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L'emorragia incontrollata hè una di e cause principali di morte.A realizazione di l'hemostasi rapida assicura a sopravvivenza di u sughjettu cum'è primu aiutu durante u cummattimentu, l'accidenti di trafficu è l'operazioni di riduzzione di morte.Scaffold compositu rinforzatu in fibra nanoporosa (NFRCS) derivata da una cumpusizioni emostatica chì forma un film (HFFC) cum'è una fase cuntinua pò innescà è rinfurzà l'hemostasi.U sviluppu di u NFRCS hè basatu annantu à u disignu di l'ala di libellula.A struttura di l'ala di libellula hè custituita da ali trasversali è longitudinali, è e membrani di l'ala sò cunnessi l'una cù l'altru per mantene l'integrità di a microstruttura.L'HFFC riveste uniformemente a superficia di a fibra cù un film di grossu nanometru è cunnetta u spessore di cuttuni (Ct) distribuitu aleatoriamente (fase dispersa) per furmà una struttura nanoporosa.A cumminazzioni di fasi cuntinui è dispersi riduce u costu di u pruduttu da dece volte in paragunà à i prudutti dispunibili in u cummerciu.NFRCS modificati (tamponi o braccialetti) pò esse usatu in una varietà di applicazioni biomediche.Studi in vivo anu cunclusu chì u Cp NFRCS sviluppatu attiva è rinforza u prucessu di coagulazione in u situ di l'applicazione.NFRCS pò modulà u microambientu è agisce à u nivellu cellulare per via di a so struttura nanoporosa chì risulta in una migliore guarigione di ferite in u mudellu di ferita escisu.
L'emorragia incontrollata durante u cummattimentu, e situazioni intraoperatorie è d'urgenza ponu esse una seria minaccia per a vita di i feriti1.Queste cundizioni portanu ancu à un aumentu generale di a resistenza vascular perifèrica, chì porta à un shock hemorrhagic.E misure adattate per cuntrullà u sanguinamentu durante è dopu a cirurgia sò cunsiderate potenzialmente periculose per a vita2,3.I danni à i grandi vasi portanu à una perdita di sangue massiva, risultatu in una rata di mortalità di ≤ 50% in cumbattimentu è 31% durante a chirurgia1.A perdita di sangue massiva porta à una diminuzione di u voluminu di u corpu, chì reduce a pruduzzione cardiaca.Un aumentu di a resistenza vascular periferica tutale è una disfunzione progressiva di a microcirculazione portanu à l'ipoxia in l'organi di supportu di vita.U scossa hemorràgica pò accade se a cundizione cuntinueghja senza intervenzione efficace1,4,5.L'altri cumplicazioni includenu a progressione di l'ipotermia è l'acidosi metabolica, è ancu un disordine di coagulazione chì impedisce u prucessu di coagulazione.U shock hemorrhagic severu hè assuciatu cù un risicu più altu di morte6,7,8.In u scossa di gradu III (progressiva), a trasfusione di sangue hè essenziale per a sopravvivenza di i pazienti durante a morbidità è a mortalità intraoperatoria è postoperatoria.Per superà tutte e situazioni di minaccia di vita sopra, avemu sviluppatu un scaffold compositu rinforzatu cù fibre nanoporose (NFRCS) chì utilizeghja una cuncentrazione minima di polimeru (0,5%) utilizendu una cumminazione di polimeri hemostatici solubili in acqua.
Cù l'usu di rinforzu di fibra, i prudutti di u costu-effettivi ponu esse sviluppati.I fibri disposti aleatoriamente s'assumiglia à a struttura di l'ala di libellula, equilibrata da e strisce horizontale è verticale nantu à l'ale.I vini trasversali è longitudinali di l'ala cumunicanu cù a membrana di l'ala (Fig. 1).NFRCS hè custituitu da Ct rinfurzata cum'è un sistema di scaffold cù una forza fisica è meccanica megliu (Figura 1).A causa di l'accessibilità è di l'artighjanu, i cirurgichi prefessu aduprà calibre di filu di cuttuni (Ct) durante l'operazioni è i vestiti. Dunque, cunsiderendu i so multiplici benefici, cumprese> 90% cellulosa cristallina (imparts in u rinfurzà di l'attività hemostatic), Ct hè stata utilizata cum'è sistema scheleticu di NFRCS9,10. Dunque, cunsiderendu i so multiplici benefici, cumprese> 90% cellulosa cristallina (imparts in u rinfurzà di l'attività hemostatic), Ct hè stata utilizata cum'è sistema scheleticu di NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90% кристаличеслеслой в повышении гемостатической активности), Ct использовали в качестве скелетной системы NFRCS9,10. Dunque, datu i so numerosi benefici, cumprese> 90% di cellulosa cristallina (involucrata in l'attività hemostatic aumentata), Ct hè stata utilizata cum'è u sistema scheleticu NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90% 的结晶纤维素（有助于增强止血有助于增强止血滢止血滴止血滴 NF ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90%Dunque, datu i so numerosi benefici, cumprese più di 90% di cellulosa cristallina (aiuta à rinfurzà l'attività hemostatic), Ct hè stata utilizata cum'è scaffold per NFRCS9,10.Ct hè stata rivestita superficialmente (a furmazione di film nano-grossa hè stata osservata) è interconnessu cù una cumpusizioni di filmatu hemostatic (HFFC).HFFC agisce cum'è un matrigel, tenendu Ct pusatu aleatoriamente inseme.U disignu sviluppatu trasmette u stress in a fase dispersa (fibre di rinforzu).Hè difficiuli di ottene strutture nanoporose cù una bona forza meccanica usendu concentrazioni di polimeru minimu.Inoltre, ùn hè micca faciule di persunalizà diverse muffa per diverse applicazioni biomediche.
A figura mostra un diagramma di u disignu NFRCS basatu annantu à a struttura di l'ala di libellula (A).Questa maghjina mostra una analogia comparativa di a struttura di l'ala di una libellula (i vini intersectanti è longitudinali di l'ala sò interconnessi) è una fotomicrografia transversale di Cp NFRCS (B).Rappresentazione schematica di NFRCS.
I NFRC sò stati sviluppati utilizendu HFFC cum'è una fase cuntinua per affruntà e limitazioni sopra.L'HFFC hè cumpostu di vari polimeri emostatici filmati cumpresi chitosan (cum'è u polimeru emostaticu principale) cù metilcellulosa (MC), idrossipropilmetilcellulosa (HPMC 50 cp) è alcool polivinilico (PVA)) (125 kDa) cum'è polimeru di supportu chì prumove a furmazione di trombi.furmazione.L'aghjunzione di polyvinylpyrrolidine K30 (PVP K30) hà migliuratu a capacità d'assorbimentu di l'umidità di u NFRCS.Polyethylene glycol 400 (PEG 400) hè statu aghjuntu per migliurà a reticulazione di polimeru in mischi di polimeru ligatu.Tre diverse composizioni emostatiche HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC e Cp HFFC), vale a dire chitosano con MC (Cm), chitosano con HPMC (Ch) e chitosano con PVA (Cp), sò stati applicati à Ct.Diversi studii di caratterizzazione in vitro è in vivo anu cunfirmatu l'attività hemostatica è di cicatrisazione di ferite di NFRCS.I materiali compositi offerti da NFRCS ponu esse aduprati per persunalizà diverse forme di scaffolding per risponde à i bisogni specifichi.
Inoltre, NFRCS pò esse mudificatu cum'è bandage o rotulu per copre tutta a zona di ferita di l'estremità inferiori è altre parti di u corpu.In particulare per i feriti di i membri di cumbattimentu, u disignu NFRCS cuncepitu pò esse cambiatu à mezzu bracciu o gamba piena (Figura supplementaria S11).U NFRCS pò esse fattu in un braccialettu cù cola di tissutu, chì pò esse usatu per piantà l'hemorragia da ferite severi di u polso suicida.U nostru scopu principale hè di sviluppà un NFRCS cù u minimu polimeru pussibule chì pò esse furnitu à una grande populazione (sottu à a linea di miseria) è chì pò esse piazzatu in un kit di primu aiutu.Semplice, efficiente è economicu in u disignu, NFRCS benefiziu e cumunità lucali è pò avè un impattu globale.
Chitosan (pesu moleculare 80 kDa) è amaranth sò stati acquistati da Merck, India.Hydroxypropyl methylcellulose 50 Cp, polyethylene glycol 400 è methylcellulose sò stati acquistati da Loba Chemie Pvt.LLC, Mumbai.Polyvinyl alcohol (pesu moleculare 125 kDa) (87-90% hydrolysed) hè statu acquistatu da National Chemicals, Gujarat.Polyvinylpyrrolidine K30 hè statu acquistatu da Molychem, Mumbai, tamponi sterili sò stati acquistati da Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, cù l'acqua Milli Q (sistema di purificazione d'acqua Direct-Q3, Merck, India) cum'è u trasportatore.
NFRCS hè statu sviluppatu cù un metudu di liofilizazione11,12.Tutte e cumpusizioni HFFC (Table 1) sò state preparate cù un agitatore meccanicu.Preparate una suluzione di 0,5% di chitosan cù l'acidu acìticu 1% in l'acqua da una agitazione continua à 800 rpm nantu à un agitatore meccanicu.U pesu esatta di u polimeru caricatu indicatu in a Tabella 1 hè aghjuntu à a suluzione di chitosan è agitatu finu à ottene una suluzione di polimeru chjaru.PVP K30 è PEG 400 sò stati aghjunti à a mistura resultanti in i quantità indicati in a Tabella 1, è l'agitazione hè stata cuntinuata finu à ottene una suluzione di polimeru viscosu chjaru.U bagnu risultatu di a suluzione polimerica hè stata sonicata per 60 minuti per caccià e bolle d'aria intrappulate da a mistura di polimeru.Cum'è mostra in a Figura Supplementaria S1 (b), Ct hè stata distribuita uniformemente in ogni pozzu di una piastra di 6 pozzi (muffa) supplementata cù 5 ml di HFFC.
A piastra di sei pozzi hè stata sonicata per 60 min per ottene una umidità uniforme è a distribuzione di HFFC in a reta Ct.Allora congelate a piastra di sei pozzi à -20 ° C per 8-12 ore.I piatti congelati sò stati liofilizzati per 48 ore per ottene diverse formulazioni di NFRCS.A listessa prucedura hè aduprata per pruduce diverse forme è strutture, cum'è tamponi o tamponi cilindrichi, o qualsiasi altra forma per diverse applicazioni.
Chitosan accuratamente pesatu (80 kDa) (3%) hè dissolutu in 1% àcitu acìticu cù un agitatore magneticu.À a suluzione resultanti di chitosan hè aghjuntu 1% PEG 400 è agitatu per 30 minuti.Pour a suluzione resultanti in un cuntinuu quadratu o rettangulare è congelate à -80 ° C durante 12 ore.I campioni congelati sò stati liofilizzati per 48 ore per ottene Cs13 poroso.
U NFRCS sviluppatu hè statu sottumessu à esperimenti cù spettroscopia infrared di trasformazione di Fourier (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokyo, Japan) per cunfirmà a cumpatibilità chimica di chitosan cù altri polimeri14,15.I spettri FTIR (larghezza di a gamma spettrale da 400 à 4000 cm-1) di tutti i campioni pruvati sò stati ottenuti da eseguendu 32 scans.
A rata di assorbimentu di sangue (BAR) per tutte e formulazioni hè stata evaluata cù u metudu descrittu da Chen et al.16 cù ligeri mudificazioni.I NFRK sviluppati di tutte e cumpusizioni sò stati secchi in un fornu à vacuum à 105 ° C durante a notte per sguassà u solvente residuale.30 mg NFRCS (pesu di mostra iniziale - W0) è 30 mg Ct (cuntrollu pusitivu) sò stati posti in platti separati chì cuntenenu un premix di 3.8% citrate di sodiu.À intervalli di tempu predeterminati, vale à dì 5, 10, 20, 30, 40 è 60 seconde, i NFRCS sò stati sguassati è e so superfici pulite di sangue micca assorbutu mettendu i campioni nantu à Ct per 30 seconde.U pesu finali di sangue assorbutu da NFRCS 16 hè statu cunsideratu (W1) à ogni puntu di tempu.Calcule u percentualità BAR cù a seguente formula:
U tempu di coagulazione di u sangue (BCT) hè statu determinatu cumu informatu da Wang et al.17 .U tempu necessariu per u sangue tutale (sangue di rat premixed with 3.8% sodium citrate) per coagulà in presenza di NFRCS hè statu calculatu cum'è u BCT di a mostra di prova.I varii cumpunenti NFRCS (30 mg) sò stati posti in vials tappi a vite da 10 ml è incubati à 37 ° C.U sangue (0,5 ml) hè aghjuntu à u vial è 0,3 ml di 0,2 M CaCl2 hè aghjuntu per attivà a coagulation di sangue.Infine, invierte u vial ogni 15 seconde (finu à 180 °) finu à chì si forma un coagulu fermu.U BCT di a mostra hè stimatu da u numeru di flips vails17,18.Basatu nantu à BCT, duie cumpusizioni ottimali da NFRCS Cm, Ch è Cp sò stati scelti per più studii di caratterizazioni.
U BCT di e cumpusizioni Ch NFRCS è Cp NFRCS hè stata determinata implementendu u metudu descrittu da Li et al.19 .Pone 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS, è Cs (cuntrolu pusitivu) in piastre Petri separati (37 ° C).U sangue chì cuntene 3,8% di citrate di sodiu hè stata mischju cù 0,2 M CaCl2 in un rapportu di volume 10: 1 per inizià u prucessu di coagulazione di sangue.20 µl di mistura di sangue di ratto 0,2 M CaCl2 sò stati applicati à a superficia di u campione è pusatu in una piastra di Petri viota.U cuntrollu era sangue versatu in piastri Petri vacanti senza Ct.À intervalli fissi di 0, 3, è 5 minuti, ferma a coagulazione aghjunghjendu 10 ml d'acqua deionizzata (DI) à a mostra chì cuntene u platu senza disturbà u coagulu.Eritrociti non coagulati (eritrociti) sò sottumessi à l'emolisi in presenza di acqua deionizzata è liberanu l'emoglobina.L'emoglobina in diversi punti temporali (HA(t)) hè stata misurata à 540 nm (λmax emoglobina) cù un spettrofotometru UV-Vis.L'assorbimentu assolutu di l'emoglobina (AH(0)) in 0 min di 20 µl di sangue in 10 ml d'acqua deionizzata hè stata presa cum'è standard di riferimentu.L'assunzione relativa di l'emoglobina (RHA) di u sangue coagulatu hè stata calculata da u rapportu HA(t) / HA (0) cù u stessu batch di sangue.
Utilizendu un analizzatore di texture (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA), e proprietà adesive di NFRK à u tissutu dannatu sò state determinate.Press un platu cilindrico à fondu apertu contru l'internu di a pelle di porcu (senza a capa di grassu).I campioni (Ch NFRCS è Cp NFRCS) sò stati appiicati via cannula in stampi cilindrichi per creà aderenza à a pelle di u porcu.Dopu una incubazione di 3 minuti à a temperatura di l'ambienti (RT) (25 ° C.), a forza di adesione NFRCS hè stata registrata à una freccia constante di 0,5 mm/sec.
A funzione principale di i sigillanti chirurgici hè di aumentà a coagulazione di sangue mentre riduce a perdita di sangue.A coagulazione senza perdita in NFRCS hè stata evaluata utilizendu un metudu publicatu prima cù ligeri mudificazioni 19.Fate un tubu di microcentrifuge (2 ml) (diamitru internu 10 mm) cù un pirtusu 8 × 5 mm2 in un latu di u tubu di centrifuga (rappresentendu una ferita aperta).NFRCS hè utilizatu per chjude l'apertura è a cinta hè aduprata per sigillà i bordi esterni.Aghjunghjite 20 µl di 0,2 M CaCl2 à u tubu di microcentrifugazione chì cuntene u premix di citrate di sodiu 3,8%.Dopu à 10 minuti, i tubi di microcentrifuge sò stati eliminati da i piatti è l'aumentu di a massa di i piatti hè stata determinata per u flussu di sangue da u NFRK (n = 3).Perdita di sangue Ch NFRCS è Cp NFRCS sò stati paragunati cù Cs.
L'integrità umida di NFRCS hè stata determinata basatu annantu à u metudu descrittu da Mishra è Chaudhary21 cù modifiche minori.Pone u NFRCS in un flask Erlenmeyer di 100 ml cù 50 ml d'acqua è gira per 60 s senza formate una cima.Ispezione visuale è priorità di i campioni per l'integrità fisica basatu nantu à a cullezzione.
A forza di ubligatoriu di HFFC à Ct hè stata studiata utilizendu metudi publicati prima cù mudificazioni minori.L'integrità di u revestimentu di a superficia hè stata valutata espunendu NFRK à onde acustiche (stimulu esternu) in presenza di acqua milliQ (Ct).L'NFRCS Ch NFRCS è Cp NFRCS sviluppati sò stati posti in un beaker pienu d'acqua è sonicati per 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 è 30 min, rispettivamente.Dopu à l'asciugatura, a diffarenza percentuale trà u pesu iniziale è finali di u NFRCS hè stata utilizata per calculà a perdita per centu di materiale (HFFC).In vitro BCT sustene ancu a forza di ligame o a perdita di materiali di superficia.L'efficienza di u ligame HFFC à Ct furnisce a coagulazione di sangue è un revestimentu elasticu nantu à a superficia di Ct22.
L'omogeneità di u NFRCS sviluppatu hè stata determinata da u BCT di campioni (30 mg) pigliati da i lochi generali selezziunati aleatoriamente di u NFRCS.Segui a prucedura BCT citata prima per determinà a conformità NFRCS.A vicinanza trà tutti i cinque campioni assicura una copertura uniforme di a superficia è a deposizione HFFC in a rete Ct.
L'area nominale di u cuntattu di u sangue (NBCA) hè stata determinata cum'è infurmatu prima cù alcune mudificazioni.Coagulate u sangue clamping 20 µl di sangue trà e duie superfici di Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS è Cs.Dopu à 1 ora, i dui parti di u stent sò stati separati è misurate manualmente l'area di u coagulu.U valore mediu di trè ripetizioni hè cunsideratu NBCA NFRCS19.
L'analisi Dynamic Vapor Sorption (DVS) hè stata aduprata per evaluà l'efficacità di NFRCS per assorbe l'acqua da l'ambiente esternu o da u situ di ferita rispunsevuli di inizià a coagulazione.Le DVS évalue ou enregistre l'absorption et la perte de vapeur dans un échantillon gravimétriquement à l'aide d'une balance ultra-sensible avec une résolution de masse de ± 0,1 µg.Una pressione di vapore parziale (umidità relativa) hè generata da un controller di flussu di massa elettronicu intornu à a mostra mischjendu gasi trasportatori saturi è secchi. Sicondu a guida di Farmacopea Europea, basatu annantu à u percentualità di assorbimentu di umidità da i campioni, i campioni sò stati categurizzati in categurie 4 (0-0.012% w / w - non-hygroscopic, 0.2-2% w / w ligeramente igroscopicu, 2-15% moderatu igroscopicu) è > 1.5% assai igroscopicu, è > 1.5%. Sicondu e linee guida di a Farmacopea Europea, basatu annantu à u percentualità di assorbimentu di umidità da i campioni, i campioni sò stati categurizzati in 4 categurie (0-0,012% w / w - non-hygroscopic, 0,2-2% w / w ligeramente igroscopicu, 2-15% moderatamente igroscopicu) è > 1,5% assai igroscopicu, è > 1,5%.In cunfurmità cù i cunsiglii di a Farmacopea Europea, secondu a percentuale di l'assorbimentu di l'umidità da i campioni, i campioni sò stati divisi in 4 categurie (0-0,012% w / w - non-hygroscopic, 0,2-2% w / w ligeramente igroscopicu, 2-15 %).% умеренно гигроскопичен и > 15% очень гигроскопичен)23. % moderatamente hygroscopic è > 15% assai hygroscopic)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0.012% w/0.012% w/0.012% w/0.012% w/0.012% w/2. /w 轻微吸湿性、2-15 % 适度吸湿，> 15% 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分为 分为 分 分为 分为 分 分 0（ 0.0（ 0.0（ 0.00，湿 性 、 、 、 、 0,2-2% W/w 轻微 、 2-15% 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。In cunfurmità cù i cunsiglii di a Farmacopea Europea, i campioni sò divisi in 4 classi secondu u percentualità di umidità assorbita da a mostra (0-0,012% in pesu - non-hygroscopic, 0,2-2% in pesu ligeramente hygroscopic, 2-15% in pesu).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % moderatamente igroscopica, > 15% assai igroscopica) 23.L'efficienza igroscòpica di NFCS X NFCS è TsN NFCS hè stata determinata nantu à un analizzatore DVS TA TGA Q5000 SA.Duranti stu prucessu, u tempu di corsa, l'umidità relativa (RH) è u pesu di mostra in tempu reale à 25 ° C24 sò stati ottenuti.U cuntenutu di umidità hè calculatu da l'analisi di massa NFRCS precisa utilizendu l'equazione seguente:
MC hè l'umidità NFRCS.m1 - pesu seccu di NSAIDs.m2 hè a massa NFRCS in tempu reale à una data RH.
L'area di a superficia tutale hè stata stimata utilizendu un esperimentu di adsorption di nitrogenu cù nitrogenu liquidu dopu avè svuotatu i campioni à 25 ° C per 10 h (< 7 × 10-3 Torr). L'area di a superficia tutale hè stata stimata utilizendu un esperimentu di adsorption di nitrogenu cù nitrogenu liquidu dopu avè svuotatu i campioni à 25 ° C per 10 h (< 7 × 10-3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адсорбции азоток по помощью ожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). A superficia tutale hè stata stimata utilizendu un esperimentu di adsorption di nitrogenu cù nitrogenu liquidu dopu chì i campioni sò stati sbulicati à 25 ° C per 10 h (< 7 × 10-3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 Torr）后，使用液氮的氮吸附实验估计总表靂总表靂在 25 ° C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов по адсорбтцик по адсорбцод пи бтцик с использованием ле опорожнения образцов в течение 10 часов при 25 ° C (< 7 × 10-3 торр). A superficia tutale hè stata stimata utilizendu esperimenti di adsorption di nitrogenu cù nitrogenu liquidu dopu chì i campioni sò stati sbulicati per 10 ore à 25 ° C (< 7 x 10-3 torr).A superficia tutale, u voluminu di i pori è a dimensione di i pori NFRCS sò stati determinati cù un Quantachrome da NOVA 1000e, Austria cù u software RS 232.
Preparate 5% RBCs (saline cum'è diluente) da u sangue sanu.Allora trasferisce una aliquota di HFFC (0,25 ml) à una piastra di 96 pozzi è 5% di massa RBC (0,1 ml).Incubate a mistura à 37 ° C durante 40 minuti.Una mistura di globuli rossi è serum hè stata cunsiderata cum'è un cuntrollu pusitivu, è una mistura di saline è globuli rossi cum'è un cuntrollu negativu.Hemagglutination hè stata determinata secondu a scala Stajitzky.I scali pruposti sò i seguenti: + + + + aggregati granulari densi;+ + + cuscinetti di fondu lisci cù bordi curvi;+ + cuscinetti di fondu lisci cù bordi strappati;+ anelli rossi stretti intornu à i bordi di i pads lisci;- (negativu) discretu buttone rossu 12 in u centru di u pozzu più bassu.
L'emocompatibilità di NFRCS hè stata studiata secondu u metudu di l'Organizazione Internaziunale di Standardizazione (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.U metudu gravimetricu descrittu da Singh et al.Modificazioni minori sò state fatte per evaluà a furmazione di trombi in presenza di o nantu à a superficia di NFRCS.500 mg di Cs, Ch NFRCS è Cp NFRCS sò stati incubati in soluzione salina tamponata fosfatatu (PBS) per 24 ore à 37 ° C.Dopu à 24 ore, PBS hè stata eliminata è NFRCS hè stata trattata cù 2 ml di sangue chì cuntene 3.8% citrate di sodium.À a superficia di u NFRCS, aghjunghje 0,04 ml di 0,1 M CaCl2 à i campioni incubati.Dopu à 45 minuti, 5 ml d'acqua distillata hè aghjuntu per impedisce a coagulazione.U sangue coagulatu nantu à a superficia di NFRK hè stata trattata cù una suluzione di formaldehyde 36-38%.I coaguli fissi cù formaldehyde sò stati siccati è pisati.U pircintuali di trombosi hè statu stimatu per calculà u pesu di u vetru senza sangue è mostra (cuntrollu negativu) è u vetru cù sangue (cuntrollu pusitivu).
Cum'è una cunferma iniziale, i campioni sò stati visualizati sottu un microscopiu otticu per capiscenu a capacità di u revestimentu di a superficia HFFC, Ct interconnected, è a rete Ct per furmà pori.Setti sottili di Ch è Cp da NFRCS sò stati tagliati cù una lama di scalpel.A rùbbrica resultanti hè stata posta nantu à un vetru di vetru, coperto cù una coperta, è i bordi sò stati fissi cù cola.I diapositivi preparati sò stati visti sottu un microscopiu otticu è e fotografie sò state pigliate à diversi ingrandimenti.
A deposizione di polimeru in e rete Ct hè stata visualizata cù a microscopia di fluoriscenza basatu nantu à u metudu descrittu da Rice et al.29. A cumpusizioni HFFC aduprata per a formulazione hè stata mischjata cù un colorante fluorescente (amaranth), è NFRCS (Ch & Cp) sò stati preparati secondu u metudu citatu prima. A cumpusizioni HFFC aduprata per a formulazione hè stata mischjata cù un colorante fluorescente (amaranth), è NFRCS (Ch & Cp) sò stati preparati secondu u metudu citatu prima.A cumpusizioni HFFC utilizata per a formulazione hè stata mischjata cù un colorante fluorescente (amaranth) è NFRCS (Ch è Cp) hè stata ottenuta secondu u metudu prima citatu.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的杢提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶到的斶龜Ch）将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的杢提到的斶光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的斶到的斶龜Ch）A cumpusizioni HFFC utilizata in a formulazione hè stata mischjata cù un tintu fluoriscente (Amaranth) è hà ricevutu NFRCS (Ch è Cp), cum'è l'esitatu prima.Seccioni sottili di NFRK sò stati tagliati da i campioni ottenuti, posti nantu à vetru di vetru, è cuparti cù coperti.Osservate i diapositivi preparati sottu un microscopiu fluorescente cù un filtru verde (310-380 nm).L'imaghjini sò stati pigliati à l'ingrandimentu 4x per capiscenu e relazioni Ct è a deposizione di polimeru eccessiva in a reta Ct.
A topografia di a superficia di NFRCS Ch è Cp hè stata determinata utilizendu un microscopiu di forza atomica (AFM) cun un cantilever TESP ultra-sharp in modalità tapping: 42 N / m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.A rugosità di a superficia hè stata determinata da a radica media quadrata (RMS) cù u software (Scanning Probe Image Processor).Diversi lochi NFRCS sò stati resi nantu à l'imaghjini 3D per verificà l'uniformità di a superficia.A deviazione standard di u puntuatu per una zona data hè definita cum'è a rugosità di a superficia.L'equazione RMS hè stata aduprata per quantificà a rugosità di a superficia di NFRCS31.
Studi basati in FESEM sò stati realizati cù FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokyo, per capiscenu a morfologia di a superficia di Ch NFRCS è Cp NFRCS, chì dimustrava megliu BCT cà Cm NFRCS.U studiu FESEM hè statu realizatu secondu u metudu descrittu da Zhao et al.32 cù mudificazioni minori.NFRCS 20 à 30 mg Ch NFRCS è Cp NFRCS sò stati premixati cù 20 µl di citratu di sodiu 3,8% premiscelatu cù sangue di ratto.20 μl di 0,2 M CaCl2 sò stati aghjuntu à i campioni trattati di sangue per inizià a coagulazione è i campioni sò stati incubati à a temperatura di l'ambienti per 10 minuti.Inoltre, l'eritrociti eccessivi sò stati eliminati da a superficia NFRCS rinsendu cù saline.
I campioni successivi sò stati trattati cù 0.1% glutaraldehyde è poi siccati in un fornu d'aria calda à 37 ° C per sguassà l'umidità.I campioni secchi sò stati rivestiti è analizati 32 .L'altri imaghjini ottenuti durante l'analisi eranu a furmazione di coaguli nantu à a superficia di fibre di cuttuni individuali, a deposizione di polimeru trà Ct, a morfologia di eritrociti (forma), l'integrità di u coagulu è a morfologia di eritrociti in presenza di NFRCS.I zoni NFRCS senza trattamentu è i zoni NFRCS trattati cù Ch è Cp incubati cù sangue sò stati scansati per ioni elementari (sodiu, potassiu, nitrogenu, calcium, magnesiu, zincu, ramu è seleniu)33.Comparare i percentuali di ioni elementari trà i campioni trattati è micca trattati per capisce l'accumulazione di ioni elementari durante a furmazione di coaguli è l'omogeneità di i coaguli.
U spessore di u revestimentu di a superficia Cp HFFC nantu à a superficia Ct hè stata determinata cù FESEM.I sezzioni trasversali di Cp NFRCS sò stati tagliati da u quadru è sputter coated.I campioni di revestimentu sputter resultanti sò stati osservati da FESEM è u grossu di u revestimentu di a superficia hè stata misurata 34, 35, 36.
U micro-CT di raghji X furnisce l'imaghjini non distruttivi 3D d'alta risoluzione è vi permette di studià l'arrangiamentu strutturale internu di NFRK.Micro-CT usa un fasciu di raghji X chì passa per u campione per registrà u coefficient d'attenuazione lineale lucale di i raghji X in a mostra, chì aiuta à ottene infurmazione morfologica.U locu internu di Ct in Cp NFRCS è Cp NFRCS trattatu di sangue hè stata esaminata da micro-CT per capisce l'efficienza di l'assorbimentu è a coagulazione di sangue in presenza di NFRCS37,38,39.E strutture 3D di campioni di Cp NFRCS trattati cù sangue è micca trattati sò stati ricostruiti cù micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Germania).Utilizendu a versione 2.2 di u software VG STUDIO-MAX, parechji imaghjini di raghji X sò stati pigliati da diverse anguli (idealmente una copertura di 360 °) per sviluppà imaghjini 3D per NFRCS.I dati di proiezione raccolti sò stati ricostruiti in immagini volumetriche 3D utilizendu u software 3D ScanIP Academic simplice currispondente.
Inoltre, per capiscenu a distribuzione di u coagulu, 20 µl di sangue citratu premixed è 20 µl di 0,2 M CaCl2 sò stati aghjuntu à u NFRCS per inizià a coagulazione di sangue.I campioni preparati sò lasciati à indurisce.A superficia NFRK hè stata trattata cù 0.5% glutaraldehyde è secca in un fornu d'aria calda à 30-40 ° C per 30 min.U coagulu di sangue furmatu nantu à u NFRCS hè statu scansatu, ricustruitu, è una maghjina 3D di u coagulu di sangue hè stata visualizata.
L'analisi antibacteriali sò stati realizati nantu à Cp NFRCS (megliu paragunatu à Ch NFRCS) utilizendu u metudu descrittu prima cù modifiche minori.L'attività antibacteriale di Cp NFRCS è Cp HFFC hè stata determinata cù trè microorganismi di teste differenti [S.aureus (batteri gram-positivi), E.coli (batteri gram-negativi) è Candida bianca (C.albicans)] chì cresce nantu à l'agar in i platti Petri in un incubatore.Inoculate uniformemente 50 ml di a sospensione di cultura bacteriana diluita à una cuncentrazione di 105-106 CFU ml-1 nantu à u mediu agar.Pour u mediu in una piastra di Petri è lasciate solidificà.I pozzi sò stati fatti nantu à a superficia di a piastra d'agar per riempie cù HFFC (3 pozzi per HFFC è 1 per u cuntrollu negativu).Aggiungere 200 µl di HFFC a 3 pozzetti e 200 µl di pH 7,4 PBS al quarto pozzetto.À l'altra parte di u petri, mette un discu 12 mm Cp NFRCS nantu à l'agar solidificatu è umidificate cù PBS (pH 7,4).Ciprofloxacina, ampicillina è comprimi fluconazole sò cunsiderate standard di riferimentu per Staphylococcus aureus, Escherichia coli è Candida albicans.Misura a zona di inibizione manualmente è pigliate una maghjina digitale di a zona di inibizione.
Dopu l'appruvazioni etiche istituzionali, u studiu hè statu realizatu à u Kasturba Medical College of Education and Research in Manipal, Karnataka, in u sudu di l'India.U protokollu sperimentale in vitro TEG hè statu rivedutu è appruvatu da u Cumitatu d'Etica Istituziunale di Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).I sughjetti sò stati recrutati da donatori di sangue vuluntarii (da 18 à 55 anni) da u bancu di sangue di l'uspidale.Inoltre, una forma di accunsentu infurmatu hè stata ottenuta da i vuluntarii per a cullizzioni di mostre di sangue.Native TEG (N-TEG) ​​​​hè stata aduprata per studià l'effettu di a formulazione Cp HFFC nantu à u sangue interu premixatu cù citrate di sodiu.N-TEG hè largamente ricunnisciutu per u so rolu in a risuscitazione di u puntu di cura, chì crea prublemi per i clinichi per u putenziale di ritardu clinicamente significativu in i risultati (testi di coagulazione di rutina).L'analisi N-TEG hè stata realizata cù u sangue sanu.Un accunsentu infurmatu è una storia medica dettagliata sò stati ottenuti da tutti i participanti.U studiu ùn hà micca inclusu i participanti cù cumplicazioni hemostatiche o trombotiche cum'è gravidenza / postpartum o malatia di fegatu.I sughjetti chì piglianu droghe chì affettanu a cascata di coagulazione sò ancu esclusi da u studiu.I testi di laboratoriu di basa (emoglobina, tempu di protrombina, tromboplastina attivata è conte di piastine) sò stati realizati nantu à tutti i participanti secondu e prucedure standard.N-TEG determina a viscoelasticità di u coagulu di sangue, a struttura iniziale di u coagulu, l'interazione di particelle, u rinfurzamentu di u coagulu è a lisi di u coagulu.L'analisi N-TEG furnisce dati grafichi è numerichi nantu à l'effetti cullettivi di parechji elementi cellulari è plasma.L'analisi N-TEG hè stata realizata nantu à dui volumi differenti di Cp HFFC (10 µl è 50 µl).In u risultatu, 1 ml di sangue sanu cù l'acidu citricu hè aghjuntu à 10 μl di Cp HFFC.Aggiungere 1 ml (Cp HFFC + sangue citrato), 340 µl di sangue misto a 20 µl di CaCl2 0,2 ​​M contenenti TEG.Dopu, i piatti TEG sò stati caricati in TEG® 5000, US per misurà R, K, angolo alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30% di campioni di sangue in presenza di Cp HFFC41.
U protocolu di studiu in vivo hè statu rivedutu è appruvatu da u Cumitatu Istituzionale di Etica Animale (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Tutti l'esperimenti di l'animali sò stati realizati in cunfurmità cù i cunsiglii di u Cumitatu per u Controlu è a Supervisione di l'Esperimentazione Animale (CPCSEA).Tutti i studii NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) sò stati realizati nantu à i ratti Wistar femminili (pesanu da 200 à 250 g).Tutti l'animali sò stati acclimatizzati à una temperatura di 24-26 ° C, l'animali avianu accessu liberu à l'alimentariu standard è l'acqua ad libitum.Tutti l'animali sò stati divisi aleatoriamente in diversi gruppi, ogni gruppu era custituitu da trè animali.Tutti i studii sò stati realizati in cunfurmità cù Animal Studies: Report of In Vivo Experiments 43 .Prima di u studiu, l'animali sò stati anesthetizzati da l'amministrazione intraperitoneale (ip) di una mistura di 20-50 mg di ketamina (per 1 kg di pisu corpu) è 2-10 mg di xylazine (per 1 kg di pisu corpu).Dopu à u studiu, u vulume di sanguinamentu hè statu calculatu per evaluà a diffarenza trà u pesu iniziale è finali di i campioni, u valore mediu ottenutu da e trè teste hè stata presa cum'è u voluminu di sanguinamentu di a mostra.
U mudellu di amputazione di a coda di ratu hè statu implementatu per capisce u putenziale di NFRCS per modulà u sanguinamentu in traumu, cummattimentu o accidenti di trafficu (mudellu di ferita).Tagliate u 50% di a cuda cù una lama di scalpel è mette in l'aria per 15 s per assicurà un sanguinamentu normale.Inoltre, i campioni di teste sò stati posti nantu à a cuda di un ratu appiendu pressione (Ct, Cs, Ch NFRCS è Cp NFRCS).L'emorragia è u PCT sò stati signalati per i campioni di teste (n ​​= 3) 17,45.
L'efficacezza di u cuntrollu di pressione NFRCS in cumbattimentu hè stata investigata nantu à un mudellu di l'arteria femoral superficial.L'arteria femorale hè esposta, perforata cù un trocaru 24G, è sanguinatu in 15 seconde.Dopu avè osservatu l'emorragia incontrollata, u specimenu di prova hè piazzatu in u situ di puntura cù pressione applicata.Immediatamente dopu l'applicazione di a mostra di prova, u tempu di coagulazione hè stata registrata è l'efficienza hemostatica hè stata osservata per i prossimi 5 minuti.A listessa prucedura hè stata ripetuta cù Cs è Ct46.
Dowling et al.47 hà prupostu un mudellu di ferita di fegato per valutà u putenziale hemostatic di i materiali hemostatic in u cuntestu di l'hemorragia intraoperatoria.BCT hè stata registrata per campioni Ct (cuntrollu negativu), framework Cs (cuntrollu pusitivu), campioni Ch NFRCS, è campioni Cp NFRCS.A vena cava suprahepatica di u ratu hè stata esposta da a realizazione di una laparotomia mediana.Dopu questu, a parte distale di u lòbulu manca hè stata tagliata cù forbici.Fate una incisione in u fegatu cù una lama di scalpel è lasciate sanguinà per uni pochi seconde.I campioni di teste Ch NFRCS è Cp NFRCS pesati accuratamente sò stati posti nantu à a superficia dannata senza pressione positiva è BCT hè stata registrata.U gruppu di cuntrollu (Ct) poi appiicà a pressione seguita da Cs 30 s47 senza rompe a ferita.
I saggi di guarigione di ferite in vivo sò stati realizati utilizendu un mudellu di ferita excisionale per valutà e proprietà di cicatrisazione di e ferite di i NFRCS basati in polimeri sviluppati.I mudelli di ferite escisionali sò stati scelti è eseguiti secondu i metudi publicati prima cù mudificazioni minori19,32,48.Tutti l'animali sò stati anestesiati cum'è descrittu prima.Aduprate un punch di biòpsia (12 mm) per fà una incisione prufonda circular in a pelle di u spinu.I siti di ferita preparati sò stati vestiti cù Cs (cuntrollu pusitivu), Ct (ricunnoscendu chì i pads di cuttuni interferiscenu cù a guariscenza), Ch NFRCS è Cp NFRCS (gruppu sperimentale) è un cuntrollu negativu senza trattamentu.Ogni ghjornu di u studiu, l'area di a ferita hè stata misurata in tutti i rati.Aduprate una camera digitale per piglià una foto di a zona di a ferita è mette un vestitu novu.U percentualità di chjusu di a ferita hè stata misurata da a seguente formula:
Basatu nantu à u percentualità di chjusu di ferita in u 12th ghjornu di l'studiu, a pelle di ratu di u megliu gruppu hè stata escisata ((Cp NFRCS) è u gruppu di cuntrollu) è studiata da a tintura H & E è a tintura trichrome di Masson. Basatu nantu à u percentualità di chjusu di ferita in u 12th ghjornu di l'studiu, a pelle di ratu di u megliu gruppu hè stata escisata ((Cp NFRCS) è u gruppu di cuntrollu) è studiata da a tintura H & E è a tintura trichrome di Masson.Basatu nantu à u percentualità di chjusu di ferita in u 12th ghjornu di u studiu, a pelle di i rati di u megliu gruppu ((Cp NFRCS) è u gruppu di cuntrollu) hè stata escisata è esaminata da a tintura cù hematoxilina-eosina è trichrome di Masson.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠的大鼠皌大鼠皌H&Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠的大鼠皌大鼠皌大鼠皌H眳组）I ratti in u megliu gruppu ((Cp NFRCS) è gruppi di cuntrollu) sò stati escisi per a tintura di hematoxilina-eosina è a tintura trichrome di Masson basatu annantu à u percentu di chjusu di ferita in u ghjornu 12 di u studiu.A prucedura di tintura implementata hè stata realizata secondu i metudi descritti prima49,50.In breve, dopu a fissazione in 10% formalin, i campioni sò stati disidratati cù una seria di alcoli classificati.Aduprate un microtomu per ottene sezioni sottili (5 µm grossu) di u tissutu escisatu.Setti serii sottili di cuntrolli è Cp NFRCS sò stati trattati cù hematoxilina è eosina per studià i cambiamenti istopatologichi.A macchia trichrome di Masson hè stata aduprata per detectà a furmazione di fibrille di collagene.I risultati ottenuti sò stati studiati cecu da i patologi.
A stabilità di i campioni di Cp NFRCS hè stata studiata à a temperatura di l'ambienti (25 ° C ± 2 ° C / 60% RH ± 5 %) per 12 mesi51.Cp NFRCS (decolorazione di a superficia è crescita microbica) hè stata inspeccionata visualmente è pruvata per a resistenza à l'usura di a piega è BCT secondu i metudi sopra descritti in a sezione Materiali è Metodi.
A scalabilità è a riproducibilità di Cp NFRCS hè stata esaminata preparendu Cp NFRCS cù una dimensione di 15 × 15 cm2.Inoltre, i campioni di 30 mg (n = 5) sò stati escisi da diverse frazioni Cp NFRCS è u BCT di i campioni studiati hè stata evaluata cum'è descritta prima in a sezione di Metodi.
Avemu pruvatu à sviluppà diverse forme è strutture cù cumpusizioni Cp NFRCS per diverse applicazioni biomediche.Tali forme o cunfigurazioni includenu tamponi cònichi per l'emorragie nasali, i prucessi dentali, è i tamponi cilindrichi per l'hemorragia vaginale.
Tutti i set di dati sò espressi cum'è media ± deviazione standard è sò stati analizati da ANOVA cù Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) seguitu da a prova di comparazioni multipli di Bonferroni (* p<0.05).
Tutte e prucedure realizate in i studii umani eranu in cunfurmità cù i normi di l'Istitutu è u Cunsigliu Naziunale di Ricerca, è ancu a Dichjarazione di Helsinki 1964 è e so mudificazioni successive, o norme etiche simili.Tutti i participanti sò stati infurmati nantu à e caratteristiche di u studiu è a so natura vuluntaria.I dati di i participanti restanu cunfidenziale una volta raccolti.U protokollu sperimentale in vitro TEG hè statu rivedutu è appruvatu da u Cumitatu d'Etica Istituziunale di Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).I vuluntarii anu firmatu un accunsentu infurmatu per raccoglie mostre di sangue.
Tutte e prucedure realizate in studii animali sò state realizate in cunfurmità cù a Facultà di Medicina di Kastuba, Istitutu Manipal di Educazione Superiore, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Tutti l'esperimenti animali cuncepiti sò stati realizati in cunfurmità cù e linee guida di u Cumitatu per u Controlu è a Supervisione di l'Esperimentazione Animale (CPCSEA).Tutti l'autori seguitanu e linee guida ARRIVE.
I spettri FTIR di tutti i NFRCS sò stati analizati è paragunati cù u spettru di chitosanu mostratu in a Figura 2A.Picchi spettrali caratteristici di chitosano (registrati) à 3437 cm-1 (OH è NH allungamentu, sovrapposizione), 2945 è 2897 cm-1 (CH stretching), 1660 cm-1 (deformazione NH2), 1589 cm-1 (N-H flessione), 1157 cm-1157 cm-1, (stretch secondaria C-1, C-10) yl), 993 cm-1 (stretch CO, Bo-OH) 52,53,54.A Tabella Supplementaria S1 mostra i valori di spettru di assorbimentu FTIR NFRCS per chitosan (reporter), chitosan puro, Cm, Ch, è Cp.I spettri FTIR di tutti i NFRCS (Cm, Ch è Cp) dimustranu i stessi bandi d'absorzione caratteristiche cum'è chitosan puru senza cambiamenti significativu (Fig. 2A).I risultati FTIR anu cunfirmatu l'absenza di interazzione chimica o fisica trà i polimeri utilizati per sviluppà u NFRCS, chì indicanu chì i polimeri utilizati sò inerti.
Caratterizzazione in vitro di Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS e Cs.(A) rapprisenta i spettri FTIR cumminati di e cumpusizioni di chitosan è Cm NFRCS, Ch NFRCS è Cp NFRCS sottu compressione.(B) a) Tasso di assunzione di sangue sanu di NFRCS Cm, Ch, Cp è Cg (n = 3);I campioni Ct dimustratu un BAR supiriuri perchè u cuttuni di cuttuni hà una efficienza di absorption più altu;b) Sangue dopu l'absorzione di sangue Illustrazione di a mostra assorbita.Rappresentazione grafica di u BCT di a prova C (Cp NFRCS hà avutu u megliu BCT (15 s, n = 3)). I dati in C, D, E è G sò stati mostrati cum'è media ± SD, è e barre d'errore rapprisentanu SD, *** p < 0,0001. I dati in C, D, E è G sò stati mostrati cum'è media ± SD, è e barre d'errore rapprisentanu SD, *** p < 0,0001. Данные в C, D, E и G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешноставлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки погрешностей прешностей прешностей прешностей преднее онение, ***p <0,0001. I dati in C, D, E è G sò presentati cum'è media ± deviazione standard, è e barre d'errore rapprisentanu a deviazione standard, *** p<0.0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0.0001。 Данные в C, D, E и G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрештносде погрештносде погрештносда е отклонение, ***p <0,0001. I dati in C, D, E è G sò indicati cum'è media ± deviazione standard, e barre d'errore rapprisentanu deviazione standard, ***p <0.0001.