori, di membrana è inferiori. Ogni stratu hè irreversibilmente ligatu da trattamentu à plasma o corona. f, Schema di u dispositivu gut-on-a-chip fabbricatu cù microcanali convoluti sovrapposti è camere à vuoto. g, Configurazione di gut-on-a-chip per a cultura cellulare microfluidica. L'intestinu fabbricatu nantu à un chip assemblatu cù un tubu di silicone è una siringa hè statu piazzatu nantu à un coprioggetto. U dispositivu à chip hè statu piazzatu nantu à u coperchio di una piastra Petri di 150 mm per u trattamentu. U legante hè adupratu per chjude u tubu di silicone. h, Istantanee visuali di a fabricazione di chip ibridi è di a morfogenesi 3D utilizendu chip ibridi. Inserti Transwell preparati indipindentamente per cultivà monostrati 2D di cellule epiteliali intestinali sò stati inseriti in u chip ibridu per induce a morfogenesi intestinale 3D. U mezu hè perfusu attraversu microcanali sottu à u stratu cellulare stabilitu nantu à l'insertu Transwell. Barra di scala, 1 cm. h Ristampatu cù u permessu di a riferenza. 4. Elsevier.
In questu protocolu, a linea cellulare Caco-2 è l'organoidi intestinali sò stati aduprati cum'è fonti epiteliali (Fig. 3a). Tramindui i tipi di cellule sò stati cultivati ​​indipindentamente (Casella 2 è Casella 5) è aduprati per suminà i microcanali rivestiti di ECM di l'intestinu on-chip o inserti Transwell. Quandu e cellule sò confluenti (> 95% di cupertura in fiaschi), e cellule Caco-2 cultivate di rutina (trà i passaggi 10 è 50) in fiaschi T sò raccolte per preparà sospensioni cellulari dissociate da fluidu di tripsinizazione (casella 2). L'organoidi intestinali umani da biopsie intestinali o resezioni chirurgiche sò stati cultivati ​​in cupole di scaffold Matrigel in piastre à 24 pozzetti per sustene u microambiente strutturale. U mezu chì cuntene morfogeni essenziali (cum'è Wnt, R-spondin è Noggin) è fattori di crescita preparati cum'è descrittu in a Casella 3 hè statu supplementatu ogni dui ghjorni finu à chì l'organoidi sò cresciuti à ~ 500 µm di diametru. L'organoidi cumpletamente cresciuti sò raccolti è dissociati in singole cellule per a suminazione nantu à Inserti intestinali o Transwell nantu à un chip (Casella 5). Cum'è avemu digià signalatu, pò esse differenziatu secondu u tipu di malatia12,13 (per esempiu, colite ulcerosa, malatia di Crohn, cancru colorectal, o donatore nurmale), situ di lesione (per esempiu, lesione versus zona micca lesionata) è locu gastrointestinale in u trattu (per esempiu, duodenu, jejunum, ileum, ciecum, colon, o rettu). Fornemu un protocolu ottimizatu in a Casella 5 per cultivà organoidi colonichi (coloidi) chì tipicamente richiedenu concentrazioni più elevate di morfogeni cà l'organoidi intestinali tenui.
a, Flussu di travagliu per l'induzione di a morfogenesi intestinale in u chip intestinale. L'epiteliu intestinale umanu Caco-2 è l'organoidi intestinali sò usati in questu protocolu per dimustrà a morfogenesi 3D. E cellule epiteliali isolate sò state seminate in u dispositivu gut-on-a-chip preparatu (preparazione di chip). Una volta chì e cellule sò seminate (seminate) è attaccate (attaccate) à a membrana porosa PDMS u ghjornu 0 (D0), u flussu apicale (AP) hè iniziatu è mantinutu per i primi 2 ghjorni (flussu, AP, D0-D2). U flussu basolaterale (BL) hè ancu iniziatu inseme cù movimenti di allungamentu ciclicu (allungamentu, flussu, AP è BL) quandu si forma un monostrato 2D cumpletu. A morfogenesi intestinale 3D si hè verificata spontaneamente dopu à 5 ghjorni di cultura microfluidica (morfogenesi, D5). L'imaghjini di cuntrastu di fase mostranu a morfologia rappresentativa di e cellule Caco-2 in ogni passu sperimentale o puntu di tempu (graficu à barre, 100 µm). Quattru diagrammi schematici chì illustranu e cascate currispondenti di morfogenesi intestinale (in cima à diritta). E frecce tratteggiate In u schema rapprisenta a direzzione di u flussu di fluidu.b, Imagine SEM chì mostra a topologia di a superficia di l'epiteliu 3D Caco-2 stabilitu (à manca). L'insertu chì mette in risaltu l'area ingrandita (casella bianca tratteggiata) mostra i microvilli rigenerati nantu à u stratu 3D Caco-2 (à diritta).c, Vista frontale orizzontale di Caco-2 3D stabilitu, claudina (ZO-1, rossa) è membrane di bordu di spazzola cuntinue etichettate F-actina (verde) è nuclei (blu) Visualizazione cunfocale di immunofluorescenza di cellule epiteliali nantu à chip intestinali.E frecce chì puntanu à u schema mediu indicanu a pusizione di u pianu focale per ogni vista cunfocale.d, Corsu temporale di cambiamenti morfologichi in organoidi cultivati ​​​​​​su un chip ottenutu per microscopia di cuntrastu di fase in i ghjorni 3, 7, 9, 11 è 13. L'insertu (in cima à diritta) mostra l'altu ingrandimentu di l'imagine furnita.e, Microfotografia DIC di epiteliu 3D organoide stabilitu in l'intestinu nantu à una fetta presa u ghjornu 7.f, Sovrappostu Imagine d'immunofluorescenza chì mostranu marcatori per e cellule staminali (LGR5; magenta), e cellule caliciformi (MUC2; verde), a F-actina (grigia) è i nuclei (cian) cresciuti nantu à chips intestinali per 3 ghjorni, rispettivamente (sinistra) è organoidi di 13 ghjorni (mezzu) nantu à u stratu epiteliale. Vede ancu a Figura 3 di Dati Estesi, chì mette in risaltu a segnalazione LGR5 senza segnalazione MUC2. Imagine d'immunofluorescenza chì mostranu a microstruttura epiteliale (destra) di l'epiteliu organoide 3D stabilitu in l'intestinu nantu à un chip culurendu a membrana plasmatica cù u colorante CellMask (destra) u ghjornu 13 di a cultura. A barra di scala hè 50 μm, salvu indicazione contraria. b Ristampatu cù u permessu di a riferenza. 2. Oxford University Press; c Adattatu cù u permessu di a riferenza. 2. Oxford University Press; e è f adattati cù u permessu di a riferenza. 12 Sottu Licenza Creative Commons CC BY 4.0.
In l'intestinu nantu à un chip, hè necessariu mudificà a superficia idrofobica di a membrana porosa PDMS per un rivestimentu ECM riesciutu. In questu protocolu, applichemu dui metudi diversi per mudificà l'idrofobicità di e membrane PDMS. Per cultivà e cellule Caco-2, l'attivazione di a superficia per trattamentu UV/ozonu solu era sufficiente per riduce l'idrofobicità di a superficia PDMS, rivestisce l'ECM è attaccà e cellule Caco-2 à a membrana PDMS. Tuttavia, a cultura microfluidica di l'epiteliu organoide richiede una funzionalizazione di a superficia basata nantu à chimica per ottene una deposizione efficiente di proteine ​​ECM applicendu sequenzialmente polietilenimina (PEI) è glutaraldeide à i microcanali PDMS. Dopu a mudificazione di a superficia, e proteine ​​ECM sò state depositate per copre a superficia PDMS funzionalizzata è poi introdutte in l'epiteliu organoide isolatu. Dopu chì e cellule sò attaccate, a cultura cellulare microfluidica principia perfundendu solu u mezu in u microcanale superiore finu à chì e cellule formanu un monostrato cumpletu, mentre chì u microcanale inferiore mantene e cundizioni statiche. Questu metudu ottimizatu per l'attivazione di a superficia è u rivestimentu ECM permette l'attaccamentu di organoidi. epiteliu per induce a morfogenesi 3D nantu à a superficia di PDMS.
E culture Transwell richiedenu ancu un rivestimentu ECM prima di a suminazione cellulare; tuttavia, e culture Transwell ùn richiedenu micca passi di pretrattamentu cumplessi per attivà a superficia di l'inserti porosi. Per a crescita di cellule Caco-2 nantu à inserti Transwell, u rivestimentu ECM nantu à inserti porosi accelera l'attaccamentu di e cellule Caco-2 dissociate (<1 ora) è a furmazione di barriere à giunzione stretta (<1-2 ghjorni). Per cultivà organoidi nantu à inserti Transwell, l'organoidi isolati sò suminati nantu à inserti rivestiti di ECM, attaccati à a superficia di a membrana (<3 h) è mantenuti finu à chì l'organoidi formanu un monostrato cumpletu cù integrità di barriera. E culture Transwell sò realizate in piastre à 24 pozzetti senza l'usu di chip ibridi.
A morfogenesi 3D in vitro pò esse iniziata applicendu u flussu di fluidu à l'aspettu basolaterale di un stratu epiteliale stabilitu. In l'intestinu nantu à un chip, a morfogenesi epiteliale hà iniziatu quandu u mezu hè statu perfusu in i microcanali superiori è inferiori (Fig. 3a). Cum'è descrittu prima, hè criticu introduce u flussu di fluidu in u compartimentu inferiore (basolaterale) per a rimozione cuntinua di l'inibitori di morfogeni secreti direzionali. Per furnisce nutrienti è serum sufficienti à e cellule legate à e membrane porose è generà stress di taglio luminale, tipicamente applichemu un doppiu flussu in l'intestinu nantu à un chip. In i chip ibridi, l'inserti Transwell chì cuntenenu monostrati epiteliali sò stati inseriti in i chip ibridi. Dopu, u mezu hè statu applicatu sottu à u latu basolaterale di l'insertu Transwell porosu attraversu u microcanale. A morfogenesi intestinale hè accaduta 3-5 ghjorni dopu l'iniziu di u flussu basolaterale in entrambe e piattaforme di cultura.
E caratteristiche morfologiche di i strati epiteliali 3D microingegnerizzati ponu esse analizate applicendu diverse modalità di imaging, cumprese a microscopia à cuntrastu di fase, a microscopia à cuntrastu di interferenza differenziale (DIC), SEM, o a microscopia cunfocale à immunofluorescenza (Figure 3 è 4). L'imaging à cuntrastu di fase o DIC pò esse facilmente realizatu in ogni mumentu durante a cultura per monitorà a forma è a sporgenza di i strati epiteliali 3D. A causa di a trasparenza ottica di i filmi PDMS è di poliestere, e piattaforme gut-on-a-chip è ibride di chip ponu furnisce imaging in situ in tempu reale senza a necessità di sezionamentu o smontaggio di u dispusitivu. Quandu si esegue l'imaging à immunofluorescenza (Figure 1, 3c, f è 4b, c), e cellule sò tipicamente fissate cù 4% (pesu/vol) di paraformaldeide (PFA), seguita da Triton X-100 è 2% (pesu/vol) di albumina di serum bovinu (BSA), in ordine. Sicondu u tipu di cellula, si ponu aduprà diversi fissativi, permeabilizanti è agenti bloccanti. Primariu L'anticorpi chì miranu i marcatori di cellule o regioni dipendenti da a ligna sò usati per mette in risaltu e cellule immobilizzate in situ nantu à u chip, seguitate da anticorpi secundarii inseme cù un colorante di contrastu chì mira sia u nucleu (per esempiu, 4′,6-diamidino-2-fenilene) indolo, DAPI) sia a F-actina (per esempiu, falloidina marcata fluorescentemente). L'imaghjini in diretta basate nantu à a fluorescenza ponu ancu esse realizate in situ per rilevà a produzzione di mucus (Fig. 1, "Differenziazione cellulare" è "Fisiologia intestinale"), a culunizazione casuale di cellule microbiche (Fig. 1, "Co-cultura ospite-microbu"), u recrutamentu di cellule immunitarie (Fig. 1, 'Modellazione di e malatie') o i contorni di a morfologia epiteliale 3D (Fig. 3c, f è 4b, c). Quandu si modifica l'intestinu nantu à u chip per separà u stratu superiore da u stratu inferiore di microcanali, cum'è descrittu in rif. Cum'è mostratu in Fig. 2, a morfologia epiteliale 3D è ancu i microvilli nantu à u bordu apicale di a spazzola ponu esse visualizati da SEM (Fig. 3b). L'espressione di i marcatori di differenziazione pò esse valutata realizendu PCR5 quantitativa o sequenziamentu di RNA di una sola cellula. In questu casu, i strati 3D di cellule epiteliali cultivate in chip intestinali o chip ibridi sò raccolti per tripsinizazione è poi aduprati per analisi moleculare o genetica.
a, Flussu di travagliu per l'induzione di a morfogenesi intestinale in un chip ibridu. Caco-2 è organoidi intestinali sò usati in questu protocolu per dimustrà a morfogenesi 3D in una piattaforma di chip ibridi. E cellule epiteliali dissociate sò state seminate in inserti Transwell preparati (prep. TW; vede a figura sottu). Una volta chì e cellule sò state seminate (seminate) è attaccate à membrane di poliestere in inserti Transwell, tutte e cellule sò state cultivate in cundizioni statiche (cultura TW). Dopu à 7 ghjorni, un unicu insertu Transwell chì cuntene un monostrato 2D di cellule epiteliali hè statu integratu in un chip ibridu per introduce un flussu basolaterale (Flow, BL), chì infine hà purtatu à a generazione di un stratu epiteliale 3D (morfogenesi). Micrografie di cuntrastu di fase chì mostranu e caratteristiche morfologiche di e cellule epiteliali di l'organi umani derivate da u colon ascendente di u donatore nurmale (linea C103) in ogni passu sperimentale o puntu di tempu. I schemi in i strati superiori illustranu a cunfigurazione sperimentale per ogni passu. b, I chip ibridi (schema di manca) ponu purtà à a morfogenesi 3D di e cellule epiteliali organoidi cù viste di microscopia cunfocale top-down. Prese in diverse pusizioni Z (superiore, media è inferiore; vede u schema di diritta è e linee punteggiate currispondenti). anu mostratu caratteristiche morfologiche evidenti. F-actina (cian), nucleu (grisgiu). c, Micrografie cunfocali à fluorescenza (vista angulata 3D) di cellule epiteliali derivate da organoidi cultivate in Transwell staticu (TW; inseritu in a casella tratteggiata bianca) versus chip ibridu (a più grande vista completa) chì paragunanu a morfologia 2D versus 3D, rispettivamente. Un paru di viste trasversali verticali 2D (inserite in l'angulu superiore destro; "XZ") mostranu ancu caratteristiche 2D è 3D. Barra di scala, 100 µm. c Ristampatu cù u permessu di a riferenza. 4. Elsevier.
I cuntrolli ponu esse preparati cultivendu e stesse cellule (Caco-2 o cellule epiteliali organoidi intestinali) in monostrati bidimensionali in cundizioni di cultura statica convenzionali. In particulare, l'esaurimentu di nutrienti pò risultà da a capacità di volume limitata di i microcanali (vale à dì ~ 4 µL in u canale superiore nantu à u disignu originale di chip intestinale). Dunque, a morfologia epiteliale prima è dopu l'applicazione di u flussu basolaterale pò ancu esse paragunata.
U prucessu di litografia dolce deve esse realizatu in una stanza bianca. Per ogni stratu nantu à u chip (strati superiori è inferiori è membrane) è chip ibridi, sò state aduprate diverse fotomaschere è fabbricate nantu à wafer di siliciu separati perchè l'altezze di i microcanali eranu diverse. L'altezze di u target di i microcanali superiori è inferiori di l'intestinu nantu à u chip sò 500 µm è 200 µm, rispettivamente. L'altezza di u target di u canale di u chip ibridu hè di 200 µm.
Pone una cialda di silicone di 3 pollici in un piattu cù acetone. Agita delicatamente a piastra per 30 secondi, poi asciuga a cialda à l'aria. Trasferisci a cialda in un piattu cù IPA, poi gira a piastra per 30 secondi per pulirla.
Una suluzione di piranha (mistura di perossidu d'idrogenu è acidu sulfuricu cuncintratu, 1:3 (vol/vol)) pò esse aduprata facultativamente per massimizà a rimuzione di residui organici da a superficia di a cialda di siliciu.
A suluzione Piranha hè estremamente currusiva è genera calore. Precauzioni di sicurezza supplementari sò necessarie. Per u smaltimentu di i rifiuti, lasciate chì a suluzione si raffreddi è trasferitela in un cuntainer di rifiuti pulitu è ​​asciuttu. Aduprate cuntainer secundarii è etichettate currettamente i cuntainer di rifiuti. Seguitate e linee guida di sicurezza di l'installazione per procedure più dettagliate.
Disidratate e cialde piazzendule nantu à una piastra calda à 200 °C per 10 minuti. Dopu a disidratazione, a cialde hè stata scuzzulata cinque volte in aria per rinfriscà si.
Versate ~10 g di fotoresist SU-8 2100 nantu à u centru di a cialda di silicone pulita. Aduprate una pinzetta per sparghje a fotoresist uniformemente nantu à a cialda. Di tantu in tantu, mette a cialda nantu à una piastra calda à 65 ° C per rende a fotoresist menu appiccicosa è più faciule da sparghje. Ùn mette micca a cialda direttamente nantu à a piastra calda.
SU-8 hè statu distribuitu uniformemente nantu à u wafer eseguendu u rivestimentu per rotazione. Prugrammate una rotazione in entrata di SU-8 per 5-10 s per propagassi à 500 rpm à una accelerazione di 100 rpm/s. Impostate a rotazione principale per un mudellu di spessore di 200 µm à 1.500 rpm, o ottenete un spessore di 250 µm (creendu una altezza di 500 µm per u stratu superiore di l'intestinu nantu à u chip; vede "Passi critici" quì sottu) impostata à una accelerazione di 300 rpm/s 30 secondi à 1.200 rpm.
A velocità di rotazione principale pò esse aghjustata secondu u spessore di destinazione di u mudellu SU-8 nantu à a cialda di siliciu.
Per fabricà mudelli SU-8 di 500 µm d'altezza per u stratu superiore di l'intestinu nantu à u chip, i passi di spin coating è soft bake di sta casella (passi 7 è 8) sò stati ripetuti sequenzialmente (vede u passu 9) per pruduce dui strati di 250 µm di spessore di SU-8, chì ponu esse stratificati è uniti per esposizione UV in u passu 12 di sta casella, creendu un stratu di 500 µm d'altezza.
Cuocere delicatamente le cialde rivestite di SU-8 posizionandole con cura su una piastra calda a 65 °C per 5 minuti, quindi impostare l'impostazione a 95 °C e incubare per altri 40 minuti.
Per ottene un'altezza di 500 μm di u mudellu SU-8 in u microcanale superiore, ripetite i passi 7 è 8 per generà dui strati SU-8 di 250 μm di spessore.
Aduprendu l'allineatore di maschera UV, eseguite una prova di lampada secondu l'istruzzioni di u fabricatore per calculà u tempu di esposizione di a cialda (tempu di esposizione, ms) = (dose di esposizione, mJ/cm2)/(putenza di a lampada, mW/cm2).
Dopu avè determinatu u tempu di esposizione, piazzate a fotomaschera nantu à u supportu di a maschera di l'allineatore di maschera UV è piazzate a fotomaschera nantu à u wafer rivestitu di SU-8.
Pone a superficia stampata di a fotomaschera direttamente nantu à u latu rivestitu di SU-8 di a cialda di siliciu per minimizà a dispersione UV.
Espone a cialda rivestita di SU-8 è a fotomaschera verticalmente à 260 mJ/cm2 di luce UV per u tempu di esposizione predeterminatu (vede u passu 10 di sta casella).
Dopu l'esposizione à i raggi UV, i wafer di silicone rivestiti di SU-8 sò stati cotti à 65 °C per 5 minuti è 95 °C per 15 minuti nantu à ogni piastra calda per fabricà mudelli cù una altezza di 200 μm. Estende u tempu di post-cottura à 95 °C à 30 minuti per fabricà mudelli cù una altezza di 500 µm.
U sviluppatore hè versatu in un piattu di vetru, è a cialda cotta hè piazzata in u piattu. U vulume di sviluppatore SU-8 pò varià secondu a dimensione di a piastra di vetru. Assicuratevi di utilizà abbastanza sviluppatore SU-8 per rimuovere cumpletamente u SU-8 micca espostu. Per esempiu, quandu si usa un piattu di vetru di 150 mm di diametru cù una capacità di 1 L, aduprate ~ 300 mL di sviluppatore SU-8. Sviluppate u stampu per 25 minuti cù una rotazione dolce occasionale.
Risciacquate u stampu sviluppatu cù ~ 10 mL di sviluppatore frescu seguitu da IPA spruzzendu a suluzione cù una pipetta.
Pone a cialda in un pulitore à plasma è espone à u plasma d'ossigenu (gas atmosfericu, pressione target 1 × 10−5 Torr, putenza 125 W) per 1,5 min.
Pone a cialda in un essiccatore à vuoto cù un vetrino dentru. E cialde è i vetrini ponu esse posti unu accantu à l'altru. Se l'essiccatore à vuoto hè divisu in parechji strati da una piastra, mette i vetrini in a camera inferiore è e cialde in a camera superiore. Lasciate cascà 100 μL di soluzione di tricloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil)silano nantu à un vetrino è applicate u vuoto per a silanizazione.
Scongelate una fiala di cellule Caco-2 congelate in un bagnu d'acqua à 37 ° C, poi trasferisce e cellule scongelate in un matraccio T75 contenente 15 mL di terreno Caco-2 preriscaldato a 37 ° C.
Per passà e cellule Caco-2 à una confluenza di ~90%, prima scaldate u mezu Caco-2, PBS è 0,25% di tripsina/1 mM EDTA in un bagnu d'acqua à 37°C.
Aspirate u mezu per aspirazione à u vacuum. Lavate e cellule duie volte cù 5 mL di PBS caldu ripetendu l'aspirazione à u vacuum è aghjunghjendu PBS frescu.