Adaptace struktury minimálního eukaryotického ribozomu na rozpad genomu

Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Evoluce mikrobiálních parazitů zahrnuje protiklad mezi přirozeným výběrem, který způsobuje zlepšení parazitů, a genetickým driftem, který způsobuje, že paraziti ztrácejí geny a hromadí škodlivé mutace.Abychom porozuměli tomu, jak k tomuto protipůsobení dochází v měřítku jedné makromolekuly, popíšeme kryo-EM strukturu ribozomu Encephalitozoon cuniculi, eukaryotického organismu s jedním z nejmenších genomů v přírodě.Extrémní redukce rRNA v ribozomech E. cuniculi je doprovázena bezprecedentními strukturálními změnami, jako je evoluce dříve neznámých fúzovaných rRNA linkerů a rRNA bez vyboulení.Kromě toho ribozom E. cuniculi přežil ztrátu fragmentů rRNA a proteinů vyvinutím schopnosti používat malé molekuly jako strukturální napodobeniny degradovaných fragmentů a proteinů rRNA.Celkově ukazujeme, že molekulární struktury, o kterých se dlouho předpokládalo, že jsou redukované, degenerované a podléhají vysilujícím mutacím, mají řadu kompenzačních mechanismů, které je udržují aktivní navzdory extrémním molekulárním kontrakcím.
Protože většina skupin mikrobiálních parazitů má jedinečné molekulární nástroje k využívání svých hostitelů, musíme často vyvinout různá terapeutika pro různé skupiny parazitů1,2.Nové důkazy však naznačují, že některé aspekty evoluce parazitů jsou konvergentní a do značné míry předvídatelné, což ukazuje na potenciální základ pro široké terapeutické zásahy u mikrobiálních parazitů3,4,5,6,7,8,9.
Předchozí práce identifikovala společný evoluční trend u mikrobiálních parazitů nazývaný redukce genomu nebo rozpad genomu10,11,12,13.Současný výzkum ukazuje, že když se mikroorganismy vzdají svého svobodného životního stylu a stanou se intracelulárními parazity (nebo endosymbionty), jejich genomy procházejí pomalými, ale úžasnými metamorfózami po miliony let9,11.V procesu známém jako rozpad genomu mikrobiální parazité hromadí škodlivé mutace, které mění mnoho dříve důležitých genů na pseudogeny, což vede k postupné ztrátě genů a kolapsu mutací14,15.Tento kolaps může zničit až 95 % genů v nejstarších intracelulárních organismech ve srovnání s blízce příbuznými volně žijícími druhy.Evoluce intracelulárních parazitů je tedy přetahovanou mezi dvěma protichůdnými silami: darwinovským přírodním výběrem, vedoucím ke zlepšení parazitů, a kolapsem genomu, uvrhujícím parazity do zapomnění.Jak se parazitovi podařilo vymanit se z této přetahované a zachovat si aktivitu své molekulární struktury, zůstává nejasné.
Ačkoli mechanismus rozpadu genomu není zcela objasněn, zdá se, že k němu dochází hlavně v důsledku častého genetického driftu.Protože paraziti žijí v malých, asexuálních a geneticky omezených populacích, nemohou účinně eliminovat škodlivé mutace, které se někdy vyskytují během replikace DNA.To vede k nevratné akumulaci škodlivých mutací a redukci genomu parazita.V důsledku toho parazit ztrácí nejen geny, které již nejsou nutné pro jeho přežití v intracelulárním prostředí.Právě neschopnost populací parazitů účinně eliminovat sporadické škodlivé mutace způsobuje, že se tyto mutace hromadí v celém genomu, včetně jejich nejdůležitějších genů.
Velká část našeho současného chápání redukce genomu je založena pouze na srovnávání genomových sekvencí, s menší pozorností na změny ve skutečných molekulách, které provádějí úklidové funkce a slouží jako potenciální lékové cíle.Srovnávací studie ukázaly, že zátěž škodlivých intracelulárních mikrobiálních mutací zřejmě predisponuje proteiny a nukleové kyseliny k nesprávnému skládání a agregaci, což je činí více závislými na chaperonech a přecitlivělými na teplo19,20,21,22,23.Kromě toho různí parazité – nezávislá evoluce od sebe někdy oddělená až 2,5 miliardami let – zažili podobnou ztrátu center kontroly kvality v jejich syntéze proteinů5,6 a mechanismech opravy DNA24.Málo je však známo o dopadu intracelulárního životního stylu na všechny ostatní vlastnosti buněčných makromolekul, včetně molekulární adaptace na rostoucí zátěž škodlivých mutací.
V této práci jsme za účelem lepšího pochopení vývoje proteinů a nukleových kyselin intracelulárních mikroorganismů určili strukturu ribozomů intracelulárního parazita Encephalitozoon cuniculi.E. cuniculi je houbovitý organismus patřící do skupiny parazitických mikrosporidií, které mají neobvykle malé eukaryotické genomy, a proto se používají jako modelové organismy pro studium rozpadu genomu25,26,27,28,29,30.Nedávno byla stanovena struktura kryo-EM ribozomu pro mírně redukované genomy Microsporidia, Paranosema locustae a Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genom).Tyto struktury naznačují, že určitá ztráta amplifikace rRNA je kompenzována rozvojem nových kontaktů mezi sousedními ribozomálními proteiny nebo získáním nových ribozomálních proteinů msL131,32.Druhy Encephalitozoon (genom ~2,5 milionu bp), spolu s jejich nejbližší příbuznou Ordosporou, demonstrují konečný stupeň redukce genomu u eukaryot – mají méně než 2000 genů kódujících proteiny a očekává se, že jejich ribozomy jsou nejen zbaveny expanze rRNA od fragmentů rRNA (některé rRNA ribotické fragmenty rozlišují také čtyři ribozomy) proteiny kvůli jejich nedostatku homologů v genomu E. cuniculi26,27,28.Proto jsme došli k závěru, že ribozom E. cuniculi může odhalit dříve neznámé strategie molekulární adaptace na rozpad genomu.
Naše kryo-EM struktura představuje nejmenší eukaryotický cytoplazmatický ribozom, který má být charakterizován, a poskytuje pohled na to, jak konečný stupeň redukce genomu ovlivňuje strukturu, sestavení a vývoj molekulárního aparátu, který je nedílnou součástí buňky.Zjistili jsme, že ribozom E. cuniculi porušuje mnoho široce konzervovaných principů skládání RNA a sestavování ribozomů, a objevili jsme nový, dříve neznámý ribozomální protein.Zcela neočekávaně jsme ukázali, že ribozomy mikrosporidií vyvinuly schopnost vázat malé molekuly, a předpokládáme, že zkrácení rRNA a proteinů spouští evoluční inovace, které mohou nakonec ribozomu poskytnout užitečné vlastnosti.
Abychom lépe porozuměli vývoji proteinů a nukleových kyselin v intracelulárních organismech, rozhodli jsme se izolovat spory E. cuniculi z kultur infikovaných savčích buněk za účelem čištění jejich ribozomů a stanovení struktury těchto ribozomů.Je obtížné získat velké množství parazitických mikrosporidií, protože mikrosporidie nelze kultivovat v živném médiu.Místo toho rostou a množí se pouze uvnitř hostitelské buňky.Proto, abychom získali biomasu E. cuniculi pro purifikaci ribozomů, infikovali jsme buněčnou linii RK13 savčí ledviny sporami E. cuniculi a kultivovali jsme tyto infikované buňky po dobu několika týdnů, abychom umožnili E. cuniculi růst a množit se.Pomocí monovrstvy infikovaných buněk o ploše asi půl metru čtverečního jsme byli schopni vyčistit asi 300 mg spor Microsporidia a použít je k izolaci ribozomů.Poté jsme rozrušili vyčištěné spory skleněnými kuličkami a izolovali surové ribozomy pomocí postupné polyethylenglykolové frakcionace lyzátů.To nám umožnilo získat přibližně 300 ug surových ribozomů E. cuniculi pro strukturální analýzu.
Poté jsme shromáždili kryo-EM snímky pomocí výsledných vzorků ribozomů a zpracovali tyto snímky pomocí masek odpovídajících velké ribozomální podjednotce, hlavě malé podjednotky a malé podjednotce.Během tohoto procesu jsme shromáždili snímky asi 108 000 ribozomálních částic a vypočítali kryo-EM snímky s rozlišením 2,7 Å (doplňkové obrázky 1-3).Poté jsme použili kryoEM snímky k modelování rRNA, ribozomálního proteinu a hibernačního faktoru Mdf1 asociovaného s ribozomy E. cuniculi (obr. 1a, b).
a Struktura ribozomu E. cuniculi v komplexu s hibernačním faktorem Mdf1 (pdb id 7QEP).b Mapa hibernačního faktoru Mdf1 asociovaného s ribozomem E. cuniculi.c Mapa sekundární struktury srovnávající získanou rRNA u druhů Microsporidian se známými ribozomálními strukturami.Panely ukazují umístění amplifikovaných fragmentů rRNA (ES) a aktivních míst ribozomů, včetně dekódovacího místa (DC), sarcicicinové smyčky (SRL) a centra peptidyl transferázy (PTC).d Elektronová hustota odpovídající centru peptidyl transferázy ribozomu E. cuniculi naznačuje, že toto katalytické místo má stejnou strukturu u parazita E. cuniculi a jeho hostitelů, včetně H. sapiens.e, f Odpovídající elektronová hustota dekódovacího centra (e) a schematická struktura dekódovacího centra (f) naznačují, že E. cuniculi má zbytky U1491 místo A1491 (číslování E. coli) v mnoha dalších eukaryotech.Tato změna naznačuje, že E. cuniculi může být citlivý na antibiotika, která cílí na toto aktivní místo.
Na rozdíl od dříve zavedených struktur ribozomů V. necatrix a P. locustae (obě struktury představují stejnou mikrosporidiovou čeleď Nosematidae a jsou si navzájem velmi podobné), 31,32 ribozomy E. cuniculi procházejí četnými procesy fragmentace rRNA a proteinů.Další denaturace (doplňkové obrázky 4-6).V rRNA nejnápadnější změny zahrnovaly úplnou ztrátu amplifikovaného 25S rRNA fragmentu ES12L a částečnou degeneraci h39, h41 a H18 helixů (obr. 1c, doplňkový obr. 4).Mezi ribozomálními proteiny nejnápadnější změny zahrnovaly úplnou ztrátu proteinu eS30 a zkrácení proteinů eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 a eS7 (doplňkové obrázky 5).
Extrémní redukce genomů druhů Encephalotozoon/Ordospora se tedy odráží v jejich ribozomové struktuře: ribozomy E. cuniculi zažívají nejdramatičtější ztrátu obsahu proteinů v eukaryotických cytoplazmatických ribozomech podléhajících strukturní charakterizaci a nemají ani ty rRNA a fragmenty proteinů, které jsou široce konzervované nejen u tří zvířat.Struktura ribozomu E. cuniculi poskytuje první molekulární model pro tyto změny a odhaluje evoluční události, které byly přehlíženy jak srovnávací genomikou, tak studiem intracelulární biomolekulární struktury (doplňkový obrázek 7).Níže popisujeme každou z těchto událostí spolu s jejich pravděpodobným evolučním původem a jejich potenciálním dopadem na funkci ribozomů.
Poté jsme zjistili, že kromě velkých zkrácení rRNA mají ribozomy E. cuniculi variace rRNA na jednom ze svých aktivních míst.Ačkoli má peptidyltransferázové centrum ribozomu E. cuniculi stejnou strukturu jako jiné eukaryotické ribozomy (obr. 1d), dekódovací centrum se liší v důsledku sekvenční variace na nukleotidu 1491 (číslování E. coli, obr. 1e, f).Toto pozorování je důležité, protože dekódovací místo eukaryotických ribozomů typicky obsahuje zbytky G1408 a A1491 ve srovnání se zbytky A1408 a G1491.Tato variace je základem rozdílné citlivosti bakteriálních a eukaryotických ribozomů na aminoglykosidovou rodinu ribozomálních antibiotik a další malé molekuly, které cílí na dekódovací místo.V dekódovacím místě ribozomu E. cuniculi byl zbytek A1491 nahrazen U1491, což potenciálně vytvořilo jedinečné vazebné rozhraní pro malé molekuly zacílené na toto aktivní místo.Stejná varianta A14901 je také přítomna v jiných mikrosporidiích, jako jsou P. locustae a V. necatrix, což naznačuje, že je rozšířená mezi druhy mikrosporidií (obr. 1f).
Protože naše vzorky ribozomů E. cuniculi byly izolovány z metabolicky neaktivních spór, testovali jsme kryo-EM mapu E. cuniculi na dříve popsanou vazbu ribozomů za podmínek stresu nebo hladovění.Hibernační faktory 31,32,36,37, 38. Porovnali jsme dříve stanovenou strukturu hibernujícího ribozomu s kryo-EM mapou ribozomu E. cuniculi.Pro dokování byly použity ribozomy S. cerevisiae v komplexu s hibernačním faktorem Stm138, ribozomy kobylky v komplexu s faktorem Lso232 a ribozomy V. necatrix v komplexu s faktory Mdf1 a Mdf231.Současně jsme zjistili hustotu kryo-EM odpovídající klidovému faktoru Mdf1.Podobně jako Mdf1 se váže na ribozom V. necatrix, Mdf1 se také váže na ribozom E. cuniculi, kde blokuje E místo ribozomu, což možná pomáhá zpřístupnit ribozomy, když se spory parazitů stanou metabolicky neaktivními po inaktivaci těla (obrázek 2).).
Mdf1 blokuje E místo ribozomu, což zřejmě pomáhá inaktivovat ribozom, když se spory parazitů stanou metabolicky neaktivními.Ve struktuře ribozomu E. cuniculi jsme zjistili, že Mdf1 tvoří dříve neznámý kontakt s kmenem ribozomu L1, částí ribozomu, která usnadňuje uvolňování deacylované tRNA z ribozomu během syntézy proteinů.Tyto kontakty naznačují, že Mdf1 disociuje z ribozomu pomocí stejného mechanismu jako deacetylovaná tRNA, což poskytuje možné vysvětlení toho, jak ribozom odstraňuje Mdf1, aby reaktivoval syntézu proteinů.
Naše struktura však odhalila neznámý kontakt mezi Mdf1 a nohou ribozomu L1 (část ribozomu, která pomáhá uvolnit deacylovanou tRNA z ribozomu během syntézy proteinů).Konkrétně Mdf1 používá stejné kontakty jako loketní segment deacylované molekuly tRNA (obr. 2).Toto dříve neznámé molekulární modelování ukázalo, že Mdf1 disociuje z ribozomu pomocí stejného mechanismu jako deacetylovaná tRNA, což vysvětluje, jak ribozom odstraňuje tento hibernační faktor, aby reaktivoval syntézu proteinů.
Při konstrukci modelu rRNA jsme zjistili, že ribozom E. cuniculi má abnormálně složené fragmenty rRNA, které jsme nazvali fúzovaná rRNA (obr. 3).V ribozomech, které pokrývají tři domény života, se rRNA sbalí do struktur, ve kterých většina bází rRNA buď páruje a vzájemně se složí, nebo interaguje s ribozomálními proteiny38,39,40.Zdá se však, že v ribozomech E. cuniculi rRNA porušují tento princip skládání tím, že převádějí některé z jejich helixů na rozvinuté oblasti rRNA.
Struktura helixu rRNA H18 25S u S. cerevisiae, V. necatrix a E. cuniculi.Typicky se v ribozomech zahrnujících tři životní domény tento linker stočí do šroubovice RNA, která obsahuje 24 až 34 zbytků.Naproti tomu u Microsporidia je tento linker rRNA postupně redukován na dva jednovláknové linkery bohaté na uridin obsahující pouze 12 zbytků.Většina těchto zbytků je vystavena rozpouštědlům.Obrázek ukazuje, že parazitické mikrosporidie zřejmě porušují obecné principy skládání rRNA, kde jsou báze rRNA obvykle spojeny s jinými bázemi nebo zapojeny do interakcí rRNA-protein.U mikrosporidií dochází u některých fragmentů rRNA k nepříznivému záhybu, kdy se z dřívější helixu rRNA stává jednovláknový fragment protažený téměř v přímce.Přítomnost těchto neobvyklých oblastí umožňuje rRNA mikrosporidií vázat vzdálené fragmenty rRNA pomocí minimálního počtu bází RNA.
Nejnápadnější příklad tohoto evolučního přechodu lze pozorovat u helixu rRNA H18 25S (obr. 3).U druhů od E. coli po člověka obsahují báze této rRNA šroubovice 24-32 nukleotidů, které tvoří mírně nepravidelnou šroubovici.V dříve identifikovaných ribozomálních strukturách z V. necatrix a P. locustae31,32 jsou báze helixu H18 částečně odvinuté, ale párování nukleotidových bází je zachováno.Avšak v E. cuniculi se tento fragment rRNA stává nejkratšími linkery 228UUUGU232 a 301UUUUUUUUU307.Na rozdíl od typických fragmentů rRNA se tyto linkery bohaté na uridin nesvíjejí ani nenavazují rozsáhlý kontakt s ribozomálními proteiny.Místo toho přijímají rozpouštědlově otevřené a plně rozvinuté struktury, ve kterých jsou řetězce rRNA prodlouženy téměř rovně.Tato natažená konformace vysvětluje, jak E. cuniculi používá pouze 12 bází RNA k vyplnění mezery 33 Á mezi helixy rRNA H16 a H18, zatímco jiné druhy vyžadují k vyplnění mezery alespoň dvakrát tolik bází rRNA.
Můžeme tedy demonstrovat, že prostřednictvím energeticky nepříznivého skládání si parazitické mikrosporidie vyvinuly strategii kontrakcí i těch segmentů rRNA, které zůstávají široce konzervované napříč druhy ve třech doménách života.Je zřejmé, že akumulací mutací, které transformují helixy rRNA na krátké poly-U linkery, může E. cuniculi vytvořit neobvyklé fragmenty rRNA obsahující co nejméně nukleotidů pro ligaci distálních fragmentů rRNA.To pomáhá vysvětlit, jak microsporidia dosáhly dramatického snížení své základní molekulární struktury, aniž by ztratily svou strukturální a funkční integritu.
Dalším neobvyklým znakem rRNA E. cuniculi je vzhled rRNA bez ztluštění (obr. 4).Boule jsou nukleotidy bez párů bází, které se stáčejí ven ze šroubovice RNA, místo aby se v ní schovávaly.Většina výčnělků rRNA působí jako molekulární adheziva a pomáhají vázat sousední ribozomální proteiny nebo jiné fragmenty rRNA.Některé z vyboulenin působí jako panty, což umožňuje, aby se helix rRNA optimálně ohýbal a skládal pro produktivní syntézu proteinů41.
a Protruze rRNA (číslování S. cerevisiae) chybí ve struktuře ribozomu E. cuniculi, ale je přítomna ve většině ostatních eukaryot b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens a vnitřní ribozomy E. cuniculi.parazitům chybí mnoho starých, vysoce konzervovaných rRNA vyboulenin.Tato ztluštění stabilizují strukturu ribozomu;proto jejich nepřítomnost v mikrosporidiích ukazuje na sníženou stabilitu skládání rRNA u mikrosporidiových parazitů.Srovnání s P stonky (L7/L12 stonky u bakterií) ukazuje, že ztráta rRNA hrbolků se někdy shoduje s výskytem nových hrbolků vedle ztracených hrbolků.Helix H42 v 23S/28S rRNA má prastarou vybouleninu (U1206 v Saccharomyces cerevisiae), jejíž stáří se odhaduje na nejméně 3,5 miliardy let kvůli její ochraně ve třech oblastech života.U mikrosporidií je tato boule eliminována.Vedle ztracené výdutě se však objevila nová výduť (A1306 u E. cuniculi).
Překvapivě jsme zjistili, že ribozomy E. cuniculi postrádají většinu výdutí rRNA nalezených u jiných druhů, včetně více než 30 výdutí konzervovaných u jiných eukaryot (obr. 4a).Tato ztráta eliminuje mnoho kontaktů mezi ribozomálními podjednotkami a přilehlými rRNA šroubovicemi, někdy vytváří velké duté dutiny v ribozomu, díky čemuž je ribozom E. cuniculi poréznější ve srovnání s tradičnějšími ribozomy (obr. 4b).Pozoruhodně jsme zjistili, že většina těchto vyboulenin byla ztracena také v dříve identifikovaných ribozomových strukturách V. necatrix a P. locustae, které byly předchozími strukturálními analýzami přehlédnuty31,32.
Někdy je ztráta výdutí rRNA doprovázena rozvojem nových výdutí vedle ztracené výdutě.Například ribozomální P-kmen obsahuje vybouleninu U1208 (u Saccharomyces cerevisiae), která přežila z E. coli do člověka a její stáří se proto odhaduje na 3,5 miliardy let.Během syntézy proteinů tato boule pomáhá kmeni P pohybovat se mezi otevřenou a uzavřenou konformací, takže ribozom může získávat translační faktory a doručit je do aktivního místa.U ribozomů E. cuniculi toto ztluštění chybí;k obnovení optimální flexibility kmene P však může přispět nové ztluštění (G883) umístěné pouze ve třech párech bází (obr. 4c).
Naše data o rRNA bez vyboulenin naznačují, že minimalizace rRNA není omezena na ztrátu prvků rRNA na povrchu ribozomu, ale může zahrnovat i jádro ribozomu, čímž vzniká parazitově specifický molekulární defekt, který nebyl popsán u volně žijících buněk.jsou pozorovány živé druhy.
Po modelování kanonických ribozomálních proteinů a rRNA jsme zjistili, že konvenční ribozomální komponenty nemohou vysvětlit tři části kryo-EM obrazu.Dva z těchto fragmentů jsou malé molekuly (obr. 5, doplňkový obr. 8).První segment je sevřen mezi ribozomálními proteiny uL15 a eL18 v poloze obvykle obsazené C-koncem eL18, který je zkrácen v E. cuniculi.I když nemůžeme určit identitu této molekuly, velikost a tvar tohoto ostrůvku hustoty je dobře vysvětlen přítomností molekul spermidinu.Jeho vazba na ribozom je stabilizována mutacemi specifickými pro mikrosporidia v proteinech uL15 (Asp51 a Arg56), které zřejmě zvyšují afinitu ribozomu k této malé molekule, protože umožňují uL15 zabalit malou molekulu do ribozomální struktury.Doplňkový obrázek 2).8, doplňující údaje 1, 2).
Cryo-EM zobrazení ukazující přítomnost nukleotidů mimo ribózu vázanou na ribozom E. cuniculi.V ribozomu E. cuniculi tento nukleotid zaujímá stejné místo jako nukleotid 25S rRNA A3186 (číslování Saccharomyces cerevisiae) ve většině ostatních eukaryotických ribozomů.b V ribozomální struktuře E. cuniculi je tento nukleotid umístěn mezi ribozomálními proteiny uL9 a eL20, čímž se stabilizuje kontakt mezi těmito dvěma proteiny.cd eL20 sekvenční konzervační analýza mezi druhy mikrosporidií.Fylogenetický strom druhů Microsporidia (c) a vícenásobné zarovnání sekvencí proteinu eL20 (d) ukazují, že nukleotid-vazebné zbytky F170 a K172 jsou konzervovány ve většině typických Microsporidia, s výjimkou S. lophii, s výjimkou časně větvených Microsporidia, které si zachovaly ES39L rRNA extenzi.e Tento obrázek ukazuje, že zbytky vázající nukleotidy F170 a K172 jsou přítomny pouze v eL20 vysoce redukovaného genomu mikrosporidií, ale ne v jiných eukaryotech.Celkově tato data naznačují, že Microsporidian ribozomy vyvinuly nukleotidové vazebné místo, které se zdá, že váže molekuly AMP a používá je ke stabilizaci interakcí protein-protein v ribozomální struktuře.Vysoká konzervace tohoto vazebného místa v Microsporidia a jeho nepřítomnost v jiných eukaryotech naznačuje, že toto místo může poskytnout selektivní výhodu přežití pro Microsporidia.Kapsa vázající nukleotid v ribozomu mikrosporidií se tedy nezdá být degenerovaným znakem nebo konečnou formou degradace rRNA, jak bylo popsáno dříve, ale spíše užitečnou evoluční inovací, která umožňuje ribozomu mikrosporidií přímo vázat malé molekuly a používat je jako molekulární stavební bloky.stavební kameny pro ribozomy.Tento objev dělá z ribozomu microsporidia jediný známý ribozom, který používá jeden nukleotid jako svůj strukturální stavební blok.f Hypotetická evoluční dráha odvozená z vazby nukleotidů.
Druhá hustota s nízkou molekulovou hmotností se nachází na rozhraní mezi ribozomálními proteiny uL9 a eL30 (obr. 5a).Toto rozhraní bylo dříve popsáno ve struktuře ribozomu Saccharomyces cerevisiae jako vazebné místo pro 25S nukleotid rRNA A3186 (část ES39L rRNA extenze)38.Ukázalo se, že v degenerovaných ribozomech P. locustae ES39L toto rozhraní váže neznámý jediný nukleotid 31 a předpokládá se, že tento nukleotid je redukovanou konečnou formou rRNA, ve které je délka rRNA ~130-230 bází.ES39L je redukován na jeden nukleotid 32.43.Naše kryo-EM snímky podporují myšlenku, že hustotu lze vysvětlit nukleotidy.Vyšší rozlišení naší struktury však ukázalo, že tento nukleotid je extraribozomální molekula, možná AMP (obr. 5a, b).
Poté jsme se zeptali, zda se nukleotidové vazebné místo objevilo v ribozomu E. cuniculi nebo zda existovalo dříve.Protože vazba nukleotidů je zprostředkována hlavně zbytky Phe170 a Lys172 v ribozomálním proteinu eL30, hodnotili jsme konzervaci těchto zbytků u 4396 reprezentativních eukaryot.Stejně jako v případě uL15 výše jsme zjistili, že zbytky Phe170 a Lys172 jsou vysoce konzervované pouze v typických Microsporidiích, ale chybí u jiných eukaryot, včetně atypických Microsporidia Mitosporidium a Amphiamblys, ve kterých není fragment rRNA ES39L redukován 44, 446 (obr. 5, 5).-E).
Celkově vzato tato data podporují myšlenku, že E. cuniculi a možná i další kanonické mikrosporidie vyvinuly schopnost efektivně zachytit velké množství malých metabolitů ve struktuře ribozomů, aby kompenzovaly pokles hladin rRNA a proteinů.Při tom vyvinuli jedinečnou schopnost vázat nukleotidy mimo ribozom, což ukazuje, že parazitické molekulární struktury kompenzují tím, že zachycují hojné malé metabolity a používají je jako strukturální napodobeniny degradované RNA a proteinových fragmentů..
Třetí nesimulovaná část naší kryo-EM mapy, nalezená ve velké ribozomální podjednotce.Relativně vysoké rozlišení (2,6 Å) naší mapy naznačuje, že tato hustota patří proteinům s unikátními kombinacemi zbytků velkých postranních řetězců, což nám umožnilo identifikovat tuto hustotu jako dříve neznámý ribozomální protein, který jsme identifikovali jako msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (metody, obrázek 6).Naše hledání homologie ukázalo, že msL2 je konzervovaný v kladu Microsporidia rodu Encephaliter a Orosporidium, ale chybí u jiných druhů, včetně jiných Microsporidia.V ribozomální struktuře zaujímá msL2 mezeru vytvořenou ztrátou rozšířené ES31L rRNA.V této prázdnotě pomáhá msL2 stabilizovat skládání rRNA a může kompenzovat ztrátu ES31L (obrázek 6).
Elektronová hustota a model Microsporidia-specifického ribozomálního proteinu msL2 nalezeného v ribozomech E. cuniculi.b Většina eukaryotických ribozomů, včetně 80S ribozomu Saccharomyces cerevisiae, má u většiny druhů Microsporidian ztrátu ES19L rRNA amplifikace.Dříve stanovená struktura ribozomu V. necatrix microsporidia naznačuje, že ztráta ES19L u těchto parazitů je kompenzována evolucí nového ribozomálního proteinu msL1.V této studii jsme zjistili, že ribozom E. cuniculi také vyvinul další mimický protein ribozomální RNA jako zjevnou kompenzaci za ztrátu ES19L.Nicméně msL2 (v současnosti označovaný jako hypotetický protein ECU06_1135) a msL1 mají odlišný strukturální a evoluční původ.c Tento objev generování evolučně nepříbuzných ribozomálních proteinů msL1 a msL2 naznačuje, že pokud ribozomy akumulují škodlivé mutace ve své rRNA, mohou dosáhnout bezprecedentní úrovně kompoziční diverzity i v malé podskupině blízce příbuzných druhů.Tento objev by mohl pomoci objasnit původ a evoluci mitochondriálního ribozomu, který je známý pro svou vysoce sníženou rRNA a abnormální variabilitu ve složení proteinů napříč druhy.
Poté jsme porovnali protein msL2 s dříve popsaným proteinem msL1, jediným známým ribozomálním proteinem specifickým pro mikrosporidia, který se nachází v ribozomu V. necatrix.Chtěli jsme otestovat, zda spolu msL1 a msL2 evolučně souvisí.Naše analýza ukázala, že msL1 a msL2 zaujímají stejnou dutinu v ribozomální struktuře, ale mají odlišné primární a terciární struktury, což ukazuje na jejich nezávislý evoluční původ (obr. 6).Náš objev msL2 tedy poskytuje důkaz, že skupiny kompaktních eukaryotických druhů mohou nezávisle vyvíjet strukturně odlišné ribozomální proteiny, aby kompenzovaly ztrátu fragmentů rRNA.Toto zjištění je pozoruhodné tím, že většina cytoplazmatických eukaryotických ribozomů obsahuje invariantní protein, včetně stejné rodiny 81 ribozomálních proteinů.Objevení se msL1 a msL2 v různých kladech mikrosporidií v reakci na ztrátu rozšířených segmentů rRNA naznačuje, že degradace molekulární architektury parazita způsobuje, že paraziti hledají kompenzační mutace, což může nakonec vést k jejich získání v různých populacích parazitů.struktur.
Nakonec, když byl náš model dokončen, jsme porovnali složení ribozomu E. cuniculi se složením předpovězeným ze sekvence genomu.Dříve se předpokládalo, že několik ribozomálních proteinů, včetně eL14, eL38, eL41 a eS30, chybí v genomu E. cuniculi kvůli zjevné nepřítomnosti jejich homologů v genomu E. cuniculi.Ztráta mnoha ribozomálních proteinů se také předpovídá u většiny ostatních vysoce redukovaných intracelulárních parazitů a endosymbiontů.Například, ačkoli většina volně žijících bakterií obsahuje stejnou rodinu 54 ribozomálních proteinů, pouze 11 z těchto proteinových rodin má detekovatelné homology v každém analyzovaném genomu bakterií omezených na hostitele.Na podporu této představy byla experimentálně pozorována ztráta ribozomálních proteinů u mikrosporidií V. necatrix a P. locustae, které postrádají proteiny eL38 a eL4131,32.
Naše struktury však ukazují, že pouze eL38, eL41 a eS30 jsou ve skutečnosti ztraceny v ribozomu E. cuniculi.Protein eL14 byl konzervován a naše struktura ukázala, proč tento protein nemohl být nalezen při hledání homologie (obr. 7).V ribozomech E. cuniculi je většina vazebného místa eL14 ztracena v důsledku degradace rRNA-amplifikovaného ES39L.V nepřítomnosti ES39L ztratil eL14 většinu své sekundární struktury a pouze 18 % sekvence eL14 bylo identických u E. cuniculi a S. cerevisiae.Toto špatné zachování sekvence je pozoruhodné, protože dokonce i Saccharomyces cerevisiae a Homo sapiens – organismy, které se vyvinuly 1,5 miliardy let od sebe – sdílejí více než 51 % stejných zbytků v eL14.Tato anomální ztráta konzervace vysvětluje, proč je E. cuniculi eL14 v současnosti označován jako domnělý protein M970_061160 a nikoli jako ribozomální protein eL1427.
a Microsporidia ribozom ztratil ES39L rRNA prodloužení, které částečně eliminovalo vazebné místo eL14 ribozomálního proteinu.V nepřítomnosti ES39L podléhá mikrosporový protein eL14 ztrátě sekundární struktury, ve které bývalý a-helix vázající rRNA degeneruje do smyčky minimální délky.b Vícenásobné zarovnání sekvencí ukazuje, že protein eL14 je vysoce konzervovaný u eukaryotických druhů (57% sekvenční identita mezi kvasinkovými a lidskými homology), ale špatně konzervovaný a divergentní v mikrosporidiích (ve kterých není více než 24 % zbytků identických s homologem eL14).z S. cerevisiae nebo H. sapiens).Tato špatná konzervace sekvence a variabilita sekundární struktury vysvětluje, proč homolog eL14 nebyl nikdy nalezen v E. cuniculi a proč se předpokládá, že tento protein byl ztracen v E. cuniculi.Naproti tomu E. cuniculi eL14 byl dříve označován jako předpokládaný protein M970_061160.Toto pozorování naznačuje, že diverzita genomu mikrosporidií je v současnosti přeceňována: některé geny, o kterých se v současnosti předpokládá, že jsou v mikrosporidiích ztraceny, jsou ve skutečnosti zachovány, i když ve vysoce diferencovaných formách;místo toho se předpokládá, že některé kódují geny mikrosporidií pro proteiny specifické pro červy (např. hypotetický protein M970_061160) ve skutečnosti kóduje velmi rozmanité proteiny nalezené v jiných eukaryotech.
Toto zjištění naznačuje, že denaturace rRNA může vést k dramatické ztrátě konzervace sekvence v sousedních ribozomálních proteinech, což činí tyto proteiny nedetekovatelnými pro hledání homologie.Můžeme tedy přeceňovat skutečný stupeň molekulární degradace u malých genomových organismů, protože některé proteiny, o kterých se předpokládá, že byly ztraceny, ve skutečnosti přetrvávají, i když ve vysoce změněných formách.
Jak si mohou paraziti zachovat funkci svých molekulárních strojů v podmínkách extrémní redukce genomu?Naše studie na tuto otázku odpovídá popisem složité molekulární struktury (ribozomu) E. cuniculi, organismu s jedním z nejmenších eukaryotických genomů.
Již téměř dvě desetiletí je známo, že molekuly proteinů a RNA u mikrobiálních parazitů se často liší od svých homologních molekul u volně žijících druhů, protože jim chybí centra kontroly kvality, u volně žijících mikrobů jsou zmenšeny na 50 % své velikosti atd.mnoho vysilujících mutací, které zhoršují skládání a funkci.Například se očekává, že ribozomy malých genomových organismů, včetně mnoha intracelulárních parazitů a endosymbiontů, budou postrádat několik ribozomálních proteinů a až jednu třetinu nukleotidů rRNA ve srovnání s volně žijícími druhy 27, 29, 30, 49. Nicméně způsob, jakým tyto molekuly fungují v parazitech, zůstává do značné míry kompromativní záhadou studovaných genů.
Naše studie ukazuje, že struktura makromolekul může odhalit mnoho aspektů evoluce, které je obtížné extrahovat z tradičních srovnávacích genomických studií intracelulárních parazitů a dalších organismů omezených na hostitele (doplňkový obrázek 7).Například příklad proteinu eL14 ukazuje, že můžeme přeceňovat skutečný stupeň degradace molekulárního aparátu u parazitických druhů.Dnes se předpokládá, že encefalitičtí paraziti mají stovky genů specifických pro mikrosporidii.Naše výsledky však ukazují, že některé z těchto zdánlivě specifických genů jsou ve skutečnosti jen velmi odlišné varianty genů, které jsou běžné u jiných eukaryot.Navíc příklad proteinu msL2 ukazuje, jak přehlížíme nové ribozomální proteiny a podceňujeme obsah parazitických molekulárních strojů.Příklad malých molekul ukazuje, jak můžeme přehlédnout ty nejdůmyslnější inovace v parazitických molekulárních strukturách, které jim mohou dát novou biologickou aktivitu.
Celkově vzato tyto výsledky zlepšují naše chápání rozdílů mezi molekulárními strukturami organismů s omezeným přístupem k hostiteli a jejich protějšky ve volně žijících organismech.Ukazujeme, že molekulární stroje, o nichž se dlouho předpokládalo, že jsou redukované, degenerované a podléhají různým oslabujícím mutacím, místo toho mají soubor systematicky přehlížených neobvyklých strukturních rysů.
Na druhou stranu, nevelké fragmenty rRNA a fúzované fragmenty, které jsme našli v ribozomech E. cuniculi, naznačují, že redukce genomu může změnit i ty části základního molekulárního aparátu, které jsou zachovány ve třech doménách života – po téměř 3,5 miliardách let.nezávislý vývoj druhů.
Ve světle předchozích studií molekul RNA v endosymbiotických bakteriích jsou zvláště zajímavé fragmenty rRNA bez vyboulenin a fúzované fragmenty v ribozomech E. cuniculi.Například u endosymbionta mšice Buchnera aphidicola se ukázalo, že molekuly rRNA a tRNA mají teplotně citlivé struktury v důsledku zkreslení složení A+T a vysokého podílu nekanonických párů bází20,50.Tyto změny v RNA, stejně jako změny v molekulách proteinů, jsou nyní považovány za zodpovědné za přílišnou závislost endosymbiontů na partnerech a neschopnost endosymbiontů přenášet teplo 21, 23 .Přestože rRNA parazitických mikrosporidií má strukturálně odlišné změny, povaha těchto změn naznačuje, že snížená tepelná stabilita a vyšší závislost na chaperonových proteinech mohou být společnými rysy molekul RNA v organismech s redukovaným genomem.
Na druhé straně naše struktury ukazují, že parazitické mikrosporidie si vyvinuly jedinečnou schopnost odolávat široce konzervované rRNA a proteinovým fragmentům, rozvíjejí schopnost využívat hojné a snadno dostupné malé metabolity jako strukturální napodobeniny degenerované rRNA a proteinových fragmentů.Degradace molekulární struktury..Tento názor podporuje skutečnost, že malé molekuly, které kompenzují ztrátu proteinových fragmentů v rRNA a ribozomech E. cuniculi, se vážou na zbytky specifické pro mikrosporidia v proteinech uL15 a eL30.To naznačuje, že vazba malých molekul na ribozomy může být produktem pozitivní selekce, ve které byly selektovány mutace specifické pro Microsporidia v ribozomálních proteinech pro jejich schopnost zvýšit afinitu ribozomů k malým molekulám, což může vést k efektivnějším ribozomálním organismům.Tento objev odhaluje chytrou inovaci v molekulární struktuře mikrobiálních parazitů a umožňuje nám lépe porozumět tomu, jak si molekulární struktury parazitů zachovávají svou funkci navzdory redukčnímu vývoji.
V současnosti zůstává identifikace těchto malých molekul nejasná.Není jasné, proč se vzhled těchto malých molekul v ribozomální struktuře liší mezi druhy mikrosporidií.Zejména není jasné, proč je nukleotidová vazba pozorována v ribozomech E. cuniculi a P. locustae, a ne v ribozomech V. necatrix, navzdory přítomnosti zbytku F170 v proteinech eL20 a K172 V. necatrix.Tato delece může být způsobena zbytkem 43 ul6 (umístěným v blízkosti nukleotidové vazebné kapsy), což je tyrosin ve V. necatrix a nikoli threonin v E. cuniculi a P. locustae.Objemný aromatický postranní řetězec Tyr43 může interferovat s nukleotidovou vazbou v důsledku sterického překrývání.Alternativně může být zjevná nukleotidová delece způsobena nízkým rozlišením kryo-EM zobrazování, které brání modelování ribozomálních fragmentů V. necatrix.
Na druhou stranu naše práce naznačuje, že proces rozpadu genomu může být vynalézavou silou.Zejména struktura ribozomu E. cuniculi naznačuje, že ztráta rRNA a proteinových fragmentů v ribozomu mikrosporidií vytváří evoluční tlak, který podporuje změny ve struktuře ribozomů.Tyto varianty se vyskytují daleko od aktivního místa ribozomu a zdá se, že pomáhají udržovat (nebo obnovovat) optimální sestavení ribozomu, které by jinak bylo narušeno redukovanou rRNA.To naznačuje, že se zdá, že velká inovace ribozomu mikrosporidií se vyvinula v potřebu tlumit genový drift.
Snad nejlépe to ilustruje vazba nukleotidů, která dosud u jiných organismů nebyla nikdy pozorována.Skutečnost, že zbytky vázající nukleotidy jsou přítomny v typických mikrosporidiích, ale nikoli v jiných eukaryotech, naznačuje, že místa vázající nukleotidy nejsou jen relikvie čekající na zmizení, nebo konečné místo pro obnovení rRNA do podoby jednotlivých nukleotidů.Místo toho se tato stránka jeví jako užitečná funkce, která se mohla vyvinout během několika kol pozitivního výběru.Vazebná místa nukleotidů mohou být vedlejším produktem přirozeného výběru: jakmile je ES39L degradován, jsou mikrosporidie nuceny hledat kompenzaci, aby obnovily optimální biogenezi ribozomů v nepřítomnosti ES39L.Protože tento nukleotid může napodobovat molekulární kontakty nukleotidu A3186 v ES39L, stává se molekula nukleotidu stavebním blokem ribozomu, jehož vazba je dále zlepšena mutací sekvence eL30.
S ohledem na molekulární evoluci intracelulárních parazitů naše studie ukazuje, že síly darwinovského přirozeného výběru a genetického driftu rozpadu genomu nepůsobí paralelně, ale oscilují.Za prvé, genetický drift eliminuje důležité rysy biomolekul, takže kompenzace je velmi potřebná.Pouze když paraziti uspokojí tuto potřebu pomocí darwinovského přírodního výběru, budou mít jejich makromolekuly šanci vyvinout své nejpůsobivější a nejinovativnější vlastnosti.Důležité je, že evoluce vazebných míst nukleotidů v ribozomu E. cuniculi naznačuje, že tento model molekulární evoluce ztráty a zisku nejen amortizuje škodlivé mutace, ale někdy uděluje parazitickým makromolekulám zcela nové funkce.
Tato myšlenka je v souladu s teorií pohyblivé rovnováhy Sewella Wrighta, která uvádí, že přísný systém přirozeného výběru omezuje schopnost organismů inovovat51,52,53.Pokud však genetický drift naruší přirozený výběr, mohou tyto drifty způsobit změny, které samy o sobě nejsou adaptivní (nebo dokonce škodlivé), ale vedou k dalším změnám, které poskytují vyšší zdatnost nebo novou biologickou aktivitu.Náš rámec podporuje tuto myšlenku tím, že ilustruje, že stejný typ mutace, který snižuje záhyb a funkci biomolekuly, se zdá být hlavním spouštěčem pro její zlepšení.V souladu s evolučním modelem win-win naše studie ukazuje, že rozpad genomu, tradičně považovaný za degenerativní proces, je také hlavní hnací silou inovací, někdy a možná dokonce často umožňuje makromolekulám získat nové parazitické aktivity.může je použít.


Čas odeslání: srpen-08-2022