Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v prohlížeči Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Abychom zajistili neustálou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Zobrazí karusel se třemi snímky najednou. Pomocí tlačítek Předchozí a Další můžete procházet tři snímky najednou nebo pomocí posuvníků na konci můžete procházet tři snímky najednou.
Samoorganizující se nervové organely představují slibnou platformu in vitro pro modelování lidského vývoje a onemocnění. Organoidy však postrádají konektivitu, která existuje in vivo, což omezuje zrání a brání integraci s jinými okruhy, které řídí chování. Zde ukazujeme, že kortikální organoidy odvozené z lidských kmenových buněk transplantované do somatosenzorické kůry novorozených nahých potkanů ​​vyvíjejí zralé buněčné typy, které se integrují do senzorických a motivačních okruhů. MRI odhalila růst organoidů po transplantaci u několika linií kmenových buněk a zvířat, zatímco analýza jednoho jádra odhalila progresi kortikogeneze a vznik transkripčního programu závislého na aktivitě. Transplantované kortikální neurony skutečně vykazují složitější morfologické, synaptické a vnitřní membránové vlastnosti než jejich in vitro protějšky, což umožňuje detekci neuronálních defektů u pacientů s Timothyho syndromem. Anatomické a funkční sledování ukázalo, že transplantované organely přijímají thalamokortikální a kortikokortikální vstupy a in vivo záznamy nervové aktivity naznačují, že tyto vstupy mohou generovat senzorické reakce v lidských buňkách. Kortikální organoidy nakonec rozšiřují axony po celém mozku potkanů ​​a jejich optogenetická aktivace vede k chování zaměřenému na odměnu. Transplantované neurony lidské kůry tak dozrávají a zapojují se do obvodů hostitele, které řídí chování. Očekáváme, že tento přístup usnadní detekci fenotypů na úrovni řetězců v buňkách odvozených od pacienta, které nelze detekovat jinými způsoby.
Vyvíjející se lidský mozek je pozoruhodný samoorganizující se proces, ve kterém buňky proliferují, diferencují se, migrují a spojují se a vytvářejí funkční neuronální obvody, které jsou dále zdokonalovány prostřednictvím senzorických zkušeností. Klíčovým problémem v pochopení vývoje lidského mozku, zejména v kontextu onemocnění, je nedostatečný přístup k mozkové tkáni. Samoorganizující se organely, včetně organoidů lidské kůry (hCO; také známých jako sféra lidské kůry), mohou generovat 2,3,4,5,6. Několik omezení však omezuje jejich širší použití na pochopení vývoje a fungování nervových obvodů. Zejména není jasné, zda je zrání hCO omezeno absencí určitých mikroenvironmentálních a senzorických vstupů přítomných in vivo. Kromě toho, protože hCO nejsou integrovány do obvodů, které mohou generovat behaviorální výsledky, je jejich využití při modelování geneticky komplexních a behaviorálních neuropsychiatrických poruch v současné době omezené.
Transplantace hCO do intaktního živého mozku může tato omezení překonat. Předchozí studie ukázaly, že lidské neurony transplantované do mozkové kůry hlodavců jsou schopny přežít, promítat signály a komunikovat s buňkami hlodavců7,8,9,10,11,12. Tyto experimenty se však obvykle provádějí na dospělých zvířatech, což může omezovat synaptickou a axonální integraci. Zde popisujeme transplantační paradigma, ve kterém jsme transplantovali 3D hCO odvozený z buněk hiPS do primární somatosenzorické kůry (S1) imunodeficientních krys v rané fázi plastického vývoje. Transplantované neurony hCO (t-hCO) procházejí podstatným zráním, přijímají thalamokortikální a kortikálně-kortikální vstupy, které vyvolávají senzorické reakce, a rozšiřují axonální projekce do mozku krys, aby řídily chování zaměřené na hledání odměny. Prodloužené zrání t-hCO odhalilo neuronální defekty u pacientů s Timothyho syndromem (TS), což je závažná genetická porucha způsobená mutacemi v napěťově citlivém kalciovém kanálu CaV1.2 typu L (kódovaném CACNA1C).
Pro studium lidských kortikálních neuronů v okruzích in vivo jsme stereotakticky transplantovali intaktní 3D hCO do S1 raně postnatálních atymických krys (3.–7. den po narození) (obr. 1a a rozšířená data z obr. 1a–c). V tomto bodě thalamokortikální a kortikokortikální axonální projekce ještě nedokončily svou inervaci S1 (odkaz 13). Tento přístup je proto navržen tak, aby maximalizoval integraci t-hCO a zároveň minimalizoval dopad na endogenní okruhy. Pro vizualizaci umístění t-hCO u živých zvířat jsme provedli T2-vážené MRI rekonstrukce mozku krys 2–3 měsíce po transplantaci (obr. 1b a rozšířená data, obr. 1d). t-hCO2 byly snadno pozorovatelné a objemová měření t-hCO2 byla podobná těm vypočítaným z fixních řezů (Extended Data Obr. 1d,e; P > 0,05). t-hCO2 byly snadno pozorovatelné a objemová měření t-hCO2 byla podobná těm vypočítaným z fixních řezů (Extended Data Obr. 1d,e; P > 0,05). t-hCO легко наблюдались, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитанонымирныр срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO2 byly snadno pozorovatelné a objemová měření t-hCO2 byla podobná těm vypočítaným pro fixní řezy (rozšířená data, obr. 1d, e; P > 0,05).很容易观察到t-hCO，并且t-hCO的体积测量值与从固定切片计算的测量值相似（扩展数据图1d、e；P > 0,05）很容易观察到t-hCO，并且t-hCO t-hCO легко наблюдался, а объемные измерения t-hCO были аналогичны рассчитаннымим срезов (расширенные данные, рис. 1d, e; P> 0,05). t-hCO₂ byl snadno pozorovatelný a objemová měření t-hCO₂ byla podobná těm vypočítaným pro fixní řezy (rozšířená data, obr. 1d, e; P > 0,05).U 81 % transplantovaných zvířat jsme stanovili t-hCO₂ přibližně 2 měsíce po transplantaci (n = 72 zvířat; hCO₂ z 10 buněčných linií hiPS; buněčné linie hiPS v doplňkové tabulce 1). Z nich se 87 % nacházelo v mozkové kůře (obr. 1c). Provedením sériových MRI vyšetření v několika časových bodech u stejné transplantované krysy jsme zjistili devítinásobné zvýšení objemu t-hCO₂ během 3 měsíců (obr. 1d a rozšířená data, obr. 1f). Transplantovaná zvířata měla vysokou míru přežití (74 %) 12 měsíců po transplantaci (rozšířená data, obr. 1g a doplňková tabulka 2) a nebyly zjištěny žádné zjevné motorické nebo paměťové poruchy, glióza ani elektroencefalogram (EEG). Data (obr. 1g a doplňková tabulka 2). 1h–m a 3e).
a, Schéma experimentálního designu. hCO2 odvozený z buněk hiPS byl transplantován do S1 novorozených nahých potkanů ​​ve dnech 30-60 diferenciace. b, T2-vážené koronální a horizontální MRI snímky ukazující t-hCO2 v S1 2 měsíce po transplantaci. Měřítko, 2 mm. c, Kvantifikace míry úspěšnosti uchycení štěpu uvedená pro každou buněčnou linii hiPS (n = 108, čísla v sloupcích označují množství t-hCO2 na buněčnou linii hIPS) a kortikální nebo subkortikální lokalizaci (n = 88). d, MRI snímek koronární tepny (vlevo; měřítko, 3 mm) a odpovídající 3D volumetrická rekonstrukce (měřítko, 3 mm) ukazující zvýšení t-hCO2 během 3 měsíců. e, Přehled vzorců t-hCO2 v mozkové kůře potkanů. Měřítko, 1 mm. f, Reprezentativní imunocytochemické snímky t-hCO zobrazené zleva nahoře doprava (během diferenciace): PPP1R17 (4 měsíce starý), NeuN (8 měsíců starý), SOX9 a GFAP (8 měsíců starý), PDGFRα; (8 měsíců), MAP2 (8 měsíců) a IBA1 (8 měsíců). Měřítko, 20 µm. Koexprese HNA indikuje buňky lidského původu. g, snRNA-seq: Zobrazování redukce dimenzionality všech vysoce kvalitních jader t-hCO po Seuratově integraci pomocí Unified manifold and projection (UMAP) (n=3 vzorky t-hCO, n=2 buněčné linie hiPS). Astrocyty, buňky astrocytové linie; cyc prog, cirkulující progenitory; GluN DL, hluboké glutamatergní neurony; GluN DL/SP, hluboké a sublamelární glutamatergní neurony; GluN UL, glutamatergní neurony horní vrstvy; oligodendrocyty, oligodendrocyty; OPC, progenitorové buňky oligodendrocytů; RELN, reelinové neurony. h, Analýza obohacení genů pomocí genové ontologie (GO) s významně zvýšenou expresí (upravené P < 0,05, násobná změna > 2, exprimováno v alespoň 10 % jader) v glutamátergních neuronech t-hCO ve srovnání s glutamátergními neurony hCO. h, Analýza obohacení genů pomocí genové ontologie (GO) s významně zvýšenou expresí (upravené P < 0,05, násobná změna > 2, exprimováno v alespoň 10 % jader) v glutamátergních neuronech t-hCO ve srovnání s glutamátergními neurony hCO. h, Анализ обогащения терминов Genová ontologie (GO) для генов со значительной активацный, <скор0рей <скор0рей кратность изменения > 2, экспрессия по крайней мере в 10% ядер) в глутаматергихерненскигихернере по сравнению с глутаматергическими нейронами hCO. h, Analýza obohacení genů pomocí genové ontologie (GO) pro geny s významnou aktivací (upravené P <0,05, násobná změna >2, exprese v alespoň 10 % jader) v glutamátergních neuronech t-hCO ve srovnání s glutamátergními neurony hCO. h，与hCO 谷氨酸能神经元相比，t-hCO 谷氨酸能神经元中基因显着上调（莃P < 0,05，倍数变化> 2，在至少10 % 的细胞核中表达）的基因本体论(GO) 术语密集 h ， 与 hco 谷氨酸 能 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 能 神经 元 基因 显着 <.0 上调 吼 上莃 吼变化 变化> 2 ， 至少 10 % 的 核中 表达） 基因 基因 基因 的 的 的 的 的 的 的 的的 的 的 的本体论(GO) 术语富集分析。 h, гены значительно активизировались (скорректированный P <0,05, кратность измеснениятся 2, р. по крайней мере в 10% ядер) v глутаматергических нейронах t-hCO по сравнегтиртиресе гилу нейронами hCO Онтологический (GO) анализ термина обогащения. h, geny byly významně upregulovány (upravené P < 0,05, násobek změny > 2, exprimovány v alespoň 10 % jader) v t-hCO glutamátergních neuronech ve srovnání s hCO glutamátergními neurony. Ontologická (GO) analýza obohacovacího termínu.Tečkovaná čára označuje hodnotu aq 0,05. i, UMAP zobrazování buněčných typů GluN v t-hCO₂ s použitím přenosu značení z referenčního souboru dat 22 snRNA-seq dospělé motorické kůry. CT — kortikothalamické buňky, ET — extracerebrální buňky, IT — vnitřní telencefalické buňky, NP — blízká projekce.
Poté jsme vyhodnotili cytoarchitekturu a celkové buněčné složení t-hCO. Barvení endoteliálních buněk potkanů ​​pomocí protilátek odhalilo vaskularizaci pomocí t-hCO, zatímco barvení IBA1 odhalilo přítomnost mikroglií potkanů ​​v celém štěpu (obr. 1f a rozšířená data, obr. 3c,d). Imunobarvení odhalilo buňky pozitivní na lidský jaderný antigen (HNA) koexprimující PPP1R17 (kortikální progenitory), NeuN (neurony), SOX9 a GFAP (gliové buňky) nebo PDGFRα (oligodendrocytové progenitory) (obrázek 1f). Pro studium buněčného složení t-hCO s rozlišením jednotlivých buněk jsme provedli sekvenování jednojádrové RNA (snRNA-seq) po přibližně 8 měsících diferenciace. Hromadná filtrace a odstranění jader potkanů ​​poskytly 21 500 vysoce kvalitních map lidských mononukleárních buněk (obr. 1g a rozšířená data, obr. 4a,b). Expresní vzorce typických markerů buněčného typu identifikovaly shluky hlavních tříd kortikálních buněk, včetně hlubokých a povrchových glutamatergních neuronů, cirkulujících progenitorových buněk, oligodendrocytů a astrocytové linie (obr. 1g, rozšířená data, obr. 4c a doplňková tabulka 3). Imunobarvení pro SATB2 a CTIP2 ukázalo, že navzdory přítomnosti kortikálních podtypů t-hCO nevykazoval jasnou anatomickou stratifikaci (rozšířená data, obr. 3a). hCO s odpovídající snRNA-seq produkoval v podstatě podobné buněčné třídy, s několika výjimkami, včetně absence oligodendrocytů a přítomnosti GABAergních neuronů, což může odrážet dříve popsané příznivé podmínky in vitro pro laterální progenitorové buňky15 (rozšířená data, obr. 4f-i a doplňková tabulka 4). Analýza diferenciální genové exprese odhalila významné rozdíly v glutamatergních neuronech mezi t-hCO a hCO (doplňková tabulka 5), ​​včetně aktivace sad genů spojených s neuronálním zráním, jako je synaptická signalizace, dendritická lokalizace a aktivita napěťově řízených kanálů (obrázek 1h a doplňková tabulka 5, tabulka 6). Kortikální glutamatergní t-hCO neurony tedy vykazovaly zrychlené transkripční zrání.
Abychom objasnili, zda tyto transkripční změny v t-hCO souvisely s morfologickými rozdíly mezi hCO in vitro a t-hCO in vivo, rekonstruovali jsme stadiumicky shodné biocytiny naplněné hCO a hCO v akutních řezech po 7–8 měsících diferenciace. Neurony hCO (obr. 2a). Neurony t-hCO byly významně větší, měly 1,5krát větší průměr somy, dvakrát více dendritů a celkově šestinásobné zvýšení celkové délky dendritů ve srovnání s hCO in vitro (obr. 2b). Kromě toho jsme pozorovali významně vyšší hustotu dendritických trnů v neuronech t-hCO než v neuronech hCO (obr. 2c). To naznačuje, že neurony t-hCO procházejí rozsáhlým prodlužováním a větvením dendritů, což v kombinaci s pokračující buněčnou proliferací může přispívat k intenzivnímu růstu t-hCO po transplantaci (obr. 1d a rozšířená data, obr. 1f). To nás vedlo k prozkoumání elektrofyziologických vlastností. Membránová kapacita byla osmkrát vyšší (rozšířená data, obr. 8d), membránový potenciál v klidovém stavu byl více hyperpolarizovaný (přibližně 20 mV) a injekce proudu indukovala vyšší maximální rychlost excitace v neuronech t-hCO než v neuronech hCO. in vitro (obr. 2d), e), což je v souladu s většími a složitějšími morfologickými rysy t-hCO. Kromě toho byla frekvence spontánních excitačních postsynaptických proudových událostí (EPSC) významně vyšší v neuronech t-hCO (obr. 2f), což naznačuje, že zvýšená hustota dendritických spinů pozorovaná v neuronech t-hCO byla spojena s funkční excitabilitou. sexuální synapse. Nezralý charakter neuronů hCO jsme potvrdili in vitro záznamem značených glutamatergních neuronů (rozšířená data, obr. 6a-c).
a, 3D rekonstrukce neuronů hCO a t-hCO naplněných biocytiny po 8 měsících diferenciace. b, Kvantifikace morfologických znaků (n = 8 neuronů hCO, n = 6 neuronů t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 a ***P < 0,0001). b, Kvantifikace morfologických znaků (n = 8 neuronů hCO, n = 6 neuronů t-hCO; **P = 0,0084, *P = 0,0179 a ***P < 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов hCO, n = 6 нейронов, n = 6 ней-84, * P = 0, P = 0,0**; P 0,0179 a *** P <0,0001). b, kvantifikace morfologických znaků (n=8 neuronů hCO, n=6 neuronů t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 a ***P<0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084 <0,1*P *** 0,0,1*P = *** 0,0001). b，形态学特征的量化（n = 8 个hCO 神经元，n = 6 个t-hCO 神经元；**P = 0,0084 <0,1*P *** 0,0,1*P = *** 0,0001). б, количественная оценка морфологических признаков (n = 8 нейронов hCO, n = 6 нейронов hCO, n = 6 нейронов, n = 6 ней-84, * P = 0, P = 0,0**; P 0,0179 a *** P <0,0001). b, kvantifikace morfologických znaků (n=8 neuronů hCO, n=6 neuronů t-hCO; **P=0,0084, *P=0,0179 a ***P<0,0001).c, 3D rekonstrukce dendritických větví hCO a t-hCO po 8 měsících diferenciace. Červené hvězdičky označují předpokládané dendritické trny. Kvantifikace hustoty dendritických trnů (n = 8 neuronů hCO, n = 6 neuronů t-hCO; **P = 0,0092). d, Kvantifikace klidového membránového potenciálu (n = 25 hCO neuronů, n = 16 t-hCO neuronů; ***P < 0,0001). d, Kvantifikace klidového membránového potenciálu (n = 25 hCO neuronů, n = 16 t-hCO neuronů; ***P < 0,0001). d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нов0;*** 01рон). d, kvantifikace klidového membránového potenciálu (n = 25 neuronů hCO, n = 16 neuronů t-hCO; ***P < 0,0001). d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d，静息膜电位的量化（n = 25 hCO 神经元，n = 16 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 d, количественная оценка мембранного потенциала покоя (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нов0;*** 01рон). d, kvantifikace klidového membránového potenciálu (n = 25 neuronů hCO, n = 16 neuronů t-hCO; ***P < 0,0001). e, Opakované pálení akčního potenciálu v hCO a t-hCO indukované zvyšujícími se proudovými injekcemi a kvantifikace maximální rychlosti pálení (n = 25 neuronů hCO, n = 16 neuronů t-hCO; ***P < 0,0001). e, Opakované pálení akčního potenciálu v hCO a t-hCO indukované zvyšujícími se proudovými injekcemi a kvantifikace maximální rychlosti pálení (n = 25 neuronů hCO, n = 16 neuronů t-hCO; ***P < 0,0001). e, повторное возбуждение потенциала действия в hCO a t-hCO, вызванное увеличением тноканием оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нейронов t-hCO; *** 00 P <0). e, opětovné spuštění akčního potenciálu v hCO a t-hCO indukované zvýšením proudu a kvantifikací maximální frekvence spuštění (n = 25 neuronů hCO, n = 16 neuronů t-hCO; *** P < 0,0001). e，通过增加电流注入诱导的hCO 和t-hCO 重复动作电位放电，以及最25 大放电5 大放电个hCO 神经元，n = 16 个t-hCO 神经元；***P < 0,0001）。 E ， 通过 增加 电流 注入 的 的 hco 和 t-hco 重复 电位 放电 ， 以及 最 夏叼 25个 hco 神经 ， n = 16 个 t-hco 神经 ； *** p <0,0001） 。 e, повторяющееся возбуждение потенциала действия hCO a t-hCO, вызванное увелитипокание количественная оценка максимальной скорости возбуждения (n = 25 нейронов hCO, n = 16 нов;йронов;й <0,0001). e, opakované pálení akčních potenciálů hCO a t-hCO indukované zvýšeným přívodem proudu a kvantifikace maximální frekvence pálení (n = 25 neuronů hCO, n = 16 neuronů t-hCO; *** P < 0,0001). f, Spontánní EPSC (sEPSC) v neuronech hCO a t-hCO po 8 měsících diferenciace a kvantifikace frekvence synaptických událostí (n = 25 neuronů hCO, n = 17 neuronů t-hCO; ***P < 0,0001). f, Spontánní EPSC (sEPSC) v neuronech hCO a t-hCO po 8 měsících diferenciace a kvantifikace četnosti synaptických událostí (n = 25 neuronů hCO, n = 17 neuronů t-hCO; ***P < 0,0001). f, спонтанные EPSC (sEPSC) v нейронах hCO a t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колинонанествене частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P <0,0001) . f, Spontánní EPSC (sEPSC) v neuronech hCO a t-hCO po 8 měsících diferenciace a kvantifikace četnosti synaptických událostí (n = 25 neuronů hCO, n = 17 neuronů t-hCO; ***P < 0,0001). f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触及突触及突触事件频率的的频率的鄼频率的的金 5神经元，n = 17 t-hCO 神经元；***P < 0,0001）. f，分化8 个月时hCO 和t-hCO 神经元中的自发性EPSCs (sEPSCs)，以及突触事件频率皼件频率皼鄏5 aritmetické hodnoty n = 25 hCO glykemie n = 25 hCO P < 0,0001）. f, спонтанные EPSC (sEPSC) v нейронах hCO a t-hCO через 8 месяцев дифференцировки и колинонанествене частоты синаптических событий (n = 25 нейронов hCO, n = 17 нейронов t-hCO; *** P < 0,0001). f, Spontánní EPSC (sEPSC) v neuronech hCO a t-hCO po 8 měsících diferenciace a kvantifikace četnosti synaptických událostí (n = 25 neuronů hCO, n = 17 neuronů t-hCO; *** P < 0,0001).Pro bf byly hCO a t-hCO v linii 1208-2 odebrány ze stejné diferenciační šarže udržované paralelně. g, Analýza obohacení genové sady (jednostranný Fisherův exaktní test) genů významně upregulovaných (upravené P < 0,05, násobná změna > 2, exprimovaných v alespoň 10 % jader) v t-hCO glutamatergních neuronech ve srovnání s hCO glutamatergními neurony se sadami genů závislých na aktivitě jak s časnou odpovědí (ERG), tak s pozdní odpovědí (LRG), identifikovanými z in vivo studie na myších16 a lidsky specifickými LRG z in vitro neuronů17. g, Analýza obohacení genové sady (jednostranný Fisherův exaktní test) genů významně upregulovaných (upravené P < 0,05, násobná změna > 2, exprimovaných v alespoň 10 % jader) v t-hCO glutamatergních neuronech ve srovnání s hCO glutamatergními neurony se sadami genů závislých na aktivitě jak s časnou odpovědí (ERG), tak s pozdní odpovědí (LRG), identifikovanými z in vivo studie na myších16 a lidsky specifickými LRG z in vitro neuronů17. g, анализ обогащения набора генов (односторонний точный критерий Фишера) геновачит зновачиет активацией (скорректированный P <0,05, кратность изменения > 2, экспрессия по меньшерей 10% меньшерей глутаматергических нейронах t-hCO по сравнению с глутаматергическими нейронамиоконорн раннего (ERG), tak a позднего (LRG) генов, зависящих от активности, идентифицированинысна ванинысна мышах in vivo16, a специфических для человека LRG a нейронов in vitro17. g, analýza obohacení genové sady (jednostranný Fisherův exaktní test) genů s významnou aktivací (upravené P < 0,05, násobná změna > 2, exprese v alespoň 10 % jader) v t-hCO glutamatergních neuronech ve srovnání se sadami hCO glutamatergních neuronů jak časných (ERG), tak pozdních (LRG) genů závislých na aktivitě identifikovaných u myší in vivo16 a lidsky specifických LRG z neuronů in vitro17. g，t-hCO谷氨酸能神经元与hCO谷氨酸能神经元相比，t -hCO谷氨酸能神经元显着上调（调整后P<0,05，倍数变化>2，在至少10 %的细胞核中表达）的基因集富集分析（单侧F isher精确检验）从体内小鼠研究中鉴定的早期反应 (ERG)和晚期反应(LRG) 活性依赖性基因的基因组16 和体外神经元17 中的人类秉G g ， t-hco 谷氨酸 神经 元 与 hco 谷氨酸 神经 元 相比 ， t-hco 谷氨酸 神经 元 舞经比<0,05 ， 倍数> 2 ， 至少 至少 10 % 的 细胞 核中 表达） 的 集 富集 分析 （宕 （宕体内 小鼠 研究 中 的 早期 反应 反应 反应 和 晚期 反应 反应 (lrg) 活瀧 基因咛 囌 儺神经元 神经元 17 中 中 17 中 17 的人类特异性LRG。 g, глутаматергические нейроны t-hCO были значительно активизированкпо сравнениютиресе глут нейронами hCO (скорректированный P<0,05, кратность изменения> 2, не менее 10 % АналигаѱобноЏ генов (односторонний точный тест Фишера) раннего ответа (ERG) a позднего генатщины ответа (LRG), идентифицированные в исследованиях na мышах in vivo16 a нейронах in vitroципецна17 человека. g, t-hCO glutamátergní neurony byly významně upregulovány ve srovnání s hCO glutamátergními neurony (upravené P < 0,05, násobná změna > 2, alespoň 10% analýza obohacení genů včasné odpovědi (ERG) a pozdní odpovědi (jednostranný Fisherův exaktní test) a geny závislé na aktivitě odpovědi (LRG) identifikované u myší in vivo16 a neuronů in vitro.17 Lidské specifické LRG.Tečkovaná čára označuje hodnotu P 0,05 korigovanou Bonferroniho metodou. h-1, exprese genu GluN (pseudo-balení a škálování každého genu) byla významně zvýšena v replikách snRNA-seq genů LRG v t-hCO glutamatergních neuronech. i, imunobarvení ukazující expresi SCG2 v t-hCO (nahoře) a hCO (dole) neuronech. Bílé šipky ukazují na buňky SCG2+. Měřítko, 25 µm. Data jsou vyjádřena jako průměr ± směrodatná odchylka.
Na základě zvýšené aktivity t-hCO pozorované v ex vivo řezech odhalila snRNA-seq na aktivitě závislou upregulaci genových transkriptů v t-hCO ve srovnání s hCO in vitro. Glutamátergní t-hCO neurony exprimovaly vyšší hladiny genů regulujících aktivitu pozdní odpovědi (obr. 2g,h), které byly zjištěny v předchozích studiích na myších a lidských neuronech16,17. Například BDNF18, SCG2 a OSTN, gen regulující aktivitu specifický u primátů, vykazovaly zvýšenou expresi v t-hCO neuronech ve srovnání s hCO neurony (obr. 2g-i). T-hCO neurony tedy vykazovaly zlepšené charakteristiky zrání ve srovnání s hCO neurony, a to transkripčními, morfologickými a funkčními analýzami.
Pro další vyhodnocení souvislosti zrání t-hCO s vývojem lidského mozku jsme provedli transkriptomické srovnání fetálních a dospělých typů kortikálních buněk19,20 a dospělých21,22, stejně jako rozsáhlá data o expresi kortikálních genů23 během vývoje (rozšířená data, obr. 5). S předchozí prací24 je globální stav zrání hCO a transkriptomu t-hCO v 7–8 měsících diferenciace v zásadě v souladu s dobou vývoje in vivo a nejvíce odpovídá pozdnímu fetálnímu životu (rozšířená data, obr. 5a). Zejména jsme pozorovali zvýšenou zralost transkriptomu u t-hCO ve srovnání s hCO odpovídajícího věku, stejně jako aktivaci transkriptomu spojenou se synaptogenezí, astrogenezí a myelinací (rozšířená data, obr. 5b-d). Na buněčné úrovni jsme zjistili důkazy o tenčím podtypu kortexu u t-hCO, přičemž shluky glutamatergních neuronů se překrývají s dospělými neuronovými podtypy L2/3, L5 a L6 (obrázek 1i). Naproti tomu překrývání shluků mezi glutamatergními t-hCO neurony a fetálními kortikálními neurony bylo v polovině těhotenství omezenější (rozšířená data, obrázek 5e-j). Abychom zjistili, zda jsou t-hCO neurony funkčně podobné lidským postnatálním neokortikálním neuronům, provedli jsme elektrofyziologické záznamy a anatomické rekonstrukce lidských pyramidálních neuronů L2/3 v ostrých řezech lidské postnatální kůry (rozšířená data, obr. 7a). Elektrofyziologické vlastnosti pyramidálních neuronů L2/3 byly podobné vlastnostem pyramidálních neuronů t-hCO (rozšířená data, obr. 7e). Morfologicky byly L2/3 neurony z postnatálních lidských vzorků podobnější t-hCO než hCO, ačkoli buňky L2/3 byly delší, celkově obsahovaly více větví a měly vyšší hustotu páteře (obr. 3g a rozšířená data, obr. 7b-). G).
a, transplantace hCO produkovaného kontrolními a TS hiPS buněčnými liniemi do novorozených potkanů. b, 3D rekonstrukce biocytinem naplněných t-hCO neuronů po 8 měsících diferenciace. c, kvantifikace průměrné délky dendritických buněk (n = 19 kontrolních neuronů, n = 21 TS neuronů; **P = 0,0041). d, 3D rekonstruované dendritické větve z kontroly a TS t-hCO v 8 měsících diferenciace a kvantifikace hustoty dendritických spinů (n = 16 kontrolních neuronů, n = 21 TS neuronů, ***P < 0,0001). d, 3D rekonstruované dendritické větve z kontroly a TS t-hCO v 8 měsících diferenciace a kvantifikace hustoty dendritických spinů (n = 16 kontrolních neuronů, n = 21 TS neuronů, ***P < 0,0001). d, 3D-реконструкция дендритных ветвей из контроля a TS t-hCO через 8 měsíců количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS, n = 21 ронов <0,0001). d, 3D rekonstrukce dendritických větví z kontrolních a t-hCO TS v 8 měsících diferenciace a kvantifikace hustoty dendritických spinů (n=16 kontrolních neuronů, n=21 TS neuronů, ***P<0,0001). d，分化8 个月时对照和TS t-hCO 的3D 重建树突分支，以及树突棘密度的量化 =16.个对照神经元，n = 21 个TS 神经元，***P < 0,0001）。 d ， 分化 8 个 时 对照 和 ts t-hco 的 3d 重建 分支 分支 a 以及 树突棘 密刖並 量刖神经 元 ， n = 21 个 ts 神经 ， *** p < 0,0001 ）。 d, 3D-реконструкция дендритных ветвей контроля a TS t-hCO через 8 měsíců количественная оценка плотности дендритных шипов (n = 16 контрольных нейронов, n = 21 TS, n = 21 ронов <0,0001). d, 3D rekonstrukce kontrolních dendritických větví a TS t-hCO v 8 měsících diferenciace a kvantifikace hustoty dendritických spinů (n=16 kontrolních neuronů, n=21 TS neuronů, ***P<0,0001).Červené hvězdičky označují předpokládané dendritické trny. e, spontánní EPSC v kontrolních a TS t-hCO neuronech po 8 měsících diferenciace. f, graf kumulativní frekvence a kvantifikace frekvence a amplitudy synaptických událostí (n=32 kontrolních neuronů, n=26 TS neuronů; **P=0,0076 a P=0,8102). g, Scholl analýza TS a kontrolních neuronů v hCO a t-hCO. Čárkované čáry znázorňují lidské postnatální pyramidální neurony L2/3 pro srovnání (n = 24 kontrolních t-hCO neuronů, n = 21 TS t-hCO neuronů, n = 8 kontrolních hCO neuronů a n = 7 TS hCO neuronů). Data jsou vyjádřena jako průměr ± směrodatná odchylka.
Schopnost t-hCO replikovat morfologické a funkční vlastnosti neuronů lidské kůry na vysoké úrovni nás vedla k prozkoumání, zda by t-hCO mohl být použit k detekci chorobných fenotypů. Zaměřili jsme se na TS, závažnou neurovývojovou poruchu způsobenou mutacemi se ziskem funkce v genu kódujícím CaV1.2, který iniciuje transkripci genů závislou na aktivitě v neuronech. HCO jsme získali od tří pacientů s TS s nejčastější substitucí (p.G406R) a tří kontrolních pacientů (obr. 3a). Po transplantaci jsme zjistili, že morfologie dendritů byla u neuronů TS změněna ve srovnání s kontrolami (obr. 3b a rozšířená data, obr. 8a,b), s dvojnásobným nárůstem počtu primárních dendritů a celkovým nárůstem průměrné a celkové délky dendritů (obr. 3c a rozšířená data, obr. 8c). To bylo spojeno se zvýšenou hustotou spinů a zvýšenou frekvencí spontánních EPSC u TS ve srovnání s kontrolními neurony (obr. 3d–f a rozšířená data, obr. 8g). Další analýza odhalila vzorce abnormálního dendritického větvení v t-hCO TS ve srovnání s kontrolami, ale ne v in vitro TS hCO v podobném stádiu diferenciace (obr. 3g). To je v souladu s našimi předchozími zprávami o dendritickém zmenšování závislém na aktivitě v TS a zdůrazňuje schopnost této transplantační platformy detekovat fenotypy onemocnění in vivo.
Poté jsme se ptali, do jaké míry jsou t-hCO buňky funkčně integrovány do S1 potkanů. S1 u hlodavců přijímá silné synaptické vstupy z ipsilaterálních ventrálních bazálních a zadních thalamických jader, stejně jako z ipsilaterálních motorických a sekundárních somatosenzorických kortexů a kontralaterálního S1 (obr. 4a). Pro obnovení inervačního vzoru jsme infikovali hCO virem vztekliny-dG-GFP/AAV-G a o 3 dny později jsme transplantovali hCO do S1 potkanů. 7–14 dní po transplantaci jsme pozorovali hustou expresi GFP v neuronech ipsilaterálního S1 a ventrálních bazálních ganglií (obr. 4b, c). Kromě toho barvení protilátek thalamického markeru netrinu G1 odhalilo přítomnost thalamických zakončení v t-hCO (obr. 4d, e). Abychom vyhodnotili, zda by tyto aferentní projekce mohly vyvolat synaptické reakce v t-hCO buňkách, provedli jsme záznamy celých buněk z lidských buněk v ostrých řezech thalamokortikální vrstvy. Elektrická stimulace potkaního S1, vnitřního pouzdra, bílé hmoty, vláken v blízkosti t-hCO nebo optogenetická aktivace thalamických zakončení exprimujících opsin v t-hCO indukovala krátkolatenční EPSC v t-hCO neuronech vystavených antagonistovi AMPA receptoru NBQX. (Obr. 4f, g a rozšířená data, Obr. 9a–g). Tato data ukazují, že t-hCO je anatomicky integrován do mozku potkana a je schopen být aktivován hostitelskou tkání potkana.
a, Schematický diagram experimentu se sledováním vztekliny. b, Exprese GFP a lidsky specifického STEM121 mezi t-hCO a mozkovou kůrou potkana (horní panel). Dále je znázorněna exprese GFP v ipsilaterálním ventrálním bazálním jádru (VB) potkana (vlevo dole) a ipsilaterálním S1 (vpravo dole). Měřítko, 50 µm. Červené čtverce představují oblasti mozku, kde byly snímky pořízeny. c, kvantifikace buněk exprimujících GFP (n = 4 potkani). d, e — Thalamické zakončení Netrinu G1+ v t-hCO. d ukazuje koronální řez obsahující jádra t-hCO a VB. Měřítko, 2 mm. e ukazuje expresi Netrinu G1 a STEM121 v neuronech t-hCO (vlevo) a VB (vpravo). Měřítko, 50 µm. Oranžová tečkovaná čára označuje hranici t-hCO. f, g, Aktuální stopy t-hCO neuronů po elektrické stimulaci u krysy S1 (f) nebo vnitřní kapsle (g), s (fialová) nebo bez (černá) NBQX (vlevo). Amplitudy EPSC s a bez NBQX (n = 6 neuronů S1, *P = 0,0119; a n = 6 neuronů vnitřní kapsle, **P = 0,0022) (uprostřed). Procento t-hCO neuronů vykazujících EPSC v reakci na elektrickou stimulaci krysy S1 (f) nebo vnitřní kapsle (g) (vpravo). aCSF, umělý mozkomíšní mok. h, schematický diagram zobrazovacího experimentu 2P (vlevo). Exprese GCaMP6 v t-hCO (uprostřed). Měřítko, 100 µm. Časosběr fluorescence GCaMP6 (vpravo). i, Z-skóre spontánní aktivity fluorescence. j, schematické znázornění stimulace kníru. k, z-skóre trajektorií fluorescence 2P v jednom pokusu, zarovnané s odchylkou vousů v čase nula (čárkovaná čára) v příkladných buňkách. l, populačně zprůměrované z-skóre odpovědi všech buněk zarovnané s odchylkou vousů v čase nula (čárkovaná čára) (červená) nebo náhodně generované časové značky (šedá). m. Schematický diagram experimentu s optickým značením. n, Nezpracované napěťové křivky z příkladné buňky t-hCO během stimulace modrým laserem nebo vychýlení vousů. Červené šipky označují první hroty způsobené světlem (nahoře) nebo způsobené vychýlením vousů (dole). Šedé stínování označuje periody vychýlení vousů. o, Vrcholové světelné průběhy a odpovědi na vychýlení vousů. p, hroty jednoho pokusu, zarovnané s odchylkou vousů v buňkách příkladu. 0 označuje odchylku vousů (čárkovaná čára). q, populačně zprůměrovaná frekvence zážehu z-skóre pro všechny fotocitlivé buňky, zarovnaná s odchylkou vousů v čase nula (čárkovaná čára) (červená) nebo náhodně generované časové značky (šedá). r, Podíl fotosenzitivních jednotek významně modulovaných odchylkou vousů (n = 3 krysy) (vlevo). Latence vrcholu z-skóre (n = 3 krysy; n = 5 (světle zelená), n = 4 (tmavě zelená) a n = 4 (azurová) modulační jednotky odchylky vousů na krysu) (vpravo). Data jsou vyjádřena jako průměr ± směrodatná odchylka.
Poté jsme se ptali, zda by t-hCO mohl být aktivován senzorickými podněty in vivo. Transplantovali jsme hCO exprimující geneticky kódované indikátory vápníku GCaMP6 do krys S1. Po 150 dnech jsme provedli vláknovou fotometrii nebo dvoufotonové zobrazování vápníku (obr. 4h a rozšířená data, obr. 10a). Zjistili jsme, že buňky t-hCO vykazovaly synchronizovanou rytmickou aktivitu (obrázek 4i, rozšířená data, obrázek 10b a doplňkové video 1). Pro charakterizaci vrcholové aktivity t-hCO jsme provedli extracelulární elektrofyziologické záznamy u anestetizovaných transplantovaných krys (rozšířená data, obr. 10c-f). Z MRI snímků jsme generovali stereotaktické souřadnice; tyto zaznamenané jednotky tedy představují domnělé lidské neurony, ačkoli samotná elektrofyziologie neumožňuje určit druhový původ. Pozorovali jsme synchronizované záblesky aktivity (rozšířená data, obr. 10d). Záblesky trvaly přibližně 460 ms a byly odděleny periodami ticha přibližně 2 s (rozšířená data, obr. 10d, e). Jednotlivé jednotky vypálily v průměru asi tři rány na dávku, což představuje přibližně 73 % registrovaných jednotek na dávku. Aktivita jednotlivých jednotek byla vysoce korelovaná a tyto korelace byly vyšší než u jednotek identifikovaných u neočkovaných zvířat zaznamenaných za stejných podmínek (rozšířená data, obr. 10f). Pro další charakterizaci hrotových odpovědí identifikovaných neuronů lidského původu jsme provedli experimenty se světelným značením na anestetizovaných krysách, kterým byl transplantován hCO exprimující světlocitlivý kationtový kanál rhodopsin 2 (hChR2), jehož prostřednictvím t-hCO neurony rozpoznávají s krátkou latencí (méně než 10 ms) v reakci na modré světelné podněty (obr. 4m–o). t-hCO neurony vykazovaly záblesky spontánní aktivity na frekvencích podobných těm, které byly pozorovány při zobrazování vápníkem, stejně jako elektrofyziologické záznamy provedené v t-hCO bez světelného značení (rozšířená data, obr. 10c-g). V odpovídajících fázích hCO zaznamenaných in vitro nebyla pozorována žádná spontánní aktivita. Abychom posoudili, zda by t-hCO mohl být aktivován senzorickými podněty, krátce jsme odklonili vousy potkanů ​​od t-hCO (obr. 4j,m a rozšířená data, obr. 10h,k). Podle předchozích studií8,10 vykazovala podskupina buněk t-hCO zvýšenou aktivitu v reakci na odchylku vousů, což nebylo pozorováno při porovnání dat s náhodnými časovými razítky (obr. 4k–q a rozšířená data, obr. 10h–q). Ve skutečnosti přibližně 54 % opto-značených jednotlivých jednotek vykazovalo po stimulaci vousů významně zvýšenou rychlost buzení s vrcholem přibližně 650 ms (obr. 4r). Celkově vzato tato data naznačují, že t-hCO přijímá vhodné funkční vstupy a může být aktivován podněty z prostředí.
Poté jsme zkoumali, zda t-hCO může aktivovat nervové okruhy u potkanů ​​a řídit jejich chování. Nejprve jsme zkoumali, zda axony neuronů t-hCO promítají do okolních tkání potkana. Infikovali jsme hCO lentivirem kódujícím hChR2 fúzovaný s EYFP (hChR2-EYFP). Po 110 dnech jsme pozorovali expresi EYFP v ipsilaterálních kortikálních oblastech, včetně sluchové, motorické a somatosenzorické kůry, a také v subkortikálních oblastech, včetně striata, hipokampu a thalamu (obr. 5a). Abychom posoudili, zda tyto eferentní projekce mohou vyvolat synaptické reakce v buňkách potkanů, opticky jsme aktivovali buňky t-hCO exprimující hChR2-EYFP záznamem buněk mozkové kůry potkanů ​​v ostrých řezech mozku. Aktivace axonů t-hCO modrým světlem indukovala krátkolatenční EPSC v neuronech pyramidální kůry potkanů, které byly blokovány pomocí NBQX (obr. 5b–g). Kromě toho mohly být tyto reakce blokovány tetrodotoxinem (TTX) a obnoveny 4-aminopyridinem (4-AP), což naznačuje, že byly způsobeny monosynaptickými spojeními (obr. 5e).
a, Schematický diagram sledování axonů (vlevo). Exprese t-hCO EYFP (vpravo). Měřítko, 100 µm. A1, sluchová kůra, ACC, přední cingulární kůra, d. striatum, dorzální striatum, HPC, hipokampus; bránice, laterální septum, mPFC, mediální prefrontální kůra, piri, piriformní kůra, v. striatum, ventrální striatum, VPM, ventropostomediální jádro thalamu, VTA, ventrální tegmentální oblast. Červené čtverce představují oblasti mozku, kde byly snímky pořízeny. b, Schematický diagram stimulačního experimentu. c, d, Příklady odezvy fotoproudu (nahoře) a napětí (dole) indukovaného modrým světlem v lidských (c) EYFP+ t-hCO nebo potkaních (d) EYFP- buňkách. e, f, Aktuální stopy neuronů potkanů ​​po stimulaci axonů t-hCO modrým světlem pomocí TTX a 4-AR (zelená), TTX (šedá) nebo aCSF (černá) (e), s (fialová) nebo bez (černá) ) ) NBQX (e). g, latence odpovědí indukovaných modrým světlem v buňkách potkanů ​​(n = 16 buněk); vodorovné sloupce označují průměrnou latenci (7,13 ms) (vlevo). Amplituda světlem evokovaných EPSC zaznamenaných s NBQX nebo bez něj (n = 7 buněk; ***P < 0,0001) (uprostřed). Amplituda světlem evokovaných EPSC zaznamenaných s NBQX nebo bez něj (n = 7 buněk; ***P < 0,0001) (uprostřed). Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P) <0,000). Amplituda světlem indukovaných EPSC zaznamenaných s NBQX nebo bez něj (n = 7 buněk; ***P < 0,0001) (střed).使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）　使用或不使用NBQX 记录的光诱发EPSC 的振幅（n = 7 个细胞；***P < 0,0001）（中）　 Амплитуда вызванных светом EPSC, зарегистрированных с или без NBQX (n = 7 клеток; ***P) <0,000). Amplituda světlem indukovaných EPSC zaznamenaných s NBQX nebo bez něj (n = 7 buněk; ***P < 0,0001) (střed).Procento buněk potkanů ​​vykazujících EPSC, které reagují na modré světlo (vpravo). h, Schematický diagram behaviorálního úkolu. d0, den 0. i. Výkonnost příkladných zvířat v den 1 (vlevo) nebo den 15 (vpravo) tréninku. Průměrný počet olizování provedených 1. den (vlevo) nebo 15. den (vpravo uprostřed) (n = 150 pokusů s modrým světlem, n = 150 pokusů s červeným světlem; ***P < 0,0001). Průměrný počet olizování provedených 1. den (vlevo) nebo 15. den (vpravo uprostřed) (n = 150 pokusů s modrým světlem, n = 150 pokusů s červeným světlem; ***P < 0,0001). Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (slева) или день 15 (в центре 150 слева испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Průměrný počet olizování provedených 1. den (vlevo) nebo 15. den (vpravo uprostřed) (n = 150 pokusů s modrým světlem, n = 150 pokusů s červeným světlem; ***P < 0,0001).第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150 n次红光试验；***P < 0,0001）。第1 天（左）或第15 天（右中）执行的平均舔次数（n = 150 次蓝光试验，n = 150 n次红光试验；***P < 0,001 Среднее количество облизываний, выполненных в день 1 (slева) или день 15 (в центре 150 слева испытаний с синим светом, n = 150 испытаний с красным светом ***P <0,0001). Průměrný počet olizování provedených 1. den (vlevo) nebo 15. den (vpravo uprostřed) (n = 150 pokusů s modrým světlem, n = 150 pokusů s červeným světlem; ***P < 0,0001).Kumulativní olizování pro testy s červeným a modrým světlem v den 1 (vlevo uprostřed) nebo v den 15 (vpravo). NS, nevýznamné. j,k, Behaviorální charakteristiky všech zvířat transplantovaných s t-hCO exprimujícím hChR2-EYFP (j) nebo kontrolním fluoroforem (k) v den 1 nebo 15 (hChR2-EYFP: n = 9 krys, ** P = 0,0049; kontrola: n = 9, P = 0,1497). l, Vývoj skóre preference (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Vývoj skóre preference (n = 9 hChR2, n = 9 kontrola; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l, Эволюция показателя предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контрольных; **P <0,001, ***P <0,000). l, Vývoj skóre preference (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001). l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）。 l，偏好评分的演变（n = 9 hChR2，n = 9 对照；**P < 0,001,***P < 0,0001）。 l, Эволюция показателей предпочтения (n = 9 hChR2, n = 9 контролей; **P <0,001, ***P <0,0001). l, Vývoj preferenčních skóre (n = 9 hChR2, n = 9 kontrol; **P < 0,001, ***P < 0,0001).m, exprese FOS v reakci na optogenetickou aktivaci t-hCO v S1. Jsou zobrazeny snímky exprese FOS (vlevo) a kvantifikace (n = 3 na skupinu; *P < 0,05, **P < 0,01 a ***P < 0,001) (vpravo). Jsou zobrazeny snímky exprese FOS (vlevo) a kvantifikace (n = 3 na skupinu; *P < 0,05, **P < 0,01 a ***P < 0,001) (vpravo). Показаны изображения экспрессии FOS (слева) a количественного определения (n = 3 наппрессии на **,5 Pуру) <0,01 a *** P <0,001) (справа). Vpravo jsou zobrazeny snímky exprese FOS (vlevo) a kvantifikace (n = 3 na skupinu; *P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001).显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001＃倉：右值倉显示了FOS 表达（左）和量化（每组n = 3；*P < 0,05、**P < 0,01 和***P < 0,001＃倉：右值倉 Показаны изображения экспрессии FOS (слева) a количественного определения (n = 3 наппрессии на **,5 Pуру) <0,01 a *** P <0,001) (справа). Vpravo jsou zobrazeny snímky exprese FOS (vlevo) a kvantifikace (n = 3 na skupinu; *P<0,05, **P<0,01 a ***P<0,001).Měřítko, 100 µm. Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní chyba BLA, bazolaterální tonzily, MDT, dorzomediálního thalamického jádra, PAG, periakveduktální šedé vrstvy.
Nakonec jsme se zeptali, zda t-hCO může modulovat chování potkanů. Abychom to otestovali, transplantovali jsme hCO exprimující hChR2-EYFP do S1 a o 90 dní později jsme do t-hCO implantovali optická vlákna pro dodávání světla. Poté jsme potkany trénovali modifikovaným paradigmatem operantního podmiňování (obr. 5h). Zvířata jsme umístili do behaviorální testovací komory a náhodně aplikovali 5sekundové modré (473 nm) a červené (635 nm) laserové stimuly. Zvířata dostávala odměnu ve formě vody, pokud si během stimulace modrým světlem olizovala, ale během stimulace červeným světlem ne. První den tréninku zvířata nevykazovala žádný rozdíl v olizování při stimulaci modrým nebo červeným světlem. Nicméně 15. den zvířata s transplantovaným hCO exprimujícím hChR2-EYFP vykazovala aktivnější olizování při stimulaci modrým světlem ve srovnání se stimulací červeným světlem. Tyto změny v chování při olizování nebyly pozorovány u kontrolních zvířat, kterým byl transplantován hCO exprimující kontrolní fluorofor (míra úspěšnosti učení: hChR2 89 %, EYFP 0 %, obrázek 5i-1 a doplňkové video 2). Tato data naznačují, že buňky t-hCO mohou aktivovat neurony potkanů ​​a stimulovat tak chování zaměřené na odměnu. Abychom zjistili, které nervové okruhy t-hCO potkanů ​​by mohly být zapojeny do těchto změn chování, optogeneticky jsme aktivovali t-hCO u trénovaných zvířat a o 90 minut později jsme odebrali tkáně. Imunohistochemie odhalila expresi proteinu FOS závislého na aktivitě v několika oblastech mozku zapojených do motivovaného chování, včetně mediálního prefrontálního kortexu, mediálního thalamu a periakveduktální šedé hmoty, která byla exprimována buď u nestimulovaných kontrolních zvířat, nebo u zvířat (rýže. 5m). Celkově vzato tato data naznačují, že t-hCO může modulovat neuronální aktivitu potkanů ​​a řídit tak chování.
Neurální organoidy představují slibný systém pro studium lidského vývoje a onemocnění in vitro, ale jsou omezeny nedostatkem propojení mezi okruhy, které existují in vivo. Vyvinuli jsme novou platformu, ve které jsme transplantovali hCO do S1 imunokompromitovaných časných postnatálních krys, abychom studovali vývoj a funkci lidských buněk in vivo. Ukázali jsme, že t-hCO vyvíjí zralé buněčné typy, které nebyly pozorovány in vitro28, a že t-hCO je anatomicky a funkčně integrován do mozku hlodavců. Integrace t-hCO do nervových okruhů hlodavců nám umožnila prokázat souvislost mezi lidskou buněčnou aktivitou a studovaným chováním zvířat, což ukazuje, že neurony t-hCO mohou modulovat neuronální aktivitu potkanů ​​a řídit tak behaviorální reakce.
Platforma, kterou popisujeme, má oproti předchozímu výzkumu transplantace lidských buněk do mozků hlodavců několik výhod. Zaprvé jsme transplantovali hCO do vyvíjející se kůry raných postnatálních krys, což může usnadnit anatomickou a funkční integraci. Zadruhé, monitorování t-hCO2 pomocí MRI nám umožnilo studovat polohu a růst štěpu u živých zvířat, což nám umožnilo provádět dlouhodobé studie na více zvířatech a stanovit spolehlivost několika buněčných linií hiPS. Nakonec jsme transplantovali intaktní organoidy, spíše než izolované suspenze jednotlivých buněk, které jsou pro lidské buňky méně destruktivní a mohou podporovat integraci a tvorbu neuronů lidské kůry v mozku krys.
Uznáváme, že navzdory pokrokům v této platformě brání časová, prostorová a mezidruhová omezení tvorbě lidských nervových obvodů s vysokou věrností, a to i po transplantaci v rané fázi vývoje. Například není jasné, zda spontánní aktivita pozorovaná v t-hCO představuje vývojový fenotyp podobný rytmické aktivitě pozorované během kortikálního vývoje, nebo zda je způsobena absencí supresivních typů buněk přítomných v t-hCO. Podobně není jasné, do jaké míry absence laminace v t-hCO ovlivňuje konektivitu řetězce30. Budoucí práce se zaměří na integraci dalších typů buněk, jako jsou lidské mikroglie, lidské endoteliální buňky a různé podíly GABAergních interneuronů, jak je ukázáno pomocí sestavy 6 in vitro, a také na pochopení toho, jak může docházet k nervové integraci a zpracování v pozměněném t-hCO na transkripčních, synaptických a behaviorálních úrovních v buňkách získaných od pacientů.
Celkově vzato, tato in vivo platforma představuje silný zdroj, který může doplnit in vitro vývoj lidského mozku a výzkum onemocnění. Očekáváme, že nám tato platforma umožní objevit nové fenotypy na úrovni řetězců v jinak nedosažitelných buňkách odvozených od pacientů a testovat nové terapeutické strategie.
Z buněk HiPS jsme generovali hCO2,5, jak bylo popsáno dříve. Pro zahájení produkce hCO z buněk hiPS kultivovaných na podpůrných vrstvách byly intaktní kolonie buněk hiPS odstraněny z kultivačních misek pomocí dispázy (0,35 mg/ml) a přeneseny do plastových kultur s ultranízkou adhezí obsahujících misky s kultivačním médiem pro buňky hiPS (Corning) doplněným dvěma inhibitory SMAD, dorsomorfinem (5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) a SB-431542 (10 μM; 1614, Tocris) a inhibitorem ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Během prvních 5 dnů bylo médium pro buňky hiPS denně měněno a byly přidány dorsomorfin a SB-431542. Šestý den v suspenzi byly nervové sféroidy přeneseny do nervového média obsahujícího neurobasal-A (10888, Life Technologies), doplněk B-27 bez vitaminu A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin a streptomycin (1:100, Life Technologies) a doplněny epidermálním růstovým faktorem (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) a fibroblastovým růstovým faktorem 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) až do 24. dne. Od 25. do 42. dne bylo médium doplněno mozkovým neurotrofickým faktorem (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) a neurotrofinem 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) s výměnou média obden. Šestý den v suspenzi byly nervové sféroidy přeneseny do nervového média obsahujícího neurobasal-A (10888, Life Technologies), doplněk B-27 bez vitaminu A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), penicilin a streptomycin (1:100, Life Technologies) a doplněny epidermálním růstovým faktorem (EGF; 20 ng ml−1; R&D Systems) a fibroblastovým růstovým faktorem 2 (FGF2; 20 ng ml−1; R&D Systems) až do 24. dne. Od 25. do 42. dne bylo médium doplněno mozkovým neurotrofickým faktorem (BDNF; 20 ng ml−1, Peprotech) a neurotrofinem 3 (NT3; 20 ng ml−1; Peprotech) s výměnou média obden.Šestý den v suspenzi byly nervové sféroidy přeneseny do nervového média obsahujícího Neurobasal-A (10888, Life Technologies), doplněk B-27 bez vitaminu A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies) a penicilin.и стрептомицин (1:100, Life Technologies) a дополнены эпидермальным фактором роста (EGF; 20 нгт/рмал) R; роста фибробластов 2 (FGF2; 20 нг/мл; R&D Systems) do 24-го дня. a streptomycinem (1:100, Life Technologies) a doplněn epidermálním růstovým faktorem (EGF; 20 ng/ml; R&D Systems) a fibroblastovým růstovým faktorem 2 (FGF2; 20 ng/ml; R&D Systems) do 24. dne.Od 25. do 42. dne byl do média přidán neurotrofický faktor odvozený z mozku (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) a neurotrofin 3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech), přičemž médium bylo měněno obden.在悬浮的第6 天，将神经球体转移到含有neurobasal-A（10888，Life Technologies）瀁不含维生素A补充剂）(12587，Life Technologies）、GlutaMax（1:100，Life Technologies）、青霉素的神经培养基中和链霉:00和链霉和链霉和链霉和链霉和链霉和链霉和链霉和Technologies）并辅以表皮生长因子（EGF；20 ng ml-1；R&D Systems）和成纤维细胞生长因子2（FGF2 （FGF2！R Systémy）直至第24 天。在 悬浮 的 第 第 6 天 将 神 经 球 体 转 移 含 有 含 有 的 第 第 （ 10888 ， Life Technologies Ｋ 不b-27 补充剂 （12587 ， Life Technologies） Glutamax （1: 100 ， Life TechNOGIS青霉素 的神经 埉养 基 丈 链頼， Life Technologies） 表皮 生长 因子 （（；20 ng ml-1 ； r & d Systems） 成 纤维 细胞 生长 2 （fgf2 ； 20 ng ml- 1；R Systémy）直至第24天。 На 6-й день суспензии нейросферы были переведены на добавку, содержащую незарова, 88, Life Technologies незароs добавку В-27 без витамина А (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), пенициллин- нейтрализовантиней: 10. Life Technologies) с добавлением эпидермального фактора роста (EGF; 20 нг мл-1; R&D Systems) a факторат ростарта (FGF2; 20 nг ul-1) 1; Šestý den byly suspenze neurosfér převedeny na doplněk obsahující neurobasal-A (10888, Life Technologies), doplněk B-27 bez vitaminu A (12587, Life Technologies), GlutaMax (1:100, Life Technologies), streptomycin neutralizovaný penicilinem (1:100, Life Technologies) doplněný epidermálním růstovým faktorem (EGF; 20 ng ml-1; R&D Systems) a fibroblastovým růstovým faktorem 2 (FGF2; 20 ng ml-1)1; R&D Systems) do 24-го дня. Systémy výzkumu a vývoje) do 24. dne.Od 25. do 42. dne byly do kultivačního média každý druhý den přidávány mozkové neurotrofické faktory (BDNF; 20 ng ml-1, Peprotech) a NT3 (NT3; 20 ng ml-1, Peprotech). Médium bylo jednou vyměněno.Počínaje 43. dnem byl hCO₃ udržován v nedoplněném neurobazálním médiu A (NM; 1088022, Thermo Fisher) s výměnou média každé 4–6 dny. Pro získání hCO₃ z buněk hiPS kultivovaných za bezkrmových podmínek byly buňky hiPS inkubovány s Accutase (AT-104, Innovate Cell Technologies) při 37 °C po dobu 7 minut, disociovány na jednotlivé buňky a naneseny na destičky AggreWell 800 (34815, STEMCELL Technologies) v hustotě 3 × 10⁶ jednotlivých buněk na jamku v médiu Essential 8 doplněném inhibitorem ROCK Y-27632 (10 μM; S1049, Selleckchem). Po 24 hodinách byla média v jamkách pipetou přelita nahoru a dolů do média obsahujícího médium Essential 6 (A1516401, Life Technologies) doplněné dorsomorfinem (2,5 μM; P5499, Sigma-Aldrich) a SB-431542 (10 μM; 1614). (Tocrida). Od 2. do 6. dne bylo médium Essential 6 denně nahrazováno dorsomorfinem a doplňkem SB-431542. Od šestého dne byly suspenze neurosfér přeneseny do neurobazálního média a udržovány, jak je popsáno výše.
Všechny postupy na zvířatech byly provedeny v souladu s pokyny pro péči o zvířata schválenými Správním výborem pro péči o laboratorní zvířata Stanfordské univerzity (APLAC). Byly zakoupeny nebo chovány březí euthymické krysy RNU (rnu/+) (Charles River Laboratories). Zvířata byla chována v 12hodinovém cyklu světlo-tma s potravou a vodou ad libitum. Mláďata nahých krys (FOXN1–/–) ve věku tří až sedmi dnů byla identifikována podle růstu nezralých vousů před utracením. Štěňata (samci a samice) byla anestetizována 2–3% isofluranem a umístěna na stereotaktický rám. Byla provedena trepanace lebky o průměru přibližně 2–3 mm nad S1, přičemž byla zachována integrita tvrdé pleny mozkové (dura mater). Poté byla těsně vně kraniotomie použita jehla 30-G (přibližně 0,3 mm) k propíchnutí tvrdé pleny mozkové. Poté byl na tenký parafilm o rozměrech 3×3 cm aplikován HCO3 a přebytečné médium odstraněno. Pomocí Hamiltonovy stříkačky připojené k jehle 23 G, 45°, jemně natáhněte hCO₃ do nejdistálnějšího konce jehly. Poté nasaďte stříkačku na injekční pumpu připojenou ke stereotaktickému zařízení. Poté umístěte hrot jehly nad předem vytvořený 0,3 mm široký otvor v tvrdé pleně (z = 0 mm) a zúžte stříkačku o 1–2 mm (z = přibližně –1,5 mm), dokud se jehla nedostane mezi dura mater A. Nevytvoří se hustý uzávěr. Poté zvedněte stříkačku do středu kortikálního povrchu v bodě z = -0,5 mm a vstřikujte hCO₃ rychlostí 1–2 µl za minutu. Po dokončení injekce hCO₃ se jehla vytáhne rychlostí 0,2–0,5 mm za minutu, kůže se zašije a štěně se okamžitě umístí na teplou vyhřívací podložku až do úplného uzdravení. Některá zvířata byla transplantována bilaterálně.
Všechny postupy na zvířatech byly provedeny v souladu s pokyny pro péči o zvířata schválenými Stanfordskou univerzitou APLAC. Krysy (starší 60 dní po transplantaci) byly anestetizovány 5% isofluranem a během zobrazování byly anestetizovány 1-3% isofluranem. Pro vizualizaci byl použit aktivně stíněný horizontální vrtný skener Bruker (Bruker Corp.) o výkonu 7 Tesla s gradientním pohonem od International Electric Company (IECO), stíněnou gradientní vložkou s vnitřním průměrem 120 mm (600 mT/m, 1000 T/m/s) s využitím softwaru AVANCE.III, osmikanálové vícecívkové RF cívky a vícejádrových funkcí a doprovodné platformy Paravision 6.0.1. Záznam byl prováděn pomocí aktivně oddělené volumetrické RF cívky s vnitřním průměrem 86 mm a čtyřkanálové kryogenicky chlazené RF cívky pouze pro příjem. Axiální 2D Turbo-RARE (doba opakování = 2500 ms, doba ozvěny = 33 ms, 2 průměry) s 16 snímáními řezů, tloušťka řezu 0,6–0,8 mm, obsahující 256 × 256 vzorků. Signály byly přijímány pomocí kvadraturní transceiverové volumetrické RF cívky s vnitřním průměrem 2 cm (Rapid MR International, LLC). Nakonec byly použity vestavěné funkce pro odhad povrchu Imaris (BitPlane) pro 3D vykreslování a objemovou analýzu. Úspěšná transplantace byla definována jako transplantace, u které se v transplantované hemisféře vytvořily oblasti kontinuálního T2 váženého MRI signálu. Rejekce štěpu byla definována jako štěp, který v transplantované hemisféře neprodukoval oblasti kontinuálního T2 váženého MRI signálu. Subkortikální t-hCO₂ byl z následné analýzy vyloučen.
Pro stabilní expresi GCaMP6s v hCO₃ pro dvoufotonové zobrazování vápníku byly buňky hiPS infikovány pLV[Exp]-EF1a::GcaMP6s-WPRE-Puro a následně provedena selekce antibiotik. Stručně řečeno, buňky byly disociovány s EDTA a suspendovány v 1 ml média Essential 8 v hustotě přibližně 300 000 buněk za přítomnosti polybrenu (5 μg/ml) a 15 μl viru. Buňky byly poté inkubovány v suspenzi po dobu 60 minut a vysety v hustotě 50 000 buněk na jamku. Po konfluenci byly buňky ošetřeny 5-10 μg ml-1 puromycinu po dobu 5-10 dnů nebo dokud se neobjevily stabilní kolonie. Akutní infekce hCO byla provedena, jak bylo popsáno dříve5, s určitými úpravami. Stručně řečeno, hCO₃ byl přenesen 30.-45. den do 1,5ml mikrocentrifugačních zkumavek Eppendorf obsahujících 100 µl nervového média. Poté se odebere přibližně 90 µl média, do zkumavky se přidá 3–6 µl lentiviru s vysokým titrem (od 0,5 x 108 do 1,2 x 109) a hCO3 se na 30 minut přenese do inkubátoru. Poté se do každé zkumavky přidá 90–100 µl média a zkumavky se přes noc vrátí do inkubátoru. Následující den se hCO3 přenese do čerstvého nervového média v destičkách s nízkou vazbou. Po 7 dnech se hCO3 přenese na 24jamkové destičky se skleněným dnem pro vizualizaci a vyhodnocení kvality infekce. pLV[Exp]-SYN1::EYFP-WPRE a pLV[Exp]-SYN1::hChR2-EYFP-WPRE byly generovány pomocí VectorBuilderu. Lentivirus se používá ve většině experimentů, protože je integrován do hostitelského genomu, což umožňuje expresi reportérového genu v infikovaných buněčných liniích. Pro sledování vztekliny byl hCO v den 30-45 koinfikován virem vztekliny-ΔG-eGFP a AAV-DJ-EF1a-CVS-G-WPRE-pGHpA (plazmid č. 67528, Addgene), důkladně promyt po dobu 3 dnů a transplantován do krys v S1 a udržován in vivo po dobu 7-14 dnů.
Pro imunocytochemický rozbor byla zvířata anestetizována a transkardiálně perfuzována PBS a následně 4% paraformaldehydem (PFA v PBS; Electron Microscopy Sciences). Mozky byly fixovány ve 4% PFA po dobu 2 hodin nebo přes noc při 4 °C, kryokonzervovány v 30% sacharóze v PBS po dobu 48–72 hodin a zality do 1:1 30% sacharózy:OCT (Tissue-Tek OCT Compound 4583, Sakura Finetek) a koronální řezy byly provedeny o tloušťce 30 µm za použití kryostatu (Leica). Pro imunohistochemický rozbor tlustých řezů byla zvířata perfuzována PBS a mozek byl preparován a koronálně nařezán o tloušťce 300–400 µm za použití vibratomu (Leica) a řezy byly fixovány 4% PFA po dobu 30 minut. Kryořezy nebo silné řezy byly poté promyty PBS, blokovány po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě (10% normální oslí sérum (NDS) a 0,3% Triton X-100 zředěný v PBS) a blokovány blokovacím roztokem při 4 °C. – Inkubace Kryořezy byly inkubovány přes noc a silné řezy byly inkubovány po dobu 5 dnů. Primárně použité protilátky byly: anti-NeuN (myš, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (krysa, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (králík, 1:1 000; Z0334, Dako), anti-GFP (kuře, 1:1 000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (myš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (králík, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (králík, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (králík, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (myš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (králík, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (králík, 1:400; ABN904, Millipore) a anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Primárně použité protilátky byly: anti-NeuN (myš, 1:500; ab104224, abcam) anti-CTIP2 (krysa, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (králík, 1:1 000; Z0334, Dako), anti-GFP (kuře, 1:1 000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (myš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (králík, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (králík, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (králík, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (myš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (králík, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (králík, 1:400; ABN904, Millipore) a anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam). Использовались следующие первичные антитела: анти-NeuN (мышиные, 1:500; ab104224, ab104224, ab104224, ab104224 (abcam-2CT-IPанытинир), 2CT 1:300; ab18465, abcam), анти-GFAP (кроличьи, 1:1000; Z0334, Dako), анти- -GFP (курица, 1:1000; GTX13970, GeneTex), нашнти-Hы. 1:200; ab191181, abcam), анти-NeuN (кролик, 1:500; ABN78, Millipore), анти-PDGFRA (кролик, 1:200; sc-338, Санта-Круза), анти-PPP1R17 (кролик, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), анти-RECA-1 (мышь, 1:50; ab9774, abcam), анти-SCG2 (крол-1ик,50, , , Proteintech), анти-SOX9 (козий, 1:500; AF3075, R&D Systems), нетрин G1a (козий, 1:100; AF1166, R&D Systems), анти-STEMши0и;мы: Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) a анти-IBA1 (коза, 1:100; аб5076, абкам). Primárně použité protilátky byly: anti-NeuN (myš, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (krysa, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (králík, 1:1000; Z0334, Dako), anti-GFP (kuře, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (myš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (králík, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (králík, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (králík, 1:200; HPA047819, Atlas Antibodies), anti-RECA-1 (myš, 1:50; ab9774). abcam), anti-SCG2 (králík, 1:100; 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (králík, 1:400; ABN904, Millipore) a anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1:3 00；ab18465，abcam））抗GFAP（兔，1:1,000；Z0334，Dako））,抗-GF P（鸡，1:1,000；GTX13970；GeneTex），抗HNA（小鼠；1:200；ab1911 81，abcam））,抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore）））,抗PDGFRA(兔，, 1:200；sc-338；Santa Cruz）），抗PPP1R17(兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2（兔） , 1:100；20357-1-AP，Proteintech））抗SOX9(山羊，1:500；AF3075，R&D Systems）））Netrin G1a（山羊，1:100；AF1166，R&D Systems），抗STEM121（小鼠, 1:200;使用的一抗是：抗NeuN（小鼠，1:500；ab104224，abcam）抗CTIP2（大鼠，1 :300；ab18465，abcam），抗GFAP（兔；1:1000；Z0334，Dako））,抗-GFP（鸡，1:1000；GTX13970，GeneTex），抗HNA（小鼠，1:200；ab 191181，abcam））抗NeuN（兔，1:500；ABN78，Millipore％弔，抗1: 200；sc-338；Santa Cruz）），抗PPP1R17(兔，1:200；HPA047819，Atlas抗体），抗RECA-1（小鼠，1:50；ab9774，abcam），抗SCG2 100；20357-1-AP，Proteintech），抗SOX9（山羊，1:500；AF3075；R&D Systems）；Netrin G1a（山羊，1:160,R&, AF160,R&, 1:100 Systems）頏1:20, ;Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (králík, 1:400; ABN904, Millipore) a anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abcam).Primárně použité protilátky byly: anti-NeuN (myš, 1:500; ab104224, abcam), anti-CTIP2 (krysa, 1:300; ab18465, abcam), anti-GFAP (králík, 1:1000; Z0334, Dako). , anti-GFP (kuře, 1:1000; GTX13970, GeneTex), anti-HNA (myš, 1:200; ab191181, abcam), anti-NeuN (králík, 1:500; ABN78, Millipore), anti-PDGFRA (králík, 1:200; sc-338, Santa Cruz), anti-PPP1R17 (králík, 1:200; HPA047819, protilátka Atlas), anti-RECA-1 (myš, 1:50; ab9774, abcam), anti-SCG2 (králík), 1:100;20357-1-AP, Proteintech), анти-SOX9 (коза, 1:500; AF3075, R&D Systems); Y40410, Takara Bio), анти-SATB2 (мышь, 1:50; ab51502, abcam), анти-GAD65/67 (кролик, 1:400; ABN904, Millipore) a (анти 1,100) аб5076, абкам). 20357-1-AP, Proteintech), anti-SOX9 (koza, 1:500; AF3075, R&D Systems), Netrin G1a (koza, 1:100; AF1166, R&D Systems), anti-STEM121 (myš, 1:200; Y40410, Takara Bio), anti-SATB2 (myš, 1:50; ab51502, abcam), anti-GAD65/67 (králík, 1:400; ABN904, Millipore) a anti-IBA1 (koza, 1:100; ab5076, abkam).Řezy byly poté promyty PBS a inkubovány se sekundární protilátkou po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě (zmrazené řezy) nebo přes noc při 4 °C (tlusté řezy). Byla použita sekundární protilátka Alexa Fluor (Life Technologies) zředěná 1:1000 v blokovacím roztoku. Po promytí PBS byla jádra vizualizována pomocí Hoechst 33258 (Life Technologies). Nakonec byla sklíčka umístěna na mikroskop s krycími sklíčky (Fisher Scientific) za použití Aquamount (Polysciences) a analyzována na fluorescenčním mikroskopu Keyence (analyzátor BZ-X) nebo konfokálním mikroskopu Leica TCS SP8 (Las-X) na snímku. Snímky byly zpracovány pomocí programu ImageJ (Fiji). Pro kvantifikaci podílu lidských neuronů v t-hCO a kortexu potkana byly pořízeny obdélníkové snímky o šířce 387,5 μm ve středu t-hCO, na okraji kortexu potkana nebo v jeho blízkosti. Okraje štěpu byly stanoveny hodnocením změn v průhlednosti tkáně, jádrech HNA+ a/nebo přítomnosti autofluorescence tkáně. V každém snímku byl celkový počet buněk NeuN+ a HNA+ dělen celkovým počtem buněk NeuN+ ve stejné oblasti. Aby se zajistilo, že se započítávají pouze buňky s jádry v rovině snímku, jsou do výpočtu zahrnuty pouze buňky, které jsou zároveň Hoechst+. Pro snížení statistické chyby byly zprůměrovány dva snímky oddělené alespoň 1 mm.
Jeden týden před odběrem vzorků byla zvířata s transplantací hCO3 (přibližně 8 měsíců po diferenciaci) umístěna do tmavé místnosti s zastřiženými vousy, aby se minimalizovala senzorická stimulace. Izolace jader byla provedena dle dříve popsaného postupu s určitými úpravami. Stručně řečeno, t-hCO3 a hCO3 byly zničeny pomocí detergentně-mechanické buněčné lýzy a 2ml skleněného tkáňového mlýnku (D8938, Sigma-Aldrich/KIMBLE). Surová jádra byla poté odfiltrována pomocí 40 µm filtru a centrifugována při 320 g po dobu 10 minut při 4 °C před provedením gradientu hustoty sacharózy. Po kroku centrifugace (320 g po dobu 20 minut při 4 °C) byly vzorky resuspendovány v 0,04% BSA/PBS s přídavkem 0,2 jednotek µl-1 inhibitoru RNázy (40 u µl-1, AM2682, Ambion) a profiltrovány přes 40 µm průtokový filtr. Disociovaná jádra byla poté resuspendována v PBS obsahujícím 0,02 % BSA a nanesena na čip Chromium Single Cell 3′ (odhadovaný výtěžek 8 000 buněk na dráhu). Knihovny snRNA-seq byly připraveny pomocí sady Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Knihovny snRNA-seq byly připraveny pomocí sady Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Библиотеки snRNA-seq были приготовлены с помощью Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Knihovny snRNA-seq byly připraveny za použití sady Chromium Single cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 snRNA-seq 文库是使用Chromium Single cell 3′ GEM、Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics) 制备的。 Библиотеку snRNA-seq готовили с использованием Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics). Knihovna snRNA-seq byla připravena za použití sady Chromium Single Cell 3′ GEM, Library & Gel Bead Kit v3 (10x Genomics).Knihovny z různých vzorků byly sloučeny a sekvenovány pomocí systému Admera Health na NovaSeq S4 (Illumina).
Hladiny genové exprese pro každý předpokládaný jaderný čárový kód byly kvantifikovány pomocí analytického softwarového balíčku 10x Genomics CellRanger (verze 6.1.2). Konkrétně byly naměřené hodnoty porovnány s kombinací lidských (GRCh38, Ensemble, verze 98) a krysích (Rnor_6.0, Ensemble, verze 100) referenčních genomů vytvořených příkazem mkref a s použitím příkazu count s příkazem –include-introns=TRUE pro kvantifikaci zahrnujících hodnoty mapované na intronové oblasti. U vzorků t-hCO3 byla lidská jádra identifikována na základě konzervativního požadavku, aby alespoň 95 % všech mapovaných naměřených hodnot odpovídalo lidskému genomu. Všechny následné analýzy byly provedeny na filtrovaném výstupu pole čárových kódů z CellRangeru pomocí balíčku R (verze 4.1.2) Seurat (verze 4.1.1)32.
Aby bylo zajištěno, že do následné analýzy budou zahrnuta pouze vysoce kvalitní jádra, byl pro každý vzorek implementován iterativní proces filtrování. Nejprve budou identifikována a odstraněna jádra nízké kvality s méně než 1000 nalezenými unikátními geny a více než 20 % celkového počtu mitochondrií. Následně byla matice počtu genů normalizována regularizovanou negativní binomickou regresí s použitím funkce sctransform(vst.flavor=”v2″), která také identifikovala 3000 nejvariabilnějších genů s použitím výchozích parametrů. Redukce dimenzí byla provedena u genů vyšší variability pomocí analýzy hlavních komponent (PCA) s výchozími parametry a použitím dimenze datové sady 30 (dims = 30 byla zvolena na základě vizuální kontroly míst kolen a použita pro všechny vzorky a analýzy souborů). Poté jsme provedli několik kol iterativního shlukování (rozlišení = 1) pro klasifikaci genů na základě abnormálně nízkého počtu genů (medián pod 10. percentilem), abnormálně vysokého počtu mitochondriálních genů (medián nad 95. percentilem) za účelem identifikace a odstranění domnělých buněk nízké kvality, shluků a/nebo vysokého podílu podezřelých dvojčat identifikovaných pomocí balíčku DoubletFinder33 (průměrné skóre DoubletFinder nad 95. percentilem). Vzorky t-hCO (n=3) a vzorky hCO (n=3) byly integrovány samostatně pomocí funkce IntegrateData s výše uvedenými parametry. Poté Další kolo kvalitativního filtrování integrovaného datového souboru bylo provedeno, jak je popsáno výše.
Po odstranění nekvalitních jader byl integrovaný datový soubor seskupen (rozlišení = 0,5) a vložen pro účely vizualizace UMAP34. Markerové geny pro každý klastr byly stanoveny pomocí funkce FindMarkers s výchozími parametry vypočítanými z normalizovaných dat genové exprese. Hlavní buněčné třídy identifikujeme a klasifikujeme kombinací referenčních datových souborů fetální a dospělé kůry s expresí markerových genů 19,20,21,35 a anotací. Zejména cirkulující prekurzory byly identifikovány expresí MKI67 a TOP2A. Progenitorové shluky byly definovány absencí mitotických transkriptů, vysokým překrytím s multipotentními gliovými progenitorovými shluky popsanými v pozdní metafázové fetální kůře a expresí EGFR a OLIG1. Termín astrocyt používáme k zahrnutí několika stavů diferenciace astrocytů, od pozdní radiální glie až po zrání astrocytů. Astrocytové shluky exprimují vysoké hladiny SLC1A3 a AQP4 a bylo prokázáno, že mapují s podtypy fetální radiální glie a/nebo dospělými astrocyty. OPC exprimují PDGFRA a SOX10, zatímco oligodendrocyty exprimují myelinizační markery (MOG a MYRF). Glutamatergní neurony byly identifikovány přítomností neuronálních transkriptů (SYT1 a SNAP25), absencí GABAergních markerů (GAD2) a expresí NEUROD6, SLC17A7, BCL11B nebo SATB2. GluN neurony byly dále rozděleny do vyšších (exprese SATB2 a ztráta BCL11B) a hlubokých (exprese BCL11B) podtříd. Putativní neurony podplošky (SP) exprimují kromě hlubokých GluN markerů i známé markery SP18, jako jsou ST18 a SORCS1. Buňky podobné chorioideálnímu plexu byly identifikovány expresí TTR a buňky podobné meningeálním buňkám exprimovaly geny asociované s fibroblasty a mapovaly piální/vaskulární buňky z referenčního souboru dat.
Diferenciální analýza genové exprese mezi podtřídami t-hCO a hCO byla provedena pomocí nově vyvinuté pseudo-dávkové metody reprodukované ve vzorcích implementovaných pomocí balíčku Libra R (verze 1.0.0). Konkrétně byly pro skupiny provedeny log-likelihood testy edgeR (verze 3.36.0, balíček R) součtem počtu genů v buňkách pro danou buněčnou třídu pro každou replikaci vzorku. Pro vizualizaci tepelné mapy byly vypočítány normalizované hodnoty na milion (CPM) pomocí edgeR (funkce cpm()) a škálovány (pro dosažení průměru = 0, směrodatné odchylky = 1). Byla provedena analýza obohacení Gene Ontology (GO) signifikantně upregulovaných genů t-hCO GluN (hodnota P korigovaná Benjaminim-Hochbergem menší než 0,05 exprimovaná v alespoň 10 % buněk t-hCO GluN a násobek změny alespoň 2krát) provedená pomocí ToppGene Suite (https://toppgene.cchmc.org/)37. Používáme aplikaci ToppFun s výchozími parametry a uvádíme P-hodnoty korigované Benjaminiho-Hochbergovým algoritmem vypočítané z hypergeometrických testů anotovaných GO.
Abychom porovnali naše shluky snRNA-seq s anotovanými buněčnými shluky z referenčních studií primární jednobuněčné RNA-seq nebo dospělé snRNA-seq19,20,21,22, použili jsme přístup integrace párových datových sad. K integraci a porovnání překrývání shluků mezi datovými sadami jsme použili normalizační pracovní postup SCTransform (v2) v programu Seurat (s použitím stejných parametrů jako výše). Jednotlivé datové sady byly pro zvýšení výpočetní efektivity náhodně podmnoženy až do 500 buněk nebo jader na původní shluk. Použitím podobného přístupu, jaký byl popsán dříve, bylo překrývání shluků definováno jako podíl buněk nebo jader v každém sdruženém shluku, které se překrývaly s označením referenčního shluku. Pro další klasifikaci GluN jsme použili pracovní postup TransferData v programu Seurat pro data podmnožin GluN k přiřazení označení referenčních datových sad našim GluN buňkám.
Pro posouzení stavu zrání globálního transkriptomu vzorků t-hCO a hCO jsme porovnali naše pseudo-hromadné vzorky s programem BrainSpan/psychENCODE23, který se skládá z rozsáhlé sekvence RNA zahrnující vývoj lidského mozku. PCA jsme provedli na kombinované matrici genové exprese normalizované na vzor z kortikálních vzorků 10 týdnů po početí a později, u 5567 genů (spolu s našimi daty), které byly dříve identifikovány jako aktivní v kortikálních vzorcích BrainSpan (definované jako více než 50 % vývojové variance vysvětlené věkem pomocí kubického modelu)38. Kromě toho jsme odvodili geny spojené s hlavními transkriptomovými signaturami neurovývoje pomocí nenegativní maticové faktorizace, jak bylo popsáno dříve. Váhy vzorků vypočítané pomocí postupu nenegativní maticové faktorizace jsou znázorněny na obr. 5b s rozšířenými daty pro každou z pěti signatur popsaných Zhu et al.38. Transkripční markery závislé na aktivitě byly opět odvozeny z dříve publikovaných studií. Zejména ERG a LRG byly významně upregulovány v glutamatergních neuronech identifikovaných sběrem snRNA-seq z myší zrakové kůry po vizuální stimulaci z doplňkové tabulky 3 Hrvatin et al.16. Lidské obohacené LRG byly získány z kultur lidských fetálních mozků aktivovaných KCl a sklizeny 6 hodin po stimulaci a filtrované geny byly významně upregulovány u lidí, ale nikoli u hlodavců (doplňková tabulka 4). Analýza obohacení genových sad s použitím těchto genových sad byla provedena jednocestným Fisherovým exaktním testem.
Krysy se anestetizují isofluranem, vyjmou se mozky a umístí se do studeného (přibližně 4 °C) okysličeného (95 % O2 a 5 % CO2) roztoku sacharózy pro řezy obsahující: 234 mM sacharózy, 11 mM glukózy, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 a 0,5 mM CaCl2 (přibližně 310 mOsm). Koronální řezy mozků krys (300–400 µm) obsahující t-hCO2 byly připraveny pomocí vibratomu Leica VT1200, jak bylo popsáno dříve39. Řezy byly poté přeneseny do řezací komory s kontinuálním okysličením při pokojové teplotě obsahující aCSF připravený z: 10 mM glukózy, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2 a 126 mM NaCl (298 mOsm). nejméně 45 minut před záznamem. Řezy byly zaznamenány v ponořené komoře, kde byly kontinuálně perfundovány aCSF (lahvička s 95% O2 a 5% CO2). Všechna data byla zaznamenána při pokojové teplotě. Neurony t-hCO byly ukončeny pipetou z borosilikátového skla naplněnou roztokem obsahujícím 127 mM glukonátu draselného, ​​8 mM NaCl, 4 mM ATP hořečnatého, 0,3 mM GTP sodného, ​​10 mM HEPES a 0,6 mM EGTA, pH 7,2, vnitřní roztok upravený KOH (290 mOsm). Pro regeneraci byl do záznamového roztoku přidán biocytin (0,2%).
Data byla získána pomocí zesilovače MultiClamp 700B (Molecular Devices) a digitalizátoru Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrována dolní propustí při 2 kHz, digitalizována při 20 kHz a analyzována pomocí Clampfit (Molecular Devices), Origin (OriginPro). 2021b, OriginLab) a vlastních funkcí MATLABu (Mathworks). Potenciál spojení byl vypočítán pomocí JPCalc a vstupy byly upraveny na vypočítanou hodnotu -14 mV. Operace IV se skládá ze série proudových kroků v krocích 10-25 pA, od -250 do 750 pA.
Thalamus, bílá hmota a aferentní vláken S1 byly elektricky stimulovány v thalamokortikálních řezech během patch-clamp záznamu neuronů hCO, jak bylo popsáno dříve. Stručně řečeno, mozek byl umístěn na 3D tiskový stůl nakloněný v úhlu 10° a přední část mozku byla proříznuta v úhlu 35°. Mozek byl poté přilepen k řeznému povrchu a preparován, přičemž byly zachovány vyčnívající thalamokortikální axony. Bipolární wolframové elektrody (0,5 MΩ) byly namontovány na druhý mikromanipulátor a strategicky umístěny tak, aby stimulovaly čtyři oblasti na buňku (vnitřní pouzdro, bílá hmota, S1 a hCO). Synaptické odpovědi byly zaznamenány po fázové stimulaci 300 µA při 0,03–0,1 Hz.
Neurony hChR2 exprimující hCO byly aktivovány při 480 nm a světelné pulzy generované LED diodou (Prizmatix) byly aplikovány přes objektiv ×40 (0,9 NA; Olympus) za účelem zaznamenání exprese hChR2 v blízkosti buněk. Průměr osvětleného pole je přibližně 0,5 mm a celkový výkon je 10-20 mW. Šířka pulzu byla nastavena na 10 ms, což odpovídá pulzu vydávanému během experimentu s behaviorálním učením. Byly použity různé stimulační frekvence, od 1 do 20 Hz, ale pro kvantifikaci byl použit pouze první pulz série. Intervaly mezi sériemi jsou obvykle delší než 30 s, aby se minimalizoval vliv na synaptické inhibiční nebo facilitační dráhy. Abychom otestovali, zda je odpověď hChR2 monosynaptická, aplikovali jsme do lázně TTX (1 μM), dokud reakce EPSC nezmizela, a poté jsme aplikovali 4-aminopyridin (4-AP; 100 μM). Odpověď se obvykle dostaví během několika minut, s mírně delším zpožděním mezi zábleskem LED diody a generací EPSC. NBQX (10 μM) byl použit k testování, zda je odpověď řízena AMPA receptory.
Ostré hCO řezy byly vytvořeny dle dříve popsaného postupu. Stručně řečeno, hCO řezy byly zality do 4% agarózy a přeneseny do buněk obsahujících 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 a 10 mM d-(+)-glukózy. Řezy byly nařezány na tloušťku 200–300 µm při pokojové teplotě pomocí vibrátoru Leica VT1200 a uloženy v ASF při pokojové teplotě. Poté byl na hCO řezech proveden patch-camp záznam celých buněk pod přímým mikroskopem SliceScope (Scientifica). Řezy byly perfuzovány aCSF (95% O2 a 5% CO2) a buněčné signály byly zaznamenávány při pokojové teplotě. Neurony hCO byly aplikovány pomocí borosilikátové skleněné pipety naplněné roztokem obsahujícím 127 mM glukonátu draselného, ​​8 mM NaCl, 4 mM ATP hořečnatého, 0,3 mM GTP sodného, ​​10 mM HEPES a 0,6 mM EGTA, vnitřní pH 7,2, upravené KOH (osmolarita 290). Pro účely regenerace bylo do vnitřního roztoku přidáno 0,2% biocytinu.
Data byla získána programem Clampex (Clampex 11.1, Molecular Devices) s použitím zesilovače MultiClamp 700B (Molecular Devices) a digitalizátoru Digidata 1550B (Molecular Devices), filtrována dolní propustí při 2 kHz, digitalizována při 20 kHz a analyzována pomocí programu Clampfit (verze 10.6) pro analýzu (Molecular Devices) a uživatelských funkcí MATLABu (MATLAB 2019b, Mathworks). Potenciál spojení byl vypočítán pomocí JPCalc a vstupy byly upraveny na vypočítaný potenciál spojení -14 mV. Operace IV se skládá z řady proudových kroků v krocích 5-10 pA od -50 do 250 pA.
Pro morfologickou rekonstrukci sevřených neuronů byl do vnitřního roztoku přidán 0,2% biocytin (Sigma-Aldrich). Buňky jsou po hacknutí aktivovány alespoň 15 minut. Pipeta je poté pomalu vtahována po dobu 1–2 minut, dokud není registrovaná membrána zcela utěsněna. Po fyziologickém postupu řezu byly řezy fixovány přes noc při 4 °C ve 4% PFA, promyty PBS X3 a zředěny 1:1000 streptavidinem konjugovaným DyLight 549 nebo DyLight 405 (Vector Labs). Buňky naplněné biocytinem (2 %; Sigma-Aldrich) byly značeny během záznamu patch clamp při pokojové teplotě po dobu 2 hodin. Řezy byly poté upevněny na mikroskopická sklíčka pomocí Aquamount (Thermo Scientific) a vizualizovány následující den na konfokálním mikroskopu Leica TCS SP8 s použitím olejového imerzního objektivu s numerickou aperturou ×40 1,3, zvětšením ×0,9–1,0, xy. Vzorkovací frekvence je přibližně 7 pixelů na mikron. Z-stacky v intervalech 1 µm byly získávány sériově a pro pokrytí celého dendritického stromu každého neuronu byly provedeny mozaiky z-stacků a automatické sešívání pomocí Leica. Neurony byly poté sledovány polomanuálně pomocí rozhraní neuTube 40 a byly generovány soubory SWC. Soubory byly následně nahrány do pluginu SimpleNeuriteTracer41 Fiji (ImageJ, verze 2.1.0; NIH).
Lidská kortikální tkáň byla získána s informovaným souhlasem podle protokolu schváleného Etickou komisí Stanfordské univerzity. Dva vzorky lidské poporodní tkáně (ve věku 3 a 18 let) byly získány resekcí frontálního kortexu (středního gyrus frontalis) v rámci chirurgického zákroku pro refrakterní epilepsii. Po resekci byla tkáň odebrána v ledově vychlazeném NMDG-aCSF obsahujícím: 92 mM NMDG, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 25 mM glukózy, 2 mM thiomočoviny, 5 mM askorbátu sodného, ​​3 mM pyruvátu sodného, ​​0,5 mM CaCl2·4H2O a 10 mM MgSO4·7H2O. Titrováno na pH 7,3-7,4 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Tkáně byly doručeny do laboratoře do 30 minut a koronální řezy byly odebrány podle výše popsaného postupu.
Všechny zákroky na zvířatech byly provedeny v souladu s pokyny pro péči o zvířata schválenými Stanfordskou univerzitou APLAC. Krysy (starší 140 dní po transplantaci) byly anestetizovány 5% isofluranem a intraoperačně anestetizovány 1-3% isofluranem. Zvířata byla umístěna do stereotaktického rámu (Kopf) a subkutánně jim byl injikován buprenorfin s prodlouženým uvolňováním (SR). Lebka byla obnažena, vyčištěna a bylo zavedeno 3-5 kostních šroubů. Pro cílení t-hCO₂ jsme z MRI snímků vygenerovali stereotaktické souřadnice. V sledovaném místě byl vyvrtán otvor a vlákna (průměr 400 µm, NA 0,48, Doric) byla snížena 100 µm pod povrch hCO₂ a upevněna k lebce UV vytvrditelným zubním cementem (Relyx).
Záznamy z vláknové fotometrie byly provedeny dle dříve popsaného postupu42. Pro záznam spontánní aktivity byly krysy umístěny do čisté klece a k implantovanému optickému kabelu byl připojen optický patch kabel (Doric) o průměru 400 µm, připojený k systému pro sběr dat z optických vláken a fotometrů. Během 10minutového záznamu motorické aktivity mohla zvířata volně prozkoumávat klec. Pro záznam evokované aktivity byly krysy (více než 140 dní po transplantaci) anestetizovány 5% isofluranem pro indukci a 1-3% isofluranem pro udržování aktivity. Zvíře bylo umístěno do stereotaktického rámu (Kopf) a vousy na opačné straně t-hCO₂ byly zastřiženy na přibližně 2 cm a provlečeny síťkou připojenou k piezoelektrickému aktuátoru (PI). K implantovanému vláknu byl připojen optický patch kabel (Doric) o průměru 400 µm a k systému pro sběr dat. Vousy na opačné straně t-hCO₂ byly poté 50krát (2 mm při 20 Hz, 2 s na prezentaci) v náhodných časech vychýleny piezoelektrickým pohonem během 20minutového záznamového období. Pro řízení doby vychýlení pomocí vlastního kódu MATLAB použijte balíček podpory Arduino MATLAB. Události jsou synchronizovány se softwarem pro sběr dat pomocí pulzů tranzistor-tranzistorové logiky (TTL).
Krysy (starší než 140 dní po transplantaci) byly anestetizovány 5% isofluranem a intraoperačně anestetizovány 1-3% isofluranem. Zvířata byla umístěna do stereotaktického rámu (Kopf) a subkutánně jim byl injikován buprenorfin SR a dexamethason. Lebka byla obnažena, vyčištěna a bylo do ní zavedeno 3-5 kostních šroubů. Pro cílení t-hCO₂ jsme z MRI snímků vygenerovali stereotaktické souřadnice. Přímo nad transplantovaným hCO₂ byla provedena kruhová kraniotomie (o průměru přibližně 1 cm) vysokorychlostním vrtákem. Jakmile je kost co nejtenčí, ale před vrtáním skrz celou kost, byla pomocí kleští odstraněna zbývající intaktní pánevní ploténka, aby se odhalil pod ní ležící t-hCO₂. Kraniotomie byla naplněna sterilním fyziologickým roztokem a k lebce bylo pomocí UV vytvrzeného zubního cementu (Relyx) připevněno krycí sklíčko a speciální hlavový kolík.
Dvoufotonové zobrazování bylo provedeno pomocí multifotonového mikroskopu Bruker s objektivem Nikon LWD (×16, 0,8 NA). Zobrazování GCaMP6 bylo provedeno při 920 nm s 1,4násobným zvětšením v jedné rovině z a 8násobným průměrem 7,5 fps. Krysy byly indukovány 5% isofluranovou anestezií a udržovány 1-3% isofluranem. Krysy byly umístěny do zakázkového držáku na hlavu a umístěny pod čočkou. Byl pořízen 3minutový záznam motorické aktivity na pozadí. Během 20 minut záznamu bylo pomocí pikospriceru náhodně doručeno 50 potahů (každá prezentace o délce 100 ms) na vousovou podložku naproti t-hCO₂. Pro řízení doby dávkového snímání s vlastním kódem MATLAB použijte balíček podpory Arduino MATLAB. Synchronizujte události se softwarem pro sběr dat (PrairieView 5.5) pomocí TTL pulzů. Pro analýzu byly snímky korigovány na pohyb xy pomocí afinní korekce v programu MoCo spuštěném na Fidži. Extrakce fluorescenčních stop z jednotlivých buněk za použití CNMF-E43. Fluorescence byla extrahována pro každou sledovanou oblast, převedena na křivky dF/F a poté převedena na z-skóre.
Krysy (starší než 140 dní po transplantaci) byly anestetizovány 5% isofluranem a intraoperačně anestetizovány 1-3% isofluranem. Zvířata byla umístěna do stereotaktického rámu (Kopf) a subkutánně jim byl injikován buprenorfin SR a dexamethason. Vousy na opačné straně t-hCO byly zkráceny na přibližně 2 cm a provlečeny síťkou připojenou k piezoelektrickému aktuátoru. Lebka byla odkryta a vyčištěna. K lebce byl připevněn zemnicí šroub z nerezové oceli. Pro cílení t-hCO jsme vygenerovali stereotaktické souřadnice z MRI snímků. Proveďte kruhovou kraniotomii (o průměru přibližně 1 cm) vysokorychlostním vrtákem těsně nad t-hCO. Jakmile je kost co nejtenčí, ale před vrtáním skrz celou kost, pomocí kleští odstraňte zbývající neporušenou pánevní ploténku, abyste odhalili pod ní ležící t-hCO. Jednotlivé buňky byly zaznamenávány pomocí 32kanálových nebo 64kanálových silikonových sond s vysokou hustotou (Cambridge Neurotech) uzemněných k zemnícím šroubům a předem amplifikovaných zesilovači RHD (Intan). Pomocí manipulátoru byly elektrody spuštěny do cílového místa skrz kraniotomii, která je naplněna sterilním fyziologickým roztokem. Sběr dat byl prováděn při frekvenci 30 kHz pomocí systému pro sběr dat Open Ephys. Záznam pokračoval pouze tehdy, když jsme detekovali vysoce korelovanou rytmickou spontánní aktivitu ve více než 10 kanálech, což naznačuje, že elektrody byly umístěny v štěpu (na základě dat dvoufotonového zobrazování vápníku). Byl získán 10minutový záznam motorické aktivity na pozadí. Vousy na opačné straně t-hCO₂ byly poté 50krát (2 mm při 20 Hz, 2 s na prezentaci) v náhodných časech vychýleny piezoelektrickým pohonem po dobu 20 minut záznamu. Pomocí balíčku MATLAB Support Package pro Arduino (MATLAB 2019b) ovládejte dobu vychýlení pomocí vlastního kódu MATLAB. Pro synchronizaci událostí se softwarem pro sběr dat použijte TTL pulzy.
Pro experimenty s optickým značením byl k optickému vláknu o průměru 200 µm umístěnému nad kraniotomií připojen optický patchcord (Doric) o průměru 200 µm připojený k laseru o vlnové délce 473 nm (Omicron). Bezprostředně předtím byl výkon propojky nastaven na 20 mW. Pomocí manipulátoru spustite elektrody do cílového místa skrz kraniotomii, která je naplněna sterilním fyziologickým roztokem. Na začátku záznamu bylo emitováno deset světelných pulzů o vlnové délce 473 nm (frekvence 2 Hz, délka pulzu 10 ms). Fotosenzitivní buňky byly definovány jako buňky, které vykazovaly bodcovou odezvu do 10 ms světla v 70 % nebo více pokusů.