Certi temi di risoluzione di i prublemi LC ùn sò mai obsoleti, postu chì ci sò prublemi in a pratica LC, ancu s'è a tecnulugia di i strumenti migliora cù u tempu. Ci sò parechji modi in cui i prublemi ponu nasce in un sistema LC è finisce per avè una forma di piccu scarsa. Quandu si presentanu prublemi ligati à a forma di u piccu, una breve lista di pussibili cause per questi risultati aiuta à simplificà a nostra sperienza di risoluzione di i prublemi.
Hè statu divertente scrive sta colonna "Risoluzione di i prublemi LC" è pensà à i temi ogni mese, perchè certi temi ùn passanu mai di moda. Mentre in u campu di a ricerca cromatografica certi temi o idee diventanu obsoleti postu chì sò rimpiazzati da idee più nove è megliu, in u campu di a risoluzione di i prublemi, dapoi chì u primu articulu di risoluzione di i prublemi hè apparsu in questa rivista (u LC Journal à l'epica) postu chì certi temi sò sempre pertinenti) in u 1983 (1). In l'ultimi anni, aghju focalizatu parechje sezioni di risoluzione di i prublemi LC nantu à e tendenze cuntempuranee chì affettanu a cromatografia liquida (LC) (per esempiu, u paragone relativu di a nostra comprensione di l'effettu di a pressione nantu à a ritenzione [2] Novi Avanzamenti) A nostra interpretazione di i risultati LC è cumu risolve i prublemi cù strumenti LC muderni. In a rata di stu mese, cuntinuu a mo serie (3), chì hà iniziatu in dicembre 2021, chì si hè focalizata nantu à alcuni di i temi di "vita è morte" di a risoluzione di i prublemi LC - elementi chì sò ottimi per qualsiasi risolutore di prublemi sò essenziali, indipendentemente da l'età di u sistema chì usemu. U tema principale di sta serie hè assai pertinente à u famosu graficu murale "Guida di risoluzione di i prublemi LC" di LCGC (4). appesu in parechji laboratorii. Per a terza parte di sta seria, aghju sceltu di fucalizza nantu à i prublemi ligati à a forma di u piccu o à e caratteristiche di u piccu. Incredibilmente, u graficu murale elenca 44 diverse cause potenziali di una scarsa forma di u piccu! Ùn pudemu micca cunsiderà tutti questi prublemi in dettagliu in un articulu, dunque in questa prima parte nantu à u tema, mi fucalizeraghju nantu à alcuni di quelli chì vecu più spessu. Spergu chì i ghjovani è anziani utilizatori di LC truveranu qualchi cunsiglii utili è ricordi nantu à questu tema impurtante.
Mi ritrovu sempre di più à risponde à e dumande di risoluzione di i prublemi cù "tuttu hè pussibule". Sta risposta pò sembrà faciule quandu si cunsideranu osservazioni difficiuli da interpretà, ma a trovu spessu adatta. Cù parechje cause pussibuli di una mala forma di u piccu, hè impurtante mantene una mente aperta quandu si cunsidereghja ciò chì puderia esse u prublema, è esse capace di dà priorità à e cause putenziali per cumincià i nostri sforzi di risoluzione di i prublemi, fucalizendu nantu à e pussibilità più cumuni, questu puntu hè assai impurtante.
Un passu chjave in ogni eserciziu di risoluzione di prublemi - ma unu chì pensu sia sottovalutatu - hè di ricunnosce chì ci hè un prublema chì deve esse risoltu. Ricunnosce chì ci hè un prublema significa spessu ricunnosce chì ciò chì accade à u strumentu hè diversu da e nostre aspettative, chì sò furmate da a teoria, a cunniscenza empirica è l'esperienza (5). A "forma di u piccu" à quale si riferisce quì si riferisce in realtà micca solu à a forma di u piccu (simmetrica, asimmetrica, liscia, soffice, bordu d'attaccu, coda, ecc.), ma ancu à a larghezza. E nostre aspettative per a forma attuale di u piccu sò simplici. A teoria (6) sustene bè l'aspettativa di u manuale chì, in a maiò parte di i casi, i picchi cromatografichi devenu esse simmetrici è conformi à a forma di una distribuzione gaussiana, cum'è mostratu in a Figura 1a. Ciò chì ci aspettemu da e larghezze di i picchi hè una questione più cumplessa, è discuteremu questu tema in un articulu futuru. L'altre forme di piccu in a Figura 1 mostranu alcune di l'altre pussibilità chì puderanu esse osservate - in altre parole, alcuni di i modi in cui e cose puderanu andà male. In u restu di sta parte, passeremu u tempu à discute alcuni esempi specifici di situazioni chì ponu purtà à queste. tipi di forma.
Calchì volta i picchi ùn sò micca osservati in u cromatogramma induve si prevede ch'elli sianu eluiti. U graficu murale sopra indica chì l'assenza di un piccu (supponendu chì u campione cuntene in realtà l'analita di destinazione à una cuncentrazione chì duveria rende a risposta di u rilevatore sufficiente per vedelu sopra u rumore) hè generalmente ligata à qualchì prublema di u strumentu o à cundizioni di fase mobile incorrette (se osservate). picchi, di solitu troppu "debuli"). Una breve lista di prublemi potenziali è suluzioni in questa categuria si pò truvà in a Tavula I.
Cum'è mintuvatu sopra, a quistione di quantu allargamentu di u piccu deve esse tolleratu prima di fà casu è pruvà à riparallu hè un tema cumplessu chì discuteraghju in un articulu futuru. A mo sperienza hè chì un allargamentu significativu di u piccu hè spessu accumpagnatu da un cambiamentu significativu in a forma di u piccu, è a coda di u piccu hè più cumuna chè u pre-piccu o a scissione. Tuttavia, i picchi nominalmente simmetrici sò ancu allargati, ciò chì pò esse causatu da uni pochi di ragioni diverse:
Ognunu di sti prublemi hè statu discussu in dettagliu in numeri precedenti di Troubleshooting LC, è i lettori interessati à questi temi ponu riferisce à questi articuli precedenti per infurmazioni nantu à e cause principali è e suluzioni potenziali à sti prublemi. Più dettagli.
A coda di piccu, a fronte di piccu è a scissione ponu esse tutti causati da fenomeni chimichi o fisichi, è a lista di suluzioni potenziali à questi prublemi varia assai, secondu s'ellu si tratta di un prublema chimicu o fisicu. Spessu, paragunendu i diversi picchi in un cromatogramma, pudete truvà indizii impurtanti nantu à quale hè u culpevule. Se tutti i picchi in un cromatogramma mostranu forme simili, a causa ùn hè probabilmente micca fisica. Se solu unu o uni pochi di picchi sò affettati, ma u restu pare bè, a causa hè probabilmente chimica.
E cause chimiche di a coda di piccu sò troppu cumplesse per esse discusse brevemente quì. U lettore interessatu hè riferitu à u numeru recente di "LC Troubleshooting" per una discussione più approfondita (10). Tuttavia, una cosa faciule da pruvà hè di riduce a massa di l'analita iniettatu è vede se a forma di u piccu migliora. S'ellu hè cusì, allora questu hè un bon indiziu chì u prublema hè "sovraccaricu di massa". In questu casu, u metudu deve esse limitatu à l'iniezione di piccule masse di analiti, o e cundizioni cromatografiche devenu esse cambiate in modu chì si possinu ottene bone forme di piccu ancu cù masse più grande iniettate.
Ci sò ancu parechje ragioni fisiche potenziali per a coda di piccu. I lettori interessati à una discussione dettagliata di e pussibilità sò riferiti à un altru numeru recente di "LC Troubleshooting" (11). Una di e cause fisiche più cumuni di a coda di piccu hè una mala cunnessione in un puntu trà l'iniettore è u rilevatore (12). Un esempiu estremu hè mostratu in a Figura 1d, ottenuta in u mo laburatoriu uni pochi di settimane fà. In questu casu, avemu custruitu un sistema cù una nova valvula d'iniezione chì ùn avemu micca adupratu prima, è avemu installatu un circuitu d'iniezione di picculu vulume cù una ferula chì era stata stampata nantu à un capillare d'acciaio inox. Dopu à alcuni esperimenti iniziali di risoluzione di prublemi, ci simu resi contu chì a prufundità di u portu in u statore di a valvula d'iniezione era assai più profonda di ciò chì eramu abituati, risultendu in un grande vulume mortu in u fondu di u portu. Stu prublema hè facilmente risoltu rimpiazzendu u circuitu d'iniezione cù un altru tubu, pudemu aghjustà a ferula à a pusizione adatta per eliminà u vulume mortu in u fondu di u portu.
I fronti di piccu cum'è quelli mostrati in a Figura 1e ponu ancu esse causati da prublemi fisichi o chimichi. Una causa fisica cumuna di u bordu d'attaccu hè chì u lettu di particelle di a colonna ùn hè micca bè imballatu, o chì e particelle si sò riurganizate cù u tempu. Cum'è cù a coda di u piccu causata da questu fenomenu fisicu, u megliu modu per risolve questu hè di rimpiazzà a colonna è cuntinuà. Fundamentalmente, e forme di u bordu d'attaccu cù origine chimica spessu derivanu da ciò chì chjamemu cundizioni di ritenzione "non lineari". In cundizioni ideali (lineari), a quantità di analitu ritenuta da a fase stazionaria (dunque, u fattore di ritenzione) hè linearmente ligata à a cuncentrazione di l'analita in a colonna. Cromatograficamente, questu significa chì mentre a massa di analitu iniettata in a colonna aumenta, u piccu diventa più altu, ma micca più largu. Questa relazione hè rotta quandu u cumpurtamentu di ritenzione hè non lineare, è i picchi ùn diventanu micca solu più alti ma ancu più larghi mentre più massa hè iniettata. Inoltre, e forme non lineari determinanu a forma di i picchi cromatografichi, risultendu in bordi d'attaccu o di uscita. Cum'è cù u sovraccaricu di massa chì provoca a coda di u piccu (10), u piccu L'avanzamentu causatu da a ritenzione non lineare pò ancu esse diagnosticatu riducendu a massa di l'analitu iniettatu. Se a forma di u piccu migliora, u metudu deve esse mudificatu per ùn superà a qualità di l'iniezione chì provoca u bordu d'avanzamentu, o e cundizioni cromatografiche devenu esse cambiate per minimizà stu cumpurtamentu.
Calchì volta observemu ciò chì pare esse un piccu "divisu", cum'è mostratu in a Figura 1f. U primu passu per risolve stu prublema hè di determinà se a forma di u piccu hè dovuta à una coeluzione parziale (vale à dì, a presenza di dui cumposti distinti ma chì eluiscenu strettamente). S'ellu ci sò in realtà dui analiti diversi chì eluiscenu vicinu, allora si tratta di migliurà a so risoluzione (per esempiu, aumentendu a selettività, a ritenzione o u conteggio di piastre), è i picchi apparenti "divisi" sò ligati à a fisica. A prestazione ùn hà nunda à chì vede cù a colonna stessa. Spessu, l'indiziu più impurtante per sta decisione hè se tutti i picchi in u cromatogramma mostranu forme divise, o solu una o duie. S'ellu hè solu unu o dui, hè probabilmente un prublema di coeluzione; se tutti i picchi sò divisi, hè probabilmente un prublema fisicu, assai prubabilmente ligatu à a colonna stessa.
I picchi divisi ligati à e proprietà fisiche di a colonna stessa sò generalmente dovuti à fritte d'entrata o di uscita parzialmente bluccate, o à a riurganizazione di e particelle in a colonna, chì permettenu à a fase mobile di scorrere più velocemente di a fase mobile in certe zone di a furmazione di canali di colonna in altre regioni (11). A fritta parzialmente intasata pò qualchì volta esse eliminata invertendu u flussu attraversu a colonna; tuttavia, in a mo sperienza, questu hè generalmente una suluzione à cortu termine piuttostu chè à longu andà. Questu hè spessu fatale cù e colonne muderne se e particelle si ricombinanu in a colonna. À questu puntu, hè megliu rimpiazzà a colonna è cuntinuà.
U piccu in a Figura 1g, ancu da un esempiu recente in u mo laburatoriu, indica di solitu chì u signale hè cusì altu ch'ellu hà righjuntu a fine alta di a gamma di risposta. Per i detectori d'assorbanza ottica (UV-vis in questu casu), quandu a cuncentrazione di l'analita hè assai alta, l'analita assorbe a maiò parte di a luce chì passa per a cella di flussu di u detector, lascendu assai poca luce da rilevà. In queste cundizioni, u signale elettricu da u fotodetector hè fortemente influenzatu da varie fonti di rumore, cum'è a luce dispersa è a "corrente scura", rendendu u signale assai "sfocatu" in aspettu è indipendente da a cuncentrazione di l'analita. Quandu questu accade, u prublema pò spessu esse facilmente risoltu riducendu u vulume d'iniezione di l'analita - riducendu u vulume d'iniezione, diluendu u campione, o tramindui.
In a scola di cromatografia, usemu u signale di u detector (vale à dì, l'asse y in u cromatogramma) cum'è indicatore di a cuncentrazione di l'analitu in u campione. Dunque pare stranu vede un cromatogramma cù un signale sottu à zeru, postu chì l'interpretazione simplice hè chì questu indica una cuncentrazione negativa di l'analitu - chì benintesa ùn hè micca fisicamente pussibule. In a mo sperienza, i picchi negativi sò più spessu osservati quandu si utilizanu detector di assorbanza ottica (per esempiu, UV-vis).
In questu casu, un piccu negativu significa solu chì e molecule chì eluiscenu da a colonna assorbenu menu luce chè a fase mobile stessa subitu prima è dopu u piccu. Questu pò accade, per esempiu, quandu si utilizanu lunghezze d'onda di rilevazione relativamente basse (<230 nm) è additivi di fase mobile chì assorbenu a maiò parte di a luce à queste lunghezze d'onda. Tali additivi ponu esse cumpunenti di solvente di fase mobile cum'è u metanolu o cumpunenti tampone cum'è l'acetatu o u formiatu. Si ponu in realtà aduprà picchi negativi per preparà una curva di calibrazione è ottene informazioni quantitative accurate, dunque ùn ci hè nisuna ragione fundamentale per evità li per se (stu metudu hè qualchì volta chjamatu "rilevazione UV indiretta") (13). Tuttavia, se vulemu veramente evità i picchi negativi in ​​tuttu, in u casu di a rilevazione di l'assorbanza, a megliu suluzione hè di utilizà una lunghezza d'onda di rilevazione diversa in modu chì l'analita assorba più di a fase mobile, o cambià a cumpusizione di a fase mobile in modu chì assorbanu menu luce chè l'analiti.
I picchi negativi ponu ancu cumparisce quandu si usa a rilevazione di l'indice di rifrazione (RI) quandu l'indice di rifrazione di i cumpunenti diversi da l'analita in u campione, cum'è a matrice di solvente, hè differente da l'indice di rifrazione di a fase mobile. Questu accade ancu cù a rilevazione UV-vis, ma questu effettu tende à esse attenuatu in relazione à a rilevazione RI. In i dui casi, i picchi negativi ponu esse minimizzati currispundendu più strettamente a cumpusizione di a matrice di u campione à quella di a fase mobile.
In a terza parte nantu à u tema basicu di a risoluzione di i prublemi LC, aghju discuttu situazioni in quale a forma di u piccu osservata hè diversa da a forma di u piccu prevista o nurmale. A risoluzione efficace di tali prublemi principia cù a cunniscenza di e forme di u piccu previste (basate nantu à a teoria o l'esperienza precedente cù i metudi esistenti), dunque e deviazioni da queste aspettative sò evidenti. I prublemi di forma di u piccu anu parechje cause potenziali diverse (troppu largu, coda, bordu d'attaccu, ecc.). In questa parte, discurgu in dettagliu alcune di e ragioni chì vecu più spessu. Cunnosce questi dettagli furnisce un bonu puntu di partenza per a risoluzione di i prublemi, ma ùn cattura micca tutte e pussibilità. I ​​lettori interessati à una lista più dettagliata di cause è suluzioni ponu riferisce à u graficu murale "Guida per a risoluzione di i prublemi LC" di LCGC.
(4) Carta murale LCGC "Guida di risoluzione di i prublemi LC". https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analisi di Dati è Trasfurmazione di Segnali in Cromatografia (Elsevier, New York, NY, 1998), pp. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF è Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.