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I particeddi di silice porosa sò stati preparati da un metudu sol-gel cù alcune mudificazioni per ottene particelle macroporose. Queste particelle sò derivate da polimerizazione di trasferimentu di catena di frammentazione (RAFT) cù N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) è styrene per preparà N-phenylmaleimide intercalation of polystyrene phase × Narrow stationary phase (10.80P). mm id) sò stati imballati da slurry packing.Evaluated PMP separazione di colonna di una mistura di peptide custituita da cinque peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) chromatographic performance di l'album di digestione ottimali, u HA ottimali di digestione di l'album di cromatografica è u ottimali di digestione di l'umanità di e cundizioni di sepsi. count oretical piastra di u mischiu peptide hè altu cum'è 280.000 plates / m².Comparing u funziunamentu di siparazione di a colonna sviluppata cù u cumerciu Ascentis Express RP-Amide culonna, hè statu osservatu chì u funziunamentu di siparazione di a colonna PMP era superiore à a colonna cummirciali in termini di efficienza siparazioni è risuluzzioni.
Nta l'ultimi anni, l'industria biofarmaceutica hè diventata un mercatu globale in espansione cù un aumentu sustanziale di a quota di mercatu. Cù a crescita splussiva di l'industria biofarmaceutica1,2,3, l'analisi di peptidi è proteine ​​​​hè assai desiderata. In più di u peptide di destinazione, parechje impurità sò generate durante a sintesi di peptide, cusì necessanu purificazione cromatografica di peptidi di u corpu di purità è analisi di purità di u corpu di peptidi desiderati. hè un compitu estremamente sfida per via di u gran numaru di spezie potenzialmente rilevabili in una sola mostra. Ancu se a spettrometria di massa hè un strumentu efficace per a sequenza di peptidi è di proteine ​​​​, se tali campioni sò iniettati in u spettrometru di massa in una sola passata, a separazione ùn serà micca ideale. 5,6.In più, durante a separazione di a fase liquida, l'analite pò esse focalizati in regioni strette, cuncentrandu cusì questi analiti è migliurà a sensibilità di deteczione di MS. A cromatografia liquida (LC) hà avanzatu significativamente in l'ultima dècada è hè diventata una tecnica populari in l'analisi proteomica7,8,9,10.
A cromatografia liquida in fase inversa (RP-LC) hè largamente usata per a purificazione è a separazione di miscele di peptidi utilizendu a silice modificata octadecyl (ODS) cum'è a fase stazionaria11,12,13. Tuttavia, e fasi stazionarie RP ùn furnisce micca una separazione soddisfacente di peptidi è proteine ​​​​per via di a so struttura cumplessa è di a natura anfifila di stazioni di stazioni di stazioni anfifili 14,15 necessarii sò stati studiati in modu speciale. e prutiìni cù partiti polari è non polari per interagisce cù e ritene questi analiti16. A cromatografia in modalità mista, chì furnisce interazzioni multimodali, pò esse una alternativa à RP-LC per a separazione di peptidi, proteini è altri mischi cumplessi. 21.Fase stazionarie in modalità mista (WAX / RPLC, HILIC / RPLC, intercalation polari / RPLC) sò adattati per separazioni di peptidi è di prutezione per via di a presenza di gruppi polari è non polari22,23,24,25,26,27,28 .Similarly, polar intercalation intercalation stazionariu è unicu polarità stazionaria di u gruppu di polarità stazionaria di stazionaria di u polar è unicu. r analiti, cum'è a separazione dipende da l'interazzione trà l'analite è a fase stazionaria.Interazzione multimodale 29, 30, 31, 32.Recently, Zhang et al.30 hà preparatu una fase stazionaria di poliamina terminata in dodecyl è separò cù successu idrocarburi, antidepressivi, flavonoidi, nucleosidi, estrogeni, è parechji altri analiti. L'intercalatore polare hà gruppi polari è non polari, per quessa pò esse usatu per separà peptidi è proteine ​​​​chì anu una colonna idrofobica, idrofobica, idrofobica e idrofobica. 8 culonni) sò dispunibuli cummirciali sottu u nomu cummerciale Ascentis Express RP-Amide columns, ma sti culonni sò usati per l'analisi di l'amina 33 solu.
In u studiu attuale, una fase stazionaria incrustata polare (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) hè stata preparata è valutata per a separazione di peptidi è digesti di tripsina di HSA. A fase stazionaria hè stata preparata cù a seguente strategia. Particelle di silice porosa sò state preparate secondu a prucedura data in a nostra publicazione precedente cù alcune mudificazioni à a preparazione di l'acidu di urea, polietilene, urea, polietilene, acqua. Hè stata adattata per preparà particelle di silice cù una grande dimensione di poru. In segundu, un novu ligand, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, hè statu sintetizatu è utilizatu per derivatize particles di silice per preparà una fase stazionaria incrustata polare. d in a colonna.Evaluate a separazione di colonna imballata di mischi di peptide cumpostu di cinque peptidi;(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) è Tripsin digest di l'albumina di sieru umanu (HAS). A mistura di peptide è a tripsina digest di HSA sò stati osservati per separà a colonna di separazione cù una bona risuluzione è efficienza. -Amide column.Both peptides è proteini sò stati osservati per esse risolta bè è efficaci nantu à a colonna PMP, chì era più efficaci di a colonna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilene glicole), urea, acido acetico, trimetossi ortosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albumina di siero umano (HSA), cloruro d'ammonio, urea, hexane metildisilazane (HMDS), metacriloil cloruro (MC-4-POH), (perossido di metacriloil cloruro (MC-4-POH), perossido di metacriloil (MC-4-POH) Grade Acetonitrile (ACN), Methanol, 2-Propanol, è Acetone Cumpratu da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Una mistura di urea (8 g), polietilenglicol (8 g) è 8 mL d'acidu acìticu 0,01 N hè stata agitata per 10 minuti, è dopu 24 mL di TMOS sò stati aghjunti in cundizioni di ghiaccio. ed à 70 ° C per 12 hours.The secca di massa molle hè stata liscia in un fornu è calcined à 550 ° C per 12 hours.Three batchs sò stati preparati è carattarizatu per esaminà a riproducibilità in a dimensione di particella, a dimensione di poru è a superficia.
Per a mudificazione di a superficia di particelle di silice cù un ligand pre-sintetizatu phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) seguita da a polimerizazione radiale cù stirene, un compostu chì cuntene un gruppu polare hè statu preparatu.Fase stazionaria per aggregati è catene di polistirene. U prucessu di preparazione hè descrittu quì sottu.
N-phenylmaleimide (200 mg) è methyl vinyl isocyanate (100 mg) sò stati dissolti in toluene seccu, è 0,1 mL di 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) sò stati aghjuntu à u fiasco di reazione per preparà phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate copolymered. mette in u fornu à 40 ° C per 3 ore.
Particelle di silice secca (2 g) sò state disperse in toluene seccu (100 mL), agitate è sonicate in un fiasco à fondu tondu da 500 mL per 10 minuti. 0 ° C per 3 ore. Allora, particelle di silice legata à PMCP (100 g) sò state dissolte in toluene (200 ml) è 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) hè stata aghjuntu in presenza di 100 µL di dilaurato di dibutilestanu cum'è catalizzatore. A mistura hè stata agitata à 50 ° C, filtrata per 8 ore à 5 ° C è 8 ° C.
Styrene (1 mL), perossidu di benzoil BPO (0,5 mL), è particelle di silice attaccate à TEMPO-PMCP (1,5 g) sò spargugliati in toluene è purgati cù nitrogenu. A polimerizazione di stirene hè stata realizata à 100 ° C per 12 ore. U pruduttu risultatu hè lavatu cù metanol 60 ° C in generale.
I campioni sò stati degassed à 393 K per 1 ora per ottene una pressione residuale di menu di 10-3 Torr. A quantità di N2 adsorbita à una pressione relativa di P / P0 = 0,99 hè stata aduprata per determinà u voluminu di poru tutale. A morfologia di particelle di silice nuda è ligand-bonded hè stata esaminata cù scanning electron microscopy, Tokyo, Japan. particelle di silice ligate) sò stati posti nantu à una colonna d'aluminiu cù nastro di carbonu adesivo. L'oru hè statu placcatu nantu à i campioni cù un sputter coater Q150T, è una capa di 5 nm Au hè stata dipositata nantu à i campioni. n (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 analizzatore di dimensione di particella hè stata utilizata per ottene a distribuzione di particella. Particelle di silice nuda è particelle di silice ligand-bonded (5 mg ognuna) sò state disperse in 5 mL di isopropanol, sonicated per 10 min, vortexed per 5 min, è pusatu nantu à u bancu otticu Master analisi per 5 minuti. gamme de températures de 30 à 800 °C.
Culonni narrow-bore d'acciaio inossidabile di vetru di dimensioni (100 × 1,8 mm id) sò stati imballati cù u metudu di imballaggio di slurry, applicà a listessa prucedura utilizata in Ref.31.Una colonna d'acciaio inossidabile (rivestita in vetru, 100 × 1,8 mm id) cù un raccordu di uscita chì cuntene una fritta di 1 µm hè stata cunnessa à un imballatore di slurry (Alltech Deerfield, IL, USA). u solvente propulsore.Fill a colonna sequentially appiicando pressioni di 100 MP per 10 minuti, 80 MP per 15 minuti, è 60 MP per 30 minuti.Durante l'imballaggio, a vibrazione meccanica hè stata appiicata cù dui agitatori di colonna GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) per assicurà l'imballaggio uniforme di a colonna. da l'unità di imballaggio di slurry è cunnette un altru raccordu à l'entrata è à u sistema LC per verificà a so prestazione.
Una pompa LC (10AD Shimadzu, Giappone), iniettore (Valco (USA) C14 W.05) cù loop d'iniezione 50nL, degassatore a membrana (Shimadzu DGU-14A), finestra capillare UV-VIS hè stata custruita Un rivelatore speciale di dispositivi µLC (UV-2075) è microcolumns rivestiti di vetru per minimizzà l'effettu di a cullizzioni di a cullizzioni extra. imballaggio, capillaries (50 μm id 365 è capillari di unione riduzzione (50 μm) sò stati installati à l'outlet 1/16 "di l'unione riduzzione. A cullizzioni di dati è u processu cromatograficu sò stati fatti cù u software Multichro 2000. U monitoraghju à 254 nm Analytes sò stati testati per l'absorbanza UV, Origine 8, chromatographic.
Albumina da siero umanu, polvere liofilizzata, ≥ 96% (elettroforesi di gel d'agarose) 3 mg mischjata cù tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL), è bicarbonate d'ammoniu 0,2 M (1 mL). A suluzione hè stata agitata per 10 minuti è mantenuta in un bagnu d'acqua à 6 37 ° C. % TFA.Filtre a suluzione è conserva sottu à 4 °C.
A separazione di mischi di peptide è di digestioni di tripsina HSA sò stati valutati separatamente nantu à colonne PMP. Verificate a separazione di a mistura di peptide è di digestione di tripsina di HSA da a colonna PMP è paragunate i risultati à a colonna Ascentis Express RP-Amide.
L'imaghjini SEM di particelle di silice nuda è particelle di silice ligandu à ligand sò mostrati in FIG.2 .SEM images di particeddi di silica nuda (A, B) mostra chì, in cuntrastu à i nostri studii pricidenti, sti particeddi sò sferica in u quali i particeddi sò allungati o hannu simetria irregulari. A superficia di i particeddi silica ligand-bonded (C, D) hè più liscia cà chiddu di i particeddi silica nuda, chì pò esse duvuta à u revestimentu di chains silicia superficia di particeddi.
Imaghjini di microscopiu elettronicu à scansione di particelle di silice nuda (A, B) è di particelle di silice liganduli (C, D).
I distribuzioni di particeddi di silice nuda è particelle di silice ligand-bonded sò mostrati in a Figura 3 (A). Curve di distribuzione di particella basata in u voluminu hà dimustratu chì a dimensione di e particelle di silice hà aumentatu dopu a mudificazione chimica (Fig. 3A). I ​​dati di distribuzione di particeddi di silice da u studiu attuale è u studiu precedente sò paragunati in a Tabella 1 (A.5, μm 3, μm). , paragunatu à u nostru studiu precedente cun valore ad (0,5) di 3,05 μm (particelle di silice ligati à polystyrene) 34. Stu batch hà avutu una distribuzione di particella più stretta cumparatu cù u nostru studiu precedente per via di e diverse proporzioni di PEG, urea, TMOS è àcitu acìticu in a mistura di reazzione. Studiatu in precedenza. Questu significa chì a funziunalità di a superficia di particeddi di silice cù styrene hà dipositu solu una strata di polistirene (0,97 µm) nantu à a superficia di silice, mentre chì in a fase PMP u spessore di a capa era di 1,38 µm.
Distribuzione granulometrica (A) è distribuzione granulometria (B) di particelle di silice nuda è particelle di silice ligandu à ligand.
A dimensione di i pori, u voluminu di i pori è a superficia di e particelle di silice di u studiu attuale sò datu in a Tabella 1 (B). I profili PSD di particelle di silice nuda è particelle di silice ligandu sò mostrati in Figura 3 (B). I risultati sò paragunabili à u nostru studiu precedente. cum'è mostra in a Tabella 1 (B), è u cambiamentu di a curva hè mostratu in Fig. 3 (B) .Similarly, u voluminu di poru di e particelle di silice diminuite da 0,67 à 0,58 cm3 / g dopu a mudificazione chimica. A superficia specifica di i particeddi di silice attualmente studiatu hè 116 m2 / g, chì hè paragunabili à a nostra superficia precedente (124 B m2 / g) di studiu (124 B m2). /g) di e particelle di silice anu ancu diminuitu da 116 m2 / g à 105 m2 / g dopu a mudificazione chimica.
I risultati di l'analisi elementale di a fase stazionaria sò mostrati in a Tabella 2. A carica di carbone di a fase stazionaria attuale hè di 6,35%, chì hè più bassu di a carica di carbone di u nostru studiu precedente (particelle di silice bonded polystyrène, 7,93% 35 è 10,21%, rispettivamente) 42. A carica di carbone di a fase stazionaria currente hè in più di a preparazione di u currenti SP, in a preparazione di ligami in pocu tempu. nds cum'è phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) è 4-hydroxy-TEMPO sò stati usati. U percentu di pisu di nitrogenu di a fase stazionaria attuale hè 2,21%, cumparatu à 0,1735 è 0,85% in pesu di nitrogenu in studi precedenti, rispettivamente. 4) è (5) eranu 2.7% è 2.9%, rispettivamente, mentre chì a carica di carbone di u pruduttu finali (6) era 6.35%, cum'è mostra in a Tabella 2. A perdita di pisu hè stata verificata cù a fase stazionaria PMP, è a curva TGA hè mostrata in a Figura 4. A curva TGA mostra una perdita di pisu di 8.6%, chì hè ancu un bonu accordu di carbone, chì ùn hè micca solu cuntenuta di carbone (6. , O è H.
U ligandu di fenilmaleimide-metilvinilisocianatu hè statu sceltu per a mudificazione di a superficia di particelle di silice perchè hà gruppi di fenilmaleimide polari è gruppi di vinilisocyanate. A parte di imide ùn hà micca carica virtuale à u pH normale. A polarità di a fase stazionaria pò esse cuntrullata da a quantità ottima di stirene è u tempu di reazione di a polimerizazione radicali liberi. L'ultimu passu di a reazione (polimerizazione radicali liberi) hè criticu è pò cambià a polarità di a fase stazionaria. I SP preparati cù diverse concentrazioni di stirene anu cariche di carbone diverse. In novu, caricate queste fasi stazionarie in colonne d'acciaio inox è verificate a so prestazione cromatografica (selettività, risoluzione, valore N, etc.). Basatu nantu à sti esperimenti, una formulazione ottimisata hè stata scelta per preparà a fase stazionaria PMP per assicurà una bona retenzioni polarità anali cuntrullata.
Cinque mischi di peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) sò stati valutati ancu cù una colonna PMP cù una fase mobile;60/40 (v/v) acetonitrile/acqua (0,1% TFA) à un flussu di 80 μL/min. In cundizioni d'eluzione ottimali, u numeru teoricu di piastra (N) per colonna (100 × 1,8 mm id) hè 20.000 ± 100 (200.000 000 (200.000 μL/min). grammi sò mostrati in Figura 5A.Fast analisi nantu à una colonna PMP à altu flussu (700 μL / min), cinque peptides sò stati eluted in un minutu, valori N eranu assai boni, 13.500 ± 330 per colonna (100 × 1.8 mm id), Corrisponde à 135.000 platti 135.000 000000000000 identificate (colonna 135.000 0000 m identica). .8 mm id) sò stati imballati cù trè lotti diffirenti di fase stazionaria PMP per verificà a riproducibilità. A cuncentrazione di l'analite per ogni colonna hè stata registrata utilizendu e cundizioni d'eluzione ottimali è u numeru di platti teorichi N è u tempu di ritenzione per separà a stessa mistura di prova in ogni colonna.
Separazione di a mistura di peptide nantu à a colonna PMP (B) è a colonna Ascentis Express RP-Amide (A);fase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimensioni di colonna PMP (100 × 1.8 mm id);analitica L'ordine di l'eluzione di i composti: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) è 5 (leucine) acid enkephalin)).
Una colonna PMP (100 × 1.8 mm id) hè stata evaluata per a separazione di digeriti triptichi di l'albumina di serum umanu in cromatografia liquida d'alta prestazione. U cromatogramma in a Figura 6 mostra chì a mostra hè ben separata è a risuluzione hè assai bona. I digeriti HSA sò stati analizati cù un flussu di 100 µL/min, fase mobile ace 70.1.30. chromatogram (Figura 6), a digestione HSA hè stata divisa in 17 picchi chì currispondenu à 17 peptides. L'efficienza di separazione di ogni piccu in a digestione HSA hè stata calculata è i valori sò dati in Table 5.
Una digestione triptica di HSA (100 × 1.8 mm id) hè stata separata nantu à una colonna PMP;débit (100 µL/min), phase mobile 60/40 acétonitrile/eau avec 0,1 % TFA.
induve L hè a lunghezza di a colonna, η hè a viscosità di a fase mobile, ΔP hè a pressione di retrocede di a colonna, è u hè a velocità lineale di a fase mobile. A permeabilità di a colonna PMP era 2,5 × 10-14 m2, u flussu era 25 μL / min, è 60/40 v / v ACN / v 60/40 v / v ACN / acqua hè stata utilizata. u nostru studiu precedente Ref.34.A permeabilità di a colonna imballata cù particeddi superficialmente porosi hè: 1,7 × 10-15 per particeddi 1,3 μm, 3,1 × 10-15 per particelle 1,7 μm, 5,2 × 10-15 è 2,5 × 10-14 μm per particeddi 2,5 × 10-14 μm2. a permeabilità di a fase PMP hè simile à quella di particelle core-shell di 5 μm.
induve Wx hè u pesu di a colonna imballata cù chloroform, Wy hè u pesu di a colonna imballata cù metanol, è ρ hè a densità di u solvent.Densità di metanol (ρ = 0.7866) è cloroformu (ρ = 1.484). A porosità tutale di PARTICULA DI SILICA-C18018 colonna × 104 mm. 31 chì avemu studiatu prima eranu 0,63 è 0,55, rispettivamente. Questu significa chì a prisenza di ligands d'urea reduce a permeabilità di a fase stazionaria. Per d 'altra banda, a porosità tutale di a colonna PMP (100 × 1,8 mm id) hè 0,60. A permeabilità di PMP colons-bonded C1 stazionari hè più bassu di stazioni C1 di columns-bonded in C1 stazionari. fasi i ligands C18 sò attaccati à i particeddi di silice cum'è catene lineari, mentri in polystyrene-tipu stazioni fasi, u A strata di polimeru relativamente grossa hè furmata intornu à it.In un spirimintu tipicu, a porosità culonna hè calculata cum'è:
A Figura 7A,B mostra a colonna PMP (100 × 1.8 mm id) è a colonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) utilizendu e stesse cundizioni d'eluzione (ie, 60/40 ACN/H2O è 0.1% TFA).) di a trama di van Deemter.I miscele di peptidi selezionati (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) sò state preparate in 20 µL/ Il flusso minimo per entrambe le colonne è di 800 µL/min. A colonna Express RP-Amide era 2.6 µm è 3.9 µm, rispettivamente. I valori HETP indicanu chì l'efficienza di separazione di a colonna PMP (100 × 1.8 mm id) hè assai megliu cà a colonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id). studiu.L'efficienza di separazione più altu di a colonna PMP (100 × 1,8 mm id) paragunatu à a colonna Ascentis Express RP-Amide hè basatu annantu à i migliuramentu in a forma di particella, a dimensione, è e prucedure di imballaggio di colonna cumplessu utilizati in u travagliu attuale34.
(A) trama di van Deemter (HETP versus velocità lineale di fase mobile) ottenuta utilizendu una colonna PMP (100 × 1,8 mm id) in 60/40 ACN/H2O cù 0,1% TFA. cù 0,1% TFA.
Una fase stazionaria di polistirene incrustatu polare hè stata preparata è valutata per a separazione di miscele di peptidi sintetici è digestioni di tripsina di albumina di siero umanu (HAS) in cromatografia liquida d'alta prestazione. A prestazione cromatografica di colonne PMP per miscele di peptidi hè eccellente in efficienza di separazione è risoluzione. , Sintesi cuntrullata di a fase stazionaria, è l'imballaggio di colonna cumplessu. In più di l'alta efficienza di separazione, a bassa pressione di back-colonna à un altu flussu hè un altru vantaghju di sta fase stazionaria. I culonni PMP mostranu una bona riproducibilità è ponu esse aduprati per l'analisi di miscele di peptidi è di digestioni di tripsina di diverse proteini. serà ancu evaluatu per a separazione di proteine ​​​​è anticorpi monoclonali.
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