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L'evoluzione di i parassiti microbici implica una cuntrastazione trà a selezzione naturale, chì face chì i parassiti si migliuranu, è a deriva genetica, chì face chì i parassiti perdino geni è accumulino mutazioni deleterie. Quì, per capisce cumu sta cuntrastazione si verifica à a scala di una sola macromolecula, descrivemu a struttura cryo-EM di u ribosomu di Encephalitozoon cuniculi, un urganismu eucarioticu cù unu di i genomi più chjuchi in natura. A riduzione estrema di rRNA in i ribosomi di E. cuniculi hè accumpagnata da cambiamenti strutturali senza precedenti, cum'è l'evoluzione di linker rRNA fusi prima scunnisciuti è rRNA senza rigonfiamenti. Inoltre, u ribosomu di E. cuniculi hà sopravvissutu à a perdita di frammenti di rRNA è proteine ​​sviluppendu a capacità di utilizà piccule molecule cum'è imitazioni strutturali di frammenti di rRNA è proteine ​​degradati. In generale, mostremu chì e strutture moleculari chì si pensavanu dapoi tantu tempu esse ridotte, degenerate è soggette à mutazioni debilitanti anu una quantità di meccanismi compensatori chì li mantenenu attivi malgradu cuntrazioni moleculari estreme.
Siccomu a maiò parte di i gruppi di parassiti microbichi anu strumenti moleculari unichi per sfruttà i so ospiti, spessu duvemu sviluppà diverse terapie per diversi gruppi di parassiti1,2. Tuttavia, nuove evidenze suggerenu chì certi aspetti di l'evoluzione di i parassiti sò convergenti è largamente prevedibili, indicendu una basa putenziale per interventi terapeutici ampi in i parassiti microbichi3,4,5,6,7,8,9.
U travagliu precedente hà identificatu una tendenza evolutiva cumuna in i parassiti microbiani chjamata riduzione di u genomu o decadenza di u genomu10,11,12,13. A ricerca attuale mostra chì quandu i microorganismi rinuncianu à u so stile di vita liberu è diventanu parassiti intracellulari (o endosimbionti), i so genomi subiscenu metamorfosi lente ma stupende in milioni d'anni9,11. In un prucessu cunnisciutu cum'è decadenza di u genomu, i parassiti microbiani accumulanu mutazioni deleterie chì trasformanu parechji geni prima impurtanti in pseudogeni, purtendu à una perdita graduale di geni è à un colapsu mutazionale14,15. Stu colapsu pò distrughje finu à u 95% di i geni in l'organismi intracellulari più antichi paragunatu à e spezie libere strettamente correlate. Cusì, l'evoluzione di i parassiti intracellulari hè un tira è molla trà duie forze opposte: a selezzione naturale darwiniana, chì porta à u miglioramentu di i parassiti, è u colapsu di u genomu, chì ghjetta i parassiti in l'oblio. Cumu u parassita hè riesciutu à esce da stu tira è molla è à mantene l'attività di a so struttura moleculare ùn hè micca chjaru.
Ancu s'è u mecanismu di decadenza di u genomu ùn hè micca cumpletamente capitu, pare chì si verifichi principalmente per via di una deriva genetica frequente. Siccomu i parassiti vivenu in pupulazioni chjuche, asessuali è geneticamente limitate, ùn ponu micca eliminà efficacemente e mutazioni deleterie chì qualchì volta si verificanu durante a replicazione di u DNA. Questu porta à l'accumulazione irreversibile di mutazioni dannose è à a riduzione di u genomu di u parassita. Di cunsiguenza, u parassita ùn solu perde geni chì ùn sò più necessarii per a so sopravvivenza in l'ambiente intracellulare. Hè l'incapacità di e pupulazioni di parassiti di eliminà efficacemente e mutazioni deleterie sporadiche chì face chì queste mutazioni si accumulinu in tuttu u genomu, cumpresi i so geni più impurtanti.
Gran parte di a nostra cunniscenza attuale di a riduzione di u genomu hè basata solu nantu à paraguni di sequenze di genomu, cù menu attenzione à i cambiamenti in e molecule attuali chì svolgenu funzioni di mantenimentu è servenu cum'è potenziali bersagli di farmaci. Studi comparativi anu dimustratu chì u pesu di e mutazioni microbiche intracellulari deleterie pare predispone e proteine ​​è l'acidi nucleichi à piegassi male è à aggregassi, rendenduli più dipendenti da i chaperoni è ipersensibili à u calore19,20,21,22,23. Inoltre, vari parassiti - evoluzione indipendente à volte separata da finu à 2,5 miliardi d'anni - anu sperimentatu una perdita simile di centri di cuntrollu di qualità in a so sintesi proteica5,6 è in i meccanismi di riparazione di u DNA24. Tuttavia, si sà pocu nantu à l'impattu di u stile di vita intracellulare nantu à tutte l'altre proprietà di e macromolecule cellulari, cumprese l'adattazione moleculare à un pesu crescente di mutazioni deleterie.
In questu travagliu, per capisce megliu l'evoluzione di e proteine ​​è di l'acidi nucleichi di i microrganismi intracellulari, avemu determinatu a struttura di i ribosomi di u parassita intracellulare Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi hè un urganismu simile à un fungu chì appartene à un gruppu di microsporidi parassiti chì anu genomi eucarioti insolitamente chjuchi è sò dunque aduprati cum'è organismi mudellu per studià u decadimentu di u genomu25,26,27,28,29,30. Recentemente, a struttura di i ribosomi cryo-EM hè stata determinata per genomi moderatamente ridutti di Microsporidi, Paranosema locustae è Vairimorpha necatrix31,32 (genoma di ~3,2 Mb). Queste strutture suggerenu chì una certa perdita di amplificazione di rRNA hè compensata da u sviluppu di novi cuntatti trà proteine ​​ribosomiali vicine o da l'acquisizione di nuove proteine ​​ribosomiali msL131,32. A spezia Encephalitozoon (genoma ~ 2,5 milioni di bp), inseme cù u so parente u più vicinu Ordospora, dimustranu u gradu ultimu di riduzione di u genomu in l'eucarioti - anu menu di 2000 geni chì codificanu proteine, è si prevede chì i so ribosomi ùn sò micca solu privi di frammenti di espansione di rRNA (frammenti di rRNA chì distinguenu i ribosomi eucarioti da i ribosomi batterichi) ma anu ancu quattru proteine ​​ribosomiali per via di a so mancanza di omologhi in u genomu di E. cuniculi26,27,28. Dunque, avemu cunclusu chì u ribosomu di E. cuniculi pò rivelà strategie prima scunnisciute per l'adattazione moleculare à u decadimentu di u genomu.
A nostra struttura cryo-EM rapprisenta u più chjucu ribosomu citoplasmaticu eucariotu à esse carattarizatu è furnisce una visione di cumu u gradu ultimu di riduzione di u genomu affetta a struttura, l'assemblea è l'evoluzione di a machina moleculare chì hè parte integrante di a cellula. Avemu trovu chì u ribosomu di E. cuniculi viola parechji di i principii largamente cunservati di u plegamentu di l'ARN è di l'assemblea di i ribosomi, è avemu scupertu una nova proteina ribosomiale prima scunnisciuta. In modu abbastanza inaspettatu, mostremu chì i ribosomi di microsporidi anu evolutu a capacità di ligà piccule molecule, è ipotizzemu chì e truncature in rRNA è proteine ​​scatenanu innovazioni evolutive chì ponu infine cunferisce qualità utili à u ribosomu.
Per migliurà a nostra capiscitura di l'evoluzione di e proteine ​​è di l'acidi nucleichi in l'organismi intracellulari, avemu decisu d'isolà e spore di E. cuniculi da culture di cellule di mammiferi infettate per purificà i so ribosomi è determinà a struttura di sti ribosomi. Hè difficiule d'ottene un gran numeru di microsporidi parassiti perchè i microsporidi ùn ponu esse cultivati ​​in un mezu nutritivu. Invece, crescenu è si riproducenu solu in l'internu di a cellula ospite. Dunque, per ottene a biomassa di E. cuniculi per a purificazione di i ribosomi, avemu infettatu a linea cellulare renale di mammiferi RK13 cù spore di E. cuniculi è avemu cultivatu queste cellule infettate per parechje settimane per permette à E. cuniculi di cresce è multiplicassi. Usendu un monostrato di cellule infettate di circa mezu metru quadru, simu stati capaci di purificà circa 300 mg di spore di Microsporidi è aduprà per isolà i ribosomi. Avemu dopu disgregatu e spore purificate cù perle di vetru è isolatu i ribosomi grezzi aduprendu a frazziunazione graduale di polietilenglicole di i lisati. Questu ci hà permessu di ottene circa 300 µg di ribosomi crudi di E. cuniculi per l'analisi strutturale.
Avemu dopu raccoltu immagini cryo-EM utilizendu i campioni di ribosomi risultanti è avemu trattatu queste immagini utilizendu maschere currispondenti à a grande subunità ribosomiale, a testa di a subunità chjuca è a subunità chjuca. Durante stu prucessu, avemu raccoltu immagini di circa 108.000 particelle ribosomiali è calculatu immagini cryo-EM cù una risoluzione di 2,7 Å (Figure Supplementari 1-3). Avemu dopu utilizatu immagini cryoEM per mudellà rRNA, proteina ribosomiale è fattore di ibernazione Mdf1 assuciatu à i ribosomi di E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Struttura di u ribosomu di E. cuniculi in cumplessu cù u fattore d'ibernazione Mdf1 (pdb id 7QEP). b Carta di u fattore d'ibernazione Mdf1 assuciatu cù u ribosomu di E. cuniculi. c Carta di a struttura secundaria chì paraguna l'rRNA recuperatu in e spezie microsporidiane à e strutture ribosomiali cunnisciute. I pannelli mostranu a situazione di i frammenti di rRNA amplificati (ES) è i siti attivi di i ribosomi, cumpresi u situ di decodificazione (DC), u loop di sarcinicina (SRL) è u centru di peptidil transferasi (PTC). d A densità elettronica currispondente à u centru di peptidil transferasi di u ribosomu di E. cuniculi suggerisce chì questu situ cataliticu hà a stessa struttura in u parassita E. cuniculi è i so ospiti, cumpresi H. sapiens. e, f A densità elettronica currispondente di u centru di decodificazione (e) è a struttura schematica di u centru di decodificazione (f) indicanu chì E. cuniculi hà residui U1491 invece di A1491 (numerazione di E. coli) in parechji altri eucarioti. Stu cambiamentu suggerisce chì E. cuniculi puderia esse sensibile à l'antibiotici chì miranu stu situ attivu.
À u cuntrariu di e strutture stabilite prima di i ribosomi di V. necatrix è P. locustae (e duie strutture rapprisentanu a stessa famiglia di microsporidi Nosematidae è sò assai simili trà di elle), 31,32 i ribosomi di E. cuniculi subiscenu numerosi prucessi di frammentazione di rRNA è proteine. Ulteriore denaturazione (Figure Supplementari 4-6). In rRNA, i cambiamenti più impressiunanti includenu a perdita cumpleta di u frammentu amplificatu di 25S rRNA ES12L è a degenerazione parziale di l'eliche h39, h41 è H18 (Fig. 1c, Fig. Supplementare 4). Frà e proteine ​​ribosomiali, i cambiamenti più impressiunanti includenu a perdita cumpleta di a proteina eS30 è l'accorciamentu di e proteine ​​eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 è eS7 (Figure Supplementari 4, 5).
Cusì, a riduzione estrema di i genomi di e spezie di Encephalotozoon/Ordospora si riflette in a so struttura di ribosomi: i ribosomi di E. cuniculi sperimentanu a perdita più drammatica di cuntenutu proteicu in i ribosomi citoplasmatici eucariotici sottumessi à caratterizazione strutturale, è ùn anu mancu quelli frammenti di rRNA è proteine ​​chì sò largamente cunservati micca solu in l'eucarioti, ma ancu in i trè duminii di a vita. A struttura di u ribosomu di E. cuniculi furnisce u primu mudellu moleculare per questi cambiamenti è rivela eventi evolutivi chì sò stati trascurati sia da a genomica comparativa sia da i studii di a struttura biomoleculare intracellulare (Figura supplementare 7). Quì sottu, descrivemu ognunu di questi eventi inseme cù e so probabili origini evolutive è u so impattu potenziale nantu à a funzione di i ribosomi.
Avemu tandu scupertu chì, in più di e grande truncature di rRNA, i ribosomi di E. cuniculi anu variazioni di rRNA in unu di i so siti attivi. Ancu s'è u centru di peptidil transferasi di u ribosomu di E. cuniculi hà a stessa struttura cum'è l'altri ribosomi eucarioti (Fig. 1d), u centru di decodificazione differisce per via di a variazione di sequenza à u nucleotide 1491 (numerazione di E. coli, Fig. 1e, f). Questa osservazione hè impurtante perchè u situ di decodificazione di i ribosomi eucarioti cuntene tipicamente i residui G1408 è A1491 paragunatu à i residui di tipu battericu A1408 è G1491. Questa variazione hè à a basa di a diversa sensibilità di i ribosomi batterichi è eucarioti à a famiglia di l'aminoglicosidi di l'antibiotici ribosomiali è altre piccule molecule chì miranu u situ di decodificazione. À u situ di decodificazione di u ribosomu di E. cuniculi, u residuu A1491 hè statu rimpiazzatu da U1491, creendu potenzialmente una interfaccia di legame unica per e piccule molecule chì miranu stu situ attivu. A listessa variante A14901 hè ancu presente in altri microsporidi cum'è P. locustae è V. necatrix, ciò chì suggerisce ch'ella hè diffusa trà e spezie di microsporidi (Fig. 1f).
Siccomu i nostri campioni di ribosomi di E. cuniculi sò stati isolati da spore metabolicamente inattive, avemu testatu a mappa cryo-EM di E. cuniculi per u ligame di ribosomi descrittu prima in cundizioni di stress o di fame. Fattori d'ibernazione 31,32,36,37, 38. Avemu currispundente a struttura stabilita prima di u ribosomu in ibernazione cù a mappa cryo-EM di u ribosomu di E. cuniculi. Per l'attraccu, i ribosomi di S. cerevisiae sò stati aduprati in cumplessu cù u fattore d'ibernazione Stm138, i ribosomi di locusta in cumplessu cù u fattore Lso232, è i ribosomi di V. necatrix in cumplessu cù i fattori Mdf1 è Mdf231. À u listessu tempu, avemu trovu a densità cryo-EM currispondente à u fattore di riposu Mdf1. Simile à a ligatura di Mdf1 à u ribosomu di V. necatrix, Mdf1 si lega ancu à u ribosomu di E. cuniculi, induve blocca u situ E di u ribosomu, aiutendu forse à rende dispunibili i ribosomi quandu e spore di u parassita diventanu metabolicamente inattive dopu l'inattivazione di u corpu (Figura 2).
Mdf1 blocca u situ E di u ribosomu, ciò chì pare aiutà à inattivà u ribosomu quandu e spore di u parassita diventanu metabolicamente inattive. In a struttura di u ribosomu di E. cuniculi, avemu trovu chì Mdf1 forma un cuntattu prima scunnisciutu cù u fustu di u ribosomu L1, a parte di u ribosomu chì facilita a liberazione di tRNA deacetilatu da u ribosomu durante a sintesi di e proteine. Quessi cuntatti suggerenu chì Mdf1 si dissocia da u ribosomu aduprendu u listessu mecanismu cum'è u tRNA deacetilatu, furnendu una pussibile spiegazione di cumu u ribosomu rimuove Mdf1 per riattivà a sintesi di e proteine.
Tuttavia, a nostra struttura hà revelatu un cuntattu scunnisciutu trà Mdf1 è a gamba di u ribosomu L1 (a parte di u ribosomu chì aiuta à liberà u tRNA deacilatu da u ribosomu durante a sintesi di e proteine). In particulare, Mdf1 usa i stessi cuntatti cum'è u segmentu di u gomitu di a molecule di tRNA deacilatu (Fig. 2). Questa modelizazione moleculare prima scunnisciuta hà dimustratu chì Mdf1 si dissocia da u ribosomu aduprendu u listessu mecanismu cum'è u tRNA deacetilatu, ciò chì spiega cumu u ribosomu rimuove stu fattore d'ibernazione per riattivà a sintesi di e proteine.
Quandu avemu custruitu u mudellu rRNA, avemu scupertu chì u ribosomu di E. cuniculi hà frammenti di rRNA piegati anormalmente, chì avemu chjamatu rRNA fusu (Fig. 3). In i ribosomi chì abbraccianu i trè duminii di a vita, l'rRNA si piega in strutture in cui a maiò parte di e basi di l'rRNA si accoppianu è si pieganu trà di elle o interagiscenu cù e proteine ​​ribosomali38,39,40. Tuttavia, in i ribosomi di E. cuniculi, l'rRNA parenu viulà stu principiu di piegamentu cunvertendu alcune di e so eliche in regioni di rRNA dispiegate.
Struttura di l'elica rRNA H18 25S in S. cerevisiae, V. necatrix, è E. cuniculi. Tipicamente, in i ribosomi chì abbraccianu i trè duminii di vita, questu linker s'avvolge in una elica RNA chì cuntene da 24 à 34 residui. In Microsporidi, invece, questu linker rRNA hè gradualmente riduttu à dui linker ricchi di uridina à catena unica chì cuntenenu solu 12 residui. A maiò parte di questi residui sò esposti à solventi. A figura mostra chì i microsporidi parassiti parenu viulà i principii generali di u ripiegamentu di l'rRNA, induve e basi di l'rRNA sò generalmente accoppiate à altre basi o implicate in interazzione rRNA-proteina. In i microsporidi, alcuni frammenti di rRNA assumenu una piega sfavorevole, in a quale l'elica rRNA precedente diventa un frammentu à catena unica allungatu quasi in linea retta. A presenza di queste regioni inusuali permette à i microsporidi rRNA di ligà frammenti di rRNA distanti utilizendu un numeru minimu di basi di RNA.
L'esempiu u più impressiunante di sta transizione evolutiva pò esse osservatu in l'elica H18 25S rRNA (Fig. 3). In e spezie da E. coli à l'omu, e basi di sta elica rRNA cuntenenu 24-32 nucleotidi, furmendu una elica ligeramente irregulare. In e strutture ribosomiali identificate prima da V. necatrix è P. locustae,31,32 e basi di l'elica H18 sò parzialmente srotolate, ma l'accoppiamentu di basi nucleotidiche hè cunservatu. Tuttavia, in E. cuniculi stu frammentu di rRNA diventa i linker più corti 228UUUGU232 è 301UUUUUUUUUU307. À u cuntrariu di i frammenti di rRNA tipici, sti linker ricchi di uridina ùn si arrotolanu nè facenu un cuntattu estensivu cù e proteine ​​ribosomiali. Invece, adottanu strutture aperte à u solvente è cumpletamente spiegate in cui i filamenti di rRNA sò estesi quasi dritti. Questa cunfurmazione allungata spiega cumu E. cuniculi usa solu 12 basi di ARN per riempie u spaziu di 33 Å trà l'eliche di rRNA H16 è H18, mentre chì altre spezie necessitanu almenu u doppiu di basi di rRNA per riempie u spaziu.
Cusì, pudemu dimustrà chì, per via di un ripiegamentu energeticamente sfavorevole, i microsporidi parassiti anu sviluppatu una strategia per cuntrae ancu quelli segmenti di rRNA chì restanu largamente cunservati in e spezie in i trè duminii di a vita. Apparentemente, accumulendu mutazioni chì trasformanu l'eliche di rRNA in corti linker poli-U, E. cuniculi pò furmà frammenti di rRNA inusuali chì cuntenenu u menu nucleotidi pussibule per a ligazione di frammenti di rRNA distali. Questu aiuta à spiegà cumu i microsporidi anu ottenutu una riduzione drammatica di a so struttura moleculare basica senza perde a so integrità strutturale è funzionale.
Un'altra caratteristica insolita di l'ARNr di E. cuniculi hè l'apparizione di l'ARNr senza ispessimentu (Fig. 4). I rigonfiamenti sò nucleotidi senza coppie di basi chì si torcenu fora di l'elica di l'ARN invece di piattassi in ella. A maiò parte di e sporgenze di l'ARNr agiscenu cum'è adesivi moleculari, aiutendu à ligà e proteine ​​ribosomiali adiacenti o altri frammenti di rARN. Alcuni di i rigonfiamenti agiscenu cum'è cerniere, permettendu à l'elica di l'ARNr di flettessi è piegassi in modu ottimale per una sintesi proteica produttiva 41.
a Una protrusione di rRNA (numerazione di S. cerevisiae) hè assente da a struttura di i ribosomi di E. cuniculi, ma presente in a maiò parte di l'altri eucarioti b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, è ribosomi interni di E. cuniculi. I parassiti mancanu di parechji di i rigonfiamenti antichi è altamente cunservati di rRNA. Questi ispessimentu stabilizanu a struttura di i ribosomi; dunque, a so assenza in i microsporidi indica una stabilità ridutta di u ripiegamentu di l'rRNA in i parassiti microsporidi. U paragone cù i steli P (steli L7/L12 in i batteri) mostra chì a perdita di protuberanze di rRNA qualchì volta coincide cù l'apparizione di novi protuberanze accantu à e protuberanze perse. L'elica H42 in u rRNA 23S/28S hà un rigonfiamentu anticu (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) stimatu à avè almenu 3,5 miliardi d'anni per via di a so prutezzione in trè duminii di a vita. In i microsporidi, questu rigonfiamentu hè eliminatu. Tuttavia, una nova protuberanza hè apparsa accantu à a protuberanza persa (A1306 in E. cuniculi).
Sorprendentemente, avemu scupertu chì i ribosomi di E. cuniculi mancanu a maiò parte di i rigonfiamenti di rRNA truvati in altre spezie, cumpresi più di 30 rigonfiamenti cunservati in altri eucarioti (Fig. 4a). Sta perdita elimina parechji cuntatti trà e subunità ribosomiali è l'eliche di rRNA adiacenti, qualchì volta creendu grandi vuoti cavi in ​​u ribosomu, rendendu u ribosomu di E. cuniculi più porosu paragunatu à i ribosomi più tradiziunali (Fig. 4b). In particulare, avemu scupertu chì a maiò parte di sti rigonfiamenti eranu ancu persi in e strutture di ribosomi di V. necatrix è P. locustae identificate prima, chì eranu state trascurate da analisi strutturali precedenti31,32.
Calchì volta a perdita di rigonfiamenti di rRNA hè accumpagnata da u sviluppu di novi rigonfiamenti accantu à u rigonfiamentu persu. Per esempiu, u fustu P ribosomiale cuntene un rigonfiamentu U1208 (in Saccharomyces cerevisiae) chì hè sopravvissutu da E. coli à l'omu è dunque hè stimatu chì hà 3,5 miliardi d'anni. Durante a sintesi di e proteine, questu rigonfiamentu aiuta u fustu P à spustassi trà cunfurmazioni aperte è chjuse in modu chì u ribosomu possi reclutà fattori di traduzzione è trasmetteli à u situ attivu. In i ribosomi di E. cuniculi, questu ispessimentu hè assente; tuttavia, un novu ispessimentu (G883) situatu solu in trè coppie di basi pò cuntribuisce à a restaurazione di a flessibilità ottima di u fustu P (Fig. 4c).
I nostri dati nantu à l'ARNr senza rigonfiamenti suggerenu chì a minimizazione di l'ARNr ùn hè micca limitata à a perdita di elementi di l'ARNr nantu à a superficia di u ribosomu, ma pò ancu implicà u nucleu di u ribosomu, creendu un difettu moleculare specificu di u parassita chì ùn hè statu discrittu in e cellule libere. Si osservanu spezie viventi.
Dopu avè modellatu e proteine ​​ribosomiali canoniche è l'rRNA, avemu trovu chì i cumpunenti ribosomiali cunvinziunali ùn ponu micca spiegà e trè parte di l'imagine cryo-EM. Dui di sti frammenti sò molecule di piccula dimensione (Fig. 5, Fig. Supplementare 8). U primu segmentu hè inseritu trà e proteine ​​ribosomiali uL15 è eL18 in una pusizione generalmente occupata da u C-terminale di eL18, chì hè accurtatu in E. cuniculi. Ancu s'è ùn pudemu micca determinà l'identità di sta molecule, a dimensione è a forma di sta isula di densità sò ben spiegate da a presenza di molecule di spermidina. U so ligame à u ribosomu hè stabilizatu da mutazioni specifiche di microsporidi in e proteine ​​uL15 (Asp51 è Arg56), chì parenu aumentà l'affinità di u ribosomu per sta piccula molecule, postu chì permettenu à uL15 di avvolge a piccula molecule in una struttura ribosomiale. Figura Supplementare 2). 8, dati supplementari 1, 2).
Imaging cryo-EM chì mostra a presenza di nucleotidi fora di u ribosu ligatu à u ribosomu di E. cuniculi. In u ribosomu di E. cuniculi, stu nucleotide occupa u listessu postu chè u nucleotide 25S rRNA A3186 (numerazione Saccharomyces cerevisiae) in a maiò parte di l'altri ribosomi eucarioti. b In a struttura ribosomiale di E. cuniculi, stu nucleotide si trova trà e proteine ​​ribosomiali uL9 è eL20, stabilizendu cusì u cuntattu trà e duie proteine. cd Analisi di cunservazione di a sequenza eL20 trà e spezie di microsporidi. L'arburu filogeneticu di e spezie di Microsporidi (c) è l'allineamentu di sequenze multiple di a proteina eL20 (d) mostranu chì i residui di legame à i nucleotidi F170 è K172 sò cunservati in a maiò parte di i Microsporidi tipici, cù l'eccezzione di S. lophii, cù l'eccezzione di i Microsporidi à ramificazione precoce, chì anu cunservatu l'estensione di l'rRNA ES39L. e Questa figura mostra chì i residui di legame di nucleotidi F170 è K172 sò presenti solu in eL20 di u genomu di microsporidi assai riduttu, ma micca in altri eucarioti. In generale, questi dati suggerenu chì i ribosomi microsporidiani anu sviluppatu un situ di legame di nucleotidi chì pare ligà e molecule di AMP è aduprà per stabilizà l'interazioni proteina-proteina in a struttura ribosomiale. L'alta cunservazione di questu situ di legame in Microsporidi è a so assenza in altri eucarioti suggerisce chì questu situ pò furnisce un vantaghju di sopravvivenza selettiva per Microsporidi. Cusì, a sacchetta di legame di nucleotidi in u ribosoma di microsporidi ùn pare micca esse una caratteristica degenerata o una forma finale di degradazione di rRNA cum'è descrittu prima, ma piuttostu una innovazione evolutiva utile chì permette à u ribosoma di microsporidi di ligà direttamente piccule molecule, aduprendule cum'è blocchi di custruzzione moleculari. blocchi di custruzzione per ribosomi. Questa scuperta face di u ribosoma di microsporidi l'unicu ribosoma cunnisciutu per aduprà un solu nucleotide cum'è u so bloccu di custruzzione strutturale. f Percorsu evolutivu ipoteticu derivatu da u ligame di nucleotidi.
A seconda densità di bassu pesu moleculare si trova à l'interfaccia trà e proteine ​​ribosomiali uL9 è eL30 (Fig. 5a). Questa interfaccia hè stata descritta prima in a struttura di u ribosomu di Saccharomyces cerevisiae cum'è un situ di ligame per u nucleotide 25S di rRNA A3186 (parte di l'estensione ES39L rRNA)38. Hè statu dimustratu chì in i ribosomi degenerati di P. locustae ES39L, sta interfaccia lega un unicu nucleotide scunnisciutu 31, è si suppone chì questu nucleotide sia una forma finale ridutta di rRNA, in a quale a lunghezza di rRNA hè ~130-230 basi. ES39L hè riduttu à un unicu nucleotide 32.43. E nostre immagini cryo-EM sustenenu l'idea chì a densità pò esse spiegata da i nucleotidi. Tuttavia, a risoluzione più alta di a nostra struttura hà dimustratu chì questu nucleotide hè una molecula extraribosomiale, forse AMP (Fig. 5a, b).
Avemu dumandatu tandu s'ellu u situ di ligame di i nucleotidi apparia in u ribosomu di E. cuniculi o s'ellu esistia prima. Siccomu u ligame di i nucleotidi hè mediatu principalmente da i residui Phe170 è Lys172 in a proteina ribosomiale eL30, avemu valutatu a cunservazione di sti residui in 4396 eucarioti rappresentativi. Cum'è in u casu di uL15 sopra, avemu trovu chì i residui Phe170 è Lys172 sò assai cunservati solu in Microsporidia tipici, ma assenti in altri eucarioti, cumpresi Microsporidia atipici Mitosporidium è Amphiamblys, in i quali u frammentu di rRNA ES39L ùn hè micca riduttu 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Pigliati inseme, sti dati sustenenu l'idea chì E. cuniculi è forse altri microsporidi canonichi anu sviluppatu a capacità di catturà efficacemente un gran numeru di picculi metaboliti in a struttura di i ribosomi per cumpensà u calu di i livelli di rRNA è proteine. Cusì, anu sviluppatu una capacità unica di ligà i nucleotidi fora di u ribosomi, mustrendu chì e strutture moleculari parassite compensanu catturendu picculi metaboliti abbundanti è aduprenduli cum'è imitazioni strutturali di frammenti di RNA è proteine ​​degradati.
A terza parte micca simulata di a nostra mappa cryo-EM, truvata in a grande subunità ribosomiale. A risoluzione relativamente alta (2,6 Å) di a nostra mappa suggerisce chì sta densità appartene à e proteine ​​cù cumminazzioni uniche di grandi residui di catena laterale, ciò chì ci hà permessu d'identificà sta densità cum'è una proteina ribosomiale prima scunnisciuta chì avemu identificatu cum'è hè stata chjamata msL2 (proteina L2 specifica di Microsporidia) (metudi, figura 6). A nostra ricerca d'omologia hà dimustratu chì msL2 hè cunservata in u clade Microsporidia di u genaru Encephaliter è Orosporidium, ma assente in altre spezie, cumprese altre Microsporidia. In a struttura ribosomiale, msL2 occupa un spaziu furmatu da a perdita di u rRNA ES31L allargatu. In questu viotu, msL2 aiuta à stabilizà u piegamentu di u rRNA è pò cumpensà a perdita di ES31L (Figura 6).
a Densità elettronica è mudellu di a proteina ribosomiale msL2 specifica di Microsporidi truvata in i ribosomi di E. cuniculi. b A maiò parte di i ribosomi eucarioti, cumpresu u ribosomu 80S di Saccharomyces cerevisiae, anu una amplificazione di rRNA ES19L persa in a maiò parte di e spezie di Microsporidi. A struttura precedentemente stabilita di u ribosomu di microsporidi V. necatrix suggerisce chì a perdita di ES19L in questi parassiti hè compensata da l'evoluzione di a nova proteina ribosomiale msL1. In questu studiu, avemu trovu chì u ribosomu di E. cuniculi hà ancu sviluppatu una proteina mimica di RNA ribosomiale supplementaria cum'è una apparente compensazione per a perdita di ES19L. Tuttavia, msL2 (attualmente annotata cum'è l'ipotetica proteina ECU06_1135) è msL1 anu origini strutturali è evolutive diverse. c Sta scuperta di a generazione di proteine ​​ribosomiali msL1 è msL2 evolutivamente senza relazione suggerisce chì, se i ribosomi accumulanu mutazioni dannose in u so rRNA, ponu ghjunghje à livelli senza precedenti di diversità cumposizionale ancu in un picculu sottoinsieme di spezie strettamente correlate. Sta scuperta puderia aiutà à chiarificà l'origine è l'evoluzione di u ribosomu mitocondriale, chì hè cunnisciutu per u so rRNA assai riduttu è a variabilità anormale in a cumpusizione di e proteine ​​trà e spezie.
Avemu tandu paragunatu a proteina msL2 cù a proteina msL1 descritta prima, l'unica proteina ribosomiale specifica di i microsporidi cunnisciuta truvata in u ribosomu V. necatrix. Vulìamu verificà se msL1 è msL2 sò evolutivamente correlati. A nostra analisi hà dimustratu chì msL1 è msL2 occupanu a stessa cavità in a struttura ribosomiale, ma anu strutture primarie è terziarie diverse, ciò chì indica a so origine evolutiva indipendente (Fig. 6). Cusì, a nostra scuperta di msL2 furnisce evidenze chì gruppi di spezie eucariote compatte ponu evoluzione indipindentamente proteine ​​ribosomiali strutturalmente distinte per cumpensà a perdita di frammenti di rRNA. Questa scuperta hè notevule in quantu a maiò parte di i ribosomi eucarioti citoplasmatici cuntenenu una proteina invariante, cumprese a stessa famiglia di 81 proteine ​​ribosomiali. L'apparizione di msL1 è msL2 in vari cladi di microsporidi in risposta à a perdita di segmenti di rRNA estesi suggerisce chì a degradazione di l'architettura moleculare di u parassita face chì i parassiti cerchinu mutazioni compensatorie, chì ponu eventualmente purtà à a so acquisizione in diverse strutture di pupulazioni di parassiti.
Infine, quandu u nostru mudellu hè statu cumpletatu, avemu paragunatu a cumpusizione di u ribosomu di E. cuniculi cù quella prevista da a sequenza di u genomu. Parechje proteine ​​ribosomiali, cumprese eL14, eL38, eL41 è eS30, eranu prima cunsiderate mancanti da u genomu di E. cuniculi per via di l'apparente assenza di i so omologhi da u genomu di E. cuniculi. A perdita di parechje proteine ​​ribosomiali hè ancu prevista in a maiò parte di l'altri parassiti intracellulari è endosimbionti altamente ridutti. Per esempiu, ancu s'è a maiò parte di i batteri chì vivenu liberi cuntenenu a stessa famiglia di 54 proteine ​​ribosomiali, solu 11 di queste famiglie di proteine ​​anu omologhi rilevabili in ogni genomu analizatu di batteri ristretti à l'ospite. À sustegnu di sta nuzione, una perdita di proteine ​​ribosomiali hè stata osservata sperimentalmente in i microsporidi di V. necatrix è P. locustae, chì mancanu di e proteine ​​eL38 è eL4131,32.
Tuttavia, e nostre strutture mostranu chì solu eL38, eL41, è eS30 sò in realtà persi in u ribosomu di E. cuniculi. A proteina eL14 hè stata cunservata è a nostra struttura hà mostratu perchè sta proteina ùn pudia esse truvata in a ricerca di omologia (Fig. 7). In i ribosomi di E. cuniculi, a maiò parte di u situ di legame di eL14 hè persa per via di a degradazione di l'ES39L amplificatu da rRNA. In assenza di ES39L, eL14 hà persu a maiò parte di a so struttura secundaria, è solu u 18% di a sequenza eL14 era identica in E. cuniculi è S. cerevisiae. Questa scarsa preservazione di a sequenza hè rimarchevule perchè ancu Saccharomyces cerevisiae è Homo sapiens - organismi chì si sò evoluti à 1,5 miliardi d'anni di distanza - spartenu più di u 51% di i stessi residui in eL14. Questa perdita anomala di cunservazione spiega perchè E. cuniculi eL14 hè attualmente annotata cum'è a presunta proteina M970_061160 è micca cum'è a proteina ribosomiale eL1427.
è u ribosomu di Microsporidii hà persu l'estensione di rRNA ES39L, chì hà eliminatu parzialmente u situ di legame di a proteina ribosomiale eL14. In assenza di ES39L, a proteina di a microspore eL14 subisce una perdita di struttura secundaria, in a quale l'antica α-elica di legame à u rRNA degenera in un loop di lunghezza minima. b L'allineamentu di sequenze multiple mostra chì a proteina eL14 hè assai cunservata in e spezie eucariote (57% d'identità di sequenza trà omologhi di lievito è umani), ma pocu cunservata è divergente in i microsporidii (in i quali micca più di u 24% di i residui sò identichi à l'omologu eL14). da S. cerevisiae o H. sapiens). Questa scarsa cunservazione di sequenze è variabilità di a struttura secundaria spiega perchè l'omologu eL14 ùn hè mai statu trovu in E. cuniculi è perchè si pensa chì sta proteina sia stata persa in E. cuniculi. In cuntrastu, E. cuniculi eL14 hè statu precedentemente annotatu cum'è una putativa proteina M970_061160. Questa osservazione suggerisce chì a diversità di u genomu di i microsporidi hè attualmente sopravvalutata: certi geni chì si pensa attualmente chì sò persi in i microsporidi sò in realtà cunservati, ancu s'è in forme assai differenziate; invece, si pensa chì alcuni codificanu per i geni di microsporidi per e proteine ​​specifiche di i vermi (per esempiu, l'ipotetica proteina M970_061160) in realtà codifica per e proteine ​​assai diverse truvate in altri eucarioti.
Questa scuperta suggerisce chì a denaturazione di l'ARN ribosomiale pò purtà à una perdita drammatica di cunservazione di sequenza in e proteine ​​ribosomiali adiacenti, rendendu queste proteine ​​indetectabili per e ricerche d'omologia. Cusì, pudemu sopravvalutà u gradu attuale di degradazione moleculare in l'organismi di genomi chjuchi, postu chì alcune proteine ​​chì si pensa esse perse persistenu in realtà, ancu s'è in forme assai alterate.
Cumu ponu i parassiti mantene a funzione di e so macchine moleculari in cundizioni di riduzione estrema di u genomu ? U nostru studiu risponde à sta quistione discrittendu a struttura moleculare cumplessa (ribosoma) di E. cuniculi, un urganismu cù unu di i genomi eucarioti più chjuchi.
Hè cunnisciutu dapoi guasi duie decennie chì e molecule di proteine ​​è d'ARN in i parassiti microbiani sò spessu sfarenti da e so molecule omologhe in e spezie libere perchè mancanu di centri di cuntrollu di qualità, sò ridotte à u 50% di a so dimensione in i microbi liberi, ecc. parechje mutazioni debilitanti chì impediscenu u piegamentu è a funzione. Per esempiu, si prevede chì i ribosomi di picculi organismi di genomu, cumpresi parechji parassiti intracellulari è endosimbionti, mancanu di parechje proteine ​​ribosomiali è finu à un terzu di nucleotidi d'ARN paragunatu à e spezie libere 27, 29, 30, 49. Tuttavia, u modu in cui queste molecule funzionanu in u parassita ferma in gran parte un misteru, studiatu principalmente per mezu di a genomica comparativa.
U nostru studiu mostra chì a struttura di e macromolecule pò rivelà parechji aspetti di l'evoluzione chì sò difficiuli da estrarre da i studii genomichi comparativi tradiziunali di parassiti intracellulari è altri organismi ristretti à l'ospite (Figura supplementare 7). Per esempiu, l'esempiu di a proteina eL14 mostra chì pudemu sopravvalutà u gradu attuale di degradazione di l'apparatu moleculare in e spezie parassite. Si crede avà chì i parassiti encefalitici anu centinaie di geni specifichi di microsporidi. Tuttavia, i nostri risultati mostranu chì alcuni di questi geni apparentemente specifichi sò in realtà solu varianti assai diverse di geni chì sò cumuni in altri eucarioti. Inoltre, l'esempiu di a proteina msL2 mostra cumu trascuremu e nuove proteine ​​ribosomiali è sottovalutemu u cuntenutu di e macchine moleculari parassite. L'esempiu di piccule molecule mostra cumu pudemu trascurà l'innuvazioni più ingegnose in e strutture moleculari parassite chì ponu dà li una nova attività biologica.
Pigliati inseme, sti risultati migliuranu a nostra capiscitura di e differenze trà e strutture moleculari di l'organismi ristretti à l'ospite è i so omologhi in l'organismi viventi liberi. Mostremu chì e macchine moleculari, dapoi tantu tempu cunsiderate ridotte, degenerate è sottumesse à varie mutazioni debilitanti, anu invece un inseme di caratteristiche strutturali inusuali sistematicamente trascurate.
Da l’altra parte, i frammenti di rRNA micca ingombranti è i frammenti fusi chì avemu trovu in i ribosomi di E. cuniculi suggerenu chì a riduzione di u genomu pò cambià ancu quelle parti di a machina moleculare basica chì sò cunservate in i trè duminii di a vita - dopu à quasi 3,5 miliardi d’anni. evoluzione indipendente di e spezie.
I frammenti di rRNA senza rigonfiamenti è fusi in i ribosomi di E. cuniculi sò di particulare interessu à a luce di studii precedenti di molecule di RNA in batteri endosimbionti. Per esempiu, in l'endosimbionte afide Buchnera aphidicola, hè statu dimustratu chì e molecule di rRNA è tRNA anu strutture sensibili à a temperatura per via di u pregiudiziu di cumpusizione A+T è di una alta proporzione di coppie di basi non canoniche20,50. Si pensa avà chì questi cambiamenti in l'RNA, è ancu i cambiamenti in e molecule di proteine, sò rispunsevuli di a sovradipendenza di l'endosimbionti da i partenarii è di l'incapacità di l'endosimbionti di trasferisce u calore21, 23. Ancu s'è l'rRNA di microsporidi parassiti hà cambiamenti strutturalmente distinti, a natura di questi cambiamenti suggerisce chì a ridotta stabilità termica è a più alta dipendenza da e proteine ​​chaperone possinu esse caratteristiche cumuni di e molecule di RNA in organismi cù genomi ridutti.
Da l’altra parte, e nostre strutture mostranu chì i microsporidi di i parassiti anu sviluppatu una capacità unica di resistere à i frammenti di rRNA è di proteine ​​largamente cunservati, sviluppendu a capacità di utilizà picculi metaboliti abbundanti è facilmente dispunibili cum'è imitazioni strutturali di frammenti di rRNA è di proteine ​​degenerati. Degradazione di a struttura moleculare. Questa opinione hè sustenuta da u fattu chì e piccule molecule chì compensanu a perdita di frammenti di proteine ​​in u rRNA è i ribosomi di E. cuniculi si leganu à i residui specifichi di i microsporidi in e proteine ​​uL15 è eL30. Questu suggerisce chì u ligame di piccule molecule à i ribosomi pò esse un pruduttu di selezzione pusitiva, in a quale e mutazioni specifiche di i microsporidi in e proteine ​​ribosomiali sò state selezziunate per a so capacità di aumentà l'affinità di i ribosomi per e piccule molecule, ciò chì pò purtà à organismi ribosomiali più efficienti. A scuperta rivela una innovazione intelligente in a struttura moleculare di i parassiti microbici è ci dà una megliu comprensione di cume e strutture moleculari di i parassiti mantenenu a so funzione malgradu l'evoluzione riduttiva.
Attualmente, l'identificazione di ste piccule molecule ferma pocu chjara. Ùn hè chjaru perchè l'apparizione di ste piccule molecule in a struttura ribosomiale hè diversa trà e spezie di microsporidi. In particulare, ùn hè chjaru perchè u ligame di i nucleotidi hè osservatu in i ribosomi di E. cuniculi è P. locustae, è micca in i ribosomi di V. necatrix, malgradu a presenza di u residu F170 in e proteine ​​eL20 è K172 di V. necatrix. Sta delezione pò esse causata da u residu 43 uL6 (situatu accantu à a sacchetta di ligame di i nucleotidi), chì hè tirosina in V. necatrix è micca treonina in E. cuniculi è P. locustae. A catena laterale aromatica ingombrante di Tyr43 pò interferisce cù u ligame di i nucleotidi per via di a sovrapposizione sterica. In alternativa, l'apparente delezione di i nucleotidi pò esse duvuta à a bassa risoluzione di l'imaghjini cryo-EM, chì impedisce a modellazione di i frammenti ribosomiali di V. necatrix.
Da l’altra parte, u nostru travagliu suggerisce chì u prucessu di decadimentu di u genomu puderia esse una forza inventiva. In particulare, a struttura di u ribosomu di E. cuniculi suggerisce chì a perdita di rRNA è frammenti di proteine ​​in u ribosomu di microsporidia crea una pressione evolutiva chì prumove cambiamenti in a struttura di i ribosomi. Queste varianti si trovanu luntanu da u situ attivu di u ribosomu è parenu aiutà à mantene (o restaurà) l'assemblea ottimale di i ribosomi chì altrimenti seria interrotta da un rRNA riduttu. Questu suggerisce chì una innovazione maiò di u ribosomu di microsporidia pare esse evoluta in un bisognu di tamponà a deriva genetica.
Forse questu hè megliu illustratu da u ligame di nucleotidi, chì ùn hè mai statu osservatu in altri organismi finu à avà. U fattu chì i residui di ligame di nucleotidi sò presenti in microsporidi tipici, ma micca in altri eucarioti, suggerisce chì i siti di ligame di nucleotidi ùn sò micca solu reliquie chì aspettanu di sparisce, o u situ finale per chì l'rRNA sia restauratu à a forma di nucleotidi individuali. Invece, questu situ pare una caratteristica utile chì puderia esse evoluta in parechji cicli di selezzione pusitiva. I siti di ligame di nucleotidi ponu esse un sottoproduttu di a selezzione naturale: una volta chì ES39L hè degradatu, i microsporidi sò furzati à circà una compensazione per restaurà a biogenesi ottimale di i ribosomi in assenza di ES39L. Siccomu questu nucleotide pò imità i cuntatti moleculari di u nucleotide A3186 in ES39L, a molecula di nucleotidi diventa un elementu custitutivu di u ribosomu, u ligame di u quale hè ulteriormente miglioratu da a mutazione di a sequenza eL30.
In quantu à l'evoluzione moleculare di i parassiti intracellulari, u nostru studiu mostra chì e forze di a selezzione naturale darwiniana è a deriva genetica di u decadimentu di u genomu ùn operanu micca in parallelu, ma oscillanu. Prima, a deriva genetica elimina caratteristiche impurtanti di e biomolecule, rendendu a compensazione assai necessaria. Solu quandu i parassiti soddisfanu questu bisognu per mezu di a selezzione naturale darwiniana, e so macromolecule averanu a pussibilità di sviluppà i so tratti più impressiunanti è innovativi. Impurtantemente, l'evoluzione di i siti di legame di i nucleotidi in u ribosomu di E. cuniculi suggerisce chì questu mudellu perdita-guadagnu di l'evoluzione moleculare ùn solu ammortizza e mutazioni deleterie, ma qualchì volta cunferisce funzioni completamente nove à e macromolecule parassite.
Questa idea hè coerente cù a teoria di l'equilibriu mobile di Sewell Wright, chì afferma chì un sistema strettu di selezzione naturale limita a capacità di l'organismi d'innuvà51,52,53. Tuttavia, se a deriva genetica perturba a selezzione naturale, queste derive ponu pruduce cambiamenti chì ùn sò micca in sè stessi adattivi (o ancu dannosi) ma portanu à ulteriori cambiamenti chì furniscenu una maggiore fitness o una nova attività biologica. U nostru quadru sustene sta idea illustrendu chì u listessu tipu di mutazione chì riduce u ripiegamentu è a funzione di una biomolecula pare esse u principale fattore scatenante per u so miglioramentu. In linea cù u mudellu evolutivu win-win, u nostru studiu mostra chì u decadimentu di u genomu, tradiziunalmente vistu cum'è un prucessu degenerativu, hè ancu un mutore maiò di l'innuvazione, qualchì volta è forse ancu spessu permettendu à e macromolecule d'acquistà nuove attività parassite. ponu aduprà.