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A morfogenesi di l'intestinu umanu stabilisce caratteristiche di criptu-villus di a microarchitettura epiteliale 3D è di l'urganizazione spaziale. Questa struttura unica hè necessaria per mantene l'omeostasi intestinale pruteggendu u nichu di cellule staminali in a cripta basale da antigeni microbichi esogeni è i so metaboliti. Strutture epiteliali D hè cruciale per a custruzzione di mudelli intestinali in vitro. In particulare, u gut-on-a-chip mimeticu organicu pò induce a morfogenesi 3D spontanea di l'epiteliu intestinale cù funzioni fisiologiche è biomeccanica rinfurzate. , Cultivazione di Caco-2 o cellule epiteliali organoidi intestinali in ambienti cunvinziunali è ancu in una piattaforma microfluidica, induzione di morfogenesi 3D, è caratterizzazione di epitelii 3D stabiliti utilizendu parechje modalità di imaging. Stu protokollu ottene a rigenerazione di a microarchitettura intestinale funzionale cuntrullendu u flussu di fluidu basolaterale per 5 d. esige ingegneria o manipulazione di cellule cumplessu, chì ponu superà altre tecniche esistenti. Prevedemu chì u nostru protokollu prupostu puderia avè ampie implicazioni per a cumunità di ricerca biomedica, furnisce un metudu per rigenerate strati epiteliali intestinali 3D in vitro per applicazioni biomedicali, cliniche è farmaceutiche.
L'esperimenti dimustranu chì e cellule epiteliali intestinali Caco-2 cultivate in gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o dispositivi microfluidici a doppia strata6,7 ponu esse sottumessi à una morfogenesi 3D spontanea in vitro senza una comprensione chjara di u mecanismu sottostante. morphogenèse in vitro, qui a été démontrée par Caco-2 et organoïdes intestinales dérivés du patient.E cellule epiteliali sò state validate. In questu studiu, avemu cuncentratu specificamente in a produzzione cellulare è a distribuzione di cuncentrazione di un potente antagonista Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), in gut-on-a-chip è dispositivi microfluidici modificati chì cuntenenu inserti Transwell, chjamati "Hybrid Chip". -proteina 1, o Soggy-1) à l'intestinu in chip inibisce a morfogenesi o disturba a strata epiteliale 3D prestrutturata, suggerendu chì u stress antagonisticu durante a cultura hè rispunsevule per a morfogenesi intestinale in vitro. (per esempiu, in piattaforme gut-on-a-chip o hybrid-on-a-chip) o diffusione .Basolateral media (per esempiu, da Transwell inserts in large reservoirs basolateral in wells).
In questu protokollu, furnimu un metudu detallatu per a fabricazione di microdispositivi gut-on-a-chip è chip ibridi inseribili in Transwell (passi 1-5) per cultivà cellule epiteliali intestinali nantu à membrane porose basate in polidimetilsiloxano (PDMS) (passi 6A, 7A, 8, 9) o membrani di poliester di inserti Transwell 36B, 7psB, 36B, 7ps induced 9D morfogenesi in vitro (passu 10). Avemu ancu identificatu e caratteristiche cellulari è molecolari indicative di histogenesi specifichi di tissuti è di differenziazione cellulare dipendente da u lignaghju applicà parechje modalità di imaging (passi 11-24). di u microambientu biomeccanicu.in vitro.To induce 3D morphogenesis from 2D epithelial monolayers, avemu sguassatu l'antagonisti di morphogen in i dui formi cultivati ​​da u flussu di u mediu in u compartment basolaterale di a cultura. -cultures, infizzione patogenu, ferita inflammatory, disfunzioni barriera epithelial, è terapii basati probiotic Example.influences.
U nostru protokollu pò esse utile à una larga gamma di scientisti in basi (per esempiu, biologia mucosa intestinale, biologia di cellule staminali è biologia di u sviluppu) è ricerca applicata (per esempiu, teste di droghe precliniche, modellazione di malatie, ingegneria tissutale è gastroenterologia) impattu largu. s studià a dinamica di a signalazione cellulare durante u sviluppu intestinali, a rigenerazione o l'omeostasi .In più, u nostru protocolu hè utile per interrogating infezzione sottu diversi agenti infizziosi cum'è Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae.L'audienza di a patologia di a malatia è a patogenesi sò ancu utili. L'usu di un sistema di microfisiologia di l'intestinu in chip pò permette a co-cultura longitudinale 10 è a valutazione successiva di a difesa di l'ospiti, risposti immune è a riparazione di ferite in u trattu gastrointestinali (GI) 11. o sindromu di l'intestione irritabile pò esse simulatu quandu i strati epiteliali intestinali 3D sò preparati utilizendu i strati epiteliali intestinali 3D di u paziente, queste malatie includenu l'atrofia vilosa, l'accortamentu di a cripta, u dannu mucosa, o a barriera epiteliale deteriorata. tipi, cum'è cellule mononucleari di sangue perifericu di u paziente (PBMC), à mudelli chì cuntenenu microarchitetture 3D di villus-criptu intestinali.cellule immunitarie specifiche di tessuti, 5.
Siccomu a microstruttura epiteliale 3D pò esse fissata è visualizata senza u prucessu di seccionamentu, i telespettatori chì travaglianu nantu à a transcriptomica spaziale è l'imaghjini d'alta risoluzione o super-risoluzione ponu esse interessate in a nostra mappatura di a dinamica spazio-temporale di i geni è e proteine ​​​​in i nicchi epiteliali.Interessatu in a tecnulugia. Risposta à stimuli microbiali o immune. Inoltre, a diafonia longitudinale di l'ospite-microbioma 10, 14 chì coordina l'omeostasi di l'intestinu pò esse stabilitu in a capa di mucosa intestinale 3D co-cultivando diverse spezie microbiche, comunità microbiche o microbiota fecale, in particulare in u gut-on-a-chip.in a piattaforma. Stu approcciu hè particularmente attraente per u publicu chì studia l'immunologia mucosa, a gastroenterologia, u microbioma umanu, a culturomica è a microbiologia clinica chì cercanu di cultivà microbiota intestinale prima inculturata in u laboratoriu. u protokollu pò ancu esse disseminatu à quelli chì sviluppanu piattaforme farmaceutiche, biomediche O di screening o validazione d'alta produzzione per l'industria alimentaria. Cum'è una prova di principiu, avemu recentemente dimustratu a fattibilità di un sistema di morfogenesi multiplex high-throughput scalable à un format di piastra 24-well. U metudu di morfogenesi pò esse acceleratu è potenzialmente aduttatu da parechji laboratorii di ricerca, industria o guvernu è agenzie regulatori per capiscenu a riprogrammazione cellulare di a morfogenesi intestinale in vitro à u livellu trascriptomicu per pruvà droghe o bioterapiche L'assorbimentu è u trasportu di i candidati à a droga hè stata valutata utilizendu surrogati intestinali 3D o utilizendu mudelli persunalizati o cummirciali di l'assessu di morfogenesi di a morfogenesi.
Un numaru limitatu di mudelli sperimentali pertinenti per l'omu sò stati utilizati per studià a morfogenesi epiteliale intestinale, principalmente per a mancanza di protokolli implementabili per induce a morfogenesi 3D in vitro. In fatti, assai di a cunniscenza attuale nantu à a morfogenesi intestinale hè basatu annantu à studii animali (per esempiu, zebrafish20, mice21 o polli22). Determinà i prucessi di sviluppu umanu. Questi mudelli sò ancu assai limitati in a so capacità per esse pruvati in una manera scalabile multidirezionale. Per quessa, u nostru protokollu per a rigenerazione di strutture di tissuti 3D in vitro supera i mudelli animali in vivo è ancu altri mudelli di cultura di cellule 2D statiche tradiziunali. Stimuli mucosali o immune. I strati epiteliali 3D ponu furnisce un spaziu per studià cumu e cellule microbiche cumpetenu per furmà nichi spaziali è l'evoluzione ecologica in risposta à i fatturi di l'ospiti (per esempiu, strati di mucus internu versus esterni, secrezione di IgA è peptidi antimicrobiali). per esempiu, l'acidi grassi di a catena corta) chì formanu l'urganizazione cellulare è i nicchi di cellule staminali in i cripti basali. Queste caratteristiche ponu esse dimustrate solu quandu i strati epiteliali 3D sò stabiliti in vitro.
In più di u nostru metudu di creazione di strutture epiteliali intestinali 3D, ci sò parechji metudi in vitro. A cultura organoide intestinale hè una tecnica di ingegneria di tissuti di punta basata nantu à a cultura di cellule staminali intestinali in cundizioni morfogene specifiche23,24,25. dunque, l'intruduzioni di cumpunenti luminali cum'è cellule microbiche o antigens esogeni hè limitata.L'accessu à i lumens organoidi pò esse migliuratu cù un microinjector, 26,27, ma stu metudu hè invasivu è intensivu di travagliu è esige cunniscenze specializate per eseguisce. Inoltre, i culturi organoidi tradiziunali manteni in scaffolds d'idrogel in cundizioni statiche ùn riflettenu micca precisamente a biomeccanica attiva in vivo.
Altri approcci impiegati da parechji gruppi di ricerca utilizanu scaffolds d'idrogel 3D prestrutturati per imite a struttura epiteliale di l'intestinu cultivendu cellule intestinali umane isolate nantu à a superficia di gel. Fabbricate scaffolds d'idrogel cù stampi stampati in 3D, micro-fresati, o fabbricati litograficamente. Stu metudu mostra l'arrangimentu di cellule epiteliali isolate in vitro, pertinenti. In una struttura epiteliale altu rapportu d'aspettu è crosstalk stroma-epiteliale includendu cellule stromali in u scaffold. Tuttavia, a natura di scaffolds prestrutturati pò impedisce a visualizazione di u prucessu morfogeneticu spontaneu stessu. Questi mudelli ùn furniscenu micca un flussu luminosu o interstiziale dinamicu, mancanu u stress di cisellamentu fluidu chì e cellule intestinali necessitanu di studià l'idrogenesi di l'idrogenesi. Una piattaforma microfluidica è strutture epiteliali intestinali stampate cù tecniche di incisione laser. L'organoidi intestinali di u mouse seguenu mudelli incisi per furmà strutture tubulari intestinali, è u flussu di fluidu intraluminale pò esse recapitulatu cù un modulu di microfluidica. Processi tic. Malgradu a fabricazione cumplessa di diversi segmenti intestinali in u tubu, stu mudellu ùn manca ancu di flussu di fluidu luminale è di deformazione meccanica. Inoltre, l'operabilità di u mudellu pò esse limitata, soprattuttu dopu chì u prucessu di bioprinting hè cumpletu, perturbando e cundizioni sperimentali o interazzione cellula à cellula. tments, è ri-creazione di microambienti biològichi cumplessi di modularity.Therefore, u nostru protocolu morphogenesis in vitro 3D pò furnisce un accostu cumplementari à superà i sfidi di metudi esistenti.
U nostru protokollu hè interamente focu annantu à a morfogenesi epiteliale 3D, cù solu cellule epiteliali in cultura è senza altri tipi di cellule circundanti cum'è cellule mesenchimali, cellule endoteliali è cellule immunitarie. On-a-chip è hybrid-on-a-chip ci permette di ricreà a strata epiteliale 3D ondulante, cumplessità biologiche supplementari cum'è interazzioni epiteliali-mesenchimali 33,34, deposizione di Matrix extracellulare (ECM) 35 è, in u nostru mudellu, caratteristiche di criptu-villus chì trasmettenu cellule staminali in nicchie di cellule staminali, per esempiu, i fibrosi basali sò più criptati in cellule basali. chyme ghjucà un rolu chjave in a pruduzzione di proteini ECM è regulazione di morphogenesis intestinali in vivo35,37,38.L'aghjuntu di cellule mesenchymal à u nostru mudellu hà rinfurzatu u prucessu morphogenetic è l'efficacità di l'attaccamentu di e cellule. A strata endoteliale (vale à dì, capillari o lymphatics) ghjoca un rolu impurtante in a regulazione di u trasportu moleculare39, u microimmune immune, i cumpunenti di recruitmorement immune immune. ponu esse cunnessi trà i mudelli di tissuti sò un prerequisite quandu i mudelli di tissuti sò pensati per dimustrà interazzione multi-organi. Per quessa, e cellule endoteliali ponu esse incluse per mudificà caratteristiche fisiologiche più precise cù una risoluzione à l'urganu. malatia.
L'usu di chips hibridi hè più simplice di gut-on-a-chip perchè a cunfigurazione di u dispusitivu hè più simplice è l'usu di inserti Transwell permette una cultura scalabile di l'epiteliu intestinale. Tuttavia, l'inserti Transwell dispunibili in cumerciu cù membrani di poliester ùn sò micca elastici è ùn ponu micca simulà movimenti peristaltici. Arly, e proprietà statiche in u compartment apical raramente permettenu a co-cultura bacteriana à longu andà in chips hibridi. Mentre pudemu induce robustamente a morfogenesi 3D in inserti Transwell quandu usanu chips hibridi, a carenza di biomeccanica fisiologicamente pertinenti è u flussu di fluidu apicale pò limità a fattibilità di piattaforme di chip hybrid per applicazioni potenziali.
E ricustruzzioni in scala completa di l'asse criptu-villus umanu in i culturi gut-on-a-chip è hybrid-on-a-chip ùn sò micca stati cumplettamente stabiliti. Siccomu a morfogenesi principia da un monolayer epiteliale, e microarchitetture 3D ùn furnisce micca necessariamente una similitudine morfologica à e cripte in vivo. a cripta è e regioni villose ùn sò micca chjaramente delimitate. Ancu se i canali superiori più alti nantu à u chip portanu à una altezza aumentata di l'epiteliu microingegneria, l'altezza massima hè sempre limitata à ~ 300-400 µm. A prufundità attuale di e cripte intestinali umane in l'intestinu chjucu è grossu hè ~ 135 µm è ~ 400 µm, rispettivamente, l'altezza di l'intestinali è ~ 400 µm, è l'altezza di l'intestinali è ~ 400 µm.
Da u puntu di vista di l'imaghjini, l'imaghjini in situ super-risoluzione di microarchitetture 3D ponu esse limitati à l'intestinu nantu à un chip, postu chì a distanza di travagliu necessaria da a lente objetiva à a strata epiteliale hè di l'ordine di pochi millimetri. A microfabricazione di l'intestinu nantu à un chip implica l'adesione permanente trà ogni capa, hè assai sfida per apre o caccià a capa superiore per esaminà a struttura di a superficia di a capa epiteliale. Per esempiu, utilizendu un microscopiu elettronicu à scanning (SEM).
L'idrofobicità di PDMS hè stata un fattore limitante in studi basati in microfluidi chì trattanu di piccule molecole idrofobiche, postu chì PDMS pò assorbire tali molecole idrofobiche in modo non specifico. Alternative à PDMS ponu esse considerate cù altri materiali polimerici. In alternativa, a modificazione di a superficia di PDMS (per esempiu, rivestimentu cù materiali lipofili) (per esempiu, rivestimentu cù materiali lipofili, pò esse cunsideratu idrofobicu 43 o polietilene) molécule fobiche.
Infine, u nostru metudu ùn hè micca statu bè carattarizatu in quantu à furnisce una screening high-throughput o "one-size-fits-all" piattaforma sperimentale user-friendly. U protokollu attuale richiede una pompa di siringa per microdispositivu, chì occupa spaziu in un incubatore di CO2 è impedisce esperimenti à grande scala. Questa limitazione pò esse significativamente migliurata da a scalabilità di furmati di cultura innovativi, 926-4-well, 92-4-well, 92-4-well, 92-4-well, 92-4-well, 92-4-well, 92-4-well, 92-4-well, 92-4-well, 92-4-well, 92-4-well, 92-4-7, chì permettenu un rifornimentu cuntinuu è a rimozione di i media basolate).
Per induce a morfogenesi 3D di l'epiteliu intestinali umanu in vitro, avemu utilizatu un dispositivu intestinali microfluidic chip contenente dui microcanali paralleli è una membrana porosa elastica trà per creà una interfaccia lumen-capillary.We dimustramu ancu l'usu di un dispositivu microfluidic monocanale (un chip hibridu) chì furnisce un flussu basolateral cuntinuu sottu à varii piattaforme polarizzate di l'epitheliu umanu. E cellule epiteliali ponu esse dimustrate appiendu a manipulazione direzionale di u flussu per caccià l'antagonisti di morphogen da u compartment basolateral. L'intera prucedura sperimentale (Figura 1) hè custituita di cinque parti: (i) microfabricazione di u chip intestinale o chip hibridu inseribile Transwell (passi 1-5; Box 1), (ii) preparazione di cellule intestinali epiteliali intestinali o cellule intestinali umane;scatuli 2-5), (iii) cultura di cellule epiteliali intestinali nantu à chips intestinali o chips hibridi (passi 6-9), (iv) induzione di morfogenesi 3D in vitro (passu 10) è (v)) per caratterizà a microstruttura epiteliale 3D (passi 11-24). morfogenesi teliale à cuntrolli spaziali, temporali, cundiziunali, o prucedurali.
Avemu utilizatu duie piattaforme di cultura diverse: gut-on-a-chip cù canali dritti o canali convoluted non lineari, o chips ibridi chì cuntenenu inserti Transwell (TW) in un dispositivu microfluidic, fabbricatu cum'è descrittu in Box 1, è u passu 1 -5 "Device Fabrication" mostra i passi principali per fà un unicu chip o un chip ibridu "Culture of Human Cells organocoidi o testi di cellule intestinali umane. ) è a prucedura di cultura utilizata in stu protokollu "Morfogenesi in vitro" mostra i passi generali in quale Caco-2 o cellule epiteliali derivate da organoidi sò cultivate nantu à un chip intestinali o nantu à inserti Transwell di un chip hibridu, seguita da induzione di morfogenesi 3D è a furmazione di una struttura epiteliale carattarizzata. in a carattarizazione di differenziazione cellula, studii di fisiologia di l'intestinu, stabilimentu di l'ecosistemi di u microbioma ospite, è mudeli di malatie.Immagini di immunofluorescenza in "Cell Differentiation" chì mostranu nuclei, F-actin è MUC2 espressi in a capa epiteliale 3D Caco-2 generata nantu à u chip intestinale.MUC2 signaling cells. A fisiologia mostra u mucus pruduciutu da a tintura per l'acidu sialic è i residui di N-acetilglucosamina cù l'agglutinina di germe di granu fluorescente. E duie imagine sovrapposte in "Co-Cultures Host-Microbe" mostranu co-culture rappresentative di microbioma-host in l'intestinu nantu à un chip. U pannellu di sinistra mostra a co-cultura di E. lial cells.The right panel mostra a localisation di GFP E. coli co-cultivatu cù 3D Caco-2 epithelial cells, seguita da immunofluorescence staining with F-actin (red) and nuclei (blue). Disease modelling illustrates healthy versus leaky gut in gut inflammation chips under physiology inflammation chips with physigenly PS, physiological LPS è batteri. cellule (per esempiu, PBMC;verde).Celluli Caco-2 sò stati cultivati ​​​​per stabilisce una capa epiteliale 3D.Barra di scala, 50 µm.Immagini in a fila di fondu: "Differentiazione di e cellule" adattatu cù permessu di riferimentu.2.Oxford University Press;Riproduce cù permessu di Ref.5.NAS;"Host-Microbe Co-Culture" adattatu cù permessu di ref.3.NAS;"Disease Modeling" adattatu cù permessu da riferimentu.5.NAS.
Sia i chip gut-on-chip è ibridi sò stati fabbricati cù repliche PDMS chì sò state smoldate da stampi di siliciu da litografia soft1,44 è modellate cù SU-8. U disignu di i microcanali in ogni chip hè determinatu da cunsiderà l'idrodinamica cum'è u stress di taglio è a pressione idrodinamica1,4,12. U gut-on-a-chip originale hè custituitu da un designu di microcanale parallelu (1,4,12). , hà evolutu in un gut-on-a-chip cumplessu (Extended Data Fig. 1b) chì include un paru di microcanale curve per induce un tempu di residenza di fluidu aumentatu, mudelli di flussu non lineari, è deformazione multiassiale di e cellule cultivate (Fig. 2a-f) 12.Quandu più cumplessu gut biomeccanica deve esse ricreate, a biomeccanica di u gut hè bisognu à esse ricreatu. voluted Gut-Chip induce ancu fermamente a morfogenesi 3D in un marcu di tempu simili cù un gradu simili di crescita epiteliale cumparatu cù u Gut-Chip originale, indipendentemente da u tipu di cellula cultivata.2a). Per fabricà l'intestinu nantu à un chip, a capa superiore di PDMS preparata hè stata ligata in sequenza à un film PDMS poroso è poi allinata cù a capa di PDMS inferiore per ligame irreversibile cù un trattamenti corona (Fig. 2b-f). Extended Data Fig. 2). U prucessu di bonding hè realizatu da u trattamentu di e superfici di a replica PDMS è di u vetru cù plasma d'ossigenu o trattamentu corona.Dopu a sterilizazione di u dispusitivu microfabricated attaccatu à u tubu di silicone, a stallazione di u dispusitivu hè stata pronta per realizà a morfogenesi 3D di l'epiteliu intestinali (Figura 2g).
a, Illustrazione schematica di a preparazione di parti PDMS da stampi di silicone SU-8. A suluzione PDMS senza cura hè stata versata nantu à un stampu di siliciu (a sinistra), curata à 60 ° C (mezzu) è demolded (a destra). d, Una seria di ritratti di i cumpunenti PDMS superiore è inferiore è u dispusitivu intestinali assemblatu nantu à u chip.e, Schematicu di l'allinjamentu di i cumpunenti PDMS superiore, membrana è inferiore. Ogni strata hè irreversibilmente ligata da u trattamentu di plasma o corona. cultura cellula idica. U gut fabbricatu nantu à un chip assemblatu cù un tubu di silicone è a siringa hè stata posta nantu à un vetrinu. U chip device hè stata posta nantu à a tapa di una piastra di Petri 150 mm per processing.The binder hè utilizatu per chjude u tubu di silicone. ed in u chip hibridu per induce a morfogenesi intestinale 3D. U mediu hè perfusu attraversu microcanale sottu à a capa di cellula stabilita nantu à l'inseritu Transwell. Scala bar, 1 cm.h Reprinted with permission from reference.4.Elsevier.
In questu protokollu, a linea di cellula Caco-2 è l'organoidi intestinali sò stati utilizati com'è fonti epiteliali (Fig. 3a). I dui tipi di celluli sò stati cultivati ​​indipindente (Box 2 and Box 5) è usati per sementà i microcanali rivestiti di ECM di intestinu in chip o inserti Transwell. 50) in T-flasks sò colti per preparà sospensioni di cellule dissociate da u fluidu di tripsinizazione (box 2). Organoids intestinali umani da biopsie intestinali o resections chirurgichi sò stati cultivati ​​​​in cupole di scaffold Matrigel in piastre di 24 pozzi per sustene u microambientu strutturale. Hè stata supplementata ogni ghjornu, finu à chì l'organoidi crescenu à ~ 500 µm di diametru. lesion versus zone non-lesione) è u locu gastrointestinali in u trattu (per esempiu, duodenu, jejunum, ileum, cecum, colon, o rectum). Avemu furnitu un protokollu ottimizatu in Box 5 per cultivà l'organoidi di u colon (coloids) chì tipicamenti necessitanu concentrazioni più altu di morphogens cà l'organoidi intestinali.
a, Flussu di travagliu per l'induzione di a morfogenesi di l'intestinu in u chip intestinale. L'epiteliu intestinali umanu Caco-2 è l'organoidi intestinali sò usati in stu protokollu per dimustrà a morfogenesi 3D. E cellule epiteliali isolate sò state seminate in u dispositivu gut-on-a-chip preparatu (preparazione di chip). U flussu ical (AP) hè iniziatu è mantinutu per i primi 2 ghjorni (flussu, AP, D0-D2). U flussu basolaterale (BL) hè ancu iniziatu cù movimenti di stretching ciclicu (stretch, flussu, AP è BL) quandu hè furmatu un monolayer 2D cumpletu. A morfogenesi 3D intestinale hè accaduta spontaneamente dopu à 5 ghjorni di cultura microfluogenesi, camorfogenesi D, cuntrastu d'imaghjini di microfluogenesi di ca-morfogenesi D. ogni passu sperimentale o puntu di tempu (graficu à barre, 100 µm). Quattru diagrammi schematici illustranu e cascate currispondenti di morfogenesi intestinale (in cima à destra). I frecce tratteggiate in u schema rapprisentanu a direzzione di u flussu di fluidu. layer (destra).c, Vista frontale horizontale di Caco-2 3D stabilitu, claudin (ZO-1, rossu) è membrani di bordu di spazzola cuntinuu marcati F-actin (verde) è nuclei (blu) Immunofluorescenza visualizazione confocale di cellule epiteliali nantu à chips intestinali. d nantu à un chip ottenutu da a microscopia di cuntrastu di fasi in i ghjorni 3, 7, 9, 11 è 13. L'inseritu (in cima à destra) mostra l'altu ingrandimentu di l'imaghjini furniti.e, microfotografia DIC di l'epiteliu 3D organoide stabilitu in l'intestinu nantu à a fetta presa u ghjornu 7.f, Overlaid immunofluorescence cells staminali 5;magenta), cellule caliciforme (MUC2; verde), F-actina (grigio) e nuclei (cian) cresciuti su chips intestinali per 3 giorni, rispettivamente (Left) e 13-day (medio) organoidi in u stratu epiteliale. id epithelium stabilitu in l'intestinu nantu à un chip da staining a membrana plasma cun tintura CellMask (a diritta) u ghjornu 13 di a cultura. A barra di scala hè 50 μm, salvu altrimenti dichjaratu.b Reprinted with permission from reference.2.Oxford University Press;c Adattatu cù permessu di Reference.2.Oxford University Press;e è f adattatu cù permessu per riferimentu.12 Sutta Creative Commons License CC BY 4.0.
In l'intestinu nantu à un chip, hè necessariu di mudificà a superficia idrofobica di a membrana porosa PDMS per un rivestimentu ECM successu. In questu protocolu, applichemu dui metudi diffirenti per mudificà l'idrofobicità di membrane PDMS. A cultura idica di l'epiteliu organoide richiede una funziunalità di a superficia chimica per ottene una deposizione efficiente di proteine ​​​​ECM applicando in sequenza polietilenimina (PEI) è glutaraldeide à i microcanali PDMS. Dopu a mudificazione di a superficia, e proteine ​​​​ECM sò state dipositate per copre a superficia PDMS funzionalizzata è poi introdotte in l'epiteliu di l'organoidi isolati, i microfluidi sò iniziati solu da a cultura di cellule organoidi. u mediu in u microcanale superiore finu à chì e cellule formanu un monolayer cumpletu, mentre chì u microcanale inferiore mantene e cundizioni statiche. Stu metudu ottimizatu per l'attivazione di a superficia è u revestimentu ECM permette l'attaccamentu di l'epiteliu organoide per induce a morfogenesi 3D nantu à a superficia PDMS.
I culturi Transwell necessitanu ancu un rivestimentu ECM prima di a semina di e cellule;Tuttavia, i culturi Transwell ùn anu micca bisognu di passi di pretrattamentu cumplessi per attivà a superficia di inserti porosi. Per a crescita di cellule Caco-2 in inserti Transwell, u rivestimentu ECM nantu à inserti porosi accelera l'attaccamentu di cellule Caco-2 dissociate (<1 ora) è a furmazione di barriera di giunzione stretta (<1-2 ghjorni). superficia di a membrana (<3 h) è mantinutu finu à chì l'organoidi formanu un monolayer cumpletu cù l'integrità di a barriera. I culturi Transwell sò realizati in platti 24 pozzi senza l'usu di chips hibridi.
A morfogenesi in vitro 3D pò esse iniziata da applicà u flussu di fluidu à l'aspettu basolaterale di una strata epiteliale stabilita. In l'intestinu nantu à un chip, a morfogenesi epiteliale hà iniziatu quandu u mediu hè stata perfusa in i microcanali superiori è inferiori (Fig. 3a). As prima descritta, hè criticu per intruduce u flussu di fluidu in l'inferiore (direzzione basolaterale continued inibizione). nutrienti è serum à e cellule ligati à e membrane porose è generanu stress di taglio luminale, avemu tipicamente applicà un flussu duale in l'intestinu nantu à un chip.In chips hibridi, inserti Transwell chì cuntenenu monolayers epiteliali sò stati inseriti in i chips hibridi. Allora, u mediu hè stata appiicata sottu à u latu basolaterale di l'inserzione Transwell porosa attraversu u microchannel.
E caratteristiche morfologiche di strati epiteliali 3D microengineered ponu esse analizate appiicando diverse modalità di imaging, cumprese microscopia di cuntrastu di fase, microscopia di cuntrastu di interferenza differenziale (DIC), SEM, o microscopia confocale di immunofluorescenza (Figure 3 è 4). E à a trasparenza ottica di PDMS è di film di poliester, sia e piattaforme gut-on-a-chip sia ibride di chip ponu furnisce l'imaghjini in situ in tempu reale senza a necessità di sezionamentu o disassemblamentu di u dispusitivu. -100 è 2% (wt / vol) ) albumina di serum bovina (BSA), in ordine. A seconda di u tipu di cellula, ponu esse aduprati diversi fissativi, permeabilizatori è agenti di bloccu. Anticorpi primari chì miranu à i marcatori di cellula o regione dipendente da u lignamentu sò usati per mette in risaltu e cellule immobilizzate in situ nantu à u chip, seguite da anticorpi secondari (p.e. -phenylene) indole, DAPI) o F-actin (per esempiu, fluorescently labelled phalloidin). L'imaging live basatu in fluorescenza pò ancu esse realizatu in situ per detectà a produzzione di mucus (Fig.1, "Cell differentiation" è "Gut physiology"), culunizazione aleatoria di e cellule microbiche (Fig. 1, "Host-microbe co-culture"), u reclutamentu di cellule immunitarie (Fig. 1, 'Disease Modeling') o i contorni di a morfologia epiteliale 3D (Fig. 3c, u When4byer, u When4byer, u When4byer à u chip, u When4byer, u When4byer à u lapper). 2, a morfologia epiteliale 3D è ancu i microvilli nantu à u bordu di u spazzole apical pò esse visualizatu da SEM (Fig. 3b). L'espressione di i marcatori di differenziazione pò esse valutata da eseguendu PCR5 quantitative o sequenza di RNA unicellulare. investitu da tripsinizazione è dopu utilizatu per l'analisi moleculare o genetica.
a, Flussu di travagliu per l'induzione di a morfogenesi intestinale in un chip hibridu. Caco-2 è organoidi intestinali sò usati in questu protocolu per dimustrà a morfogenesi 3D in una piattaforma di chip hibridu. Cellule epiteliali dissociate sò state seminate in inserti Transwell preparati (preparazione TW; vede a figura sottu). W culture).Dopu 7 ghjorni, un unicu insertu Transwell chì cuntene una monolayer 2D di cellule epiteliali hè stata integrata in un chip hibridu per intruduce un flussu basolaterale (Flow, BL), chì infine hà purtatu à a generazione di una strata epiteliale 3D (morfogenesi). .The schematics in i strati suprani illustrate a cunfigurazione spirimintali per ogni passu.b, Chips Hybrid (schematica manca) pò purtà à morphogenesis 3D di cellule epiteliali organoid cù vista microscopy confocal top-down pigliata à differente pusizioni Z (superior, mediu, è bassu);vede schema destra e linee punteggiate corrispondenti).mostrava caratteristiche morfologiche evidenti. F-actina (ciano), nucleo (grigio).c, Micrografie confocali a fluorescenza (vista angolata 3D) di cellule epiteliali derivate da organoidi coltivate in Transwell statico (TW; inserito in una casella tratteggiata bianca) versus chip ibrido (più grande colpo completo) paragunando 2D versus viste incrociate in 3D verticali rispettivamente. pper right corner; "XZ") mostra ancu e caratteristiche 2D è 3D. Barra di scala, 100 µm.c Ristampata cù permessu di riferimentu.4.Elsevier.
I cuntrolli ponu esse preparati cultivendu e stesse cellule (Caco-2 o cellule epiteliali organoidi intestinali) in monostrati bidimensionali in cundizioni di cultura statica cunvinziunali. In particulare, l'esaurimentu di nutrienti pò esse risultatu da a capacità di volume limitata di i microcanali (vale à dì ~ 4 µL in u canali superiore nantu à u disignu originale di chip di gut-chip).
U prucessu di litografia suave deve esse realizatu in una stanza pulita. Per ogni strata nantu à u chip (strati superiori è inferiori è membrani) è chips hibridi, diverse fotomaschere sò state aduprate è fabbricate nantu à wafers di siliciu separati perchè l'altezza di i microcanali eranu diverse. µm.
Pone un wafer di silicio di 3 inch in un piattu cù acetone. Gira a piastra per 30 seconde, poi secca l'ostia à l'aria. Trasferisce l'oblea à una piastra cù IPA, poi spin u platu per 30 s per pulisce.
Una suluzione di piranha (mistura di perossu di l'idrogenu è di l'acidu sulfuricu cuncintratu, 1: 3 (vol / vol)) pò esse aduprata opcionalmente per maximizà l'eliminazione di residui organici da a superficia di l'oblea di siliciu.
A suluzione di Piranha hè estremamente corrosiva è genera calore. Precauzioni di sicurezza supplementari sò necessarie. Per a eliminazione di i rifiuti, permette a suluzione per rinfriscà è trasfiriri à un cuntainer di rifiuti puliti è seccu. Aduprate cuntenituri secundarii è etichettate currettamente i contenitori di rifiuti.
Dehydrate l'oblete mettenduli nantu à una piastra calda di 200 ° C per 10 min.Dopu a desidratazione, l'ostia hè stata scuzzulata cinque volte in l'aria per rinfriscà.
Pour ~ 10 g di photoresist SU-8 2100 nantu à u centru di l'oblea di silicone pulita. Aduprate pinzette per sparghje a fotoresist in modu uniforme nantu à u wafer. Occasionally mette l'ostia nantu à una piastra calda di 65 ° C per fà u photoresist menu appiccicosu è più faciule da sparghje.
SU-8 hè stata distribuita uniformemente nantu à a wafer cù l'esecuzione di spin coating. Programmà una rotazione entrante di u SU-8 per 5-10 s per propagare à 500 rpm à una accelerazione di 100 rpm / s. yer di l'intestinu nantu à u chip; vede "Passi critichi" sottu) stabilitu à una accelerazione di 300 rpm / s 30 seconde à 1.200 rpm.
A vitezza di spin principale pò esse aghjustata secondu u spessore di destinazione di u mudellu SU-8 nantu à a wafer di siliciu.
Per fabricà mudelli SU-8 di 500 µm di altezza per a capa superiore di l'intestinu nantu à u chip, u spin coating è i passi di cuttura molle di sta Box (passi 7 è 8) sò stati ripetuti in sequenza (vede u passu 9) per pruduce dui strati di 250 µm Una strata spessa di SU-8, chì pò esse strata di sta esposizione alta µ0, facendu una strata di µ0 µ0 in una strata alta. .
Cuoce suavemente i wafers rivestiti SU-8 mettendu cù cura i wafers nantu à una piastra calda à 65 ° C per 5 min, dopu cambia l'impostazione à 95 ° C è incubate per 40 min addiziunali.
Per ottene una altezza di 500 μm di u mudellu SU-8 in u microcanale superiore, ripetite i passi 7 è 8 per generà dui strati SU-8 di 250 μm.
Utilizendu u UV Mask Aligner, eseguite una prova di lampada secondu l'istruzzioni di u fabricatore per calculà u tempu di esposizione di u wafer. (tempu d'esposizione, ms) = (dosa di esposizione, mJ/cm2)/(potenza di lampada, mW/cm2).
Dopu avè determinatu u tempu di esposizione, mette a fotomaschera nantu à u supportu di maschera di l'aligner di maschera UV è mette a fotomaschera nantu à l'ostia rivestita SU-8.
Pone a superficia stampata di a fotomaschera direttamente nantu à u latu rivestitu di SU-8 di u wafer di siliciu per minimizzà a dispersione UV.
Espone l'ostia rivestita SU-8 è a fotomaschera verticalmente à 260 mJ / cm2 di luce UV per u tempu d'esposizione predeterminatu (vede u passu 10 di sta casella).
Dopu l'esposizione UV, i wafers di silicone rivestiti SU-8 sò stati cotti à 65 ° C per 5 min è 95 ° C per 15 min in ogni piastra calda per fabricà mudelli cù una altezza di 200 μm. Estende u tempu post-bake à 95 ° C à 30 min per fabricà mudelli cù una altezza di 500 μm.
U sviluppatore hè versuto in un piattu di vetru, è u catturu di bicchione hè pusatu in u mischju di u sviluppatore su-8.000 di u vetru, utilizendu abbastanza per 25 minuti.
Risciacquare la muffa sviluppata con ~ 10 mL di sviluppatore fresco seguita da IPA spruzzando a soluzione usando una pipetta.
Pone a wafer in un purificatore di plasma è espone à u plasma di l'ossigenu (gas atmosfericu, pressione di destinazione 1 × 10−5 Torr, putenza 125 W) per 1,5 min.
Pone a wafer in un dessiccatore di vacuum cù un vetru di vetru à l'internu. Wafers è slides ponu esse posti fiancu à fiancu. Se u dessiccatore di vacuum hè divisu in parechje strati da una piastra, mette i diapositive in a camera inferiore è i wafers in a camera superiore. è applicà u vacuum per silanizazione.
Scongelare un vial di cellule Caco-2 congelate in un bagnu d'acqua à 37 ° C, dopu trasfirì e cellule scongelate in un flask T75 chì cuntene 15 mL di mediu Caco-2 prewarmed à 37 ° C.
Per passà e cellule Caco-2 à ~ 90% di cunfluenza, prima calda u mediu Caco-2, PBS, è 0,25% tripsina / 1 mM EDTA in un bagnu d'acqua à 37 ° C.
Aspirate u mediu per l'aspirazione di vacuum.Wash cells two volte cù 5 mL di PBS caldu ripetendu l'aspirazione di vacuum è aghjunghjendu PBS frescu.