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A biopsia liquida (LB) hè un cuncettu chì guadagna rapidamente pupularità in u campu biomedicu. U cuncettu hè principalmente basatu annantu à a rilevazione di frammenti di DNA extracellulare circulante (ccfDNA), chì sò principalmente liberati cum'è picculi frammenti dopu a morte cellulare in vari tessuti. Una piccula parte di sti frammenti sò originarii di tessuti o organismi stranieri (stranieri). In u travagliu attuale, avemu applicatu stu cuncettu à i mitili, una spezia sentinella cunnisciuta per a so alta capacità di filtrazione di l'acqua di mare. Usemu a capacità di i mitili di agisce cum'è filtri naturali per catturà frammenti di DNA ambientali da una varietà di fonti per furnisce informazioni nantu à a biodiversità di l'ecosistemi marini custieri. I nostri risultati mostranu chì l'emolinfa di i mitili cuntene frammenti di DNA chì varianu assai in dimensione, da 1 à 5 kb. U sequenziamentu cù fucile hà dimustratu chì un gran numeru di frammenti di DNA sò di origine microbica straniera. Trà elli, avemu trovu frammenti di DNA da batteri, archea è virus, cumpresi virus cunnisciuti per infettà una varietà di ospiti cumunimenti truvati in l'ecosistemi marini custieri. In cunclusione, u nostru studiu dimostra chì u cuncettu di LB applicatu à i mitili rapprisenta una fonte ricca ma ancu inesplorata di cunniscenza nantu à a diversità microbica in l'ecosistemi custieri marini.
L'impattu di u cambiamentu climaticu (CC) nant'à a biodiversità di l'ecosistemi marini hè un duminiu di ricerca in rapida crescita. U riscaldamentu glubale ùn solu provoca stress fisiologichi impurtanti, ma spinge ancu i limiti evolutivi di a stabilità termica di l'organismi marini, affettendu l'habitat di un certu numeru di spezie, spinghjenduli à circà cundizioni più favurevuli [1, 2]. Oltre à affettà a biodiversità di i metazoi, u CC perturba u delicatu equilibriu di l'interazioni ospite-microbianu. Sta disbatteriosi microbica rapprisenta una seria minaccia per l'ecosistemi marini postu chì rende l'organismi marini più suscettibili à i patogeni infettivi [3, 4]. Si crede chì l'SS ghjocanu un rolu impurtante in e morti di massa, chì hè un prublema seriu per a gestione di l'ecosistemi marini mundiali [5, 6]. Questa hè una questione impurtante datu l'impatti ecunomichi, ecologichi è nutrizionali di parechje spezie marine. Questu hè particularmente veru per i bivalvi chì vivenu in e regioni polari, induve l'effetti di u CK sò più immediati è severi [6, 7]. In fatti, i bivalvi cum'è Mytilus spp. sò largamente aduprati per monitorà l'effetti di u CC nant'à l'ecosistemi marini. Ùn hè micca surprisante chì un numeru relativamente grande di biomarcatori sianu stati sviluppati per monitorà a so salute, spessu aduprendu un approcciu à dui livelli chì implica biomarcatori funziunali basati nantu à l'attività enzimatica o funzioni cellulari cum'è a viabilità cellulare è l'attività fagocitica [8]. Questi metudi includenu ancu a misurazione di a cuncentrazione di indicatori di pressione specifichi chì s'accumulanu in i tessuti molli dopu l'assorbimentu di grandi quantità d'acqua di mare. Tuttavia, l'alta capacità di filtrazione è u sistema circulatoriu semi-apertu di i bivalvi offrenu l'uppurtunità di sviluppà novi biomarcatori di l'emolinfa aduprendu u cuncettu di biopsia liquida (LB), un approcciu simplice è minimamente invasivu per a gestione di i pazienti. campioni di sangue [9, 10]. Ancu s'è parechji tippi di molecule circulanti ponu esse truvati in LB umanu, questu cuncettu hè principalmente basatu nantu à l'analisi di sequenziamentu di u DNA di frammenti di DNA extracellulare circulante (ccfDNA) in u plasma. In fatti, a presenza di DNA circulante in u plasma umanu hè cunnisciuta dapoi a mità di u XXu seculu [11], ma hè solu in l'ultimi anni chì l'avventu di metudi di sequenziamentu à altu rendiment hà purtatu à una diagnosi clinica basata nantu à u ccfDNA. A prisenza di sti frammenti di DNA circulanti hè duvuta in parte à a liberazione passiva di DNA genomicu (nucleare è mitocondriale) dopu a morte cellulare. In l'individui sani, a cuncentrazione di ccfDNA hè nurmalmente bassa (<10 ng/mL) ma pò esse aumentata di 5-10 volte in i pazienti chì soffrenu di diverse patologie o sottumessi à stress, pruvucendu danni à i tessuti. In l'individui sani, a cuncentrazione di ccfDNA hè nurmalmente bassa (<10 ng/mL) ma pò esse aumentata di 5-10 volte in i pazienti chì soffrenu di diverse patologie o sottumessi à stress, pruvucendu danni à i tessuti. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышаться повышаться в 5–10 в больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению стрессу. In e persone sane, a cuncentrazione di cccDNA hè nurmalmente bassa (<10 ng/mL), ma pò aumentà di 5-10 volte in i pazienti cun diverse patologie o sottu stress chì porta à danni tissutali.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而导致滍炟在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 扅理 或 扅理 或 扅中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увеличе ны 10 увеличе ны 10 пациентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. E cuncentrazioni di ccfDNA sò generalmente basse (<10 ng/ml) in individui sani, ma ponu esse aumentate di 5-10 volte in pazienti cun diverse patologie o stress, causendu danni à i tessuti.A dimensione di i frammenti di ccfDNA varia assai, ma di solitu varieghja da 150 à 200 bp. [12]. L'analisi di ccfDNA autoderivatu, vale à dì, ccfDNA da cellule ospiti nurmali o trasformate, pò esse aduprata per rilevà cambiamenti genetichi è epigenetici presenti in u genomu nucleare è/o mitocondriale, aiutendu cusì i clinici à selezziunà terapie specifiche mirate à i moleculi [13]. Tuttavia, u ccfDNA pò esse ottenutu da fonti straniere cum'è u ccfDNA da e cellule fetali durante a gravidanza o da organi trapiantati [14,15,16,17]. U ccfDNA hè ancu una fonte impurtante d'infurmazioni per rilevà a presenza di acidi nucleici di un agente infettivu (stranieru), chì permette a rilevazione non invasiva di infezioni diffuse micca identificate da e culture di sangue, evitendu a biopsia invasiva di u tissutu infettatu [18]. Studi recenti anu in effetti dimustratu chì u sangue umanu cuntene una ricca fonte d'infurmazioni chì pò esse aduprata per identificà patogeni virali è batterici, è chì circa l'1% di u ccfDNA truvatu in u plasma umanu hè d'origine straniera [19]. Questi studii dimustranu chì a biodiversità di u microbioma circulante di un urganisimu pò esse valutata aduprendu l'analisi di ccfDNA. Tuttavia, finu à pocu tempu fà, questu cuncettu era adupratu solu in l'omu è, in misura minore, in altri vertebrati [20, 21].
In u presente articulu, usemu u putenziale LB per analizà u ccfDNA di Aulacomya atra, una spezia miridiunali chì si trova cumunemente in l'Isule Kerguelen subantartiche, un gruppu d'isule in cima à un grande altipianu chì si hè furmatu 35 milioni d'anni fà. eruzione vulcanica. Usendu un sistema sperimentale in vitro, avemu trovu chì i frammenti di DNA in l'acqua di mare sò rapidamente assorbiti da i mitili è entranu in u compartimentu di l'emolinfa. U sequenziamentu cù fucile hà dimustratu chì u ccfDNA di l'emolinfa di i mitili cuntene frammenti di DNA di a so propria origine è micca di l'origine propria, cumpresi batteri simbiotici è frammenti di DNA da biomi tipici di l'ecosistemi custieri marini vulcanichi freddi. U ccfDNA di l'emolinfa cuntene ancu sequenze virali derivate da virus cù diverse gamme d'ospiti. Avemu ancu trovu frammenti di DNA da animali multicellulari cum'è pesci ossei, anemoni di mare, alghe è insetti. In conclusione, u nostru studiu dimostra chì u cuncettu LB pò esse applicatu cù successu à l'invertebrati marini per generà un riccu repertoriu genomicu in l'ecosistemi marini.
Adulti (55-70 mm di lunghezza) Mytilus platensis (M. platensis) è Aulacomya atra (A. atra) sò stati raccolti da e coste rocciose intertidali di Port-au-France (049°21.235 S, 070°13.490 E.). Isule Kerguelen in dicembre 2018. Altre cozze turchine adulte (Mytilus spp.) sò state ottenute da un fornitore cummerciale (PEI Mussel King Inc., Isola di u Principe Eduardu, Canada) è piazzate in un serbatoiu aeratu à temperatura cuntrullata (4°C) chì cuntene 10-20 L di salamoia artificiale à 32‰. (sale marinu artificiale Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA). Per ogni esperimentu, sò state misurate a lunghezza è u pesu di e singole conchiglie.
Un protocolu d'accessu apertu gratuitu per questu prugramma hè dispunibule in linea (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). In breve, l'emolinfa LB hè stata raccolta da i musculi abduttori cum'è descrittu [22]. L'emolinfa hè stata chiarificata per centrifugazione à 1200 × g per 3 minuti, u surnatante hè statu congelatu (-20 ° C) finu à l'usu. Per l'isolamentu è a purificazione di cfDNA, i campioni (1,5-2,0 ml) sò stati scongelati è processati cù u kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. U ccfDNA hè statu cunservatu à -80 ° C finu à ulteriori analisi. In certi esperimenti, u ccfDNA hè statu isolatu è purificatu cù u kit QIAamp DNA Investigator (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada). U DNA purificatu hè statu quantificatu cù un test standard PicoGreen. A distribuzione di i frammenti di u ccfDNA isolatu hè stata analizata per elettroforesi capillare utilizendu un bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) utilizendu un kit di DNA ad alta sensibilità. U test hè statu realizatu utilizendu 1 µl di u campione di ccfDNA secondu l'istruzzioni di u fabricatore.
Per u sequenziamentu di frammenti di ccfDNA di l'emolinfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) hà preparatu biblioteche shotgun utilizendu u kit Illumina DNA Mix di u kit Illumina MiSeq PE75. Hè statu utilizatu un adattatore standard (BioO). I fugliali di dati grezzi sò dispunibili da l'archiviu di lettura di sequenze NCBI (SRR8924808 è SRR8924809). A qualità di lettura di basa hè stata valutata utilizendu FastQC [23]. Trimmomatic [24] hè statu utilizatu per adattatori di clipping è letture di scarsa qualità. E letture Shotgun cù estremità accoppiate sò state fusi FLASH in letture singole più lunghe cù una sovrapposizione minima di 20 bp per evità discrepanze [25]. E letture fusionate sò state annotate cù BLASTN aduprendu una basa di dati di tassonomia NCBI bivalve (valore e < 1e−3 è 90% d'omologia), è u mascheramentu di sequenze di bassa cumplessità hè statu realizatu aduprendu DUST [26]. E letture fusionate sò state annotate cù BLASTN aduprendu una basa di dati di tassonomia NCBI bivalve (valore e < 1e−3 è 90% d'omologia), è u mascheramentu di sequenze di bassa cumplessità hè statu realizatu aduprendu DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы данных танных таикием двустворчатых моллюсков NCBI (значение e < 1e-3 è 90% гомологии), а маскирование последовательй ностель сложности было выполнено с использованием DUST [26]. E letture raggruppate sò state annotate cù BLASTN utilizendu a basa di dati di tassonomia di bivalvi NCBI (valore e < 1e-3 è 90% d'omologia), è u mascheramentu di sequenze di bassa cumplessità hè statu realizatu utilizendu DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌并的诌数，数）进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 （并 读数 Ｈ 同源）进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичеснкой бчеснкой Объединенные чтения были аннотированы с помощью двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 è 90% гомологии), а маскирование последовательй ностельно сложности было выполнено с использованием DUST [26]. E letture raggruppate sò state annotate cù BLASTN utilizendu a basa di dati tassonomica di bivalvi NCBI (valore e <1e-3 è 90% d'omologia), è u mascheramentu di sequenze di bassa cumplessità hè statu realizatu utilizendu DUST [26].E letture sò state divise in dui gruppi: relative à e sequenze di bivalvi (quì chjamate autoletture) è senza relazione (micca autoletture). Dui gruppi sò stati assemblati separatamente aduprendu MEGAHIT per generà contig [27]. Intantu, a distribuzione tassonomica di e letture di microbioma alienu hè stata classificata aduprendu Kraken2 [28] è rapprisentata graficamente da un graficu à torta Krona nantu à Galaxy [29, 30]. I kmers ottimali sò stati determinati cum'è kmers-59 da i nostri esperimenti preliminari. L'autocontigs sò stati dopu identificati per allineamentu cù BLASTN (basa di dati NCBI di bivalvi, valore e < 1e−10 è 60% d'omologia) per una annotazione finale. L'autocontigs sò stati dopu identificati per allineamentu cù BLASTN (basa di dati NCBI di bivalvi, valore e < 1e−10 è 60% d'omologia) per una annotazione finale. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (BLASTN моллюсков NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. L'autocontigs sò stati poi identificati currispundendu à BLASTN (base di dati di bivalvi NCBI, valore e <1e-10 è 60% d'omologia) per l'annotazione finale.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60%同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем совенные контиги для окончательной аннотации путем совенные контиги данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). L'autocontigs sò stati poi identificati per l'annotazione finale currispundendu à BLASTN (base di dati di bivalvi NCBI, valore e <1e-10 è 60% d'omologia). In parallelu, i contigs di gruppi nonself sò stati annotati cù BLASTN (base di dati nt NCBI, valore e < 1e−10 è 60% d'omologia). In parallelu, i contigs di gruppi nonself sò stati annotati cù BLASTN (base di dati nt NCBI, valore e < 1e−10 è 60% d'omologia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база даннных , e <1e-10 è гомология 60%). In parallelu, i contigs di gruppi stranieri sò stati annotati cù BLASTN (base di dati NT NCBI, valore e <1e-10 è 60% d'omologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。组重叠组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。组重叠组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощью на BLASTN NCBI, значение e <1e-10 и гомология 60%). In parallelu, i contigs di gruppu micca autonomi sò stati annotati cù BLASTN (base di dati nt NCBI, valore e <1e-10 è 60% d'omologia). BLASTX hè statu ancu realizatu nantu à contigs nonself utilizendu e basi di dati NCBI di proteine ​​nr è RefSeq (valore e < 1e−10 è 60% d'omologia). BLASTX hè statu ancu realizatu nantu à contigs nonself utilizendu e basi di dati NCBI di proteine ​​nr è RefSeq (valore e < 1e−10 è 60% d'omologia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белSeq nr белSeка nr e <1e-10 и гомология 60%). BLASTX hè statu ancu realizatu nantu à contigs non-self utilizendu e basi di dati di proteine ​​nr è RefSeq NCBI (valore e < 1e-10 è 60% d'omologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０ 倧怼 性 60%〉还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０ 倧怼 性 60%〉 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безка NC e BI (Ref. <1e-10 è гомология 60%). BLASTX hè statu ancu realizatu nantu à contigs non-self utilizendu e basi di dati di proteine ​​nr è RefSeq NCBI (valore e <1e-10 è 60% d'omologia).I gruppi BLASTN è BLASTX di contigs non-auto-riprisentanu i contigs finali (vede u schedariu supplementariu).
I primer utilizati per a PCR sò elencati in a Tavula S1. A Taq DNA polimerasi (Bio Basic Canada, Markham, ON) hè stata utilizata per amplificà i geni bersagliu di ccfDNA. Sò state aduprate e seguenti cundizioni di reazione: denaturazione à 95°C per 3 minuti, 95°C per 1 minutu, temperatura di ricottura impostata per 1 minutu, allungamentu à 72°C per 1 minutu, 35 cicli, è infine 72°C in 10 minuti. I prudutti PCR sò stati separati per elettroforesi in gel d'agarosa (1,5%) chì cuntenenu SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) à 95 V.
I mitili (Mytilus spp.) sò stati acclimatati in 500 ml d'acqua di mare ossigenata (32 PSU) per 24 ore à 4°C. U DNA plasmidicu chì cuntene un insertu chì codifica a sequenza di cDNA di galectina-7 umana (numeru d'accessu NCBI L07769) hè statu aghjuntu à a fiala à una cuncentrazione finale di 190 μg/μl. I mitili incubati in e stesse cundizioni senza aggiunta di DNA eranu u cuntrollu. U terzu tank di cuntrollu cunteneva DNA senza mitili. Per monitorà a qualità di u DNA in l'acqua di mare, sò stati prelevati campioni d'acqua di mare (20 μl; trè ripetizioni) da ogni tank à u mumentu indicatu. Per a tracciabilità di u DNA plasmidicu, i mitili LB sò stati raccolti à i tempi indicati è analizzati da qPCR è ddPCR. A causa di l'altu cuntenutu di sale di l'acqua di mare, l'aliquote sò state diluite in acqua di qualità PCR (1:10) prima di tutti i test PCR.
A PCR digitale à gocce (ddPCR) hè stata realizata cù u protocolu BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada). Aduprate u prufilu di temperatura per determinà a temperatura ottima (Tavula S1). E gocce sò state generate cù un generatore di gocce QX200 (BioRad). A ddPCR hè stata realizata cum'è seguita: 95°C per 5 min, 50 cicli di 95°C per 30 s è una data temperatura di ricottura per 1 min è 72°C per 30 s, 4°C per 5 min è 90°C in 5 minuti. U numeru di gocce è di reazioni pusitivi (numeru di copie/µl) sò stati misurati cù un lettore di gocce QX200 (BioRad). I campioni cù menu di 10.000 gocce sò stati rigettati. U cuntrollu di u mudellu ùn hè statu realizatu ogni volta chì a ddPCR hè stata eseguita.
A qPCR hè stata realizata cù Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) è primer specifichi LGALS7. Tutte e PCR quantitative sò state realizate in 20 µl utilizendu u QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). A qPCR hè stata iniziata cù una incubazione di 15 minuti à 95°C seguita da 40 cicli à 95°C per 10 secondi è à 60°C per 60 secondi cù una sola raccolta di dati. E curve di fusione sò state generate utilizendu misurazioni successive à 95°C per 5 s, 65°C per 60 s è 97°C à a fine di a qPCR. Ogni qPCR hè stata realizata in triplicatu, eccettu per i campioni di cuntrollu.
Siccomu i mitili sò cunnisciuti per a so alta velocità di filtrazione, avemu prima investigatu s'elli pudianu filtrà è mantene i frammenti di DNA prisenti in l'acqua di mare. Eramu ancu interessati à sapè s'elli si accumulanu in u so sistema linfaticu semi-apertu. Avemu risoltu stu prublema sperimentalmente tracciendu u destinu di i frammenti di DNA solubili aghjunti à i serbatoi di mitili blu. Per facilità u tracciamentu di i frammenti di DNA, avemu utilizatu DNA plasmidicu straneru (micca auto) chì cuntene u genu umanu galectina-7. A ddPCR traccia i frammenti di DNA plasmidicu in l'acqua di mare è i mitili. I nostri risultati mostranu chì se a quantità di frammenti di DNA in l'acqua di mare hè rimasta relativamente costante in u tempu (finu à 7 ghjorni) in assenza di mitili, allora in presenza di mitili questu livellu hè sparitu quasi cumpletamente in 8 ore (Fig. 1a,b). Frammenti di DNA esogenu sò stati facilmente rilevati in 15 minuti in u fluidu intravalvulare è l'emolinfa (Fig. 1c). Questi frammenti pudianu ancu esse rilevati finu à 4 ore dopu l'esposizione. Questa attività di filtrazione in quantu à i frammenti di DNA hè paragunabile à l'attività di filtrazione di batteri è alghe [31]. Questi risultati suggerenu chì i mitili ponu filtrà è accumulà DNA straneru in i so compartimenti fluidi.
Cuncentrazioni relative di DNA plasmidicu in acqua di mare in presenza (A) o assenza (B) di cozze, misurate da ddPCR. In A, i risultati sò espressi cum'è percentuali, cù i bordi di e caselle chì rapprisentanu u 75esimu è u 25esimu percentile. A curva logaritmica adattata hè mostrata in rossu, è l'area ombreggiata in grisgiu rapprisenta l'intervallu di fiducia di u 95%. In B, a linea rossa rapprisenta a media è a linea blu rapprisenta l'intervallu di fiducia di u 95% per a cuncentrazione. C Accumulazione di DNA plasmidicu in l'emolinfa è u fluidu valvulare di e cozze in tempi diversi dopu l'aghjunta di DNA plasmidicu. I risultati sò presentati cum'è copie assolute rilevate/mL (±SE).
Dopu, avemu investigatu l'origine di u ccfDNA in i mitili raccolti da i letti di mitili di l'Isule Kerguelen, un gruppu remoto d'isule cù influenza antropogenica limitata. Per questu scopu, u cccDNA da l'emolinfe di mitili hè statu isolatu è purificatu cù metudi cumunimenti usati per purificà u cccDNA umanu [32, 33]. Avemu trovu chì e concentrazioni medie di ccfDNA di l'emolinfa in i mitili sò in a gamma di microgrammi bassi per ml di emolinfa (vede a Tabella S2, Informazioni Supplementari). Questa gamma di concentrazioni hè assai più grande chè in e persone sane (nanogrammi bassi per millilitru), ma in casi rari, in i pazienti cun cancru, u livellu di ccfDNA pò ghjunghje à parechji microgrammi per millilitru [34, 35]. Un'analisi di a distribuzione di e dimensioni di u ccfDNA di l'emolinfa hà dimustratu chì questi frammenti varianu assai in dimensioni, da 1000 bp à 1000 bp. finu à 5000 bp (Fig. 2). Risultati simili sò stati ottenuti aduprendu u QIAamp Investigator Kit à basa di silice, un metudu cumunemente adupratu in a scienza forense per isolà è purificà rapidamente u DNA genomicu da campioni di DNA à bassa concentrazione, cumpresu u ccfDNA [36].
Elettroforegramma rappresentativu di ccfDNA di l'emolinfa di e cozze. Estrattu cù u Kit di Plasma NucleoSnap (in cima) è u Kit QIAamp DNA Investigator. Graficu B di u viulinu chì mostra a distribuzione di e concentrazioni di ccfDNA di l'emolinfa (±SE) in e cozze. E linee nere è rosse rapprisentanu rispettivamente a mediana è u primu è u terzu quartile.
Circa l'1% di u ccfDNA in l'omu è in i primati hà una fonte straniera [21, 37]. Datu u sistema circulatoriu semi-apertu di i bivalvi, l'acqua di mare ricca di microbi è a distribuzione di e dimensioni di u ccfDNA di e cozze, avemu ipotizzatu chì u ccfDNA di l'emolinfa di e cozze puderia cuntene un gruppu riccu è diversu di DNA microbianu. Per pruvà sta ipotesi, avemu sequenziatu u ccfDNA di l'emolinfa da campioni di Aulacomya atra raccolti da l'Isule Kerguelen, dendu più di 10 milioni di letture, u 97,6% di e quali hà passatu u cuntrollu di qualità. E letture sò state poi classificate secondu e fonti self è non-self utilizendu e basi di dati di bivalvi BLASTN è NCBI (Fig. S1, Informazioni Supplementari).
In l'omu, sia u DNA nucleare sia quellu mitocondriale ponu esse liberati in u sangue [38]. Tuttavia, in u presente studiu, ùn hè statu pussibule di discrive in dettagliu u DNA genomicu nucleare di e cozze, datu chì u genomu di A. atra ùn hè statu sequenziatu o discrittu. Tuttavia, simu stati capaci di identificà un numeru di frammenti di ccfDNA di a nostra propria origine utilizendu a biblioteca di bivalvi (Fig. S2, Informazioni Supplementari). Avemu ancu cunfirmatu a presenza di frammenti di DNA di a nostra propria origine per amplificazione PCR diretta di quelli geni di A. atra chì sò stati sequenziati (Fig. 3). In listessu modu, datu chì u genomu mitocondriale di A. atra hè dispunibule in e basi di dati publiche, si pò truvà evidenze di a presenza di frammenti di ccfDNA mitocondriale in l'emolinfa di A. atra. A presenza di frammenti di DNA mitocondriale hè stata cunfirmata da l'amplificazione PCR (Fig. 3).
Diversi geni mitocondriali eranu prisenti in l'emolinfa di A. atra (punti rossi - numeru di stock: SRX5705969) è M. platensis (punti blu - numeru di stock: SRX5705968) amplificati da PCR. Figura adattata da Breton et al., 2011 B Amplificazione di u surnatante di l'emolinfa di A. atra Cunservatu nantu à carta FTA. Aduprate un punzone di 3 mm per aghjunghje direttamente à u tubu PCR chì cuntene a mistura PCR.
Datu l'abbundante cuntenutu microbianu in l'acqua di mare, ci simu inizialmente cuncentrati nantu à a caratterizazione di e sequenze di DNA microbianu in l'emolinfa. Per fà questu, usemu duie strategie diverse. A prima strategia hà utilizatu Kraken2, un prugramma di classificazione di sequenze basatu annantu à algoritmi chì pò identificà e sequenze microbiane cù una precisione paragunabile à BLAST è altri strumenti [28]. Più di 6719 letture sò state determinate cum'è d'origine batterica, mentre chì 124 è 64 eranu rispettivamente da archaea è virus (Fig. 4). I frammenti di DNA battericu più abbundanti eranu Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) è Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a). Questa distribuzione hè coerente cù studii precedenti di u microbioma di e cozze blu marine [39, 40]. I gammaproteobacteria eranu a classe principale di Proteobacteria (44%), cumprese parechje Vibrionales (Fig. 4b). U metudu ddPCR hà cunfirmatu a prisenza di frammenti di DNA di Vibrio in u ccfDNA di l'emolinfa di A. atra (Fig. 4c) [41]. Per ottene più infurmazioni nantu à l'origine batterica di u ccfDNA, hè statu aduttatu un approcciu supplementariu (Fig. S2, Informazioni Supplementari). In questu casu, e letture chì si sovrapponevanu sò state assemblate cum'è letture à estremità appaiate è sò state classificate cum'è di origine propria (bivalvi) o non propria utilizendu BLASTN è un valore e di 1e−3 è un cutoff cù >90% d'omologia. In questu casu, e letture chì si sovrapponevanu sò state assemblate cum'è letture à estremità appaiate è sò state classificate cum'è di origine propria (bivalvi) o non propria utilizendu BLASTN è un valore e di 1e−3 è un cutoff cù >90% d'omologia. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны как чтения с парными концами и были собраны как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием зованием зованием зованием BLAS отсечения с гомологией> 90%. In questu casu, e letture sovrapposte sò state raccolte cum'è letture à accoppiamenti è sò state classificate cum'è native (bivalve) o non uriginale utilizendu BLASTN è un valore e di 1e-3 è un cutoff cù una omologia di >90%.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 值值值同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 的 用 的 3值 和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и классикфи класы собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использовани зовани e BLAS 1e-3 è порога гомологии> 90%. In questu casu, e letture sovrapposte sò state raccolte cum'è letture à accoppiamenti è classificate cum'è proprie (bivalvi) o non uriginali utilizendu i valori e BLASTN è 1e-3 è una soglia di omologia > 90%.Siccomu u genomu di A. atra ùn hè ancu statu sequenziatu, avemu utilizatu a strategia di assemblaggio de novo di l'assemblatore MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Un totale di 147.188 contigs sò stati identificati cum'è dipendenti (bivalvi) da l'origine. Quessi contigs sò stati poi esplosi cù valori e di 1e-10 utilizendu BLASTN è BLASTX. Sta strategia ci hà permessu di identificà 482 frammenti non bivalvi presenti in u ccfDNA di A. atra. Più di a metà (57%) di sti frammenti di DNA sò stati ottenuti da batteri, principalmente da simbionti branchiali, cumpresi simbionti sulfotrofichi, è da simbionti branchiali Solemya velum (Fig. 5).
Abbundanza relativa à u livellu di tipu. B Diversità microbica di dui phyla principali (Firmicutes è Proteobacteria). Amplificazione rappresentativa di ddPCR C Vibrio spp. A. Frammenti di u genu 16S rRNA (blu) in trè emolinfe atra.
Un totale di 482 contigs raccolti sò stati analizati. Profilu generale di a distribuzione tassonomica di l'annotazioni di contigs metagenomici (procarioti è eucarioti). B Distribuzione dettagliata di frammenti di DNA battericu identificati da BLASTN è BLASTX.
L'analisi di Kraken2 hà ancu dimustratu chì u ccfDNA di e cozze cuntene frammenti di DNA archeale, cumpresi frammenti di DNA di Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) è Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a). A presenza di frammenti di DNA derivati ​​da Euryarchaeota è Crenarchaeota, prima truvati in a cumunità microbica di e cozze californiane, ùn deve micca esse una surpresa [42]. Ancu s'è Euryarchaeota hè spessu assuciatu à cundizioni estreme, hè avà ricunnisciutu chì sia Euryarchaeota sia Crenarcheota sò trà i procarioti più cumuni in l'ambiente criogenicu marinu [43, 44]. A presenza di microrganismi metanogenici in e cozze ùn hè micca surpresa, datu i recenti rapporti di estese perdite di metanu da perdite di fondu nantu à l'Altopianu di Kerguelen [45] è a pussibile pruduzzione microbica di metanu osservata à u largu di a costa di l'Isule Kerguelen [46].
A nostra attenzione s'hè tandu spostata à e letture di i virus à DNA. À a nostra cunniscenza, questu hè u primu studiu fora di u target di u cuntenutu di virus di e cozze. Cum'è previstu, avemu trovu frammenti di DNA di batteriofagi (Caudovirales) (Fig. 6b). Tuttavia, u DNA virale più cumunu vene da un phylum di nucleocitovirus, cunnisciutu ancu cum'è u virus à DNA grande citoplasmaticu nucleare (NCLDV), chì hà u più grande genomu di qualsiasi virus. In questu phylum, a maiò parte di e sequenze di DNA appartenenu à e famiglie Mimimidoviridae (58%) è Poxviridae (21%), chì i so ospiti naturali includenu vertebrati è artropodi, mentre chì una piccula parte di queste sequenze di DNA appartene à alghe virologiche cunnisciute. Infetta l'alghe eucariote marine. E sequenze sò state ancu ottenute da u virus Pandora, u virus gigante cù a più grande dimensione di genomu di qualsiasi genere virale cunnisciutu. Hè interessante nutà chì a gamma di ospiti cunnisciuti per esse infettati da u virus, cum'è determinatu da u sequenziamentu di ccfDNA di l'emolinfa, era relativamente grande (Figura S3, Informazioni Supplementari). Include virus chì infettanu insetti cum'è Baculoviridae è Iridoviridae, è ancu virus chì infettanu amebe, alghe è vertebrati. Avemu ancu trovu sequenze chì currispondenu à u genomu di Pithovirus sibericum. I pitovirus (cunnisciuti ancu cum'è "virus zombie") sò stati isolati per a prima volta da u permafrost di 30.000 anni in Siberia [47]. Cusì, i nostri risultati sò coerenti cù i rapporti precedenti chì mostranu chì micca tutte e spezie muderne di sti virus sò estinte [48] è chì sti virus ponu esse presenti in ecosistemi marini subartici remoti.
Infine, avemu fattu una prova per vede s'ellu pudemu truvà frammenti di DNA da altri animali multicellulari. Un totale di 482 contig stranieri sò stati identificati da BLASTN è BLASTX cù biblioteche nt, nr è RefSeq (genomiche è proteiche). I nostri risultati mostranu chì trà i frammenti stranieri di ccfDNA di animali multicellulari predomina u DNA di l'osse ossee (Fig. 5). Frammenti di DNA d'insetti è altre spezie sò stati ancu trovati. Una parte relativamente grande di i frammenti di DNA ùn hè stata identificata, forse per via di a sottorappresentazione di un gran numeru di spezie marine in e basi di dati genomiche paragunate à e spezie terrestri [49].
In u presente articulu, applichemu u cuncettu LB à i mitili, sustinendu chì u sequenziamentu di ccfDNA di l'emolinfa pò furnisce infurmazioni nantu à a cumpusizione di l'ecosistemi custieri marini. In particulare, avemu trovu chì 1) l'emolinfa di i mitili cuntene concentrazioni relativamente alte (livelli di microgrammi) di frammenti di DNA circulanti relativamente grandi (~1-5 kb); 2) questi frammenti di DNA sò sia indipendenti sia micca indipendenti 3) Trà e fonti straniere di questi frammenti di DNA, avemu trovu DNA battericu, archeale è virale, è ancu DNA di altri animali multicellulari; 4) L'accumulazione di questi frammenti di ccfDNA stranieri in l'emolinfa si faci rapidamente è cuntribuisce à l'attività di filtrazione interna di i mitili. In conclusione, u nostru studiu dimostra chì u cuncettu di LB, chì finu à avà hè statu applicatu principalmente in u campu di a biomedicina, codifica una fonte di cunniscenza ricca ma inesplorata chì pò esse aduprata per capisce megliu l'interazione trà e spezie sentinelle è u so ambiente.
In più di i primati, l'isolamentu di ccfDNA hè statu signalatu in i mammiferi, cumpresi topi, cani, gatti è cavalli [50, 51, 52]. Tuttavia, à a nostra cunniscenza, u nostru studiu hè u primu à signalà a rilevazione è u sequenziamentu di ccfDNA in spezie marine cù un sistema di circulazione aperta. Questa caratteristica anatomica è a capacità di filtraggio di e cozze ponu, almenu in parte, spiegà e diverse caratteristiche di dimensione di i frammenti di DNA circulanti paragunati à altre spezie. In l'omu, a maiò parte di i frammenti di DNA chì circulanu in u sangue sò picculi frammenti chì varianu in dimensione da 150 à 200 bp. cù un piccu massimu di 167 bp [34, 53]. Una piccula ma significativa parte di i frammenti di DNA sò trà 300 è 500 bp in dimensione, è circa u 5% sò più longhi di 900 bp. [54]. A ragione di sta distribuzione di e dimensioni hè chì a principale fonte di ccfDNA in u plasma si verifica per via di a morte cellulare, sia per via di a morte cellulare sia per via di a necrosi di e cellule ematopoietiche circulanti in individui sani o per via di l'apoptosi di e cellule tumorali in i pazienti cun cancru (cunnisciuta cum'è DNA tumorale circulante). , ctDNA). A distribuzione di e dimensioni di u ccfDNA di l'emolinfa chì avemu trovu in i mitili variava da 1000 à 5000 bp, ciò chì suggerisce chì u ccfDNA di i mitili hà una origine diversa. Questa hè un'ipotesi logica, postu chì i mitili anu un sistema vasculare semi-apertu è vivenu in ambienti acquatici marini chì cuntenenu alte concentrazioni di DNA genomicu microbianu. In fatti, i nostri esperimenti di laburatoriu chì utilizanu DNA esogenu anu dimustratu chì i mitili accumulanu frammenti di DNA in acqua di mare, almenu dopu à qualchì ora sò degradati dopu l'assorbimentu cellulare è / o liberati è / o almacenati in varie urganisazioni. Data a rarità di e cellule (sia procariote sia eucariote), l'usu di compartimenti intravalvulari riducerà a quantità di ccfDNA da auto-fonti è ancu da fonti straniere. Cunsiderendu l'impurtanza di l'immunità innata di i bivalvi è u grande numeru di fagociti circulanti, avemu ancu ipotizzatu chì ancu u ccfDNA straneru hè arricchitu in fagociti circulanti chì accumulanu DNA straneru dopu l'ingestione di microrganismi è/o detriti cellulari. Pigliati inseme, i nostri risultati mostranu chì u ccfDNA di l'emolinfa bivalve hè un repositoriu unicu di informazioni moleculari è rinforza u so statutu di spezia sentinella.
I nostri dati indicanu chì u sequenziamentu è l'analisi di frammenti di ccfDNA di l'emolinfa derivati ​​da batteri ponu furnisce informazioni chjave nantu à a flora batterica ospitante è i batteri presenti in l'ecosistema marinu circundante. E tecniche di sequenziamentu à colpi anu rivelatu sequenze di i batteri cummensali A. atra gill chì sarebbero state mancate se i metudi convenzionali di identificazione di 16S rRNA fussinu stati aduprati, in parte per via di un pregiudiziu di biblioteca di riferimentu. In fatti, u nostru usu di dati LB raccolti da M. platensis in u listessu stratu di cozze in Kerguelen hà dimustratu chì a cumpusizione di i simbionti batterici assuciati à e branchie era a stessa per e duie spezie di cozze (Fig. S4, Informazioni Supplementari). Questa similitudine di duie cozze geneticamente diverse pò riflette a cumpusizione di e cumunità batteriche in i depositi freddi, sulfurei è vulcanichi di Kerguelen [55, 56, 57, 58]. Livelli più alti di microrganismi chì riducenu u zolfu sò stati ben descritti durante a raccolta di cozze da zone costiere bioturbate [59], cum'è a costa di Port-au-France. Un'altra pussibilità hè chì a flora cummensale di e cozze possi esse affettata da a trasmissione urizzuntale [60, 61]. Ci vole più ricerca per determinà a currelazione trà l'ambiente marinu, a superficia di u fondu marinu è a cumpusizione di i batteri simbiotici in e cozze. Quessi studii sò attualmente in corsu.
A lunghezza è a cuncentrazione di u ccfDNA di l'emolinfa, a so facilità di purificazione è l'alta qualità per permette un sequenziamentu rapidu di u shotgun sò alcuni di i numerosi vantaghji di l'usu di u ccfDNA di e cozze per valutà a biodiversità in l'ecosistemi marini custieri. Questu approcciu hè particularmente efficace per caratterizà e cumunità virali (viromì) in un ecosistema datu [62, 63]. À u cuntrariu di i batteri, l'archea è l'eucarioti, i genomi virali ùn cuntenenu micca geni filogeneticamente cunservati cum'è e sequenze 16S. I nostri risultati indicanu chì e biopsie liquide da spezie indicatrici cum'è e cozze ponu esse aduprate per identificà un numeru relativamente grande di frammenti di virus ccfDNA cunnisciuti per infettà ospiti chì tipicamente abitanu l'ecosistemi marini custieri. Questu include virus cunnisciuti per infettà protozoi, artropodi, insetti, piante è virus batterichi (per esempiu, batteriofagi). Una distribuzione simile hè stata trovata quandu avemu esaminatu u viroma ccfDNA di l'emolinfa di e cozze blu (M. platensis) raccolte in u listessu stratu di cozze à Kerguelen (Tabella S2, Informazioni Supplementari). U sequenziamentu à fucile di ccfDNA hè veramente un novu approcciu chì guadagna slanciu in u studiu di u viroma di l'omu o di altre spezie [21, 37, 64]. Questu approcciu hè particularmente utile per studià i virus à DNA à doppia catena, postu chì nisun genu unicu hè cunservatu trà tutti i virus à DNA à doppia catena, chì rapprisentanu a classa di virus più diversa è larga in Baltimore [65]. Ancu se a maiò parte di sti virus restanu senza classificazione è ponu include virus da una parte cumpletamente scunnisciuta di u mondu virale [66], avemu trovu chì i viromi è e gamme d'ospiti di e cozze A. atra è M. platensis si trovanu trà e duie spezie. in modu simile (vede a figura S3, informazioni supplementari). Questa similitudine ùn hè micca sorprendente, postu chì pò riflette una mancanza di selettività in l'assorbimentu di DNA presente in l'ambiente. Studi futuri chì utilizanu RNA purificatu sò attualmente necessarii per caratterizà u viroma di RNA.
In u nostru studiu, avemu utilizatu una pipeline assai rigorosa adattata da u travagliu di Kowarski è culleghi [37], chì anu utilizatu una eliminazione in dui passi di letture è contig raggruppati prima è dopu l'assemblementu di ccfDNA nativu, risultendu in una alta proporzione di letture micca mappate. Dunque, ùn pudemu micca escludere chì alcune di queste letture micca mappate possinu ancu avè a so propria origine, principalmente perchè ùn avemu micca un genomu di riferimentu per sta spezia di cozza. Avemu ancu utilizatu sta pipeline perchè eramu preoccupati per e chimere trà letture self è non-self è e lunghezze di lettura generate da Illumina MiSeq PE75. Un'altra ragione per a maiò parte di e letture micca mappate hè chì gran parte di i microbi marini, in particulare in zone remote cum'è Kerguelen, ùn sò state annotate. Avemu utilizatu Illumina MiSeq PE75, assumendu lunghezze di frammenti di ccfDNA simili à u ccfDNA umanu. Per studii futuri, dati i nostri risultati chì mostranu chì u ccfDNA di l'emolinfa hà letture più lunghe di l'umani è / o di i mammiferi, ricumandemu di utilizà una piattaforma di sequenziamentu più adatta per frammenti di ccfDNA più lunghi. Sta pratica renderà assai più faciule d'identificà più indicazioni per un'analisi più approfondita. L'ottenimentu di a sequenza cumpleta di u genomu nucleare di A. atra, attualmente indisponibile, faciliterebbe ancu assai a discriminazione di u ccfDNA da fonti proprie è non proprie. Datu chì a nostra ricerca s'hè cuncentrata nantu à a pussibilità d'applicà u cuncettu di biopsia liquida à i mitili, speremu chì, mentre stu cuncettu hè adupratu in a ricerca futura, novi strumenti è pipeline saranu sviluppati per aumentà u putenziale di stu metudu per studià a diversità microbica di i mitili in l'ecosistema marinu.
Cum'è un biomarcatore clinicu non invasivu, i livelli elevati di ccfDNA in u plasma umanu sò assuciati à diverse malatie, danni à i tessuti è cundizioni di stress [67,68,69]. Questu aumentu hè assuciatu à a liberazione di frammenti di DNA di a so propria origine dopu à u dannu à i tessuti. Avemu trattatu stu prublema aduprendu u stress termicu acutu, in u quale i mitili sò stati brevemente esposti à una temperatura di 30 °C. Avemu realizatu sta analisi nantu à trè diversi tipi di mitili in trè esperimenti indipendenti. Tuttavia, ùn avemu trovu alcun cambiamentu in i livelli di ccfDNA dopu à u stress termicu acutu (vede a Figura S5, informazioni supplementari). Sta scuperta pò spiegà, almenu in parte, u fattu chì i mitili anu un sistema circulatoriu semi-apertu è accumulanu grandi quantità di DNA straneru per via di a so alta attività di filtrazione. D’altronde, i mitili, cum'è parechji invertebrati, ponu esse più resistenti à i danni à i tessuti indotti da u stress, limitendu cusì a liberazione di ccfDNA in a so emolinfa [70, 71].
Finu à oghje, l'analisi di u DNA di a biodiversità in l'ecosistemi acquatichi s'hè cuncentrata principalmente nantu à u metabarcoding di u DNA ambientale (eDNA). Tuttavia, questu metudu hè generalmente limitatu in l'analisi di a biodiversità quandu si utilizanu primer. L'usu di u sequenziamentu shotgun aggira i limiti di a PCR è a selezzione sbilanciata di i gruppi di primer. Cusì, in un certu sensu, u nostru metudu hè più vicinu à u metudu di sequenziamentu eDNA Shotgun à altu rendimentu utilizatu recentemente, chì hè capace di sequenzià direttamente u DNA frammentatu è analizà quasi tutti l'organismi [72, 73]. Tuttavia, ci sò una quantità di prublemi fundamentali chì distinguenu LB da i metudi standard di eDNA. Benintesa, a principale differenza trà eDNA è LB hè l'usu di ospiti filtranti naturali. L'usu di spezie marine cum'è spugne è bivalvi (Dreisseina spp.) cum'è filtru naturale per studià l'eDNA hè statu signalatu [74, 75]. Tuttavia, u studiu di Dreissena hà utilizatu biopsie di tessuti da i quali hè statu estrattu u DNA. L'analisi di ccfDNA da LB ùn richiede micca biopsia di tessuti, apparecchiature specializate è à volte costose è logistica assuciata à l'eDNA o à a biopsia di tessuti. In fatti, avemu signalatu pocu fà chì u ccfDNA da LB pò esse almacenatu è analizatu cù u supportu FTA senza mantene una catena di u fretu, chì hè una sfida maiò per a ricerca in zone remote [76]. L'estrazione di ccfDNA da biopsie liquide hè ancu simplice è furnisce DNA di alta qualità per u sequenziamentu shotgun è l'analisi PCR. Questu hè un grande vantaghju datu alcune di e limitazioni tecniche assuciate à l'analisi di eDNA [77]. A simplicità è u bassu costu di u metudu di campionamentu sò ancu particularmente adatti per i prugrammi di monitoraghju à longu andà. In più di a so alta capacità di filtrazione, un'altra caratteristica ben cunnisciuta di i bivalvi hè a cumpusizione chimica di mucopolisaccaridi di u so mucus, chì prumove l'assorbimentu di virus [78, 79]. Questu face di i bivalvi un filtru naturale ideale per caratterizà a biodiversità è l'impattu di u cambiamentu climaticu in un datu ecosistema acquaticu. Ancu s'è a presenza di frammenti di DNA derivati ​​da l'ospite pò esse vista cum'è una limitazione di u metudu paragunatu à l'eDNA, u costu assuciatu à avè un tale ccfDNA nativu paragunatu à l'eDNA hè simultaneamente comprensibile per a vasta quantità di informazioni dispunibili per studii di salute offset host. Questu include a presenza di sequenze virali integrate in u genomu di l'ospite ospite. Questu hè particularmente impurtante per i mitili, data a presenza di retrovirus leucemici trasmessi orizzontalmente in i bivalvi [80, 81]. Un altru vantaghju di LB rispetto à l'eDNA hè chì sfrutta l'attività fagocitica di e cellule sanguine circulanti in l'emolinfa, chì inghiotte i microrganismi (è i so genomi). A fagocitosi hè a funzione principale di e cellule sanguine in i bivalvi [82]. Infine, u metudu sfrutta l'alta capacità di filtrazione di i mitili (media 1,5 l/h d'acqua di mare) è a circulazione di dui ghjorni, chì aumentanu a miscelazione di diversi strati d'acqua di mare, permettendu a cattura di eDNA eterologu. [83, 84]. Cusì, l'analisi di ccfDNA di i mitili hè una strada interessante datu l'impatti nutrizionali, ecunomichi è ambientali di i mitili. Simile à l'analisi di LB raccoltu da l'omu, questu metudu apre ancu a pussibilità di misurà i cambiamenti genetichi è epigenetici in u DNA ospite in risposta à sustanzi esogeni. Per esempiu, e tecnulugie di sequenziamentu di terza generazione ponu esse previste per realizà analisi di metilazione à livellu di genomu in ccfDNA nativu utilizendu u sequenziamentu di nanopori. Stu prucessu duveria esse facilitatu da u fattu chì a lunghezza di i frammenti di ccfDNA di cozze hè idealmente cumpatibile cù e piattaforme di sequenziamentu à longa lettura chì permettenu l'analisi di metilazione di u DNA à livellu di genomu da una sola corsa di sequenziamentu senza a necessità di trasfurmazioni chimiche.85,86] Questa hè una pussibilità interessante, postu chì hè statu dimustratu chì i mudelli di metilazione di u DNA riflettenu una risposta à u stress ambientale è persistenu per parechje generazioni. Dunque, pò furnisce una preziosa infurmazione nantu à i meccanismi sottostanti chì guvernanu a risposta dopu l'esposizione à u cambiamentu climaticu o à l'inquinanti [87]. Tuttavia, l'usu di LB ùn hè micca senza limitazioni. Inutile dì chì questu richiede a presenza di spezie indicatrici in l'ecosistema. Cum'è menzionatu sopra, l'usu di LB per valutà a biodiversità di un datu ecosistema richiede ancu una pipeline bioinformatica rigorosa chì tenga contu di a presenza di frammenti di DNA da a fonte. Un altru prublema maiò hè a dispunibilità di genomi di riferimentu per e spezie marine. Si spera chì iniziative cum'è u Marine Mammal Genomes Project è u prughjettu Fish10k recentemente creatu [88] faciliteranu tali analisi in u futuru. L'applicazione di u cuncettu LB à l'organismi marini chì si nutriscenu per filtrazione hè ancu cumpatibile cù l'ultimi progressi in a tecnulugia di sequenziamentu, rendendulu adattatu per u sviluppu di biomarcatori multi-ohm per furnisce informazioni impurtanti nantu à a salute di l'habitat marini in risposta à u stress ambientale.
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