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L'Angustifolius lupine (NLL, Lupinus angustifolius L.) hè una pianta leguminosa utilizata per a produzzione alimentaria è a migliione di a terra.L'espansione glubale di NLL cum'è una cultura hà attrattu parechji fungi patogeni, cumprese l'antracnosi lupine, chì provoca a malatia di l'antracnosi devastanti.Dui alleli, Lanr1 è AnMan, chì cunferiscenu una resistenza aumentata, sò stati utilizati in l'allevamentu di NLL, ma i meccanismi molecolari sottostanti restanu scunnisciuti.In questu studiu, i marcatori Lanr1 è AnMan sò stati usati per screening samples NLL europei.A prova di a vacuna in un ambiente cuntrullatu hà cunfirmatu l'efficacità di i dui donatori resistenti.A profilazione di l'espressione genica differenziale hè stata realizata nantu à e linee rappresentative resistenti è suscettibili.A resistenza à l'antracnosi hè stata assuciata cù l'espressione di i termini di l'ontologia genetica "GO: 0006952 Defense Response", "GO: 0055114 Redox Process" è "GO: 0015979 Photosynthesis".Inoltre, a linea Lanr1 (83A: 476) dimustrava una riprogrammazione significativa di u transcriptome rapidamente dopu l'inoculazione, mentre chì l'altri linii mostranu un ritardu in questa risposta da circa 42 ore.I risposti di difesa sò assuciati cù i geni TIR-NBS, CC-NBS-LRR è NBS-LRR, 10 proteini implicati in a patogenesi, proteine ​​​​di trasferimentu di lipidi, endoglucan-1,3-β-glucosidase, proteini di a parete cellulare ricca di glicina, è geni da a via reattiva di l'ossigenu.I primi risposti à 83A: 476, cumpresa a suppressione attenta di i geni assuciati à a fotosintesi, coincidenu cù a prutezzione riescita durante a fase di crescita vegetativa di a biologia fungica, chì suggerenu chì un effector attiva l'immunità.A reazione di Mandeloop hè rallentata, cum'è l'arrastramentu horizontale generale.
Le lupin à feuilles étroites (NLL, Lupinus angustifolius L.) est une céréale riche en protéines originaire de la région méditerranéenne occidentale1,2.Attualmente hè cultivatu cum'è una cultura alimentaria per l'animali è l'omu.Hè ancu cunsideratu manure verde in i sistemi di rotazione di culturi per via di a fissazione di nitrogenu da i batteri simbiotici di fissazione di nitrogenu è a migliione generale di a struttura di a terra.NLL hà subitu un rapidu prucessu di domesticazione in l'ultimu seculu è hè sempre sottu pressione di ripruduzzione alta3,4,5,6,7,8,9,10,11,12.Cù u cultivo generalizatu di NLL, a successione di fungi patogeni hà sviluppatu novi nichi agriculi è hà causatu novi malatie chì distruggenu i culturi. U più rimarchevule per l'agricultori è i criatori di lupini era l'apparizione di l'antracnose, causata da u fungus patogeni, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. U più rimarchevule per l'agricultori è i criatori di lupini era l'apparizione di l'antracnose, causata da u fungus patogeni, Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Наиболее примечательным для фермеров и селекционеров люпина было появление антракнозав антракнозав, паибонеров люпина ибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. U più notu per l'agricultori è l'allevatori di lupini hè stata l'emergenza di l'antracnose causata da u fungu patogenu Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现，它是由眗Botrhum, Feeder, Lupin, 它是由眗腏目的是炭疽iler & Hagedorn13 引起的。对于羽扇豆农民和饲养者来说，最引人注目的是炭疽病的出现，它是现，它是现，它是现它是由眵眵腏目的是炭目的是的出现，它是现ColleHum d。1 Наиболее поразительным для фермеров и селекционеров люпина является появление антракнозого,вакнозого грибком Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13. Le plus frappant pour les agriculteurs et les éleveurs de lupins est l'apparition de l'antracnose causée par le champignon patogène Colletotrichum lupini (Bondar) Nirenberg, Feiler & Hagedorn13.I primi rapporti di a malatia sò vinuti da u Brasile è i Stati Uniti, cù sintomi tipici apparsu in 1912 è 1929 rispettivamente.Tuttavia, dopu à circa 30 anni, u patogenu hè statu designatu cum'è Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., телеоморф Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc., teleomorph of Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc.，有目的形态的Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld。 & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld в Целенаправленной морфологии. & Sacc., Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld in Targeted Morphology. & H. Schrenk,. & H. Schrenk, .è H. Schrenk. & H.施伦克，。 & H.施伦克，。è H. Schlenk,.U fenotipamentu di e malatie preliminari fattu à a mità di u XXu seculu hà dimustratu una certa resistenza in l'accessioni di NLL è di lupini gialli (L. luteus L.), ma tutti l'accessioni di lupini bianchi (L. albus L.) pruvati eranu assai suscettibili15,16.I studii anu dimustratu chì u sviluppu di l'antracnosi hè assuciatu cù l'aumentu di a precipitazione (umidità di l'aria) è di a temperatura (in u intervalu di 12-28 ° C), chì porta à una violazione di a resistenza à a temperatura più alta17, 18. In fattu, u tempu necessariu per a conidia per germinà è a malatia per cumincià, era quattru volte più corta à 24 ° C (4 ore) 12 ° 1 umidità alta (12 h 12 ° C) in umidità alta.Cusì, u riscaldamentu glubale in corso hà purtatu à a diffusione di l'antracnosi.In ogni casu, a malatia hè stata osservata in Francia (1982) è in Ucraina (1983) cum'è un precursore di una minaccia imminente, ma era apparentemente ignorata da l'industria lupine à u mumentu20,21.Uni pochi anni dopu, sta malatia devastante si sparghje in u mondu è hà ancu affettatu i principali paesi pruduttori di lupini cum'è l'Australia, a Pulonia è a Germania22,23,24.Dopu un focu di antracnosi à a mità di l'anni 1990, un screening estensivu hà risultatu in l'identificazione di parechji donatori resistenti in campioni NLL19.A resistenza NLL à l'antracnose hè cuntrullata da dui alleli dominanti separati truvati in diverse fonti di germoplasma: Lanr1 in cultivar Tanjil è Wonga è AnMan in cultivar.Mandalay 25, 26. Questi alleli cumplementanu i marcatori moleculari chì sustenenu a selezzione di germplasm resistenti in i prugrammi di ripruduzzione25,26,27,28,29,30.A linea di ripruduzzione resistente 83A: 476 chì porta l'allele Lanr1 hè stata cruciata cù a linea salvatica suscettibile P27255 per ottene una populazione RIL segregante per a resistenza à l'antracnosi, chì hà permessu di assignà u locu Lanr1 à u cromosoma NLL-1131, 32, 33. u locu di tutti i trè alleli nantu à u stessu cromusomu (NLL-11), ma in pusizioni differenti29,34,35.Tuttavia, per via di u picculu numeru di RIL è di a grande distanza genetica trà i marcatori è l'alleli currispondenti, ùn si ponu micca cunclusioni affidabili nantu à i so geni sottostanti.Per d 'altra banda, l'usu di a genetica inversa in lupini hè difficiule per via di u so putenziale di rigenerazione assai bassu, chì rende a manipulazione genetica ingombrante37.
U sviluppu di u germoplasma domesticatu chì porta l'allelu desideratu in u statu omozigote, cum'è 83A: 476 (Lanr1) è Mandelup (AnMan), hà apertu a porta à studià a resistenza à l'antracnosi in fronte di a presenza di cumminazzioni opposti di alleli in pupulazioni salvatichi.Possibilità di miccanismi moleculari.Comparare e risposte di difesa generate da genotipi specifichi.Stu studiu hà evaluatu a risposta transcriptome prima di NLL à a vaccinazione di C. lupini.Prima, un pannellu di germoplasma NLL europeu chì cuntene 215 linee hè statu screened cù marcatori moleculari chì marcanu l'alleli Lanr1 è AnMan.U fenotipamentu di l'antracnosi hè statu dopu realizatu nantu à e linee 50 NLL, prima scelte per marcatori moleculari, in cundizioni cuntrullate.Basatu annantu à questi esperimenti, quattru linee chì si differenzianu in a resistenza à l'antracnosi è in a cumpusizioni allelica di Lanr1 / AnMan sò state scelte per a profilazione di l'espressione genica di difesa differenziale utilizendu dui approcci cumplementari: sequencing RNA high-throughput è quantificazione PCR in tempu reale.
U screening di un inseme di germoplasma NLL (N = 215) cù marcatori Lanr1 (Anseq3 è Anseq4) è AnMan (Anseq4) è AnMan (AnManM1) hà dimustratu chì una sola linea (95726, vicinu à Salamanca-b) amplifica l'allele di "resistenza" per tutti i marcatori, mentre chì "presenza di tutti i marcatori" in a proporzione di 185 "alleli" trovanu in 185. .5%) linii.Tredeci linee pruducianu dui alleli "resistenti" di u marcatu Lanr1, è 8 linee producenu alleli "resistenti" di Lanr1.marcatore.L'allele "resistenza" di u marcatore AnMan (Table Supplementary S1).Dui linii eranu eterozigoti per u marcatore Anseq3 è una eterozigote per u marcatore AnManM1.42 linee (19,5%) portavanu fasi opposte di l'alleli Anseq3 è Anseq4, chì indicanu una alta frequenza di recombinazione trà sti dui lochi.I fenotipi di antracnosi in cundizioni cuntrullate (Table Supplementary S2) anu revelatu una variabilità in a resistenza di i genotipi testati, chì si riflette in a gravità di l'antracnosi.E sferenze in i punteggi medii varianu da 1,8 (moderatamente resistente) à 6,9 (susceptible) è e differenzi di pesu di a pianta varianu da 0,62 (susceptible) à 4,45 g (resistente). Ci era una correlazione significativa trà i valori osservati in duie replicazioni di l'esperimentu (0,51 per i punteggi di gravità di a malatia, P = 0,00017 è 0,61 per u pesu di a pianta, P <0,0001) è trà questi dui parametri (-0,59 è - 0,77, P <0,0001). Ci era una correlazione significativa trà i valori osservati in duie replicazioni di l'esperimentu (0,51 per i punteggi di gravità di a malatia, P = 0,00017 è 0,61 per u pesu di a pianta, P <0,0001) è trà questi dui parametri (-0,59 è - 0,77, P <0,0001). Выявлена ​​​​достоверная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция между значениями, наблюдаемыми в двух повторностяция э0,лстентера э0,лстях э0 в тяжести болезни, P = 0,00017 и 0,61 для массы растения, P < 0,0001), а также между этими этими дав,5,-7 Р < 0,0001) 0,0001). Una correlazione significativa hè stata trovata trà i valori osservati in duie ripetizioni di l'esperimentu (0,51 per i punteggi di gravità di a malatia, P = 0,00017 è 0,61 per u pesu di a pianta, P <0,0001), è ancu trà questi dui parametri (-0,59 è -0,77, P <0,00001).在两次重复实验中观察到的值之间存在显着相关性（疾病严重程度评分1︺00.51︺00.51︺00.物重量为0.61，P < 0.0001）以及这两个参数之间（- 0.59 和- 0.77，P < 0.0001)。在 两 次 重复 实验 中 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 观察 的 值 之间 存在 相关性 （疾病 严重 程度 帄度 诺0. 1 ， p = 0,00017 ， 植物 为 为 0,61 ， p <0,0001） 以及 两 个 参数 之间 （（（（（，及 两 个 参数 之间 （（（（（，及 两 个 参数 之间 （（（（（（２59.和– 0,59 和- 0,77，P <0,0001). Наблюдалась значительная корреляция между значениями, наблюдаемыми в двух потцонка значениями аболевания 0,51, P = 0,00017 и масса растения 0,61, P <0,0001), è между этими двумя параметрами 0,61, P <0,0001), è между этими двумя параметрами 0,70,509 (-1,0,50) . Ci era una correlazione significativa trà i valori osservati in duplicate (puntu di gravità di a malatia 0,51, P = 0,00017 è u pesu di a pianta 0,61, P <0,0001) è trà questi dui parametri (-0,59 è -0,0001) 0,77, P <0,0001. ).I sintomi tipici vistu in i pianti suscettibili includenu torsioni è torsioni di u troncu chì s'assumiglia à una struttura di "arcu di pastore", seguita da lesioni ovali cù sporozoiti aranciu / rosa (Figura supplementaria 1).L'accessioni australiani chì portanu i geni Lanr1 (83A: 476 è Tanjil) è AnMan (Mandelup) sò moderatamente resistenti, 0,0331 è 0,0036).Alcune linee chì portanu ancu "resistenti" alleli Lanr1 è / o AnMan mostranu sintomi di a malatia.
Curiosamente, uni pochi di linee NLL chì mancavanu qualsiasi allele di marcatore "resistente" anu revelatu un altu livellu di resistenza à l'antracnosi (cumparabile o più altu ch'è per i genotipi Lanr1 o AnMan), cum'è Boregine (valore P <0.0001 per i dui parametri), Bojar (valore P <0.0001 per u puntuazione è u pesu di a pianta 0.0001) (POP 0.0001 per u pesu di a pianta) è 0.50091 / Pop. 001 per u puntu è micca significativu per u pesu). Curiosamente, uni pochi di linee NLL chì mancavanu qualsiasi allele di marcatore "resistente" anu revelatu un altu livellu di resistenza à l'antracnosi (cumparabile o più altu ch'è per i genotipi Lanr1 o AnMan), cum'è Boregine (valore P <0.0001 per i dui parametri), Bojar (valore P <0.0001 per u puntuazione è u pesu di a pianta 0.0001) (POP 0.0001 per u pesu di a pianta) è 0.50091 / Pop. 001 per u puntu è micca significativu per u pesu). Интересно, что несколько линий NLL, лишенных какого-либо «резистентного» маркерного аллекавы аллокавы залокавы ь устойчивости к антракнозу (сопоставимый или более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan), так0, более высокий, чем для генотипов Lanr1 или AnMan, так0 1 для обоих параметров), Bojar (значение P < 0,0001 для оценки и 0,001 для массы растения) и по значение P-549ние B-549ние и 0,001 для оценки ,0001 для оценки и незначимо для массы). Curiosamente, parechje linee NLL mancanti di qualsiasi allele marcatore "resistente" dimustranu un altu livellu di resistenza à l'antracnose (cumparabile o più altu ch'è per i genotipi Lanr1 o AnMan), cum'è Boregine (valore P < 0,0001 per i dui parametri), Bojar (valore P < 0,0001 per a valutazione è u valore B - 0,0001 per u pesu di a pianta è < 0,0001 per a pupulazione). 0001 per a valutazione è micca significativu per u pesu).有趣的是，一些缺乏任何“抗性”标记等位基因的NLL 系显示出高水平的炭水平的炭水平的炭疽An 的炭等位基因的NLL基因型相当或更高），例如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<律如Boregine（两个参数的P 值< 0.0001）、Bojar（P 值<得分0万0.麉，分0. 01）和种群B-549/79b（得分P 值< 0.0001，重量不显着）。 Hè interessante chì certi sistemi NLL chì ùn anu micca marcatori "antigenici" mostranu una alta resistenza horizontale (equivalente à i geni Lanr1 o AnMan o più altu), cum'è Boregine (i dui paràmetri P <0.0001), Bojar (valore P <0.0001, pesu di pianta 0.001) è strain B-549/0.001. Интересно, что некоторые линии NLL, лишенные каких-либо маркерных аллелей «резистентноста», слистентноста в слова стойчивости к антракнозу (сравнимые или выше, чем у генотипов Lanr1 или AnMan), такие как Boregine (знерач долипов) 0,0001), Bojar (значение P <0,0001, масса растения 0,001) и популяция B-549/79b (оценка P-значенка P-значение <0,0001, масса 0,0001) a). Curiosamente, alcune linee NLL chì mancavanu qualsiasi alleli di marcatori "resistenza" anu mostratu alti livelli di resistenza à l'antracnosi (cumparabile o più altu di i genotipi Lanr1 o AnMan), cum'è Boregine (valore P per i dui paràmetri <0,0001), Bojar (valore P <0,0001, pesu di a pianta <0,90-51) è 0,70-51 populazione (p. 01, pesu micca significativu).Stu fenomenu suggerisce a pussibilità di una nova fonte genetica di resistenza, spieghendu a mancanza di correlazione osservata trà genotipi di marcatori è fenotipi di malatie (valori P da ~ 0,42 à ~ 0,98).Cusì, a prova di Kolmogorov-Smirnov hà dimustratu chì e dati nantu à a resistenza à l'antracnose sò stati distribuiti apprussimativamente in modu normale per punteggi (valori P 0,25 è 0,11) è massa vegetale (valori P 0,47 è 0,55), suggerendu chì l'ipotesi chì più alleli chì Lanr1 è AnMan sò implicati.
Basatu nantu à i risultati di u screening di resistenza à l'antracnose, i linii 4 sò stati selezziunati per l'analisi di transcriptome: 83A: 476, Boregine, Mandelup, and Population 22660. Sti linii sò stati testati per a resistenza à l'anthrax in esperimenti di inoculazione per sequenza di RNA, sempre chì eranu listessi cum'è in a prova precedente.I valori di puntuazione eranu i seguenti: Boregin (1.71 ± 1.39), 83A: 476 (2.09 ± 1.38), Mandelup (3.82 ± 1.42) è populazione 22660 (6.11 ± 1.29 ).
U protokollu Illumina NovaSeq 6000 hà ottenutu una media di 40.5 Mread coppie per campione (29.7 à 54.4 Mreads) (Tavola Supplementaria S3).I punteggi di allineamentu in a sequenza di riferimentu varienu da 75,5% à 88,6%.A correlazione media di i dati di u conte di lettura trà varianti sperimentali trà replicati biologichi variava da 0.812 à 0.997 (media 0.959). Da i 35,170 geni analizati, 2917 ùn anu revelatu nisuna espressione, è l'altri geni 4785 sò stati spressi à un livellu insignificante (media di basa <5). Da i 35,170 geni analizati, 2917 ùn anu revelatu nisuna espressione, è l'altri geni 4785 sò stati spressi à un livellu insignificante (media di basa <5). Из 35 170 проанализированных генов 2917 не проявляли экспрессии, а остальные 4785 генов спрессии начительном уровне (базовое среднее <5). Di i 35,170 geni analizati, 2917 ùn anu micca espressione, è i 4785 genes restanti sò stati spressi à un livellu insignificante (base media <5).在分析的35,170 个基因中，2917 个没有表达，其他4785 个基因的表达可以忨达可以応表达，其他4785值< 5）.35.170 Из 35 170 проанализированных генов 2917 не экспрессировались, а остальные 4785 генов имелсуч имелсуч имельные прессию (базовое среднее значение <5). Di i 35,170 geni analizati, 2917 ùn sò micca stati spressi è i 4785 geni rimanenti avianu una espressione insignificante (media di basa <5).Cusì, u numeru di geni cunsiderati espressi (media di basa ≥ 5) durante l'esperimentu era 27,468 (78.1%) (Tabella Supplementaria S4).
Da u primu puntu di u tempu, tutti i linii NLL rispundenu à l'inoculazione di C. lupini (strain Col-08) per reprogramming the transcriptome (Table 1), in ogni modu, differenzi significati sò stati osservati trà e linii.Cusì, a linea di resistenza 83A: 476 (portendu u genu Lanr1) hà dimustratu una riprogrammazione significativa di transcriptome à u primu puntu di tempu (6 hpi) cù un aumentu di 31-69 volte in u nùmeru di geni isolati up-and down paragunatu à l'altri punti di tempu in questu tempu.Inoltre, stu piccu era di corta durata, cum'è l'espressione di solu uni pochi di geni sò stati significativamente alterati à u sicondu puntu di tempu (12 hpi).Curiosamente, Boregine, chì hà ancu dimustratu un altu livellu di resistenza in a prova di l'injertu, ùn hà micca sottumessu una riprogrammazione trascrizionale massiva durante l'esperimentu.Tuttavia, u numeru di geni espressi di manera differenziale (DEG) era u listessu per Boregine è 83A: 476 à 12 HPI.Sia Mandelup sia a pupulazione 22660 anu mostratu picchi di DEG à l'ultimu puntu di tempu (48 l / s), chì indicanu un ritardu relative in e risposte di difesa.
Perchè 83A: 476 hà subitu una riprogrammazione massiva di transcriptome in risposta à C. lupini à 6 HPI cumparatu cù tutti l'altri linii, ~ 91% di i DEG osservati in questu tempu era specificu di linea (Fig. 1).Tuttavia, ci era una certa sovrapposizione in i primi risposti trà e linee di studiu, cum'è 68.5%, 50.9%, è 52.6% DEG in Boregine, Mandelup, è a pupulazione 22660, rispettivamente, si sovrapponevanu cù quelli chì si trovanu in 83A: 476 in certi punti in u tempu.Tuttavia, questi DEG rapprisentanu solu una piccula frazione (0.97-1.70%) di tutti i DEG attualmente rilevati cù 83A: 476.Inoltre, 11 DEG da tutte e linee eranu coerenti à questu tempu (Tabelle Supplementari S4-S6), cumprese cumpunenti cumuni di risposti di difesa di e piante: proteina di trasferimentu di lipidi (TanjilG_32225), enzima endoglucan-1,3-β-glucoside (TanjilG_23384), duie proteine ​​​​inducible da stress (TanjilG_23384). 531), a proteina basica di lattice (TanjilG_32352), è duie proteine ​​​​strutturali di muru di cellula strutturale ricche di glicina (TanjilG_19701 è TanjilG_19702).Ci era ancu una sovrapposizione relativamente alta in risposti di transcriptome trà 83A: 476 è Boregine à 24 HPI (totale 16-38% DEG) è trà Mandelup è Populazione 22660 à 48 HPI (totale 14-20% DEG).
Diagramme de Venn montrant le nombre de gènes à expression différentielle (DEG) dans les lignées de lupin à feuilles étroites (NLL) inoculées avec Colletotrichum lupini (souche Col-08 obtenue à partir de champs de lupin à Wierzhenice, Pologne, 1999).I linii NLL analizati eranu: 83A: 476 (resistente, purtendu l'allele Lanr1), Boregine (resistente, fondo geneticu scunnisciutu), Mandelup (moderatamente resistente, purtendu l'allele AnMan) è pupulazione 22660 (assai suscettibile).L'abbreviazione hpi sta per ore dopu a vaccinazione.I valori zero sò stati eliminati per simplificà u graficu.
L'insieme di geni sovraespressi à 6 hpi hè statu analizatu per a presenza di domini di geni R canonici (Tabella Supplementaria S7).Stu studiu hà revelatu l'induzione di transcriptome di i geni classici di resistenza à e malatie cù domini NBS-LRR solu à 83A: 476.Questu inseme era custituitu da un genu TIR-NBS-LRR (tanjilg_05042), cinque geni CC-NBS-LRR (tanjilg_06165, tanjilg_06162, tanjilg_22773, tanjilg_22640, è tanjilg_16162, è Quattru NBS-LR6, è Quattru NBS-LR6, Tanjilg_16162) jilg_16162) è ancu Four NBS-Lrr (tanjilg_16162) è Four NBS-LRR (TANJILG_16162).Tutti questi geni anu duminii canonichi disposti in sequenze cunservate.In più di i geni di u duminiu NBS-LRR, parechji RLL kinases sò stati attivati ​​à 6 hpi, vale à dì unu in Boregine (TanjilG_19877), dui in Mandelup (TanjilG_07141 è TanjilG_19877) è in a pupulazione 22660 (TanjilG_03jilG_19877) 476.
Genes cù espressione significativamente alterata in risposta à l'inoculazione cù C. lupini (strain Col-08) sò stati sottumessi à l'analisi di arricchimentu di Gene Ontology (GO) (Supplementary Table S8). U terminu di prucessu biologicu più frequentemente overrepresented era "GO: risposta di difesa 0006952" chì apparsu in 6 fora di 16 (tempu × linea) cumminzioni cun significazione alta (valore P <0.001) (Fig. 2). U terminu di prucessu biologicu più frequentemente overrepresented era "GO: risposta di difesa 0006952" chì apparsu in 6 fora di 16 (tempu × linea) cumminzioni cun significazione alta (valore P <0.001) (Fig. 2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 термином биологического процесса был «GO: 0006952 й появлялся в 6 из 16 (время × линия) комбинаций с высокой значимостью (значение P <0,001) (рисокой значимостью). U termu di prucessu biologicu più frequentemente overrepresented era 'GO: 0006952 risposta di difesa', chì apparsu in 6 di 16 (tempu × lineage) cumminzioni cù alta significazione (valore P <0.001) (Fig. 2).最常被过度代表的生物过程术语是“GO:0006952 防御反应”，它出现在16 个（縶魗（时魗（时魗应”个中，具有高显着性（P 值< 0.001）（图2）。 U terminu di prucessu biologicu più rappresentativu hè "GO: 0006952 risposta di difesa", chì si prisenta in 6 di e 16 (时间×线) cumminazzioni, cun significazione alta (valore P <0.001) (图2). Наиболее часто чрезмерно представленным термином биологического процесса был «GO: 0006952 Risposta», Risposta 0006952 в 6 из 16 комбинаций (время × линия) с высокой значимостью (значение P <0,001) (рис. 2). U terminu di prucessu biologicu più frequentemente overrepresented era 'GO: 0006952 Defense Response', chì apparsu in 6 cumminzioni di 16 (tempu × linea) cun significatu altu (valore P <0.001) (Fig. 2).Stu termu era sovrarappresentatu in dui punti di tempu in 83A: 476 è Boregine (6 è 24 hpi) è in un puntu di tempu in Mandelup è Populazione 22660 (12 è 6 hpi, rispettivamente).Questu hè un risultatu aspittatu, chì mette in risaltu a risposta antifungali di e linee resistenti.In più, 83A: 476 rispunniu à C. lupini da induce rapidamente genes ligati à u burst oxidative rapprisintatu da u terminu "GO: 0055114 prucessu redox", chì indica una risposta di difesa specifichi, mentri Boregine palesu risposti di difesa specifichi, in relazione à u terminu "GO".: 0006950 Risposta à u stress ".A pupulazione 22660 hà attivatu a risposta di resistenza horizontale chì implica metaboliti secondari, mettendu in risaltu u numeru eccessivu di termini "GO: 0016104 Process of triterpene biosintesi" è "GO: 0006722 Process of triterpene metabolism" (i dui termini appartenenu à u stessu inseme di geni), tenendu in contu i risultati di l'analisi di ricchezza di i termini di Mandelup è di l'analisi di ricchezza di Mandelup. 22660. Inoltre, a reazione iniziale 83A: 476 (6 hpi) è a reazione ritardata Mandelup è Populazione 22660 includenu u termu GO: 0015979 'fotosintesi' è altri prucessi biologichi rilativi.
I termini di l'ontologia di i geni di u bioprocessu selezziunati in l'annotazione di geni espressi in modu differenziale durante e risposti di transcriptoma di lupinu à foglie strette (NLL) inoculati cù lupinu di antrax (ceppa Col-08 ottenuta da campi di lupini in Wierzhenice, Polonia, in 1999) sò assai esagerati.I linii NLL analizati eranu: 83A: 476 (resistenti, purtendu l'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, fondo geneticu scunnisciutu), Mandelup (moderatamente resistente, purtendu l'allele homozygous AnMan) è populazione 22660 (susceptible).
Perchè stu studiu hà u scopu di identificà i geni chì cuntribuiscenu à a resistenza à l'antracnosi, i geni assignati à i termini GO "GO: 0006952 Defensive responses" è "GO: 0055114 Redox processes" sò stati analizati cù cut-offs, postu chì basale significa ≥ 30 cù almenu una linea.× puntu in u tempu chì combina valori statisticamente significativi di log2 (cambio di volte).U numaru di geni chì risponde à questi criterii era 65 per GO: 0006952 è 524 per GO: 0055114.
83A: 476 hà revelatu dui picchi DEG annotati cù u terminu GO: 0006952, u primu à 6 genes per inch (64 genes, up and down regulation) è u sicondu à 24 genes per inch (15 genes, up regulation only).Boregine hà ancu dimustratu chì GO: 0006952 hà cullatu à u listessu tempu, ma cù menu DEG (11 è 8) è attivazione preferenziale.Mandeloop hà dimustratu dui picchi di GO: 0006952 à 12 è 48 HPI, tramindui purtendu 12 genes (u primu cù geni attivatori, è u sicondu cù solu geni suppressivi), mentri a pupulazione 22660 à 6 HPI (13 genes) avia una predominanza più grande di u piccu di crescita.regulamentu.Si deve esse nutatu chì u 96.4% di GO: 0006952 DEG in questi cimi avianu u listessu tipu di risposta (su o giù), chì indicanu una sovrapposizione significativa in risposti di difesa malgradu e differenze in u numeru di geni implicati.U più grande gruppu di sequenze ligati à u terminu GO: 0006952 codifica a Protein 22 di Messaghju Stress-Associated Starvation (SAM22-like), chì appartene à a classa 10 di proteina associata à a patogenesi (PR-10) clade di proteina è u lattice di proteina core.similar (MLP-like) protein) proteina (Fig. 3).I dui gruppi sò diffirenti in a natura di l'espressione è a direzzione di a risposta.I geni chì codificanu e proteine ​​​​simile à SAM22 dimustranu una induzione consistente è significativa à i primi punti di tempu (6 o 12 hpi) è ùn sò generalmente micca rispunsevuli à a fine di l'esperimentu (48 hpi), mentre chì e proteine ​​​​simili MLP mostranu coordinazione à 6 hpi.hpi.83A: 476 è Mandelup à 48 hp / in, quasi tutti l'altri punti di dati ùn rispundenu.Inoltre, e differenze in i profili di espressione di i geni di proteine ​​​​simile à SAM22 anu seguitu a variabilità osservata in a resistenza à l'antracnosi, postu chì e linee più resistenti anu più punti di tempu inducendu significativamente questi geni cà i geni più suscettibili.Un altru genu LlR18A / B-like PR-10 hà dimustratu un mudellu d'espressione assai simili à u genu di a proteina SAM22-like.
I cumpunenti principali di u terminu di prucessu biologicu "GO: 0006952 Defense Response" è i mudelli di espressione di i geni candidati di l'alleli Lanr1 è AnMan sò stati identificati.A scala Log2 rapprisenta i valori log2 (variazione di volte) trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, ottenuta da i campi di lupini, Wizhenica, Pulonia, 1999) è i pianti di cuntrollu (inoculati sham) à u stessu tempu.E seguenti linee di lupini narrowleaf sò state analizate: 83A: 476 (resistente, chì porta l'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, fondo geneticu scunnisciutu), Mandelup (moderatamente resistente, chì porta l'allele omozigote AnMan), è Populazione 22660 (susceptible).
Inoltre, i profili di espressione di i geni candidati RNA-seq Lanr1 (TanjilG_05042) è AnMan (TanjilG_12861) sò stati evaluati (Fig. 3).U genu TanjilG_05042 hà dimustratu una risposta significativa (attivazione) à 83A: 476 solu à u primu puntu di tempu (6 hpi), mentri TanjilG_12861 era significativu in Mandeloop solu in dui punti di tempu: 6 hpi (regulazione down) è 24 hpi (6 hpi).Cù.).regolabile) ).
I genesi più overexpressed in u termu GO: 0055114 "processu redox" eranu genes chì codificanu i proteini di citocromu P450 è peroxidase (Fig. 4).Per i campioni isolati da 83A: 476 à 6 HPI, i valori massimi o minimi di log2 (cambio di volte) (per 86,6% di i geni) sò stati generalmente osservati trà e piante inoculate è di cuntrollu, mettendu in risaltu l'alta risposta di stu genotipu à u sessu inoculatu.83A: 476 hà dimustratu u GO più significativu: 0055114 DEG à 6 hpi (503 genes), mentri u restu di e linee à 48 hpi (Boregine, 31 genes; Mandelup, 85 genes; è Populazione 22660, 78 genes)).In a maiò parte di i geni di a famiglia GO: 0055114, sò stati osservati dui tipi di risposti à a vaccinazione (attivazione è inhibizione).Curiosamente, finu à u 97.6% di i DEG identificati per u terminu GO: 0055114 in Mandelupe à 48 hp Queste osservazioni suggerenu chì, malgradu a scala significativamente più chjuca (vale à dì, u numeru di geni redox mutati, 85 versus 503), u mudellu di risposti di transcriptome ritardatu à a risposta iniziale di 36:A mandeloseup hè simili à a risposta iniziale di 874.In Boregine è Populazione 22660, sta cunvergenza hè più bassu à 51,6% è 75,6%, rispettivamente.
I mudelli di spressione di i cumpunenti principali di u terminu di u prucessu biologicu "GO: 0055114 Redox process" sò stati revelati.A scala Log2 rapprisenta i valori log2 (variazione di volte) trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, ottenuta da i campi di lupini, Wizhenica, Pulonia, 1999) è i pianti di cuntrollu (inoculati sham) à u stessu tempu.E seguenti linee di lupini narrowleaf sò state analizate: 83A: 476 (resistente, chì porta l'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, fondo geneticu scunnisciutu), Mandelup (moderatamente resistente, chì porta l'allele omozigote AnMan), è Populazione 22660 (susceptible).
83A: 476 Risposti transcriptomic à l'inoculazione cù C. lupini (strain Col-08) includenu ancu u silenziu coordinatu di i geni attribuiti à u termu GO: 0015979 "fotosintesi" è altri prucessi biologichi rilativi (FIG. 5).Questu set GO:0015979 DEG cuntene 105 genes chì sò stati significativamente ripressi à 6 hpi à 83A:476.In questu subset, 37 geni sò stati ancu regulati in Mandelup à 48 HPI è 35 à u listessu tempu in a pupulazione 22660, cumprese 19 DEG cumuni à i dui genotipi.Nisun DEG ligatu à u termu GO: 0015979 sò stati attivati ​​significativamente in ogni cumminazione (linea x tempu).
I mudelli di spressione di i cumpunenti principali di u terminu di u prucessu biologicu "GO: 0015979 Photosynthesis" sò stati revelati.A scala Log2 rapprisenta i valori log2 (variazione di volte) trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, ottenuta da i campi di lupini, Wizhenica, Pulonia, 1999) è i pianti di cuntrollu (inoculati sham) à u stessu tempu.E seguenti linee di lupini narrowleaf sò state analizate: 83A: 476 (resistente, chì porta l'allele omozigote Lanr1), Boregine (resistente, fondo geneticu scunnisciutu), Mandelup (moderatamente resistente, chì porta l'allele omozigote AnMan), è Populazione 22660 (susceptible).
Basatu nantu à i risultati di l'analisi di espressione differenziale è presumibilmente implicati in risposti di difesa contr'à funghi patogeni, stu gruppu di sette geni hè statu sceltu per a quantificazione di i profili di espressione per PCR in tempu reale (Tabella Supplementaria S9).
U genu di a proteina putativa TanjilG_10657 hè statu indottu significativamente in tutte e linee studiate è i punti di tempu paragunatu à e piante di cuntrollu (mimicu) (Tavule Supplementari S10, S11).Inoltre, u prufilu d'espressione di TanjilG_10657 hà dimustratu una tendenza crescente in u cursu di l'esperimentu per tutte e linee.A pupulazione 22660 hà dimustratu a più alta sensibilità di TanjilG_10657 à l'inoculazione cù l'attivazione di 114 volte è u più altu livellu di espressione relative (4.4 ± 0.4) à 24 HPI (Fig. 6a).U genu di a proteina PR10 LlR18A TanjilG_27015 hà ancu dimustratu l'attivazione in tutti i linii è i punti di u tempu, cù significati statistichi in a maiò parte di i punti di dati (Fig. 6b).Simile à TanjilG_10657, u più altu livellu di espressione relative di TanjilG_27015 hè statu osservatu in a populazione inoculata 22660 à 24 HPI (19.5 ± 2.4).U genu di l'endochitinase à l'acidu TanjilG_04706 hè statu significativamente upregulated in tutti i linii è in tutti i punti di u tempu eccettu per Boregine 6 hpi (Fig. 6c).Hè statu induvatu forti à u primu puntu di tempu (6 HPI) à 83A: 476 (da 10,5 volte) è moderatu aumentatu in altre linee (da 6,6-7,5 volte).Durante l'esperimentu, l'espressione di TanjilG_04706 hè stata à livelli simili in 83A: 476 è Boregine, mentre chì in Mandelup è Populazione 22660 hà aumentatu significativamente, righjunghjendu valori relativamente alti (5,9 ± 1,5 è 6,2 ± 1,5, rispettivamente).U genu endoglucan-1,3-β-glucosidase-like TanjilG_23384 mostrò una alta attivazione in i primi dui punti di tempu (6 è 12 hpi) in tutti i linii eccettu a pupulazione 22660 (Fig. 6d).I più alti livelli di espressione relative di TanjilG_23384 sò stati osservati à u sicondu puntu di tempu (12 hpi) in Mandelup (2.7 ± 0.3) è 83A: 476 (1.5 ± 0.1).À 24 HPI, l'espressione TanjilG_23384 era relativamente bassu in tutte e linee studiate (da 0.04 ± 0.009 à 0.44 ± 0.12).
Profili d'espressione di geni selezziunati (ag) rivelati da PCR quantitativa.I numeri 6, 12 è 24 rapprisentanu ore dopu a vaccinazione.I geni LanDExH7 è LanTUB6 sò stati usati per a normalizazione è LanTUB6 hè stata utilizata per a calibrazione inter-serie.E barre d'errore rapprisentanu a deviazione standard basata nantu à trè replicati biologichi, ognunu di i quali hè a media di trè replicati tecnichi. U significatu statisticu di e diffirenzii in i livelli d'espressione trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, ottenuta in u 1999 da u campu di lupini in Wierzenica, Pulonia) è di cuntrollu (innoculate simulate) sò marcati sopra i punti di dati (* valore P < 0.05, ** valore P ≤ 0.0.0. U significatu statisticu di e diffirenzii in i livelli d'espressione trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, ottenuta in u 1999 da u campu di lupini in Wierzenica, Pulonia) è di cuntrollu (innoculate simulate) sò marcati sopra i punti di dati (* valore P < 0.05, ** valore P ≤ 0.0.0. Статистическая значимость различий в уровнях экспрессии между инокулированными (Colletotrichum lupini, муш-0 прессии 1999 г. с поля люпина в Верженице, Польша) и контрольными (ложно инокулированными расодим ными) и данных (*значение P < 0,05, **значение P ≤ 0,01, ***значение P ≤ 0,001). Differenze statisticamente significative in i livelli d'espressione trà e piante inoculate (Colletotrichum lupini, cepa Col-08, ottenuta in u 1999 da un campu di lupini in Wierzhenice, Polonia) è di cuntrollu (sham-inoculated) sò nutate sopra à i punti di dati (* P value < 0.05, **P-value ≤ 0.0.0, ≤ 0.0.接种（Colletotrichum lupini，Col-08株，1999年从波兰Wierzenica的羽扇豆田获得）和对照（模拟照（模拟掉模拟掉波艇豆田获得）水平差异的统计学显着性标记在数据点上方（*P值< 0.05, **P 值≤ 0.01, ***P 值≤ 〼≤ 0.01)接种 （colletotrichum lupini ， color-08 株 ， 1999 年 波兰 波兰 wierzenica 的 羽扇 获得） 和 对照 秉 波兰平 差异 的 统计学 显着性 标记 数据点 上方*p 值 <0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001)。 Colletotrichum lupini олей люпина в Верженице, Польша, в 1999 г.) и контрольными (ложно инокулированыными толированымитето расимы нымитон растрольными) ми данных (* значение P < 0,05, ** P-значение ≤ 0,01, ***P-значение ≤ 0,001). Differenze statisticamente significativa in i livelli di espressione trà i pianti inoculati (Colletotrichum lupini, strain Col-08, ottenutu da i campi di lupini in Verzhenice, Pulonia, in 1999) è di cuntrollu (sham-inoculated) sò nutati sopra à i punti di dati (* P value < 0.05, **P-value ≤ 0.01, ≤ 0.0-0.I linii NLL analizati eranu: 83A: 476 (resistenti, chì portanu l'allele omozigote Lanr1), Mandelup (moderatamente resistente, chì porta l'allele homozygous AnMan), Boregine (resistente, fondo geneticu scunnisciutu) è pupulazione 22660 (susceptible).
U genu candidatu TanjilG_05042 à u locu Lanr1 hà dimustratu un mudellu di espressione marcatamente sfarente da i profili ottenuti da studii RNA-seq (Fig. 6e).L'attivazione significativa di stu genu hè stata osservata in Mandelup è a pupulazione 22660 (finu à 39,7 è 11,7 volte, rispettivamente), chì risultanu in livelli d'espressione relativamente alti (finu à 1,4 ± 0,14 è 7,2 ± 1,3, rispettivamente).83A: 476 hà ancu revelatu una certa regulazione di u genu TanjilG_05042 (finu à 3,8 volte), però, i livelli di espressione relative ottenuti (0,044 ± 0,002) eranu più di 30 volte più bassi di quelli osservati in Mandelup è a pupulazione 22660.analizatu da qPCR hà dimustratu differenzi significativi in ​​i livelli di espressione trà i genotipi in varianti mock-vaccinated (cuntrollu), righjunghjendu una diferenza di 58 volte trà e populazioni 22660 è 83A: 476, è ancu trà e populazioni 22660 è 22660. Una diferenza duie volte hè stata ottenuta trà Boregine è Mandalup.
U genu candidatu à u locu AnMan, TanjilG_12861, hè stata attivata in risposta à a vaccinazione in 83A: 476 è Mandelup, era neutrali in a pupulazione 22660, è era downregulated in Boregine (Fig. 6f).L'espressione relative di u genu TanjilG_12861 era a più alta in 83A inoculata: 476 (0.14±0.01).U 17.4 kDa class I heat shock protein gene TanjilG_05080 HSP17.4 dimustrava livelli di spressione relative più bassi in tutti i ceppi studiati è i punti di tempu (Fig. 6g).U valore più altu hè statu osservatu à 24 HPI in a pupulazione 22660 (0,14 ± 0,02, un aumentu di ottu volte in risposta à a vaccinazione).
A comparazione di i profili di l'espressione genica (Fig. 7) hà revelatu una alta correlazione trà TanjilG_10657 è quattru altri geni: TanjilG_27015 (r = 0.89), TanjilG_05080 (r = 0.85), TanjilG_05042 (r = 0.60.6G), è TanjilG_0.6G_0.Tali risultati ponu indicà a co-regulazione di questi geni durante e risposte di difesa.I geni TanjilG_12861 è TanjilG_23384 anu mostratu diversi profili di espressione cù valori di coefficienti di correlazione Pearson più bassi (da 0,08 à 0,43 è -0,19 à 0,28, rispettivamente) cumparatu cù altri geni.
E correlazioni trà i profili di espressione genica sò state rilevate cù PCR quantitativa.E seguenti linee di lupini narrowleaf sò state analizate: 83A: 476 (resistente, purtendu l'allele omozigote Lanr1), Mandelup (moderatamente resistente, purtendu l'allele omozigote AnMan), Boregine (resistente, genetica scunnisciuta), è Populazione 22660 (susceptible).Trè punti di tempu sò stati calculati (6, 12 è 24 ore dopu à l'inoculazione), cumpresi i pianti inoculati (Colletotrichum lupini, strain Col-08, ottenutu da i campi di lupini in Wierzhenice, Pulonia, in 1999) è di cuntrollu (sham-inoculated).A scala mostra u valore di u coefficient di correlazione di Pearson.
Basatu nantu à e dati ottenuti à 6 horsepower per inch, WGCNA hè statu realizatu nantu à 9981 DEG identificati paragunendu e piante inoculate è di cuntrollu per fucalizza nantu à e prime risposte di difesa (Tavola Supplementaria S12).Vinti-dui moduli di geni (clusters) sò stati truvati cù profili di espressione correlati (positivi o negativi) trà genotipi è varianti sperimentali. In media, i livelli di l'espressione genica eranu in ordine 83A: 476> Mandelup> Boregine> Populazione 22660 (in e duie varianti, però, sta tendenza era più forte in i pianti di cuntrollu). In media, i livelli di l'espressione genica eranu in ordine 83A: 476> Mandelup> Boregine> Populazione 22660 (in e duie varianti, però, sta tendenza era più forte in i pianti di cuntrollu). В среднем уровни экспрессии генов снижались в порядке 83A: 476 > Mandelup > Boregine > Populazione 22660 (в оботих, на дава нденция была сильнее у контрольных растений). In media, i livelli di espressione genica diminuite in l'ordine 83A: 476> Mandelup> Boregine> Populazione 22660 (in i dui varianti, però, sta tendenza era più forte in i pianti di cuntrollu).平均而言，基因表达水平按83A:476 > Mandelup > Boregine > Populazione 22660 的顺序下降（然而，在两缌在两缌在势在对照植物中更强）。平均 而 言 ， 基因 水平 按 按 83a: 476> mandelup> boregine> populazione 22660 的 顺序 下降 （， 在 筌 在 筏 下降 平均 而 言在 植物 中 更）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 В среднем уровни экспрессии генов снижались в ряду 83A:476 > Mandelup > Boregine > Populazione 22660 (однако в обтнади ция была сильнее у контрольных растений). In media, i livelli di espressione genica diminuite in a serie 83A: 476> Mandelup> Boregine> Populazione 22660 (in ogni modu, in e duie varianti, sta tendenza era più forte in i pianti di cuntrollu).A vaccinazione hà risultatu in upregulation di l'espressione genica, in particulare in i moduli 18, 19, 14, 6 è 1 (in ordine decrescente di l'effettu), regulazione negativa (per esempiu, i moduli 9 è 20) o cù effetti neutri (per esempiu, i moduli 11, 22, 8 è 13).L'analisi di arricchimentu di termine GO (Tabella Supplementaria S13) hà revelatu "GO: 0006952 Risposte protettive" per u modulu inoculatu (18) cù l'attivazione massima, cumprese i geni analizati da qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657, 10657, 10657, 10657, 18657, 18657, 18657, 18657) s moduli (9).Module 18 concentrator (Fig. 8) hè statu identificatu cum'è u genu TanjilG_26536 chì codifica a proteina LlR18B PR-10-like, è u modulu 9 concentrator hè statu identificatu cum'è u genu TanjilG_28955 chì codifica a proteina PsbQ photosystem II.Un candidatu genu di resistenza à l'antracnosi Lanr1, TanjilG_05042, hè statu truvatu in u modulu 22 (Fig. 9) è hè assuciatu cù i termini "GO: 0044260 Cellular macromolecular metabolic processes" è "GO: 0006355 Transcriptional regulation, DNA templating" chì porta u TanjilG_01212 hub.u gene codifica u fattore di trascrizione di stress termico A-4a (HSFA4a).
Analisi di rete ponderata di coespressione genica di moduli cù termini di prucessu biologicu sovrarappresentatu "GO: 0006952 Risposte di difesa".A ligazione hè stata simplificata per mette in risaltu i quattru geni analizati da qPCR (TanjilG_04706, TanjilG_23384, TanjilG_10657 è TanjilG_27015).
Analisi di a rete ponderata di a co-espressione genica di un modulu cù un terminu di prucessu biologicu sovrarappresentatu "GO: 0006355: Regulazione di trascrizione, DNA Templating" è chì porta un candidatu genu di resistenza à l'antracnosi Lanr1 TanjilG_05042.A ligazione hè stata simplificata per isolà u genu TanjilG_05042 è u genu TanjilG_01212 centrale.
U screening di resistenza à l'antracnosi cullucatu in Australia hà dimustratu chì a maiò parte di i primi cultivati ​​liberati eranu suscettibili;Kalya, Coromup è Mandelup sò stati scritti cum'è moderatamente resistenti, mentri Wonga, Tanjil è 83A: 476 sò stati scritti cum'è assai resistenti26,27,31.avia u listessu allele di resistenza, designatu Lanr1, è Coromup è Mandelup avianu un allele sfarente, designatu AnMan10, 26, 39, mentre chì Kalya passava un allele sfarente., Lanr2.U screening per a resistenza à l'antracnosi in Germania hà risultatu in l'identificazione di una linea resistente Bo7212 cù un allele candidatu altru da Lanr1, designatu LanrBo36.
U nostru studiu hà revelatu una freccia assai bassa (circa 6%) di l'allelu Lanr1 in u germoplasma testatu.Questa osservazione hè coherente cù i risultati di u screening di u germoplasma d'Europa di l'Est utilizendu i marcatori Anseq3 è Anseq4, chì anu dimustratu chì l'allele Lanr1 hè presente in solu duie linee bielorusse.Questu suggerisce chì l'allelu Lanr1 ùn hè micca ancu largamente utilizatu da i prugrammi di ripruduzzione lucali, à u cuntrariu di l'Australia, induve hè unu di l'alleli chjave per a ripruduzzione assistita da marcatore.Questu pò esse dovutu à u livellu più bassu di resistenza furnitu da l'allelu Lanr1 in e cundizioni di u campu europeu cumparatu cù u rapportu australianu.Inoltre, studii di l'antracnosi in i zoni d'alta precipitazione in Australia anu dimustratu chì e risposti di resistenza mediate da l'allelu Lanr1 ùn pò micca esse efficace in e cundizioni climatichi chì favurizanu a crescita è u sviluppu rapidu di u patogenu19,42.Infatti, in u presente studiu, certi sintomi di l'antracnosi sò stati ancu osservati in i genotipi chì portanu l'allelu Lanr1, chì suggerenu chì a resistenza pò sparisce in cundizioni ottimali per u sviluppu di C. lupini.Inoltre, interpretazioni falsi pusitivi di a presenza di marcatori Anseq3 è Anseq4, chì sò circa 1 cM da u locu Lanr1, sò pussibuli 28,30,43.
U nostru studiu hà dimustratu chì 83A: 476, purtendu l'allelu Lanr1, hà rispostu à l'inoculazione di C. lupini cù reprogrammazione di transcriptome à grande scala à u primu puntu di tempu analizatu (6 hpi), mentre chì in Mandelup, purtendu l'allelu AnMan, risposti transcriptomic sò stati osservati assai più tardi.(da 24 à 48 hp).Queste variazioni tempurali in risposti di difesa sò assuciati cù differenzi in i sintomi di a malatia, chì mette in risaltu l'impurtanza di a ricunniscenza di i patogeni precoci per una risposta riescita à a resistenza.Per infettà u tessulu di a pianta, i spori di l'antrax anu da passà per parechje tappe di sviluppu nantu à a superficia di l'ospiti, cumprese a germinazione, a divisione cellulare è a furmazione di un appressoriu.Un appendice hè una struttura infettiva chì si attacca à a superficia di l'ospiti è facilita a penetrazione in i tessuti di l'ospiti.Cusì, i spori di C. gloeosporioides in l'extracte di piselli mostranu a prima divisione di u nucleu dopu à 75-90 minuti d'incubazione, a furmazione di un tubu germinatu dopu à 90-120 minuti, è a suppressione dopu à 4 ore 45 .Mango C. gloeosporioides hà dimustratu più di 40% di germinazione conidiale dopu à 3 ore d'incubazione è circa 20% di furmazione di appressori dopu à 4 ore.U genu CAP20 assuciatu à a virulenza di C. gloeosporioides hà dimustratu l'attività di transcriptional in conidia epiphyte-forming after 3.5 h incubation in avocado surface wax with high concentrations of CAP20 protein after 4 h 46 min.In listessu modu, l'attività di i geni di biosintesi di melanina in C. trifolii hè stata indutta durante una incubazione di 2 ore seguita da a furmazione di un appressoriu dopu à 1 ora.I studii di i tessuti di foglie anu dimustratu chì e fragole inoculate cù C. acutatum anu prima suppressione à 8 hpi, mentri i pumati inoculati cù C. coccodes anu prima suppressione à 4 hpi48,49.largement cohérent avec l'échelle de temps de Colletotrichum spp.prucessu infettivu.Risposti rapidi di difesa à 83A: 476 suggerenu l'implicazione di i geni di resistenza di a pianta è di l'immunità attivata da l'effettu (ETI) in questa linea, mentre chì i risposti ritardati di Mandelup sustenenu l'ipotesi di l'immunità (MTI) micro-associated pattern-triggered 50. I primi risposti à 83A: 476 è Mandelup.A sovrapposizione parziale trà i geni regulati in up-or down-regulated in a risposta ritardata sustene ancu stu cuncettu, cum'è ETI hè spessu cunsideratu cum'è una risposta MTI accelerata è rinfurzata chì culmina in a morte cellulare programata in u situ di l'infezzione, cunnisciutu com'è scossa anafilattica 51,52.
A maiò parte di i geni attribuiti à u termu sovrappresentatu Gene Ontology GO: 0006952 "Defense Response" sò l'omologu 11 di a proteina 22 di u messagiu di digiunu induvatu da stress (simile à SAM22) è i sette maiò di proteini di lattice (MLP).-like prutiìni 31, 34, 43 è 423 dimustrau sequenza similarità.I geni simili à SAM22 dimustranu una attivazione significativa chì durò più longu, chì mostra livelli aumentati di resistenza à l'antracnosi (83A: 476 è Boregine).Tuttavia, i geni simili à MLP sò stati rigulati solu in e linee chì portanu l'allele di resistenza candidatu (83A: 476 / Lanr1 à 6 hpi è Mandelup / AnMan à 24 hpi).Hè da nutà chì tutti l'omologi simili à SAM22 identificati sò urigginati da un cluster di geni chì spannendu circa 105 kb, mentre chì i geni simili à MLP originanu da regioni separate di u genoma.L'attivazione coordinata di tali genesi simili à SAM22 hè stata ancu truvata in u nostru studiu precedente di a resistenza di NLL à l'inoculazione di Diaporthetoxica, chì suggerenu chì sò implicati in i cumpunenti horizontali di a risposta di difesa.Questa cunclusione hè ancu sustinuta da i rapporti di una risposta positiva di i geni simili à SAM22 à ferite o trattamentu cù l'acidu salicylic, induttori fungi, o perossu di l'idrogenu.
I geni simili à MLP sò stati dimustrati per risponde à diversi stress abiotici è biotici, cumprese infezioni fungali batteriche, virali è patogeniche in parechje spezie vegetali55.A direzzione di risposta à certe interazzione trà e piante è i patogeni varianu da una forte crescita (vale à dì, durante l'infestazione di u cuttuni cù Verticillium dahliae) à una diminuzione significativa (vale à dì, dopu l'infezzione di l'arbulu cù Alternaria spp.)56,57.Un downregulation significativu di u genu MLP-like 423 hè statu osservatu durante i difesi di l'avocado à l'infezzione da F. niger è durante l'infezzione di u pomu Botryosphaeria berengeriana f.cn.piricola è Alternaria alternata sò patotipi di mela58,59.Inoltre, i calli di mela chì sopraesprimenu u genu MLP-like 423 avianu una espressione più bassa di geni associati à a resistenza è eranu più suscettibili à l'infezione fungica59.Dopu à Fusarium oxysporum f, u genu MLP-like 423 hè statu ancu supprimitu in u germoplasma di fagioli cumuni resistenti.cn.Infezzione di fagioli 60.
Altri membri di a famiglia PR-10 identificati in u nostru studiu RNA-seq eranu i geni LlR18A è LlR18B in risposta à l'upregulation, è ancu u genu upregulated (1 gene) o downregulated (3 genes) per a proteina di trasferimentu di lipidi DIR1..Inoltre, WGCNA mette in risaltu u genu LlR18B cum'è un centru in stu modulu, chì hè assai suscettibile à a vaccinazione è porta parechji geni di risposta protettiva.I geni LlR18A è LlR18B sò stati indotti in foglie di lupini gialli in risposta à i batteri patogeni, è ancu in steli di NLL dopu l'inoculazione di D. toxica, mentre chì l'omologu di risu di sti geni, RSOsPR10, hè statu indottu rapidamente da una infezzione fungica presumibilmente implicata in u trasportu di l'acidu jasmonicu, chì signala a proteina D.163. s chì sò necessarii per l'iniziu di a resistenza sistemica acquistata (SAR).Cù u sviluppu di reazzione protettiva, a proteina DIR1 hè trasportata da u focu di l'infezzione attraversu u floema per induce SAR in organi distanti.Curiosamente, u genu TanjilG_02313 DIR1 hè statu indottu significativamente à u primu puntu di tempu in i linii 84A: 476 è Populazione 22660, ma a resistenza à l'antracnosi hà sviluppatu successu solu in a linea 84A: 476.Questu pò indicà una certa subfunctionalization di u genu DIR1 in NLL, postu chì i trè omologhi rimanenti rispundenu à l'inoculazione solu in a linea 83A: 476 à 6 hpi, è sta risposta hè stata diretta à u bassu.
In u nostru studiu, i cumpunenti più cumuni chì currispondenu à u prucessu biologicu chjamatu "GO: 0055114 Redox process" eranu cytochrome P450 protein, peroxidase, acid linoleic 9S-/13S-lipoxygenase, è 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase.Inoltre, u nostru WGCNA definisce l'omologu HSFA4a cum'è un hub chì porta moduli cum'è u candidatu di u gene di resistenza Lanr1 TanjilG_05042.HSFA4a hè un cumpunente di a regulazione dipendente da redox di a trascrizione nucleare in e piante.
I proteini di u citocromu P450 sò ossidorduttasi chì catalizzanu e reazioni di idrossilazione dipendenti da NADPH è / o O2 in u metabolismu primariu è secundariu, cumpresu u metabolismu di xenobiotici, è ancu hormone, acidi grassi, steroli, cumpunenti di u muru cellulare, biopolimeri, è a biosintesi di a prutezzione protettiva. d from -10.6 log2 (fold change) à 5.7 a causa di un gran numaru di omologu alterati (37) è differenze in mudelli di risposta trà geni specifichi, riflettendu una rivisione upward..Aduprendu solu dati RNA-seq per elucidare a funzione biologica putativa di i geni NLL in una superfamiglia di proteine ​​​​tale grande seria altamente speculativa.Tuttavia, vale a pena nutà chì certi geni di citocromu P450 sò assuciati cù una resistenza aumentata à fungi o batteri patogeni, cumpresa una cuntribuzione à reazzioni allergii69,70,71.
I perossidasi di Classe III sò enzimi vegetali multifunzionali implicati in una larga gamma di prucessi metabolichi durante a crescita è u sviluppu di e piante, è ancu in risposta à stress ambientali cum'è a salinità, a siccità, l'alta intensità di luce è l'attaccu di patogeni72.Perossidasi sò implicati in l'interazzione di parechje spezie vegetali cù Anthracis, cumprese Stylosanthes humilis è C. gloeosporioides, Lens culinaris è C. truncatum, Phaseolus vulgaris è C. lindemuthianum, Cucumis sativus è C. lagenarium73,74,75,76.A risposta hè assai rapida, à volte ancu à 4 HPI, prima chì u fungus penetra in u tissue di a pianta73.U genu peroxidase hà ancu rispostu à l'inoculazione di D. toxica NLL.In più di e so funzioni tipiche per regulà u burst oxidative o eliminà u stress oxidative, peroxidases ponu interferiscenu cù a crescita di u patogenu creendu barriere fisiche basate nantu à u rinfurzamentu di u muru cellulare durante a lignificazione, subunità o cross-linking di composti specifichi.Questa funzione pò esse attribuita in silico à u genu TanjilG_03329 chì codifica una perossidasi anionica putativa chì formava lignina chì era significativamente upregulated in u nostru studiu in a linea resistente 83A: 476 à 6 HPI, ma micca in altri ceppi è punti di tempu chì ùn anu micca rispostu.
9S-/13S-lipoxygenase di l'acidu linoleicu hè u primu passu in a via oxidativa di a biosintesi di lipidi78.I prudutti di sta via anu parechje funzioni in a difesa di a pianta, cumpresu u rinfurzamentu di u muru cellulare per via di a furmazione di dipositi di callose è pectin, è a regulazione di l'estressi oxidativu per a produzzione di spezie reattive d'ossigenu79,80,81,82,83.In u presente studiu, l'espressione di l'acidu linoleicu 9S-/13S-lipoxygenase hè stata alterata in tutti i ceppi, ma in a pupulazione suscettibile 22660, l'upregulation prevaleva in diversi punti di u tempu, mentre chì in i ceppi chì portanu Lanr1 resistente è l'allele AnMan, enfatiza a diversificazione di l'ossilipina di a reazzione protettiva di l'antigena.
L'omologu 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase (ACO) era significativamente upregulated (9 genes) o downregulated (2 genes) quandu inoculatu cù lupinu.Cù duie eccezzioni, tutte sti risposti sò accaduti à 6 hp.à 83A:476.A reazione enzimatica mediata da e proteine ​​​​ACO hè u passu limitante di a rata in a produzzione di etilene è hè dunque altamente regulata84.L'etilene hè una hormona vegetale chì ghjoca una varietà di roli in a regulazione di u sviluppu di a pianta è a risposta à e cundizioni di stress abioticu è bioticu.L'induzione di a trascrizione ACO è l'attivazione di a via di signalazione di l'etilene sò implicati in l'aumentu di a resistenza di u risu à u fungus hemibiotrophic oryzae oryzae regulendu a produzzione di spezie di ossigenu reattivu è fitoalexini.Un prucessu d'infezzione di foglia assai simili truvata trà M. oryzae è C. lupini88,89, in u sfondate di un significativu upregulation di l'omologi ACO in a linea 83A: 476 riportata in stu studiu, cambia a pussibilità di cunferisce a resistenza à NLL antracnose Ethylene un passu cintrali di signalazione in i viaghji moleculari.
In u presente studiu, a suppressione à grande scala di parechji geni assuciati à a fotosintesi hè stata osservata à 6 hpi in 83A: 476 è à 48 hpi in Mandeloop è a pupulazione 22660.L'estensione è a progressione di sti cambiamenti hè proporzionale à u livellu.A resistenza à l'antracnosi hè stata osservata in questu esperimentu.Ricertamenti, a ripressione forte è precoce di e trascrizioni relative à a fotosintesi hè stata rappurtata in parechji mudelli di interazzione vegetale-patogenu, cumprese batteri patogeni è fungi.A fretta (da 2 HPI in alcune interazzione) è a suppressione glubale di i geni assuciati à a fotosintesi in risposta à l'infezzione ponu attivà l'immunità di a pianta basata nantu à l'implementazione di spezie reattive di l'ossigenu è a so interazzione cù a via di l'acidu salicylic per mediate reazzioni allergii 90,94.
In cunclusioni, i meccanismi di risposta di difesa pruposti per a linea più resistente (83A: 476) includenu a ricunniscenza rapida di u patogenu da u genu R (presumibilmente TIR-NBS-LRR TanjilG_05042) è l'acidu salicilicu è l'etilene mediate da a risposta allergica, seguita da stabilimentu di SAR à longu andà.L'azione hè supportata da a proteina DIR-1.Hè da nutà chì u periodu biotrophic per l'infezzione da C. lupini hè assai curtu (circa 2 ghjorni), seguitu da a crescita necrotica95.A transizione trà queste tappe pò esse assuciata cù necrosi è l'espressione di proteine ​​​​inducibili à l'etilene chì agiscenu cum'è triggers per reazzioni di ipersensibilità in i pianti ospiti.Per quessa, a finestra di u tempu per a cattura riescita di C. lupini in u stadiu biotrophic hè assai ristretta.A riprogrammazione di i geni assuciati cù redox è fotosintesi osservati in 83A: 476 à 6 hpi hè coherente cù a progressione di l'hyphae fungali è annuncia u sviluppu di una risposta protettiva riescita à u stadiu biotrophic.I risposti transcriptomic di Mandelup è a pupulazione 22660 pò esse troppu ritardatu per catturà u fungus prima di passà à a crescita necrotica, in ogni modu, Mandelup pò esse più efficau cà a pupulazione 22660 perchè a regulazione relativamente veloce di a proteina PR-10 prumove a resistenza horizontale.
ETI, guidata da u genu R canonicu, pare esse un mecanismu cumuni per a resistenza di fagioli à l'antracnose.Cusì, in u mudellu di legumi Medicago truncatula, a resistenza à l'antracnose hè cunferita da u genu RCT1, un membru di a classe di gene R di a pianta TIR-NBS-LRR97.Stu genu cunferisce ancu una resistenza à l'antracnosi di spettru largu in l'alfalfa quandu hè trasferitu à e piante suscettibili.In u fagiolu cumuni (P. vulgaris), più di duie duzina di geni di resistenza à l'antracnosi sò stati identificati finu à a data.Alcuni di questi geni si trovanu in regioni chì mancanu di geni R canonichi, ma assai altri sò situati à i bordi di i cromusomi chì portanu u gruppu di geni NBS-LRR, cumpresu TIR-NBS-LRRs99.U studiu di u genoma SSR hà ancu cunfirmatu l'associazione di u genu NBS-LRR cù a resistenza à l'antracnosi in u fagiolu cumuni.U genu R canonicu hè statu ancu truvatu in a regione genomica chì porta u locu di resistenza à l'antracnosi maiò in u lupinu biancu 101.
U nostru travagliu mostra chì una reazione di resistenza immediata, attivata in una prima fase di l'infezzione di a pianta (preferibile micca più tardi di 12 hpi), prutege efficacemente u lupinu strettu da l'antracnosi causata da u fungus patogenu Collelotrichum lupini.Utilizendu a sequenza di altu throughput, avemu dimustratu profili di espressione differenziale di geni di resistenza à l'antracnosi in e piante NLL mediate da i geni di resistenza Lanr1 è AnMan.A difesa di successu implica cuncepimentu currettamente di i geni per e proteine ​​​​involte in redox, fotosintesi è patogenesi in pochi ore da u primu cuntattu di a pianta cù un patogenu.E reazzioni protettive simili, ma ritardate in u tempu, sò assai menu efficaci in a prutezzione di e piante da e malatie.A resistenza di l'antrax mediata da u genu Lanr1 s'assumiglia à a risposta rapida tipica di u genu R (immunità attivata da l'effector), mentre chì u genu AnMan prubabilmente furnisce una risposta horizontale (immunità attivata da un mudellu moleculare assuciatu à u microbicu), chì furnisce un livellu moderatu di sustenibilità.
E 215 linee NLL utilizzate per u screening per i marcatori di l'antracnosi sò custituiti da 74 cultivars, 60 linii ottenuti da incruciamentu o ripruduzzione, 5 mutanti è 76 germoplasmi salvatichi o originali.E linee venenu da 17 paesi, principarmenti da Pulonia (58), Spagna (47), Germania (27), Australia (26), Russia (19), Bielorussia (7), Italia (5) è altre linee.da 10 paesi.U settore include ancu e linee resistenti di riferimentu: 83A: 476, Tanjil, Wonga chì porta l'allele Lanr1, è Mandelup chì porta l'allele AnMan.I linii sò stati ottenuti da a basa di dati di risorsa genetica europea di Lupine mantinuta da Poznań Plant Breeding Ltd., Wiatrowo, Pulonia (Table Supplementary S1).
I pianti sò cultivati ​​in cundizioni cuntrullati (fotoperiodu 16 ore, temperatura 25 ° C durante u ghjornu è 18 ° C à notte).Dui replicati biologichi sò stati analizati.L'ADN hè statu isolatu da foglie di trè settimane cù u DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania) secondu u protocolu.A qualità è a cuncentrazione di l'ADN isolatu hè stata valutata da metudi spettrofotometrici (NanoDrop 2000; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).U marcatu AnManM1 chì marca u genu di resistenza à l'antracnosi AnMan (derivatu da cv. Mandelup) è i marcatori Anseq3 è Anseq4 flanking u genu Lanr1 (derivatu da cv. Tanjil) sò stati analizati 11,26,28.L'omozigoti per l'allele resistente sò stati puntuati cum'è "1", suscettibile - cum'è "0" è eterozigoti - cum'è 0,5.
Basatu nantu à i risultati di screening per i marcatori AnManM1, AnSeq3 è AnSeq4 è a dispunibilità di sementi per l'esperimenti finali di seguitu, 50 linee NLL sò state scelte per u fenotipamentu di resistenza à l'antracnosi.L'analisi hè stata realizata in duplicate in una serra cuntrullata per computer cun un fotoperiodu di 14 ore cù una temperatura di 22 ° C durante u ghjornu è 19 ° C di notte.I Seeds sò scratched (tagliate u mantellu di a sumente nantu à u latu oppostu di l'embriione cù una lama affilata) prima di a simminzioni per prevene a dormancy di a sumente per via chì a sumente hè troppu dura è per assicurà a germinazione uniforme.I pianti sò cultivati ​​in pote (11 × 11 × 21 cm) cù terra sterile (TS-1 REC 085 Medium Basic, Klasmann-Deilmann Polska, Varsavia, Polonia).L'inoculazione hè stata fatta cù a ceppa Colletotrichum lupini Col-08, cultivata in u 1999 da i steli di e piante di lupini à foglie strette cultivate in un campu in Verzhenitsa, Greater Poland (52° 27′ 42″ N 17° 04′ 05″ E ).Pigliate una zona.L'isolati sò stati cultivati ​​in SNA medium à 20 ° C sottu u lume neru per 21 ghjorni per induce a sporulazione.Quattru settimani dopu à a simminzioni, quandu i pianti avianu righjuntu u stadiu di a foglia 4-6, l'inoculazione hè stata realizata spraying with a suspension of conidia à una cuncentrazione di 0,5 x 106 conidia per ml.Dopu a inoculazione, i pianti sò stati guardati in u bughju per l'ora di 24 à una umidità di circa 98% è una temperatura di 25 ° C per facilità a germinazione di conidia è u prucessu d'infezzione.I pianti sò poi cultivati ​​sottu un fotoperiodu di 14 ore à 22 ° C di ghjornu / 19 ° C di notte è 70% umidità.A puntuazione di a malatia hè stata fatta 22 ghjorni dopu l'inoculazione è varieghja da 0 (immune) à 9 (assai suscettibile) secondu a prisenza o l'absenza di lesioni necrotiche nantu à steli è foglie.Inoltre, dopu à scoring, u pesu di e piante hè stata misurata.E relazioni trà i genotipi di marcatori è i fenotipi di e malatie sò stati calculati cum'è correlazioni puntuali di duie sequenze (assenza di marcatori eterozigoti in u settore di linee per l'analisi di u fenotipu di resistenza à l'antracnosi).