Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Mezitím budeme web vykreslovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Nedávno byla vyvinuta bezchemická antimikrobiální platforma založená na nanotechnologiích s využitím umělých vodních nanostruktur (EWNS). EWNS mají vysoký povrchový náboj a jsou nasyceny reaktivními formami kyslíku (ROS), které mohou interagovat s řadou mikroorganismů a inaktivovat je, včetně patogenů přenášených potravinami. Zde je ukázáno, že jejich vlastnosti během syntézy lze jemně doladit a optimalizovat, aby se dále zvýšil jejich antibakteriální potenciál. Laboratorní platforma EWNS byla navržena tak, aby doladila vlastnosti EWNS změnou parametrů syntézy. Charakterizace vlastností EWNS (náboj, velikost a obsah ROS) pomocí moderních analytických metod. Kromě toho byly hodnoceny z hlediska jejich mikrobiálního inaktivačního potenciálu proti mikroorganismům přenášeným potravinami, jako jsou Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum a Saccharomyces cerevisiae. Zde prezentované výsledky ukazují, že vlastnosti EWNS lze během syntézy jemně doladit, což vede k exponenciálnímu zvýšení účinnosti inaktivace. Zejména se povrchový náboj zvýšil čtyřnásobně a zvýšil se počet reaktivních forem kyslíku. Rychlost odstraňování mikrobů byla mikrobiálně závislá a pohybovala se v rozmezí od 1,0 do 3,8 log po 45minutové expozici dávce aerosolu 40 000 #/cc EWNS.
Mikrobiální kontaminace je hlavní příčinou onemocnění přenášených potravinami způsobených požitím patogenů nebo jejich toxinů. Jen ve Spojených státech způsobují onemocnění přenášená potravinami přibližně 76 milionů onemocnění, 325 000 hospitalizací a 5 000 úmrtí ročně1. Ministerstvo zemědělství Spojených států (USDA) navíc odhaduje, že zvýšená konzumace čerstvých produktů je zodpovědná za 48 % všech hlášených onemocnění přenášených potravinami ve Spojených státech2. Náklady na nemoci a úmrtí způsobené patogeny přenášenými potravinami ve Spojených státech jsou velmi vysoké a Centra pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC) je odhadují na více než 15,6 miliardy USD ročně3.
Chemické4, radiační5 a tepelné6 antimikrobiální intervence k zajištění bezpečnosti potravin se v současnosti provádějí většinou v omezených kritických kontrolních bodech (CCP) v rámci výrobního řetězce (obvykle po sklizni a/nebo během balení), nikoli kontinuálně. Jsou proto náchylné ke křížové kontaminaci. 7. Lepší kontrola nemocí přenášených potravinami a znehodnocení potravin vyžaduje antimikrobiální intervence, které lze potenciálně aplikovat v celém kontinuu „od farmy až na stůl“ a zároveň snížit dopad na životní prostředí a náklady.
Nedávno byla vyvinuta antimikrobiální platforma bez chemikálií založená na nanotechnologiích, která dokáže inaktivovat povrchové a vzdušné bakterie pomocí umělých vodních nanostruktur (EWNS). EWNS byly syntetizovány pomocí dvou paralelních procesů, elektrospreje a ionizace vody (obr. 1a). Předchozí studie ukázaly, že EWNS mají jedinečnou sadu fyzikálních a biologických vlastností8,9,10. EWNS mají v průměru 10 elektronů na strukturu a průměrnou velikost v nanoměřítku 25 nm (obr. 1b,c)8,9,10. Kromě toho elektronová spinová rezonance (ESR) ukázala, že EWNS obsahují velké množství reaktivních forem kyslíku (ROS), zejména hydroxylových (OH•) a superoxidových (O2-) radikálů (obr. 1c)8. EVNS jsou ve vzduchu dlouhou dobu a mohou se srážet s mikroorganismy suspendovanými ve vzduchu a přítomnými na povrchu, čímž dodávají své ROS a způsobují inaktivaci mikroorganismů (obr. 1d). Tyto rané studie také ukázaly, že EWNS mohou interagovat s různými gramnegativními a grampozitivními bakteriemi, včetně mykobakterií, a inaktivovat je. Transmisní elektronová mikroskopie ukázala, že inaktivace byla způsobena narušením buněčné membrány. Studie akutní inhalace navíc ukázaly, že vysoké dávky EWNS nezpůsobují poškození plic ani zánět8.
(a) K elektrospreji dochází, když je mezi kapiláru obsahující kapalinu a protielektrodu aplikováno vysoké napětí. (b) Aplikace vysokého tlaku má za následek dva různé jevy: (i) elektrosprej vody a (ii) tvorbu reaktivních forem kyslíku (iontů) zachycených v EWNS. (c) Unikátní struktura EWNS. (d) Vzhledem ke své nanoskopické povaze jsou EWNS vysoce mobilní a mohou interagovat s patogeny přenášenými vzduchem.
Nedávno byla prokázána i schopnost antimikrobiální platformy EWNS inaktivovat mikroorganismy přenášené potravinami na povrchu čerstvých potravin. Ukázalo se také, že povrchový náboj EWNS v kombinaci s elektrickým polem lze využít k dosažení cíleného dodání. Předběžné výsledky u bio rajčat po 90minutové expozici při EWNS přibližně 50 000 #/cm3 byly navíc povzbudivé, přičemž byly pozorovány různé mikroorganismy přenášené potravinami, jako je E. coli a Listeria II. Předběžné organoleptické testy navíc neprokázaly žádné senzorické účinky ve srovnání s kontrolními rajčaty. Ačkoli jsou tyto počáteční výsledky inaktivace povzbudivé pro aplikace v oblasti bezpečnosti potravin i při velmi nízkých dávkách EWNS 50 000#/cm3, je zřejmé, že vyšší inaktivační potenciál by byl prospěšnější pro další snížení rizika infekce a znehodnocení.
Zde se zaměříme na výzkum vývoje platformy pro generování EWNS, která umožní jemné doladění parametrů syntézy a optimalizaci fyzikálně-chemických vlastností EWNS za účelem zvýšení jejich antibakteriálního potenciálu. Optimalizace se zaměřila zejména na zvýšení jejich povrchového náboje (pro zlepšení cíleného dodávání) a obsahu ROS (pro zlepšení účinnosti inaktivace). Charakterizujeme optimalizované fyzikálně-chemické vlastnosti (velikost, náboj a obsah ROS) s využitím moderních analytických metod a běžných potravinářských mikroorganismů, jako je E. .
EVNS byl syntetizován současným elektrosprejováním a ionizací vysoce čisté vody (18 MΩ cm–1). Elektrický nebulizér 12 se obvykle používá pro atomizaci kapalin a syntézu polymerních a keramických částic 13 a vláken 14 o kontrolované velikosti.
Jak je podrobně popsáno v předchozích publikacích 8, 9, 10, 11, v typickém experimentu bylo mezi kovovou kapiláru a uzemněnou protielektrodu aplikováno vysoké napětí. Během tohoto procesu dochází ke dvěma různým jevům: i) elektrosprej a ii) ionizace vody. Silné elektrické pole mezi oběma elektrodami způsobuje hromadění záporných nábojů na povrchu kondenzované vody, což vede k tvorbě Taylorových kuželů. V důsledku toho se tvoří vysoce nabité kapičky vody, které se dále rozpadají na menší částice, jako v Rayleighově teorii16. Zároveň silná elektrická pole způsobují štěpení a odštěpování elektronů (ionizaci) některých molekul vody, což vede k tvorbě velkého množství reaktivních forem kyslíku (ROS)17. Současně generovaný ROS18 byl zapouzdřen v EWNS (obr. 1c).
Na obr. 2a je znázorněn systém generování EWNS vyvinutý a použitý při syntéze EWNS v této studii. Čištěná voda uložená v uzavřené láhvi byla přiváděna teflonovou trubicí (vnitřní průměr 2 mm) do jehly z nerezové oceli 30G (kovová kapilára). Průtok vody je řízen tlakem vzduchu uvnitř láhve, jak je znázorněno na obrázku 2b. Jehla je upevněna na teflonové konzoli a lze ji ručně nastavit do určité vzdálenosti od protielektrody. Protielektroda je leštěný hliníkový disk s otvorem uprostřed pro odběr vzorků. Pod protielektrodou se nachází hliníkový vzorkovací trychtýř, který je připojen ke zbytku experimentálního zařízení přes vzorkovací port (obr. 2b). Aby se zabránilo hromadění náboje, které by mohlo narušit provoz vzorkovače, jsou všechny součásti vzorkovače elektricky uzemněny.
(a) Systém pro generování nanostruktur vody (EWNS). (b) Průřez vzorkovačem a elektrosprejem znázorňující nejdůležitější parametry. (c) Experimentální uspořádání pro inaktivaci bakterií.
Výše popsaný systém generování EWNS je schopen měnit klíčové provozní parametry pro usnadnění jemného doladění vlastností EWNS. Upravte aplikované napětí (V), vzdálenost mezi jehlou a protielektrodou (L) a průtok vody (φ) kapilárou pro jemné doladění charakteristik EWNS. Symbol použitý k znázornění různých kombinací: [V (kV), L (cm)]. Upravte průtok vody tak, abyste dosáhli stabilního Taylorova kužele určité sady [V, L]. Pro účely této studie byl průměr otvoru protielektrody (D) udržován na 0,5 palce (1,29 cm).
Vzhledem k omezené geometrii a asymetrii nelze intenzitu elektrického pole vypočítat z prvních principů. Místo toho byl k výpočtu elektrického pole použit software QuickField™ (Svendborg, Dánsko)19. Elektrické pole není rovnoměrné, takže hodnota elektrického pole na špičce kapiláry byla použita jako referenční hodnota pro různé konfigurace.
Během studie bylo hodnoceno několik kombinací napětí a vzdálenosti mezi jehlou a protielektrodou z hlediska tvorby Taylorova kužele, stability Taylorova kužele, stability produkce EWNS a reprodukovatelnosti. Různé kombinace jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1.
Výstup generátorového systému EWNS byl připojen přímo k analyzátoru velikosti částic Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, MN) pro měření koncentrace částic a také k aerosolovému Faradayovu elektrometru (TSI, model 3068B, Shoreview, MN). Proudy aerosolů byly měřeny dle popisu v naší předchozí publikaci. SMPS i aerosolový elektrometr odebíraly vzorky průtokem 0,5 l/min (celkový průtok vzorku 1 l/min). Koncentrace částic a průtok aerosolu byly měřeny po dobu 120 sekund. Měření se opakuje 30krát. Na základě měření proudu se vypočítá celkový náboj aerosolu a odhadne se průměrný náboj EWNS pro daný celkový počet vybraných částic EWNS. Průměrné náklady na EWNS lze vypočítat pomocí rovnice (1):
kde IEl je měřený proud, NSMPS je digitální koncentrace měřená pomocí SMPS a φEl je průtok na elektrometr.
Protože relativní vlhkost (RH) ovlivňuje povrchový náboj, teplota a (RH) byly během experimentu udržovány konstantní na 21 °C, respektive 45 %.
Pro měření velikosti a životnosti EWNS byla použita mikroskopie atomárních sil (AFM), přístroj Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) a sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japonsko). Skenovací frekvence AFM byla 1 Hz, skenovací plocha byla 5 μm × 5 μm a 256 skenovacích řádků. Všechny snímky byly podrobeny zarovnání obrazu 1. řádu pomocí softwaru Asylum (rozsah masky 100 nm, prahová hodnota 100 pm).
Testovací trychtýř byl odstraněn a povrch slídy byl umístěn do vzdálenosti 2,0 cm od protielektrody po dobu průměrování 120 s, aby se zabránilo aglomeraci částic a tvorbě nepravidelných kapiček na povrchu slídy. EWNS (elektronické naprašování slídy) bylo nastříkáno přímo na povrch čerstvě nařezané slídy (Ted Pella, Redding, CA). Obrázek povrchu slídy bezprostředně po AFM naprašování. Kontaktní úhel povrchu čerstvě nařezané nemodifikované slídy je blízký 0°, takže EVNS je na povrchu slídy rozložen ve tvaru kopule. Průměr (a) a výška (h) difuzních kapiček byly měřeny přímo z topografie AFM a použity k výpočtu difuzního objemu kopule EWNS pomocí naší dříve validované metody. Za předpokladu, že integrované EWNS mají stejný objem, lze ekvivalentní průměr vypočítat pomocí rovnice (2):
Na základě naší dříve vyvinuté metody byla k detekci přítomnosti krátkodobých radikálových meziproduktů v EWNS použita spinová past s elektronovou spinovou rezonancí (ESR). Aerosoly byly probublávány přes 650 μm Midget rozprašovač (Ace Glass, Vineland, NJ) obsahující 235 mM roztok DEPMPO(5-(diethoxyfosforyl)-5-methyl-1-pyrrolin-N-oxidu) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon. Všechna měření ESR byla provedena pomocí spektrometru Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) a ploché cely. Pro sběr a analýzu dat byl použit software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA). Stanovení charakteristik ROS bylo provedeno pouze pro soubor provozních podmínek [-6,5 kV, 4,0 cm]. Koncentrace EWNS byly měřeny pomocí SMPS po započtení ztrát EWNS v impaktoru.
Hladiny ozonu byly monitorovány pomocí dvoupaprskového ozonového monitoru 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Pro všechny vlastnosti EWNS se jako naměřená hodnota používá průměrná hodnota a jako chyba měření směrodatná odchylka. Pro porovnání hodnot optimalizovaných atributů EWNS s odpovídajícími hodnotami základního EWNS byly provedeny t-testy.
Obrázek 2c ukazuje dříve vyvinutý a charakterizovaný systém „tahání“ elektrostatického srážení (EPES), který lze použít pro cílené dodávání EWNS na povrch. EPES využívá náboje EVNS, které lze „vést“ přímo na povrch cíle vlivem silného elektrického pole. Podrobnosti o systému EPES jsou prezentovány v nedávné publikaci Pyrgiotakise a kol. 11. EPES se tedy skládá z 3D tištěné PVC komory se zúženými konci, která obsahuje dvě paralelní kovové desky z nerezové oceli (304, zrcadlově lakovaná nerezová ocel) uprostřed vzdálené od sebe 15,24 cm. Desky byly připojeny k externímu zdroji vysokého napětí (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), spodní deska byla vždy připojena ke kladnému napětí a horní deska byla vždy připojena k zemi (plovoucí zem). Stěny komory jsou pokryty hliníkovou fólií, která je elektricky uzemněna, aby se zabránilo ztrátě částic. Komora má utěsněná přední plnicí dvířka, která umožňují umístění testovacích povrchů na plastové stojany, které je zvedají nad spodní kovovou desku, aby se zabránilo rušení vysokým napětím.
Účinnost depozice EWNS v EPES byla vypočtena podle dříve vyvinutého protokolu podrobně popsaného v doplňkovém obrázku S111.
Jako řídicí komora byla k systému EPES sériově připojena druhá válcová průtoková komora, ve které byl k odstraňování EWNS použit mezilehlý HEPA filtr. Jak je znázorněno na obrázku 2c, aerosol EWNS byl čerpán dvěma vestavěnými komorami. Filtr mezi řídicí místností a EPES odstraňuje veškeré zbývající EWNS, což vede ke stejné teplotě (T), relativní vlhkosti (RH) a hladině ozonu.
Bylo zjištěno, že důležité mikroorganismy přenášené potravinami kontaminují čerstvé potraviny, jako je E. coli (ATCC #27325), indikátor stolice, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen přenášený potravinami, Listeria infest (ATCC #33090), náhrada patogenní Listeria monocytogenes, odvozená z ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), náhrada kvasinek způsobujících kazení, a odolnější inaktivovaná bakterie Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kupte si náhodné krabice bio rajčat odrůdy hroznů z místního trhu a uložte je do spotřeby (až 3 dny) do chladničky při teplotě 4 °C. Experimentální rajčata měla všechna stejnou velikost, asi 1,2 cm v průměru.
Protokoly kultivace, inokulace, expozice a počítání kolonií jsou podrobně popsány v naší předchozí publikaci a v doplňkových datech. Účinnost EWNS byla hodnocena vystavením inokulovaných rajčat působení 40 000 #/cm3 po dobu 45 minut. Stručně řečeno, tři rajčata byla použita k vyhodnocení přeživších mikroorganismů v čase t = 0 min. Tři rajčata byla umístěna do EPES a vystavena EWNS v koncentraci 40 000 #/cm3 (rajčata vystavená EWNS) a zbývající tři byla umístěna do kontrolní komory (kontrolní rajčata). Další zpracování rajčat v obou skupinách nebylo provedeno. Rajčata vystavená EWNS a kontrolní rajčata byla po 45 minutách odstraněna za účelem vyhodnocení účinku EWNS.
Každý experiment byl proveden trojmo. Analýza dat byla provedena podle protokolu popsaného v doplňkových datech.
Inaktivační mechanismy byly hodnoceny sedimentací exponovaných vzorků EWNS (45 minut při koncentraci aerosolu EWNS 40 000 #/cm3) a neozářených vzorků neškodných bakterií E. coli, Salmonella enterica a Lactobacillus. Částice byly fixovány v 2,5% glutaraldehydu, 1,25% paraformaldehydu a 0,03% kyselině pikrové v 0,1 M pufru kakodylátu sodného (pH 7,4) po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. Po promytí byla provedena dodatečná fixace 1% oxidem osmia (OsO4)/1,5% ferokyanidem draselným (KFeCN6) po dobu 2 hodin, 3krát promyta ve vodě a inkubována v 1% uranylacetátu po dobu 1 hodiny, poté dvakrát promyta ve vodě a poté dehydratována po dobu 10 minut v 50%, 70%, 90% a 100% alkoholu. Vzorky byly poté na 1 hodinu umístěny do propylenoxidu a impregnovány směsí propylenoxidu a TAAP Eponu v poměru 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Vzorky byly zality do TAAB Eponu a polymerovány při 60 °C po dobu 48 hodin. Vytvrzená granulovaná pryskyřice byla nařezána a vizualizována pomocí TEM za použití konvenčního transmisního elektronového mikroskopu JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japonsko) vybaveného CCD kamerou AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Všechny experimenty byly provedeny trojmo. Pro každý časový bod byly bakteriální výplachy zasety trojmo, což vedlo k celkem devíti datovým bodům na bod, jejichž průměr byl použit jako bakteriální koncentrace pro daný mikroorganismus. Směrodatná odchylka byla použita jako chyba měření. Počítají se všechny body.
Logaritmus poklesu koncentrace bakterií v porovnání s časem t = 0 min byl vypočítán pomocí následujícího vzorce:
kde C0 je koncentrace bakterií v kontrolním vzorku v čase 0 (tj. po vysušení povrchu, ale před umístěním do komory) a Cn je koncentrace bakterií na povrchu po n minutách expozice.
Aby se zohlednil přirozený rozklad bakterií během 45minutové expozice, byl logaritmický pokles ve srovnání s kontrolou po 45 minutách vypočítán také následovně:
kde Cn je koncentrace bakterií v kontrolním vzorku v čase n a Cn-Control je koncentrace kontrolních bakterií v čase n. Data jsou prezentována jako logaritmické snížení ve srovnání s kontrolou (bez expozice EWNS).
Během studie bylo vyhodnoceno několik kombinací napětí a vzdálenosti mezi jehlou a protielektrodou z hlediska tvorby Taylorova kužele, stability Taylorova kužele, stability produkce EWNS a reprodukovatelnosti. Různé kombinace jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1. Pro komplexní studii byly vybrány dva případy vykazující stabilní a reprodukovatelné vlastnosti (Taylorův kužel, generování EWNS a stabilita v čase). Na obr. 3 jsou znázorněny výsledky pro náboj, velikost a obsah ROS v obou případech. Výsledky jsou také shrnuty v tabulce 1. Pro referenci, jak obrázek 3, tak tabulka 1 zahrnují vlastnosti dříve syntetizovaných neoptimalizovaných EWNS8, 9, 10, 11 (výchozí hodnota-EWNS). Výpočty statistické významnosti s použitím oboustranného t-testu jsou znovu publikovány v doplňkové tabulce S2. Kromě toho další data zahrnují studie vlivu průměru vzorkovacího otvoru protielektrody (D) a vzdálenosti mezi zemnící elektrodou a hrotem (L) (doplňkové obrázky S2 a S3).
(ac) Distribuce velikosti měřená pomocí AFM. (df) Charakteristika povrchového náboje. (g) Charakterizace ROS EPR.
Je také důležité poznamenat, že pro všechny výše uvedené podmínky byl naměřený ionizační proud mezi 2 a 6 μA a napětí mezi -3,8 a -6,5 kV, což vedlo ke spotřebě energie menší než 50 mW pro tento jediný kontaktní modul generující EWNS. Přestože byl EWNS syntetizován za vysokého tlaku, hladiny ozonu byly velmi nízké a nikdy nepřekročily 60 ppb.
Doplňkový obrázek S4 ukazuje simulovaná elektrická pole pro scénáře [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm]. Pro scénáře [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] jsou výpočty pole 2 × 10⁶ V/m a 4,7 × 10⁶ V/m. To se dalo očekávat, protože ve druhém případě je poměr napětí a vzdálenosti mnohem vyšší.
Na obr. 3a,b je znázorněn průměr EWNS měřený pomocí AFM8. Vypočítané průměrné průměry EWNS byly 27 nm a 19 nm pro schémata [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm]. Pro scénáře [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] jsou geometrické směrodatné odchylky rozdělení 1,41 a 1,45, což naznačuje úzké rozdělení velikosti. Průměrná velikost i geometrická směrodatná odchylka jsou velmi blízké základnímu EWNS, a to 25 nm a 1,41. Na obr. 3c je znázorněno rozdělení velikosti základního EWNS měřené stejnou metodou za stejných podmínek.
Na obr. 3d,e jsou znázorněny výsledky charakterizace náboje. Data představují průměrná měření 30 simultánních měření koncentrace (#/cm3) a proudu (I). Analýza ukazuje, že průměrný náboj na EWNS je 22 ± 6 e- a 44 ± 6 e- pro [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] v uvedeném pořadí. Mají výrazně vyšší povrchové náboje ve srovnání se základním EWNS (10 ± 2 e-), dvakrát větší než ve scénáři [-6,5 kV, 4,0 cm] a čtyřikrát větší než ve scénáři [-3,8 kV, 0,5 cm]. Obrázek 3f ukazuje data náboje pro základní EWNS.
Z map koncentrací čísla EWNS (doplňkové obrázky S5 a S6) je patrné, že scénář [-6,5 kV, 4,0 cm] má výrazně více částic než scénář [-3,8 kV, 0,5 cm]. Za zmínku také stojí, že koncentrace čísla EWNS byla monitorována až 4 hodiny (doplňkové obrázky S5 a S6), přičemž stabilita generace EWNS vykazovala v obou případech stejné úrovně koncentrace čísla částic.
Na obr. 3g je znázorněno EPR spektrum po odečtení optimalizované kontroly EWNS (pozadí) při [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektra byla také porovnána se scénářem Baseline-EWNS v dříve publikované práci. Počet EWNS reagujících se spinovými pastmi byl vypočítán na 7,5 × 10⁴ EWNS/s, což je podobné dříve publikovanému scénáři Baseline-EWNS8. EPR spektra jasně ukázala přítomnost dvou typů ROS, přičemž O2- byl převládajícím druhem a OH• byl méně hojný. Kromě toho přímé srovnání intenzit píků ukázalo, že optimalizované EWNS měly výrazně vyšší obsah ROS ve srovnání se základním EWNS.
Na obr. 4 je znázorněna účinnost depozice EWNS v EPES. Data jsou také shrnuta v tabulce I a porovnána s původními daty EWNS. V obou případech EUNS je depozice blízká 100 % i při nízkém napětí 3,0 kV. Typicky je 3,0 kV dostatečné pro 100% depozici, bez ohledu na změnu povrchového náboje. Za stejných podmínek byla účinnost depozice Baseline-EWNS pouze 56 % kvůli jejich nižšímu náboji (průměrně 10 elektronů na EWNS).
Na obr. 5 a v tabulce 2 je shrnuta hodnota inaktivace mikroorganismů naočkovaných na povrchu rajčat po expozici přibližně 40 000 #/cm3 EWNS po dobu 45 minut v optimálním režimu [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulované E. coli a Lactobacillus innocuous vykazovaly během 45minutové expozice významný pokles o 3,8 logaritmů. Za stejných podmínek vykázala S. enterica pokles o 2,2 logaritmů, zatímco S. cerevisiae a M. parafortutum vykázaly pokles o 1,0 logaritmů.
Elektronové mikrofotografie (obrázek 6) znázorňují fyzikální změny vyvolané EWNS na neškodných buňkách Escherichia coli, Streptococcus a Lactobacillus, které vedly k jejich inaktivaci. Kontrolní bakterie měly neporušené buněčné membrány, zatímco exponované bakterie měly poškozené vnější membrány.
Elektromikroskopické zobrazování kontrolních a exponovaných bakterií odhalilo poškození membrány.
Data o fyzikálně-chemických vlastnostech optimalizovaných EWNS souhrnně ukazují, že vlastnosti (povrchový náboj a obsah ROS) EWNS se ve srovnání s dříve publikovanými základními daty EWNS výrazně zlepšily. Na druhou stranu jejich velikost zůstala v nanometrovém rozsahu, což je velmi podobné dříve publikovaným výsledkům, což jim umožňuje zůstat ve vzduchu po dlouhou dobu. Pozorovanou polydisperzitu lze vysvětlit změnami povrchového náboje, které určují velikost EWNS, náhodností Rayleighova jevu a potenciální koalescencí. Jak však podrobně popsali Nielsen a kol.22, vysoký povrchový náboj snižuje odpařování efektivním zvýšením povrchové energie/napětí vodní kapky. V naší předchozí publikaci8 byla tato teorie experimentálně potvrzena pro mikrokapičky22 a EWNS. Ztráta náboje během doby trvání může také ovlivnit velikost a přispět k pozorovanému rozdělení velikosti.
Kromě toho je náboj na strukturu přibližně 22–44 e-, v závislosti na situaci, což je výrazně více ve srovnání se základním EWNS, který má průměrný náboj 10 ± 2 elektronů na strukturu. Je však třeba poznamenat, že se jedná o průměrný náboj EWNS. Seto a kol. Bylo prokázáno, že náboj je nehomogenní a sleduje logaritmicky normální rozdělení21. Ve srovnání s naší předchozí prací zdvojnásobení povrchového náboje zdvojnásobuje účinnost depozice v systému EPES na téměř 100 %11.