Děkujeme, že jste navštívili Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu pro CSS. Abyste dosáhli co nejlepšího zážitku, doporučujeme vám používat aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v Internet Exploreru). Abychom zajistili nepřetržitou podporu, budeme web mezitím zobrazovat bez stylů a JavaScriptu.
Morfogeneze lidského střeva vytváří rysy krypt-klků 3D epiteliální mikroarchitektury a prostorové organizace. Tato jedinečná struktura je nutná k udržení homeostázy střeva tím, že chrání niku kmenových buněk v bazální kryptě před exogenními mikrobiálními antigeny a jejich metabolity. Kromě toho střevní klky a sekreční sliz přítomné na povrchu střevních slizničních buněk funkčně diferencovaných pro epiteliální bariéru a epiteliální bariéru teliální struktury jsou klíčové pro konstrukci střevních modelů in vitro. Zejména organické mimetické gut-on-a-chip může vyvolat spontánní 3D morfogenezi střevního epitelu se zlepšenými fyziologickými funkcemi a biomechanikou. Zde poskytujeme reprodukovatelný protokol pro robustní indukci střevní morfogeneze ve střevě pro hybridní čip i mikrofluiční metody, stejně jako metody kultivace mikroflui Caco-2 nebo intestinálních organoidních epiteliálních buněk v konvenčním prostředí i na mikrofluidní platformě, indukce 3D morfogeneze a charakterizace vytvořeného 3D epitelu pomocí více zobrazovacích modalit. Tento protokol dosahuje regenerace funkční střevní mikroarchitektury řízením bazolaterálního průtoku tekutiny po dobu 5 dnů. Naše metoda in vitro a nevyužívá fyziologický a fyziologický fyziologický pohyb, který může vyžadovat fyziologický pohyb a morfogenezi, vyžaduje regeneraci provádět další existující techniky. Předpokládáme, že náš navrhovaný protokol by mohl mít široké důsledky pro biomedicínskou výzkumnou komunitu, protože poskytuje metodu pro regeneraci 3D střevních epiteliálních vrstev in vitro pro biomedicínské, klinické a farmaceutické aplikace.
Experimenty ukazují, že střevní epiteliální buňky Caco-2 kultivované ve střevech na čipu1,2,3,4,5 nebo dvouvrstvých mikrofluidních zařízeních6,7 mohou podstoupit spontánní 3D morfogenezi in vitro bez jasného pochopení základního mechanismu. V naší nedávné studii jsme zjistili, že odstranění bazolaterálně sekretovaných antagonistů morfogenu z kultivačních zařízení incolimorphal je nezbytné a dostatečné. -2 a střevní organoidy odvozené od pacienta.Epiteliální buňky byly validovány. V této studii jsme se konkrétně zaměřili na buněčnou produkci a distribuci koncentrace silného antagonisty Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), ve střevech na čipu a modifikovaných mikrofluidních zařízeních obsahujících vložky Transwell, nazývané „Hybrid Chip“. y-1) do střeva na čipu inhibuje morfogenezi nebo narušuje předstrukturovanou 3D epiteliální vrstvu, což naznačuje, že antagonistický stres během kultivace je odpovědný za střevní morfogenezi in vitro. Praktickým přístupem k dosažení robustní morfogeneze na epiteliálním rozhraní je proto odstranění nebo minimální udržování hladin Wantagonisty Wnt-on-on-eg v aktivním hybridním kompartmentu nebo flushingu v basgitálním -platformy na čipy) nebo difúze .Bazolaterální média (např. z Transwell vložek do velkých bazolaterálních rezervoárů v jamkách).
V tomto protokolu poskytujeme podrobnou metodu pro výrobu mikrozařízení gut-on-a-chip a Transwell vložitelných hybridních čipů (kroky 1-5) pro kultivaci střevních epiteliálních buněk na porézních membránách na bázi polydimethylsiloxanu (PDMS) (kroky 6A, 7A, 8, 9) nebo polyesterových membránách vložek Transwell, indukovaných morfogenesis7B (kroky 3D indukované morfogenesis7B) in vitro (krok 10). Také jsme identifikovali buněčné a molekulární rysy indikující tkáňově specifickou histogenezi a buněčnou diferenciaci závislou na linii použitím více zobrazovacích modalit (kroky 11-24). Morfogenezi indukujeme pomocí lidských střevních epiteliálních buněk, jako je Caco-2 nebo střevní organoidy, ve dvou formátech kultury s reporézními technickými detaily povrchové biochemické modifikace a chemické modifikace povrchu D mechanické mikroprostředí.in vitro.K indukci 3D morfogeneze z 2D epiteliálních monovrstev jsme odstranili antagonisty morfogenu v obou kultivovaných formách prouděním média do bazolaterálního kompartmentu kultury.Nakonec poskytujeme reprezentaci užitečnosti regenerovatelné 3D epiteliální vrstvy, kterou lze použít k modelování morfogenu-zánětlivého růstu-zánětlivého podélného epiteliálního poškození hostitele, podélné epiteliální infekce závislé na epitelu dysfunkce liální bariéry a probiotické terapie Příklad.vlivy.
Náš protokol může být užitečný širokému spektru vědců v základním (např. střevní slizniční biologie, biologie kmenových buněk a vývojové biologii) a aplikovaném výzkumu (např. preklinické testování léků, modelování onemocnění, tkáňové inženýrství a gastroenterologie) s širokým dopadem. Vzhledem k reprodukovatelnosti a robustnosti našeho protokolu k navození 3D morfogeneze střevního epitelu dokážeme disponovat dynamickou buněčnou strategii šíření in vitro Kromě toho je náš protokol užitečný pro vyšetřování infekce pod různými infekčními agens, jako je Norovirus 8, závažný akutní respirační syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 nebo Vibrio cholerae.Užitečné jsou také posluchače patologie a patogeneze onemocnění. Použití systému střevní mikrofyziologie na čipu může umožnit podélnou společnou kultivaci 10 a následné hodnocení obrany hostitele, imunitních odpovědí a opravy poranění souvisejících s patogenem v gastrointestinálním traktu (GI) 11 .Další poruchy GI spojené se syndromem prosakujícího střeva, celiakií, Crohnovou chorobou3, ulcerózním onemocněním střev, může jít o vředovou chorobu tlustého střeva, ulcerózní zánět tlustého střeva, simulovanou střevní zánět teliální vrstvy jsou připravovány pomocí pacientových 3D střevních epiteliálních vrstev, mezi tato onemocnění patří atrofie klků, zkrácení krypt, poškození sliznice nebo narušená epiteliální bariéra. Biopsie nebo střevní organoidy odvozené z kmenových buněk12,13. Pro lepší modelování vyšší složitosti prostředí onemocnění mohou čtenáři zvážit přidání pro nemoc relevantních buněk střeva obsahujících pro onemocnění typy buněk periferní krve, jako jsou mononukleární buňky pacientů s mikronukleárními krevními buňkami, např. tectures.tkáňově specifické imunitní buňky, 5.
Vzhledem k tomu, že 3D epiteliální mikrostrukturu lze fixovat a vizualizovat bez procesu dělení, diváky pracující na prostorové transkriptomice a zobrazování s vysokým rozlišením nebo s vysokým rozlišením může zajímat naše mapování časoprostorové dynamiky genů a proteinů na epiteliálních výklencích.Zajímá se o technologii. Reakce na mikrobiální nebo imunitní podněty. Kromě toho lze ve 3D vrstvě střevní sliznice vytvořit podélné přeslechy hostitel-mikrobiom 10, 14, které koordinují střevní homeostázu, společnou kultivací různých mikrobiálních druhů, mikrobiálních komunit nebo fekální mikroflóry, zejména ve střevech.na platformě.Tento přístup je zvláště atraktivní pro posluchače studující slizniční imunologii, gastroenterologii, lidský mikrobiom, kulturomiku a klinickou mikrobiologii, kteří chtějí kultivovat dříve nekultivovanou střevní mikroflóru v laboratoři. Pokud lze náš protokol morfogeneze in vitro přizpůsobit škálovatelným formátům kultury, jako jsou vícejamkové vložky v 24, 96 nebo 384 kompartmentech, které mohou být kontinuálně vyvíjeny i ty basolaterální plotny, aby mohly být dobře rozloženy. farmaceutické, biomedicínské nebo vysoce výkonné screeningové nebo validační platformy pro potravinářský průmysl. Jako důkaz principu jsme nedávno prokázali proveditelnost multiplexního vysoce výkonného systému morfogeneze škálovatelného na formát 24jamkových destiček. Kromě toho bylo komercializováno několik produktů typu orgán na čipu16,17,18. Proto je možné urychlit validaci našeho potenciálu v laboratoři mnoha výzkumnými metodami. laboratoře, průmysl nebo vládní a regulační agentury, aby porozuměly buněčnému přeprogramování in vitro střevní morfogeneze na transkriptomické úrovni za účelem testování léků nebo bioterapeutik Absorpce a transport kandidátních léků byla hodnocena pomocí 3D střevních náhrad nebo pomocí vlastních nebo komerčních modelů orgán na čipu k posouzení reprodukovatelnosti procesu morfogeneze střeva.
Ke studiu morfogeneze střevního epitelu byl použit omezený počet experimentálních modelů relevantních pro člověka, zejména kvůli nedostatku implementovatelných protokolů pro indukci 3D morfogeneze in vitro. Ve skutečnosti je velká část současných znalostí o morfogenezi střeva založena na studiích na zvířatech (např. zebrafish20, myši21 nebo kuřata22). přesně určují lidské vývojové procesy.Tyto modely jsou také velmi omezené, pokud jde o jejich schopnost být testována vícenásobně škálovatelným způsobem. Proto náš protokol pro regeneraci 3D tkáňových struktur in vitro překonává in vivo zvířecí modely i jiné tradiční statické 2D modely buněčných kultur. Jak již bylo popsáno dříve, využití 3D epiteliálních struktur nám umožnilo zkoumat prostorovou lokalizaci různých 3D epitelových slizničních nebo stimulovaných imunitních epitelů. liální vrstvy mohou poskytnout prostor pro studium toho, jak mikrobiální buňky soutěží o vytváření prostorových výklenků a ekologickou evoluci v reakci na hostitelské faktory (např. vnitřní versus vnější vrstvy hlenu, sekrece IgA a antimikrobiálních peptidů). Kromě toho nám 3D epiteliální morfologie může umožnit pochopit, jak střevní mikroflóra strukturuje svá společenství a synergicky vytváří mikrobiální organizaci v buněčných metabolitech s krátkým bazálním metabolitem (např. s. Tyto vlastnosti lze prokázat pouze tehdy, když jsou 3D epiteliální vrstvy vytvořeny in vitro.
Kromě naší metody vytváření 3D střevních epiteliálních struktur existuje několik metod in vitro. Kultivace střevních organoidů je nejmodernější technika tkáňového inženýrství založená na kultivaci střevních kmenových buněk za specifických morfogenních podmínek. protože mikrobiální buňky nebo exogenní antigeny jsou omezené.Přístup k organoidním lumenům lze zlepšit pomocí mikroinjektoru26,27, ale tato metoda je invazivní a pracná a vyžaduje specializované znalosti. Kromě toho tradiční kultury organoidů udržované v hydrogelových lešeních za statických podmínek přesně neodrážejí aktivní biomechaniku in vivo.
Jiné přístupy používané několika výzkumnými skupinami využívají předstrukturované 3D hydrogelové lešení k napodobení struktury střevního epitelu kultivací izolovaných lidských střevních buněk na povrchu gelu. Vyrobte hydrogelové lešení pomocí 3D tištěných, mikrofrézovaných nebo litograficky vyrobených forem. Tato metoda ukazuje samoorganizované uspořádání izolovaných epiteliálních buněk s vysokým gradientem epiteliálních a stromogenních spektrálních gradientů. a-epiteliální přeslech zahrnutím stromálních buněk do lešení. Povaha předstrukturovaných skeletů však může bránit zobrazení samotného spontánního morfogenetického procesu. Tyto modely také neposkytují dynamický luminální nebo intersticiální tok, postrádají smykový stres tekutiny, který střevní buňky potřebují k morfogenezi a získání fyziologické funkce střevních struktur. Myší střevní organoidy sledují vyleptané vzory a vytvářejí střevní tubulární struktury a intraluminální proudění tekutiny lze rekapitulovat pomocí modulu mikrofluidiky. Tento model však nevykazuje spontánní morfogenetické procesy ani nezahrnuje střevní mechanobiologické pohyby. Techniky 3D tisku ze stejné skupiny dokázaly vytvořit miniaturní střevní trubičky se spontánními morfogenetickými procesy. deformace. Kromě toho může být funkčnost modelu omezena, zejména po dokončení procesu biotisku, což narušuje experimentální podmínky nebo interakce mezi buňkami. Namísto toho náš navrhovaný protokol poskytuje spontánní morfogenezi střeva, fyziologicky relevantní smykové napětí, biomechaniku, která napodobuje motilitu střeva, dostupnost nezávislých apikálních a bazolaterálních kompartmentů, a pro biologickou re-tvorbu našeho mikroenviogenního komplexu Protokol esis může poskytnout doplňkový přístup k překonání problémů existujících metod.
Náš protokol je zcela zaměřen na 3D epiteliální morfogenezi, s pouze epiteliálními buňkami v kultuře a žádnými dalšími typy okolních buněk, jako jsou mezenchymální buňky, endoteliální buňky a imunitní buňky. Jak již bylo popsáno dříve, jádrem našeho protokolu je indukce epiteliální morfogeneze odstraněním inhibitorů morfogenů vylučovaných na bazolaterální a hybridní straně zavedeného robustního modulárního média. a-chip nám umožňuje znovu vytvořit zvlněnou 3D epiteliální vrstvu, další biologické komplexy, jako jsou epiteliálně-mezenchymální interakce33,34, ukládání extracelulární matrice (ECM) 35 a v našem modelu znaky krypt-klků, které přenášejí výklenky kmenových buněk v bazálních kryptách, je třeba dále zvážit. střevní morfogeneze in vivo35,37,38.Přidání mezenchymálních buněk k našemu modelu posílilo morfogenetický proces a účinnost přichycení buněk. Endoteliální vrstva (tj. kapiláry nebo lymfatika) hraje důležitou roli v regulaci molekulárního transportu39 a náboru imunitních buněk40 ve střevním mikroprostředí.Kromě toho, které mohou být navrženy jako modely interakcí mezi tkáňovými preparáty, prokazují, že modely interakcí s více orgány jsou pro tkáňové modely propojeny Může být nutné zahrnout endoteliální buňky, aby bylo možné modelovat přesnější fyziologické rysy s rozlišením na úrovni orgánu. Imunitní buňky získané od pacienta jsou také nezbytné pro zobrazování vrozených imunitních reakcí, prezentace antigenu, vrozeného adaptivního imunitního přeslechu a tkáňově specifické imunity v kontextu napodobování střevních onemocnění.
Použití hybridních čipů je přímočařejší než gut-on-a-chip, protože nastavení zařízení je jednodušší a použití vložek Transwell umožňuje škálovatelnou kultivaci střevního epitelu. Komerčně dostupné vložky Transwell s polyesterovými membránami však nejsou elastické a nemohou simulovat pohyby podobné peristaltice. Navíc apikální oddíl hybridní, transwellové vložky zůstaly bez napětí umístěné ve stanici čipu. vlastnosti v apikálním kompartmentu jen zřídka umožňují dlouhodobou bakteriální kokultivaci v hybridních čipech. I když při použití hybridních čipů můžeme robustně indukovat 3D morfogenezi ve vložkách Transwell, nedostatek fyziologicky relevantní biomechaniky a apikální proudění tekutiny může omezit proveditelnost hybridních čipových platforem pro potenciální aplikace.
Kompletní rekonstrukce osy lidské krypty a klků v kulturách střeva na čipu a hybridů na čipu nebyly plně stanoveny. Vzhledem k tomu, že morfogeneze začíná z monovrstvy epitelu, 3D mikroarchitektury nemusí nutně poskytovat morfologickou podobnost s kryptami in vivo. Přestože jsme charakterizovali populaci proliferující bazální 3D epiteliální buňky oblasti krypt a klků nebyly jasně ohraničeny. Přestože vyšší horní kanály na čipu vedou ke zvýšení výšky mikroinženýrského epitelu, maximální výška je stále omezena na ~300–400 µm. Skutečná hloubka lidských střevních krypt v tenkém a tlustém střevě je ~135 µm a ~400 µm u tenkého střeva ~60 µm1 a výška 00 µm1.
Z hlediska zobrazování může být zobrazování 3D mikroarchitektur v superrozlišení in situ omezeno na střevo na čipu, protože požadovaná pracovní vzdálenost od čočky objektivu k epiteliální vrstvě je řádově několik milimetrů. K překonání tohoto problému může být zapotřebí vzdálený objektiv. Kromě toho vytváření tenkých řezů pro zobrazovací vzorky je pro přípravu vzorků s vysokou pružností, protože je náročná na vrstvu mikrovrstvy. nanesení střeva na čip zahrnuje trvalou adhezi mezi každou vrstvou, je extrémně náročné otevřít nebo odstranit horní vrstvu, aby se prozkoumala povrchová struktura epiteliální vrstvy. Například pomocí rastrovacího elektronového mikroskopu (SEM).
Hydrofobita PDMS byla omezujícím faktorem v mikrofluidních studiích zabývajících se hydrofobními malými molekulami, protože PDMS může nespecificky adsorbuje takové hydrofobní molekuly. Alternativy na PDMS lze považovat za internativně, jak se lze považovat Imize adsorpce hydrofobních molekul.
A konečně, naše metoda nebyla dobře charakterizována, pokud jde o poskytování vysoce výkonného screeningu nebo uživatelsky přívětivé experimentální platformy „jedna velikost pro všechny“. Současný protokol vyžaduje injekční pumpu na mikrozařízení, která zabírá místo v CO2 inkubátoru a zabraňuje experimentům ve velkém měřítku. Toto omezení lze výrazně zlepšit škálovatelností inovativních formátů kultury, které umožňují kontinuální a 264 dobře vložené a kontinuální odstraňování bazolaterálních médií).
K indukci 3D morfogeneze lidského střevního epitelu in vitro jsme použili mikrofluidní čipové střevní zařízení obsahující dva paralelní mikrokanály a elastickou porézní membránu mezi nimi, abychom vytvořili rozhraní lumen-kapilára. Také demonstrujeme použití jednokanálového mikrofluidního zařízení (hybridní čip), které zajišťuje kontinuální bazolaterální tok pod oběma polarizovanými epiteliálními buňkami na různých epiteliálních vložkách na různých epiteliálních vrstvách vypěstovaných v lidských epitelových vrstvách. lze demonstrovat aplikací směrové manipulace toku k odstranění antagonistů morfogenu z bazolaterálního kompartmentu. Celý experimentální postup (obrázek 1) se skládá z pěti částí: (i) mikrovýroba střevního čipu nebo vložitelného hybridního čipu Transwell (kroky 1-5; rámeček 1), (ii) příprava střevních epiteliálních buněk (buňky Caco-2 organoidů) nebo lidských střevních organoidů;boxy 2-5), (iii) kultivace střevních epiteliálních buněk na střevních čipech nebo hybridních čipech (kroky 6-9), (iv) indukce 3D morfogeneze in vitro (krok 10) a (v) ) k charakterizaci 3D epiteliální mikrostruktury (kroky 11-24). Nakonec byla navržena další kontrolní skupina, která byla prodiskutována validovanou účinností epitelu (viz níže). morfogeneze k prostorovým, časovým, podmíněným nebo procedurálním kontrolám.
Použili jsme dvě různé kultivační platformy: gut-on-a-chip s rovnými kanály nebo nelineárními stočenými kanály nebo hybridní čipy obsahující vložky Transwell (TW) v mikrofluidním zařízení, vyrobené tak, jak je popsáno v rámečku 1, a krok 1-5. a kultivační postup použitý v tomto protokolu.„In vitro morfogeneze“ ukazuje celkové kroky, ve kterých jsou Caco-2 nebo epiteliální buňky odvozené od organoidů kultivovány na střevním čipu nebo na Transwell vložkách hybridního čipu, následuje indukce 3D morfogeneze a vytvoření charakterizované střevní epiteliální struktury. Číslo kroku programu nebo číslo rámečku je zobrazeno pod každou šipkou, příklady zavedené epiteliální vrstvy, aplikace v aplikaci je možné použít jako příklad pro vytvoření epitelu. Aplikace v aplikaci studie střevní fyziologie, vytvoření hostitelských mikrobiomových ekosystémů a modelování onemocnění. Imunofluorescenční snímky v „Cell Differentiation“ ukazující jádra, F-aktin a MUC2 exprimované ve 3D Caco-2 epiteliální vrstvě generované na střevním čipu. Signalizace MUC2 je přítomna v pohárkových buňkách produkovaných mukózními buňkami a hlenem sekretovaným na obrázcích hlenu z hlenu. alic kyseliny a N-acetylglukosaminových zbytků pomocí fluorescenčního aglutininu z pšeničných klíčků. Dva překrývající se obrázky v „Host-Microbe Co-Cultures“ ukazují reprezentativní společné kultury hostitel-mikrobiom ve střevě na čipu. Levý panel ukazuje kokultivaci E. coli exprimující zelený fluorescenční protein (GFP) s 3 mikroinženýrstvím na pravém panelu EEPLICO. li kokultivované s 3D epiteliálními buňkami Caco-2, následované imunofluorescenčním barvením F-aktinem (červená) a jádry (modrá). Modelování onemocnění ilustruje zdravé versus prosakující střevo v čipech zánětu střeva pod fyziologickou expozicí bakteriálním antigenům (např. lipopolysacharid, LPS) a imunitním buňkám (např. PBMC;zelená). Buňky Caco-2 byly kultivovány, aby se vytvořila 3D epiteliální vrstva. Měřítko, 50 µm. Obrázky ve spodním řádku: „Diferenciace buněk“ upraveno se svolením z odkazu.2.Oxford University Press;Reprodukováno se svolením Ref.5.NAS;„Společná kultura hostitele a mikroorganismu“ upravena se svolením z ref.3.NAS;„Modelování onemocnění“ upraveno se svolením reference.5.NAS.
Jak čipy gut-on-chip, tak hybridní čipy byly vyrobeny pomocí replik PDMS, které byly vyjmuty ze silikonových forem měkkou litografií1,44 a vzorovány pomocí SU-8. Konstrukce mikrokanálů v každém čipu je určena s ohledem na hydrodynamiku, jako je smykové napětí a hydrodynamický tlak1,4,12. Původní návrh střeva, který se skládá ze dvou paralelních přímé mikrokanály se vyvinul do komplexního gut-on-a-chip (rozšířená data obr. 1b), který zahrnuje pár zakřivených mikrokanálů k vyvolání zvýšené doby setrvání tekutiny, nelineárních vzorců proudění a multiaxiální deformace kultivovaných buněk (obr. 2a–f) 12. Když složitější střevní biomechanika může být vybrána, je třeba zvolit komplexní konvoluci Uted Gut-Chip také silně indukuje 3D morfogenezi v podobném časovém rámci s podobným stupněm epiteliálního růstu ve srovnání s původním Gut-Chipem, bez ohledu na typ kultivované buňky. Pro indukci 3D morfogeneze jsou proto lineární a komplexní návrhy střev na čipu zaměnitelné.2a). Pro výrobu střeva na čipu byla připravená horní PDMS vrstva postupně napojena na porézní PDMS film a poté zarovnána se spodní PDMS vrstvou nevratným spojením pomocí koronového upravovače (obr. 2b–f). K výrobě hybridních čipů byly vytvrzené repliky PDMS napojeny na skleněné vložky a mikrosklíčka Datafluidic 2hten. Obr. 2). Proces lepení se provádí ošetřením povrchů repliky PDMS a skla ošetřením kyslíkovou plazmou nebo korónou. Po sterilizaci mikrofabrikovaného zařízení připojeného ke silikonové hadičce bylo zařízení připraveno k provedení 3D morfogeneze střevního epitelu (obrázek 2g).
a, Schematické znázornění přípravy dílů PDMS ze vzorovaných silikonových forem SU-8. Nevytvrzený roztok PDMS byl nalit do silikonové formy (vlevo), vytvrzen při 60 °C (uprostřed) a vyjmut z formy (vpravo). Deformovaný PDMS byl rozřezán na kusy a vyčištěn pro další použití.b, Fotografie silikonové formy PDMS použité k přípravě silikonové formy použité k výrobě MS porézní membrána.d, Série fotografií horních a dolních komponent PDMS a sestaveného intestinálního zařízení na čipu.e, Schéma vyrovnání horních, membránových a spodních komponent PDMS. Každá vrstva je nevratně spojena ošetřením plazmou nebo korónou. pro mikrofluidní buněčnou kulturu.Upravené střevo na čipu sestaveném se silikonovou hadičkou a injekční stříkačkou bylo umístěno na krycí sklíčko.Čipové zařízení bylo umístěno na víko Petriho misky o průměru 150 mm za účelem zpracování.Pojivo se používá k uzavření silikonové zkumavky.h, Vizuální snímky výroby hybridního čipu a 3D morfogeneze střeva pomocí intestinálních čipů.Transwell do 2D vložek hybridní kultury byly vloženy nezávisle do monovrstvy hybridních čipů, aby se vložily do monovrstvy hybridní kultury3 samostatně D morfogeneze. Médium je perfundováno mikrokanály pod buněčnou vrstvou vytvořenou na vložce Transwell. Měřítko, 1 cm.h Přetištěno se svolením z reference.4.Elsevier.
V tomto protokolu byla buněčná linie Caco-2 a střevní organoidy použity jako epiteliální zdroje (obr. 3a). Oba typy buněk byly kultivovány nezávisle (rámeček 2 a rámeček 5) a použity k naočkování mikrokanálů potažených ECM střevních vložek na čipu nebo vložek Transwell. T-láhve se odebírají za účelem přípravy disociovaných buněčných suspenzí trypsinizační kapalinou (box 2). Lidské střevní organoidy ze střevních biopsií nebo chirurgických resekcí byly kultivovány v kopulích Matrigel scaffold na 24jamkových destičkách, aby se podpořilo strukturní mikroprostředí. Médium obsahující esenciální morfogeny (jako jsou Wnt, R-day, jak byly popsány) růstové faktory a růstové faktory každého dalšího dne rostly růstové faktory a Noggx do ~500 µm v průměru. Zcela vypěstované organoidy jsou sklizeny a disociovány do jednotlivých buněk pro naočkování do střeva nebo Transwell vložek na čipu (rámeček 5). Jak jsme již dříve uvedli, lze je rozlišit podle typu onemocnění12,13 (např. ulcerózní kolitida, Crohnova choroba, rakovina tlustého střeva a konečníku) v oblasti (např. léze a léze u dárce), léze v oblasti gastrointestinálního traktu (např. dvanáctníku, jejuna, ilea, slepého střeva, tlustého střeva nebo konečníku). V rámečku 5 poskytujeme optimalizovaný protokol pro kultivaci organoidů tlustého střeva (koloidů), které typicky vyžadují vyšší koncentrace morfogenů než organoidy tenkého střeva.
a, Pracovní postup pro indukci morfogeneze střeva ve střevním čipu. Lidský střevní epitel Caco-2 a střevní organoidy se v tomto protokolu používají k demonstraci 3D morfogeneze. Izolované epiteliální buňky byly nasazeny do připraveného zařízení střevo na čipu (příprava čipu). pikální (AP) tok je zahájen a udržován po dobu prvních 2 dnů (tok, AP, D0-D2).Bazolaterální (BL) tok je také iniciován spolu s cyklickými natahovacími pohyby (stretch, flow, AP a BL), když se vytvoří kompletní 2D monovrstva. Střevní 3D morfogeneze se objevila spontánně po 5 dnech morfogeneze morfogeneze, reprezentativní kultura buněk 5. každý experimentální krok nebo časový bod (sloupcový graf, 100 µm). Čtyři schematické diagramy znázorňující odpovídající kaskády střevní morfogeneze (vpravo nahoře). Přerušované šipky ve schématu představují směr proudění tekutiny.b, SEM obrázek znázorňující povrchovou topologii vytvořeného 3D epitelu Caco-2 (vlevo). Vložená oblast (vlevo) ukazuje zvětšený mikro-bílý rámeček na zvětšeném 3D-bílém poli. vpravo).c, Horizontální čelní pohled na zavedený Caco-2 3D, claudin (ZO-1, červená) a souvislé membrány kartáčového lemu označené F-aktin (zelená) a jádra (modrá) Imunofluorescenční konfokální vizualizace epiteliálních buněk na střevních čipech.Šipky směřující doprostřed schematicky označují umístění ohniskové roviny získané pomocí mikroorganizmů, morfologický průběh kultury, kontrastní fáze na jednotlivých konfokálních změnách kopie ve dnech 3, 7, 9, 11 a 13. Vložka (vpravo nahoře) ukazuje velké zvětšení poskytnutého snímku.e, mikrofotografie DIC organoidního 3D epitelu vytvořeného ve střevě na řezu pořízeném v den 7.f, překryté imunofluorescenční snímky ukazující markery pro kmenové buňky (LGR5;purpurová), pohárkové buňky (MUC2; zelená), F-aktin (šedá) a jádra (azurová) pěstované na střevních čipech po dobu 3 dnů, v tomto pořadí (vlevo) a 13 dnů (uprostřed) organoidy na epiteliální vrstvě. Viz také Rozšířená data Obrázek 3, který zvýrazňuje signalizaci LGR5 bez mikrostruktury MUC2 nebo správné organoidní signalizace. um vytvořené ve střevě na čipu obarvením plazmatické membrány barvivem CellMask (vpravo) 13. den kultivace. Měřítko je 50 μm, pokud není uvedeno jinak.b Přetištěno se svolením odkazu.2.Oxford University Press;c Upraveno se svolením Reference.2.Oxford University Press;eaf upraveno se svolením odkazem.12 Pod licencí Creative Commons CC BY 4.0.
Ve střevě na čipu je nutné upravit hydrofobní povrch porézní membrány PDMS pro úspěšné potažení ECM. V tomto protokolu aplikujeme dvě různé metody pro modifikaci hydrofobnosti membrán PDMS. Pro kultivaci buněk Caco-2 stačila aktivace povrchu pomocí UV/ozonové úpravy samotná ke snížení hydrofobnosti PDMS membrány a přichycení povrchu Cacooidní membrány, potažení orgánu mikroorganismem ECM2 epitel vyžaduje chemickou funkcionalizaci povrchu, aby se dosáhlo účinného ukládání proteinů ECM postupnou aplikací polyethyleniminu (PEI) a glutaraldehydu na mikrokanály PDMS. Po povrchové úpravě byly proteiny ECM deponovány, aby pokryly funkcionalizovaný povrch PDMS, a poté zavedeny do izolovaného organoidního epitelu. spodní mikrokanál zachovává statické podmínky. Tato optimalizovaná metoda pro aktivaci povrchu a ECM povlak umožňuje připojení organoidního epitelu k vyvolání 3D morfogeneze na povrchu PDMS.
Transwell kultury také vyžadují ECM potah před naočkováním buněk;nicméně kultury Transwell nevyžadují složité kroky předúpravy k aktivaci povrchu porézních vložek. Pro pěstování buněk Caco-2 na vložkách Transwell urychluje povlak ECM na porézních vložkách připojení disociovaných buněk Caco-2 (< 1 hodina) a tvorbu bariéry těsného spojení (< 1–2 dny). Ke kultivaci organoidů na vložkách Transwell jsou na izolovaném povrchu nalepené a udržované organoidy ECM nasazeny <3 organoidy tvoří kompletní monovrstvu s bariérovou integritou. Transwell kultury se provádějí na 24jamkových destičkách bez použití hybridních čipů.
In vitro 3D morfogenezi lze iniciovat aplikací toku tekutiny do bazolaterálního aspektu vytvořené epiteliální vrstvy. Ve střevě na čipu začala epiteliální morfogeneze, když bylo médium perfundováno do horních a dolních mikrokanálů (obr. 3a). Jak bylo popsáno dříve, je kritické zavést tok tekutiny v dolním směru odvádění tekutin a inhibitor sekretního sekretu pro zajištění kontinuálního sekrečního kompartmentu pro sekreci sekretu (baso buňky navázané na porézní membrány a generují luminální smykové napětí, typicky aplikujeme duální tok ve střevě na čipu. V hybridních čipech byly do hybridních čipů vloženy vložky Transwell obsahující epiteliální monovrstvy. Poté bylo médium aplikováno pod bazolaterální stranu porézní vložky Transwell přes mikrokanál. K morfogenezi střeva došlo během 3-5 dnů po kultivaci baso.
Morfologické rysy mikroinženýrských 3D epiteliálních vrstev lze analyzovat použitím různých zobrazovacích modalit, včetně mikroskopie s fázovým kontrastem, mikroskopie s diferenciálním interferenčním kontrastem (DIC), SEM nebo imunofluorescenční konfokální mikroskopie (obrázky 3 a 4). Fázový kontrast nebo zobrazení DIC lze snadno provádět kdykoli během protruze a protruze 3D optických vrstev za účelem sledování tvaru epiliální transparentnosti vrstvy PD pro sledování tvaru epili PD. MS a polyesterové filmy, jak platformy gut-on-a-chip, tak hybridní čipové platformy, mohou poskytovat zobrazování in situ v reálném čase bez nutnosti dělení nebo rozebírání zařízení. Při provádění imunofluorescenčního zobrazování (obrázky 1, 3c, f a 4b, c) jsou buňky obvykle fixovány 4% (hmotn./obj.) paraformaldehydem (Trimtontovinerum-1% album) a následně bvol. (BSA), v pořadí. V závislosti na typu buňky lze použít různá fixativa, permeabilizéry a blokující činidla. Primární protilátky zacílené na markery buněk nebo regionů závislých na linii se používají ke zvýraznění buněk imobilizovaných in situ na čipu, následují sekundární protilátky spolu s barvivem s kontrastním barvivem cíleným na jedno jádro (např. ly značený phalloidin). Živé zobrazování na bázi fluorescence lze také provádět in situ k detekci produkce hlenu (obr.1, „Diferenciace buněk“ a „Fyziologie střeva“), náhodná kolonizace mikrobiálních buněk (obr. 1, „Kokultivace hostitel-mikrobe“), nábor imunitních buněk (obr. 1, „Modelování onemocnění“) nebo obrysy 3D epiteliální morfologie (obr. 3c,f, oddělte spodní vrstvu od horní vrstvy čipu a 4). 2, 3D epiteliální morfologii, stejně jako mikroklky na apikálním kartáčkovém lemu lze vizualizovat pomocí SEM (obr. 3b). Expresi diferenciačních markerů lze hodnotit provedením kvantitativní PCR5 nebo jednobuněčného sekvenování RNA. V tomto případě jsou 3D 3D vrstvy z čipu kultivovány na molekulárním čipu pomocí epithepsu nebo pomocí molekulárního čipu kultivované pomocí epithepsu genetická analýza.
a, Pracovní postup pro indukci střevní morfogeneze v hybridním čipu. Caco-2 a střevní organoidy se v tomto protokolu používají k demonstraci 3D morfogeneze na platformě hybridního čipu. Disociované epiteliální buňky byly nasazeny do připravených vložek Transwell (TW příprava; viz obrázek níže). Jakmile byly buňky naočkovány (zaočkovány) a přichyceny ke kultivaci s polyesterovými TW membránami za všech podmínek (transwell TW kultura). 7 dní byla do hybridního čipu integrována jediná vložka Transwell obsahující 2D monovrstvu epiteliálních buněk, aby se zavedl bazolaterální tok (Flow, BL), což nakonec vedlo k vytvoření 3D epiteliální vrstvy (morfogeneze). Mikrofotografie s fázovým kontrastem ukazující morfologické rysy epiteliálních buněk lidských orgánů odvozené od normálního dárce jako schématický krok experimentu na horní linii dárce (C103) každý krok.b, Hybridní čipy (schéma vlevo) mohou vést k 3D morfogenezi organoidních epiteliálních buněk s pohledy konfokální mikroskopie shora dolů v různých polohách Z (horní, střední a dolní);viz schéma vpravo a odpovídající tečkované čáry).vykazovaly zjevné morfologické charakteristiky.F-aktin (azurová), jádro (šedá).c, Fluorescenční konfokální mikrofotografie (3D úhlový pohled) epiteliálních buněk odvozených z organoidů kultivovaných ve statickém Transwell (TW; vsazeno do bílého přerušovaného rámečku) versus hybridní čip (největší plný záběr; srovnávání 2D versus 3D párová morfologie ZD vertikální řez, v tomto pořadí). ) také zobrazují 2D a 3D prvky. Měřítko, 100 µm.c Přetištěno se svolením reference.4.Elsevier.
Kontroly lze připravit kultivací stejných buněk (Caco-2 nebo intestinální organoidní epiteliální buňky) do dvourozměrných monovrstev za konvenčních podmínek statické kultivace. Zejména může dojít k vyčerpání živin kvůli omezené objemové kapacitě mikrokanálů (tj. ~4 µl v horním kanálku na původním designu střevního čipu). Proto lze také porovnat epiteliální a bazální tok po aplikaci.
Proces měkké litografie by měl být prováděn v čisté místnosti. Pro každou vrstvu na čipu (horní a spodní vrstva a membrány) a hybridní čipy byly použity různé fotomasky a vyrobeny na samostatných křemíkových destičkách, protože výšky mikrokanálů byly různé. Cílové výšky horních a spodních mikrokanálů střeva na čipu jsou 500 µm, výška hybridního čipu je 200 µm a výška hybridního čipu je 200 µm. m
Umístěte 3palcový silikonový plátek do misky s acetonem. Jemně otáčejte talířem po dobu 30 sekund, poté plátek osušte na vzduchu. Přeneste plátek na talíř s IPA a poté talíř 30 s otáčejte, aby se očistil.
Roztok piraně (směs peroxidu vodíku a koncentrované kyseliny sírové, 1:3 (obj./obj.)) lze volitelně použít k maximalizaci odstranění organických zbytků z povrchu křemíkového plátku.
Roztok Piranha je extrémně korozivní a vytváří teplo. Jsou nutná další bezpečnostní opatření. Pro likvidaci odpadu nechte roztok vychladnout a přeneste ho do čisté suché nádoby na odpad. Používejte sekundární nádoby a řádně označte nádoby na odpad. Podrobnější postupy naleznete v bezpečnostních pokynech zařízení.
Dehydratujte oplatky jejich umístěním na 200 °C horkou plotnu na 10 minut. Po dehydrataci se oplatka pětkrát protřepala na vzduchu, aby vychladla.
Nalijte ~10 g fotorezistu SU-8 2100 do středu vyčištěného silikonového plátku. Pomocí pinzety rozprostřete fotorezist rovnoměrně na plátek. Občas umístěte plátek na plotýnku o teplotě 65 °C, aby byl fotorezist méně lepivý a snadněji se roztíral. Nevkládejte plátek přímo na plotýnku.
SU-8 byl rovnoměrně rozložen na destičce pomocí rotačního potahování. Naprogramujte příchozí rotaci SU-8 na 5–10 s, aby se šířila rychlostí 500 ot./min. při zrychlení 100 ot./min. střeva na čipu; viz „Kritické kroky“ níže) nastavena na zrychlení 300 ot./min. 30 sekund při 1 200 ot./min.
Hlavní rychlost odstřeďování lze upravit podle cílové tloušťky vzoru SU-8 na křemíkové destičce.
Pro výrobu vzorů SU-8 o výšce 500 µm pro horní vrstvu střeva na čipu byly kroky odstředění a měkkého vypalování tohoto boxu (kroky 7 a 8) postupně opakovány (viz krok 9), aby se vytvořily dvě vrstvy o tloušťce 250 µm.
Pečte oplatky potažené SU-8 opatrným položením na horkou plotnu při 65 °C po dobu 5 minut, poté přepněte nastavení na 95 °C a inkubujte dalších 40 minut.
Chcete-li dosáhnout výšky 500 μm vzoru SU-8 v horním mikrokanálu, opakujte kroky 7 a 8, abyste vytvořili dvě vrstvy SU-8 o tloušťce 250 μm.
Pomocí UV Mask Aligner proveďte lampový test podle pokynů výrobce pro výpočet doby expozice destičky. (expoziční doba, ms) = (expoziční dávka, mJ/cm2)/(výkon lampy, mW/cm2).
Po určení doby expozice umístěte fotomasku na držák masky vyrovnávače UV masky a umístěte fotomasku na destičku potaženou SU-8.
Umístěte potištěný povrch fotomasky přímo na stranu křemíkového plátku potaženou SU-8, abyste minimalizovali rozptyl UV záření.
Vystavte plátek a fotomasku potaženou SU-8 vertikálně UV zářením o síle 260 mJ/cm2 po předem stanovenou dobu expozice (viz krok 10 tohoto boxu).
Po vystavení UV záření byly křemíkové plátky potažené SU-8 vypalovány při 65 °C po dobu 5 minut a 95 °C po dobu 15 minut na každé plotýnce, aby se vyrobily vzory o výšce 200 μm. Prodlužte dobu po vypalování při 95 °C na 30 minut, abyste vyrobili vzory o výšce 500 μm.
Vývojka se nalije do skleněné misky a upečený oplatek se umístí do misky. Objem vývojky SU-8 se může lišit v závislosti na velikosti skleněné desky. Ujistěte se, že používáte dostatek vývojky SU-8 k úplnému odstranění neexponovaného SU-8. Například při použití skleněné misky o průměru 150 mm s kapacitou 1 l použijte ~300 ml pro příležitostné vyvíjení 2 minut na vývojku s jemným vyvíjením SU-.8
Opláchněte vyvolanou formu ~10 ml čerstvé vývojky a poté IPA nastříkáním roztoku pomocí pipety.
Umístěte wafer do plazmového čističe a vystavte kyslíkovému plazmatu (atmosférický plyn, cílový tlak 1 × 10−5 Torr, výkon 125 W) po dobu 1,5 min.
Umístěte oplatku do vakuového exsikátoru se skleněným sklíčkem uvnitř. Oplatky a podložní sklíčka lze umístit vedle sebe. Pokud je vakuový exsikátor rozdělen na několik vrstev destičkou, umístěte sklíčka do spodní komory a destičky do horní komory. Nakapejte 100 μl trichloro(1H, 1H, 2H, 2H, 2H, vakuum)H-silane.
Rozmrazte lahvičku se zmrazenými buňkami Caco-2 ve vodní lázni o teplotě 37 °C, poté přeneste rozmrazené buňky do baňky T75 obsahující 15 ml média Caco-2 předehřátého na teplotu 37 °C.
Pro průchod buněk Caco-2 při ~90% konfluenci se nejprve zahřeje médium Caco-2, PBS a 0,25% trypsin/1 mM EDTA ve vodní lázni o teplotě 37 °C.
Aspirujte médium vakuovou aspirací. Promyjte buňky dvakrát 5 ml teplého PBS opakováním vakuové aspirace a přidáním čerstvého PBS.