Některá témata řešení problémů s LC nikdy nezastarají, protože v praxi LC existují problémy, a to i přes to, že se technologie přístrojů v průběhu času zlepšuje. Existuje mnoho způsobů, jak mohou v LC systému vzniknout problémy a vést ke špatnému tvaru píku. Pokud se vyskytnou problémy související s tvarem píku, krátký seznam možných příčin těchto výsledků pomáhá zjednodušit naše řešení problémů.
Je zábavné psát tento sloupek „Řešení problémů s LC“ a každý měsíc přemýšlet o tématech, protože některá témata nikdy nevyjdou z módy. Zatímco v oblasti výzkumu chromatografie se některá témata nebo myšlenky stávají zastaralými, protože jsou nahrazovány novějšími a lepšími nápady, v oblasti řešení problémů to platí od prvního článku o řešení problémů v tomto časopise (v té době LC Journal) v roce 1983 (1). V posledních několika letech jsem se v několika sekcích o řešení problémů s LC zaměřil na současné trendy ovlivňující kapalinovou chromatografii (LC) (například relativní srovnání našeho chápání vlivu tlaku na retenci [2] Nové pokroky), naši interpretaci výsledků LC a jak řešit problémy s moderními LC přístroji. V tomto měsíčním díle pokračuji ve své sérii (3), která začala v prosinci 2021 a která se zaměřovala na některá „život a smrt“ ohrožující témata řešení problémů s LC – prvky, které jsou skvělé pro každého odborníka na řešení problémů, jsou nezbytné bez ohledu na stáří systému, který používáme. Hlavní téma této série je velmi relevantní pro slavný nástěnný graf „Průvodce řešením problémů s LC“ (4) od LCGC, který visí v... mnoho laboratoří. Ve třetí části této série jsem se rozhodl zaměřit na problémy týkající se tvaru nebo charakteristik píku. Je neuvěřitelné, že nástěnný graf uvádí 44 různých potenciálních příčin špatného tvaru píku! V jednom článku se nemůžeme podrobně zabývat všemi těmito problémy, takže se v této první části na toto téma zaměřím na některé z těch, se kterými se setkávám nejčastěji. Doufám, že mladí i staří uživatelé LC najdou k tomuto důležitému tématu užitečné tipy a připomínky.
Stále častěji zjišťuji, že na otázky týkající se řešení problémů odpovídám „všechno je možné“. Tato odpověď se může zdát snadná, když bereme v úvahu pozorování, která je obtížné interpretovat, ale často ji považuji za vhodnou. Vzhledem k mnoha možným příčinám špatného tvaru píku je důležité zachovat si otevřenou mysl při zvažování, v čem by mohl být problém, a být schopen upřednostnit potenciální příčiny, abychom mohli začít s řešením problémů se zaměřením na ty nejběžnější možnosti, což je velmi důležité.
Klíčovým krokem v jakémkoli cvičení na řešení problémů – ale myslím, že je podceňovaný – je uznání, že existuje problém, který je třeba vyřešit. Uznání, že existuje problém, často znamená uznání, že to, co se s nástrojem děje, se liší od našich očekávání, která jsou formována teorií, empirickými znalostmi a zkušenostmi (5). „Tvar píku“, o kterém se zde hovoří, se ve skutečnosti nevztahuje pouze na tvar píku (symetrický, asymetrický, hladký, nadýchaný, na náběžné hraně, na konci atd.), ale také na jeho šířku. Naše očekávání ohledně skutečného tvaru píku jsou jednoduchá. Teorie (6) dobře podporuje učebnicové očekávání, že ve většině případů by chromatografické píky měly být symetrické a odpovídat tvaru Gaussova rozdělení, jak je znázorněno na obrázku 1a. To, co očekáváme od šířky píku, je složitější otázka a toto téma probereme v budoucím článku. Ostatní tvary píků na obrázku 1 ukazují některé další možnosti, které by mohly být pozorovány – jinými slovy, některé ze způsobů, jak se věci mohou pokazit. Ve zbytku této části se budeme věnovat diskusi o některých konkrétních příkladech situací, které mohou vést k těmto typům tvarů.
Někdy se píky na chromatogramu vůbec nepozorují tam, kde se očekává jejich eluce. Výše ​​uvedený nástěnný graf ukazuje, že absence píku (za předpokladu, že vzorek skutečně obsahuje cílový analyt v koncentraci, která by měla zajistit dostatečnou odezvu detektoru k jeho viditelnosti nad šumem) obvykle souvisí s nějakým problémem s přístrojem nebo nesprávnými podmínkami mobilní fáze (pokud jsou vůbec pozorovány). píky, obvykle příliš „slabé“). Stručný seznam potenciálních problémů a řešení v této kategorii lze nalézt v tabulce I.
Jak již bylo zmíněno výše, otázka, kolik rozšíření píku by mělo být tolerováno, než se mu budeme věnovat pozornost a pokusíme se ho opravit, je složité téma, o kterém budu diskutovat v budoucím článku. Z mých zkušeností vyplývá, že významné rozšíření píku je často doprovázeno významnou změnou tvaru píku a jeho chvostování je častější než stav před píkem nebo jeho rozdělení. Rozšířené jsou však i nominálně symetrické píky, což může být způsobeno několika různými důvody:
Každý z těchto problémů byl podrobně probrán v předchozích vydáních časopisu Troubleshooting LC a čtenáři, kteří se o tato témata zajímají, se mohou v těchto předchozích článcích podívat na informace o základních příčinách a možných řešeních těchto problémů. Více podrobností.
Chvostování píku, čelní lícování píku a štěpení píku mohou být způsobeny chemickými nebo fyzikálními jevy a seznam možných řešení těchto problémů se značně liší v závislosti na tom, zda se jedná o chemický nebo fyzikální problém. Porovnáním různých píků v chromatogramu lze často najít důležité vodítka o tom, který je viníkem. Pokud všechny píky v chromatogramu vykazují podobné tvary, příčina s největší pravděpodobností není fyzikální. Pokud je ovlivněn pouze jeden nebo několik píků, ale zbytek vypadá dobře, příčina je s největší pravděpodobností chemická.
Chemické příčiny chvostování píku jsou příliš složité na to, abychom je zde stručně rozebrali. Zájemce o čtenáře odkazujeme na nedávné vydání časopisu „LC Troubleshooting“ pro podrobnější diskusi (10). Snadnou možností je však snížit hmotnost vstřikovaného analytu a sledovat, zda se tvar píku zlepší. Pokud ano, pak je to dobrý signál, že problém spočívá v „přetížení hmotností“. V tomto případě se metoda musí omezit na vstřikování malých hmotností analytu nebo se musí změnit chromatografické podmínky tak, aby bylo možné dosáhnout dobrých tvarů píku i při vstřikování větších hmotností.
Existuje také mnoho potenciálních fyzikálních důvodů pro chvostování píku. Čtenáři, kteří se zajímají o podrobnou diskusi o možnostech, se odkazují na další nedávné vydání „LC Troubleshooting“ (11). Jednou z nejčastějších fyzikálních příčin chvostování píku je špatné spojení v bodě mezi injektorem a detektorem (12). Extrémní příklad je znázorněn na obrázku 1d, který byl pořízen v mé laboratoři před několika týdny. V tomto případě jsme postavili systém s novým vstřikovacím ventilem, který jsme dříve nepoužívali, a nainstalovali jsme vstřikovací smyčku s malým objemem s ferulí, která byla nalisována na kapiláru z nerezové oceli. Po několika počátečních experimentech s řešením problémů jsme si uvědomili, že hloubka portu ve statoru vstřikovacího ventilu byla mnohem větší, než na jakou jsme byli zvyklí, což vedlo k velkému mrtvému ​​objemu ve spodní části portu. Tento problém lze snadno vyřešit nahrazením vstřikovací smyčky jinou trubicí, přičemž feruli můžeme upravit do správné polohy, abychom eliminovali mrtvý objem ve spodní části portu.
Čela píků, jako jsou ta znázorněná na obrázku 1e, mohou být také způsobena fyzikálními nebo chemickými problémy. Běžnou fyzikální příčinou náběžné hrany je, že lože částic v koloně není dobře zabaleno nebo že se částice v průběhu času reorganizovaly. Stejně jako u ocasů píků způsobených tímto fyzikálním jevem je nejlepším způsobem, jak to napravit, vyměnit kolonu a pokračovat v práci. V zásadě tvary píků náběžných hran chemického původu často vznikají z toho, čemu říkáme „nelineární“ retenční podmínky. Za ideálních (lineárních) podmínek je množství analytu zadrženého stacionární fází (odtud retenční faktor) lineárně úměrné koncentraci analytu v koloně. Chromatograficky to znamená, že s rostoucí hmotností analytu vstřikovaného do kolony se pík stává vyšším, ale ne širším. Tento vztah se naruší, když je retenční chování nelineární, a píky se nejen stávají vyššími, ale také širšími s tím, jak se vstřikuje větší hmotnost. Kromě toho nelineární tvary určují tvar chromatografických píků, což vede k náběžným nebo zadním hranám. Stejně jako u hmotnostního přetížení, které způsobuje ocasy píků (10), je náběžná hrana píku způsobená Nelineární retenci lze také diagnostikovat snížením hmotnosti vstřikovaného analytu. Pokud se tvar píku zlepší, je nutné upravit metodu tak, aby nepřekročila kvalitu vstřikování, která způsobuje náběžnou hranu, nebo změnit chromatografické podmínky, aby se toto chování minimalizovalo.
Někdy pozorujeme něco, co se jeví jako „rozdělený“ pík, jak je znázorněno na obrázku 1f. Prvním krokem k řešení tohoto problému je určit, zda je tvar píku způsoben částečnou koelucí (tj. přítomností dvou odlišných, ale těsně se eluujících sloučenin). Pokud se ve skutečnosti vylučují dva různé analyty blízko sebe, pak je třeba zlepšit jejich rozlišení (například zvýšením selektivity, retence nebo počtu destiček) a zdánlivé „rozdělené“ píky souvisejí s fyzikálními vlastnostmi. Výkonnost nemá nic společného se samotnou kolonou. Často je nejdůležitějším vodítkem k tomuto rozhodnutí, zda všechny píky v chromatogramu vykazují rozdělené tvary, nebo jen jeden nebo dva. Pokud je to jen jeden nebo dva, pravděpodobně se jedná o problém s koelucí; pokud jsou všechny píky rozdělené, pravděpodobně se jedná o fyzikální problém, s největší pravděpodobností související se samotnou kolonou.
Rozštěpené píky související s fyzikálními vlastnostmi samotné kolony jsou obvykle způsobeny částečně zablokovanými vstupními nebo výstupními fritami nebo reorganizací částic v koloně, což umožňuje mobilní fázi proudit rychleji než mobilní fáze v určitých oblastech formování kanálu kolony v jiných oblastech (11). Částečně zanesenou fritu lze někdy odstranit obrácením toku kolonou; nicméně podle mých zkušeností je to obvykle spíše krátkodobé než dlouhodobé řešení. U moderních kolon je to často fatální, pokud se částice v koloně rekombinují. V tomto okamžiku je nejlepší kolonu vyměnit a pokračovat.
Vrchol na obrázku 1g, rovněž z nedávného případu v mé vlastní laboratoři, obvykle indikuje, že signál je tak vysoký, že dosáhl horní hranice rozsahu odezvy. U optických absorbančních detektorů (v tomto případě UV-VIS), když je koncentrace analytu velmi vysoká, analyt absorbuje většinu světla procházejícího průtokovou celou detektoru, a zbývá jen velmi málo světla k detekci. Za těchto podmínek je elektrický signál z fotodetektoru silně ovlivněn různými zdroji šumu, jako je rozptýlené světlo a „temný proud“, což signál činí velmi „rozmazaným“ a nezávislým na koncentraci analytu. V takovém případě lze problém často snadno vyřešit snížením objemu vstřikovaného analytu – snížením objemu vstřikovaného analytu, zředěním vzorku nebo obojím.
V chromatografii používáme signál detektoru (tj. osu y v chromatogramu) jako indikátor koncentrace analytu ve vzorku. Zdá se tedy zvláštní vidět chromatogram se signálem pod nulou, protože jednoduchá interpretace je, že to naznačuje negativní koncentraci analytu – což samozřejmě není fyzikálně možné. Z mých zkušeností jsou negativní píky nejčastěji pozorovány při použití optických absorbančních detektorů (např. UV-Vis).
V tomto případě negativní pík jednoduše znamená, že molekuly eluující z kolony absorbují méně světla než samotná mobilní fáze bezprostředně před a za píkem. K tomu může dojít například při použití relativně nízkých detekčních vlnových délek (<230 nm) a aditiv mobilní fáze, která absorbují většinu světla na těchto vlnových délkách. Takovými aditivy mohou být složky rozpouštědla mobilní fáze, jako je methanol, nebo složky pufru, jako je acetát nebo formiát. Negativní píky lze ve skutečnosti použít k přípravě kalibrační křivky a získání přesných kvantitativních informací, takže neexistuje žádný zásadní důvod, proč se jim samým vyhýbat (tato metoda se někdy označuje jako „nepřímá UV detekce“) (13). Pokud se však chceme negativním píkům skutečně zcela vyhnout, v případě detekce absorbance je nejlepším řešením použít jinou detekční vlnovou délku, aby analyt absorboval více než mobilní fáze, nebo změnit složení mobilní fáze tak, aby absorbovaly méně světla než analyty.
Negativní píky se mohou objevit také při použití detekce indexu lomu (RI), pokud se index lomu jiných složek než analyt ve vzorku, jako je matrice rozpouštědla, liší od indexu lomu mobilní fáze. K tomu dochází i při UV-VIS detekci, ale tento efekt bývá ve srovnání s RI detekcí zeslaben. V obou případech lze negativní píky minimalizovat bližším složením matrice vzorku se složením mobilní fáze.
Ve třetí části, která se zabývá základním tématem řešení problémů s LC, jsem se zabýval situacemi, kdy se pozorovaný tvar píku liší od očekávaného nebo normálního tvaru píku. Efektivní řešení takových problémů začíná znalostí očekávaných tvarů píku (na základě teorie nebo předchozích zkušeností se stávajícími metodami), takže odchylky od těchto očekávání jsou zřejmé. Problémy s tvarem píku mají mnoho různých potenciálních příčin (příliš široký, chvostovitý, náběžná hrana atd.). V této části podrobně rozebírám některé z důvodů, které vídám nejčastěji. Znalost těchto podrobností poskytuje dobrý výchozí bod pro řešení problémů, ale nezahrnuje všechny možnosti. Čtenáři, kteří mají zájem o podrobnější seznam příčin a řešení, se mohou podívat na nástěnnou tabulku LCGC „Průvodce řešením problémů s LC“.
(4) Nástěnná tabulka „Průvodce řešením problémů s LC“ od LCGC. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Analýza dat a zpracování signálu v chromatografii (Elsevier, New York, NY, 1998), s. 43–96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF a Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev. 907, 31–44 (2016). https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.