Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Mezitím budeme web vykreslovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Evoluce mikrobiálních parazitů zahrnuje protipůsobení mezi přirozeným výběrem, který způsobuje zlepšování parazitů, a genetickým driftem, který způsobuje, že paraziti ztrácejí geny a hromadí škodlivé mutace. Abychom pochopili, jak k tomuto protipůsobení dochází v měřítku jediné makromolekuly, popisujeme zde kryo-EM strukturu ribozomu Encephalitozoon cuniculi, eukaryotického organismu s jedním z nejmenších genomů v přírodě. Extrémní redukce rRNA v ribozomech E. cuniculi je doprovázena bezprecedentními strukturálními změnami, jako je vývoj dříve neznámých fúzovaných linkerů rRNA a rRNA bez vyboulení. Ribozom E. cuniculi navíc přežil ztrátu fragmentů rRNA a proteinů díky rozvoji schopnosti používat malé molekuly jako strukturní napodobeniny degradovaných fragmentů rRNA a proteinů. Celkově ukazujeme, že molekulární struktury, o nichž se dlouho myslelo, že jsou redukované, degenerující a náchylné k oslabujícím mutacím, mají řadu kompenzačních mechanismů, které je udržují aktivní i přes extrémní molekulární kontrakce.
Protože většina skupin mikrobiálních parazitů má jedinečné molekulární nástroje k využití svých hostitelů, musíme často vyvíjet různá léčebná opatření pro různé skupiny parazitů1,2. Nové důkazy však naznačují, že některé aspekty evoluce parazitů jsou konvergentní a do značné míry předvídatelné, což naznačuje potenciální základ pro široké terapeutické intervence u mikrobiálních parazitů3,4,5,6,7,8,9.
Předchozí práce identifikovaly společný evoluční trend u mikrobiálních parazitů, nazývaný redukce genomu nebo rozpad genomu10,11,12,13. Současný výzkum ukazuje, že když se mikroorganismy vzdají svého volně žijícího způsobu života a stanou se intracelulárními parazity (nebo endosymbionty), jejich genomy procházejí pomalými, ale úžasnými metamorfózami v průběhu milionů let9,11. V procesu známém jako rozpad genomu mikrobiální paraziti hromadí škodlivé mutace, které mění mnoho dříve důležitých genů na pseudogeny, což vede k postupné ztrátě genů a mutačnímu kolapsu14,15. Tento kolaps může zničit až 95 % genů u nejstarších intracelulárních organismů ve srovnání s blízce příbuznými volně žijícími druhy. Evoluce intracelulárních parazitů je tedy přetahovanou mezi dvěma protichůdnými silami: darwinovským přirozeným výběrem, který vede ke zdokonalení parazitů, a kolapsem genomu, který uvrhne parazity v zapomnění. Jak se parazitovi podařilo z této přetahované vymanit a zachovat si aktivitu své molekulární struktury, zůstává nejasné.
Ačkoli mechanismus rozpadu genomu není plně objasněn, zdá se, že k němu dochází hlavně v důsledku častého genetického driftu. Protože paraziti žijí v malých, nepohlavních a geneticky omezených populacích, nemohou účinně eliminovat škodlivé mutace, které se někdy vyskytují během replikace DNA. To vede k nevratné akumulaci škodlivých mutací a redukci genomu parazita. V důsledku toho parazit nejen ztrácí geny, které již nejsou nezbytné pro jeho přežití v intracelulárním prostředí. Právě neschopnost populací parazitů účinně eliminovat sporadické škodlivé mutace způsobuje, že se tyto mutace hromadí v celém genomu, včetně jejich nejdůležitějších genů.
Velká část našeho současného chápání redukce genomu je založena výhradně na srovnávání genomových sekvencí, s menší pozorností věnovanou změnám ve skutečných molekulách, které plní údržbářské funkce a slouží jako potenciální cíle léčiv. Srovnávací studie ukázaly, že zátěž škodlivých intracelulárních mikrobiálních mutací zřejmě predisponuje proteiny a nukleové kyseliny k chybnému skládání a agregaci, což je činí více závislými na chaperonech a přecitlivělými na teplo19,20,21,22,23. Kromě toho různí paraziti – nezávislá evoluce, někdy oddělená až 2,5 miliardami let – zaznamenali podobnou ztrátu center kontroly kvality v syntéze proteinů5,6 a mechanismech opravy DNA24. O dopadu intracelulárního životního stylu na všechny ostatní vlastnosti buněčných makromolekul, včetně molekulární adaptace na rostoucí zátěž škodlivých mutací, je však známo jen málo.
V této práci jsme pro lepší pochopení evoluce proteinů a nukleových kyselin intracelulárních mikroorganismů určili strukturu ribozomů intracelulárního parazita Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi je houbovitý organismus patřící do skupiny parazitických mikrosporidií, které mají neobvykle malé eukaryotické genomy, a proto se používají jako modelové organismy pro studium rozpadu genomu25,26,27,28,29,30. Nedávno byla kryo-EM struktura ribozomů stanovena pro středně redukované genomy Microsporidia, Paranosema locustae a Vairimorpha necatrix31,32 (genom o velikosti ~3,2 Mb). Tyto struktury naznačují, že určitá ztráta amplifikace rRNA je kompenzována vývojem nových kontaktů mezi sousedními ribozomálními proteiny nebo získáním nových ribozomálních proteinů msL131,32. Druh Encephalitozoon (genom ~2,5 milionu bp) spolu s jeho nejbližším příbuzným Ordospora vykazuje nejvyšší stupeň redukce genomu u eukaryot – má méně než 2000 genů kódujících proteiny a očekává se, že jeho ribozomy nejenže postrádají expanzní fragmenty rRNA (fragmenty rRNA, které odlišují eukaryotické ribozomy od bakteriálních ribozomů), ale také čtyři ribozomální proteiny kvůli nedostatku homologů v genomu E. cuniculi26,27,28. Proto jsme dospěli k závěru, že ribozom E. cuniculi může odhalit dříve neznámé strategie molekulární adaptace na rozpad genomu.
Naše kryo-EM struktura představuje nejmenší eukaryotický cytoplazmatický ribozom, který byl dosud charakterizován, a poskytuje vhled do toho, jak maximální stupeň redukce genomu ovlivňuje strukturu, sestavení a vývoj molekulárního aparátu, který je nedílnou součástí buňky. Zjistili jsme, že ribozom E. cuniculi porušuje mnoho široce konzervovaných principů skládání RNA a sestavování ribozomů, a objevili jsme nový, dříve neznámý ribozomální protein. Zcela nečekaně ukazujeme, že ribozomy mikrosporidií si vyvinuly schopnost vázat malé molekuly, a předpokládáme, že zkrácení v rRNA a proteinech spouštějí evoluční inovace, které mohou ribozomu v konečném důsledku propůjčit užitečné vlastnosti.
Abychom lépe porozuměli vývoji proteinů a nukleových kyselin v intracelulárních organismech, rozhodli jsme se izolovat spory E. cuniculi z kultur infikovaných savčích buněk, abychom purifikovali jejich ribozomy a určili jejich strukturu. Získat velké množství parazitických mikrosporidií je obtížné, protože mikrosporidie nelze kultivovat v živném médiu. Místo toho rostou a množí se pouze uvnitř hostitelské buňky. Proto jsme pro získání biomasy E. cuniculi pro purifikaci ribozomů infikovali buněčnou linii savčích ledvin RK13 sporami E. cuniculi a tyto infikované buňky jsme kultivovali několik týdnů, aby E. cuniculi mohly růst a množit se. Pomocí infikované buněčné monovrstvy o velikosti přibližně půl metru čtverečního jsme byli schopni purifikovat přibližně 300 mg spor mikrosporidií a použít je k izolaci ribozomů. Poté jsme purifikované spory rozrušili skleněnými kuličkami a surové ribozomy jsme izolovali pomocí postupné frakcionace lyzátů polyethylenglykolem. To nám umožnilo získat přibližně 300 µg surových ribozomů E. cuniculi pro strukturní analýzu.
Poté jsme s využitím výsledných vzorků ribozomů shromáždili kryo-EM snímky a tyto snímky jsme zpracovali pomocí masek odpovídajících velké ribozomální podjednotce, hlavě malé podjednotky a malé podjednotce. Během tohoto procesu jsme shromáždili snímky přibližně 108 000 ribozomálních částic a vypočítali kryo-EM snímky s rozlišením 2,7 Å (doplňkové obrázky 1-3). Kryo-EM snímky jsme poté použili k modelování rRNA, ribozomálního proteinu a hibernačního faktoru Mdf1 asociovaného s ribozomy E. cuniculi (obr. 1a, b).
a Struktura ribozomu E. cuniculi v komplexu s hibernačním faktorem Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mapa hibernačního faktoru Mdf1 asociovaného s ribozomem E. cuniculi. c Mapa sekundární struktury porovnávající získanou rRNA u druhů mikrosporidií se známými ribozomálními strukturami. Panely ukazují umístění amplifikovaných fragmentů rRNA (ES) a aktivních míst ribozomu, včetně dekódovacího místa (DC), sarcinicinové smyčky (SRL) a peptidyltransferázového centra (PTC). d Elektronová hustota odpovídající peptidyltransferázovému centru ribozomu E. cuniculi naznačuje, že toto katalytické místo má stejnou strukturu u parazita E. cuniculi a jeho hostitelů, včetně H. sapiens. e, f Odpovídající elektronová hustota dekódovacího centra (e) a schematická struktura dekódovacího centra (f) naznačují, že E. cuniculi má zbytky U1491 místo A1491 (číslování E. coli) v mnoha jiných eukaryotech. Tato změna naznačuje, že E. cuniculi může být citlivá na antibiotika, která cílí na toto aktivní místo.
Na rozdíl od dříve stanovených struktur ribozomů V. necatrix a P. locustae (obě struktury představují stejnou čeleď mikrosporidií Nosematidae a jsou si navzájem velmi podobné),31,32 ribozomy E. cuniculi procházejí četnými procesy fragmentace rRNA a proteinů. Další denaturace (doplňkové obrázky 4-6). U rRNA mezi nejvýraznější změny patřila úplná ztráta amplifikovaného fragmentu 25S rRNA ES12L a částečná degenerace helixů h39, h41 a H18 (obr. 1c, doplňkový obr. 4). Mezi ribozomálními proteiny mezi nejvýraznější změny patřila úplná ztráta proteinu eS30 a zkrácení proteinů eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 a eS7 (doplňkové obrázky 4, 5).
Extrémní redukce genomů druhů Encephalotozoon/Ordospora se tedy odráží v jejich ribozomální struktuře: Ribozomy E. cuniculi zažívají nejdramatičtější ztrátu obsahu proteinů v eukaryotických cytoplazmatických ribozomech, které jsou podrobeny strukturní charakterizaci, a nemají ani ty rRNA a proteinové fragmenty, které jsou široce konzervované nejen u eukaryot, ale také ve třech doménách života. Struktura ribozomu E. cuniculi poskytuje první molekulární model těchto změn a odhaluje evoluční události, které byly přehlíženy jak komparativní genomikou, tak studiemi intracelulární biomolekulární struktury (doplňkový obrázek 7). Níže popisujeme každou z těchto událostí spolu s jejich pravděpodobným evolučním původem a jejich potenciálním dopadem na funkci ribozomů.
Zjistili jsme, že kromě velkých zkrácení rRNA mají ribozomy E. cuniculi variace rRNA v jednom ze svých aktivních míst. Ačkoli peptidyltransferázové centrum ribozomu E. cuniculi má stejnou strukturu jako jiné eukaryotické ribozomy (obr. 1d), dekódovací centrum se liší v důsledku sekvenční variace v nukleotidu 1491 (číslování E. coli, obr. 1e, f). Toto pozorování je důležité, protože dekódovací místo eukaryotických ribozomů typicky obsahuje zbytky G1408 a A1491 ve srovnání se zbytky bakteriálního typu A1408 a G1491. Tato variace je základem rozdílné citlivosti bakteriálních a eukaryotických ribozomů na aminoglykosidovou rodinu ribozomálních antibiotik a další malé molekuly, které cílí na dekódovací místo. V dekódovacím místě ribozomu E. cuniculi byl zbytek A1491 nahrazen zbytkem U1491, což potenciálně vytváří unikátní vazebné rozhraní pro malé molekuly cílící na toto aktivní místo. Stejná varianta A14901 je přítomna i v jiných mikrosporidiích, jako jsou P. locustae a V. necatrix, což naznačuje, že je mezi druhy mikrosporidií rozšířená (obr. 1f).
Protože naše vzorky ribozomů E. cuniculi byly izolovány z metabolicky neaktivních spor, testovali jsme kryo-EM mapu E. cuniculi na dříve popsanou vazbu ribozomů za stresových nebo hladových podmínek. Hibernační faktory 31, 32, 36, 37, 38. Dříve stanovenou strukturu hibernujícího ribozomu jsme porovnali s kryo-EM mapou ribozomu E. cuniculi. Pro dokování byly použity ribozomy S. cerevisiae v komplexu s hibernačním faktorem Stm138, ribozomy kobylky v komplexu s faktorem Lso232 a ribozomy V. necatrix v komplexu s faktory Mdf1 a Mdf231. Zároveň jsme zjistili hustotu kryo-EM odpovídající klidovému faktoru Mdf1. Podobně jako se Mdf1 váže na ribozom V. necatrix, Mdf1 se také váže na ribozom E. cuniculi, kde blokuje místo E ribozomu, což pravděpodobně pomáhá zpřístupnit ribozomy, když se spory parazitů stanou metabolicky neaktivními po inaktivaci těla (obrázek 2).
Mdf1 blokuje vazebné místo E ribozomu, což zřejmě pomáhá inaktivovat ribozom, když se spory parazita stanou metabolicky neaktivními. Ve struktuře ribozomu E. cuniculi jsme zjistili, že Mdf1 tvoří dříve neznámý kontakt se stopkou ribozomu L1, což je část ribozomu, která usnadňuje uvolňování deacylované tRNA z ribozomu během syntézy proteinů. Tyto kontakty naznačují, že Mdf1 disociuje z ribozomu stejným mechanismem jako deacetylovaná tRNA, což poskytuje možné vysvětlení pro to, jak ribozom odstraňuje Mdf1, aby reaktivoval syntézu proteinů.
Naše struktura však odhalila neznámý kontakt mezi Mdf1 a ribozomální větví L1 (část ribozomu, která pomáhá uvolňovat deacylovanou tRNA z ribozomu během syntézy proteinů). Mdf1 používá konkrétně stejné kontakty jako loketní segment deacylované molekuly tRNA (obr. 2). Toto dříve neznámé molekulární modelování ukázalo, že Mdf1 disociuje z ribozomu stejným mechanismem jako deacetylovaná tRNA, což vysvětluje, jak ribozom odstraňuje tento hibernační faktor, aby reaktivoval syntézu proteinů.
Při konstrukci modelu rRNA jsme zjistili, že ribozom E. cuniculi má abnormálně složené fragmenty rRNA, které jsme nazvali fúzovaná rRNA (obr. 3). V ribozomech, které zahrnují tři domény života, se rRNA skládá do struktur, ve kterých se většina bází rRNA buď páruje a skládá navzájem, nebo interaguje s ribozomálními proteiny38,39,40. V ribozomech E. cuniculi se však zdá, že rRNA tento princip skládání porušují tím, že některé ze svých helixů přeměňují na nerozložené oblasti rRNA.
Struktura helixu H18 25S rRNA u druhů S. cerevisiae, V. necatrix a E. cuniculi. V ribozomech, které se rozprostírají přes tři životní domény, se tento linker obvykle stočí do helixu RNA, který obsahuje 24 až 34 zbytků. U mikrosporidií je naopak tento linker rRNA postupně redukován na dva jednovláknové linkery bohaté na uridin, které obsahují pouze 12 zbytků. Většina těchto zbytků je vystavena rozpouštědlům. Obrázek ukazuje, že parazitické mikrosporidie zřejmě porušují obecné principy skládání rRNA, kde jsou báze rRNA obvykle vázány na jiné báze nebo se podílejí na interakcích rRNA-protein. U mikrosporidií některé fragmenty rRNA nabývají nepříznivého složení, kdy se z dřívějšího helixu rRNA stává jednovláknový fragment protáhlý téměř v přímce. Přítomnost těchto neobvyklých oblastí umožňuje rRNA mikrosporidií vázat vzdálené fragmenty rRNA s použitím minimálního počtu bází RNA.
Nejvýraznější příklad tohoto evolučního přechodu lze pozorovat u šroubovice H18 25S rRNA (obr. 3). U druhů od E. coli až po člověka obsahují báze této šroubovice rRNA 24–32 nukleotidů, čímž tvoří mírně nepravidelnou šroubovici. V dříve identifikovaných ribozomálních strukturách z V. necatrix a P. locustae31,32 jsou báze šroubovice H18 částečně rozvinuté, ale párování nukleotidových bází je zachováno. U E. cuniculi se však tento fragment rRNA stává nejkratšími linkery 228UUUGU232 a 301UUUUUUUUUU307. Na rozdíl od typických fragmentů rRNA se tyto linkery bohaté na uridin nesvinují ani nenavazují rozsáhlý kontakt s ribozomálními proteiny. Místo toho zaujímají struktury otevřené pro rozpouštědlo a plně rozvinuté, ve kterých jsou řetězce rRNA protaženy téměř rovně. Tato natažená konformace vysvětluje, jak E. cuniculi používá pouze 12 RNA bází k vyplnění mezery 33 Å mezi helixy rRNA H16 a H18, zatímco jiné druhy potřebují k vyplnění mezery alespoň dvakrát tolik rRNA bází.
Můžeme tedy prokázat, že parazitické mikrosporidie si prostřednictvím energeticky nevýhodného skládání vyvinuly strategii pro kontrakci i těch segmentů rRNA, které zůstávají napříč druhy ve třech oblastech života široce konzervované. Zdá se, že akumulací mutací, které transformují helixy rRNA na krátké poly-U linkery, může E. cuniculi vytvářet neobvyklé fragmenty rRNA obsahující co nejméně nukleotidů pro ligaci distálních fragmentů rRNA. To pomáhá vysvětlit, jak mikrosporidie dosáhly dramatické redukce své základní molekulární struktury, aniž by ztratily svou strukturní a funkční integritu.
Dalším neobvyklým rysem rRNA E. cuniculi je vzhled rRNA bez ztluštění (obr. 4). Výčnělky (bulges) jsou nukleotidy bez párů bází, které se kroutí ven ze šroubovice RNA, místo aby se v ní skrývaly. Většina výčnělků rRNA funguje jako molekulární lepidla, která pomáhají vázat sousední ribozomální proteiny nebo jiné fragmenty rRNA. Některé z výčnělků fungují jako panty, což umožňuje šroubovici rRNA optimální ohýbání a skládání pro produktivní syntézu proteinů 41.
a Výčnělek rRNA (číslování S. cerevisiae) chybí ve struktuře ribozomu E. cuniculi, ale je přítomen u většiny ostatních eukaryot b Vnitřní ribozomy E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens a E. cuniculi. Paraziti postrádají mnoho starověkých, vysoce konzervovaných rRNA vyvýšenin. Tato ztluštění stabilizují strukturu ribozomu; jejich absence v mikrosporidiích proto naznačuje sníženou stabilitu skládání rRNA u mikrosporidií jako parazitů. Srovnání s P stonky (stonky L7/L12 u bakterií) ukazuje, že ztráta rRNA vyvýšenin se někdy shoduje s výskytem nových vyvýšenin vedle ztracených vyvýšenin. Šroubovice H42 v 23S/28S rRNA má starověkou vyvýšeninu (U1206 u Saccharomyces cerevisiae), jejíž stáří se odhaduje na nejméně 3,5 miliardy let díky její ochraně ve třech doménách života. U mikrosporidií je tato vyvýšenina eliminována. Vedle ztracené boule (A1306 u E. cuniculi) se však objevila nová boule.
Překvapivě jsme zjistili, že ribozomům E. cuniculi chybí většina rRNA vyboulení nalezených u jiných druhů, včetně více než 30 vyboulení konzervovaných u jiných eukaryot (obr. 4a). Tato ztráta eliminuje mnoho kontaktů mezi ribozomálními podjednotkami a sousedními rRNA helixy, což někdy vytváří velké duté prostory uvnitř ribozomu, čímž se ribozom E. cuniculi stává poréznějším ve srovnání s tradičnějšími ribozomy (obr. 4b). Zjistili jsme, že většina těchto vyboulení byla také ztracena v dříve identifikovaných ribozomálních strukturách V. necatrix a P. locustae, které byly předchozími strukturními analýzami přehlédnuty31,32.
Někdy je ztráta rRNA vyboulení doprovázena vývojem nových vyboulení vedle ztraceného vyboulení. Například ribozomální P-stonek obsahuje vyboulení U1208 (u Saccharomyces cerevisiae), které přežilo z E. coli na člověka, a proto se odhaduje, že jeho stáří je 3,5 miliardy let. Během syntézy proteinů toto vyboulení pomáhá P-stonku pohybovat se mezi otevřenou a uzavřenou konformací, aby ribozom mohl přijímat translační faktory a doručovat je do aktivního místa. U ribozomů E. cuniculi toto ztluštění chybí; nové ztluštění (G883) umístěné pouze ve třech párech bází však může přispět k obnovení optimální flexibility P-stonku (obr. 4c).
Naše data o rRNA bez vyboulení naznačují, že minimalizace rRNA se neomezuje pouze na ztrátu elementů rRNA na povrchu ribozomu, ale může zahrnovat i jádro ribozomu, čímž vzniká molekulární defekt specifický pro parazita, který nebyl u volně žijících buněk popsán. U volně žijících druhů jsou pozorovány...
Po modelování kanonických ribozomálních proteinů a rRNA jsme zjistili, že konvenční ribozomální komponenty nemohou vysvětlit tři části kryo-EM obrazu. Dva z těchto fragmentů jsou molekuly malé velikosti (obr. 5, doplňkový obr. 8). První segment je vložen mezi ribozomální proteiny uL15 a eL18 v pozici, kterou obvykle zaujímá C-konec eL18, který je u E. cuniculi zkrácen. Ačkoli nemůžeme určit identitu této molekuly, velikost a tvar tohoto ostrůvku hustoty lze dobře vysvětlit přítomností molekul spermidinu. Jeho vazba na ribozom je stabilizována mutacemi specifickými pro mikrosporidie v proteinech uL15 (Asp51 a Arg56), které zřejmě zvyšují afinitu ribozomu k této malé molekule, protože umožňují uL15 obalit malou molekulu do ribozomální struktury. Doplňkový obrázek 2). 8, další data 1, 2).
Kryo-EM zobrazování ukazující přítomnost nukleotidů vně ribózy vázané na ribozom E. cuniculi. V ribozomu E. cuniculi zaujímá tento nukleotid stejné místo jako nukleotid 25S rRNA A3186 (číslování Saccharomyces cerevisiae) ve většině ostatních eukaryotických ribozomů. b V ribozomální struktuře E. cuniculi se tento nukleotid nachází mezi ribozomálními proteiny uL9 a eL20, čímž stabilizuje kontakt mezi těmito dvěma proteiny. cd Analýza konzervace sekvence eL20 u druhů mikrosporidií. Fylogenetický strom druhů mikrosporidií (c) a vícenásobné zarovnání sekvencí proteinu eL20 (d) ukazují, že nukleotidové vazebné zbytky F170 a K172 jsou konzervovány u většiny typických mikrosporidií, s výjimkou S. lophii, s výjimkou raně větvících se mikrosporidií, které si zachovaly prodloužení rRNA ES39L. e Tento obrázek ukazuje, že nukleotidové vazebné zbytky F170 a K172 jsou přítomny pouze v eL20 vysoce redukovaného genomu mikrosporidií, ale nikoli u jiných eukaryot. Celkově tato data naznačují, že ribozomy mikrosporidií si vyvinuly vazebné místo pro nukleotidy, které se zdá vázat molekuly AMP a používat je ke stabilizaci protein-proteinových interakcí v ribozomální struktuře. Vysoká konzervace tohoto vazebného místa u mikrosporidií a jeho absence u jiných eukaryot naznačuje, že toto místo může mikrosporidiím poskytovat selektivní výhodu v přežití. Kapsa pro vazbu nukleotidů v ribozomu mikrosporidií se tedy nezdá být degenerovaným prvkem nebo koncovou formou degradace rRNA, jak bylo popsáno dříve, ale spíše užitečnou evoluční inovací, která umožňuje ribozomu mikrosporidií přímo vázat malé molekuly a používat je jako molekulární stavební bloky pro ribozomy. Tento objev činí z ribozomu mikrosporidií jediný známý ribozom, který používá jediný nukleotid jako svůj strukturální stavební blok. f Hypotetická evoluční dráha odvozená z vazby nukleotidů.
Druhá nízká molekulová hustota se nachází na rozhraní mezi ribozomálními proteiny uL9 a eL30 (obr. 5a). Toto rozhraní bylo dříve popsáno ve struktuře ribozomu Saccharomyces cerevisiae jako vazebné místo pro 25S nukleotid rRNA A3186 (součást prodloužení rRNA ES39L)38. Bylo prokázáno, že v degenerovaných ribozomech P. locustae ES39L se toto rozhraní váže na neznámý jediný nukleotid 31 a předpokládá se, že tento nukleotid je redukovanou finální formou rRNA, ve které je délka rRNA ~130-230 bází. ES39L je redukován na jediný nukleotid 32,43. Naše kryo-EM snímky podporují myšlenku, že hustotu lze vysvětlit nukleotidy. Vyšší rozlišení naší struktury však ukázalo, že tento nukleotid je extraribozomální molekula, pravděpodobně AMP (obr. 5a, b).
Poté jsme se ptali, zda se vazebné místo pro nukleotidy nachází v ribozomu E. cuniculi, nebo zda existovalo již dříve. Vzhledem k tomu, že vazba nukleotidů je zprostředkována hlavně zbytky Phe170 a Lys172 v ribozomálním proteinu eL30, posoudili jsme konzervaci těchto zbytků u 4396 reprezentativních eukaryot. Stejně jako v případě uL15 výše jsme zjistili, že zbytky Phe170 a Lys172 jsou vysoce konzervované pouze v typických mikrosporidiích, ale chybí v jiných eukaryotech, včetně atypických mikrosporidií (Mitosporidium) a Amphiamblys, u kterých není fragment rRNA ES39L redukován 44, 45, 46 (obr. 5c). -e).
Tato data dohromady podporují myšlenku, že E. cuniculi a možná i další kanonická mikrosporidie si vyvinuly schopnost efektivně zachycovat velké množství malých metabolitů ve struktuře ribozomu, aby kompenzovaly pokles hladin rRNA a proteinů. Tímto způsobem si vyvinuly jedinečnou schopnost vázat nukleotidy vně ribozomu, což ukazuje, že parazitické molekulární struktury to kompenzují zachycením hojného množství malých metabolitů a jejich použitím jako strukturních napodobenin degradovaných fragmentů RNA a proteinů.
Třetí nesimulovaná část naší kryo-EM mapy, nalezená ve velké ribozomální podjednotce. Relativně vysoké rozlišení (2,6 Å) naší mapy naznačuje, že tato hustota patří proteinům s unikátními kombinacemi zbytků velkých postranních řetězců, což nám umožnilo identifikovat tuto hustotu jako dříve neznámý ribozomální protein, který jsme identifikovali jako. Byl pojmenován msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (metody, obrázek 6). Naše hledání homologie ukázalo, že msL2 je konzervovaný v kladu Microsporidia rodu Encephaliter a Orosporidium, ale chybí u jiných druhů, včetně jiných Microsporidia. V ribozomální struktuře msL2 zaujímá mezeru vytvořenou ztrátou prodlužené ES31L rRNA. V této mezerě msL2 pomáhá stabilizovat skládání rRNA a může kompenzovat ztrátu ES31L (obrázek 6).
a Elektronová hustota a model ribozomálního proteinu msL2 specifického pro mikrosporidie, který se nachází v ribozomech E. cuniculi. b Většina eukaryotických ribozomů, včetně 80S ribozomu Saccharomyces cerevisiae, má u většiny druhů mikrosporidií ztrátu amplifikace ES19L rRNA. Dříve stanovená struktura ribozomu mikrosporidií V. necatrix naznačuje, že ztráta ES19L u těchto parazitů je kompenzována vývojem nového ribozomálního proteinu msL1. V této studii jsme zjistili, že ribozom E. cuniculi také vyvinul další protein napodobující ribozomální RNA jako zjevnou kompenzaci za ztrátu ES19L. MsL2 (v současnosti označovaný jako hypotetický protein ECU06_1135) a msL1 však mají odlišný strukturní a evoluční původ. c Tento objev generace evolučně nesouvisejících ribozomálních proteinů msL1 a msL2 naznačuje, že pokud ribozomy akumulují škodlivé mutace ve své rRNA, mohou dosáhnout nebývalé úrovně kompoziční rozmanitosti i u malé podskupiny blízce příbuzných druhů. Tento objev by mohl pomoci objasnit původ a vývoj mitochondriálního ribozomu, který je známý svou vysoce redukovanou rRNA a abnormální variabilitou ve složení proteinů napříč druhy.
Poté jsme porovnali protein msL2 s dříve popsaným proteinem msL1, jediným známým ribozomálním proteinem specifickým pro mikrosporidie, který se nachází v ribozomu V. necatrix. Chtěli jsme otestovat, zda jsou msL1 a msL2 evolučně příbuzné. Naše analýza ukázala, že msL1 a msL2 zaujímají stejnou dutinu v ribozomální struktuře, ale mají odlišné primární a terciární struktury, což naznačuje jejich nezávislý evoluční původ (obr. 6). Náš objev msL2 tedy poskytuje důkaz, že skupiny kompaktních eukaryotických druhů mohou nezávisle vyvíjet strukturně odlišné ribozomální proteiny, aby kompenzovaly ztrátu fragmentů rRNA. Toto zjištění je pozoruhodné v tom, že většina cytoplazmatických eukaryotických ribozomů obsahuje invariantní protein, včetně stejné rodiny 81 ribozomálních proteinů. Výskyt msL1 a msL2 v různých subtypech mikrosporidií v reakci na ztrátu prodloužených segmentů rRNA naznačuje, že degradace molekulární architektury parazita způsobuje, že paraziti hledají kompenzační mutace, což může nakonec vést k jejich získání v různých populacích parazitů.
Nakonec, když byl náš model dokončen, jsme porovnali složení ribozomu E. cuniculi se složením předpovězeným na základě sekvence genomu. Dříve se předpokládalo, že v genomu E. cuniculi chybí několik ribozomálních proteinů, včetně eL14, eL38, eL41 a eS30, kvůli zjevné absenci jejich homologů v genomu E. cuniculi. Ztráta mnoha ribozomálních proteinů je také předpovídána u většiny ostatních vysoce redukovaných intracelulárních parazitů a endosymbiontů. Například ačkoli většina volně žijících bakterií obsahuje stejnou rodinu 54 ribozomálních proteinů, pouze 11 z těchto proteinových rodin má detekovatelné homology v každém analyzovaném genomu bakterií omezených na hostitele. Na podporu této teorie byla experimentálně pozorována ztráta ribozomálních proteinů u mikrosporidií V. necatrix a P. locustae, kterým chybí proteiny eL38 a eL4131,32.
Naše struktury však ukazují, že v ribozomu E. cuniculi se ve skutečnosti ztrácejí pouze eL38, eL41 a eS30. Protein eL14 byl konzervován a naše struktura ukázala, proč tento protein nebyl nalezen při hledání homologie (obr. 7). V ribozomech E. cuniculi je většina vazebného místa eL14 ztracena v důsledku degradace rRNA-amplifikovaného ES39L. V nepřítomnosti ES39L ztratil eL14 většinu své sekundární struktury a pouze 18 % sekvence eL14 bylo identických u E. cuniculi a S. cerevisiae. Tato špatná konzervace sekvence je pozoruhodná, protože i Saccharomyces cerevisiae a Homo sapiens – organismy, které se vyvinuly s odstupem 1,5 miliardy let – sdílejí více než 51 % stejných zbytků v eL14. Tato anomální ztráta konzervace vysvětluje, proč je E. cuniculi eL14 v současnosti označován jako putativní protein M970_061160 a nikoli jako ribozomální protein eL1427.
a Ribozom mikrosporidií ztratil prodloužení rRNA ES39L, což částečně eliminovalo vazebné místo ribozomálního proteinu eL14. V nepřítomnosti ES39L dochází u proteinu mikrospor eL14 ke ztrátě sekundární struktury, kdy dřívější α-helix vázající rRNA degeneruje do smyčky minimální délky. b Vícenásobné zarovnání sekvencí ukazuje, že protein eL14 je vysoce konzervovaný u eukaryotických druhů (57% sekvenční identita mezi kvasinkovými a lidskými homology), ale špatně konzervovaný a divergentní u mikrosporidií (u kterých je s homologem eL14 identických maximálně 24 % zbytků). z S. cerevisiae nebo H. sapiens). Tato špatná konzervace sekvence a variabilita sekundární struktury vysvětluje, proč homolog eL14 nebyl nikdy nalezen u E. cuniculi a proč se předpokládá, že tento protein byl u E. cuniculi ztracen. Naproti tomu eL14 u E. cuniculi byl dříve označen jako putativní protein M970_061160. Toto pozorování naznačuje, že diverzita genomu mikrosporidií je v současnosti nadhodnocena: některé geny, o nichž se v současnosti předpokládá, že se v mikrosporidiích ztratily, jsou ve skutečnosti zachovány, i když ve vysoce diferencovaných formách; místo toho se předpokládá, že některé kódují geny mikrosporidií pro proteiny specifické pro červy (např. hypotetický protein M970_061160) ve skutečnosti kóduje velmi rozmanité proteiny, které se nacházejí u jiných eukaryot.
Toto zjištění naznačuje, že denaturace rRNA může vést k dramatické ztrátě konzervace sekvence v sousedních ribozomálních proteinech, což tyto proteiny činí nedetekovatelnými pro hledání homologie. Můžeme tedy nadhodnocovat skutečný stupeň molekulární degradace u organismů s malým genomem, protože některé proteiny, o kterých se předpokládá, že byly ztraceny, ve skutečnosti přetrvávají, i když ve vysoce pozměněných formách.
Jak si mohou paraziti zachovat funkci svých molekulárních strojů za podmínek extrémní redukce genomu? Naše studie odpovídá na tuto otázku popisem komplexní molekulární struktury (ribozomu) E. cuniculi, organismu s jedním z nejmenších eukaryotických genomů.
Již téměř dvě desetiletí je známo, že molekuly proteinů a RNA u mikrobiálních parazitů se často liší od svých homologních molekul u volně žijících druhů, protože jim chybí centra pro kontrolu kvality, u volně žijících mikrobů jsou zmenšeny na 50 % své velikosti atd., vykazují mnoho oslabujících mutací, které zhoršují skládání a funkci. Například se očekává, že ribozomy organismů s malým genomem, včetně mnoha intracelulárních parazitů a endosymbiontů, budou postrádat několik ribozomálních proteinů a až jednu třetinu nukleotidů rRNA ve srovnání s volně žijícími druhy 27, 29, 30, 49. Způsob, jakým tyto molekuly fungují u parazitů, však zůstává do značné míry záhadou a je studován především prostřednictvím srovnávací genomiky.
Naše studie ukazuje, že struktura makromolekul může odhalit mnoho aspektů evoluce, které je obtížné extrahovat z tradičních srovnávacích genomických studií intracelulárních parazitů a dalších organismů omezených na hostitele (doplňkový obr. 7). Například příklad proteinu eL14 ukazuje, že můžeme nadhodnocovat skutečný stupeň degradace molekulárního aparátu u parazitických druhů. V současnosti se předpokládá, že encefalitické parazity mají stovky genů specifických pro mikrosporidie. Naše výsledky však ukazují, že některé z těchto zdánlivě specifických genů jsou ve skutečnosti jen velmi odlišnými variantami genů, které jsou běžné u jiných eukaryot. Příklad proteinu msL2 navíc ukazuje, jak přehlížíme nové ribozomální proteiny a podceňujeme obsah parazitických molekulárních strojů. Příklad malých molekul ukazuje, jak můžeme přehlížet ty nejdůmyslnější inovace v parazitických molekulárních strukturách, které jim mohou dát novou biologickou aktivitu.
Tyto výsledky dohromady zlepšují naše chápání rozdílů mezi molekulárními strukturami organismů omezených na hostitele a jejich protějšky ve volně žijících organismech. Ukazujeme, že molekulární stroje, o nichž se dlouho předpokládalo, že jsou redukované, degenerující a podléhají různým oslabujícím mutacím, mají místo toho soubor systematicky přehlížených neobvyklých strukturních rysů.
Na druhou stranu, neobjemné fragmenty rRNA a fúzované fragmenty, které jsme našli v ribozomech E. cuniculi, naznačují, že redukce genomu může změnit i ty části základního molekulárního aparátu, které jsou zachovány ve třech doménách života – po téměř 3,5 miliardách let nezávislé evoluce druhů.
Fragmenty rRNA bez vyboulení a fúzované fragmenty v ribozomech E. cuniculi jsou obzvláště zajímavé ve světle předchozích studií molekul RNA u endosymbiotických bakterií. Například u endosymbionta mšice Buchnera aphidicola bylo prokázáno, že molekuly rRNA a tRNA mají teplotně citlivé struktury v důsledku zkreslení složení A+T a vysokého podílu nekanonických párů bází20,50. Tyto změny v RNA, stejně jako změny v molekulách proteinů, jsou nyní považovány za zodpovědné za nadměrnou závislost endosymbiontů na partnerech a neschopnost endosymbiontů přenášet teplo21,23. Ačkoli rRNA parazitických mikrosporidií vykazuje strukturálně odlišné změny, povaha těchto změn naznačuje, že snížená tepelná stabilita a vyšší závislost na chaperonových proteinech mohou být společnými rysy molekul RNA u organismů s redukovanými genomy.
Na druhou stranu naše struktury ukazují, že parazitické mikrosporidie si vyvinuly jedinečnou schopnost odolávat široce konzervovaným rRNA a proteinovým fragmentům a rozvíjejí schopnost používat hojné a snadno dostupné malé metabolity jako strukturní napodobeniny degenerovaných rRNA a proteinových fragmentů. Degradace molekulární struktury. . Tento názor je podpořen skutečností, že malé molekuly, které kompenzují ztrátu proteinových fragmentů v rRNA a ribozomech E. cuniculi, se vážou na zbytky specifické pro mikrosporidie v proteinech uL15 a eL30. To naznačuje, že vazba malých molekul na ribozomy může být produktem pozitivní selekce, při které byly mutace specifické pro mikrosporidie v ribozomálních proteinech vybrány pro svou schopnost zvýšit afinitu ribozomů k malým molekulám, což může vést k efektivnějším ribozomálním organismům. Objev odhaluje chytrou inovaci v molekulární struktuře mikrobiálních parazitů a poskytuje nám lepší pochopení toho, jak si molekulární struktury parazitů zachovávají svou funkci navzdory reduktivní evoluci.
V současné době zůstává identifikace těchto malých molekul nejasná. Není jasné, proč se vzhled těchto malých molekul v ribozomální struktuře liší mezi druhy mikrosporidií. Zejména není jasné, proč je vazba nukleotidů pozorována v ribozomech E. cuniculi a P. locustae, a nikoli v ribozomech V. necatrix, a to i přes přítomnost zbytku F170 v proteinech eL20 a K172 V. necatrix. Tato delece může být způsobena zbytkem 43 uL6 (umístěným v blízkosti vazebné kapsy nukleotidů), což je tyrosin u V. necatrix a nikoli threonin u E. cuniculi a P. locustae. Objemný aromatický postranní řetězec Tyr43 může interferovat s vazbou nukleotidů v důsledku sterického překrytí. Alternativně může být zdánlivá delece nukleotidů způsobena nízkým rozlišením kryo-EM zobrazování, které brání modelování ribozomálních fragmentů V. necatrix.
Na druhou stranu naše práce naznačuje, že proces rozpadu genomu může být vynalézavou silou. Zejména struktura ribozomu E. cuniculi naznačuje, že ztráta rRNA a proteinových fragmentů v ribozomu mikrosporidií vytváří evoluční tlak, který podporuje změny ve struktuře ribozomů. Tyto varianty se vyskytují daleko od aktivního místa ribozomu a zdá se, že pomáhají udržovat (nebo obnovovat) optimální sestavu ribozomů, která by jinak byla narušena redukovanou rRNA. To naznačuje, že se zdá, že hlavní inovací ribozomu mikrosporidií se vyvinula v potřebu tlumit drift genů.
Možná je to nejlépe ilustrováno vazbou nukleotidů, která dosud u jiných organismů nebyla pozorována. Skutečnost, že vazebné zbytky nukleotidů jsou přítomny v typických mikrosporidiích, ale nikoli v jiných eukaryotech, naznačuje, že vazebná místa nukleotidů nejsou jen pozůstatky čekající na zánik nebo konečným místem pro obnovení rRNA do podoby jednotlivých nukleotidů. Toto místo se místo toho jeví jako užitečná vlastnost, která se mohla vyvinout v průběhu několika kol pozitivní selekce. Vazebná místa nukleotidů mohou být vedlejším produktem přirozeného výběru: jakmile je ES39L degradován, jsou mikrosporidie nuceny hledat kompenzaci pro obnovení optimální biogeneze ribozomů v nepřítomnosti ES39L. Vzhledem k tomu, že tento nukleotid může napodobovat molekulární kontakty nukleotidu A3186 v ES39L, stává se molekula nukleotidu stavebním blokem ribozomu, jehož vazba je dále zlepšena mutací sekvence eL30.
Pokud jde o molekulární evoluci intracelulárních parazitů, naše studie ukazuje, že síly darwinovského přirozeného výběru a genetického driftu rozpadu genomu nefungují paralelně, ale oscilují. Za prvé, genetický drift eliminuje důležité vlastnosti biomolekul, což činí kompenzaci naléhavě nezbytnou. Pouze tehdy, když paraziti uspokojí tuto potřebu prostřednictvím darwinovského přirozeného výběru, budou mít jejich makromolekuly šanci rozvinout své nejpůsobivější a nejinovativnější vlastnosti. Důležité je, že vývoj vazebných míst nukleotidů v ribozomu E. cuniculi naznačuje, že tento vzorec molekulární evoluce „ztráta za ziskem“ nejen amortizuje škodlivé mutace, ale někdy parazitickým makromolekulám propůjčuje zcela nové funkce.
Tato myšlenka je v souladu s teorií pohyblivé rovnováhy Sewella Wrighta, která tvrdí, že striktní systém přirozeného výběru omezuje schopnost organismů inovovat51,52,53. Pokud však genetický drift naruší přirozený výběr, mohou tyto drifty způsobit změny, které samy o sobě nejsou adaptivní (nebo dokonce škodlivé), ale vedou k dalším změnám, které poskytují vyšší zdatnost nebo novou biologickou aktivitu. Náš rámec tuto myšlenku podporuje ilustrací, že stejný typ mutace, která snižuje rozsah a funkci biomolekuly, se jeví jako hlavní spouštěč jejího zlepšení. V souladu s evolučním modelem, z něhož profitují všichni, naše studie ukazuje, že rozpad genomu, tradičně vnímaný jako degenerativní proces, je také hlavním motorem inovací, který někdy a možná i často umožňuje makromolekulám získat nové parazitické aktivity. Mohou je využívat.