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A barriera sangue-cervellu è a barriera sangue-cervellu impediscenu à l'agenti bioterapeuti di ghjunghje à i so miri in u sistema nervu cintrali, impedendu cusì u trattamentu efficace di e malatie neurologiche.Per scopre novi trasportatori di u cervellu in vivo, avemu introduttu una biblioteca di peptidi di fagi T7 è u sangue è u fluidu cerebrospinale (CSF) raccolti in serie cù un mudellu di grande piscina cunsciente cannulatu di ratti.I cloni di fagi specifichi sò stati assai arricchiti in CSF dopu quattru volte di selezzione.A prova di i peptidi candidati individuali hà revelatu un arricchimentu di più di 1000 volte in CSF.A bioattività di a consegna mediata da peptide à u core hè stata cunfirmata da una riduzione di 40% in u livellu di amiloide-β in u fluidu cerebrospinale utilizendu un inhibitore di peptide BACE1 ligatu à u novu peptide di transitu identificatu.Questi risultati suggerenu chì i peptidi identificati da i metudi di selezzione di fagi in vivo ponu esse veiculi utili per a consegna sistemica di macromolecule à u cervellu cù un effettu terapeuticu.
A ricerca di terapia mirata à u sistema nervu cintrali (CNS) hè largamente cuncentrata in l'identificazione di droghe ottimizzate è agenti chì mostranu proprietà di targeting CNS, cù menu sforzu per scopre i meccanismi chì guidanu a consegna di droga attiva à u cervellu.Questu hè cuminciatu à cambià avà cum'è a consegna di droghe, in particulare e grande molécule, hè una parte integrante di u sviluppu mudernu di droghe in neuroscienza.L'ambiente di u sistema nervu cintrali hè ben prutettu da u sistema di barriera cerebrovascular, custituitu da a barriera sangue-cervellu (BBB) ​​è a barriera sangue-cervellu (BCBB)1, facendu sfida à furnisce droghe à u cervellu1,2.Hè stimatu chì quasi tutte e droghe di grande molecule è più di 98% di e droghe di molecule petite sò eliminate da u cervellu3.Hè per quessa hè assai impurtante per identificà novi sistemi di trasportu di u cervellu chì furnisce una consegna efficiente è specifica di droghe terapeutiche à u CNS 4,5.In ogni casu, u BBB è u BCSFB presentanu ancu una excelente opportunità per a consegna di droghe cum'è penetranu è entranu in tutte e strutture di u cervellu attraversu a so vasculatura estensiva.Cusì, i sforzi attuali per aduprà metudi non invasivi di consegna à u cervellu sò largamente basati nantu à u mecanismu di trasportu mediatu da u receptore (PMT) chì utilizanu u receptore BBB6 endogenu.Malgradu i recenti avanzati chjave chì utilizanu a via di u receptore di a transferrina7,8, hè necessariu un più sviluppu di novi sistemi di consegna cù proprietà migliorate.À questu scopu, u nostru scopu era di identificà peptidi capaci di mediate u trasportu di CSF, postu chì in principiu puderanu esse aduprati per furnisce macromolecule à u SNC o per apre novi camini di receptori.In particulare, receptori specifichi è trasportatori di u sistema cerebrovascular (BBB è BSCFB) ponu serve cum'è miri potenziali per a consegna attiva è specifica di droghe bioterapeuti.U fluidu cerebrospinale (CSF) hè un pruduttu secretori di u plexus choroid (CS) è hè in cuntattu direttu cù u fluidu interstiziale di u cervellu attraversu u spaziu subaracnoide è u spaziu ventricular4.Ricertamenti hè statu dimustratu chì u fluidu cerebrospinale subaracnoide diffonde eccessivamente in l'interstiziu di u cervellu9.Speremu d'accede à u spaziu parenchymal usendu stu trattu di flussu subaracnoide o direttamente attraversu u BBB.Per ottene questu, avemu implementatu una robusta strategia di selezzione di fagi in vivo chì identifica idealmente i peptidi trasportati da una di queste duie strade distinte.
Avà descrivimu un metudu di screening di visualizazione di fagi in vivo sequenziale cù campionamentu di CSF accumpagnatu da sequenza d'altu throughput (HTS) per monitorà i turni di selezzione iniziale cù a più alta diversità di biblioteca.U screening hè statu realizatu nantu à ratti cuscenti cù una cannula grande cisterna (CM) implantata in permanenza per evità a contaminazione di sangue.Impurtante, stu approcciu selezziunate sia l'orientazione di u cervellu sia i peptidi cù attività di trasportu attraversu a barrera cerebrovascular.Avemu usatu i fagi T7 per via di a so piccula dimensione (~ 60 nm)10 è suggerenu chì sò adattati per u trasportu di vesiculi chì permettenu l'attraversu transcellulare di a barriera endoteliale è / o epiteliale-medulla.Dopu quattru round di panning, e pupulazioni di fagi sò state isolate chì mostranu un forte arricchimentu in vivo di CSF è l'associazione di microvessel cerebrali.Impurtante, avemu pussutu cunfirmà i nostri scuperti dimustrendu chì i peptidi candidati preferiti è sintetizzati chimicamente sò capaci di trasportà a carica di proteina in u fluidu cerebrospinale.Prima, l'effetti farmacodinamichi di u CNS sò stati stabiliti cumminendu un peptide di transitu principali cù un inhibitore di u peptide BACE1.In più di dimustrà chì e strategie di screening funzionale in vivo ponu identificà novi peptidi di trasportu di u cervellu cum'è trasportatori di carichi di proteine ​​​​efficaci, aspettemu chì approcci di selezzione funzionale simili diventenu ancu impurtanti in l'identificazione di novi percorsi di trasportu di u cervellu.
Basatu nantu à unità di furmazione di placche (PFU), dopu à u passu di imballaggio di fagi, una biblioteca di peptidi di fagi T7 lineari casuali 12-mer cù una diversità di circa 109 hè stata cuncepita è creata (vede Materiali è Metodi).Hè impurtante di nutà chì avemu analizatu currettamente sta biblioteca prima di panning in vivo.L'amplificazione di PCR di campioni di librerie di fagi utilizendu primers modificati generati ampliconi chì eranu direttamente applicabili à HTS (Figura supplementaria 1a).A causa di a) errori di sequenza HTS11, b) impattu nantu à a qualità di i primers (NNK) 1-12, è c) a presenza di fagi salvatichi (wt) (inserti di scheletri) in a biblioteca di standby, una prucedura di filtrazione di sequenza hè stata implementata per estrattà solu l'infurmazioni verificate di sequenza (Figura supplementaria 1b).Questi passi di filtru si applicanu à tutte e biblioteche di sequenza HTS.Per a biblioteca standard, un totale di 233,868 letture sò state ottenute, di quale 39% hà passatu i criteri di filtru è sò stati utilizati per l'analisi di a biblioteca è a selezzione per i turni successivi (Figura supplementaria 1c-e).E letture eranu principarmenti multiplici di 3 coppie di basi in lunghezza cù un piccu à 36 nucleotides (Figura Supplementaria 1c), cunfirmendu u disignu di a biblioteca (NNK) 1-12.In particulare, circa 11% di i membri di a biblioteca cuntenenu un insertu PAGISRELVDKL di spina dorsale salvatica (wt) di 12 dimensioni, è quasi a mità di e sequenze (49%) cuntenenu inserimenti o eliminazioni.L'HTS di a biblioteca di a biblioteca cunfirmò l'alta diversità di peptidi in a biblioteca: più di 81% di e sequenze di peptide sò stati truvati solu una volta è solu 1,5% hè accadutu in copie ≥4 (Figura Supplementaria 2a).E frequenze di l'aminoacidi (aa) in tutte e pusizioni 12 in u repertoriu correlavanu bè cù e frequenze previste per u numeru di codoni generati da u repertoriu degeneratu NKK (Figura Supplementaria 2b).A freccia osservata di i residui aa codificati da questi inserti correlated well with the calculated frequency (r = 0.893) (Supplementary Fig. 2c).A preparazione di biblioteche di fagi per l'iniezione include i passi di l'amplificazione è a rimozione di l'endotossina.Questu hè statu dimustratu prima per riduce potenzialmente a diversità di biblioteche di fagi12,13.Dunque, avemu sequenziatu una libreria di fagi amplificati da piastra chì avia subitu a rimozione di l'endotossina è a paragunò cù a biblioteca originale per stimà a frequenza di AA.Una forte correlazione (r = 0.995) hè stata osservata trà a piscina originale è a piscina amplificata è purificata (Figura Supplementaria 2d), chì indica chì a cumpetizione trà i cloni amplificati nantu à i platti cù u fago T7 ùn hà micca causatu preghjudiziu maiò.Questa paraguni hè basatu annantu à a freccia di i motivi tripeptidi in ogni biblioteca, postu chì a diversità di biblioteche (~ 109) ùn pò micca esse cumpletamente captu ancu cù HTS.L'analisi di frequenza di aa in ogni pusizioni palesanu un picculu preghjudiziu dipendente da a pusizione in l'ultimi trè pusizioni di u repertoriu ingressu (Figura Supplementaria 2e).In cunclusioni, avemu cunclusu chì a qualità è a diversità di a biblioteca eranu accettabili è solu cambiamenti minori in a diversità sò stati osservati per l'amplificazione è a preparazione di biblioteche di fagi trà parechje volte di selezzione.
U campionamentu di u fluidu cerebrospinal seriale pò esse realizatu cù l'implantazione chirurgica di una cannula in u CM di i rati cuscienti per facilità l'identificazione di u fago T7 injected intravenously (iv) via u BBB è / o BCSFB (Fig. 1a-b).Avemu usatu dui bracci di selezzione indipendenti (armi A è B) in i primi trè volte di selezzione in vivo (Fig. 1c).Aumentemu gradualmente a stringenza di a selezzione diminuendu a quantità tutale di fagi introduttu in i primi trè volte di selezzione.Per a quarta volta di panning, avemu cumminatu campioni da e rami A è B è eseguite trè selezioni indipendenti supplementari.Per studià e proprietà in vivo di e particelle di fagi T7 in stu mudellu, u fago salvaticu (insertu maestru PAGISRELVDKL) hè statu injectatu in i ratti via a vena di a coda.A ricuperazione di i fagi da u fluidu cerebrospinale è u sangue in i punti di u tempu hà dimustratu chì i fagi icosahedral T7 relativamente chjuchi avianu una rapida fase iniziale di clearance da u compartment di sangue (Figura supplementaria 3).Basatu nantu à i titri amministrati è u voluminu di sangue di i rati, avemu calculatu chì solu circa 1% in peso.phage da a dosa amministrata hè stata rilevata in u sangue 10 minuti dopu l'iniezione intravenosa.Dopu à sta decadenza rapida iniziale, una liberazione primaria più lenta hè stata misurata cù una mezza vita di 27,7 minuti.Impurtante, solu pochi fagi sò stati recuperati da u compartment CSF, chì indicanu un fondu bassu per a migrazione di fagi di tipu salvaticu in u compartment CSF (Figura supplementaria 3).In media, solu circa 1 x 10-3% titers di T7 phage in u sangue è 4 x 10-8% di i fagi inizialmente infusi sò stati rilevati in u fluidu cerebrospinal per tuttu u periodu di campionamentu (0-250 min).In particulare, a mezza vita (25,7 min) di u fago salvaticu in u fluidu cerebrospinal era simile à quella osservata in u sangue.Questi dati dimustranu chì a barriera chì separa u compartimentu CSF da u sangue hè intacta in i ratti cannulati CM, chì permettenu a selezzione in vivo di biblioteche di fagi per identificà i cloni chì sò facilmente trasportati da u sangue in u compartimentu CSF.
(a) Stabbilimentu di un metudu per re-sampling fluidu cerebrospinale (CSF) da una grande piscina.(b) Diagramma chì mostra a situazione cellulare di a barriera di u sistema nervu cintrali (CNS) è a strategia di selezzione aduprata per identificà i peptidi chì attraversanu a barriera sangue-cervellu (BBB) ​​è a barriera sangue-cervellu.(c) Diagramma di flussu di screening di phage in vivo.In ogni volta di selezzione, i phages (identificatori di l'animali in i frecce) sò stati injected intravenously.Dui rami alternativi indipendenti (A, B) sò guardati separatamente finu à a 4a volta di selezzione.Per i turni di selezzione 3 è 4, ogni clone di fagi estratto da CSF hè statu sequenziatu manualmente.(d) Cinetica di fagi isolati da sangue (cerchi rossi) è fluidu cerebrospinale (trianguli verdi) durante a prima volta di selezzione in dui ratti cannulati dopu l'iniezione intravenosa di a biblioteca di peptidi T7 (2 x 1012 fagi / animali).I quadri blu indicanu a cuncentrazione iniziale media di phage in u sangue, calculata da a quantità di phage injected, tenendu in contu u voluminu di sangue tutale.I quadrati neri indicanu u puntu di intersezzione di a linea y estrapolata da a concentrazione di fagi di sangue.(e,f) Presenta a frequenza relativa è a distribuzione di tutti i pussibuli motivi tripeptidi sovrapposti truvati in u peptide.U numaru di motivi truvati in 1000 letture hè mostratu.Significativamente (p <0.001) i motivi arricchiti sò marcati cù punti rossi.(e) Scatterplot di correlazione paragunendu a frequenza relativa di u mutivu tripeptide di a biblioteca injected cù u fago di sangue da l'animali #1.1 è #1.2.(f) Scatterplot di correlazione paragunendu e frequenze relative di i motivi di tripeptidi di fagi animali #1.1 è #1.2 isolati in sangue è fluidu cerebrospinale.(g, h) Rappresentazione di ID di sequenza di fagi arricchiti in sangue (g) versus biblioteche injected è fagi arricchiti in CSF (h) versus sangue dopu una volta di selezzione in vivo in i dui animali.A dimensione di u codice di una lettera indica a frequenza chì l'aminoacidu si trova in quella pusizione.Verde = polare, viola = neutro, blu = basico, rosso = acido e nero = amminoacidi idrofobici.A figura 1a, b hè stata cuncepita è prodotta da Eduard Urich.
Avemu iniettatu una biblioteca di peptidi di fagi in dui ratti di strumenti CM (cladi A è B) è fagi isolati da u fluidu cerebrospinale è u sangue (Figura 1d).A liberazione rapida iniziale di a biblioteca era menu pronunciata cumparatu cù u fage salvaticu.L'emivita media di a libreria injectata in i dui animali era di 24,8 minuti in sangue, simile à u fago salvaticu, è 38,5 minuti in CSF.I campioni di fagi di sangue è di fluidu cerebrospinal da ogni animali sò stati sottumessi à HTS è tutti i peptidi identificati sò stati analizati per a presenza di un cortu motivu tripeptide.I motivi tripeptidi sò stati scelti perchè furnisce una basa minima per a furmazione di struttura è l'interazzione peptide-proteina14,15.Avemu trovu una bona correlazione in a distribuzione di motivi trà a libreria di phage injected è i cloni estratti da u sangue di i dui animali (Fig. 1e).I dati indicanu chì a cumpusizioni di a biblioteca hè solu marginalmente arricchita in u compartmentu di sangue.E frequenze di aminoacidi è e sequenze di cunsensu sò state analizate in più in ogni pusizioni utilizendu una adattazione di u software Weblogo16.Curiosamente, avemu trovu un forte arricchimentu in i residui di glicina di sangue (Fig. 1g).Quandu u sangue era paragunatu cù i cloni selezziunati da CSF, una selezzione forte è una certa diselezzione di motivi sò stati osservati (Fig. 1f), è certi aminoacidi eranu preferenziali prisenti in pusizioni predeterminate in u membru 12 (Fig. 1h).In particulare, l'animali individuali differiscenu significativamente in u fluidu cerebrospinale, mentri l'arricchimentu di glicina di sangue hè statu osservatu in i dui animali (Figura Supplementaria 4a-j).Dopu un filtru strettu di dati di sequenza in u fluidu cerebrospinale di l'animali #1.1 è #1.2, un totale di 964 è 420 peptidi unichi 12-mer sò stati ottenuti (Figura Supplementaria 1d-e).I cloni di fagi isolati sò stati amplificati è sottumessi à una seconda volta di selezzione in vivo.Phage estratti da a seconda volta di selezzione sò stati sottumessi à HTS in ogni animali è tutti i peptidi identificati sò stati utilizati com'è input à un prugramma di ricunniscenza di motivi per analizà l'occurrence di motivi tripeptidi (Fig. 2a, b, ef).Comparatu à u primu ciculu di u phage recuperatu da CSF, avemu osservatu più selezzione è diselezzione di parechji motivi in ​​CSF in rami A è B (Fig. 2).Un algoritmu d'identificazione di a rete hè statu applicatu per determinà s'ellu rapprisentanu diversi mudelli di sequenza coherente.Una similarità chjara hè stata osservata trà e sequenze 12-dimensionali recuperate da CSF in u clade alternativu A (Fig. 2c, d) è u clade B (Fig. 2g, h).L'analisi cumminata in ogni ramu hà revelatu diversi profili di selezzione per i peptidi 12-mer (Figura Supplementaria 5c, d) è un aumentu di u rapportu di u titru CSF / sangue à u tempu per i cloni cumulati dopu a seconda volta di selezzione cumparatu cù a prima volta di selezzione (Figura Supplementaria 5e).).
Arricchimentu di motivi è peptidi in u fluidu cerebrospinale da duie volte successive di selezzione di visualizazione di fagi funzionali in vivo.
Tutti i fagi di u fluidu cerebrospinale recuperati da a prima volta di ogni animali (animali # 1.1 è # 1.2) sò stati riuniti, amplificati, HT-sequenziati è reinjected inseme (2 x 1010 phages / animale) 2 SM cannulated rats (# 1.1 → #).2.1 è 2.2, 1.2 → 2.3 è 2.4).(a, b, e, f) Scatterplots di correlazione paragunendu a frequenza relativa di motivi tripeptidi di tutti i fagi derivati ​​da CSF in a prima è a seconda volta di selezzione.Frequenza relativa è distribuzione di motivi chì rapprisentanu tutti i tripeptidi sovrapposti pussibuli truvati in peptidi in i dui orientamenti.U numaru di motivi truvati in 1000 letture hè mostratu.I motivi chì eranu significativamente (p <0.001) selezziunati o esclusi in una di e biblioteche paragunate sò evidenziati cù punti rossi.(c, d, g, h) Rappresentazione di logu di sequenza di tutte e sequenze lunghe di 12 amminoacidi ricche di CSF basate nantu à i turni 2 è 1 di a selezzione in vivo.A dimensione di u codice di una lettera indica a frequenza chì l'aminoacidu si trova in quella pusizione.Per rapprisintà u logò, a frequenza di sequenze CSF estratte da animali individuali trà dui turni di selezzione hè paragunata è e sequenze arricchite in a seconda volta sò mostrate: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 è (h) #1.2–#2.4.L'aminoacidi più arricchiti in una pusizioni data in (c, d) animali no.2.1 è nr.2.2 o (g, h) in l'animali no.2.3 è nò.2.4 sò mostrati in culore.Verde = polare, viola = neutro, blu = basico, rosso = acido e nero = amminoacidi idrofobici.
Dopu a terza volta di selezzione, avemu identificatu 124 sequenze di peptidi unichi (# 3.1 è # 3.2) da 332 cloni di fagi ricostituiti da CSF isolati da dui animali (Figura Supplementaria 6a).A sequenza LGSVS (18,7%) hà avutu a proporzione relativa più alta, seguita da l'inserzioni di tipu salvaticu PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) è SARGSWREIVSLS (2,2%).In a quarta volta finale, aghjustamu dui rami scelti indipindentamente da trè animali separati (Fig. 1c).Di i 925 cloni di fagi sequenziati recuperati da CSF, in a quarta volta avemu trovu 64 sequenze di peptidi unichi (Figura Supplementaria 6b), trà e quali a proporzione relativa di fagi salvatichi hè cascata à 0,8%.I cloni CSF più cumuni in a quarta volta eranu LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) è RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).L'intervallo di lunghezza di i peptidi selezziunati hè dovutu à inserimenti / eliminazioni di nucleotidi o codoni di stop prematuri in i primeri di a biblioteca quandu si usanu codoni degenerati per u disignu di a biblioteca NNK.I codoni di stop prematuri generanu peptidi più brevi è sò selezziunati perchè cuntenenu u mutivu favurevule aa.Peptidi più longu pò esse risultatu da inserimenti / delezioni in i primi di e librerie sintetiche.Questu pone u codon di stop designatu fora di u quadru è u leghje finu à chì un novu codon stop apparisce in aval.In generale, avemu calculatu i fatturi di arricchimentu per tutti i quattru turni di selezzione paragunendu i dati di input cù i dati di output di mostra.Per a prima volta di screening, avemu utilizatu titru di fagi di tipu salvaticu cum'è un riferimentu di fondo micca specificu.Curiosamente, a selezzione di phage negativu era assai forte in u primu ciculu CSF, ma micca in u sangue (Fig. 3a), chì pò esse dovutu à a bassa probabilità di diffusione passiva di a maiò parte di i membri di a biblioteca di peptide in u compartment CSF o i fagi parenti tendenu à esse più efficacimente ritenuti o eliminati da u sangue chì i bacteriophages.In ogni casu, in a seconda volta di panning, una forte selezzione di phages in CSF hè stata osservata in i dui cladi, chì suggerenu chì a volta precedente hè stata arricchita in phages chì mostranu peptidi chì prumove l'uptake CSF (Fig. 3a).À novu, senza arricchimentu di sangue significativu.Ancu in a terza è a quarta volta, i cloni di fagi sò stati arricchiti significativamente in CSF.Cumparendu a freccia relativa di ogni sequenza di peptide unica trà l'ultimi dui turni di selezzione, truvamu chì e sequenze eranu ancu più arricchite in a quarta volta di selezzione (Fig. 3b).Un totale di 931 motivi tripeptidi sò stati estratti da tutte e 64 sequenze di peptide uniche utilizendu i dui orientazioni peptide.I motivi più arricchiti in a quarta volta sò stati esaminati più attentamente per i so profili di arricchimentu in tutti i tondi cumparatu cù a biblioteca injected (cut-off: 10% arricchimentu) (Figura Supplementaria 6c).I mudelli generali di selezzione dimustranu chì a maiò parte di i mutivi studiati sò stati arricchiti in tutti i turni previ di i dui rami di selezzione.Tuttavia, certi motivi (per esempiu SGL, VSG, LGS GSV) eranu principarmenti da u clade alternativu A, mentre chì altri (per esempiu FGW, RTN, WGF, NTR) sò stati arricchiti in u clade alternativu B.
Validazione di u trasportu CSF di peptidi mostrati in fagi arricchiti in CSF è peptidi leader biotinilati cunjugati à carichi di streptavidina.
(a) Rapporti di arricchimentu calculati in tutti i quattru round (R1-R4) basati nantu à i tittuli di fagi (PFU) injected (input = I) è determinati phage CSF (output = O).I fatturi di arricchimentu per l'ultimi trè volte (R2-R4) sò stati calculati per paragunà cù a volta precedente è a prima volta (R1) cù dati di pesu.I bars aperti sò fluidu cerebrospinale, i bars ombreggiati sò plasma.(*** p<0,001, basatu annantu à u test t di Student).(b) Lista di i peptidi fagi più abbundanti, classificati secondu a so proporzione relativa à tutti i fagi cullati in CSF dopu a round 4 di selezzione.I sei cloni di fagi più cumuni sò evidenziati in culore, numerati è i so fatturi d'arricchimentu trà i turni 3 è 4 di selezzione (insetti).(c, d) I sei cloni di fagi più arricchiti, fagi vacanti è librerie di peptidi di fagi parentali da a round 4 sò stati analizati individualmente in un mudellu di campionamentu CSF.CSF è campioni di sangue sò stati cullati à i punti di tempu indicati.(c) Quantità uguali di 6 cloni di fagi candidati (2 x 1010 fagi/animali), fagi vuoti (# 1779) (2 x 1010 fagi/animali) è librerie di peptidi di fagi di stock (2 x 1012 fagi/animali) Iniettate almenu 3 CM separati in l'animali veduti per via di l'administazione di l'animali.A farmacocinetica CSF di ogni clone di fagi injected è libreria di peptidi di fagi in u tempu hè mostrata.(d) mostra u rapportu mediu CSF / sangue per tutti i fagi recuperati / mL durante u tempu di campionamentu.(e) Quattru peptidi di capu sinteticu è un cuntrollu scrambled sò stati ligati cù biotina à streptavidina attraversu u so N-terminale (display tetramer) seguita da iniezione (vena di coda iv, 10 mg streptavidin / kg).Almenu trè ratti intubati (N = 3).).I campioni di CSF sò stati cullati à i punti di tempu indicati è e cuncintrazioni di streptavidina sò stati misurati da CSF anti-streptavidin ELISA (nd = micca rilevatu).(* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, basatu nantu à a prova ANOVA).(f) Comparazione di a sequenza d'aminoacidu di u clone di peptide di phage più arricchitu # 2002 (viola) cù altri cloni di peptidi di fagi selezziunati da a 4a volta di selezzione.Frammenti di aminoacidi identici è simili sò codificati in culore.
Di tutti i phages arricchiti in a quarta volta (Fig. 3b), sei cloni candidati sò stati selezziunati per più analisi individuali in u mudellu di mostra CSF.Quantità ugguali di sei fagi candidati, phage vacanti (senza inserimentu) è librerie di peptidi di prophage sò stati injectati in trè animali CM cannulati, è a farmacocinetica hè stata determinata in CSF (Fig. 3c) è sangue (Supplementary Fig. 7).Tutti i cloni di fagi testati anu destinatu à u compartmentu CSF à un livellu 10-1000 volte più altu di quellu di u fago di cuntrollu viotu (# 1779).Per esempiu, i cloni # 2020 è # 2077 avianu circa 1000 volte più alti titru di CSF cà u fago di cuntrollu.U prufilu farmacocineticu di ogni peptide selezziunatu hè diversu, ma tutti anu una alta capacità di homing CSF.Avemu osservatu una diminuzione constante in u tempu per i cloni #1903 è #2011, mentri per i cloni #2077, #2002 è #2009 un aumentu durante i primi 10 minuti puderia indicà u trasportu attivu ma deve esse verificatu.I cloni #2020, #2002 è #2077 si stabilizzavanu à alti livelli, mentri a cuncentrazione CSF di u clone #2009 diminuì lentamente dopu à l'aumentu iniziale.Dopu avemu paragunatu a freccia relativa di ogni candidatu CSF cù a so cuncentrazione di sangue (Fig. 3d).A correlazione di u titru mediu di ogni candidatu CSF cù u so titru di sangue in tutti i tempi di campionamentu hà dimustratu chì trè di i sei candidati eranu significativamente arricchiti in sangue CSF.Curiosamente, u clone #2077 hà dimustratu una stabilità di sangue più altu (Figura supplementaria 7).Per cunfirmà chì i peptidi stessi sò capaci di trasportà attivamente carichi altru da particelle di fagi in u compartment CSF, avemu sintetizatu quattru peptidi leader derivati ​​cù biotina à u N-terminale induve i peptidi si attaccanu à a particella di phage.I peptidi biotinilati (n. 2002, 2009, 2020 è 2077) sò stati cunjugati cù streptavidin (SA) per ottene forme multimeriche chì imitanu un pocu a geometria di fagi.Stu furmatu ci hà ancu permessu di misurà l'esposizione SA in u sangue è u fluidu cerebrospinale cum'è peptidi di prutezione di trasportu di carica.Impurtante, i dati di phage puderanu esse ripruduciutu quandu i peptidi sintetici sò stati amministrati in questu formatu SA-conjugated (Fig. 3e).I peptidi scrambled avianu menu esposizione iniziale è eliminazione CSF più veloce cù livelli indetectable in 48 ore.Per sapè in i percorsi di consegna di questi cloni di fagi peptidici in u spaziu CSF, avemu analizatu a localizazione di i colpi di peptidi di fagi individuali utilizendu immunoistochimica (IHC) per detectà direttamente particelle di fagi 1 ora dopu l'iniezione intravenosa in vivo.In particulare, i cloni # 2002, # 2077, è # 2009 puderanu esse rilevati da una forte colorazione in i capillari cerebrali, mentre chì u fago di cuntrollu (# 1779) è u clone # 2020 ùn sò micca stati rilevati (Figura supplementaria 8).Questu suggerisce chì questi peptidi cuntribuiscenu à l'effettu nantu à u cervellu precisamente attraversu u BBB.Un analisi più detallatu hè necessariu per pruvà sta ipotesi, postu chì a strada BSCFB pò ancu esse implicata.Quandu si compara a sequenza d'aminoacidi di u clone più arricchitu (# 2002) cù altri peptidi selezziunati, hè statu nutatu chì alcuni di elli anu estensioni d'aminoacidi simili, chì ponu indicà un mecanismu di trasportu simili (Fig. 3f).
A causa di u so prufilu di plasma unicu è di un aumentu significativu di CSF à u tempu, u clone di phage display #2077 hè statu più esploratu annantu à un periudu di 48 ore più longu è hà sappiutu ripruduce l'aumentu rapidu di CSF osservatu in associazione cù i livelli SA sustinuti (Fig. 4a).In quantu à l'altri cloni di fagi identificati, # 2077 macchiatu forte per i capillari cerebrali è dimustrava una colocalizazione significativa cù a lectina di marcatore capillare quandu si vede à una risoluzione più alta è possibbilmente una certa colorazione in u spaziu parenchimale (Figura 4b).Per investigà se l'effetti farmacològichi mediati da peptidi puderanu esse ottenuti in u CNS, avemu fattu un esperimentu in quale versioni biotinilate di i) u peptide di transitu #2077 è ii) u peptide inhibitore BACE1 sò stati mischiati cù SA à dui rapporti diffirenti.Per una cumminazione avemu usatu solu l'inhibitore di peptide BACE1 è per l'altru avemu usatu un rapportu 1: 3 di l'inibitore di peptide BACE1 à u peptide #2077.I dui campioni sò stati amministrati per via intravenosa è i livelli di sangue è di fluidu cerebrospinal di peptide beta-amiloide 40 (Abeta40) sò stati misurati cù u tempu.Abeta40 hè stata misurata in CSF perchè riflette l'inibizione di BACE1 in u parenchima cerebrale.Cum'è s'aspittava, i dui cumplessi riduttanu significativamente i livelli di sangue di Abeta40 (Fig. 4c, d).Tuttavia, solu campioni chì cuntenenu una mistura di peptide no.2077 è un inhibitore di u peptide BACE1 cunjugatu à SA hà causatu una diminuzione significativa in Abeta40 in u fluidu cerebrospinal (Fig. 4c).I dati mostranu chì u peptide no.2077 hè capaci di trasportà a proteina SA 60 kDa in u CNS è ancu induce effetti farmacològichi cù inhibitori SA-conjugated di u peptide BACE1.
(a) Iniezione clonale (2 × 10 fagi/animali) di fagi T7 chì mostra profili farmacocinetici à longu andà di CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) è fagi di cuntrollu senza iniezione (#1779) in almenu trè ratti intubati CM.(b) immagine microscòpica Confocal di microvessels corticale rapprisentanti in ratti phage-injected (2 × 10 10 phages / animale) chì mostra counterstaining di peptide # 2077 è navi (lectina).Questi cloni di fagi sò stati amministrati à 3 rati è permessi di circulà per 1 ora prima di perfusione.I cervelli sò stati seccionati è macchiati cù anticorpi policlonali marcati FITC contr'à a capside di u fago T7.Dieci minuti prima di a perfusione è a fissazione successiva, a lectina marcata DyLight594 hè stata amministrata per via intravenosa.L'imaghjini fluorescenti chì mostranu a tintura di lectina (rossu) di u latu luminale di i microvessels è i fagi (verde) in u lumen di i capillari è u tissutu cerebrale perivascular.A barra di scala currisponde à 10 µm.(c, d) U peptide inibitoriu BACE1 biotinilatu solu o in cumminazione cù u peptide di transitu biotinilatu # 2077 hè stata accoppiata à streptavidin seguita da iniezione intravenosa di almenu trè ratti CM canulati (10 mg streptavidin / kg).A riduzzione mediata da l'inibitore di peptide BACE1 in Aβ40 hè stata misurata da Aβ1-40 ELISA in sangue (rossu) è fluidu cerebrospinale (aranciu) à i punti di tempu indicati.Per una megliu chjarità, una linea puntellata hè tracciata nantu à u graficu à una scala di 100%.(c) Riduzzione percentuale in Aβ40 in u sangue (trianguli rossi) è u fluidu cerebrospinale (trianguli aranciu) in ratti trattati cù streptavidina cunjugata à u peptide di transitu #2077 è u peptide inhibitore BACE1 in un rapportu 3: 1.(d) Riduzzione percentuale in sangue Aβ40 (cerchi rossi) è fluidu cerebrospinal (circuli aranciu) di ratti trattati cù streptavidina accoppiata à un peptide inhibitore BACE1 solu.A concentrazione di Aβ in u cuntrollu era 420 pg / ml (deviazione standard = 101 pg / ml).
A visualizazione di fagi hè stata appiicata cù successu in parechje aree di a ricerca biomedica17.Stu metudu hè statu utilizatu per studii di diversità vascular in vivo18,19 è ancu per studii destinati à i navi cerebrali20,21,22,23,24,25,26.In questu studiu, avemu allargatu l'applicazione di stu metudu di selezzione micca solu à l'identificazione diretta di peptidi destinati à i vasi cerebrali, ma ancu à a scuperta di candidati cù pruprietà di trasportu attivu per attraversà a barrera sangue-cervellu.Avà descrivimu u sviluppu di una prucedura di selezzione in vivo in ratti intubati CM è dimustrà u so potenziale per identificà peptidi cù proprietà di homing CSF.Utilizendu u fago T7 chì mostra una biblioteca di peptidi casuali 12-mer, avemu statu capace di dimustrà chì u fago T7 hè abbastanza chjucu (circa 60 nm di diametru)10 per esse adattatu à a barriera hematoencefalica, attraversu cusì direttamente a barriera hematoencefalica o plexus coroide.Avemu osservatu chì a cugliera di CSF da i ratti CM cannulati era un metudu di screening funzionale in vivo ben cuntrullatu, è chì u fago estratto ùn hè micca solu legatu à a vasculatura, ma funziona ancu cum'è un trasportatore attraversu a barriera sangue-cervellu.Inoltre, raccogliendu simultaneamente sangue è applicà HTS à CSF è fagi derivati ​​​​di sangue, avemu cunfirmatu chì a nostra scelta di CSF ùn era micca influenzata da l'arricchimentu di sangue o l'idoneità per l'espansione trà e turni di selezzione.Tuttavia, u compartmentu di u sangue hè parti di a prucedura di selezzione, postu chì i fagi capaci di ghjunghje à u compartmentu CSF devenu sopravvive è circulate in u sangue abbastanza longu per arricchisce in u cervellu.Per caccià l'infurmazioni di sequenza affidabile da i dati HTS crudi, avemu implementatu filtri adattati à l'errori di sequenza specifichi di a piattaforma in u flussu di travagliu di analisi.Incorporandu parametri cinetichi in u metudu di screening, avemu cunfirmatu a farmacocinetica rapida di i fagi T7 di tippu salvaticu (t½ ~ 28 min) in u sangue24, 27, 28 è ancu determinatu a so mezza vita in u fluidu cerebrospinale (t½ ~ 26 min) per minutu).Malgradu i profili farmacocinetici simili in u sangue è u CSF, solu u 0.001% di a cuncentrazione di sangue di fagi puderia esse rilevatu in CSF, chì indica una bassa mobilità di fondo di u fago T7 salvaticu attraversu a barriera sangue-cervellu.Stu travagliu mette in risaltu l'impurtanza di a prima volta di selezzione quandu si usanu strategie di panning in vivo, in particulare per i sistemi di fagi chì sò sbulicati rapidamente da a circulazione, postu chì pochi cloni sò capaci di ghjunghje à u compartimentu CNS.Cusì, in a prima volta, a riduzzione di a diversità di a biblioteca era assai grande, postu chì solu un numaru limitatu di cloni sò stati eventualmente cullati in questu mudellu CSF assai strettu.Questa strategia di panning in vivo includeu parechji passi di selezzione cum'è l'accumulazione attiva in u compartment CSF, a survival clone in u compartment di u sangue, è a rimozione rapida di i cloni di fagi T7 da u sangue in i primi 10 minuti (Fig. 1d è Supplementary Fig. 4M).).Cusì, dopu à a prima volta, diversi cloni di fagi sò stati identificati in CSF, ancu s'è a listessa piscina iniziale hè stata utilizata per l'animali individuali.Questu suggerisce chì parechji passi stretti di selezzione per e biblioteche fonte cù un gran numaru di membri di a biblioteca risultanu in una riduzione significativa di a diversità.Dunque, l'avvenimenti casuali diventeranu una parte integrante di u prucessu di selezzione iniziale, influenzendu assai u risultatu.Hè prubabile chì parechji di i cloni in a biblioteca originale avianu una propensione di arricchimentu CSF assai simili.In ogni casu, ancu in e stesse cundizioni spirimintali, i risultati di selezzione pò differisce per u picculu numeru di ogni clone particulari in a piscina iniziale.
I motivi arricchiti in CSF sò diffirenti di quelli in u sangue.Curiosamente, avemu nutatu u primu cambiamentu versu i peptidi ricchi di glicina in u sangue di l'animali individuali.(Fig. 1g, Supplementary Figs. 4e, 4f).Fagi chì cuntenenu peptidi di glicina pò esse più stabile è menu prubabile di esse eliminati da a circulazione.Tuttavia, sti peptidi ricchi di glicina ùn sò micca stati rilevati in i campioni di fluidu cerebrospinal, chì suggerenu chì e biblioteche curate passanu per dui passi di selezzione diffirenti: unu in u sangue è un altru permessu di accumulà in u fluidu cerebrospinal.I cloni arricchiti in CSF risultanti da a quarta volta di selezzione sò stati assai pruvati.Quasi tutti i cloni testati individualmente sò stati cunfirmati chì sò arricchiti in CSF cumparatu cù u fago di cuntrollu in biancu.Un colpu di peptide (# 2077) hè statu esaminatu in più detail.Hà dimustratu una semivita di plasma più longa cumparata cù altri colpi (Figura 3d è Figura Supplementaria 7), è interessante, stu peptide cuntene un residu di cisteina à u C-terminale.Recentemente hè statu dimustratu chì l'aghjunzione di cisteina à i peptidi pò migliurà e so proprietà farmacocinetiche ligandu à l'albumina 29.Questu hè attualmente scunnisciutu per u peptide #2077 è richiede più studiu.Certi peptidi dimustranu una dependenza di valenza in l'arricchimentu CSF (dati micca mostrati), chì pò esse ligatu à a geometria di a superficia mostrata di a capside T7.U sistema T7 chì avemu usatu dimustrava 5-15 copie di ogni peptide per particella di phage.L'IHC hè stata realizata nantu à i cloni di fagi di piombo candidatu injected intravenously in a corteccia cerebrale di i rati (Figura Supplementaria 8).I dati dimustranu chì almenu trè cloni (n ° 2002, n ° 2009 è n ° 2077) interazzione cù u BBB.Resta da esse determinatu se sta interazzione BBB risultatu in l'accumulazione di CSF o u muvimentu di sti cloni direttamente à u BCSFB.Impurtante, dimustramu chì i peptidi selezziunati conservanu a so capacità di trasportu CSF quandu sintetizzati è ligati à a carica di proteina.U ligame di i peptidi biotinilati N-terminali à SA ripete essenzialmente i risultati ottenuti cù i so rispettivi cloni phage in u sangue è u fluidu cerebrospinal (Fig. 3e).Infine, mostramu chì u peptide di piombu #2077 hè capaci di prumove l'azzione cerebrale di un inhibitore di peptide biotinilatu di BACE1 cunjugatu à SA, causannu effetti farmacodinamichi pronunzianu in u CNS per riduce significativamente i livelli di Abeta40 in CSF (Fig. 4).Ùn pudemu micca identificà alcunu omologu in a basa di dati eseguendu una ricerca d'omologia di sequenza di peptide di tutti i successi.Hè impurtante di nutà chì a dimensione di a biblioteca T7 hè di circa 109, mentri a dimensione di a biblioteca teorica per 12-mers hè 4 x 1015. Per quessa, avemu sceltu solu una piccula parte di u spaziu di diversità di a biblioteca di peptide 12-mer, chì pò significà chì i peptidi più ottimizzati ponu esse identificati da evaluà u spaziu di sequenza adiacente identificata.Ipoteticamente, unu di i mutivi perchè ùn avemu micca truvatu alcunu omologu naturali di sti peptidi pò esse diselezzione durante l'evoluzione per impedisce l'entrata incontrollata di certi motivi peptidi in u cervellu.
Inseme, i nostri risultati furniscenu una basa per u futuru travagliu per identificà è caratterizà i sistemi di trasportu di a barriera cerebrovascular in vivo in più detail.A cunfigurazione basica di stu metudu hè basatu annantu à una strategia di selezzione funzionale chì ùn solu identifica i cloni cù proprietà di ubligatoriu vascular cerebrale, ma include ancu un passu criticu in quale i cloni di successu anu attività intrinseca per attraversà e barriere biologiche in vivo in u compartimentu CNS.hè di spiegà u miccanisimu di trasportu di sti peptidi è a so preferenza per u ligame à a microvasculatura specifica di a regione di u cervellu.Questu pò guidà à a scuperta di novi camini per u trasportu di u BBB è i receptori.Esperemu chì i peptidi identificati ponu ligà direttamente à i receptori cerebrovascular o à i ligandi circulanti trasportati attraversu u BBB o BCSFB.I vettori di peptide cù l'attività di trasportu CSF scuperti in stu travagliu seranu più investigati.Attualmente studiemu a specificità cerebrale di questi peptidi per a so capacità di attraversà u BBB è / o BCSFB.Questi novi peptidi seranu strumenti estremamente preziosi per a scuperta potenziale di novi receptori o percorsi è per u sviluppu di novi piattaforme altamente efficaci per a consegna di macromolecole, cum'è biologiche, à u cervellu.
Cannulate a grande cisterna (CM) utilizendu una mudificazione di u metudu descrittu prima.I ratti Wistar anesthetizzati (200-350 g) sò stati muntati nantu à un apparatu stereotaxic è una incisione mediana hè stata fatta nantu à u scalp rasatu è preparatu asepticamente per espose u craniu.Perforà dui buchi in l'area di a fascia superiore è fissa i viti di fissazione in i buchi.Un foru supplementu hè statu perforatu in a cresta occipitale laterale per a guida stereotactica di una cannula in acciaio inox in u CM.Applicà u cimentu dentale intornu à a cannula è assicurate cù viti.Dopu a foto-curing è l'endurcimentu di cimentu, a ferita di a pelle hè stata chjusa cù 4/0 supramid suture.A pusizione curretta di a cannula hè cunfirmata da a fuga spontanea di u fluidu cerebrospinale (CSF).Eliminate u ratu da l'apparatu stereotaxicu, riceve una cura postoperatoria adattata è a gestione di u dolore, è permettenu di ricuperà per almenu una settimana finu à chì i signali di sangue sò osservati in u fluidu cerebrospinal.I ratti Wistar (Crl:WI/Han) sò stati ottenuti da Charles River (Francia).Tutti i rati sò stati manteni in cundizioni specifiche senza patogeni.Tutti l'esperimenti di l'animali sò stati appruvati da l'Uffiziu Veterinariu di a Cità di Basilea, Svizzera, è sò stati realizati in cunfurmità cù a Licenza d'Animale N ° 2474 (Valutazione di u Trasportu di u Cervellu Attivu da Misurazione di Livelli di Candidati Terapèuti in u Fluid Cerebrospinal è Brain of Rat).
Mantene delicatamente u ratu cuscente cù a cannula CM in manu.Retirer Datura de la canule et recueillir 10 µl de fluide céphalorachidien à flux spontané.Siccomu a patency di a cannula hè stata ultimamente cumprumessa, solu i campioni di fluidu cerebrospinale chjaru senza evidenza di contaminazione di sangue o decolorazione sò stati inclusi in stu studiu.In parallelu, circa 10-20 μl di sangue hè stata presa da una piccula incisione à a punta di a cuda in tubi cù heparin (Sigma-Aldrich).U CSF è u sangue sò stati raccolti in diversi punti di tempu dopu l'iniezione intravenosa di fago T7.Circa 5-10 μl di fluidu sò stati scartati prima di ogni mostra di CSF hè stata cullata, chì currisponde à u voluminu mortu di u cateteru.
I biblioteche sò stati generati cù u vettore T7Select 10-3b cum'è descrittu in u manuale di u sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).In breve, un insertu di DNA di 12-mer aleatoriu hè statu sintetizatu in u seguente formatu:
U codon NNK hè stata utilizata per evità i codoni doppiu stop è l'overespressione di aminoacidi in l'inseritu.N hè un rapportu equimolar mistu manualmente di ogni nucleotide, è K hè un rapportu equimolar mistu manualmente di nucleotidi adenina è citosina.E regioni single stranded sò state cunvertite in DNA double stranded per una incubazione ulteriore cù dNTP (Novagen) è l'enzima Klenow (New England Biolabs) in u buffer Klenow (New England Biolabs) per 3 ore à 37 ° C.Dopu à a reazione, l'ADN à doppia catena hè stata recuperata da a precipitazione di EtOH.L'ADN risultante hè statu digeritu cù l'enzimi di restrizione EcoRI è HindIII (i dui da Roche).L'inserzione clivata è purificata (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) hè stata allora ligata in-frame in un vettore T7 pre-clivatu dopu l'aminoacidu 348 di u genu capside 10B.I riazzioni di Ligation sò stati incubati à 16 ° C per 18 ore prima di imballaggio in vitro.L'imballaggio di fagi in vitro hè statu realizatu secondu l'istruzzioni furnite cù u kit di clonazione T7Select 10-3b (Novagen) è a suluzione di imballaggio hè stata amplificata una volta per a lisi cù Escherichia coli (BLT5615, Novagen).I lisati sò stati centrifugati, titrati è congelati à -80 ° C. cum'è una solu suluzione di glycerol.
Amplificazione diretta da PCR di regioni variabili di fagi amplificate in brodo o piastra usando primers di fusione 454/Roche-amplicon proprietari.U primer di fusione in avanti cuntene sequenze chì fiancheghjanu a regione variabile (NNK) 12 (specifica à u mudellu), GS FLX Titanium Adapter A, è una sequenza di chjave di biblioteca di quattru basi (TCAG) (Figura supplementaria 1a):
U primer di fusione inversa cuntene ancu biotina attaccata à catturà perle è l'adattatore GS FLX Titanium B necessariu per l'amplificazione clonale durante l'emulsione PCR:
L'ampliconi sò stati sottumessi à 454/Roche pyrosequencing secondu u protocolu 454 GS-FLX Titanium.Per la sequenza manuale Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), l'ADN del fago T7 è stato amplificato da PCR e sequenziato con i seguenti coppie di primer:
L'inserti da e placche individuali sò stati sottumessi à l'amplificazione PCR cù u Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (sicondu l'istruzzioni di u fabricatore).Eseguite un startu caldu (10 min à 95 ° C) è 35 cicli di spinta (50 s à 95 ° C, 1 min à 50 ° C, è 1 min à 72 ° C).
Fagi da biblioteche, fagi salvatichi, fagi salvati da CSF è sangue, o cloni individuali sò stati amplificati in Escherichia coli BL5615 in brodo TB (Sigma Aldrich) o in piatti da 500 cm2 (Thermo Scientific) per 4 h à 37 ° C.I fagi sò stati estratti da e placche risciacquando e piastre cù un tampone Tris-EDTA (Fluka Analytical) o cullendu e placche cù punte di pipette sterili.I fagi sò stati isolati da u surnatante di a cultura o da u tampone d'estrazione cù una volta di precipitazione di polietilene glycol (PEG 8000) (Promega) è risuspende in tampon Tris-EDTA.
U fago amplificatu hè statu sottumessu à 2-3 rounds di rimozione di endotoxin utilizendu perle di rimozione di endotoxin (Miltenyi Biotec) prima di iniezione intravenosa (IV) (500 μl / animale).In a prima volta, 2 × 1012 phages sò stati introdotti;in u sicondu, 2 × 1010 phages;in u terzu è quartu turnu di selezzione, 2 × 109 phages per animali.U cuntenutu di fagi in CSF è campioni di sangue raccolti à i punti di tempu indicati hè statu determinatu da u conte di placche secondu l'istruzzioni di u fabricatore (manuale di u sistema T7Select).A selezione di fagi hè stata fatta per iniezione intravenosa di biblioteche purificate in a vena di a coda o per re-iniezione di fagi estratti da CSF da a volta di selezzione precedente, è i raccolti successivi sò stati eseguiti à 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, è 240 min CSF è campioni di sangue rispettivamente.Un totale di quattru volte di panning in vivo sò stati realizati in quale i dui rami selezziunati sò stati guardati separatamente è analizati durante i primi trè volte di selezzione.Tutti l'inserti di fagi estratti da CSF da i primi dui turni di selezzione sò stati sottumessi à 454 / Roche pyrosequencing, mentri tutti i cloni estratti da CSF da l'ultimi dui turni di selezzione sò stati sequenziati manualmente.Tutti i fagi di sangue da a prima volta di selezzione sò stati ancu sottumessi à 454 / Roche pyrosequencing.Per l'iniezione di cloni di fagi, i fagi selezziunati sò stati amplificati in E. coli (BL5615) nantu à 500 cm2 plates à 37 ° C per 4 ore.I cloni selezziunati individualmente è sequenziati manualmente sò stati propagati in mediu TB.Dopu l'estrazione di fagi, a purificazione è a rimozione di l'endotossina (cum'è descritta sopra), 2 × 1010 fagi / animale in 300 μl sò stati iniettati per via intravenosa in una vena di coda.
Preprocessing è filtrazione qualitativa di dati di sequenza.I dati Raw 454/Roche sò stati cunvertiti da un formatu di mappa di flussu standard binari (sff) à un formatu leggibile umanu Pearson (fasta) cù u software di u venditore.Ulteriore trasfurmazione di a sequenza di nucleotidi hè stata realizata utilizendu prugrammi è script privati ​​​​C (pacchettu di software ineditu) cum'è descrittu quì sottu.L'analisi di dati primari include strette prucedure di filtrazione multi-stadi.Per filtrà e letture chì ùn cuntenenu micca una sequenza di DNA di inserimentu di 12mer validu, e letture sò state allineate in sequenza à l'etichetta iniziale (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), l'etichetta di stop (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) è l'inserzione di fondo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utilizendu u Needleman-Wunsch globale.allineamentu chì permette finu à 2 inconsistenze per allinamentu31.Per quessa, leghjite senza tag di start è stop è leghje chì cuntenenu inserti di fondo, vale à dì, allineamenti chì superanu u numeru permessu di mistches, sò stati eliminati da a biblioteca.In quantu à e letture rimanenti, a sequenza di DNA N-mer chì si estende da a marca di partenza è finisce prima di a marca di stop hè stata escisata da a sequenza di lettura originale è ulteriormente trattata (in seguitu "inseritu").Dopu a traduzzione di l'inserimentu, a parte dopu à u primu codon stop à l'estremità 5' di u primer hè eliminata da l'inseritu.Inoltre, i nucleotidi chì portanu à codoni incompleti à l'estremità 3' di u primer sò ancu eliminati.Per escludiri l'inserzioni chì cuntenenu solu sequenze di fondo, l'inserzioni tradutte chì cumincianu cù u mudellu di aminoacidu "PAG" sò stati ancu eliminati.Peptidi cù una longa post-traduzzione di menu di 3 aminoacidi sò stati eliminati da a biblioteca.Infine, sguassate a redundanza in a piscina di inserimentu è determina a freccia di ogni inserimentu unicu.I risultati di questa analisi includenu una lista di sequenze di nucleotidi (inserti) è e so frequenze (leghjite) (Figuri Supplementari 1c è 2).
Inserzioni di DNA N-mer di Gruppu per similitudine di sequenza: Per eliminà l'errori di sequenza specifichi di 454/Roche (cum'è prublemi cù estensioni di l'omopolimeri di sequenza) è sguassate redundancies menu impurtanti, l'inserti di sequenza di DNA N-mer filtrati prima (inserti) sò ordinati per similarità.inserzioni (finu à 2 basi non-matching permessi) utilizendu un algoritmu iterativu definitu cusì: l'inserzioni sò ordinati prima da a so frequenza (da più altu à u più bassu), è s'ellu sò listessi, da a so sorte secondaria per lunghezza (da più longa à più corta) ).Cusì, l'inserzioni più frequenti è longu definiscenu u primu "gruppu".A frequenza di u gruppu hè stabilitu à a frequenza chjave.Allora, ogni inserzione chì resta in a lista ordinata hè stata pruvata à esse aghjuntu à u gruppu per l'allineamentu Needleman-Wunsch.Se u nùmeru di discordanza, inserimenti, o eliminazioni in un allinamentu ùn supera micca u limitu di 2, una inserzione hè aghjuntu à u gruppu, è a freccia generale di u gruppu hè aumentata da quante volte l'inserimentu hè aghjuntu.L'inserti aghjuntu à un gruppu sò marcati cum'è utilizati è esclusi da ulteriore trasfurmazioni.Se a sequenza di inserimentu ùn pò micca esse aghjuntu à un gruppu digià esistente, a sequenza di inserimentu hè aduprata per creà un novu gruppu cù a freccia di inserimentu adattata è marcatu cum'è utilizatu.L'iterazione finisce quandu ogni sequenza di inserimentu hè stata aduprata per furmà un novu gruppu o pò esse inclusu in un gruppu digià esistente.Dopu tuttu, inseriti raggruppati custituiti da nucleotidi sò eventualmente tradutti in sequenze di peptidi (biblioteche di peptidi).U risultatu di sta analisi hè un inseme d'inserzioni è e so frequenze currispundenti chì custituiscenu u numeru di letture consecutivi (Figura Supplementaria 2).
Generazione di motivi: Basatu nantu à una lista di peptidi unichi, hè stata creata una biblioteca chì cuntene tutti i mudelli di aminoacidi pussibuli (aa) cum'è mostratu quì sottu.Ogni mudellu pussibule di lunghezza 3 hè stata estratta da u peptide è u so mudellu inversu hè aghjuntu cù una libreria di motivi cumuni chì cuntene tutti i mudelli (tripeptidi).Biblioteche di motivi altamente ripetitivi sò stati sequenziati è a redundanza eliminata.Allora, per ogni tripeptide in a biblioteca di motivi, avemu verificatu a so prisenza in a biblioteca utilizendu strumenti di calculu.In questu casu, a freccia di u peptide chì cuntene u tripeptide di motivi truvati hè aghjuntu è assignatu à u mutivu in a libreria di motivi ("number of motifs").U risultatu di a generazione di motivi hè un array bidimensionale chì cuntene tutte l'occurrence di tripeptidi (motivi) è i so valuri rispettivi, chì sò u numeru di letture di sequenza chì risultatu in u mutivu currispundenti quandu i leghje sò filtrati, raggruppati è tradutti.Metriche cum'è descritte in detail sopra.
Normalizazione di u numeru di motivi è scatterplots currispondenti: U numeru di motivi per ogni mostra hè statu nurmalizatu cù
induve ni hè u numeru di letture chì cuntenenu u tema i.Cusì, vi rapprisenta a freccia percentuale di leghje (o peptidi) chì cuntenenu u mutivu i in u sample.I valori P per u numeru di motivi non normalizzati sò stati calculati utilizendu a prova esatta di Fisher.In quantu à i correlogrammi di u numeru di mutivi, i correlazioni di Spearman sò stati calculati utilizendu u numeru nurmalizatu di motivi cù R.
Per visualizà u cuntenutu di l'aminoacidi in ogni pusizioni in a biblioteca di peptide, i logogrammi web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) sò stati creati.Prima, u cuntenutu di aminoacidi in ogni pusizioni di u peptide 12-mer hè guardatu in una matrice 20 × 12.Allora, un inseme di 1000 peptidi chì cuntenenu u stessu cuntenutu di aminoacidu relative à ogni pusizioni hè generatu in formatu di sequenza fasta è furnitu cum'è input à u web-logo 3, chì genera una rapprisintazioni grafica di u cuntenutu di aminoacidu relative in ogni pusizione.per una data biblioteca di peptidi.Per visualizà datasets multidimensionali, e carte di calore sò state create usendu un strumentu sviluppatu internamente in R (biosHeatmap, un pacchettu R chì deve esse liberatu).I dendrogrammi presentati in e carte di calore sò stati calculati utilizendu u metudu di clustering gerarchicu di Ward cù a metrica di distanza euclidea.Per l'analisi statistiche di i dati di puntuazione di motivi, i valori P per u puntuazione unnormalized sò stati calculati utilizendu a prova esatta di Fisher.I valori P per altri dataset sò stati calculati in R cù u test t di Student o ANOVA.
I cloni di fagi selezziunati è i fagi senza inserti sò stati iniettati per via intravenosa via a vena di a coda (2 × 1010 fagi / animale in 300 μl PBS).Dieci minuti prima di a perfusione è a fissazione successiva, i stessi animali sò stati injectati per via intravenosa cù 100 μl di lectina marcata DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuti dopu à l'iniezione di fagi, i rati sò stati perfusi in u core cù 50 ml PBS seguitu da 50 ml 4% PFA / PBS.I campioni di u cervellu sò stati ancu fissati durante a notte in 4% PFA / PBS è immersi in 30% saccarosi durante a notte à 4 ° C.I campioni sò flash congelati in a mistura OCT.L'analisi immunoistochimica di campioni congelati hè stata fatta à a temperatura di l'ambienti nantu à criosezioni di 30 µm bluccate cù 1% BSA è incubate cù anticorpi policlonali marcati FITC contr'à u fago T7 (Novus NB 600-376A) à 4 ° C.Incubate durante a notte.Infine, e rùbbriche sò lavate 3 volte cù PBS è esaminate cù un microscopiu laser confocal (Leica TCS SP5).
Tutti i peptidi cù una purezza minima di 98% sò stati sintetizzati da GenScript USA, biotinilati è liofilizzati.A biotina hè ligata per via di un spacer triple glicina supplementu à l'N-terminale.Verificate tutti i peptidi cù spettrometria di massa.
Streptavidina (Sigma S0677) hè stata mischjata cù un eccessu equimolar di 5 volte di peptide biotinilatu, peptide inibitore BACE1 biotinilatu, o una cumminazione (rapportu 3: 1) di peptide inibitore BACE1 biotinilatu è peptide inibitore BACE1 in 5-10% DMSO / incubatu in PBS.1 ora à a temperatura di l'ambienti prima di l'iniezione.I peptidi cunjugati di Streptavidin sò stati injected intravenously à una dosa di 10 mg / kg in una di e vini di coda di i rati cù una cavità cerebrale.
A cuncentrazione di cumplessi streptavidin-peptide hè stata valutata da ELISA.Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) sò stati rivestiti durante a notte à 4 ° C cù 1.5 μg / ml di anticorpi anti-streptavidin di mouse (Thermo, MA1-20011).Dopu u bloccu (buffer di bloccu: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) à a temperatura di l'ambienti per 2 ore, lavate a piastra cù 0,05% Tween-20/PBS (tampon di lavatu) per 3 Secondi, CSF è campioni di plasma sò stati aggiunte cù tamponi di plasma: CSF 1:115).A piastra hè stata incubata durante a notte à 4 ° C cù l'anticorpu di rilevazione (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Dopu trè fasi di lavatura, a streptavidina hè stata rilevata da incubazione in a suluzione di sustrato TMB (Roche) per un massimu di 20 min.Dopu avè cessatu u sviluppu di u culore cù 1M H2SO4, misurà l'assorbanza à 450 nm.
A funzione di u cumplessu inibitore streptavidin-peptide-BACE1 hè stata valutata da Aβ(1-40) ELISA secondu u protokollu di u fabricatore (Wako, 294-64701).In breve, i campioni di CSF sò stati diluiti in diluente standard (1: 23) è incubati durante a notte à 4 ° C in piastre di 96 pozzetti rivestiti cù anticorpi di cattura BNT77.Dopu à cinque fasi di lavatura, l'anticorpu BA27 cunjugatu HRP hè statu aghjuntu è incubatu per 2 ore à 4 ° C, seguitu da cinque passi di lavaggio.L'Aβ(1-40) hè stata rilevata da incubazione in una soluzione TMB per 30 minuti à a temperatura di l'ambienti.Dopu chì u sviluppu di u culore hè stata fermata cù a suluzione di stop, misurà l'assorbanza à 450 nm.I campioni di plasma sò stati sottumessi à l'estrazione in fase solida prima di Aβ(1-40) ELISA.U plasma hè statu aghjuntu à 0,2% DEA (Sigma) in platti da 96 pozzi è incubatu à a temperatura di l'ambienti per 30 minuti.Dopu avè lavatu successivamente i platti SPE (Oasis, 186000679) cù l'acqua è 100% metanol, i campioni di plasma sò stati aghjuntu à i platti SPE è tuttu u liquidu hè stata eliminata.I campioni sò stati lavati (prima cù 5% metanol dopu 30% metanol) è eluted with 2% NH4OH / 90% metanol.Dopu avè siccatu l'eluate à 55 ° C per 99 min à un currente N2 constantu, i campioni sò stati ridotti in diluenti standard è Aβ (1-40) hè stata misurata cum'è descrittu sopra.
Cumu cita stu articulu: Urich, E. et al.Consegna di carica à u cervellu utilizendu peptidi di transitu identificati in vivo.a scienza.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
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