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L'evoluzione di i parassiti microbiani implica una contraazzione trà a selezzione naturale, chì face i parassiti per migliurà, è a deriva genetica, chì face chì i parassiti pèrdite geni è accumule mutazioni deleterious.Quì, per capisce cumu si sta cuntrazione si verifica à a scala di una sola macromolecula, discrimu a struttura crio-EM di u ribosoma di Encephalitozoon cuniculi, un urganismu eucarioticu cù unu di i genomi più chjuchi in natura.A riduzzione estrema di rRNA in i ribosomi di E. cuniculi hè accumpagnata da cambiamenti strutturali senza precedente, cum'è l'evoluzione di linkers rRNA fusi precedentemente scunnisciuti è rRNA senza bulges.Inoltre, u ribosoma di E. cuniculi hà sopravvissutu à a perdita di frammenti di rRNA è di proteine ​​​​sviluppendu a capacità d'utilizà e molécule chjuche cum'è imitazioni strutturali di frammenti di rRNA è di prutezione degradati.In generale, mostramu chì e strutture molecolari longu pensate per esse ridutte, degenerate è sughjette à mutazioni debilitanti anu una quantità di miccanismi compensatori chì li mantenenu attivi malgradu cuntrazzioni molecolari estremi.
Perchè a maiò parte di i gruppi di parassiti microbiani anu strumenti moleculari unichi per sfruttà i so ospiti, spessu avemu da sviluppà diverse terapie per i diversi gruppi di parassiti1,2.In ogni casu, una nova evidenza suggerisce chì certi aspetti di l'evoluzione di parassiti sò cunvergenti è largamente prevedibili, chì indicanu una basa potenziale per intervenzioni terapeutiche largu in parassiti microbiali3,4,5,6,7,8,9.
I travaglii precedenti anu identificatu una tendenza evolutiva cumuni in i parassiti microbichi chjamati riduzzione di genoma o decadenza di genoma10,11,12,13.A ricerca attuale mostra chì quandu i microrganismi rinuncianu à u so modu di vita libera è diventanu parassiti intracellulari (o endosimbionti), i so genomi subiscenu metamorfosi lenti, ma stupendenti per milioni d'anni9,11.In un prucessu cunnisciutu cum'è decadimentu di u genoma, i parassiti microbiani accumulanu mutazioni deleteri chì trasformanu assai geni prima impurtanti in pseudogeni, chì portanu à una perdita graduale di geni è un colapsu mutazionale14,15.Stu colapsu pò distrughje finu à u 95% di i geni in l'organisimi intracellulari più antichi paragunatu à e spezie di vita libera strettamente ligati.Cusì, l'evuluzione di i parassiti intracellulari hè un tug-of-war trà duie forze opposte: a selezzione naturale darwiniana, chì porta à a migliione di i parassiti, è u colapsu di u genoma, ghjittandu i parassiti in l'obliu.Cume u parassitu hà sappiutu esce da questa guerra è mantene l'attività di a so struttura moleculare ùn hè micca chjaru.
Ancu s'è u miccanisimu di a decadenza di u genoma ùn hè micca cumplettamente capitu, pare chì accadite principalmente per via di una deriva genetica frequente.Perchè i parassiti campanu in pupulazioni chjuche, asessuali è geneticamente limitate, ùn ponu micca eliminà in modu efficace e mutazioni deleteriu chì a volte accade durante a replicazione di l'ADN.Questu porta à l'accumulazione irreversibile di mutazioni dannosi è a riduzzione di u genoma parasite.In u risultatu, u parasite ùn perde micca solu i geni chì ùn sò più necessarii per a so sopravvivenza in l'ambiente intracellulare.Hè l'incapacità di e populazioni di parassiti per eliminà in modu efficace e mutazioni deleterius sporadichi chì face chì queste mutazioni s'acumulanu in tuttu u genoma, cumpresi i so geni più impurtanti.
Gran parte di a nostra cunniscenza attuale di a riduzzione di u genoma hè basata solu nantu à paraguni di sequenze di genoma, cù menu attenzione à i cambiamenti in molécule attuali chì eseguinu funzioni di mantenimentu è serve cum'è putenziali miri di droga.Studi comparativi anu dimustratu chì a carica di mutazioni microbiche intracellulari deleterii pare chì predispone i proteini è l'acidi nucleici à misfold è aggregate, facenduli più dipindenti di chaperone è ipersensibili à u calore19,20,21,22,23.Inoltre, diversi parassiti - l'evoluzione indipindenti à volte siparati da quant'è 2,5 miliardi d'anni - hà sperimentatu una perdita simile di centri di cuntrollu di qualità in a so sintesi di proteine ​​​​5,6 è i miccanismi di riparazione di DNA24.In ogni casu, pocu hè cunnisciutu di l'impattu di u stilu di vita intracellulare nantu à tutte l'altri pruprietà di macromolecule cellulari, cumpresa l'adattazione moleculare à una carica crescente di mutazioni deleteriu.
In questu travagliu, per capisce megliu l'evoluzione di e proteine ​​​​è l'acidi nucleici di i microorganismi intracellulari, avemu determinatu a struttura di ribosomi di u parasite intracellulare Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi hè un urganismu fungus-like chì appartene à un gruppu di microsporidia parassiti chì anu genomi eucarioti inusualmente chjuchi è sò dunque utilizati com'è organismi mudellu per studià a decadenza di u genoma25,26,27,28,29,30.Recentemente, a struttura di ribosomi cryo-EM hè stata determinata per genomi moderatamente ridotti di Microsporidia, Paranosema locustae è Vairimorpha necatrix31,32 (~ 3.2 Mb genoma).Queste strutture suggerenu chì una certa perdita di l'amplificazione di rRNA hè compensata da u sviluppu di novi cuntatti trà e proteini ribosomi vicini o l'acquistu di novi proteini ribosomiali msL131,32.Species Encephalitozoon (genoma ~ 2.5 million bp), inseme cù u so parente più vicinu Ordospora, dimustranu l'ultimu gradu di riduzzione di genoma in eucarioti - anu menu di 2000 geni codificatori di proteini, è hè previstu chì i so ribosomi ùn sò micca solu privi di frammenti di espansione di rRNA (rRNA frammenti di espansione di eucarioti) (rRNA frammenti di proteina ribosomiali) chì distinguenu ancu quattru frammenti di proteina ribosome ribosomali. s per via di a so mancanza di omologu in u genomu di E. cuniculi26,27,28.Dunque, avemu cunclusu chì u ribosoma E. cuniculi pò revelà strategie scunnisciute prima per l'adattazione moleculare à a decadenza di u genoma.
A nostra struttura crio-EM rapprisenta u più chjucu ribosoma citoplasmaticu eucarioticu per esse carattarizatu è furnisce una visione di cumu l'ultimu gradu di riduzzione di u genoma affetta a struttura, l'assemblea è l'evoluzione di a machina moleculare chì hè integrale à a cellula.Avemu trovu chì u ribosoma E. cuniculi viola assai di i principii largamente cunservati di u plegamentu di l'RNA è l'assemblea di ribosomi, è scupertu una nova proteina ribosomiale scunnisciuta prima.Abbastanza inespettatu, dimustramu chì i ribosomi di microsporidia anu evolutu a capacità di unisce e molécule chjuche, è ipotisate chì i truncazioni in l'ARNr è e proteine ​​​​inducenu innovazioni evolutive chì ponu infine cunferisce qualità utili à u ribosoma.
Per migliurà a nostra cunniscenza di l'evoluzione di e proteine ​​​​è l'acidi nucleici in l'organisimi intracellulari, avemu decisu di isolà e spore di E. cuniculi da i culturi di cellule di mammiferi infettati per purificà i so ribosomi è determinà a struttura di sti ribosomi.Hè difficiuli di ottene un gran numaru di microsporidia parassiti perchè microsporidia ùn pò micca esse cultivatu in un mediu nutriente.Invece, crescenu è si riproducenu solu in a cellula ospite.Dunque, per ottene a biomassa di E. cuniculi per a purificazione di ribosomi, avemu infettatu a linea di cellula renale di mammiferi RK13 cù spore di E. cuniculi è cultivate queste cellule infettate per parechje settimane per permette à E. cuniculi di cultivà è multiplicà.Utilizendu una monolayer cellula infettata di circa a mità di metru quadru, pudemu purificà circa 300 mg di spori di Microsporidia è l'utilizanu per isolà i ribosomi.Dopu avemu disturbatu e spore purificate cù perle di vetru è isolatu i ribosomi grezzi utilizendu a fraccionazione graduale di polietilenglicol di i lisati.Questu ci hà permessu di ottene circa 300 µg di ribosomi crudi di E. cuniculi per l'analisi strutturale.
Dopu avemu cullatu l'imaghjini crio-EM utilizendu i campioni di ribosomi risultanti è trasfurmate queste imagine cù maschere chì currispondenu à a grande subunità ribosomiale, a testa di a subunità chjuca è a subunità chjuca.Duranti stu prucessu, avemu cullatu l'imaghjini di circa 108,000 particelle ribosomiali è l'imaghjini crio-EM calculate cù una risoluzione di 2.7 Å (Figura Supplementaria 1-3).Dopu avemu utilizatu l'imaghjini cryoEM per mudificà rRNA, proteina ribosomali è fattore di hibernazione Mdf1 assuciatu cù ribosomi E. cuniculi (Fig. 1a, b).
una Struttura di u ribosoma E. cuniculi in cumplessu cù u fattore di hibernazione Mdf1 (pdb id 7QEP).b Map of hibernation factor Mdf1 assuciatu cù u ribosoma E. cuniculi.c Mappa di a struttura secondaria paragunendu l'ARNr recuperatu in spezie Microsporidian à strutture ribosomiali cunnisciute.I pannelli mostranu a situazione di i frammenti di rRNA amplificati (ES) è i siti attivi di ribosomi, cumpresu u situ di decodificazione (DC), u ciclu di sarcinicin (SRL), è u centru di peptidyl transferase (PTC).d A densità elettronica chì currisponde à u centru di peptidyl transferase di u ribosoma di E. cuniculi suggerisce chì stu situ cataliticu hà a listessa struttura in u parasite E. cuniculi è i so ospiti, cumpresu H. sapiens.e, f A densità elettronica currispundente di u centru di decodificazione (e) è a struttura schematica di u centru di decodificazione (f) indicanu chì E. cuniculi hà residui U1491 invece di A1491 (numerazione E. coli) in parechji altri eucarioti.Stu cambiamentu suggerisce chì E. cuniculi pò esse sensittivi à l'antibiotici chì miranu stu situ attivu.
In cuntrastu à e strutture stabilite prima di ribosomi V. necatrix è P. locustae (i dui strutture rapprisentanu a stessa famiglia di microsporidia Nosematidae è sò assai simili à l'altri), 31,32 E. cuniculi ribosomes sottumettenu numerosi prucessi di frammentazione di rRNA è di prutezione.Ulteriore denaturazione (Figura supplementari 4-6).In rRNA, i cambiamenti più impressiunanti includenu a perdita completa di u fragmentu di rRNA 25S amplificatu ES12L è a degenerazione parziale di l'elice h39, h41 è H18 (Fig. 1c, Supplementary Fig. 4).Trà e proteine ​​​​ribosomiali, i cambiamenti più impurtanti includenu a perdita completa di a proteina eS30 è l'accortamentu di e proteine ​​​​eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, è eS7 (Figure supplementari 4, 5).
Cusì, a riduzzione estrema di i genomi di e spezie Encephalotozoon / Ordospora hè riflessa in a so struttura ribosomi: E. cuniculi ribosomes sperienze a perdita più drammatica di cuntenutu di prutezione in ribosomi citoplasmatici eucariotichi sottumessi à carattarizazione strutturale, è ùn anu mancu quelli rRNA è i frammenti di proteina chì sò ancu largamente conservati in u duminiu di trè eukaryotes.A struttura di u ribosoma di E. cuniculi furnisce u primu mudellu molekulari per questi cambiamenti è palesa l'eventi evoluzione chì sò stati trascurati da a genomica comparativa è studi di a struttura biomolecular intracellulare (Figura Supplementaria 7).Quì sottu, descrivimu ognuna di questi avvenimenti cù e so probabili origini evolutive è u so impattu potenziale nantu à a funzione ribosomi.
Dopu avemu trovu chì, in più di i grandi tronchi di rRNA, i ribosomi di E. cuniculi anu variazioni di rRNA in unu di i so siti attivi.Ancu s'ellu u centru di peptidyl transferase di u ribosoma E. cuniculi hà a listessa struttura cum'è l'altri ribosomi eucarioti (Fig. 1d), u centru di decodificazione differisce per a variazione di sequenza à u nucleotide 1491 (E. coli numerazione, Fig. 1e, f).Questa osservazione hè impurtante perchè u situ di decodificazione di i ribosomi eucarioti tipicamente cuntene residui G1408 è A1491 cumparatu cù i residui di tipu battìricu A1408 è G1491.Questa variazione sottumette a diversa sensibilità di i ribosomi battìrichi è eucarioti à a famiglia di l'aminoglicoside di antibiotici ribosomiali è altre molécule chjuche chì miranu à u situ di decodificazione.À u situ di decodificazione di u ribosoma di E. cuniculi, u residuu A1491 hè statu rimpiazzatu cù U1491, potenzalmentu creendu una interfaccia di ubligatoriu unica per e molécule chjuche destinate à stu situ attivu.A listessa variante A14901 hè ancu presente in altri microsporidia cum'è P. locustae è V. necatrix, chì suggerenu chì hè diffusa trà e spezie di microsporidia (Fig. 1f).
Perchè i nostri campioni di ribosomi di E. cuniculi sò stati isolati da spori metabolicamente inattivi, avemu pruvatu a mappa cryo-EM di E. cuniculi per u ligame ribosomi precedentemente descrittu in condizioni di stress o di fame.Fattori di l'hibernazione 31,32,36,37, 38. Cumpariscemu a struttura stabilita previamente di u ribosoma hibernante cù a mappa cryo-EM di u ribosoma E. cuniculi.Per docking, i ribosomi di S. cerevisiae sò stati utilizati in cumplessu cù u fattore di hibernazione Stm138, i ribosomi di locusta in cumplessu cù u factor Lso232, è i ribosomi di V. necatrix in cumplessu cù i fatturi Mdf1 è Mdf231.À u listessu tempu, avemu trovu a densità crio-EM currispundenti à u fattore di restu Mdf1.Simile à Mdf1 ubligatoriu à u ribosome V. necatrix, Mdf1 ligami dinù à u ribosome E. cuniculi, induve si blucca u situ E di u ribosome, forsi aiutanu à fà ribosomes disponibile quandu spores parasite addiventanu metabolically inattivu nantu à inactivation corpu (Figura 2).).
Mdf1 blocks u situ E di u ribosome, chì pare à aiutà inactivate u ribosome quandu spores parasite diventa metabolicamenti inattivi.In a struttura di u ribosoma E. cuniculi, truvamu chì Mdf1 forma un cuntattu prima scunnisciutu cù u ribosomu L1, a parte di u ribosoma chì facilita a liberazione di tRNA deacylate da u ribosoma durante a sintesi di prutezione.Questi cuntatti suggerenu chì Mdf1 si dissocia da u ribosoma utilizendu u stessu mecanismu cum'è tRNA deacetylated, chì furnisce una spiegazione pussibule per cumu u ribosoma elimina Mdf1 per riattivare a sintesi di prutezione.
Tuttavia, a nostra struttura hà revelatu un cuntattu scunnisciutu trà Mdf1 è a gamba di ribosoma L1 (a parte di u ribosoma chì aiuta à liberà tRNA deacylate da u ribosoma durante a sintesi di prutezione).In particulare, Mdf1 usa i stessi cuntatti cum'è u segmentu di u coddu di a molécula di tRNA deacylate (Fig. 2).Stu mudellu moleculare scunnisciutu prima hà dimustratu chì Mdf1 si dissocia da u ribosoma utilizendu u listessu mecanismu cum'è tRNA deacetylated, chì spiega cumu u ribosoma elimina stu fattore di hibernazione per riattivare a sintesi di prutezione.
Quandu custruì u mudellu di rRNA, avemu trovu chì u ribosoma E. cuniculi hà anormally folded fragments rRNA, chì avemu chjamatu rRNA fused (Fig. 3).In i ribosomi chì spannu i trè duminii di a vita, l'rRNA si piega in strutture in quale a maiò parte di l'rRNA basa o pari di basi è si piegate l'una cù l'altru o interagisce cù e proteine ​​​​ribosomiali38,39,40.In ogni casu, in i ribosomi di E. cuniculi, l'ARNr parenu violà stu principiu di plegamentu cunvertisce una parte di e so hélices in regioni rRNA unfolded.
Structure of the H18 25S rRNA helix in S. cerevisiae, V. necatrix, è E. cuniculi.Di genere, in i ribosomi chì copre i trè domini di a vita, stu linker si avvolge in una elica di RNA chì cuntene da 24 à 34 residui.In Microsporidia, in cuntrastu, stu linker rRNA hè gradualmente ridutta à dui linkers ricchi di uridine monocatena chì cuntenenu solu 12 residues.A maiò parte di sti residui sò esposti à solventi.A figura mostra chì i microsporidia parassiti parenu viole i principii generali di plegamentu di rRNA, induve e basi di rRNA sò generalmente accoppiate à altre basi o implicate in interazzione rRNA-proteina.In i microsporidia, certi frammenti di rRNA piglianu un pliu sfavorevule, in quale l'antica helix di rRNA diventa un fragmentu unifilaru allungatu quasi in linea dritta.A prisenza di sti rigioni inusual permette à i microsporidia rRNA di ligà frammenti di rRNA distanti utilizendu un numeru minimu di basi RNA.
L'esempiu più impurtante di sta transizione evolutiva pò esse osservatu in l'helix H18 25S rRNA (Fig. 3).In spezie da E. coli à l'omu, i basi di sta helix rRNA cuntenenu 24-32 nucleotides, furmendu una helix ligeramente irregulare.In strutture ribosomali identificate previamente da V. necatrix è P. locustae,31,32 i basi di l'helix H18 sò parzialmente uncoiled, ma l'accoppiamentu di basi di nucleotide hè cunservatu.Tuttavia, in E. cuniculi stu frammentu di rRNA diventa i linkers più brevi 228UUUUUU232 è 301UUUUUUUU307.A cuntrariu di i frammenti tipici di rRNA, questi linkers ricchi di uridine ùn si stendenu o facenu un cuntattu estensivu cù e proteine ​​​​ribosomiali.Invece, adopranu strutture aperte da solventi è cumpletamente spiegate in quale i filamenti di rRNA sò estesi quasi dritti.Questa cunfurmazione allungata spiega cumu E. cuniculi usa solu 12 basi di RNA per riempie u gap 33 Å trà l'elice di rRNA H16 è H18, mentri àutri spezie necessitanu almenu duie volte di basa di rRNA per riempie u spaziu.
Cusì, pudemu dimustrà chì, attraversu un plegamentu energeticamente sfavorevule, i microsporidi parassiti anu sviluppatu una strategia per cuntrattà ancu quelli segmenti di rRNA chì restanu largamente cunservati in tutte e spezie in i trè duminii di a vita.Apparentemente, accumulendu mutazioni chì trasformanu l'elice di rRNA in ligami poli-U brevi, E. cuniculi pò furmà frammenti di rRNA inusual chì cuntenenu pocu nucleotidi pussibule per a ligazione di frammenti di rRNA distali.Questu aiuta à spiegà cumu i microsporidia anu ottenutu una riduzione drammatica in a so struttura moleculare di basa senza perde a so integrità strutturale è funziunale.
Una altra caratteristica inusual di E. cuniculi rRNA hè l'apparizione di rRNA senza thickenings (Fig. 4).Bulges sò nucleotidi senza pari di basi chì si torcenu fora di l'elica di RNA invece di ammuccià in questu.A maiò parte di e protrusioni di rRNA agisce cum'è adesivi molecolari, aiutendu à unisce e proteine ​​​​ribosomali adiacenti o altri frammenti di rRNA.Arcuni di i bulges agisce cum'è cerniere, chì permettenu l'helix di rRNA per flexione è plegà in modu ottimale per a sintesi di prutezione produtiva 41 .
a Una protrusione di rRNA (numerazione di S. cerevisiae) hè assente da a struttura ribosomi di E. cuniculi, ma presente in a maiò parte di l'altri eucarioti b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens è E. cuniculi ribosomi interni.i parassiti mancanu assai di l'antichi rigonfiamenti di rRNA altamente conservati.Questi ingrossi stabilizzanu a struttura di ribosomi;per quessa, a so assenza in i microsporidia indica una stabilità ridutta di u plegamentu di rRNA in parassiti microsporidia.A paraguni cù i steli P (L7 / L12 steli in bacteria) mostra chì a perdita di rRNA bumps a volte coincide cù l'apparizione di novi bumps vicinu à i bumps persi.L'helix H42 in l'ARNr 23S/28S hà un anticu bulge (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) stimatu à esse almenu 3,5 miliardi d'anni per via di a so prutezzione in trè duminii di vita.In i microsporidia, stu bulge hè eliminatu.Tuttavia, un novu bulge apparsu accantu à u bulge persu (A1306 in E. cuniculi).
Strikingly, avemu trovu chì E. cuniculi ribosomi mancanu a maiò parte di i rRNA bulges truvati in altre spezie, cumprese più di 30 bulges cunservati in altri eucarioti (Fig. 4a).Questa pèrdita elimina assai cuntatti trà e subunità ribosomiali è l'elice di rRNA adiacenti, à volte creanu grandi vuoti cavu in u ribosoma, facendu u ribosoma E. cuniculi più poroso cumparatu cù ribosomi più tradiziunali (Fig. 4b).In particulare, avemu trovu chì a maiò parte di sti bulges anu ancu persu in e strutture ribosomi di V. necatrix è P. locustae identificate previamente, chì sò stati trascurati da l'analisi strutturale precedente31,32.
A volte, a perdita di rRNA bulges hè accumpagnata da u sviluppu di novi bulges vicinu à u bulge persu.Per esempiu, u ribosomal P-stem cuntene un bulge U1208 (in Saccharomyces cerevisiae) chì hà sopravvissutu da E. coli à l'omu è hè dunque stimatu à esse 3,5 miliardi anni.Duranti a sintesi di prutezione, stu bulge aiuta à u P stem move trà cunfurmazioni aperti è chjusi in modu chì u ribosoma pò reclutà fatturi di traduzzione è trasmette à u situ attivu.In i ribosomi di E. cuniculi, questu ingrossu hè assente;in ogni modu, un novu ingrossu (G883) situatu solu in trè pariglii di basa pò cuntribuisce à a risturazione di a flessibilità ottimale di u P stem (Fig. 4c).
I nostri dati nantu à rRNA senza bulges suggerenu chì a minimizazione di l'rRNA ùn hè micca limitata à a perdita di elementi di rRNA nantu à a superficia di u ribosoma, ma pò ancu implica u nucleu di ribosoma, creendu un difettu moleculare specificu di parasite chì ùn hè micca statu descrittu in cellule di vita libera.spezie viventi sò osservati.
Dopu avè modellatu e proteine ​​​​ribosomiali canoniche è rRNA, avemu trovu chì i cumpunenti ribosomi cunvinziunali ùn ponu spiegà e trè parte di l'imaghjini crio-EM.Dui di sti frammenti sò picculi molécule in grandezza (Fig. 5, Supplementary Fig. 8).U primu segmentu hè sandwiched trà e proteini ribosomi uL15 è eL18 in una pusizioni generalmente occupata da u C-terminale di eL18, chì hè scurciatu in E. cuniculi.Ancu s'ellu ùn pudemu micca determinà l'identità di sta molécula, a dimensione è a forma di questa isula di densità hè spiegata bè da a prisenza di molécule di spermidine.U so ligame à u ribosoma hè stabilizatu da mutazioni specifichi di microsporidia in i proteini uL15 (Asp51 è Arg56), chì parenu aumentà l'affinità di u ribosoma per questa molecula petite, perchè permettenu à uL15 di imbulighjà a molècula petite in una struttura ribosomiale.Figura supplementaria 2).8, dati supplementari 1, 2).
Cryo-EM imaging chì mostra a prisenza di nucleotidi fora di u ribosu ligatu à u ribosoma di E. cuniculi.In u ribosoma E. cuniculi, stu nucleotide occupa u listessu locu cum'è u nucleotide 25S rRNA A3186 (numerazione Saccharomyces cerevisiae) in a maiò parte di l'altri ribosomi eucarioti.b In a struttura ribosomiale di E. cuniculi, stu nucleotide hè situatu trà e proteini ribosomi uL9 è eL20, stabilizendu cusì u cuntattu trà e duie proteine.Analisi di conservazione di sequenza cd eL20 trà e spezie di microsporidia.L'arbulu filogeneticu di e spezie Microsporidia (c) è l'allineamentu di sequenza multipla di a proteina eL20 (d) mostranu chì i residui di nucleotide-binding F170 è K172 sò cunsirvati in a più tipica Microsporidia, cù l'eccezzioni di S. lophii, cù l'eccezzioni di i primi ramificazioni Microsporidia, chì mantenenu l'estensione ES39L di ramificazione.e Sta figura mostra chì i residui di nucleotide-binding F170 è K172 sò prisenti solu in eL20 di u genoma di microsporidia altamente ridutta, ma micca in altri eucarioti.In generale, sti dati suggerenu chì i ribosomi microsporidiani anu sviluppatu un situ di ubligatoriu di nucleotidi chì pare chì unisce e molécule AMP è l'utilizanu per stabilizzà l'interazzione proteina-proteina in a struttura ribosomale.L'alta conservazione di stu situ di ubligatoriu in Microsporidia è a so assenza in altri eucarioti suggerisce chì stu situ pò furnisce un vantaghju di sopravvivenza selettiva per Microsporidia.Cusì, a tasca di legame di nucleotidi in u ribosoma di microsporidia ùn pare micca esse una caratteristica degenerata o una forma finale di degradazione di rRNA cum'è descritta prima, ma piuttostu una innuvazione evolutiva utile chì permette à u ribosoma di microsporidia unisce direttamente e piccule molecule, utilizenduli cum'è blocchi di costruzione moleculare.blocchi di costruzione per i ribosomi.Questa scuperta face chì u ribosoma microsporidia hè l'unicu ribosoma cunnisciutu di utilizà un solu nucleotide cum'è u so bloccu strutturale.f Via evolutiva ipotetica derivata da u legame di nucleotidi.
A seconda densità di pisu molekulari pocu hè situatu à l'interfaccia trà e proteini ribosomi uL9 è eL30 (Fig. 5a).Questa interfaccia hè stata descritta prima in a struttura di u ribosoma Saccharomyces cerevisiae cum'è un situ di legame per u nucleotide 25S di rRNA A3186 (parte di l'estensione ES39L rRNA)38.Hè statu dimustratu chì in i ribosomi degenerati di P. locustae ES39L, sta interfaccia unisce un nucleotide unicu scunnisciutu 31, è si assume chì questu nucleotide hè una forma finale ridutta di rRNA, in quale a durata di rRNA hè ~ 130-230 basi.ES39L hè ridutta à un solu nucleotide 32.43.I nostri imagine crio-EM sustene l'idea chì a densità pò esse spiegata da i nucleotidi.In ogni casu, a risuluzione più altu di a nostra struttura hà dimustratu chì questu nucleotide hè una molécula extraribosomale, possibbilmente AMP (Fig. 5a, b).
Dopu avemu dumandatu se u situ di ubligatoriu di i nucleotidi apparsu in u ribosoma di E. cuniculi o s'ellu esiste prima.Siccomu l'associazione di nucleotidi hè principalmente mediata da i residui Phe170 è Lys172 in a proteina ribosomiale eL30, avemu valutatu a cunservazione di questi residui in 4396 eucarioti rappresentativi.Cum'è in u casu di uL15 sopra, avemu trovu chì i residui Phe170 è Lys172 sò assai cunservati solu in Microsporidia tipica, ma assenti in altri eucarioti, cumpresi Microsporidia Mitosporidium è Amphiamblys atipici, in quale u frammentu di rRNA ES39L ùn hè micca ridutta 44, 4c.-e).
Inseme, sti dati sustene l'idea chì E. cuniculi è possibbilmente altri microsporidia canonichi anu evolutu l'abilità di catturà in modu efficiente un gran numaru di picculi metaboliti in a struttura di ribosomi per cumpensà a diminuzione di i livelli di rRNA è di prutezione.Fendu cusì, anu sviluppatu una capacità unica per unisce i nucleotidi fora di u ribosoma, dimustrendu chì e strutture molecolari parassitarie compensanu catturà abbundanti metaboliti chjuchi è l'utilizanu cum'è imitazioni strutturali di RNA degradati è frammenti di proteina..
A terza parte unsimulata di a nostra mappa crio-EM, truvata in a grande subunità ribosomiale.A risuluzione relativamente alta (2.6 Å) di a nostra mappa suggerisce chì sta densità appartene à e proteine ​​​​con combinazioni uniche di residui di grande catena laterale, chì ci hà permessu di identificà sta densità cum'è una proteina ribosomiale precedentemente scunnisciuta chì avemu identificatu cum'è hè stata chjamata msL2 (proteina specifica di Microsporidia L2) (metode, figura 6).A nostra ricerca d'omulugia hà dimustratu chì msL2 hè cunservatu in u clade Microsporidia di u genus Encephaliter è Orosporidium, ma assente in altre spezie, cumprese altri Microsporidia.In a struttura ribosomala, msL2 occupa una lacuna formata da a perdita di u rRNA ES31L allargatu.In questu vacu, msL2 aiuta à stabilizà u plegamentu di rRNA è pò cumpensà a perdita di ES31L (Figura 6).
a Densità Elettronica è mudellu di a proteina ribosomiale specifica di Microsporidia msL2 truvata in i ribosomi di E. cuniculi.b A maiò parte di i ribosomi eucarioti, cumpresu u ribosoma 80S di Saccharomyces cerevisiae, anu l'amplificazione di rRNA ES19L persa in a maiò parte di e spezie Microsporidian.A struttura stabilita prima di u ribosoma V. necatrix microsporidia suggerisce chì a perdita di ES19L in questi parassiti hè cumpensata da l'evoluzione di a nova proteina ribosomal msL1.In questu studiu, truvamu chì u ribosoma di E. cuniculi hà ancu sviluppatu una proteina mimica di RNA ribosomali supplementu cum'è una compensazione apparente per a perdita di ES19L.Tuttavia, msL2 (attualmente annotata cum'è l'ipotetica proteina ECU06_1135) è msL1 anu diverse origini strutturali è evolutive.c Questa scuperta di a generazione di proteine ​​​​ribosomiali msL1 è msL2 senza relazione evolutiva suggerisce chì, se i ribosomi accumulanu mutazioni preghjudizii in u so rRNA, ponu ottene livelli senza precedente di diversità di cumpusizioni ancu in un picculu sottogruppu di spezie strettamente ligati.Questa scuperta puderia aiutà à chjarificà l'origine è l'evoluzione di u ribosoma mitocondriale, chì hè cunnisciutu per u so rRNA assai ridutta è a variabilità anormale in a cumpusizioni di prutezione trà e spezie.
Dopu avemu paragunatu a proteina msL2 cù a proteina msL1 descritta prima, l'unica proteina ribosomiale specifica di microsporidia cunnisciuta truvata in u ribosoma V. necatrix.Vulemu pruvà se msL1 è msL2 sò evolutivamente ligati.U nostru analisi hà dimustratu chì msL1 è msL2 occupanu a stessa cavità in a struttura ribosomiale, ma anu strutturi primari è terziarii diffirenti, chì indicanu a so origine evolutiva indipendente (Fig. 6).Cusì, a nostra scuperta di msL2 furnisce evidenza chì gruppi di spezie eucarioti compacti ponu evoluzione indipindentamente proteine ​​​​ribosomiali strutturalmente distinte per cumpensà a perdita di frammenti di rRNA.Questa scuperta hè notevole in chì a maiò parte di i ribosomi eucarioti citoplasmatici cuntenenu una proteina invariante, cumprese a stessa famiglia di 81 proteini ribosomiali.L'apparizione di msL1 è msL2 in diversi cladi di microsporidia in risposta à a perdita di segmenti di rRNA estesi suggerisce chì a degradazione di l'architettura moleculare di u parassitu induce i parassiti à circà mutazioni compensatorii, chì ponu eventualmente purtà à a so acquisizione in diverse populazioni di parassiti.strutture.
Infine, quandu u nostru mudellu hè statu cumpletu, avemu paragunatu a cumpusizioni di u ribosoma E. cuniculi cù quella prevista da a sequenza di u genoma.Diversi proteini ribosomiali, cumpresi eL14, eL38, eL41 è eS30, si pensavanu prima chì mancavanu da u genomu di E. cuniculi per via di l'assenza apparente di i so omologu da u genomu di E. cuniculi.A perdita di parechje proteine ​​​​ribosomiali hè ancu prevista in a maiò parte di l'altri parassiti intracellulari è endosimbionti altamente ridotti.Per esempiu, ancu s'è a maiò parte di i batteri di vita libera cuntenenu a stessa famiglia di 54 proteini ribosomiali, solu 11 di queste famiglie di proteini anu omologu detectable in ogni genoma analizatu di battìri ristretti d'ospiti.In supportu di sta nuzione, una perdita di proteini ribosomali hè stata osservata sperimentalmente in V. necatrix è P. locustae microsporidia, chì ùn mancanu i proteini eL38 è eL4131,32.
Tuttavia, i nostri strutturi mostranu chì solu eL38, eL41 è eS30 sò veramente persu in u ribosoma di E. cuniculi.A proteina eL14 hè stata cunsirvata è a nostra struttura hà dimustratu perchè sta proteina ùn pò micca esse truvata in a ricerca di l'omologia (Fig. 7).In i ribosomi di E. cuniculi, a maiò parte di u situ di ubligatoriu di eL14 hè persa per a degradazione di l'ES39L amplificatu da rRNA.In l'absenza di ES39L, eL14 persu a maiò parte di a so struttura secundaria, è solu 18% di a sequenza eL14 era identica in E. cuniculi è S. cerevisiae.Questa povira preservazione di a sequenza hè rimarchevule perchè ancu Saccharomyces cerevisiae è Homo sapiens - urganismi chì anu evolutu à 1,5 miliardi d'anni l'una di l'altra - sparte più di 51% di i stessi residui in eL14.Questa perdita anomala di cunservazione spiega perchè E. cuniculi eL14 hè attualmente annotata cum'è a proteina putativa M970_061160 è micca cum'è a proteina ribosomiale eL1427.
è U ribosoma Microsporidia hà persu l'estensione ES39L rRNA, chì hà eliminatu parzialmente u situ di ubligatoriu di a proteina ribosomiale eL14.In assenza di ES39L, a proteina di microspore eL14 subisce una perdita di struttura secundaria, in quale l'ex α-helix di legame à l'ARNr degenera in una loop di lunghezza minima.b L'allineamentu di sequenza multipla mostra chì a proteina eL14 hè assai cunservata in spezie eucariote (identità di sequenza 57% trà lieviti è omologi umani), ma pocu cunservata è divergente in microsporidia (in quale micca più di 24% di i residui sò identici à l'omologu eL14).da S. cerevisiae o H. sapiens).Sta cunservazione di sequenza povira è a variabilità di a struttura secundaria spiega perchè l'omologu eL14 ùn hè mai statu trovu in E. cuniculi è perchè sta proteina hè pensata per esse persa in E. cuniculi.In cuntrastu, E. cuniculi eL14 hè stata annotata prima cum'è una proteina putativa M970_061160.Sta osservazione suggerisce chì a diversità di u genoma di i microsporidia hè oghji sopravvalutata : certi geni chì sò oghji pensati persi in i microsporidia sò in fattu cunservati, ancu s'è in forme assai differenziate ;invece, alcuni sò pensati à codificà i geni di microsporidia per e proteine ​​​​specifiche di vermi (per esempiu, l'ipotetica proteina M970_061160) in realtà codificanu per e proteini assai diverse truvate in altri eucarioti.
Questa scuperta suggerisce chì a denaturazione di rRNA pò purtà à una drammatica perdita di conservazione di sequenza in proteine ​​​​ribosomali adiacenti, rendendu queste proteine ​​​​indetectable per e ricerche d'omologia.Cusì, pudemu sopravvalutà u gradu attuale di degradazione molekulari in i picculi organismi di u genoma, postu chì alcune proteine ​​​​pensate per esse perse persiste in realtà, anche se in forme altamente alterate.
Cumu i parassiti ponu mantene a funzione di e so machini moleculari in cundizioni di riduzzione estrema di u genoma?U nostru studiu risponde à sta quistione discrittendu a struttura moleculare cumplessa (ribosoma) di E. cuniculi, un urganismu cù unu di i genomi eucarioti più chjuchi.
Hè cunnisciutu per quasi duie decennii chì e molécule di proteine ​​​​è di RNA in i parassiti microbiani sò spessu diffirenti da e so molécule omologu in spezie di vita libera, perchè ùn mancanu centri di cuntrollu di qualità, sò ridotti à 50% di a so dimensione in microbichi di vita libera, etc.parechje mutazioni debilitanti chì deterioranu u plegamentu è a funzione.Per esempiu, i ribosomi di l'urganismi di u genoma chjucu, cumpresi parechji parassiti intracellulari è endosimbionti, sò previsti per manca di parechje proteini ribosomiali è sin'à un terzu di nucleotidi rRNA paragunatu à e spezie di vita libera 27, 29, 30, 49. Tuttavia, a manera chì queste molécule funzionanu in u parassitu restanu comparativamente grande per mezu di u genu.
U nostru studiu mostra chì a struttura di macromolecule pò revelà parechji aspetti di l'evoluzione chì sò difficiuli d'estrattà da i studii genomici tradiziunali comparativi di parassiti intracellulari è altri urganismi ristritti d'ospiti (Figura supplementaria 7).Per esempiu, l'esempiu di a proteina eL14 mostra chì pudemu sopravalutà u gradu attuale di degradazione di l'apparatu molekulari in spezie parasitari.I parassiti encefalitisi sò avà criduti chì anu centinaie di geni specifichi di microsporidia.Tuttavia, i nostri risultati mostranu chì alcuni di questi geni apparentemente specifichi sò in realtà solu varianti assai diffirenti di geni chì sò cumuni in altri eucarioti.Inoltre, l'esempiu di a proteina msL2 mostra cumu trascuratemu e novi proteini ribosomiali è sottovalutemu u cuntenutu di machini molecolari parassiti.L'esempiu di picculi moleculi mostra cumu pudemu trascuratà l'innuvazioni più ingegnose in strutture molecolari parassiti chì ponu dà una nova attività biologica.
Inseme, questi risultati miglioranu a nostra cunniscenza di e differenze trà e strutture molecolari di l'organisimi ristretti à l'ospiti è i so contraparti in l'organisimi di vita libera.Mostremu chì e macchine molecolari, longu pensate per esse ridutte, degenerate è sottumesse à diverse mutazioni debilitanti, anu invece un inseme di caratteristiche strutturali inusuali sistematicamente trascurate.
Per d 'altra banda, i frammenti di rRNA non voluminosi è i frammenti fusi chì avemu trovu in i ribosomi di E. cuniculi suggerenu chì a riduzzione di u genoma pò cambià ancu quelli parti di a machina moleculare di basa chì sò cunservati in i trè duminii di a vita - dopu à quasi 3,5 miliardi d'anni.evoluzione indipendente di e spezie.
I frammenti di rRNA senza bulge è fusi in i ribosomi di E. cuniculi sò d'interessu particulari à a luce di studii previ di molécule di RNA in i batteri endosimbiotici.Per esempiu, in l'endosimbionte afide Buchnera aphidicola, l'ARNr è e molécule di tRNA sò stati dimustrati per avè strutture sensibili à a temperatura per via di a cumpusizioni A + T è una alta proporzione di coppie di basi non canoniche20,50.Questi cambiamenti in l'RNA, è ancu i cambiamenti in e molécule di prutezione, sò oghji pensati per esse rispunsevuli di l'overdependence di l'endosimbionti nantu à i partenarii è l'incapacità di l'endosimbionti per trasfirià u calore 21, 23 .Ancu s'è u rRNA di microsporidia parassita hà cambiamenti strutturalmente distinti, a natura di questi cambiamenti suggerisce chì a stabilità termale ridutta è a dipendenza più alta da e proteine ​​​​chaperone pò esse caratteristiche cumuni di molécule di RNA in organismi cù genomi ridotti.
Per d 'altra banda, i nostri strutturi mostranu chì i microsporidia parassiti anu evolutu una capacità unica di resiste à rRNA largamente conservati è frammenti di proteina, sviluppando l'abilità di utilizà metaboliti abbundanti è facilmente dispunibili cum'è mimici strutturali di rRNA degenerati è frammenti di proteina.Degradazione di a struttura moleculare..Questa opinione hè sustinuta da u fattu chì e molécule chjuche chì cumpensà a perdita di frammenti di prutezione in l'ARNr è ribosomi di E. cuniculi liganu à i residui specifichi di microsporidia in i proteini uL15 è eL30.Questu suggerisce chì u ligame di picculi molécule à i ribosomi pò esse un pruduttu di selezzione pusitiva, in quale mutazioni specifiche di Microsporidia in proteine ​​​​ribosomiali sò state scelte per a so capacità di aumentà l'affinità di ribosomi per i moléculi chjuchi, chì ponu purtà à l'organisimi ribosomi più efficaci.A scuperta palesa una innuvazione intelligente in a struttura molekulari di i parassiti microbiani è ci dà una megliu comprensione di cumu e strutture moleculari di parassiti mantenenu a so funzione malgradu l'evoluzione riduttiva.
Attualmente, l'identificazione di sti picculi molécule ùn hè micca chjaru.Ùn hè micca chjaru perchè l'apparizione di sti moléculi chjuchi in a struttura ribosomale differe trà e spezie di microsporidia.In particulare, ùn hè micca chjaru perchè u nucleotide ubligatoriu hè osservatu in i ribosomi di E. cuniculi è P. locustae, è micca in i ribosomi di V. necatrix, malgradu a prisenza di u residu F170 in i proteini eL20 è K172 di V. necatrix.Questa eliminazione pò esse causata da u residuu 43 uL6 (situatu vicinu à u saccu di ubligatoriu di nucleotide), chì hè a tirosina in V. necatrix è micca treonina in E. cuniculi è P. locustae.A catena laterale aromatica voluminosa di Tyr43 pò interferisce cù u ligame di nucleotidi per via di sovrapposizione sterica.In alternativa, l'eliminazione di nucleotidi apparenti pò esse dovutu à a bassa risuluzione di l'imaghjini crio-EM, chì impedisce u mudellu di V. necatrix ribosomal fragments.
Per d 'altra banda, u nostru travagliu suggerisce chì u prucessu di decadenza di u genoma pò esse una forza inventiva.In particulare, a struttura di u ribosoma E. cuniculi suggerisce chì a perdita di rRNA è i frammenti di prutezione in u ribosoma microsporidia crea una pressione evolutiva chì prumove cambiamenti in a struttura di ribosoma.Queste varianti si trovanu luntanu da u situ attivu di u ribosoma è parenu aiutà à mantene (o restaurà) l'assemblea di ribosomi ottimali chì altrimenti seranu disturbati da rRNA ridutta.Questu suggerisce chì una innuvazione maiò di u ribosoma di microsporidia pare avè evolutu in a necessità di tamponà a deriva genica.
Forsi questu hè megliu illustratu da u ligame di nucleotidi, chì ùn hè mai statu osservatu in altri organismi finu à avà.U fattu chì i residui di ubligatoriu di nucleotidi sò prisenti in microsporidia tipica, ma micca in altri eucarioti, suggerisce chì i siti di ubligatoriu di nucleotidi ùn sò micca solu reliquie chì aspettanu di spariscia, o u situ finali di rRNA per esse restauratu à a forma di nucleotidi individuali.Invece, stu situ pare cum'è una funzione utile chì puderia avè evolutu annantu à parechje volte di selezzione positiva.I siti di ubligatoriu di i nucleotidi ponu esse un subproduttu di a selezzione naturale: una volta ES39L hè degradatu, i microsporidia sò furzati à cercà una compensazione per restaurà a biogenesi di ribosomi ottimali in l'absenza di ES39L.Siccomu stu nucleotide pò imite i cuntatti molecolari di u nucleotide A3186 in ES39L, a molècula di nucleotide diventa un bloccu di u ribosoma, u ligame di quale hè ancu migliuratu da a mutazione di a sequenza eL30.
In quantu à l'evoluzione moleculare di parassiti intracellulari, u nostru studiu mostra chì e forze di a selezzione naturale darwiniana è a deriva genetica di a decadenza di u genoma ùn operanu micca in parallelu, ma oscillate.Prima, a deriva genetica elimina e caratteristiche impurtanti di biomolecule, facendu a compensazione assai necessaria.Solu quandu i parassiti satisfacenu sta necessità per via di a selezzione naturale darwiniana, e so macromolecule anu a pussibilità di sviluppà e so caratteristiche più impressiunanti è innovatori.Impurtante, l'evoluzione di i siti di ubligatoriu di i nucleotidi in u ribosoma di E. cuniculi suggerisce chì stu mudellu di perdita à guadagnà di l'evoluzione moleculare ùn solu amortize mutazioni deleterious, ma qualchì volta cunferisce funzioni cumpletamente novi nantu à macromolecule parassiti.
Questa idea hè coherente cù a teoria di l'equilibriu in muvimentu di Sewell Wright, chì dice chì un sistema strettu di selezzione naturale limita a capacità di l'organisimi per innuvà51,52,53.In ogni casu, se a deriva genetica disturba a selezzione naturale, queste deriva pò pruduce cambiamenti chì ùn sò micca in sè stessi adattativi (o ancu preghjudizii) ma portanu à più cambiamenti chì furniscenu una fitness più altu o una nova attività biologica.U nostru quadru sustene sta idea illustendu chì u listessu tipu di mutazione chì riduce a piega è a funzione di una biomolecula pare esse u principale trigger per a so migliione.In cunfurmità cù u mudellu evolutivu win-win, u nostru studiu mostra chì a decadenza di u genoma, tradiziunale vista cum'è un prucessu degenerativu, hè ancu un mutore maiò di l'innuvazione, qualchì volta è forse ancu spessu permette à macromolecule di acquistà novi attività parassitarie.ponu aduprà.