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E particelle di silice porosa sò state preparate cù u metudu sol-gel cù alcune mudificazioni per ottene particelle à pori larghi. Queste particelle sò state derivatizate cù isocianatu di N-fenilmaleimide-metilvinile (PMI) è stirene via polimerizazione di frammentazione di trasferimentu di catena inversa (RAFT) per pruduce poliammidi intercalari di N-fenilmaleimide. Fase stazionaria di stirene (PMP). E colonne d'acciaio inox à calibru strettu (diametru internu 100 × 1,8 mm) sò state imballate cù un impaccamentu di fanghi. A prestazione cromatografica di a colonna PMP hè stata valutata per separà una mistura di peptidi sintetici custituita da cinque peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminoacidu encefalina) è idrolizzatu tripticu di albumina di serum umanu (HAS). In cundizioni di eluzione ottimali, u numeru teoricu di piastre cù una mistura di peptidi hà righjuntu 280.000 piastre/m². Cumparandu a prestazione di separazione di a colonna sviluppata cù a colonna cummerciale Ascentis Express RP-Amide, hè statu osservatu chì l'efficienza di separazione di a colonna PMP era superiore à a colonna cummerciale in termini di efficienza di separazione è risoluzione.
L'industria biofarmaceutica hè diventata un mercatu mundiale in espansione cù un aumentu significativu di a quota di mercatu in l'ultimi anni. Cù a crescita esplusiva di l'industria biofarmaceutica1,2,3 ci hè un grande bisognu di analisi di peptidi è proteine. In più di u peptide bersagliu, diverse impurità si formanu durante a sintesi di peptidi, dunque a purificazione cromatografica hè necessaria per ottene a purità desiderata di u peptide. L'analisi è a caratterizazione di e proteine ​​in i fluidi corporei, i tessuti è e cellule hè un compitu estremamente difficiule per via di u gran numeru di spezie potenzialmente rilevabili presenti in un unicu campione. Ancu se a spettrometria di massa hè un strumentu efficace per u sequenziamentu di peptidi è proteine, se tali campioni sò introdutti direttamente in u spettrometru di massa, a separazione serà insoddisfacente. Stu prublema pò esse risoltu eseguendu a cromatografia liquida (LC) prima di l'analisi MS, chì riducerà a quantità di analiti chì entranu in u spettrometru di massa in un mumentu datu4,5,6. Inoltre, l'analiti ponu cuncentrassi in una regione stretta durante a separazione di fase liquida, cuncentrandu cusì questi analiti è aumentendu a sensibilità di a rilevazione MS. A cromatografia liquida (LC) hà fattu progressi significativi in ​​l'ultima dicada è hè diventata un metudu largamente utilizatu per l'analisi proteomica7,8,9,10.
A cromatografia liquida in fase inversa (RP-LC) hè largamente aduprata per purificà è separà miscele di peptidi aduprendu silice mudificata cù ottadecil (ODS) cum'è fase stazionaria11,12,13. Tuttavia, per via di a so struttura cumplessa è di a so natura anfotera,14,15 e fasi stazionarie RP ùn ponu micca furnisce una separazione soddisfacente di peptidi è proteine. Dunque, l'analisi di peptidi è proteine ​​cù frammenti polari è non polari richiede fasi stazionarie appositamente cuncepite per interagisce è mantene questi analiti16. A cromatografia mista, chì offre interazioni multimodali, pò esse una alternativa à RP-LC per separà peptidi, proteine ​​è altre miscele cumplesse. Parechje fasi stazionarie di tipu mistu sò state preparate è e colonne piene di queste fasi stazionarie sò state aduprate per separà peptidi è proteine17,18,19,20,21. A causa di a presenza di gruppi polari è non polari, e fasi stazionarie in modu mistu (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalazione polare/RPLC) sò adatte per a separazione di peptidi è proteine22,23,24,25,26,27,28. , e fasi stazionarie intercalate polari cù gruppi polari legati covalentemente mostranu bone capacità di separazione è selettività unica per analiti polari è non polari perchè a separazione dipende da l'interazione trà l'analita è a fase stazionaria Interazioni multimodali 29,30,31,32. Recentemente, Zhang et al. 30 anu ottenutu fasi stazionarie terminate da behenil di poliammine è anu separatu cù successu idrocarburi, antidepressivi, flavonoidi, nucleosidi, estrogeni è alcuni altri analiti. U materiale stazionariu incrustatu polare hà gruppi sia polari sia non polari, dunque pò esse adupratu per separà peptidi è proteine ​​in parti idrofobiche è idrofile. E colonne polari in linea (per esempiu, e colonne C18 cù amide in linea) sò dispunibili sottu u nome cummerciale di colonne Ascentis Express RP-Amide, ma queste colonne sò state aduprate solu per l'analisi di l'amina 33.
In u studiu attuale, una fase stazionaria d'inclusione polare (N-fenilmaleimide, polistirene d'inclusione) hè stata preparata è valutata per a separazione di peptidi è a scissione di HSA triptica. A strategia seguente hè stata aduprata per preparà a fase stazionaria. E particelle di silice porosa sò state preparate secondu e procedure descritte in e nostre publicazioni precedenti, cù alcuni cambiamenti in i schemi di preparazione 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. I rapporti di urea, polietilenglicole (PEG), TMOS è acidu acquoso-aceticu sò stati aghjustati per ottene particelle di silice cù pori di grandi dimensioni. In segundu locu, un novu ligante fenilmaleimide-metilvinil isocianato hè statu sintetizatu è e so particelle di silice derivatizzate sò state aduprate per preparà fasi stazionarie polari incluse. A fase stazionaria ottenuta hè stata imballata in una colonna d'acciaio inox (diametru internu 100 × 1,8 mm) secondu un schema d'imballaggio ottimizzatu. L'imballaggio di a colonna hè aiutatu da vibrazioni meccaniche per assicurà un stratu uniforme in a colonna. A colonna impaccata hè stata valutata per a separazione di una mistura di peptidi cumposta da cinque peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptide leucina-encefalina) è idrolizzati triptici di albumina di serum umanu (HSA). Hè statu osservatu chì a mistura di peptidi è u digestu tripticu HSA si sò separati cù una bona risoluzione è efficienza. L'efficienza di separazione di a colonna PMP hè stata paragunata à quella di a colonna Ascentis Express RP-Amide. Hè statu osservatu chì i peptidi è e proteine ​​anu una bona risoluzione è una alta efficienza di separazione nantu à a colonna PMP, è l'efficienza di separazione di a colonna PMP hè più alta di quella di a colonna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicole), urea, acidu aceticu, trimetossiortosilicatu (TMOS), trimetilclorosilanu (TMCS), tripsina, albumina di serum umanu (HSA), cloruru d'ammoniu, urea, esametilmetacriloildisilazanu (HMDS), cloruru di metacriloile (MC), stirene, 4-idrossi-TEMPO, perossidu di benzoile (BPO), acetonitrile (ACN) per HPLC, metanolu, 2-propanolu è acetone. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Una mistura d'urea (8 g), polietilenglicole (8 g) è 8 ml d'acidu aceticu 0,01 N hè stata agitata per 10 minuti, è 24 ml di TMOS sò stati aghjunti sottu raffreddamentu cù ghiaccio. A mistura di reazione hè stata riscaldata à 40 °C per 6 ore è dopu à 120 °C per 8 ore in un'autoclave d'acciaio inox. L'acqua hè stata decantata è u residuu hè statu asciugatu à 70 °C per 12 ore. I blocchi morbidi secchi sò stati macinati lisciamente è calcinati in un fornu à 550 °C per 12 ore. Trè lotti sò stati preparati è caratterizati per testà a riproducibilità di e dimensioni di e particelle, a dimensione di i pori è a superficia.
Gruppu polare è fase stazionaria per e catene di polistirene. A prucedura di preparazione hè descritta quì sottu.
N-fenilmaleimide (200 mg) è isocianatu di metilvinil (100 mg) sò stati dissolti in toluene anidru, è dopu 0,1 ml di 2,2'-azoisobutironitrile (AIBN) hè statu aghjuntu à u matrazzu di reazione per ottene un copolimeru di fenilmaleimide è isocianatu di metilvinil (PMCP). A mistura hè stata riscaldata à 60 °C per 3 ore, filtrata è asciugata in un fornu à 40 °C per 3 ore.
E particelle di silice secche (2 g) sò state disperse in toluene seccu (100 ml), agitate è sonicate per 10 minuti in un matracciu à fondu tondu di 500 ml. PMCP (10 mg) hè statu dissoltu in toluene è aghjuntu goccia à goccia à u matracciu di reazione per mezu di un imbutu d'addizione. A mistura hè stata rifluita à 100 °C per 8 ore, filtrata, lavata cù acetone è asciugata à 60 °C per 3 ore. Dopu, e particelle di silice assuciate à PMCP (100 g) sò state dissolte in toluene (200 ml), è 4-idrossi-TEMPO (2 ml) hè statu aghjuntu in presenza di 100 μl di dilaurato di dibutilstagnu cum'è catalizatore. A mistura hè stata agitata à 50 °C per 8 ore, filtrata è asciugata à 50 °C per 3 ore.
U stirene (1 ml), u perossidu di benzoile BPO (0,5 ml) è e particelle di silice attaccate à TEMPO-PMCP (1,5 g) sò state disperse in toluene è purgate cù azotu. A polimerizazione di u stirene hè stata realizata à 100 °C per 12 ore. U pruduttu risultante hè statu lavatu cù metanolu è asciuttu per una notte à 60 °C. U schema generale di a reazione hè mostratu in a figura unu.
I campioni sò stati degassati à 393 K per 1 ora finu à ottene una pressione residuale inferiore à 10–3 Torr. A quantità di N2 adsorbita à a pressione relativa P/P0 = 0,99 hè stata aduprata per determinà u vulume tutale di i pori. A morfologia di e particelle di silice pura è ligata à ligandi hè stata esaminata cù un microscopiu elettronicu à scansione (Hitachi High Technologies, Tokyo, Giappone). Campioni secchi (silice pura è particelle di silice ligata à ligandi) sò stati posti nantu à barre d'aluminiu cù un nastru di carbone. L'oru hè statu depositatu nantu à u campione cù un dispositivu di sputtering Q150T, è un stratu d'Au di 5 nm di spessore hè statu depositatu nantu à u campione. Questu migliora l'efficienza di u prucessu à bassa tensione è furnisce una spruzzatura fredda fina. L'analisi elementale hè stata effettuata cù un analizzatore di cumposizione elementale Flash EA1112 Thermo Electron (Waltham, MA, USA). Un analizzatore di dimensione di e particelle Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 hè statu adupratu per ottene a distribuzione di a dimensione di e particelle. E particelle di silice senza rivestimentu è e particelle di silice ligate à ligandi (5 mg ciascuna) sò state disperse in 5 ml di isopropanolu, sonicate per 10 minuti, agitate per 5 minuti è piazzate nantu à un bancu otticu Mastersizer. L'analisi termogravimetrica hè realizata à una velocità di 5 °C per minutu in l'intervallu di temperatura da 30 à 800 °C.
Culonne d'acciaio inox à pastigliu strettu rivestite di fibra di vetru cù dimensioni (ID 100 × 1,8 mm) sò state imballate per mezu di u metudu di riempimentu di fanghi seguendu a stessa prucedura cum'è in a riferenza 31. A colonna d'acciaio inox (rivestita di vetru, ID 100 × 1,8 mm) è una uscita chì cuntene una fritta di 1 µm hè stata cunnessa à una macchina per imballà fanghi (Alltech Deerfield, IL, USA). Preparate una sospensione di a fase stazionaria suspendendu 150 mg di a fase stazionaria in 1,2 ml di metanolu è alimentendula in una colonna di riserva. U metanolu hè statu utilizatu cum'è solvente per fanghi è solvente di cuntrollu. Imballate a colonna applicendu una sequenza di pressione di 100 MP per 10 min, 80 MP per 15 min è 60 MP per 30 min. U prucessu di imballaggio hà utilizatu dui vibratori di colonna di cromatografia in fase gassosa (Alltech, Deerfield, IL, USA) per a vibrazione meccanica per assicurà un imballaggio uniforme di a colonna. Chiudete l'imballatore di fanghi è rilasciate a pressione lentamente per impedisce danni à a stringa. A colonna hè stata scollegata da l'ugellu di a poltiglia è un altru raccordu hè statu attaccatu à l'entrata è cunnessu à u sistema LC per pruvà u so funziunamentu.
Un MLC persunalizatu hè statu custruitu cù una pompa LC (10AD Shimadzu, Giappone), un campionatore cù un ciclu d'iniezione di 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), un degassatore di membrana (Shimadzu DGU-14A) è una finestra capillare UV-VIS. Dispositivu rivelatore (UV-2075) è microcolonna smaltata. Aduprate tubi di cunnessione assai stretti è corti per minimizà l'effettu di l'espansione supplementaria di a colonna. Dopu avè riempitu a colonna, installate un capillare (50 µm id 365) à l'uscita di a giunzione riducente di 1/16″ è installate un capillare (50 µm) di a giunzione riducente. A raccolta di dati è l'elaborazione di u cromatogramma sò realizate cù u software Multichro 2000. À 254 nm, l'assorbanza UV di l'analiti di i sughjetti hè stata monitorata à 0. I dati cromatografichi sò stati analizati cù OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina di serum umanu, polvere liofilizzata, ≥ 96% (elettroforesi in gel d'agarosio) 3 mg mischiati cù tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 ml) è bicarbonatu d'ammoniu 0,2 M (1 ml). A suluzione hè stata agitata per 10 minuti è mantenuta in un bagnu d'acqua à 37 °C per 6 ore, poi raffreddata cù 1 ml di TFA 0,1%. Filtrate a suluzione è cunservate sottu à 4 °C.
A separazione di una mistura di peptidi è HSA digerita da una colonna PMP hè stata valutata separatamente. Verificate l'idrolisi triptica di una mistura di peptidi è HSA separati da una colonna PMP è paragunate i risultati cù una colonna Ascentis Express RP-Amide. U numeru di piastre teoriche hè calculatu cù a seguente equazione:
L'imagine SEM di particelle di silice pura è particelle di silice ligate à u ligante sò mostrate in a Figura 2. L'imagine SEM di particelle di silice pura (A, B) mostranu una forma sferica in a quale e particelle sò allungate o anu una simmetria irregulare paragunata à i nostri studii precedenti. A superficia di e particelle di silice ligate da u ligante (C, D) hè più liscia chè quella di e particelle di silice pura, ciò chì pò esse duvutu à e catene di polistirene chì ricoprenu a superficia di e particelle di silice.
Micrografie elettroniche à scansione di particelle di silice pura (A, B) è particelle di silice legate a ligante (C, D).
A distribuzione di a dimensione di e particelle di e particelle di silice pura è di e particelle di silice ligate à ligandi hè mostrata in a Fig. 2. 3(A). E curve di distribuzione di a dimensione volumetrica di e particelle anu dimustratu chì a dimensione di e particelle di silice hè aumentata dopu a mudificazione chimica (Fig. 3A). I ​​dati di distribuzione di a dimensione di e particelle di silice di u studiu attuale è di u studiu precedente sò paragunati in a Tavula 1(A). A dimensione volumetrica di e particelle d(0,5) di PMP era di 3,36 µm, paragunata à u valore ad(0,5) di 3,05 µm in u nostru studiu precedente (particelle di silice ligate à u polistirene)34. A causa di u cambiamentu in u rapportu di PEG, urea, TMOS è acidu aceticu in a mistura di reazione, a distribuzione di a dimensione di e particelle di questu batch era più stretta paragunata à u nostru studiu precedente. A dimensione di e particelle di a fase PMP hè ligeramente più grande di quella di a fase di particelle di silice ligata à u polistirene chì avemu studiatu prima. Ciò significa chì a funziunalizazione superficiale di e particelle di silice cù u stirene hà depositatu solu un stratu di polistirene (0,97 µm) nantu à a superficia di silice, mentre chì in a fase PMP u spessore di u stratu era di 1,38 µm.
Distribuzione di a dimensione di e particelle (A) è distribuzione di a dimensione di i pori (B) di e particelle di silice pura è di e particelle di silice ligate à i ligante.
A dimensione di i pori, u vulume di i pori è a superficia di e particelle di silice aduprate in questu studiu sò mostrati in a Tavula 1 (B). I profili PSD di e particelle di silice pura è di e particelle di silice ligate à ligandi sò mostrati in e Fig. 3 (B). I risultati eranu paragunabili à u nostru studiu precedente34. E dimensioni di i pori di e particelle di silice pura è ligate à ligandi eranu 310 Å è 241 Å, rispettivamente, ciò chì indica chì dopu a mudificazione chimica, a dimensione di i pori hè diminuita di 69 Å, cum'è mostratu in a Tavula 1 (B), è a curva di spostamentu hè mostrata in a Fig. A superficia specifica di e particelle di silice in u studiu attuale hè 116 m2 / g, chì hè paragunabile à u nostru studiu precedente (124 m2 / g). Cum'è mostratu in a Tavula 1 (B), a superficia (m2 / g) di e particelle di silice dopu a mudificazione chimica hè ancu diminuita da 116 m2 / g à 105 m2 / g.
I risultati di l'analisi elementale di a fase stazionaria sò presentati in a Tavula 2. U cuntenutu di carbone di a fase stazionaria attuale hè 6,35%, chì hè più bassu chè in u nostru studiu precedente (particelle di silice assuciate à u polistirene, 7,93%35 è 10,21%, rispettivamente) 42. U cuntenutu di carbone di a fase stazionaria attuale hè quì sottu, postu chì alcuni ligandi polari cum'è u fenilmaleimide metil vinili isocianatu (PCMP) è 4-idrossi-TEMPO sò stati aduprati in più di u stirene in a preparazione di SP. A percentuale in pesu di azotu in a fase stazionaria attuale hè 2,21% paragunata à 0,1735 è 0,85% in studii precedenti42. Questu significa chì a fase stazionaria attuale hà una alta percentuale in pesu di azotu per via di a fenilmaleimide. In listessu modu, i prudutti (4) è (5) anu un cuntenutu di carbone di 2,7% è 2,9%, rispettivamente, mentre chì u pruduttu finale (6) hà un cuntenutu di carbone di 6,35%, cum'è mostratu in a Tavula 2. L'analisi termogravimetrica (TGA) hè stata aduprata nantu à a fase stazionaria di PMP per pruvà a perdita di pesu, è a curva TGA hè mostrata in a Figura 4. A curva TGA mostra una perdita di pesu di 8,6%, chì hè in bon accordu cù u cuntenutu di carbone (6,35%), postu chì i ligandi cuntenenu micca solu C, ma ancu N, O è H.
U ligante fenilmaleimide-metilvinil isocianatu hè statu sceltu per mudificà a superficia di e particelle di silice per via di i so gruppi polari fenilmaleimide è vinilisocianatu. I gruppi isocianati di vinile ponu reagisce ulteriormente cù u stirene per polimerizazione radicalica viva. A seconda ragione hè di inserisce un gruppu chì hà interazioni moderate cù l'analita è nisuna forte interazione elettrostatica trà l'analita è a fase stazionaria, postu chì a parte fenilmaleimide ùn hà micca carica virtuale à pH nurmale. A polarità di a fase stazionaria pò esse cuntrullata da a quantità ottima di stirene è u tempu di reazione di a polimerizazione radicalica libera. L'ultima tappa di a reazione (polimerizazione radicalica libera) hè critica perchè cambia a polarità di a fase stazionaria. L'analisi elementale hè stata realizata per verificà u cuntenutu di carbone in queste fasi stazionarie. Hè statu osservatu chì aumentà a quantità di stirene è u tempu di reazione aumenta u cuntenutu di carbone di a fase stazionaria è vice versa. I SP preparati cù diverse concentrazioni di stirene anu diverse cariche di carbone. In listessu modu, ste fasi stazionarie sò state piazzate nantu à colonne d'acciaiu inox è e so caratteristiche cromatografiche (selettività, risoluzione, valore N, ecc.) sò state verificate. Basendu si nantu à sti esperimenti, hè stata scelta una cumpusizione ottimizzata per a preparazione di a fase stazionaria PMP per furnisce una polarità cuntrullata è una bona ritenzione di l'analita.
A colonna PMP hè stata ancu valutata per l'analisi di cinque miscele di peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina-encefalina) utilizendu a capacità di a fase mobile. 60/40 (v/v) ACN/acqua (0,1% TFA) à una velocità di flussu di 80 µl/min. In cundizioni di eluzione ottimali (200.000 piastre/m), u numeru di piastre teoriche (N) per colonna (100 × 1,8 mm) hè 20.000 ± 100. I valori N per e trè colonne PMP sò mostrati in a Tabella 3 è i cromatogrammi sò mostrati in a Figura 5A. Analisi rapida à alta velocità di flussu (700 µl/min) nantu à una colonna PMP, cinque peptidi eluiti in un minutu, eccellente valore N di 13.500 ± 330 per colonna (100 x 1,8 mm di diametru), equivalente à 135.000 piastre/m (Fig. 5B). Trè colonne di a listessa dimensione (diametru internu 100 x 1,8 mm) sò state riempite cù trè diversi lotti di fase stazionaria PMP per testà a riproducibilità. L'analiti sò stati registrati per ogni colonna separendu a stessa mistura di prova nantu à ogni colonna utilizendu cundizioni di eluzione ottimali, numeru di piastre teoriche N è tempu di ritenzione. I dati di riproducibilità per e colonne PMP sò mostrati in a Tabella 4. A riproducibilità di a colonna PMP era ben correlata cù valori %RSD assai bassi cum'è mostratu in a Tabella 3.
Separazione di miscele di peptidi nantu à una colonna PMP (B) è una colonna Ascentis Express RP-Amide (A), fase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensioni di a colonna PMP (100 x 1,8 mm id), analisi Ordine di eluzione di i cumposti: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) è 5 (encefalina di l'acidu leucicu).
Una colonna PMP (diametru internu 100 x 1,8 mm) hè stata valutata per a separazione di l'idrolizzatu tripticu di l'albumina di serum umanu per HPLC. U cromatogramma in a Figura 6 mostra chì i campioni sò ben separati cù una risoluzione assai bona. E soluzioni HSA sò state analizate utilizendu una velocità di flussu di 100 μl/min, una fase mobile di 70/30 acetonitrile/acqua è 0,1% TFA. A scissione di HSA hè stata divisa in 17 picchi, cum'è mostratu in u cromatogramma (Fig. 6), currispondenti à 17 peptidi. L'efficienze di separazione di i picchi individuali da l'idrolizzatu HSA sò state calculate è i valori sò mostrati in a Tabella 5.
L'idrolizzati triptici HSA sò stati separati nantu à una colonna PMP (diametru internu 100 x 1,8 mm), velocità di flussu (100 μl/min), fase mobile 60/40 acetonitrile/acqua, è 0,1% TFA.
induve L hè a lunghezza di a colonna, η hè a viscosità di a fase mobile, ΔP hè a contropressione di a colonna, è u hè a velocità lineare di a fase mobile. A permeabilità di a colonna PMP era 2,5 × 10–14 m2, a velocità di flussu era 25 µl/min, hè statu utilizatu 60/40 v/v. ACN/acqua. A permeabilità di a colonna PMP (ID 100 × 1,8 mm) era simile à quella di u nostru studiu precedente Ref.34. A permeabilità di una colonna piena di particelle superficialmente porose hè 1,7 × 10 ,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 per particelle di 5 µm43. Dunque, a permeabilità di a fase PMP hè simile à a permeabilità di e particelle core-shell cù una dimensione di 5 μm.
induve Wx hè a massa di a colonna piena di cloroformu, Wy hè a massa di a colonna piena di metanolu, è ρ hè a densità di u solvente. Densità di metanolu (ρ = 0,7866) è cloroformu (ρ = 1,484). A porosità tutale di a colonna di particelle di silice-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 è a nostra colonna C18-urea31 studiata prima era 0,63 è 0,55, rispettivamente. Questu significa chì a presenza di ligandi di urea riduce a permeabilità di a fase stazionaria. D’altronde, a porosità tutale di a colonna PMP (diametru internu 100 × 1,8 mm) hè 0,60. E colonne PMP sò menu permeabili cà e colonne impaccate cù particelle di silice legate C18 perchè in e fasi stazionarie di tipu C18 i ligandi C18 sò attaccati à e particelle di silice in catene lineari, mentre chì in e fasi stazionarie di tipu polistirene si forma un polimeru relativamente grossu intornu à e particelle. stratu A. In un esperimentu tipicu, a porosità di a colonna hè calculata cusì:
In a figura 7A, B mostranu i grafici di Van Deemter per una colonna PMP (id 100 x 1,8 mm) è una colonna Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) in e stesse cundizioni di eluzione, 60/40 ACN/H2O è 0,1% TFA da 20 µl/min à 800 µl/min nantu à e duie colonne. I valori minimi HETP à a velocità di flussu ottima (80 µl/min) eranu 2,6 µm è 3,9 µm per a colonna PMP è a colonna Ascentis Express RP-Amide, rispettivamente. I valori HETP mostranu chì l'efficienza di separazione di a colonna PMP (100 x 1,8 mm id) hè assai più alta di quella di a colonna Ascentis Express RP-Amide dispunibule in cummerciu (100 x 1,8 mm id). U graficu di van Deemter in Fig. 7(A) mostra chì a diminuzione di u valore N ùn hè micca significativamente più alta cù l'aumentu di u flussu paragunatu à u nostru studiu precedente. L'efficienza di separazione più alta di a colonna PMP (id 100 × 1,8 mm) paragunata à a colonna Ascentis Express RP-Amide hè basata annantu à a forma è a dimensione di e particelle migliorate è a prucedura sofisticata di imballaggio di a colonna aduprata in u travagliu attuale34.
(A) Graficu di Van Deemter (HETP vs. velocità lineare di a fase mobile) ottenutu nantu à una colonna PMP (id 100 x 1,8 mm) in 60/40 ACN/H2O cù 0,1% TFA. (B) Graficu di Van Deemter (HETP versus velocità lineare di a fase mobile) ottenutu nantu à una colonna Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) in 60/40 ACN/H2O cù 0,1% TFA.
Una fase stazionaria polare di polistirene intercalatu hè stata preparata è valutata per a separazione di una mistura di peptidi sintetici è idrolizzatu tripticu di albumina di serum umanu (HSA) in cromatografia liquida ad alte prestazioni. A prestazione cromatografica di e colonne PMP per e misture di peptidi hè eccellente in termini di efficienza di separazione è risoluzione. L'efficienza di separazione migliorata di e colonne PMP hè dovuta à parechje ragioni cum'è a dimensione di e particelle di silice è a dimensione di i pori, a sintesi cuntrullata di e fasi stazionarie è i materiali di imballaggio di e colonne cumplessi. Oltre à l'alta efficienza di separazione, un altru vantaghju di sta fase stazionaria hè a bassa contropressione di a colonna à alte velocità di flussu. E colonne PMP sò altamente riproducibili è ponu esse aduprate per analizà misture di peptidi è digestione triptica di varie proteine. Avemu l'intenzione di aduprà sta colonna per a separazione di cumposti bioattivi da prudutti naturali, estratti di piante medicinali è funghi in cromatografia liquida. In u futuru, e colonne PMP saranu ancu valutate per a separazione di proteine ​​è anticorpi monoclonali.
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