Certi temi di risoluzione di prublemi LC ùn sò mai fora di data, postu chì ci sò prublemi in a pratica di LC, ancu cum'è a tecnulugia di l'instrumentu si migliurà cù u tempu.
Hè statu divertitu à scrive sta colonna "LC Troubleshooting" è pensendu à temi ogni mese, perchè certi temi ùn passanu mai di moda. Mentre in u campu di a ricerca di cromatografia certi temi o idee diventanu obsoleti postu chì sò rimpiazzati da idee più novi è megliu, in u campu di risoluzione di i prublemi, postu chì u primu articulu di risoluzione di i prublemi hè apparsu in questa rivista (u LC Journal in l'ultimi anni sò sempre pertinenti). Aghju cuncentratu parechje sezioni LC Troubleshooting nantu à i tendenzi cuntempuranei chì affettanu a cromatografia liquida (LC) (per esempiu, a comparazione relativa di a nostra capiscitura di l'effettu di a pressione nantu à a ritenzione [2] New Advances) A ​​nostra interpretazione di i risultati LC è cumu risolve i prublemi cù strumenti LC muderni. risoluzione di prublemi - elementi chì sò grandi per qualsiasi risolutore di prublemi sò essenziali, ùn importa micca l'età di u sistema chì usemu. U tema core di sta serie hè assai pertinente à u famosu graficu murale "LC Troubleshooting Guide" di LCGC (4) appesu in parechji laboratori. tutti sti prublemi in detail in un articulu, cusì in questa prima stallazione nantu à u tema, mi cuncintraraghju nantu à alcuni di quelli chì vecu più spessu. Spergu chì i ghjovani è vechji utilizatori LC truveranu qualchi cunsiglii utili è ricordi nantu à questu tema impurtante.
Mi ritruvu sempre più à risponde à e dumande di risoluzione di prublemi cù "tuttu hè pussibule". Sta risposta pò parè faciule quandu cunsiderà osservazioni chì sò difficiuli d'interpretà, ma mi pare spessu apprupriata. Cù parechje cause pussibuli di forma di piccu poveru, hè impurtante di mantene una mente aperta quandu cunsiderà ciò chì puderia esse u prublema, è per esse capace di prioritizà e cause potenziali per inizià i nostri punti di prublemi più impurtanti.
Un passu chjave in ogni eserciziu di risoluzione di prublemi - ma quellu chì pensu chì hè sottovalutatu - hè di ricunnosce chì ci hè un prublema chì deve esse risoltu. Ricunnosce chì ci hè un prublema spessu significa ricunnosce chì ciò chì succede à l'uttellu hè diversu da e nostre aspettative, chì sò furmatu da a teoria, a cunniscenza empirica è l'esperienza (5). , fluffy, punta di punta, tailing, etc.), ma ancu à a larghezza. I nostri aspettative per a forma di piccu attuale sò simplici. A teoria (6) sustene bè l'aspettazione di u libru di testu chì, in a maiò parte di i casi, i picchi cromatografichi duveranu esse simmetrici è conformanu à a forma di una distribuzione gaussiana, cum'è mostra in Figura 1a. in Figura 1 mostra qualchi di l 'àutri pussibulità chì pudia esse osservatu-in altri palori, certi di i modi ca li cosi putissi andà male.In u restu di sta installment, avemu Mulateri Di L'esse tempu discutiri qualchi esempii specifichi di situazioni chì ponu purtà à sti tipi di forma.
A volte i picchi ùn sò micca osservati in tuttu in u cromatogramma induve sò previsti esse eluted. U graficu murale sopra indica chì l'absenza di un piccu (assuntu chì u campione cuntene veramente l'analita di destinazione à una cuncentrazione chì deve fà a risposta di u detector abbastanza per vedelu sopra à u rumore) hè di solitu ligata à qualchì problema di strumentu o cundizioni di fase mobile incorrecte (se osservatu).cimi, di solitu troppu "debuli"). Una breve lista di prublemi potenziali è suluzioni in questa categuria pò esse truvata in Table I.
Cumu l'esitatu sopra, a quistione di quantu l'allargamentu di u piccu deve esse tolleratu prima di prestà attenzione è di pruvà à risolve hè un tema cumplessu chì discuteraghju in un futuru articulu. A mo sperienza hè chì l'allargamentu di u piccu significativu hè spessu accumpagnatu da un cambiamentu significativu in a forma di piccu, è u picu tailing hè più cumuni di u pre-piccu o splitting.
Ciascuna di sti prublemi hè statu discutitu in dettagliu in i prublemi precedenti di Troubleshooting LC, è i lettori interessati à questi temi ponu riferite à questi articuli precedenti per infurmazione nantu à e cause radicali è e pussibuli suluzioni à questi prublemi.Più dettagli.
Peak tailing, peak fronting, è splitting pò tutti esse causatu da fenomeni chimichi o fisichi, è a lista di suluzioni putenziali à sti prublemi varieghja assai, sicondu s'ellu si tratta di un prublema chimicu o fisicu. Spessu, paragunendu i sfarenti picchi in un cromatogramma, pudete truvà indizi impurtanti nantu à quale hè u culprit. solu unu o uni pochi picchi sò affettati, ma u restu si vede bè, a causa hè più prubabile chimica.
I causi chimichi di u peak tailing sò troppu cumplessi per discutiri brevi quì. U lettore interessatu hè riferitu à l'ultima questione di "LC Troubleshooting" per una discussione più approfondita (10). Tuttavia, una cosa faciule da pruvà hè di riduce a massa di l'analite injected è vede s'ellu si migliurà a forma di piccu. ing massi picculi analiti, o i cundizioni chromatographic deve esse cambiatu cusì chì boni formi piccu pò esse ottenuta ancu cù massi più grande injected.
Ci hè ancu parechje ragioni fisiche putenziali per u peak tailing. I lettori interessati à una discussione dettagliata di e pussibulità sò riferiti à un altru prublema recente di "LC Troubleshooting" (11). Una di e cause fisiche più cumuni di u peak tailing hè una cunnessione povira in un puntu trà l'iniettore è u detector (12). Ùn avia micca usatu prima, è stallatu un ciclu di iniezione di pocu voluminu cù una ferrule chì era stata modellata nantu à un capillary in acciaio inox. Dopu qualchì esperimentu iniziale di risoluzione di prublemi, avemu capitu chì a prufundità di u portu in u stator di a valvola d'iniezione era assai più profonda di ciò chì eramu abituati, chì devengu à un grande volume mortu à u fondu di u portu. u vulume mortu à u fondu di u portu.
I fronti di punta cum'è quelli mostrati in a Figura 1e ponu ancu esse causati da prublemi fisici o chimichi. Una causa fisica cumuni di a punta di punta hè chì u lettu di particelle di a colonna ùn hè micca bè imballatu, o chì e particelle sò riorganizzate cù u tempu. "Linear" cundizioni di ritenzione. In cundizioni ideali (lineari), a quantità di analite ritenuta da a fase stazionaria (per quessa, u fattore di ritenzione) hè linearmente ligata à a cuncentrazione di l'analite in a colonna. Cromatograficamente, questu significa chì cum'è a massa di analite injected in a colonna aumenta, u piccu diventa più altu, ma micca più largu. In più, e forme non lineari determinanu a forma di i picchi cromatografichi, risultannu in i bordi di punta o di estremità. Cum'è cù a sovraccarichi di massa chì provoca un peak tailing (10), u piccu di punta causatu da a ritenzione non lineare pò ancu esse diagnosticatu riducendu a massa analita injectata. deve esse cambiatu per minimizzà stu cumpurtamentu.
A volte osservemu ciò chì pare esse un piccu "split", cum'è mostra in a Figura 1f. U primu passu per risolve stu prublema hè di determinà se a forma di piccu hè duvuta à a co-elution parziale (vale à dì, a presenza di dui composti distinti, ma strettamente eluting). Se ci sò in realtà dui analiti differenti eluting vicinu, allora hè una questione di risuluzione apparente (per esempiu, rinfurzà, ritenimentu è aumentanu a so risoluzione). t "picchi sò ligati à u rendiment fisicu ùn hà nunda à fà cù a culonna stessu. Spessu, u più impurtante clue à sta decisione hè s'ellu tutti i picchi in u cromatogramma exhibenu forme split, o solu una o duie.se tutti i picchi sò spartuti, hè prubabilmente un prublema fisicu, probabilmente ligatu à a colonna stessu.
Split picchi ligati à i pruprietà fisicu di a colonna stissu sò di solitu duvuta a frits inlet o outlet parzialmente bluccatu, o riurganisazione di particeddi in a colonna, chì permette à a fase mobile à flussu più veloce di a fase mobile in certi spazii di a furmazione di canali di colonna .in altre regioni (11). Frit partially clogged pò volte esse sbulicatu da inversione u flussu attraversu a colonna;in ogni modu, in a mo spirimintà, questu hè di solitu una solu suluzione à cortu-termine. Questu hè spessu fatale cù e culonni muderni, se i particeddi recombine in a colonna. À questu puntu, hè megliu rimpiazzà a colonna è cuntinuà.
U piccu in a Figura 1g, ancu da una istanza recente in u mo propiu laboratoriu, di solitu indica chì u signale hè cusì altu chì hà righjuntu l'altu altu di a gamma di risposta. di u rumore, cum'è a luce stray è "corrente scura", facendu u signale assai "fuzzy" in l'apparenza è indipendente da a cuncentrazione di l'analite.Quandu succede questu, u prublema pò esse facilmente risolta riduzzione di u voluminu di l'iniezione di l'analita - riduzzione di u voluminu di iniezione, diluting the sample, o i dui.
In a scola di cromatografia, usemu u signalu di detector (vale à dì, l'asse y in u cromatogramma) cum'è un indicatore di a concentrazione di l'analite in u sample. Allora pare stranu per vede un cromatogramma cù un signalu sottu à zero, postu chì l'interpretazione simplice hè chì questu indica una concentrazione di analite negativa - chì di sicuru ùn hè micca fisicamente pussibule.
In questu casu, un piccu negativu significa solu chì e molécule chì escenu da a colonna assorbanu menu luce cà a fase mobile stessu immediatamente prima è dopu à u piccu. Questu pò accade, per esempiu, quandu si usanu lunghezze d'onda di rilevazione relativamente basse (<230 nm) è additivi di fase mobile chì assorbanu a maiò parte di a luce à queste lunghezze d'onda. picchi per preparà una curva di calibrazione è ottene infurmazione quantitativa precisa, per quessa, ùn ci hè nisuna ragione fundamentale per evitarli per se (stu metudu hè qualchì volta chjamatu "detezzione UV indiretta") (13). Tuttavia, se vulemu veramente evità picchi negativi in ​​tuttu, in u casu di rilevazione di assorbanza, a megliu suluzione hè di utilizà una diversa lunghezza d'onda di rilevazione di manera chì assorba più a fase mobile di a fase mobile, in modu chì assorba più a fase mobile di a luce. cà analiti.
I picchi negativi ponu appare ancu quandu si usa a rilevazione di l'indice di rifrazione (RI) quandu l'indice di rifrazione di cumpunenti diversi da l'analita in u campione, cum'è a matrice di solvente, hè diversu da l'indice di rifrazione di a fase mobile. Questu succede ancu cù a rilevazione UV-vis, ma questu effettu tende à esse attenuatu in quantu à a rilevazione RI. a fase mobile.
In a terza parte nantu à u tema di basa di a risoluzione di i prublemi di LC, aghju discututu situazioni in quale a forma di punta osservata difiere da a forma di punta prevista o normale. A risoluzione efficace di tali prublemi principia cù a cunniscenza di e forme di punta previste (basatu nantu à a teoria o l'esperienza precedente cù i metudi esistenti), cusì deviazioni da queste aspettative sò evidenti. i mutivi chì vecu più spessu. Sapendu sti ditagli furnisce un bonu postu per cumincià à risolve i prublemi, ma ùn catturà micca tutte e pussibulità.Lettori interessati à una lista più approfondita di cause è suluzione ponu riferite à u LCGC "LC Troubleshooting Guide" wall chart.
(4) Carta di muru "LC Troubleshooting Guide" LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF è Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31-44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.