Některá témata odstraňování problémů s LC nejsou nikdy zastaralá, protože v praxi LC existují problémy, i když se technologie přístroje postupem času zlepšuje. Existuje mnoho způsobů, jak mohou problémy v systému LC nastat a skončit ve špatném tvaru špičky. Když se objeví problémy související s tvarem špičky, krátký seznam možných příčin těchto výsledků pomůže zjednodušit naše zkušenosti s odstraňováním problémů.
Bylo zábavné psát tento sloupek „Řešení problémů s LC“ a přemýšlet o tématech každý měsíc, protože některá témata nikdy nevyjdou z módy. Zatímco v oblasti chromatografického výzkumu se určitá témata nebo nápady stávají zastaralými, protože jsou nahrazovány novějšími a lepšími nápady, v oblasti odstraňování problémů se od prvního článku o odstraňování problémů v tomto časopise (tehdy LC Journal) zaměřuji od několika posledních let. lekce sekcí o současných trendech ovlivňujících kapalinovou chromatografii (LC) (například relativní srovnání našeho chápání vlivu tlaku na retenci [2] New Advances) Naše interpretace výsledků LC a jak řešit problémy s moderními LC přístroji. V tomto měsíci pokračuji ve své sérii (3), která začala v prosinci 2021 a která se zaměřuje na některá z témat, která jsou zásadní pro problémy se životem a smrtí. systému, který používáme. Stěžejní téma této série je vysoce relevantní pro slavnou nástěnnou tabulku LCGC „LC Troubleshooting Guide“ (4) visící v mnoha laboratořích. Pro třetí část této série jsem se rozhodl zaměřit se na otázky související s tvarem špiček nebo charakteristikami špiček. Je neuvěřitelné, že nástěnná tabulka uvádí 44 různých potenciálních příčin špatného tvaru špiček, takže nemůžeme podrobně zvážit všechny tyto problémy, na toto téma se nejprve nezaměříme. ty, které vidím nejčastěji. Doufám, že mladí i staří uživatelé LC najdou nějaké užitečné tipy a připomínky k tomuto důležitému tématu.
Zjišťuji, že stále častěji odpovídám na otázky týkající se odstraňování problémů slovy „všechno je možné“. Tato odpověď se může zdát snadná, když vezmeme v úvahu pozorování, která se obtížně interpretují, ale často ji považuji za vhodnou. Vzhledem k mnoha možným příčinám špatného tvaru špičky je důležité mít otevřenou mysl, když zvažujeme, o jaký problém se může jednat, a abychom byli schopni upřednostnit potenciální příčiny, abychom mohli začít s řešením problémů, se zaměřením na ty nejběžnější možnosti, je tento bod velmi důležitý.
Klíčovým krokem v jakémkoli cvičení pro odstraňování problémů – ale ten, který je podle mě nedoceněný – je rozpoznání, že existuje problém, který je třeba vyřešit. Uvědomit si, že existuje problém, často znamená uznat, že to, co se stane s nástrojem, se liší od našich očekávání, která jsou utvářena teorií, empirickými znalostmi a zkušenostmi (5). „Tvar vrcholu“, o kterém se zde mluví, ve skutečnosti odkazuje nejen na tvar špičky, asymetrický, symetrický, hladký atd. šířka. Naše očekávání skutečného tvaru píku jsou jednoduchá. Teorie (6) dobře podporuje učebnicové očekávání, že ve většině případů by chromatografické píky měly být symetrické a měly by odpovídat tvaru Gaussova rozložení, jak je znázorněno na obrázku 1a. To, co očekáváme od šířky píku, je složitější problém a toto téma probereme v budoucím článku. Ostatní tvary píků mohou zůstat v některých jiných pozorovaných věcech – na obrázku 1 mohou být špatné. této části strávíme čas diskusí o některých konkrétních příkladech situací, které mohou vést k těmto typům tvarů.
Někdy nejsou píky vůbec pozorovány na chromatogramu, kde se očekává, že budou eluovány. Výše ​​uvedený nástěnný graf ukazuje, že nepřítomnost píku (za předpokladu, že vzorek skutečně obsahuje cílový analyt v koncentraci, která by měla zajistit dostatečnou odezvu detektoru, aby byla vidět nad šumem) obvykle souvisí s nějakým problémem přístroje nebo nesprávnými podmínkami mobilní fáze (pokud jsou vůbec pozorovány).špičky, obvykle příliš „slabé“). Krátký seznam potenciálních problémů a řešení v této kategorii naleznete v tabulce I.
Jak je uvedeno výše, otázka, jak velké rozšíření píku by mělo být tolerováno, než tomu budu věnovat pozornost a pokusit se to opravit, je složité téma, kterému se budu věnovat v budoucím článku. Moje zkušenost je taková, že výrazné rozšíření píku je často doprovázeno významnou změnou tvaru píku a ochlazení píku je častější než před vrcholem nebo rozdělení. Nominálně symetrické vrcholy jsou však také rozšířeny, což může být způsobeno několika různými důvody:
Každý z těchto problémů byl podrobně diskutován v předchozích vydáních Troubleshooting LC a čtenáři, kteří se o tato témata zajímají, mohou najít informace o hlavních příčinách a možných řešeních těchto problémů v těchto předchozích článcích.Více informací.
Okraj píku, čela píku a rozdělení mohou být způsobeny chemickými nebo fyzikálními jevy a seznam možných řešení těchto problémů se značně liší v závislosti na tom, zda máme co do činění s chemickým nebo fyzikálním problémem. Porovnáním různých píků na chromatogramu můžete často najít důležité vodítka o tom, který je viníkem. Pokud všechny píky na chromatogramu mají s největší pravděpodobností podobné tvary, ale zbytek vypadá jako jeden z nich, zbytek vypadá stejně dobře, zbytek chromatogramu. příčina je pravděpodobně chemická.
Chemické příčiny ochlazení píku jsou příliš složité na to, abychom je zde mohli stručně prodiskutovat. Čtenář, který je zajímá, je odkázán na nedávné vydání „LC Troubleshooting“ pro podrobnější diskusi (10). Snadno však lze zkusit snížit hmotnost injektovaného analytu a zjistit, zda se tvar píku zlepší. Pokud ano, pak je to dobré vodítko, že problém je v tomto malém případě „přetížení hmoty nebo přetížení hmoty“. musí být změněny tak, aby bylo možné získat dobré tvary píku i s většími vstřikovanými hmotami.
Existuje také mnoho potenciálních fyzikálních důvodů pro omezení špiček. Čtenáři, kteří se zajímají o podrobnou diskuzi o možnostech, se odvolávají na další nedávné vydání „LC Troubleshooting“ (11). Jednou z častějších fyzikálních příčin špičkového omezení je špatné spojení v bodě mezi vstřikovačem a detektorem (12). objemová vstřikovací smyčka s objímkou, která byla nalisována na kapiláru z nerezové oceli. Po několika počátečních experimentech s řešením problémů jsme si uvědomili, že hloubka portu ve statoru vstřikovacího ventilu byla mnohem hlubší, než jsme byli zvyklí, což vedlo k velkému mrtvému ​​objemu na dně portu. Tento problém lze snadno vyřešit výměnou vstřikovací smyčky za jinou trubici, můžeme upravit ferule do správné polohy, abychom eliminovali mrtvý objem portu na dně.
Čela píků, jako jsou ty znázorněné na obrázku 1e, mohou být také způsobeny fyzikálními nebo chemickými problémy. Běžnou fyzikální příčinou náběžné hrany je to, že lože částic kolony není dobře napěchované nebo že se částice v průběhu času reorganizovaly. Stejně jako u maximálního ochlazení způsobeného tímto fyzikálním jevem je nejlepším způsobem, jak to opravit, vyměnit kolonu a pokračovat v chodu. analyt zadržený stacionární fází (tedy retenční faktor) je lineárně úměrný koncentraci analytu v koloně. Chromatograficky to znamená, že jak se hmotnost analytu vstřikovaného do kolony zvětšuje, pík je vyšší, ale ne širší. Tento vztah je narušen, když je retenční chování nelineární, a píky se nejen stávají vyššími, ale také širšími, když je výsledný tvar píku adiční, nelineární, výsledný tvar píku je nelineární. .Stejně jako u hmotnostního přetížení, které způsobuje omezení píku (10), lze vedení píku způsobené nelineární retencí diagnostikovat také snížením hmotnosti injektovaného analytu. Pokud se tvar píku zlepší, musí být metoda upravena tak, aby nepřekročila kvalitu nástřiku, která způsobuje náběžnou hranu, nebo je nutné změnit chromatografické podmínky, aby se toto chování minimalizovalo.
Někdy pozorujeme to, co se jeví jako „rozdělený“ pík, jak je znázorněno na obrázku 1f. Prvním krokem při řešení tohoto problému je určit, zda je tvar píku způsoben částečnou koelucí (tj. přítomností dvou odlišných, ale blízko eluujících sloučenin). Pokud ve skutečnosti existují dva různé analyty eluující blízko sebe, pak jde o zlepšení jejich rozlišení (například zvýšením selektivity, samotné retence nebo počtu destiček), „split“ nemá nic společného se „souvisejícími fyzikálními“ kolonami. cs, nejdůležitějším vodítkem pro toto rozhodnutí je, zda všechny píky v chromatogramu vykazují rozdělené tvary, nebo jen jeden nebo dva. Pokud je to jen jeden nebo dva, jde pravděpodobně o problém společné eluce;pokud jsou všechny píky rozděleny, je to pravděpodobně fyzický problém, který pravděpodobně souvisí se samotným sloupcem.
Dělené píky související s fyzikálními vlastnostmi samotné kolony jsou obvykle způsobeny částečně zablokovanými vstupními nebo výstupními fritami nebo reorganizací částic v koloně, což umožňuje mobilní fázi proudit rychleji než mobilní fázi v určitých oblastech tvorby kanálků kolony .v jiných oblastech (11). Částečně ucpanou fritu lze někdy vyčistit obrácením průtoku kolonou;podle mých zkušeností je to však obvykle spíše krátkodobé než dlouhodobé řešení. To je u moderních kolon často fatální, pokud se částice v koloně rekombinují. V tomto okamžiku je nejlepší kolonu vyměnit a pokračovat.
Vrchol na obrázku 1g, také z nedávného případu v mé vlastní laboratoři, obvykle ukazuje, že signál je tak vysoký, že dosáhl horního konce rozsahu odezvy. U detektorů optické absorbance (v tomto případě UV-vis), kdy je koncentrace analytu velmi vysoká, absorbuje analyt většinu světla procházejícího průtokovou kyvetou detektoru, přičemž zanechává velmi málo světla, které je silně ovlivněno z různých zdrojů světla, jako je elektrický signál. proud, díky čemuž je signál velmi „rozmazaný“ a nezávislý na koncentraci analytu.Když k tomu dojde, problém lze často snadno vyřešit snížením injekčního objemu analytu – snížením injekčního objemu, zředěním vzorku nebo obojím.
V chromatografické škole používáme signál detektoru (tj. osa y v chromatogramu) jako indikátor koncentrace analytu ve vzorku. Zdá se tedy zvláštní vidět chromatogram se signálem pod nulou, protože jednoduchá interpretace je taková, že to znamená negativní koncentraci analytu – což samozřejmě není fyzikálně možné. Podle mých zkušeností jsou negativní píky nejčastěji pozorovány při použití optických absorbančních detektorů (např. UV detektory).
Negativní pík v tomto případě jednoduše znamená, že molekuly eluující z kolony absorbují méně světla než samotná mobilní fáze bezprostředně před a po píku. K tomu může dojít například při použití relativně nízkých vlnových délek detekce (<230 nm) a aditiv mobilní fáze, které absorbují většinu světla na těchto vlnových délkách. Takovými aditivy mohou být složky rozpouštědel mobilní fáze, jako je methanol nebo složky pufru, jako je acetát nebo mravenčan, kde lze získat přesnou informaci. žádný zásadní důvod se jim samy o sobě vyhýbat (tato metoda je někdy označována jako „nepřímá UV detekce“) (13). Chceme-li se však skutečně vyhnout negativním píkům, v případě detekce absorbance je nejlepším řešením použít jinou vlnovou délku detekce, aby analyt absorboval více než mobilní fáze, nebo změnit složení mobilní fáze tak, aby absorbovaly méně světla než analyty.
Negativní píky se mohou objevit také při použití detekce indexu lomu (RI), když se index lomu složek jiných než analyt ve vzorku, jako je matrice rozpouštědla, liší od indexu lomu mobilní fáze. K tomu dochází také při UV-vis detekci, ale tento efekt má tendenci být zeslaben ve srovnání s detekcí RI. V obou případech lze negativní píky minimalizovat tím, že se složení matrice více přizpůsobí složení matrice.
Ve třetí části o základním tématu odstraňování problémů s LC jsem probíral situace, ve kterých se pozorovaný tvar píku liší od očekávaného nebo normálního tvaru píku. Efektivní řešení takových problémů začíná znalostí očekávaných tvarů píku (na základě teorie nebo předchozích zkušeností s existujícími metodami), takže odchylky od těchto očekávání jsou zřejmé. Problémy s tvarem píku mají mnoho různých možných příčin (příliš široké, zadní, náběžná hrana atd.). Čtenáři, kteří se zajímají o podrobnější seznam příčin a řešení, mohou nahlédnout do nástěnné tabulky LCGC „LC Troubleshooting Guide“.
(4) Nástěnná tabulka LCGC „LC Troubleshooting Guide“. https://www.chromatographyonline.com/view/troubleshooting-wallchart (2021).
(6) A. Felinger, Data Analysis and Signal Processing in Chromatography (Elsevier, New York, NY, 1998), str. 43-96.
(8) Wahab MF, Dasgupta PK, Kadjo AF a Armstrong DW, Anal.Chim.Journal.Rev.907, 31–44 (2016).https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.11.043.