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A biopsia liquida (LB) hè un cuncettu chì guadagna rapidamente popularità in u campu biomedicale.U cuncettu hè principarmenti basatu annantu à a rilevazione di frammenti di DNA extracellular circulante (ccfDNA), chì sò principarmenti liberati cum'è picculi frammenti dopu a morte cellulare in diversi tessuti.Una piccula proporzione di sti frammenti sò urigginati da tessuti o organismi stranieri (straneri).In u travagliu attuale, avemu applicatu stu cuncettu à i mitili, una spezia sentinella cunnisciuta per a so alta capacità di filtrazione di l'acqua di mare.Utilizemu a capacità di i mitili per agisce cum'è filtri naturali per catturà frammenti di DNA ambientale da una varietà di fonti per furnisce infurmazioni nantu à a biodiversità di l'ecosistema costiere marini.I nostri risultati mostranu chì l'emolinfa di mussula cuntene frammenti di DNA chì varienu assai in grandezza, da 1 à 5 kb.A sequenza di Shotgun hà dimustratu chì un gran numaru di frammenti di DNA sò di origine microbiana straniera.Frà elli, avemu trovu frammenti di DNA da batteri, archee, è virus, cumpresi i virus cunnisciuti per infettà una varietà d'ospiti cumunimenti truvati in l'ecosistemi marini custieri.In cunclusioni, u nostru studiu dimostra chì u cuncettu di LB applicatu à i mitili rapprisenta una fonte di cunniscenze ricca, ma ancu inesplorata, nantu à a diversità microbica in l'ecosistema costiere marini.
L'impattu di u cambiamentu climaticu (CC) nantu à a biodiversità di l'ecosistema marini hè una zona di ricerca in rapida crescita.U riscaldamentu glubale ùn solu ùn provoca stress fisiologichi impurtanti, ma ancu spinghje i limiti evolutivi di l'stabilità termale di l'organismi marini, affettendu l'habitat di una quantità di spezie, inducendu à circà e cundizioni più favurevuli [1, 2].In più di affettà a biodiversità di i metazoani, CC disturba l'equilibriu delicatu di l'interazzione host-microbial.Questa disbacteriosi microbica pone una seria minaccia per l'ecosistemi marini, postu chì rende l'organismi marini più suscettibili à i patogeni infettivi [3, 4].Hè cresce chì SS ghjucanu un rolu impurtante in i morti di massa, chì hè un prublema seriu per a gestione di l'ecosistema marini glubale [5, 6].Questu hè un prublema impurtante datu l'impatti ecunomichi, ecologichi è nutriziunali di parechje spezie marine.Questu hè soprattuttu veru per i bivalvi chì vivenu in e regioni polari, induve l'effetti di CK sò più immediati è severi [6, 7].Infatti, i bivalvi cum'è Mytilus spp.sò largamente usati per monitorizà l'effetti di CC nantu à l'ecosistema marini.Ùn hè micca surprisante, un numeru relativamente grande di biomarcatori sò stati sviluppati per monitorà a so salute, spessu utilizendu un approcciu à dui livelli chì implica biomarcatori funzionali basati nantu à l'attività enzimatica o funzioni cellulari cum'è a viabilità cellulare è l'attività fagocitica [8].Questi metudi includenu ancu a misurazione di a cuncentrazione di indicatori di pressione specifichi chì s'acumulanu in i tessuti molli dopu l'absorzione di grandi quantità di acqua di mare.In ogni casu, l'alta capacità di filtrazione è u sistema circulatori semi-apertu di i bivalvi furnisce l'uppurtunità di sviluppà novi biomarcatori di hemolinfa utilizendu u cuncettu di biopsia liquida (LB), un approcciu simplice è minimamente invasivu à a gestione di i pazienti.campioni di sangue [9, 10].Ancu se parechji tipi di molécule circulanti ponu esse truvati in a LB umana, stu cuncettu hè principalmente basatu annantu à l'analisi di sequenza di DNA di frammenti di DNA extracellular circulante (ccfDNA) in plasma.In fatti, a prisenza di DNA circulante in u plasma umanu hè cunnisciuta da a mità di u XXu seculu [11], ma hè solu in l'ultimi anni chì l'avventu di metudi di sequencing high-throughput hà purtatu à un diagnosticu clinicu basatu annantu à ccfDNA.A prisenza di sti frammenti di DNA circulanti hè dovutu in parte à a liberazione passiva di DNA genomicu (nucleare è mitocondriale) dopu a morte cellulare. In l'individui sani, a cuncentrazione di ccfDNA hè nurmalmente bassa (<10 ng / mL) ma pò esse aumentata da 5-10 volte in i malati chì soffrenu di diverse patologie o sottumessi à stress, risultatu in danni tissutali. In l'individui sani, a cuncentrazione di ccfDNA hè nurmalmente bassa (<10 ng / mL) ma pò esse aumentata da 5-10 volte in i malati chì soffrenu di diverse patologie o sottumessi à stress, risultatu in danni tissutali. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но может повышатция вккДНК в норме низкая различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящему к повреждению тканей. In i persone sani, a cuncentrazione di cccDNA hè nurmale bassa (<10 ng / mL), ma pò aumentà da 5-10 volte in i malati cù diverse patologie o sottu stress chì porta à danni tissutali.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理有各种病理或种病理或承常较低（<10 ng/mL）加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病理 或 傯 忣 或 扏增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут быть увелича на 10 увеличе на 10 с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. A cuncentrazione di ccfDNA sò generalmente bassu (<10 ng / ml) in individui sani, ma pò esse aumentatu 5-10 volte in i malati cù diverse patologii o stress, risultatu in danni tissutali.A dimensione di i frammenti di ccfDNA varieghja assai, ma generalmente varieghja da 150 à 200 bp.[12].L'analisi di ccfDNA autoderivatu, vale à dì, ccfDNA da e cellule d'ospiti nurmali o trasformate, pò esse usata per detectà cambiamenti genetichi è epigenetici prisenti in u genoma nucleari è / o mitocondriale, aiutendu cusì i clinichi à selezziunà terapii specifichi di mira moleculare [13].Tuttavia, ccfDNA pò esse acquistatu da fonti straniere cum'è ccfDNA da e cellule fetali durante a gravidanza o da l'organi trasplantati [14,15,16,17].ccfDNA hè ancu una fonte impurtante di infurmazione per a deteczione di a prisenza di l'acidi nucleici di un agenti infizziosi (straneru), chì permette a rilevazione non-invasive di infizzioni generalizati micca identificati da i culturi di sangue, evitendu a biopsia invasiva di u tissutu infettatu [18].Studi recenti anu dimustratu chì u sangue umanu cuntene una ricca fonte d'infurmazioni chì ponu esse utilizati per identificà i patogeni virali è bacteriali, è chì circa 1% di u ccfDNA truvatu in u plasma umanu hè di origine straniera [19].Questi studii dimustranu chì a biodiversità di u microbioma circulante di l'organismu pò esse valutata cù l'analisi ccfDNA.In ogni casu, finu à pocu tempu, stu cuncettu hè stata utilizata solu in l'omu è, in una misura più menu, in altri vertebrati [20, 21].
In u presente documentu, usemu u putenziale LB per analizà u ccfDNA di Aulacomya atra, una spezia miridiunali chì si trova cumunamenti in l'Isule Kerguelen subantartiche, un gruppu d'isule in cima à un grande altipiano chì si furmò 35 milioni d'anni fà.eruzione vulcanica.Utilizendu un sistema sperimentale in vitro, truvamu chì i frammenti di DNA in l'acqua di mare sò rapidamente pigliati da i musculi è entranu in u compartment hemolinfa.A sequenza di Shotgun hà dimustratu chì l'emolinfa ccfDNA di mussula cuntene frammenti di DNA di u so propiu è di l'origine non propria, cumprese batteri simbiotici è frammenti di DNA da biomi tipici di l'ecosistema marini custieri vulcanici friddi.L'emolymph ccfDNA cuntene ancu sequenze virali derivate da virus cù diversi intervalli di ospiti.Avemu trovu ancu frammenti di DNA da animali multicellulari cum'è pesci ossei, anemoni di mare, alghe è insetti.In cunclusione, u nostru studiu dimostra chì u cuncettu LB pò esse appiicatu cù successu à l'invertebrati marini per generà un riccu repertoriu genomicu in l'ecosistema marini.
Adulti (55-70 mm long) Mytilus platensis (M. platensis) è Aulacomya atra (A. atra) sò stati cullati da i costi rocciosi intertidal di Port-au-France (049 ° 21.235 S, 070 ° 13.490 E .).Isole Kerguelen in dicembre 2018. L'altri mitili blu adulti (Mytilus spp.) sò stati ottenuti da un fornitore cummerciale (PEI Mussel King Inc., Prince Edward Island, Canada) è posti in un tank aeratu à temperatura cuntrullata (4 ° C) chì cuntene 10-20 L di 32 ‰ di salmuera artificiale.(sali marini artificiali Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).Per ogni esperimentu, a lunghezza è u pesu di cunchiglia individuali sò stati misurati.
Un protokollu d'accessu apertu gratuitu per stu prugramma hè dispunibule in linea (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).In breve, l'hemolinfa LB hè stata cullata da i musculi abductori cum'è descrittu [22].L'hemolinfa hè stata clarificata per centrifugazione à 1200 × g per 3 minuti, u supernatant hè statu congelatu (-20 ° C) finu à l'usu.Per l'isolamentu è a purificazione di cfDNA, i campioni (1,5-2,0 ml) sò stati scongelati è processati cù u kit NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) secondu l'istruzzioni di u fabricatore.ccfDNA hè stata guardata à -80 ° C finu à più analisi.In certi esperimenti, ccfDNA hè statu isolatu è purificatu cù u QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Canada).L'ADN purificatu hè statu quantificatu cù un test PicoGreen standard.A distribuzione di frammenti di u ccfDNA isolatu hè stata analizata da l'elettroforesi capillare utilizendu un bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) utilizendu un kit di DNA di alta sensibilità.L'analisi hè stata realizata cù 1 µl di u campione di ccfDNA secondu l'istruzzioni di u fabricatore.
Per a sequenza di frammenti di ccfDNA di hemolinfa, Génome Québec (Montreal, Quebec, Canada) hà preparatu biblioteche di fucili cù u kit Illumina DNA Mix di u kit Illumina MiSeq PE75.Un adattatore standard (BioO) hè statu utilizatu.I schedarii di dati crudi sò dispunibuli da l'Archiviu di Lettura di Sequenza NCBI (SRR8924808 è SRR8924809).A qualità di lettura di basa hè stata valutata cù FastQC [23].Trimmomatic [24] hè stata utilizata per adattatori di clipping è letture di qualità povera.Letture di fucile cù estremità accoppiate sò stati FLASH uniti in letture singole più lunghe cù una sovrapposizione minima di 20 bp per evità disaccordi [25]. Letture unite sò state annotate cù BLASTN utilizendu una basa di dati di Taxonomy NCBI bivalve (valore e <1e-3 è 90% omologia), è a maschera di sequenze di bassa cumplessità hè stata realizata cù DUST [26]. Letture unite sò state annotate cù BLASTN utilizendu una basa di dati di Taxonomy NCBI bivalve (valore e <1e-3 è 90% omologia), è a maschera di sequenze di bassa cumplessità hè stata realizata cù DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы с помощью BLASTN с использованием базы даннотированы танных тасмы оллюсков NCBI (значение e < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сло низкой сло слоние пользованием DUST [26]. Letture cumulate sò state annotate cù BLASTN utilizendu a basa di dati di tassonomia bivalva NCBI (valore e <1e-3 è 90% omologia), è a maschera di sequenza di bassa cumplessità hè stata realizata cù DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90% 同源性）用BLASTN 注释合并的诌合并的诌数诌数，诌数低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90% 同源） 用 用 用 注释 合并 读数 （并 读数 Ａ 读数 ） dust复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичесанкой сономичесанкой дсованы тых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовательностей низологии нослогии с использованием DUST [26]. Letture cumulate sò state annotate cù BLASTN utilizendu a basa di dati tassonomichi bivalvi NCBI (valore e <1e-3 è 90% omologia), è a maschera di sequenza di bassa cumplessità hè stata realizata cù DUST [26].Leghjite sò stati divisi in dui gruppi: ligati à sequenze bivalvi (qui chjamati self-reads) è senza relazione (non-self-reads).Dui gruppi sò stati assemblati separatamente cù MEGAHIT per generà contigs [27].Intantu, a distribuzione tassonomica di letture di microbioma alienu hè stata classificata cù Kraken2 [28] è rapprisintata graficamente da un graficu di Krona in Galaxy [29, 30].U kmers ottimali hè statu determinatu à esse kmers-59 da i nostri esperimenti preliminari. L'autocontighi sò stati identificati da l'allineamentu cù BLASTN (base di dati NCBI bivalve, valore e <1e-10 è 60% omologia) per una annotazione finale. L'autocontighi sò stati identificati da l'allineamentu cù BLASTN (base di dati NCBI bivalve, valore e <1e-10 è 60% omologia) per una annotazione finale. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN. BI, значение e <1e-10 и гомология 60%) для окончательной аннотации. L'autocontigs sò stati dopu identificati cunfrontu cù BLASTN (base di dati di bivalvi NCBI, valore e <1e-10 è 60% omologia) per l'annotazione finale.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）对齐来识对齐来识堫翇臍舫臥识建最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотации путем совенные контиги для окончательной аннотации путем совенные контиги для окончательной аннотации путем совеннад х NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 и гомология 60%). I self-contigs sò stati dopu identificati per l'annotazione finale cunfrontendu cù BLASTN (base di dati di bivalvi NCBI, valore e <1e-10 è 60% omologia). In parallelu, i contigs di u gruppu non self sò stati annotati cù BLASTN (base di dati nt NCBI, valore e <1e-10 è 60% omologia). In parallelu, i contigs di u gruppu non self sò stati annotati cù BLASTN (base di dati nt NCBI, valore e <1e-10 è 60% omologia). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (база даннных 1,1 гомология 60%). In parallelu, i contigs di u gruppu straneru sò stati annotati cù BLASTN (base di dati NT NCBI, valore e <1e-10 è 60% omologia).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。组重叠组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60% 同源性）注释非自身组釤。组重叠组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе, были аннотированы с помощщиеся к собственной группе ачение e <1e-10 и гомология 60%). In parallelu, i contigs di u gruppu non-self sò stati annotati cù BLASTN (base di dati nt NCBI, valore e <1e-10 è 60% omologia). BLASTX hè statu ancu realizatu nantu à contigs nonself utilizendu e basa di dati NCBI di proteine ​​​​nr è RefSeq (valore e <1e-10 è 60% omologia). BLASTX hè statu ancu realizatu nantu à contigs nonself utilizendu e basa di dati NCBI di proteine ​​​​nr è RefSeq (valore e <1e-10 è 60% omologia). BLASTX также был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз данных белех белека nr 10 è гомология 60%). BLASTX hè statu ancu realizatu nantu à contigs non-self utilizendu e basa di dati di proteine ​​​​nr è RefSeq NCBI (valore e <1e-10 è 60% omologia).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性怺 性 60%〉还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和０性怺 性 60%〉 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз данных безных безнка nr BI0e гомология 60%). BLASTX hè statu ancu realizatu nantu à contigs non-self utilizendu e basa di dati di proteine ​​​​nr è RefSeq NCBI (valore e <1e-10 è 60% omologia).I pool BLASTN è BLASTX di non-self-contigs rapprisentanu i contigs finali (vede File Supplementary).
I primers utilizati per a PCR sò listati in a Tabella S1.Taq DNA polymerase (Bio Basic Canada, Markham, ON) hè stata aduprata per amplificà i geni di destinazione ccfDNA.I seguenti cundizioni di reazione sò stati utilizati: denaturazione à 95 ° C per 3 minuti, 95 ° C per 1 minutu, stabilisce a temperatura di annealing per 1 minutu, allungamentu à 72 ° C per 1 minutu, 35 cicli, è infine 72 ° C in 10 minuti..I prudutti di PCR sò stati separati per elettroforesi in gel di agarose (1,5%) chì cuntenenu SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) à 95 V.
Mitili (Mytilus spp.) sò stati acclimatizzati in 500 ml d'acqua di mare ossigenata (32 PSU) per 24 ore à 4 ° C.L'ADN plasmidicu chì cuntene un insertu chì codifica a sequenza di cDNA di galectin-7 umanu (numeru d'accessu NCBI L07769) hè statu aghjuntu à u vial à una cuncentrazione finale di 190 μg/μl.I musculi incubati in e stesse cundizioni senza l'aggiunta di DNA eranu u cuntrollu.U terzu tank di cuntrollu cuntene DNA senza musselli.Per monitorà a qualità di l'ADN in l'acqua di mare, i campioni di l'acqua di mare (20 μl; trè ripetizioni) sò stati pigliati da ogni tank à u tempu indicatu.Per a tracciabilità di l'ADN plasmidicu, i cozze LB sò stati raccolti à i tempi indicati è analizati da qPCR è ddPCR.A causa di l'altu cuntenutu di sali di l'acqua di mare, l'aliquots sò stati diluiti in acqua di qualità PCR (1: 10) prima di tutti i test PCR.
A PCR digitale a goccia (ddPCR) hè stata realizata cù u protocolu BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Canada).Aduprà u prufilu di temperatura per determinà a temperatura ottima (Table S1).E gocce sò state generate cù un generatore di goccia QX200 (BioRad).A ddPCR hè stata realizata cum'è seguente: 95 ° C per 5 min, 50 cicli di 95 ° C per 30 s è una data temperatura di annealing per 1 min è 72 ° C per 30 s, 4 ° C per 5 min è 90 ° C in 5 minuti.U numeru di gocce è reazzioni pusitivi (numaru di copie/µl) sò stati misurati cù un lettore di gocce QX200 (BioRad).I campioni cù menu di 10 000 gocce sò stati rifiutati.U cuntrollu di u mudellu ùn hè micca fattu ogni volta chì ddPCR hè stata eseguita.
qPCR hè stata realizata cù Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) è primers specifichi LGALS7.Tutte e PCR quantitative sò state eseguite in 20 µl cù u QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR hè stata iniziata cù una incubazione di 15 minuti à 95 ° C seguita da 40 cicli à 95 ° C per 10 seconde è à 60 ° C per 60 seconde cù una raccolta di dati.E curve di fusione sò state generate cù misure successive à 95 ° C per 5 s, 65 ° C per 60 s, è 97 ° C à a fine di a qPCR.Ogni qPCR hè stata realizata in triplicatu, eccettu per i campioni di cuntrollu.
Siccomu i mitili sò cunnisciuti per u so altu ritmu di filtrazione, avemu prima investigatu s'ellu puderanu filtrà è retenu i frammenti di DNA prisenti in l'acqua di mare.Eramu ancu interessatu à se questi frammenti s'accumulanu in u so sistema limfaticu semi-apertu.Avemu risoltu stu prublema sperimentalmente tracciandu u destinu di frammenti di DNA soluble aghjuntu à i tanki di mitili blu.Per facilità a traccia di i frammenti di DNA, avemu usatu DNA plasmidicu straneru (micca stessu) chì cuntene u genu umanu galectin-7.ddPCR traccia frammenti di DNA plasmidi in acqua di mare è cozze.I nostri risultati mostranu chì, se a quantità di frammenti di DNA in l'acqua di mare si manteneu relativamente custanti in u tempu (finu à 7 ghjorni) in l'absenza di musselli, in a presenza di musselli stu livellu quasi cumplettamente sparitu in 8 ore (Fig. 1a, b).Fragmenti di DNA exogenous sò facilmente rilevati in 15 min in intravalvular fluid and hemolymph (Fig. 1c).Questi frammenti puderanu ancu esse rilevati finu à 4 ore dopu l'esposizione.Questa attività di filtrazione in quantu à i frammenti di DNA hè paragunabile à l'attività di filtrazione di battìri è alghe [31].Questi risultati suggerenu chì i mitili ponu filtrà è accumulà DNA straneru in i so compartimenti fluidi.
Concentrazioni relative di DNA plasmidicu in acqua di mare in presenza (A) o assenza (B) di cozze, misurate da ddPCR.In A, i risultati sò spressi in percentuale, cù i cunfini di e scatuli chì rapprisentanu u 75 è u 25 percentile.A curva logaritmica adattata hè mostrata in rossu, è l'area ombreggiata in grisgiu rapprisenta l'intervallu di cunfidenza di 95%.In B, a linea rossa rapprisenta a media è a linea blu rapprisenta l'intervallu di cunfidenza di 95% per a cuncentrazione.C Accumulazione di l'ADN plasmidicu in l'emolinfa è u fluidu valvular di i musculi in tempi diversi dopu l'aghjunzione di DNA plasmidicu.I risultati sò presentati cum'è copie assolute rilevate / mL (± SE).
In seguitu, avemu investigatu l'origine di ccfDNA in i mitili raccolti da i letti di mitili nantu à l'Isule Kerguelen, un gruppu remotu di isule cù una influenza antropogenica limitata.Per questu scopu, u cccDNA da l'emolinfa di mussell hè statu isolatu è purificatu da i metudi cumunimenti utilizati per purificà u cccDNA umanu [32, 33].Avemu trovu chì a cuncentrazione media di hemolinfa ccfDNA in i cozze sò in u minimu microgrammi per ml di gamma di hemolinfa (vede Table S2, Informazioni supplementari).Questa gamma di cuncentrazione hè assai più grande chì in i persone sani (bassu nanogrammi per millilitru), ma in casi rari, in i malati di cancru, u livellu di ccfDNA pò ghjunghje à parechji microgrammi per millilitru [34, 35].Un analisi di a distribuzione di grandezza di l'emolymph ccfDNA hà dimustratu chì questi frammenti varianu assai in grandezza, chì varieghja da 1000 bp à 1000 bp.finu à 5000 bp (Fig. 2).I risultati simili sò stati ottenuti utilizendu u QIAamp Investigator Kit basatu in silice, un metudu cumunimenti utilizatu in a scienza forensica per isolà è purificà rapidamente l'ADN genomicu da campioni di DNA di cuncentrazione bassa, cumpresu ccfDNA [36].
Elettroforegramma rappresentativo ccfDNA di l'emolinfa di cozza.Estratto cù NucleoSnap Plasma Kit (in cima) è QIAamp DNA Investigator Kit.B Violin plot chì mostra a distribuzione di e cuncintrazioni di ccfDNA di hemolinfa (± SE) in i mitili.I linii neri è rossi rapprisentanu a mediana è u primu è u terzu quartile, rispettivamente.
Circa 1% di ccfDNA in l'omu è i primati anu una fonte straniera [21, 37].In vista di u sistema circulatori semi-apertu di i bivalvi, l'acqua di mare ricca in microbica, è a distribuzione di grandezza di ccfDNA di mussel, avemu ipotisatu chì l'emolymph ccfDNA di mussell pò cuntene una piscina ricca è diversa di DNA microbial.Per pruvà sta ipotesi, avemu sequenziatu l'hemolinfa ccfDNA da i campioni di Aulacomya atra raccolti da l'Isule Kerguelen, rendendu più di 10 milioni di letture, u 97,6% di i quali anu passatu u cuntrollu di qualità.E letture sò state poi classificate secondu e fonti autore è non-self usendu e basa di dati bivalvi BLASTN è NCBI (Fig. S1, Informazioni supplementari).
In l'omu, l'ADN nucleare è mitocondriale pò esse liberatu in u sangue [38].Tuttavia, in u presente studiu, ùn era micca pussibule di discrive in dettagliu l'ADN genomicu nucleari di i mitili, postu chì u genoma di A. atra ùn hè micca statu sequenziatu o discrittu.In ogni casu, pudemu identificà una quantità di frammenti di ccfDNA di a nostra propria origine utilizendu a biblioteca di bivalvi (Fig. S2, Informazioni supplementari).Avemu ancu cunfirmatu a prisenza di frammenti di DNA di a nostra propria origine per l'amplificazione PCR diretta di quelli genesi A. atra chì sò stati sequenziati (Fig. 3).In listessu modu, datu chì u genoma mitocondriale di A. atra hè dispunibule in basa di dati publichi, si pò truvà evidenza per a presenza di frammenti mitocondriali ccfDNA in l'hemolinfa di A. atra.A prisenza di frammenti di DNA mitocondriali hè stata cunfirmata da l'amplificazione PCR (Fig. 3).
Diversi genesi mitocondriali eranu prisenti in l'hemolinfa di A. atra (punti rossi - numeru di stock: SRX5705969) è M. platensis (punti blu - numeru di stock: SRX5705968) amplificati da PCR.Figura adattata da Breton et al., 2011 B Amplificazione di hemolinfa supernatant da A. atra Stored on FTA paper.Aduprate un punch di 3 mm per aghjunghje direttamente à u tubu PCR chì cuntene a mistura PCR.
Data l'abbundante cuntenutu microbicu in l'acqua di mare, avemu inizialmente focu annantu à a carattarizazione di sequenze di DNA microbiale in hemolinfa.Per fà questu, avemu aduprà duie strategie diffirenti.A prima strategia hà utilizatu Kraken2, un prugramma di classificazione di sequenze basatu in algoritmi chì ponu identificà sequenze microbiche cù una precisione paragunabili à BLAST è altri strumenti [28].Più di 6719 leghje sò stati determinati per esse di l'urìgine bacteriana, mentri 124 è 64 eranu da archeea è virus, rispettivamente (Fig. 4).I frammenti di DNA bacterial più abbundanti eranu Firmicutes (46%), Proteobacteria (27%) è Bacteroidetes (17%) (Fig. 4a).Questa distribuzione hè coherente cù studii precedenti di u microbioma di u musculu blu marinu [39, 40].Gammaproteobacteria eranu a classa principale di Proteobacteria (44%), cumpresi assai Vibrinales (Fig. 4b).U metudu ddPCR cunfirmatu a prisenza di fragments di DNA Vibrio in u ccfDNA di A. atra hemolymph (Fig. 4c) [41].Per ottene più infurmazione nantu à l'urìggini bacterial di ccfDNA, un accostu supplementu hè statu pigliatu (Fig. S2, Information Supplementary). In questu casu, letture chì si sò sovrapposte sò state assemblate cum'è letture in coppia è sò state classificate cum'è d'origine propria (bivalvi) o non-self usendu BLASTN è un valore e di 1e-3 è un cutoff cù > 90% di omologia. In questu casu, letture chì si sò sovrapposte sò state assemblate cum'è letture in coppia è sò state classificate cum'è d'origine propria (bivalvi) o non-self usendu BLASTN è un valore e di 1e-3 è un cutoff cù > 90% di omologia. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и были собраны как чтения с парными концами и были собраны обственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с использованием BLASTN и 1e-3сначе 3 с гомологией> 90%. In questu casu, e letture sovrapposte sò state raccolte cum'è letture accoppiate è sò state classificate cum'è native (bivalve) o micca originali utilizendu BLASTN è u valore e di 1e-3 è cutoff cù > 90% omologia.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e 倢值值值值怼末端读数，并使用BLASTN值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 使用 使用 使用 的 用 用 3和> 90% 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными концами и концами и классираны енные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с использованием зованием зованием зованием зованием знач знач происхождению мологии> 90%. In questu casu, e letture sovrapposte sò state raccolte cum'è letture in coppia è classificate cum'è propiu (bivalvi) o micca originali utilizendu e BLASTN è i valori 1e-3 è un sogliu di omologia > 90%.Siccomu u genomu A. atra ùn hè ancu statu sequenziatu, avemu usatu a strategia di assemblea de novo di l'assembler MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Un totale di 147.188 contigs sò stati identificati cum'è dipendenti (bivalvi) di origine.Questi contigs sò stati poi esplosi cù e-value di 1e-10 cù BLASTN è BLASTX.Sta strategia ci hà permessu di identificà 482 frammenti non bivalvi prisenti in A. atra ccfDNA.Più di a mità (57%) di sti frammenti di DNA sò stati ottenuti da i battìri, principarmenti da i simbionti gill, inclusi i simbionti sulfotròfichi, è da i simbionti gill Solemya velum (Fig. 5).
Abbundanza relativa à u livellu di u tipu.B Diversità microbiana di dui phyla principali (Firmicutes è Proteobacteria).Amplificazione rappresentativa di ddPCR C Vibrio spp.A. Frammenti di u genu 16S rRNA (blu) in trè atra hemolimphs.
Un totale di 482 contigs raccolti sò stati analizati.Profilu generale di a distribuzione tassonomica di l'annotazioni contig metagenomiche (procarioti è eucarioti).B Distribuzione dettagliata di frammenti di DNA batterica identificati da BLASTN è BLASTX.
L'analisi Kraken2 hà ancu dimustratu chì u ccfDNA di mussula cuntene fragmenti di DNA archeali, inclusi i frammenti di DNA di Euryarchaeota (65%), Crenarchaeota (24%) è Thaurmarcheota (11%) (Fig. 6a).A prisenza di frammenti di DNA derivati ​​da Euryarchaeota è Crenarchaeota, truvati prima in a cumunità microbica di i mitili californiani, ùn deve micca esse una sorpresa [42].Ancu Euryarchaeota hè spessu assuciatu cù cundizioni estremi, hè avà ricunnisciutu chì sia Euryarchaeota è Crenarcheota sò trà i procarioti più cumuni in l'ambiente criogenicu marinu [43, 44].A prisenza di microrganismi metanogenici in i mitili ùn hè micca surprisante, datu i recenti rapporti di perdite di metanu estensivi da e fughe di fondu nantu à l'altopiano di Kerguelen [45] è a pussibuli pruduzzione microbiana di metanu osservata fora di a costa di l'Isule Kerguelen [46].
A nostra attenzione poi si trasferì à letture da i virus DNA.À u megliu di a nostra cunniscenza, questu hè u primu studiu off-target di u cuntenutu di virus di i mitili.Cum'è s'aspittava, avemu trovu fragments di DNA di bacteriophages (Caudovirales) (Fig. 6b).In ogni casu, l'ADN virali più cumuni vene da un filu di nucleocytoviruses, cunnisciutu ancu u grande virus di DNA citoplasmaticu nucleare (NCLDV), chì hà u più grande genoma di qualsiasi virus.In questu filu, a maiò parte di e sequenze di DNA appartenenu à e famiglie Mimimidoviridae (58%) è Poxviridae (21%), chì i so ospiti naturali includenu vertebrati è artropodi, mentre chì una piccula proporzione di sti sequenze di DNA appartene à l'alga virologica cunnisciuta.Infetta l'alghe eucariote marine.E sequenze sò stati ancu ottenuti da u virus Pandora, u virus gigante cù u genoma più grande di tutti i generi virali cunnisciuti.Curiosamente, a gamma di ospiti cunnisciuti per esse infettati da u virus, cum'è determinatu da a sequenza di l'emolymph ccfDNA, era relativamente grande (Figura S3, Informazioni supplementari).Include virus chì infettate insetti cum'è Baculoviridae è Iridoviridae, è ancu virus chì infettanu l'ameba, l'alga è i vertebrati.Avemu trovu ancu sequenze chì currispondenu à u genoma di Pithovirus sibericum.I pitovirus (cunnisciutu ancu com'è "virus zombie") sò stati prima isolati da permafrost di 30 000 anni in Siberia [47].Cusì, i nostri risultati sò coerenti cù i rapporti precedenti chì mostranu chì micca tutte e spezie muderne di sti virus sò estinte [48] è chì questi virus ponu esse prisenti in ecosistemi marini subartici remoti.
Infine, avemu pruvatu per vede s'ellu pudemu truvà frammenti di DNA da altri animali multicellulari.Un totale di 482 contigs stranieri sò stati identificati da BLASTN è BLASTX cù librerie nt, nr è RefSeq (genomica è proteina).I nostri risultati mostranu chì trà i frammenti straneri di ccfDNA di l'animali multicellulari l'ADN di l'osse ossei predomina (Fig. 5).Frammenti di DNA da insetti è altre spezie sò stati ancu truvati.Una parte relativamente grande di i frammenti di DNA ùn hè micca stata identificata, possibbilmente per via di a sottorappresentazione di un gran numaru di spezie marine in basa di dati genomica cumparatu cù e spezie terrestri [49].
In u presente documentu, applichemu u cuncettu di LB à i cozze, argumentendu chì a sequenza di l'hemolymph ccfDNA shot pò furnisce insight in a cumpusizioni di l'ecosistema marini custieri.In particulare, avemu trovu chì 1) mussel hemolinfa cuntene cuncintrazioni relativamente altu (niveli microgrami) di frammenti di DNA circulanti relativamente grande (~ 1-5 kb);2) sti frammenti di DNA sò indipindenti è micca indipindenti 3) Frà e fonti straniere di sti frammenti di DNA, truvamu DNA bacterial, archeali è virali, è ancu DNA di altri animali multicellulari;4) L'accumulazione di questi frammenti di ccfDNA stranieri in l'hemolinfa si faci rapidamente è cuntribuisci à l'attività di filtrazione interna di i musculi.In cunclusioni, u nostru studiu dimustra chì u cuncettu di LB, chì finu à avà hè statu appiicatu principarmenti in u campu di a biomedicina, codifica una fonte di cunniscenze ricca, ma inesplorata, chì pò esse usata per capisce megliu l'interazzione trà e spezie sentinella è u so ambiente.
In più di i primati, l'isolamentu di ccfDNA hè statu rappurtatu in mammiferi, cumpresi topi, cani, misgi è cavalli [50, 51, 52].In ogni casu, à a nostra cunniscenza, u nostru studiu hè u primu à rapportà a deteczione è a sequenza di ccfDNA in spezie marine cù un sistema di circulazione aperta.Questa caratteristica anatomica è a capacità di filtrazione di i cozze pò, almenu in parte, spiegà e diverse caratteristiche di grandezza di i frammenti di DNA circulanti cumparatu cù altre spezie.In l'omu, a maiò parte di i frammenti di DNA chì circulanu in u sangue sò picculi frammenti chì varienu da 150 à 200 bp.cù un piccu massimu di 167 bp [34, 53].Una parte chjuca ma significativa di i frammenti di DNA sò trà 300 è 500 bp in grandezza, è circa 5% sò più longu di 900 bp.[54].U mutivu di sta distribuzione di dimensioni hè chì a fonte principale di ccfDNA in plasma si trova in u risultatu di a morte di e cellule, sia per a morte di e cellule sia per a necrosi di e cellule ematopoietiche circulanti in individui sani o per l'apoptosi di e cellule tumorali in i malati di cancro (cunnisciutu cum'è DNA di tumore circulante)., ctDNA).A distribuzione di taglia di l'emolymph ccfDNA chì avemu trovu in i mitili variava da 1000 à 5000 bp, suggerendu chì l'emolymph ccfDNA hà una origine diversa.Questa hè una ipotesi lògica, postu chì i mitili anu un sistema vascular semi-apertu è campanu in ambienti aquatichi marini chì cuntenenu altu concentrazioni di DNA genomicu microbicu.In fatti, i nostri esperimenti di laboratoriu chì utilizanu DNA esogenu anu dimustratu chì i cozze accumulanu frammenti di DNA in l'acqua di mare, almenu dopu à uni pochi d'ore sò degradati dopu l'assorbimentu cellulare è / o liberatu è / o almacenatu in diverse urganisazioni.Data a rarità di e cellule (sia procariote sia eucariote), l'usu di compartimenti intravalvulari riducerà a quantità di ccfDNA da l'auto-fonti è ancu da fonti straniere.In cunsiderà l'impurtanza di l'immunità innata bivalva è u gran numaru di fagociti circulanti, avemu ancu ipotizatu chì ancu u ccfDNA straneru hè arricchitu in fagociti circulanti chì accumulanu DNA straneru dopu l'ingestimentu di microorganismi è / o detriti cellulari.Pigliati inseme, i nostri risultati mostranu chì l'emolymph bivalve ccfDNA hè un repositoriu unicu di l'infurmazioni moleculari è rinforza u so status di spezia sentinella.
I nostri dati indicanu chì a sequenza è l'analisi di frammenti di ccfDNA di hemolinfa derivati ​​​​di batteri ponu furnisce infurmazioni chjave nantu à a flora bacteriana ospitante è i batteri presenti in l'ecosistema marinu circundante.I tecnichi di sequenza di Shot anu revelatu sequenze di u battìri commensali A. atra gill chì anu mancatu se i metudi d'identificazione di 16S rRNA cunvinziunali eranu stati utilizati, in parte per un bias di biblioteca di riferimentu.In fatti, u nostru usu di e dati LB cullate da M. platensis in u listessu stratu di mussula à Kerguelen hà dimustratu chì a cumpusizioni di simbionti bacteriali assuciati à u gill era a stessa per e duie spezie di musselli (Fig. S4, Information Supplementary).Questa similitudine di dui mitili geneticamente differenti pò riflette a cumpusizioni di e cumunità bacteriale in i dipositi friddi, sulfurosi è vulcanici di Kerguelen [55, 56, 57, 58].Livelli più altimi di microorganismi riducenti di sulfuru sò stati ben descritti in a cugliera di cozze da e zone costiere bioturbate [59], cum'è a costa di Port-au-France.Una altra pussibilità hè chì a flora di u musculu commensali pò esse affettata da a trasmissione horizontale [60, 61].Hè bisognu di più ricerca per determinà a correlazione trà l'ambiente marinu, a superficia di u fondu di u mari, è a cumpusizioni di battìri simbiotichi in i mitili.Questi studii sò attualmente in corso.
A durata è a cuncentrazione di l'hemolinfa ccfDNA, a so facilità di purificazione, è di alta qualità per permette una sequenza rapida di fucile sò alcuni di i numerosi vantaghji di l'usu di ccfDNA di mussell per valutà a biodiversità in l'ecosistema costiere marini.Stu approcciu hè particularmente efficace per caratterizà e cumunità virali (viromes) in un ecosistema datu [62, 63].A cuntrariu di i batteri, l'archei è l'eucarioti, i genomi virali ùn cuntenenu geni cunservati filogeneticamente cum'è sequenze 16S.I nostri risultati indicanu chì e biopsie liquide da spezie indicatori cum'è i cozze ponu esse aduprate per identificà un numeru relativamente grande di frammenti di virus ccfDNA cunnisciuti per infettà l'ospiti chì abitanu tipicamente l'ecosistemi marini custieri.Questu include virus cunnisciuti per infettà protozoi, artropodi, insetti, piante è virus bacteriali (per esempiu, bacteriophages).Una distribuzione simili hè stata truvata quandu avemu esaminatu l'hemolymph ccfDNA virome di i musculi turchini (M. platensis) cullati in a listessa capa di musculi in Kerguelen (Table S2, Supplementary Information).A sequencing Shotgun di ccfDNA hè veramente un novu approcciu chì guadagna impulsu in u studiu di u virome di l'omu o altre spezie [21, 37, 64].Stu approcciu hè particularmente utile per studià i virus di l'ADN à doppia filamentu, postu chì ùn hè micca cunservatu un genu unicu trà tutti i virus di l'ADN doppia filamentu, chì rapprisentanu a più diversa è larga classe di virus in Baltimore [65].Ancu s'è a maiò parte di sti virus ùn sò micca classificati è ponu include virus da una parte completamente scunnisciuta di u mondu virali [66], avemu trovu chì i viromi è l'ospiti di i mitili A. atra è M. platensis si trovanu trà e duie spezie.simile (vede a figura S3, infurmazione supplementaria).Questa similitudine ùn hè micca surprisante, postu chì pò riflette una mancanza di selettività in l'assunzione di DNA presente in l'ambiente.Studi futuri chì utilizanu RNA purificatu sò attualmente necessarii per caratterizà u virome RNA.
In u nostru studiu, avemu usatu un pipeline assai rigurosu adattatu da u travagliu di Kowarski è i culleghi [37], chì anu utilizatu una delezione in dui passi di letture è contigs cumulate prima è dopu l'assemblea di ccfDNA nativu, risultatu in una alta proporzione di letture senza mappa.Dunque, ùn pudemu micca escludiri chì alcune di queste letture senza cartografia pò ancu avè a so propria origine, soprattuttu perchè ùn avemu micca un genoma di riferimentu per questa spezia di mitili.Avemu ancu utilizatu stu pipeline perchè eramu preoccupati per e chimera trà e letture di sè stessu è micca di sè stessu è di e lunghezze di lettura generate da Illumina MiSeq PE75.Un altru mutivu per a maiò parte di e letture micca scuperte hè chì a maiò parte di i microbi marini, in particulare in i zoni remoti cum'è Kerguelen, ùn sò micca stati annotati.Avemu usatu Illumina MiSeq PE75, assumendu lunghezze di fragmentu ccfDNA simili à ccfDNA umanu.Per studii futuri, datu i nostri risultati chì mostranu chì l'emolymph ccfDNA hà letture più longu chì l'omu è / o mammiferi, ricumandemu d'utilizà una piattaforma di sequenza più adattata per frammenti di ccfDNA più longu.Questa pratica farà assai più faciule per identificà più indicazione per una analisi più profonda.L'ottenimentu di a sequenza di u genoma nucleare di A. atra, attualmente indisponibile, faciliterebbe ancu assai a discriminazione di ccfDNA da e fonti di sè stessu è non-self.Dapoi chì a nostra ricerca hà focu annantu à a pussibilità di applicà u cuncettu di biòpsia di liquidu à i mitili, speremu chì cum'è stu cuncettu hè utilizatu in a ricerca futura, novi arnesi è pipeline seranu sviluppati per aumentà u putenziale di stu metudu per studià a diversità microbica di i mitili.ecosistema marinu.
Cum'è un biomarcatore clinicu non invasivu, i livelli elevati di plasma umanu di ccfDNA sò assuciati cù diverse malatie, danni tissutali è cundizioni di stress [67,68,69].Stu incrementu hè assuciatu cù a liberazione di frammenti di DNA di a so propria origine dopu danni di tissuti.Avemu affruntatu stu prublema cù u stress agutu di u calore, in quale i cozze sò stati esposti brevemente à una temperatura di 30 ° C.Avemu fattu sta analisi nantu à trè tippi diffirenti di cozze in trè esperimenti indipendenti.In ogni casu, ùn avemu micca truvatu nisun cambiamentu in i livelli di ccfDNA dopu u stress agutu di calore (vede a Figura S5, infurmazione supplementaria).Sta scuperta pò spiegà, almenu in parte, u fattu chì i musselli anu un sistema circulatori semi-apertu è accumulanu grandi quantità di DNA straneru per via di a so attività di filtrazione alta.Per d 'altra banda, i musculi, cum'è parechji invertebrati, ponu esse più resistenti à u dannu tissutu induvatu da u stress, limitendu cusì a liberazione di ccfDNA in a so hemolinfa [70, 71].
Finu a data, l'analisi di l'ADN di a biodiversità in l'ecosistema acquaticu hè stata principarmenti focu annantu à a metabarcoding di DNA ambientale (eDNA).Tuttavia, stu metudu hè generalmente limitatu in l'analisi di a biodiversità quandu i primi sò usati.L'usu di a sequenza di fucile aggira e limitazioni di a PCR è a selezzione biasata di set di primer.Cusì, in un certu sensu, u nostru metudu hè più vicinu à u metudu di sequenza di eDNA Shotgun d'altu rendiment utilizatu di pocu tempu, chì hè capace di sequenza direttamente DNA fragmentatu è analizà quasi tutti l'organisimi [72, 73].Tuttavia, ci sò una quantità di prublemi fundamentali chì distinguenu LB da i metudi standard di eDNA.Di sicuru, a principal diferenza trà eDNA è LB hè l'usu di filtri naturali.L'usu di spezie marine cum'è spugna è bivalvi (Dresseina spp.) cum'è un filtru naturali per studià eDNA hè statu rapportatu [74, 75].Tuttavia, u studiu di Dreissena hà utilizatu biopsie di tissuti da quale l'ADN hè stata estratta.L'analisi di ccfDNA da LB ùn hà micca bisognu di biòpsia di tissuti, equipaggiu specializatu è à volte caru è logistica assuciata cù eDNA o biòpsia tissutale.In fatti, avemu recentemente infurmatu chì ccfDNA da LB pò esse almacenatu è analizatu cù u supportu FTA senza mantene una catena di friddu, chì hè una sfida maiò per a ricerca in i zoni remoti [76].L'estrazione di ccfDNA da biopsie di liquidu hè ancu simplice è furnisce DNA di alta qualità per a sequenza di fucile è l'analisi PCR.Questu hè un grande vantaghju datu alcune di e limitazioni tecniche assuciate à l'analisi eDNA [77].A simplicità è u prezzu bassu di u metudu di campionamentu hè ancu particularmente adattatu per i prugrammi di monitoraghju à longu andà.In più di a so alta capacità di filtrazione, una altra caratteristica ben cunnisciuta di i bivalvi hè a cumpusizioni mucopolisaccharide chimica di u so mucus, chì prumove l'assorbimentu di virus [78, 79].Questu facenu i bivalvi un filtru naturali ideale per caratterizà a biodiversità è l'impattu di u cambiamentu climaticu in un ecosistema acquaticu datu.Ancu s'è a prisenza di frammenti di DNA derivati ​​da l'ospiti pò esse vistu cum'è una limitazione di u metudu cumparatu cù eDNA, u costu assuciatu à avè un tali ccfDNA nativu cumparatu à eDNA hè simultaneamente comprensibile per a vasta quantità di informazioni dispunibili per studii di salute.offset host.Questu include a prisenza di sequenze virali integrate in u genoma di l'ospitu host.Questu hè particularmente impurtante per i mitili, datu a presenza di retrovirus leucemici trasmessi horizontalmente in i bivalvi [80, 81].Un altru vantaghju di LB nantu à eDNA hè chì sfrutta l'attività fagocitica di e cellule di sangue in circulazione in l'emolinfa, chì engulfs microorganisms (è i so genomi).A fagocitosi hè a funzione principale di e cellule di sangue in i bivalvi [82].Infine, u metudu prufittà di l'alta capacità di filtrazione di i cozze (media 1,5 l/h d'acqua di mare) è di a circulazione di dui ghjorni, chì aumentanu a mistura di diverse strati di l'acqua di mare, chì permettenu a cattura di eDNA heterologu.[83, 84].Cusì, l'analisi di u ccfDNA di mitili hè una strada interessante datu l'impattu nutrizionale, ecunomicu è ambientale di i mitili.Simile à l'analisi di LB raccolte da l'omu, stu metudu apre ancu a pussibilità di misurà i cambiamenti genetichi è epigenetici in u DNA di l'ospiti in risposta à sustanzi esogeni.Per esempiu, tecnulugie di sequenza di terza generazione ponu esse previste per realizà l'analisi di metilazione in tuttu u genoma in ccfDNA nativu utilizendu a sequenza di nanopori.Stu prucessu deve esse facilitatu da u fattu chì a lunghezza di i frammenti di ccfDNA di mitili hè idealmente compatibile cù e plataforme di sequenza di longa lettura chì permettenu l'analisi di metilazione di l'ADN in u genoma largu da una sola corsa di sequenza senza a necessità di trasfurmazioni chimiche.Dunque, pò furnisce una insight preziosa nantu à i meccanismi sottostanti chì guvernanu a risposta dopu l'esposizione à u cambiamentu climaticu o à i contaminanti [87].Tuttavia, l'usu di LB ùn hè micca senza limitazioni.Inutili, questu hè bisognu di a presenza di spezie indicatori in l'ecosistema.Cumu l'esitatu sopra, l'usu di LB per valutà a biodiversità di un ecosistema determinatu richiede ancu un rigurosu pipeline di bioinformatica chì piglia in contu a presenza di frammenti di DNA da a fonte.Un altru prublema maiò hè a dispunibilità di genomi di riferimentu per e spezie marine.Hè speratu chì iniziative cum'è u Prughjettu di Genomi di Mammiferi Marini è u prughjettu Fish10k [88] recentemente stabilitu facilitanu tali analisi in u futuru.L'applicazione di u cuncettu LB à l'organisimi di filtri marini hè ancu cumpatibile cù l'ultimi avanzati in a tecnulugia di sequenza, facendu bè adattatu per u sviluppu di biomarcatori multi-ohm per furnisce infurmazioni impurtanti nantu à a salute di l'abitati marini in risposta à u stress ambientale.
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