Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Abychom zajistili trvalou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Zobrazí karusel tří snímků najednou.Pomocí tlačítek Předchozí a Další můžete procházet třemi snímky najednou nebo pomocí tlačítek posuvníku na konci procházet třemi snímky najednou.
Hematoencefalická bariéra a hematoencefalická bariéra brání bioterapeutickým činidlům dosáhnout jejich cílů v centrálním nervovém systému, čímž brání účinné léčbě neurologických onemocnění.Abychom objevili nové mozkové transportéry in vivo, zavedli jsme knihovnu fágových peptidů T7 a sériově odebírali krev a mozkomíšní mok (CSF) s použitím kanylovaného modelu velkého fondu krys při vědomí.Specifické fágové klony byly vysoce obohaceny v CSF po čtyřech kolech selekce.Testování jednotlivých kandidátních peptidů odhalilo více než 1000násobné obohacení v CSF.Bioaktivita peptidem zprostředkovaného dodání do mozku byla potvrzena 40% snížením hladiny amyloidu-p v mozkomíšním moku za použití peptidového inhibitoru BACE1 spojeného s identifikovaným novým tranzitním peptidem.Tyto výsledky naznačují, že peptidy identifikované metodami fágové selekce in vivo mohou být užitečnými vehikuly pro systémové dodávání makromolekul do mozku s terapeutickým účinkem.
Výzkum cílené terapie na centrální nervový systém (CNS) se do značné míry soustředil na identifikaci optimalizovaných léků a látek, které vykazují vlastnosti cílené na CNS, s menším úsilím na objevování mechanismů, které řídí aktivní dodávání léků do mozku.To se nyní začíná měnit, protože podávání léků, zejména velkých molekul, je nedílnou součástí vývoje moderních neurovědních léků.Prostředí centrálního nervového systému je dobře chráněno cerebrovaskulárním bariérovým systémem, který se skládá z hematoencefalické bariéry (BBB) ​​a hematoencefalické bariéry (BCBB)1, což ztěžuje dodávání léků do mozku1,2.Odhaduje se, že téměř všechny léky s velkou molekulou a více než 98 % léků s malou molekulou jsou eliminovány z mozku3.Proto je velmi důležité identifikovat nové mozkové transportní systémy, které zajistí účinné a specifické dodávání terapeutických léků do CNS 4,5.BBB a BCSFB však také představují vynikající příležitost pro podávání léků, protože pronikají a vstupují do všech struktur mozku prostřednictvím jeho rozsáhlé vaskulatury.Současné snahy o použití neinvazivních metod dodávání do mozku jsou tedy z velké části založeny na mechanismu receptorem zprostředkovaného transportu (PMT) pomocí endogenního receptoru BBB6.Navzdory nedávným klíčovým pokrokům využívajícím transferinovou receptorovou dráhu7,8 je nutný další vývoj nových aplikačních systémů se zlepšenými vlastnostmi.Za tímto účelem bylo naším cílem identifikovat peptidy schopné zprostředkovat transport CSF, protože by mohly být v zásadě použity k dodání makromolekul do CNS nebo k otevření nových receptorových drah.Zejména specifické receptory a transportéry cerebrovaskulárního systému (BBB a BSCFB) mohou sloužit jako potenciální cíle pro aktivní a specifické dodávání bioterapeutických léčiv.Cerebrospinální mok (CSF) je sekrečním produktem choroidálního plexu (CS) a je v přímém kontaktu s intersticiální tekutinou mozku přes subarachnoidální prostor a komorový prostor4.Nedávno bylo prokázáno, že subarachnoidální mozkomíšní mok nadměrně difunduje do intersticia mozku9.Doufáme, že se dostaneme do parenchymálního prostoru pomocí tohoto subarachnoidálního přítokového traktu nebo přímo přes BBB.Abychom toho dosáhli, implementovali jsme robustní strategii selekce fágů in vivo, která ideálně identifikuje peptidy transportované jednou z těchto dvou odlišných drah.
Nyní popisujeme sekvenční in vivo metodu screeningu na fágu se vzorkováním CSF spojeným s vysoce výkonným sekvenováním (HTS) pro monitorování počátečních kol selekce s nejvyšší diverzitou knihovny.Screening byl prováděn na krysách při vědomí s trvale implantovanou kanylou s velkou cisternou (CM), aby se zabránilo kontaminaci krve.Důležité je, že tento přístup vybírá jak cílení na mozek, tak peptidy s transportní aktivitou přes cerebrovaskulární bariéru.Použili jsme fágy T7 kvůli jejich malé velikosti (~60 nm)10 a navrhli jsme, že jsou vhodné pro transport vezikul, které umožňují transcelulární přechod endoteliální a/nebo epiteliálně-dřeňové bariéry.Po čtyřech kolech panningu byly izolovány fágové populace vykazující silné in vivo obohacení CSF a asociaci cerebrálních mikrocév.Důležité je, že jsme byli schopni potvrdit naše zjištění tím, že jsme prokázali, že preferované a chemicky syntetizované nejlepší kandidátní peptidy jsou schopny transportovat proteinový náklad do mozkomíšního moku.Nejprve byly farmakodynamické účinky CNS stanoveny kombinací hlavního tranzitního peptidu s inhibitorem peptidu BACE1.Kromě prokázání, že in vivo funkční screeningové strategie mohou identifikovat nové mozkové transportní peptidy jako účinné nosiče proteinového nákladu, očekáváme, že podobné přístupy funkční selekce budou také důležité při identifikaci nových mozkových transportních drah.
Na základě jednotek tvořících plak (PFU) byla po kroku balení fágem navržena a vytvořena knihovna náhodných 12-merních lineárních T7 fágových peptidů s diverzitou přibližně 109 (viz Materiály a metody).Je důležité poznamenat, že jsme tuto knihovnu pečlivě analyzovali před in vivo panningem.PCR amplifikace vzorků fágové knihovny pomocí modifikovaných primerů generovala amplikony, které byly přímo použitelné na HTS (doplňkový obr. la).Kvůli a) chybám sekvenování HTS11, b) dopadu na kvalitu primerů (NNK)1-12 ac) přítomnosti fága divokého typu (wt) (vložení kostry) v pohotovostní knihovně byl implementován postup filtrování sekvencí, aby se extrahovaly pouze ověřené informace o sekvenci (doplňkový obr. 1b).Tyto kroky filtrování se vztahují na všechny sekvenační knihovny HTS.Pro standardní knihovnu bylo získáno celkem 233 868 čtení, z nichž 39 % prošlo filtračními kritérii a bylo použito pro analýzu knihovny a výběr pro následující kola (doplňkový obrázek 1c–e).Čtení byly převážně násobky délky 3 párů bází s vrcholem na 36 nukleotidech (doplňkový obr. 1c), což potvrzuje design knihovny (NNK) 1-12.Je pozoruhodné, že přibližně 11 % členů knihovny obsahovalo 12rozměrný inzert PAGISRELVDKL páteře divokého typu (wt) a téměř polovina sekvencí (49 %) obsahovala inzerce nebo delece.HTS knihovny knihovny potvrdila vysokou diverzitu peptidů v knihovně: více než 81 % peptidových sekvencí bylo nalezeno pouze jednou a pouze 1,5 % se vyskytlo ve ≥4 kopiích (doplňkový obr. 2a).Frekvence aminokyselin (aa) ve všech 12 pozicích v repertoáru dobře korelovaly s frekvencemi očekávanými pro počet kodonů generovaných degenerovaným NKK repertoárem (doplňkový obrázek 2b).Pozorovaná frekvence aa zbytků kódovaných těmito inzerty dobře korelovala s vypočítanou frekvencí (r = 0,893) (doplňkový obrázek 2c).Příprava fágových knihoven pro injekci zahrnuje kroky amplifikace a odstranění endotoxinu.Již dříve se ukázalo, že to potenciálně snižuje diverzitu fágových knihoven12,13.Proto jsme sekvenovali desku amplifikovanou fágovou knihovnu, která prošla odstraněním endotoxinu, a porovnali ji s původní knihovnou, abychom odhadli frekvenci AA.Silná korelace (r = 0,995) byla pozorována mezi původním souborem a amplifikovanou a purifikovanou zásobou (doplňkový obrázek 2d), což naznačuje, že kompetice mezi klony amplifikovanými na plotnách pomocí T7 fága nezpůsobila velké zkreslení.Toto srovnání je založeno na frekvenci tripeptidových motivů v každé knihovně, protože diverzitu knihoven (~109) nelze plně zachytit ani pomocí HTS.Frekvenční analýza aa na každé pozici odhalila malé zkreslení závislé na poloze v posledních třech pozicích zadaného repertoáru (doplňkový obrázek 2e).Na závěr jsme došli k závěru, že kvalita a diverzita knihovny byly přijatelné a byly pozorovány pouze malé změny v diverzitě v důsledku amplifikace a přípravy fágových knihoven mezi několika koly selekce.
Sériové odběry mozkomíšního moku lze provést chirurgickou implantací kanyly do CM krys při vědomí, aby se usnadnila identifikace fága T7 injikovaného intravenózně (iv) prostřednictvím BBB a/nebo BCSFB (obr. la-b).Použili jsme dvě nezávislá selekční ramena (ramena A a B) v prvních třech kolech selekce in vivo (obr. 1c).Postupně jsme zvyšovali přísnost selekce snižováním celkového množství fágů zavedených v prvních třech kolech selekce.Pro čtvrté kolo rýžování jsme zkombinovali vzorky z větví A a B a provedli tři další nezávislé výběry.Pro studium in vivo vlastností fágových částic T7 v tomto modelu byl fág divokého typu (hlavní inzert PAGISRELVDKL) injikován krysám prostřednictvím ocasní žíly.Obnova fágů z mozkomíšního moku a krve v různých časových bodech ukázala, že relativně malé ikosaedrické fágy T7 měly rychlou počáteční fázi clearance z krevního kompartmentu (doplňkový obrázek 3).Na základě podaných titrů a objemu krve krys jsme vypočítali, že pouze přibližně 1 % hm.fág z podané dávky byl detekován v krvi 10 minut po intravenózní injekci.Po tomto počátečním rychlém poklesu byla naměřena pomalejší primární clearance s poločasem 27,7 minut.Důležité je, že z kompartmentu CSF bylo získáno pouze velmi málo fágů, což ukazuje na nízké pozadí migrace fágů divokého typu do kompartmentu CSF (doplňkový obrázek 3).Za celou dobu odběru vzorků (0-250 min) bylo v mozkomíšním moku v průměru detekováno pouze asi 1 x 10-3 % titrů fága T7 v krvi a 4 x 10-8 % původně infundovaných fágů.Je pozoruhodné, že poločas (25,7 min) fága divokého typu v mozkomíšním moku byl podobný jako v krvi.Tato data ukazují, že bariéra oddělující oddíl CSF od krve je u krys s CM-kanylací neporušená, což umožňuje in vivo selekci fágových knihoven pro identifikaci klonů, které jsou snadno transportovány z krve do oddílu CSF.
(a) Nastavení metody pro opětovné odběry mozkomíšního moku (CSF) z velkého fondu.(b) Diagram znázorňující buněčné umístění bariéry centrálního nervového systému (CNS) a selekční strategii použitou k identifikaci peptidů, které procházejí hematoencefalickou bariérou (BBB) ​​a hematoencefalickou bariérou.(c) Vývojový diagram screeningu in vivo fágového displeje.V každém kole selekce byly intravenózně injikovány fágy (identifikátory zvířat uvnitř šipek).Dvě nezávislé alternativní větve (A, B) jsou vedeny odděleně až do 4. kola výběru.Pro kola selekce 3 a 4 byl každý klon fága extrahovaný z CSF ručně sekvenován.(d) Kinetika fága izolovaného z krve (červené kroužky) a mozkomíšního moku (zelené trojúhelníky) během prvního kola selekce u dvou kanylovaných potkanů ​​po intravenózní injekci T7 peptidové knihovny (2 x 1012 fágů/zvíře).Modré čtverečky označují průměrnou počáteční koncentraci fága v krvi, vypočítanou z množství injikovaného fága, přičemž se bere v úvahu celkový objem krve.Černé čtverečky označují průsečík čáry y extrapolované z koncentrací krevních fágů.(e,f) Prezentujte relativní frekvenci a distribuci všech možných překrývajících se tripeptidových motivů nalezených v peptidu.Je zobrazen počet motivů nalezených v 1000 čteních.Výrazně (p < 0,001) obohacené motivy jsou označeny červenými tečkami.(e) Korelační bodový graf srovnávající relativní frekvenci tripeptidového motivu injikované knihovny s fágem získaným z krve ze zvířat #1.1 a #1.2.(f) Korelační bodový graf srovnávající relativní frekvence zvířecích fágových tripeptidových motivů #1.1 a #1.2 izolovaných v krvi a mozkomíšním moku.(g, h) Reprezentace sekvence ID fága obohaceného v krvi (g) versus injikované knihovny a fág obohacený o CSF ​​(h) versus krev po kole selekce in vivo u obou zvířat.Velikost jednopísmenného kódu udává, jak často se tato aminokyselina vyskytuje na dané pozici.Zelená = polární, fialová = neutrální, modrá = zásaditá, červená = kyselá a černá = hydrofobní aminokyseliny.Obrázek 1a, b navrhl a vyrobil Eduard Urich.
Injektovali jsme fágovou peptidovou knihovnu do dvou přístrojových krys CM (klad A a B) a izolovali jsme fág z mozkomíšního moku a krve (obrázek 1d).Počáteční rychlá clearance knihovny byla méně výrazná ve srovnání s fágem divokého typu.Průměrný poločas injikované knihovny u obou zvířat byl 24,8 minut v krvi, podobně jako u fága divokého typu, a 38,5 minut v CSF.Vzorky fágů krve a mozkomíšního moku od každého zvířete byly podrobeny HTS a všechny identifikované peptidy byly analyzovány na přítomnost krátkého tripeptidového motivu.Tripeptidové motivy byly vybrány, protože poskytují minimální základ pro tvorbu struktury a interakce peptid-protein14,15.Našli jsme dobrou korelaci v distribuci motivů mezi injikovanou fágovou knihovnou a klony extrahovanými z krve obou zvířat (obr. 1e).Data naznačují, že složení knihovny je pouze okrajově obohaceno v krevním kompartmentu.Aminokyselinové frekvence a konsenzuální sekvence byly dále analyzovány v každé pozici pomocí adaptace softwaru Weblogo16.Zajímavé je, že jsme zjistili silné obohacení zbytků glycinu v krvi (obr. 1g).Když byla krev porovnána s klony vybranými z CSF, byla pozorována silná selekce a určitá deselekce motivů (obr. lf) a určité aminokyseliny byly přednostně přítomny v předem určených pozicích ve 12členném členu (obr. lh).Je pozoruhodné, že jednotlivá zvířata se významně lišila v mozkomíšním moku, zatímco u obou zvířat bylo pozorováno obohacení krevního glycinu (doplňkový obr. 4a–j).Po přísné filtraci sekvenčních dat v mozkomíšním moku zvířat #1.1 a #1.2 bylo získáno celkem 964 a 420 jedinečných 12-merních peptidů (doplňkový obr. 1d–e).Izolované fágové klony byly amplifikovány a podrobeny druhému kolu selekce in vivo.Fág extrahovaný z druhého kola selekce byl podroben HTS u každého zvířete a všechny identifikované peptidy byly použity jako vstup do programu rozpoznávání motivů pro analýzu výskytu tripeptidových motivů (obr. 2a, b, ef).Ve srovnání s prvním cyklem fága získaného z CSF jsme pozorovali další selekci a deselekci mnoha motivů v CSF ve větvích A a B (obr. 2).Algoritmus identifikace sítě byl použit k určení, zda představují různé vzory konzistentní sekvence.Byla pozorována jasná podobnost mezi 12-rozměrnými sekvencemi získanými CSF v alternativním kladu A (obr. 2c, d) a kladu B (obr. 2g, h).Sdružená analýza v každé větvi odhalila různé profily selekce pro 12-merní peptidy (doplňkový obrázek 5c, d) a zvýšení poměru titrů CSF/krev v průběhu času pro spojené klony po druhém kole selekce ve srovnání s prvním kolem selekce (doplňkový obrázek 5e).).
Obohacení motivů a peptidů v mozkomíšním moku dvěma po sobě jdoucími koly in vivo funkční selekce fágového displeje.
Všechny fágy mozkomíšního moku získané z prvního kola každého zvířete (zvířata č. 1.1 a č. 1.2) byly spojeny, amplifikovány, sekvenovány HT a reinjektovány společně (2 x 1010 fágů/zvíře) 2 SM kanylovaným krysám (č. 1.1 → #).2.1 a 2.2, 1.2 -> 2.3 a 2.4).(a,b,e,f) Korelační rozptylové grafy porovnávající relativní frekvenci tripeptidových motivů všech fágů odvozených z CSF v prvním a druhém kole selekce.Relativní frekvence a distribuce motivů představujících všechny možné překrývající se tripeptidy nalezené v peptidech v obou orientacích.Je zobrazen počet motivů nalezených v 1000 čteních.Motivy, které byly významně (p < 0,001) vybrány nebo vyloučeny v jedné z porovnávaných knihoven, jsou zvýrazněny červenými tečkami.(c, d, g, h) Reprezentace loga sekvence všech sekvencí dlouhých 12 aminokyselin bohatých na CSF na základě kol 2 a 1 selekce in vivo.Velikost jednopísmenného kódu udává, jak často se tato aminokyselina vyskytuje na dané pozici.Pro znázornění loga se porovnává frekvence CSF sekvencí extrahovaných z jednotlivých zvířat mezi dvěma selekčními koly a jsou zobrazeny obohacené sekvence ve druhém kole: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 a (h) #1.2–#2.4.Nejvíce obohacené aminokyseliny na dané pozici u (c, d) zvířat č.2.1 a ne.2.2 nebo (g, h) u zvířat č.2.3 a ne.2.4 jsou zobrazeny barevně.Zelená = polární, fialová = neutrální, modrá = zásaditá, červená = kyselá a černá = hydrofobní aminokyseliny.
Po třetím kole selekce jsme identifikovali 124 jedinečných peptidových sekvencí (č. 3.1 a #3.2) z 332 fágových klonů rekonstituovaných CSF izolovaných ze dvou zvířat (doplňkový obrázek 6a).Nejvyšší relativní podíl měla sekvence LGSVS (18,7 %), následovaná inzerty divokého typu PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) a SARGSWREIVSLS (2,2 %).V posledním čtvrtém kole jsme spojili dvě nezávisle vybrané větve ze tří samostatných zvířat (obr. 1c).Z 925 sekvenovaných fágových klonů získaných z CSF jsme ve čtvrtém kole našli 64 jedinečných peptidových sekvencí (doplňkový obr. 6b), mezi nimiž relativní podíl fága divokého typu klesl na 0,8 %.Nejčastějšími CSF klony ve čtvrtém kole byly LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) a RLSSVDSDLSGC (3, 2).%)).Rozsah délek vybraných peptidů je způsoben nukleotidovými inzercemi/delecemi nebo předčasnými stop kodony v primerech knihovny při použití degenerovaných kodonů pro návrh knihovny NNK.Předčasné stop kodony generují kratší peptidy a jsou vybrány, protože obsahují příznivý aa motiv.Delší peptidy mohou být výsledkem inzercí/delecí v primerech syntetických knihoven.To umístí navržený stop kodon mimo rámec a čte jej, dokud se ve směru proudu neobjeví nový stop kodon.Obecně jsme vypočítali faktory obohacení pro všechna čtyři výběrová kola porovnáním vstupních dat s výstupními daty vzorku.Pro první kolo screeningu jsme použili titry fágů divokého typu jako nespecifickou referenci na pozadí.Zajímavé je, že negativní fágová selekce byla velmi silná v prvním cyklu CSF, ale ne v krvi (obr. 3a), což může být způsobeno nízkou pravděpodobností pasivní difúze většiny členů peptidové knihovny do kompartmentu CSF nebo relativní fágy mají tendenci být účinněji zadržovány nebo odstraněny z krevního řečiště než bakteriofágy.Nicméně ve druhém kole panningu byla pozorována silná selekce fágů v CSF v obou kladech, což naznačuje, že předchozí kolo bylo obohaceno o fágy vykazující peptidy, které podporují absorpci CSF (obr. 3a).Opět bez výrazného obohacení krve.Také ve třetím a čtvrtém kole byly fágové klony významně obohaceny o CSF.Porovnáním relativní frekvence každé jedinečné peptidové sekvence mezi posledními dvěma cykly selekce jsme zjistili, že sekvence byly ještě více obohaceny ve čtvrtém kole selekce (obr. 3b).Celkem 931 tripeptidových motivů bylo extrahováno ze všech 64 unikátních peptidových sekvencí za použití obou peptidových orientací.Nejvíce obohacené motivy ve čtvrtém kole byly podrobněji zkoumány z hlediska jejich profilů obohacení ve všech kolech ve srovnání s injektovanou knihovnou (mezní hodnota: 10% obohacení) (doplňkový obrázek 6c).Obecné vzorce výběru ukázaly, že většina studovaných motivů byla obohacena ve všech předchozích kolech obou výběrových větví.Některé motivy (např. SGL, VSG, LGS GSV) však byly převážně z alternativního kladu A, zatímco jiné (např. FGW, RTN, WGF, NTR) byly obohaceny o alternativní klad B.
Validace CSF transportu CSF obohacených peptidů vystavených na fágu a biotinylovaných vedoucích peptidů konjugovaných se streptavidinovým nákladem.
(a) Poměry obohacení vypočítané ve všech čtyřech kolech (R1-R4) na základě injikovaných (vstup = I) fágových (PFU) titrů a stanovených titrů fágů CSF (výstup = O).Faktory obohacení pro poslední tři kola (R2-R4) byly vypočteny porovnáním s předchozím kolem a prvním kolem (R1) s údaji o hmotnosti.Otevřené sloupce jsou mozkomíšní mok, stínované sloupce jsou plazma.(***p<0,001, na základě Studentova t-testu).(b) Seznam nejhojnějších fágových peptidů, seřazených podle jejich relativního poměru ke všem fágům odebraným v CSF po 4. kole selekce.Šest nejběžnějších fágových klonů je barevně zvýrazněno, očíslováno a jejich faktory obohacení mezi koly 3 a 4 selekce (vložky).(c, d) Šest nejvíce obohacených fágových klonů, prázdných fágových a rodičovských fágových peptidových knihoven ze 4. kola bylo analyzováno individuálně v modelu odběru vzorků CSF.Vzorky CSF a krve byly odebrány v uvedených časových bodech.(c) Stejná množství 6 kandidátních fágových klonů (2 x 1010 fágů/zvířata), prázdných fágů (# 1779) (2 x 1010 fágů/zvířata) a zásobních fágových peptidových knihoven (2 x 1012 fágů/zvířata) Injikujte alespoň 3 kanylované CM odděleně do ocasu.Je ukázána farmakokinetika CSF každého injikovaného fágového klonu a knihovny fágových peptidů v průběhu času.(d) ukazuje průměrný poměr CSF/krev pro všechny získané fágy/ml během doby odběru vzorků.(e) Čtyři syntetické vedoucí peptidy a jedna míchaná kontrola byly spojeny s biotinem se streptavidinem přes jejich N-konec (tetramerový displej) s následnou injekcí (ocasní žíla iv, 10 mg streptavidinu/kg).Alespoň tři intubovaní potkani (N = 3).).Vzorky CSF byly odebrány v uvedených časových bodech a koncentrace streptavidinu byly měřeny pomocí CSF anti-streptavidin ELISA (nd = nezjištěno).(*p<0,05,**p<0,01,***p<0,001, na základě testu ANOVA).(f) Porovnání aminokyselinové sekvence nejvíce obohaceného fágového peptidového klonu #2002 (fialový) s dalšími vybranými fágovými peptidovými klony ze 4. kola selekce.Identické a podobné fragmenty aminokyselin jsou barevně odlišeny.
Ze všech obohacených fágů ve čtvrtém kole (obr. 3b) bylo vybráno šest kandidátních klonů pro další individuální analýzu v modelu odběru vzorků CSF.Stejná množství šesti kandidátních fágů, prázdných fágů (bez inzertu) a profágových peptidových knihoven byla injikována třem kanylovaným CM zvířatům a farmakokinetika byla stanovena v CSF (obr. 3c) a krevních (doplňkový obr. 7) testech.Všechny testované fágové klony cílily na CSF kompartment na úrovni 10-1000krát vyšší než u prázdného kontrolního fága (č. 1779).Například klony #2020 a #2077 měly asi 1000krát vyšší titry CSF než kontrolní fág.Farmakokinetický profil každého vybraného peptidu je odlišný, ale všechny mají vysokou schopnost navádění do CSF.Pozorovali jsme konstantní pokles v průběhu času u klonů #1903 a #2011, zatímco u klonů #2077, #2002 a #2009 může nárůst během prvních 10 minut naznačovat aktivní transport, ale musí být ověřen.Klony #2020, #2002 a #2077 se stabilizovaly na vysokých hladinách, zatímco koncentrace CSF klonu #2009 po počátečním zvýšení pomalu klesala.Poté jsme porovnali relativní frekvenci každého kandidáta CSF s jeho koncentrací v krvi (obr. 3d).Korelace průměrného titru každého kandidáta CSF s jeho krevním titrem ve všech časech odběru vzorků ukázala, že tři ze šesti kandidátů byli významně obohaceni o krevní CSF.Je zajímavé, že klon #2077 vykazoval vyšší stabilitu krve (doplňkový obrázek 7).Abychom potvrdili, že samotné peptidy jsou schopny aktivně transportovat náklad jiný než fágové částice do CSF ​​kompartmentu, syntetizovali jsme čtyři vedoucí peptidy derivatizované biotinem na N-konci, kde se peptidy připojují k fágové částici.Biotinylované peptidy (č. 2002, 2009, 2020 a 2077) byly konjugovány se streptavidinem (SA), aby se získaly multimerní formy poněkud napodobující geometrii fága.Tento formát nám také umožnil měřit expozici SA v krvi a mozkomíšním moku jako proteinové peptidy transportující náklad.Důležité je, že fágová data mohla být často reprodukována, když byly syntetické peptidy podávány v tomto SA-konjugovaném formátu (obr. 3e).Míchané peptidy měly nižší počáteční expozici a rychlejší clearance CSF s nedetekovatelnými hladinami během 48 hodin.Abychom získali přehled o transportních drahách těchto peptidových fágových klonů do CSF ​​prostoru, analyzovali jsme lokalizaci jednotlivých fágových peptidových zásahů pomocí imunohistochemie (IHC) k přímé detekci fágových částic 1 hodinu po intravenózní injekci in vivo.Je pozoruhodné, že klony #2002, #2077 a #2009 mohly být detekovány silným barvením v mozkových kapilárách, zatímco kontrolní fág (#1779) a klon #2020 nebyly detekovány (doplňkový obrázek 8).To naznačuje, že tyto peptidy přispívají k účinku na mozek právě tím, že procházejí BBB.K otestování této hypotézy je nutná další podrobná analýza, protože může být zapojena i cesta BSCFB.Při porovnávání aminokyselinové sekvence nejvíce obohaceného klonu (#2002) s jinými vybranými peptidy bylo zjištěno, že některé z nich mají podobná rozšíření aminokyselin, což může naznačovat podobný transportní mechanismus (obr. 3f).
Díky svému jedinečnému plazmatickému profilu a významnému nárůstu CSF v průběhu času byl klon fágového displeje #2077 dále zkoumán po delší 48hodinové období a byl schopen reprodukovat rychlý nárůst CSF pozorovaný ve spojení s trvalými hladinami SA (obr. 4a).Pokud jde o další identifikované fágové klony, č. 2077 se silně barvil na mozkové kapiláry a vykazoval významnou kolokalizaci s kapilárním markerovým lektinem, když byl pozorován při vyšším rozlišení a možná i nějaké zabarvení v parenchymálním prostoru (obrázek 4b).Abychom prozkoumali, zda by bylo možné získat farmakologické účinky zprostředkované peptidy v CNS, provedli jsme experiment, ve kterém byly biotinylované verze i) tranzitního peptidu č. 2077 a ii) inhibičního peptidu BACE1 smíchány s SA ve dvou různých poměrech.Pro jednu kombinaci jsme použili pouze inhibitor peptidu BACE1 a pro druhou jsme použili poměr 1:3 peptidového inhibitoru BACE1 k peptidu #2077.Oba vzorky byly podávány intravenózně a v průběhu času byly měřeny hladiny beta-amyloidního peptidu 40 (Abeta40) v krvi a mozkomíšním moku.Abeta40 byl měřen v CSF, protože odráží inhibici BACE1 v mozkovém parenchymu.Jak se očekávalo, oba komplexy významně snížily hladiny Abeta40 v krvi (obr. 4c, d).Avšak pouze vzorky obsahující směs peptidu č.2077 a inhibitor peptidu BACE1 konjugovaný s SA způsobil významný pokles Abeta40 v mozkomíšním moku (obr. 4c).Data ukazují, že peptid č.2077 je schopen transportovat 60 kDa SA protein do CNS a také indukuje farmakologické účinky s SA-konjugovanými inhibitory peptidu BACE1.
(a) Klonální injekce (2 x 10 fágů/zvíře) fága T7 vykazující dlouhodobé farmakokinetické profily CSF peptidu #2077 (RLSSVDSDLSGC) a neinjikovaného kontrolního fága (#1779) u alespoň tří CM-intubovaných potkanů.(b) Konfokální mikroskopický snímek reprezentativních kortikálních mikrocév u krys s injekcí fágů (2 x 1010 fágů/zvíře) ukazující kontrastní barvení peptidu #2077 a cév (lektin).Tyto fágové klony byly podávány 3 krysám a ponechány cirkulovat po dobu 1 hodiny před perfuzí.Mozky byly nařezány a obarveny polyklonálními FITC-značenými protilátkami proti T7 fágové kapsidě.Deset minut před perfuzí a následnou fixací byl intravenózně podán lektin značený DyLight594.Fluorescenční snímky ukazující barvení lektinem (červeně) na luminální straně mikrocév a fágů (zeleně) v lumen kapilár a perivaskulární mozkové tkáně.Lišta měřítka odpovídá 10 µm.(c, d) Biotinylovaný BACE1 inhibiční peptid samotný nebo v kombinaci s biotinylovaným tranzitním peptidem #2077 byl spojen se streptavidinem a následně intravenózní injekcí alespoň třem kanylovaným CM potkanům (10 mg streptavidinu/kg).Snížení Ap40 zprostředkované peptidovým inhibitorem BACE1 bylo měřeno pomocí Api-40 ELISA v krvi (červená) a mozkomíšním moku (oranžová) v uvedených časových bodech.Pro lepší přehlednost je na grafu nakreslena tečkovaná čára v měřítku 100 %.(c) Procentuální snížení Ap40 v krvi (červené trojúhelníky) a mozkomíšním moku (oranžové trojúhelníky) u potkanů ​​léčených streptavidinem konjugovaným s tranzitním peptidem #2077 a inhibičním peptidem BACE1 v poměru 3:1.(d) Procentuální snížení krevního Ap40 (červené kroužky) a mozkomíšního moku (oranžové kroužky) potkanů ​​léčených streptavidinem spojeným pouze s BACE1 inhibičním peptidem.Koncentrace Ap v kontrole byla 420 pg/ml (směrodatná odchylka = 101 pg/ml).
Fágový displej byl úspěšně aplikován v několika oblastech biomedicínského výzkumu17.Tato metoda byla použita pro in vivo studie vaskulární diverzity18,19 stejně jako studie zaměřené na mozkové cévy20,21,22,23,24,25,26.V této studii jsme rozšířili aplikaci této selekční metody nejen na přímou identifikaci peptidů zacílených na mozkové cévy, ale také na objev kandidátů s aktivními transportními vlastnostmi pro přechod hematoencefalickou bariérou.Nyní popisujeme vývoj in vivo selekčního postupu u CM intubovaných potkanů ​​a demonstrujeme jeho potenciál identifikovat peptidy s CSF naváděcími vlastnostmi.Pomocí fága T7, který zobrazuje knihovnu 12-merních náhodných peptidů, jsme byli schopni prokázat, že fág T7 je dostatečně malý (přibližně 60 nm v průměru)10 na to, aby byl adaptován na hematoencefalickou bariéru, a tím přímo procházel hematoencefalickou bariérou nebo choroidálním plexem.Pozorovali jsme, že odběr mozkomíšního moku z kanylovaných CM potkanů ​​byl dobře kontrolovaný in vivo funkční screeningový způsob a že extrahovaný fág se nejen vázal na vaskulatuře, ale také fungoval jako transportér přes hematoencefalickou bariéru.Kromě toho jsme současným odběrem krve a aplikací HTS na CSF ​​a fágy získané z krve potvrdili, že náš výběr CSF nebyl ovlivněn obohacením krve nebo vhodností pro expanzi mezi koly selekce.Krevní kompartment je však součástí selekčního postupu, protože fágy schopné dostat se do CSF ​​kompartmentu musí přežít a cirkulovat v krevním řečišti dostatečně dlouho, aby se obohatily v mozku.Abychom získali spolehlivé informace o sekvenci z nezpracovaných dat HTS, implementovali jsme filtry přizpůsobené chybám sekvenování specifickým pro platformu v pracovním postupu analýzy.Začleněním kinetických parametrů do screeningové metody jsme potvrdili rychlou farmakokinetiku divokých fágů T7 (t½ ~ 28 min) v krvi24, 27, 28 a také stanovili jejich poločas v mozkomíšním moku (t½ ~ 26 min) za minutu.Navzdory podobným farmakokinetickým profilům v krvi a CSF bylo možné v CSF detekovat pouze 0,001 % koncentrace fága v krvi, což ukazuje na nízkou mobilitu pozadí fága T7 divokého typu přes hematoencefalickou bariéru.Tato práce zdůrazňuje důležitost prvního kola selekce při použití strategií panningu in vivo, zejména pro fágové systémy, které jsou rychle odstraněny z oběhu, protože jen málo klonů je schopno dosáhnout kompartmentu CNS.V prvním kole tedy bylo snížení diverzity knihovny velmi velké, protože v tomto velmi přísném modelu CSF byl nakonec shromážděn pouze omezený počet klonů.Tato in vivo strategie panningu zahrnovala několik selekčních kroků, jako je aktivní akumulace v CSF kompartmentu, přežití klonů v krevním kompartmentu a rychlé odstranění T7 fágových klonů z krve během prvních 10 minut (obr. 1d a doplňkový obr. 4M).).Po prvním kole byly tedy v CSF identifikovány různé fágové klony, ačkoli pro jednotlivá zvířata byl použit stejný počáteční soubor.To naznačuje, že více přísných kroků výběru pro zdrojové knihovny s velkým počtem členů knihovny vede k významnému snížení diverzity.Náhodné události se proto stanou nedílnou součástí procesu počátečního výběru a výrazně ovlivní výsledek.Je pravděpodobné, že mnoho klonů v původní knihovně mělo velmi podobný sklon k obohacení CSF.Avšak i za stejných experimentálních podmínek se mohou výsledky selekce lišit v důsledku malého počtu každého konkrétního klonu v počátečním poolu.
Motivy obohacené CSF se liší od motivů v krvi.Je zajímavé, že jsme zaznamenali první posun směrem k peptidům bohatým na glycin v krvi jednotlivých zvířat.(Obr. 1g, doplňkové obrázky 4e, 4f).Fág obsahující glycinové peptidy může být stabilnější a méně pravděpodobné, že bude odstraněn z oběhu.Tyto peptidy bohaté na glycin však nebyly detekovány ve vzorcích mozkomíšního moku, což naznačuje, že kurátorské knihovny prošly dvěma různými selekčními kroky: jeden v krvi a další se nechal akumulovat v mozkomíšním moku.Klony obohacené CSF pocházející ze čtvrtého kola selekce byly rozsáhle testovány.Téměř u všech individuálně testovaných klonů bylo potvrzeno, že jsou obohacené o CSF ​​ve srovnání se slepým kontrolním fágem.Jeden peptidový zásah (#2077) byl zkoumán podrobněji.Vykázal delší plazmatický poločas ve srovnání s jinými zásahy (obrázek 3d a doplňkový obrázek 7) a zajímavé je, že tento peptid obsahoval cysteinový zbytek na C-konci.Nedávno se ukázalo, že přidání cysteinu k peptidům může zlepšit jejich farmakokinetické vlastnosti vazbou na albumin29.To je v současnosti pro peptid #2077 neznámé a vyžaduje další studium.Některé peptidy vykazovaly valenční závislost v obohacení CSF (data nejsou uvedena), což může souviset se zobrazenou povrchovou geometrií kapsidy T7.Systém T7, který jsme použili, ukázal 5-15 kopií každého peptidu na fágovou částici.IHC byla provedena na kandidátních vedoucích fágových klonech injikovaných intravenózně do mozkové kůry krys (doplňkový obr. 8).Data ukázala, že alespoň tři klony (č. 2002, č. 2009 a č. 2077) interagovaly s BBB.Zbývá určit, zda tato interakce BBB vede k akumulaci CSF nebo pohybu těchto klonů přímo do BCSFB.Důležité je, že jsme ukázali, že vybrané peptidy si zachovávají svou transportní kapacitu CSF, když jsou syntetizovány a navázány na proteinový náklad.Vazba N-terminálních biotinylovaných peptidů na SA v podstatě opakuje výsledky získané s jejich příslušnými fágovými klony v krvi a mozkomíšním moku (obr. 3e).Nakonec jsme ukázali, že vedoucí peptid #2077 je schopen podporovat mozkové působení biotinylovaného peptidového inhibitoru BACE1 konjugovaného s SA, což způsobuje výrazné farmakodynamické účinky v CNS významným snížením hladin Abeta40 v CSF (obr. 4).Nebyli jsme schopni identifikovat žádné homology v databázi provedením hledání homologie peptidové sekvence všech zásahů.Je důležité poznamenat, že velikost knihovny T7 je přibližně 109, zatímco teoretická velikost knihovny pro 12-mery je 4 x 1015. Proto jsme vybrali pouze malou část prostoru diverzity knihovny 12merních peptidů, což může znamenat, že vyhodnocením prostoru sousedních sekvencí těchto identifikovaných zásahů lze identifikovat více optimalizovaných peptidů.Hypoteticky jedním z důvodů, proč jsme nenašli žádné přirozené homology těchto peptidů, může být deselekce během evoluce, aby se zabránilo nekontrolovanému vstupu určitých peptidových motivů do mozku.
Celkově vzato naše výsledky poskytují základ pro budoucí práci na podrobnější identifikaci a charakterizaci transportních systémů cerebrovaskulární bariéry in vivo.Základní nastavení této metody je založeno na strategii funkční selekce, která nejen identifikuje klony s cerebrálními vaskulárními vazebnými vlastnostmi, ale zahrnuje také kritický krok, ve kterém úspěšné klony mají vnitřní aktivitu pro překračování biologických bariér in vivo do kompartmentu CNS.je objasnit mechanismus transportu těchto peptidů a jejich preferenci pro vazbu k mikrovaskulatuře specifické pro oblast mozku.To může vést k objevu nových cest pro transport BBB a receptorů.Očekáváme, že identifikované peptidy se mohou přímo vázat na cerebrovaskulární receptory nebo na cirkulující ligandy transportované přes BBB nebo BCSFB.Peptidové vektory s CSF transportní aktivitou objevené v této práci budou dále zkoumány.V současné době zkoumáme mozkovou specificitu těchto peptidů pro jejich schopnost procházet přes BBB a/nebo BCSFB.Tyto nové peptidy budou mimořádně cennými nástroji pro potenciální objev nových receptorů nebo drah a pro vývoj nových vysoce účinných platforem pro dodávání makromolekul, jako jsou biologické látky, do mozku.
Kanylujte velkou cisternu (CM) pomocí modifikace výše popsané metody.Anestetizované krysy Wistar (200-350 g) byly upevněny na stereotaxické zařízení a byl proveden střední řez na oholené a asepticky připravené pokožce hlavy, aby se odhalila lebka.Vyvrtejte dva otvory v oblasti horního křídla a upevněte do nich upevňovací šrouby.Do laterálního okcipitálního hřebene byl vyvrtán další otvor pro stereotaktické vedení kanyly z nerezové oceli do CM.Kolem kanyly naneste dentální cement a zajistěte šrouby.Po fotovytvrzení a vytvrzení cementu byla kožní rána uzavřena supramidovým stehem 4/0.Správné umístění kanyly je potvrzeno spontánním únikem mozkomíšního moku (CSF).Vyjměte potkana ze stereotaxického aparátu, dopřejte mu vhodnou pooperační péči a zvládání bolesti a nechte ho zotavit se alespoň jeden týden, dokud se v mozkomíšním moku neobjeví známky krve.Krysy Wistar (Crl:WI/Han) byly získány od Charles River (Francie).Všechny krysy byly drženy za specifických podmínek bez patogenů.Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny Veterinárním úřadem města Basilej, Švýcarsko a byly provedeny v souladu s licencí pro zvířata č. 2474 (Assessment of Active Brain Transport by Measuring Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat).
Jemně udržujte krysu při vědomí s CM kanylou v ruce.Vyjměte Datura z kanyly a odeberte 10 µl spontánně vytékajícího mozkomíšního moku.Vzhledem k tomu, že průchodnost kanyly byla nakonec ohrožena, byly do této studie zahrnuty pouze čisté vzorky mozkomíšního moku bez známek kontaminace krve nebo změny barvy.Paralelně bylo odebráno přibližně 10–20 μl krve z malého řezu na špičce ocasu do zkumavek s heparinem (Sigma-Aldrich).CSF a krev byly odebrány v různých časových bodech po intravenózní injekci fága T7.Před odběrem každého vzorku CSF bylo zlikvidováno přibližně 5–10 μl tekutiny, což odpovídá mrtvému ​​objemu katétru.
Knihovny byly vytvořeny pomocí vektoru T7Select 10-3b, jak je popsáno v systémové příručce T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Stručně, náhodný 12-merní DNA insert byl syntetizován v následujícím formátu:
Kodon NNK byl použit, aby se zabránilo dvojitým stop kodonům a nadměrné expresi aminokyselin v insertu.N je ručně smíchaný ekvimolární poměr každého nukleotidu a K je ručně smíchaný ekvimolární poměr adeninových a cytosinových nukleotidů.Jednovláknové oblasti byly převedeny na dvouvláknovou DNA další inkubací s dNTP (Novagen) a Klenowovým enzymem (New England Biolabs) v Klenowově pufru (New England Biolabs) po dobu 3 hodin při 37 °C.Po reakci byla dvouvláknová DNA získána precipitací EtOH.Výsledná DNA byla štěpena restrikčními enzymy EcoRI a HindIII (oba od Roche).Štěpený a purifikovaný (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligáza, New England Biolabs) byl poté ligován v rámci do předem rozštěpeného vektoru T7 po aminokyselině 348 genu kapsidy 10B.Ligační reakce byly inkubovány při 16 °C po dobu 18 hodin před balením in vitro.Fágové balení in vitro bylo provedeno podle instrukcí dodaných s T7Select 10-3b klonovací soupravou (Novagen) a balicí roztok byl jednou amplifikován k lýze pomocí Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lyzáty byly odstředěny, titrovány a zmraženy při -80 °C jako zásobní roztok glycerolu.
Přímá PCR amplifikace fágových variabilních oblastí amplifikovaných v bujónu nebo na destičce s použitím patentovaných fúzních primerů 454/Roche-amplikon.Dopředný fúzní primer obsahuje sekvence lemující variabilní oblast (NNK) 12 (specifická pro šablonu), GS FLX Titanium Adapter A a klíčovou sekvenci knihovny se čtyřmi bázemi (TCAG) (doplňkový obrázek 1a):
Reverzní fúzní primer také obsahuje biotin připojený k zachycení kuliček a GS FLX Titanium Adapter B potřebný pro klonální amplifikaci během emulzní PCR:
Amplikony byly poté podrobeny pyrosekvenování 454/Roche podle protokolu 454 GS-FLX Titanium.Pro manuální Sangerovo sekvenování (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) byla T7 fágová DNA amplifikována pomocí PCR a sekvenována pomocí následujících párů primerů:
Inzerty z jednotlivých plaků byly podrobeny PCR amplifikaci pomocí Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (podle pokynů výrobce).Proveďte horký start (10 min při 95 °C) a 35 cyklů boostu (50 s při 95 °C, 1 min při 50 °C a 1 min při 72 °C).
Fág z knihoven, fág divokého typu, fág zachráněný z CSF a krve nebo jednotlivé klony byly amplifikovány v Escherichia coli BL5615 v bujónu TB (Sigma Aldrich) nebo v miskách 500 cm2 (Thermo Scientific) po dobu 4 hodin při 37 °C.Fágy byly extrahovány z destiček promytím destiček pufrem Tris-EDTA (Fluka Analytical) nebo sběrem plaků pomocí sterilních špiček pipet.Fágy byly izolovány z kultivačního supernatantu nebo extrakčního pufru jedním kolem srážení polyethylenglykolem (PEG 8000) (Promega) a resuspendovány v pufru Tris-EDTA.
Amplifikovaný fág byl podroben 2-3 cyklům odstranění endotoxinu pomocí kuliček pro odstranění endotoxinu (Miltenyi Biotec) před intravenózní (IV) injekcí (500 ul/zvíře).V prvním kole bylo zavedeno 2×1012 fágů;ve druhém, 2x1010 fágů;ve třetím a čtvrtém selekčním kole 2x109 fágů na zvíře.Obsah fágů ve vzorcích CSF a krve odebraných v uvedených časových bodech byl stanoven počítáním plaků podle pokynů výrobce (systémová příručka T7Select).Fágová selekce byla provedena intravenózní injekcí purifikovaných knihoven do ocasní žíly nebo opětovnou injekcí fága extrahovaného z CSF z předchozího selekčního kola a následné sklizně byly provedeny po 10 minutách, 30 minutách, 60 minutách, 90 minutách, 120 minutách, 180 minutách a 240 minutách, respektive vzorky CSF a krve.Byla provedena celkem čtyři kola in vivo panning, ve kterých byly dvě vybrané větve odděleně uloženy a analyzovány během prvních tří kol selekce.Všechny fágové inzerty extrahované z CSF z prvních dvou kol selekce byly podrobeny pyrosekvenování 454/Roche, zatímco všechny klony extrahované z CSF z posledních dvou kol selekce byly ručně sekvenovány.Všechny krevní fágy z prvního kola selekce byly také podrobeny pyrosekvenování 454/Roche.Pro injekci fágových klonů byly vybrané fágy amplifikovány v E. coli (BL5615) na 500 cm2 plotnách při 37 °C po dobu 4 hodin.Individuálně vybrané a ručně sekvenované klony byly propagovány v médiu TB.Po extrakci fága, purifikaci a odstranění endotoxinu (jak je popsáno výše) bylo 2x1010 fágů/zvíře ve 300 ul intravenózně injikováno do jedné ocasní žíly.
Předzpracování a kvalitativní filtrování sekvenčních dat.Nezpracovaná data 454/Roche byla převedena z binárního standardního formátu mapy proudu (sff) do formátu Pearson čitelného člověkem (fasta) pomocí softwaru dodavatele.Další zpracování nukleotidové sekvence bylo provedeno s použitím proprietárních C programů a skriptů (nevydaný softwarový balíček), jak je popsáno níže.Analýza primárních dat zahrnuje přísné vícestupňové filtrační postupy.Aby bylo možné odfiltrovat čtení, která neobsahovala platnou 12merní sekvenci DNA inzertu, byly čtení postupně zarovnány na počáteční značku (GTGATGTCGGGGGATCCGAATTCT), stop značku (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) a inzert na pozadí (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) pomocí globálního testu.zarovnání umožňující až 2 nekonzistence na zarovnání31.Proto byla z knihovny odstraněna čtení bez značek start a stop a čtení obsahující vložky na pozadí, tj. zarovnání, která překračují povolený počet neshod.Pokud jde o zbývající čtení, sekvence N-mer DNA rozprostírající se od počáteční značky a končící před značkou stop byla vyříznuta z původní čtené sekvence a dále zpracována (dále jen „vložení“).Po translaci inzertu se z inzertu odstraní část za prvním stop kodonem na 5' konci primeru.Kromě toho byly také odstraněny nukleotidy vedoucí k neúplným kodonům na 3' konci primeru.Aby se vyloučily inzerty obsahující pouze sekvence pozadí, byly také odstraněny přeložené inzerty začínající vzorem aminokyselin „PAG“.Peptidy s posttranslační délkou menší než 3 aminokyseliny byly z knihovny odstraněny.Nakonec odstraňte redundanci ve fondu vložek a určete frekvenci každé jedinečné vložky.Výsledky této analýzy zahrnovaly seznam nukleotidových sekvencí (vložení) a jejich (čtení) frekvencí (doplňkové obrázky 1c a 2).
Seskupit N-mer DNA inzerty podle sekvenční podobnosti: Aby se eliminovaly 454/Roche-specifické sekvenační chyby (jako jsou problémy se sekvenováním homopolymerních extenzí) a odstranily se méně důležité redundance, jsou dříve filtrované N-mer DNA sekvenční inzerty (inserty) seřazeny podle podobnosti.vložení (povoleny jsou až 2 neshodné báze) pomocí iterativního algoritmu definovaného takto: vložení se třídí nejprve podle jejich frekvence (od nejvyšší k nejnižší), a pokud jsou stejné, podle sekundárního řazení podle délky (od nejdelší k nejkratší) ).Nejčastější a nejdelší vkládání tedy definují první „skupinu“.Frekvence skupiny je nastavena na frekvenci klíče.Poté se každé vložení zbývající v setříděném seznamu pokusilo přidat do skupiny pomocí párového zarovnání Needleman-Wunsch.Pokud počet neshod, inzercí nebo delecí v zarovnání nepřekročí práh 2, přidá se do skupiny vložení a celková frekvence skupiny se zvýší o to, jak často bylo vložení přidáno.Přílohy přidané do skupiny jsou označeny jako použité a vyloučeny z dalšího zpracování.Pokud nelze inzertní sekvenci přidat do již existující skupiny, inzertní sekvence se použije k vytvoření nové skupiny s příslušnou inzertní frekvencí a označí se jako použitá.Iterace končí, když byla každá vkládací sekvence buď použita k vytvoření nové skupiny, nebo může být zahrnuta do již existující skupiny.Seskupené inzerty sestávající z nukleotidů jsou nakonec přeloženy do peptidových sekvencí (peptidových knihoven).Výsledkem této analýzy je soubor vložení a jejich odpovídajících frekvencí, které tvoří počet po sobě jdoucích čtení (doplňkový obr. 2).
Generování motivu: Na základě seznamu jedinečných peptidů byla vytvořena knihovna obsahující všechny možné vzorce aminokyselin (aa), jak je uvedeno níže.Každý možný vzor délky 3 byl extrahován z peptidu a jeho inverzní vzor byl přidán spolu se společnou knihovnou motivů obsahující všechny vzory (tripeptidy).Knihovny vysoce repetitivních motivů byly sekvenovány a redundance byla odstraněna.Poté jsme pro každý tripeptid v knihovně motivů zkontrolovali jeho přítomnost v knihovně pomocí výpočetních nástrojů.V tomto případě je frekvence peptidu obsahujícího nalezený motivový tripeptid přidána a přiřazena motivu v knihovně motivů („počet motivů“).Výsledkem generování motivu je dvourozměrné pole obsahující všechny výskyty tripeptidů (motivů) a jejich příslušné hodnoty, což jsou počty sekvenačních čtení, jejichž výsledkem je odpovídající motiv, když jsou čtení filtrována, seskupována a překládána.Metriky, jak je podrobně popsáno výše.
Normalizace počtu motivů a odpovídající bodové grafy: Počet motivů pro každý vzorek byl normalizován pomocí
kde ni je počet přečtení obsahující téma i.Vi tedy představuje procentuální frekvenci čtení (nebo peptidů) obsahujících motiv i ve vzorku.P-hodnoty pro nenormalizovaný počet motivů byly vypočteny pomocí Fisherova exaktního testu.Pokud jde o korelogramy počtu motivů, Spearmanovy korelace byly vypočteny pomocí normalizovaného počtu motivů s R.
Pro vizualizaci obsahu aminokyselin na každé pozici v peptidové knihovně byly vytvořeny webové logogramy 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Nejprve je obsah aminokyselin v každé poloze 12-merního peptidu uložen v matrici 20x12.Poté je ve formátu rychlé sekvence vytvořena sada 1000 peptidů obsahujících stejný relativní obsah aminokyselin v každé poloze a poskytnuta jako vstup do webového loga 3, které generuje grafické znázornění relativního obsahu aminokyselin v každé poloze.pro danou knihovnu peptidů.Pro vizualizaci vícerozměrných datových sad byly vytvořeny tepelné mapy pomocí interně vyvinutého nástroje v R (biosHeatmap, dosud nevydaný balíček R).Dendrogramy prezentované v tepelných mapách byly vypočteny pomocí Wardovy hierarchické shlukovací metody s euklidovskou metrikou vzdálenosti.Pro statistickou analýzu dat skórování motivů byly hodnoty P pro nenormalizované skórování vypočteny pomocí Fisherova exaktního testu.P-hodnoty pro jiné soubory dat byly vypočteny v R pomocí Studentova t-testu nebo ANOVA.
Vybrané fágové klony a fágy bez insertů byly injikovány intravenózně přes ocasní žílu (2x1010 fágů/zvíře ve 300 ul PBS).Deset minut před perfuzí a následnou fixací bylo stejným zvířatům intravenózně injikováno 100 ul lektinu značeného DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minut po injekci fága byly krysy promyty srdcem 50 ml PBS a následně 50 ml 4% PFA/PBS.Vzorky mozku byly dodatečně fixovány přes noc ve 4% PFA/PBS a namočeny ve 30% sacharóze přes noc při 4 °C.Vzorky se bleskově zmrazí ve směsi OCT.Imunohistochemická analýza zmrazených vzorků byla prováděna při teplotě místnosti na 30 um kryosekcích blokovaných 1% BSA a inkubovaných s polyklonálními FITC-značenými protilátkami proti T7 fágu (Novus NB 600-376A) při 4 °C.Inkubujte přes noc.Nakonec byly řezy 3krát promyty PBS a zkoumány konfokálním laserovým mikroskopem (Leica TCS SP5).
Všechny peptidy s minimální čistotou 98 % byly syntetizovány GenScript USA, biotinylovány a lyofilizovány.Biotin je vázán prostřednictvím dalšího trojitého glycinového spaceru na N-konci.Zkontrolujte všechny peptidy pomocí hmotnostní spektrometrie.
Streptavidin (Sigma S0677) byl smíchán s 5násobným ekvimolárním přebytkem biotinylovaného peptidu, biotinylovaného inhibičního peptidu BACE1 nebo kombinace (poměr 3:1) biotinylovaného inhibičního peptidu BACE1 a inhibičního peptidu BACE1 v 5–10% DMSO/inkubováno v PBS.1 hodinu při pokojové teplotě před injekcí.Peptidy konjugované se streptavidinem byly intravenózně injikovány v dávce 10 mg/kg do jedné z ocasních žil krys s cerebrální dutinou.
Koncentrace komplexů streptavidin-peptid byla hodnocena pomocí ELISA.Mikrotitrační destičky Nunc Maxisorp (Sigma) byly potaženy přes noc při 4 °C 1,5 ug/ml myší anti-streptavidinové protilátky (Thermo, MA1-20011).Po blokování (blokovací pufr: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % želatina, 1 % BSA) při pokojové teplotě po dobu 2 hodin promyjte destičku 0,05 % Tween-20/PBS (promývací pufr) po dobu 3 sekund, do jamky CSF01 byly přidány blokovací pufry CSF a plazmový pufr, CSF00 a vzorky plazmy ředěné CSF0 1:115).Destička byla poté inkubována přes noc při 4 °C s detekční protilátkou (1 ug/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Po třech promývacích krocích byl streptavidin detekován inkubací v roztoku substrátu TMB (Roche) po dobu až 20 minut.Po zastavení vývoje barvy pomocí 1M H2SO4 změřte absorbanci při 450 nm.
Funkce komplexu streptavidin-peptid-BACE1 inhibitor byla hodnocena pomocí Ap(1-40) ELISA podle protokolu výrobce (Wako, 294-64701).Stručně, vzorky CSF byly zředěny ve standardním ředidle (1:23) a inkubovány přes noc při 4 °C v 96-jamkových destičkách potažených záchytnou protilátkou BNT77.Po pěti promývacích krocích byla přidána HRP-konjugovaná BA27 protilátka a inkubována po dobu 2 hodin při 4 °C, následovalo pět promývacích kroků.Aβ(1–40) byl detekován inkubací v roztoku TMB po dobu 30 minut při pokojové teplotě.Po zastavení vývoje barvy zastavovacím roztokem změřte absorbanci při 450 nm.Vzorky plazmy byly před Aβ(1–40) ELISA podrobeny extrakci na pevné fázi.Plazma byla přidána k 0,2% DEA (Sigma) v 96-jamkových destičkách a inkubována při teplotě místnosti po dobu 30 minut.Po postupném promytí SPE destiček (Oasis, 186000679) vodou a 100% methanolem byly na SPE destičky přidány vzorky plazmy a veškerá kapalina byla odstraněna.Vzorky byly promyty (nejprve 5% methanolem, potom 30% methanolem) a eluovány 2% NH40H/90% methanolem.Po vysušení eluátu při 55 °C po dobu 99 minut při konstantním proudu N2 byly vzorky redukovány standardními ředidly a Aβ(1–40) byl měřen, jak je popsáno výše.
Jak citovat tento článek: Urich, E. et al.Doručení nákladu do mozku pomocí tranzitních peptidů identifikovaných in vivo.věda.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB a Moos T. Dodávka makromolekulárních léků do mozku pomocí cílené terapie.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. a Martinez-Martinez, P. Dodávka peptidových a proteinových léků přes hematoencefalickou bariéru.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Hematoencefalická bariéra: překážka ve vývoji léků na mozek.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG a Byrd, A. Vyhlídky na zlepšené dodávání léků a zacílení do mozku cestou choroidálního plexu-CSF.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizace biofarmaceutik pomocí molekulárních trojských koní pro dodání mozku.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptorem zprostředkovaný transport peptidu přes hematoencefalickou bariéru.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. a kol.Zvyšte penetraci do mozku a účinnost terapeutických protilátek pomocí monovalentních molekulárních raketoplánů.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. a kol.Transport transferinového receptoru (TfR) určuje mozkové vychytávání afinitních variant protilátek TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).