Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Tekutá biopsie (LB) je pojem, který rychle získává na popularitě v oblasti biomedicíny.Koncept je založen především na detekci fragmentů cirkulující extracelulární DNA (ccfDNA), které se uvolňují především jako malé fragmenty po buněčné smrti v různých tkáních.Malá část těchto fragmentů pochází z cizích (cizích) tkání nebo organismů.V současné práci jsme tento koncept aplikovali na mušle, strážní druh známý pro svou vysokou kapacitu filtrace mořské vody.Využíváme schopnosti slávek působit jako přirozené filtry k zachycení fragmentů DNA z různých zdrojů, abychom poskytli informace o biologické rozmanitosti mořských pobřežních ekosystémů.Naše výsledky ukazují, že hemolymfa mušlí obsahuje fragmenty DNA, které se velmi liší velikostí, od 1 do 5 kb.Shotgun sekvenování ukázalo, že velký počet fragmentů DNA je cizího mikrobiálního původu.Mezi nimi jsme našli fragmenty DNA z bakterií, archaea a virů, včetně virů, o kterých je známo, že infikují různé hostitele běžně se vyskytující v pobřežních mořských ekosystémech.Na závěr naše studie ukazuje, že koncept LB aplikovaný na mušle představuje bohatý, ale dosud neprozkoumaný zdroj znalostí o mikrobiální diverzitě v mořských pobřežních ekosystémech.
Vliv změny klimatu (CC) na biologickou rozmanitost mořských ekosystémů je rychle rostoucí oblastí výzkumu.Globální oteplování způsobuje nejen důležité fyziologické stresy, ale také posouvá evoluční limity tepelné stability mořských organismů, ovlivňuje stanoviště řady druhů a nutí je hledat příznivější podmínky [1, 2].Kromě toho, že CC ovlivňuje biologickou rozmanitost metazoanů, narušuje křehkou rovnováhu mezi hostitelem a mikrobiálními interakcemi.Tato mikrobiální dysbakterióza představuje vážnou hrozbu pro mořské ekosystémy, protože způsobuje, že mořské organismy jsou náchylnější k infekčním patogenům [3, 4].Předpokládá se, že SS hrají důležitou roli v masových úhynech, což je vážný problém pro řízení globálních mořských ekosystémů [5, 6].Vzhledem k ekonomickým, ekologickým a nutričním dopadům mnoha mořských druhů je to důležitá otázka.To platí zejména pro mlže žijící v polárních oblastech, kde jsou účinky CK bezprostřednější a závažnější [6, 7].Ve skutečnosti mlži jako Mytilus spp.se široce používají k monitorování účinků CC na mořské ekosystémy.Není divu, že bylo vyvinuto relativně velké množství biomarkerů pro sledování jejich zdraví, často s využitím dvoustupňového přístupu zahrnujícího funkční biomarkery založené na enzymatické aktivitě nebo buněčných funkcích, jako je buněčná životaschopnost a fagocytární aktivita [8].Mezi tyto metody patří i měření koncentrace specifických tlakových indikátorů, které se hromadí v měkkých tkáních po absorpci velkého množství mořské vody.Vysoká filtrační kapacita a polootevřený oběhový systém mlžů však poskytují příležitost vyvinout nové biomarkery hemolymfy pomocí konceptu tekuté biopsie (LB), jednoduchého a minimálně invazivního přístupu k léčbě pacienta.krevní vzorky [9, 10].Ačkoli v lidské LB lze nalézt několik typů cirkulujících molekul, tento koncept je primárně založen na DNA sekvenační analýze fragmentů cirkulující extracelulární DNA (ccfDNA) v plazmě.Ve skutečnosti je přítomnost cirkulující DNA v lidské plazmě známá již od poloviny 20. století [11], ale teprve v posledních letech vedl nástup vysoce výkonných sekvenačních metod ke klinické diagnóze založené na ccfDNA.Přítomnost těchto cirkulujících fragmentů DNA je částečně způsobena pasivním uvolňováním genomové DNA (jaderné a mitochondriální) po buněčné smrti. U zdravých jedinců je koncentrace ccfDNA normálně nízká (<10 ng/ml), ale může být zvýšena 5–10krát u pacientů trpících různými patologiemi nebo vystavených stresu, což vede k poškození tkáně. U zdravých jedinců je koncentrace ccfDNA normálně nízká (<10 ng/ml), ale může být zvýšena 5–10krát u pacientů trpících různými patologiemi nebo vystavených stresu, což vede k poškození tkáně. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но можетшат пово ольных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящейтеженЎут к пововр. U zdravých lidí je koncentrace cccDNA normálně nízká (<10 ng/ml), ale u pacientů s různými patologiemi nebo ve stresu, který vede k poškození tkáně, se může zvýšit 5–10krát.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病琚或承儚季办丛帛或承 孚或承 孛或承加5-10 倍，从而导致组织损伤。在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病 囂 戗 担 艎囂 戗 或 或 日可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伟 损伤伤伤损伤伤伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут бытичаѿыІу10 уневе иентов с различными патологиями или стрессом, что приводит к повреждению тканей. Koncentrace ccfDNA jsou obvykle nízké (<10 ng/ml) u zdravých jedinců, ale mohou být zvýšeny 5-10krát u pacientů s různými patologiemi nebo stresem, což vede k poškození tkáně.Velikost fragmentů ccfDNA se velmi liší, ale obvykle se pohybuje od 150 do 200 bp.[12].Analýza vlastní ccfDNA, tj. ccfDNA z normálních nebo transformovaných hostitelských buněk, může být použita k detekci genetických a epigenetických změn přítomných v jaderném a/nebo mitochondriálním genomu, čímž pomáhá lékařům vybrat specifické molekulárně cílené terapie [13].ccfDNA však lze získat z cizích zdrojů, jako je ccfDNA z fetálních buněk během těhotenství nebo z transplantovaných orgánů [14,15,16,17].ccfDNA je také důležitým zdrojem informací pro detekci přítomnosti nukleových kyselin infekčního agens (cizího), což umožňuje neinvazivní detekci rozšířených infekcí neidentifikovaných hemokulturami, čímž se zabrání invazivní biopsii infikované tkáně [18].Nedávné studie skutečně ukázaly, že lidská krev obsahuje bohatý zdroj informací, které lze použít k identifikaci virových a bakteriálních patogenů, a že asi 1 % ccfDNA nalezené v lidské plazmě je cizího původu [19].Tyto studie ukazují, že biologickou rozmanitost cirkulujícího mikrobiomu organismu lze hodnotit pomocí analýzy ccfDNA.Tento koncept se však donedávna používal výhradně u člověka a v menší míře i u jiných obratlovců [20, 21].
V tomto článku využíváme potenciál LB k analýze ccfDNA Aulacomya atra, jižního druhu běžně se vyskytujícího na subantarktických ostrovech Kerguelen, což je skupina ostrovů na vrcholu velké náhorní plošiny, která vznikla před 35 miliony let.sopečná erupce.Pomocí experimentálního systému in vitro jsme zjistili, že fragmenty DNA v mořské vodě jsou rychle přijímány mušlemi a vstupují do kompartmentu hemolymfy.Sekvenování pomocí brokovnice ukázalo, že ccfDNA hemolymfy mušlí obsahuje fragmenty DNA vlastního a nevlastního původu, včetně symbiotických bakterií a fragmentů DNA z biomů typických pro chladné vulkanické mořské pobřežní ekosystémy.Hemolymph ccfDNA také obsahuje virové sekvence odvozené z virů s různými hostitelskými oblastmi.Našli jsme také fragmenty DNA z mnohobuněčných živočichů, jako jsou kostnaté ryby, mořské sasanky, řasy a hmyz.Na závěr naše studie prokazuje, že koncept LB lze úspěšně aplikovat na mořské bezobratlé k vytvoření bohatého genomického repertoáru v mořských ekosystémech.
Dospělí jedinci (55-70 mm dlouzí) Mytilus platensis (M. platensis) a Aulacomya atra (A. atra) byli shromážděni z přílivových skalnatých břehů Port-au-France (049°21,235 jižní šířky, 070°13,490 východní délky).Kerguelen Islands v prosinci 2018. Další dospělí slávci modří (Mytilus spp.) byli získáni od komerčního dodavatele (PEI Mussel King Inc., Ostrov Prince Edwarda, Kanada) a umístěni do provzdušňované nádrže s řízenou teplotou (4°C) obsahující 10–20 l 32‰ umělé solanky.(umělá mořská sůl Reef Crystal, Instant Ocean, Virginia, USA).U každého experimentu byla měřena délka a hmotnost jednotlivých skořápek.
Bezplatný protokol otevřeného přístupu pro tento program je k dispozici online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1).Stručně řečeno, hemolymfa LB byla odebrána z abduktorových svalů, jak je popsáno [22].Hemolymfa byla vyčeřena centrifugací při 1200 x g po dobu 3 minut, supernatant byl zmražen (-20 °C) až do použití.Pro izolaci a purifikaci cfDNA byly vzorky (1,5-2,0 ml) rozmraženy a zpracovány pomocí sady NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) podle pokynů výrobce.ccfDNA byla skladována při -80 °C až do další analýzy.V některých experimentech byla ccfDNA izolována a purifikována pomocí QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada).Purifikovaná DNA byla kvantifikována pomocí standardního testu PicoGreen.Distribuce fragmentů izolované ccfDNA byla analyzována kapilární elektroforézou za použití bioanalyzátoru Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) za použití sady High Sensitivity DNA Kit.Test byl proveden s použitím 1 ul vzorku ccfDNA podle pokynů výrobce.
Pro sekvenování fragmentů ccfDNA hemolymfy připravil Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) knihovny brokovnic pomocí sady Illumina DNA Mix sady Illumina MiSeq PE75.Byl použit standardní adaptér (BioO).Soubory nezpracovaných dat jsou k dispozici v NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 a SRR8924809).Základní kvalita čtení byla hodnocena pomocí FastQC [23].Trimmomatic [24] byl použit pro ořezové adaptéry a nekvalitní čtení.Čtení brokovnice se spárovanými konci byly FLASH sloučeny do delších jednotlivých čtení s minimálním překrytím 20 bp, aby se předešlo neshodám [25]. Sloučená čtení byla anotována pomocí BLASTN pomocí databáze NCBI Taxonomy bivalve (hodnota e < 1e−3 a 90% homologie) a maskování sekvencí s nízkou složitostí bylo provedeno pomocí DUST [26]. Sloučená čtení byla anotována pomocí BLASTN pomocí databáze NCBI Taxonomy bivalve (hodnota e < 1e−3 a 90% homologie) a maskování sekvencí s nízkou složitostí bylo provedeno pomocí DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием базытивотаннуситивоаннузытиованнуситиованнузы чатых моллюсков NCBI (значение < 1e-3 a 90% гомологии), а маскирование последовательновательновательнователельнователельнователен 90% было выполнено с использованием DUST [26]. Sdružená čtení byla anotována pomocí BLASTN pomocí databáze taxonomie mlžů NCBI (hodnota e < 1e-3 a 90% homologie) a maskování sekvencí s nízkou složitostí bylo provedeno pomocí DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90 % 同源性）用BLASTN 注释合并的合乶 的读6 俽 的读 6.低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90 % 同源） 用 用 用 注释 合并 读敹] 翽 訡26] 翼 dust复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掽蔽 掩詩 掩蔽 掩莔 掩掩莔 蔽掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованьзованиейданчзеномим таксономи вустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 a 90 % гомологии), маскирование последоние последоние последоние ости было выполнено с использованием DUST [26]. Sdružená čtení byla anotována pomocí BLASTN pomocí taxonomické databáze mlžů NCBI (hodnota e <1e-3 a 90% homologie) a maskování sekvencí s nízkou složitostí bylo provedeno pomocí DUST [26].Čtení byla rozdělena do dvou skupin: související se sekvencemi mlžů (zde nazývané self-reads) a nesouvisející (non-self-reads).Dvě skupiny byly odděleně sestaveny pomocí MEGAHIT za účelem vytvoření kontigů [27].Mezitím byla taxonomická distribuce čtení mimozemského mikrobiomu klasifikována pomocí Kraken2 [28] a graficky reprezentována koláčovým grafem Krona na Galaxii [29, 30].Optimální kmers byl určen jako kmers-59 z našich předběžných experimentů. Vlastní kontigy byly poté identifikovány srovnáním s BLASTN (databáze NCBI pro mlži, e hodnota < 1e-10 a 60% homologie) pro konečnou anotaci. Vlastní kontigy byly poté identifikovány srovnáním s BLASTN (databáze NCBI pro mlži, e hodnota < 1e-10 a 60% homologie) pro konečnou anotaci. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN ллюсков NCBI, значение e <1e-10 a гомология 60%) pro окончательной аннотации. Vlastní kontigy byly poté identifikovány porovnáním s BLASTN (databáze mlžů NCBI, e hodnota < 1e-10 a 60% homologie) pro konečnou anotaci.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）对黍黐据库别进行以仐来行切过臛行切过行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотацвсльной аннотацвсLAST пиопутевии аза данных NCBI для двустворчатых моллюсков, значение e <1e-10 a гомология 60%). Vlastní kontigy byly poté identifikovány pro konečnou anotaci porovnáním s BLASTN (databáze mlžů NCBI, hodnota e < 1e-10 a 60% homologie). Paralelně byly kontigy jiné než vlastní skupiny anotovány pomocí BLASTN (databáze nt NCBI, hodnota e < 1e−10 a 60% homologie). Paralelně byly kontigy jiné než vlastní skupiny anotovány pomocí BLASTN (databáze nt NCBI, hodnota e < 1e−10 a 60% homologie). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (базенач не не не 1e-10 a гомология 60 %). Paralelně byly kontigy cizí skupiny anotovány pomocí BLASTN (databáze NT NCBI, e hodnota <1e-10 a 60% homologie).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重参组重叠组重叠组重叠组重参平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重参组重叠组重叠组重叠组重参 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с поманы с помой nt NCBI, значение e <1e-10 a гомология 60 %). Paralelně byly kontigy jiné než vlastní skupiny anotovány pomocí BLASTN (databáze nt NCBI, e hodnota <1e-10 a 60% homologie). BLASTX byl také proveden na nonself kontigech pomocí nr a RefSeq proteinových NCBI databází (e hodnota < 1e-10 a 60% homologie). BLASTX byl také proveden na nonself kontigech pomocí nr a RefSeq proteinových NCBI databází (e hodnota < 1e-10 a 60% homologie). BLASTX takkже был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз даненных BIзлкованием баз даненных чение e <1e-10 a гомология 60%). BLASTX byl také proveden na non-self kontigech pomocí nr a RefSeq NCBI proteinových databází (hodnota e < le-10 a 60% homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和怼 和怼 吂怼 怼还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和怼 和怼 吂怼 怼 BLASTX tak выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз даннеких nбаненыкинзSen е e <1e-10 a гомология 60 %). BLASTX byl také proveden na non-self kontigech s použitím nr a RefSeq NCBI proteinových databází (e hodnota < 1e-10 a 60% homologie).Soubory BLASTN a BLASTX ne-vlastních kontigů představují konečné kontigy (viz doplňkový soubor).
Primery použité pro PCR jsou uvedeny v tabulce S1.Taq DNA polymeráza (Bio Basic Canada, Markham, ON) byla použita k amplifikaci cílových genů ccfDNA.Byly použity následující reakční podmínky: denaturace při 95 °C po dobu 3 minut, 95 °C po dobu 1 minuty, nastavená teplota žíhání po dobu 1 minuty, prodloužení při 72 °C po dobu 1 minuty, 35 cyklů a nakonec 72 °C během 10 minut..Produkty PCR byly separovány elektroforézou v agarózových gelech (1,5 %) obsahujících SYBRTM Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) při 95 V.
Slávky (Mytilus spp.) byly aklimatizovány v 500 ml okysličené mořské vody (32 PSU) po dobu 24 hodin při 4 °C.Plazmidová DNA obsahující insert kódující sekvenci cDNA lidského galektinu-7 (přístupové číslo NCBI L07769) byla přidána do lahvičky v konečné koncentraci 190 ug/ul.Slávky inkubované za stejných podmínek bez přidání DNA byly kontrolní.Třetí kontrolní nádrž obsahovala DNA bez mušlí.Pro sledování kvality DNA v mořské vodě byly z každé nádrže v uvedeném čase odebrány vzorky mořské vody (20 μl; tři opakování).Pro sledovatelnost plazmidové DNA byly LB mušle sklizeny v uvedených časech a analyzovány pomocí qPCR a ddPCR.Kvůli vysokému obsahu soli v mořské vodě byly alikvoty před všemi PCR testy zředěny ve vodě kvality PCR (1:10).
Digitální kapičková PCR (ddPCR) byla provedena pomocí protokolu BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada).K určení optimální teploty použijte teplotní profil (tabulka S1).Kapky byly generovány pomocí generátoru kapek QX200 (BioRad).ddPCR byla provedena následovně: 95 °C po dobu 5 minut, 50 cyklů 95 °C po dobu 30 s a daná teplota žíhání po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 30 s, 4 °C po dobu 5 minut a 90 °C během 5 minut.Počet kapek a pozitivních reakcí (počet kopií/ul) byly měřeny pomocí čtečky kapek QX200 (BioRad).Vzorky s méně než 10 000 kapkami byly odmítnuty.Kontrola vzoru nebyla provedena pokaždé, když byla spuštěna ddPCR.
qPCR byla provedena pomocí Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austrálie) a LGALS7 specifických primerů.Všechny kvantitativní PCR byly provedeny ve 20 ul pomocí sady QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN).qPCR byla zahájena 15minutovou inkubací při 95 °C, po které následovalo 40 cyklů při 95 °C po dobu 10 sekund a při 60 °C po dobu 60 sekund s jedním sběrem dat.Křivky tání byly vytvořeny pomocí postupných měření při 95 °C po dobu 5 s, 65 °C po dobu 60 s a 97 °C na konci qPCR.Každá qPCR byla provedena trojmo, s výjimkou kontrolních vzorků.
Protože jsou mušle známé svou vysokou filtrační rychlostí, nejprve jsme zkoumali, zda dokážou filtrovat a zadržovat fragmenty DNA přítomné v mořské vodě.Zajímalo nás také, zda se tyto fragmenty hromadí v jejich polootevřeném lymfatickém systému.Tento problém jsme vyřešili experimentálně sledováním osudu rozpustných fragmentů DNA přidaných do nádrží mušlí.Pro usnadnění sledování fragmentů DNA jsme použili cizí (ne vlastní) plazmidovou DNA obsahující lidský gen pro galektin-7.ddPCR sleduje fragmenty plazmidové DNA v mořské vodě a mušlích.Naše výsledky ukazují, že pokud množství fragmentů DNA v mořské vodě zůstalo relativně konstantní v průběhu času (až 7 dní) v nepřítomnosti slávek, pak v přítomnosti slávek tato hladina téměř úplně zmizela během 8 hodin (obr. 1a,b).Fragmenty exogenní DNA byly snadno detekovány během 15 minut v intravalvulární tekutině a hemolymfě (obr. 1c).Tyto fragmenty mohly být stále detekovány až 4 hodiny po expozici.Tato filtrační aktivita s ohledem na fragmenty DNA je srovnatelná s filtrační aktivitou bakterií a řas [31].Tyto výsledky naznačují, že mušle mohou filtrovat a akumulovat cizí DNA ve svých tekutinových kompartmentech.
Relativní koncentrace plazmidové DNA v mořské vodě v přítomnosti (A) nebo nepřítomnosti (B) slávek, měřeno pomocí ddPCR.V A jsou výsledky vyjádřeny v procentech, přičemž okraje rámečků představují 75. a 25. percentil.Proložená logaritmická křivka je zobrazena červeně a oblast stínovaná šedě představuje 95% interval spolehlivosti.V B červená čára představuje průměr a modrá čára představuje 95% interval spolehlivosti pro koncentraci.C Akumulace plazmidové DNA v hemolymfě a chlopenní tekutině slávek v různých časech po přidání plazmidové DNA.Výsledky jsou prezentovány jako absolutní detekované kopie/ml (±SE).
Dále jsme zkoumali původ ccfDNA v mušlích odebraných z mušlí na Kerguelenských ostrovech, vzdálené skupině ostrovů s omezeným antropogenním vlivem.Za tímto účelem byla izolována a purifikována cccDNA z hemolymf mušlí metodami běžně používanými k purifikaci lidské cccDNA [32, 33].Zjistili jsme, že průměrné koncentrace ccfDNA hemolymfy v mušlích jsou v rozmezí nízkých mikrogramů na ml hemolymfy (viz tabulka S2, Doplňkové informace).Tento rozsah koncentrací je mnohem větší než u zdravých lidí (nízké nanogramy na mililitr), ale ve vzácných případech u pacientů s rakovinou může hladina ccfDNA dosáhnout několika mikrogramů na mililitr [34, 35].Analýza distribuce velikosti hemolymfy ccfDNA ukázala, že tyto fragmenty se velmi liší ve velikosti, v rozmezí od 1000 bp do 1000 bp.až 5000 bp (obr. 2).Podobné výsledky byly získány s použitím soupravy QIAamp Investigator Kit na bázi oxidu křemičitého, což je metoda běžně používaná ve forenzní vědě k rychlé izolaci a purifikaci genomové DNA ze vzorků DNA o nízké koncentraci, včetně ccfDNA [36].
Reprezentativní elektroforegram ccfDNA hemolymfy mušlí.Extrahováno pomocí sady NucleoSnap Plasma Kit (nahoře) a sady QIAamp DNA Investigator Kit.B Houslový graf znázorňující distribuci koncentrací ccfDNA hemolymfy (±SE) v mušlích.Černá a červená čára představují medián a první a třetí kvartil.
Přibližně 1 % ccfDNA u lidí a primátů má cizí zdroj [21, 37].Vzhledem k polootevřenému oběhovému systému mlžů, mořské vodě bohaté na mikroby a distribuci velikosti ccfDNA mušlí jsme předpokládali, že hemolymfa mušlí ccfDNA může obsahovat bohatou a rozmanitou zásobu mikrobiální DNA.Abychom tuto hypotézu otestovali, sekvenovali jsme ccfDNA hemolymfy ze vzorků Aulacomya atra odebraných z Kerguelenských ostrovů, což přineslo více než 10 milionů čtení, z nichž 97,6 % prošlo kontrolou kvality.Hodnoty byly poté klasifikovány podle vlastních a jiných zdrojů pomocí databáze mlžů BLASTN a NCBI (obr. S1, doplňkové informace).
U lidí se může do krevního oběhu uvolnit jak jaderná, tak mitochondriální DNA [38].V této studii však nebylo možné podrobně popsat jadernou genomovou DNA slávek, protože genom A. atra nebyl sekvenován ani popsán.Pomocí knihovny mlžů jsme však byli schopni identifikovat řadu fragmentů ccfDNA našeho vlastního původu (obr. S2, doplňkové informace).Přítomnost fragmentů DNA našeho vlastního původu jsme také potvrdili přímou PCR amplifikací těch genů A. atra, které byly sekvenovány (obr. 3).Podobně, vzhledem k tomu, že mitochondriální genom A. atra je dostupný ve veřejných databázích, lze nalézt důkazy o přítomnosti mitochondriálních fragmentů ccfDNA v hemolymfě A. atra.Přítomnost fragmentů mitochondriální DNA byla potvrzena PCR amplifikací (obr. 3).
Různé mitochondriální geny byly přítomny v hemolymfě A. atra (červené tečky – skladové číslo: SRX5705969) a M. platensis (modré tečky – skladové číslo: SRX5705968) amplifikované pomocí PCR.Obrázek upraven podle Breton et al., 2011 B Amplifikace supernatantu hemolymfy z A. atra Uloženo na papíru FTA.Použijte 3 mm děrovač pro přidání přímo do zkumavky PCR obsahující směs PCR.
Vzhledem k bohatému mikrobiálnímu obsahu v mořské vodě jsme se zpočátku zaměřili na charakterizaci sekvencí mikrobiální DNA v hemolymfě.K tomu používáme dvě různé strategie.První strategie používala Kraken2, program pro klasifikaci sekvencí založený na algoritmu, který dokáže identifikovat mikrobiální sekvence s přesností srovnatelnou s BLASTem a dalšími nástroji [28].Více než 6719 čtení bylo určeno jako bakteriálního původu, zatímco 124 a 64 bylo z archaea a virů (obr. 4).Nejhojnější bakteriální DNA fragmenty byly Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) a Bacteroidetes (17 %) (obr. 4a).Tato distribuce je v souladu s předchozími studiemi mikrobiomu slávky mořské [39, 40].Gammaproteobakterie byly hlavní třídou Proteobakterií (44 %), včetně mnoha Vibrionales (obr. 4b).Metoda ddPCR potvrdila přítomnost fragmentů Vibrio DNA v ccfDNA A. atra hemolymph (obr. 4c) [41].Pro získání více informací o bakteriálním původu ccfDNA byl přijat další přístup (obr. S2, doplňkové informace). V tomto případě byly hodnoty, které se překrývaly, sestaveny jako čtení s párovým koncem a byly klasifikovány jako vlastního (mlži) nebo jiného původu pomocí BLASTN a hodnoty e 1e-3 a mezní hodnoty s >90% homologií. V tomto případě byly hodnoty, které se překrývaly, sestaveny jako čtení s párovým koncem a byly klasifikovány jako vlastního (mlži) nebo jiného původu pomocí BLASTN a hodnoty e 1e-3 a mezní hodnoty s >90% homologií. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными консировимания ы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхождению с испольиезо1ния e-3 a отсечения с гомологией> 90 %. V tomto případě byla překrývající se čtení shromážděna jako čtení s párovým koncem a byla klasifikována jako nativní (mlž) nebo nepůvodní pomocí BLASTN a hodnoty e le-3 a cutoff s >90% homologií.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的暄e 歰组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的暄e 歰组儚末值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 彀用 用 彿用 用叠和> 90 % 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтеникае с парными кониргамамия собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с исполюензонию с исполюензония 1e-3 a порога гомологии> 90 %. V tomto případě byla překrývající se čtení shromážděna jako čtení s párovým koncem a klasifikována jako vlastní (mlži) nebo nepůvodní pomocí hodnot e BLASTN a 1e-3 a prahu homologie > 90 %.Protože genom A. atra ještě nebyl sekvenován, použili jsme de novo sestavení strategii assembleru MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS).Celkem 147 188 kontigů bylo identifikováno jako závislých (mlži) původu.Tyto kontigy byly poté rozloženy s e-hodnotami 1e-10 pomocí BLASTN a BLASTX.Tato strategie nám umožnila identifikovat 482 nemlžových fragmentů přítomných v ccfDNA A. atra.Více než polovina (57 %) těchto fragmentů DNA byla získána z bakterií, především z žaberních symbiontů, včetně sulfotrofních symbiontů, a ze žaberních symbiontů Solemya velum (obr. 5).
Relativní hojnost na úrovni typu.B Mikrobiální diverzita dvou hlavních kmenů (Firmicutes a Proteobacteria).Reprezentativní amplifikace ddPCR C Vibrio spp.A. Fragmenty genu 16S rRNA (modré) ve třech atra hemolymfách.
Bylo analyzováno celkem 482 shromážděných kontigů.Obecný profil taxonomického rozdělení metagenomických kontigových anotací (prokaryota a eukaryota).B Podrobná distribuce fragmentů bakteriální DNA identifikovaných pomocí BLASTN a BLASTX.
Analýza Kraken2 také ukázala, že ccfDNA mušlí obsahovala fragmenty archaální DNA, včetně fragmentů DNA Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) a Thaurmarcheota (11 %) (obr. 6a).Přítomnost fragmentů DNA pocházejících z Euryarchaeota a Crenarchaeota, dříve nalezených v mikrobiálním společenství kalifornských mušlí, by neměla být překvapením [42].Přestože je Euryarchaeota často spojována s extrémními podmínkami, nyní se uznává, že Euryarchaeota i Crenarcheota patří mezi nejběžnější prokaryota v mořském kryogenním prostředí [43, 44].Přítomnost metanogenních mikroorganismů v mušlích není překvapivá, vzhledem k nedávným zprávám o rozsáhlých únikech metanu ze dna na Kerguelen Plateau [45] a možné mikrobiální produkci metanu pozorované u pobřeží Kerguelenských ostrovů [46].
Naše pozornost se pak přesunula na čtení z DNA virů.Podle našich nejlepších znalostí se jedná o první mimocílovou studii obsahu virů v slávkách.Podle očekávání jsme našli fragmenty DNA bakteriofágů (Caudovirales) (obr. 6b).Nejběžnější virová DNA však pochází z kmene nukleocytovirů, známých také jako jaderný cytoplazmatický velký DNA virus (NCLDV), který má největší genom ze všech virů.V rámci tohoto kmene patří většina sekvencí DNA do čeledí Mimimidoviridae (58 %) a Poxviridae (21 %), jejichž přirozenými hostiteli jsou obratlovci a členovci, zatímco malá část těchto sekvencí DNA patří známým virologickým řasám.Infikuje mořské eukaryotické řasy.Sekvence byly také získány z viru Pandora, obřího viru s největší velikostí genomu ze všech známých virových rodů.Je zajímavé, že rozsah hostitelů, o nichž je známo, že jsou infikováni virem, jak bylo určeno sekvenováním hemolymfy ccfDNA, byl relativně velký (obrázek S3, doplňkové informace).Zahrnuje viry, které infikují hmyz, jako jsou Baculoviridae a Iridoviridae, a také viry, které infikují améby, řasy a obratlovce.Našli jsme také sekvence odpovídající genomu Pithovirus sibericum.Pitoviry (také známé jako „zombie viry“) byly poprvé izolovány z 30 000 let starého permafrostu na Sibiři [47].Naše výsledky jsou tedy v souladu s předchozími zprávami, které ukazují, že ne všechny moderní druhy těchto virů jsou vyhynulé [48] a že tyto viry mohou být přítomny ve vzdálených subarktických mořských ekosystémech.
Nakonec jsme vyzkoušeli, zda najdeme fragmenty DNA z jiných mnohobuněčných zvířat.Celkem 482 cizích kontigů bylo identifikováno pomocí BLASTN a BLASTX s knihovnami nt, nr a RefSeq (genomové a proteinové).Naše výsledky ukazují, že mezi cizími fragmenty ccfDNA mnohobuněčných zvířat převažuje DNA kostěných kostí (obr. 5).Byly také nalezeny fragmenty DNA z hmyzu a dalších druhů.Poměrně velká část fragmentů DNA nebyla identifikována, možná kvůli nedostatečnému zastoupení velkého počtu mořských druhů v genomických databázích ve srovnání s druhy suchozemskými [49].
V tomto článku aplikujeme koncept LB na mušle a tvrdíme, že sekvenování záběrů hemolymfy ccfDNA může poskytnout vhled do složení mořských pobřežních ekosystémů.Konkrétně jsme zjistili, že 1) hemolymfa mušlí obsahuje relativně vysoké koncentrace (úrovně mikrogramů) relativně velkých (~1-5 kb) cirkulujících fragmentů DNA;2) tyto fragmenty DNA jsou nezávislé i nesamostatné 3) Mezi cizími zdroji těchto fragmentů DNA jsme našli bakteriální, archaální a virovou DNA a také DNA jiných mnohobuněčných živočichů;4) Akumulace těchto cizích fragmentů ccfDNA v hemolymfě probíhá rychle a přispívá k vnitřní filtrační aktivitě slávek.Závěrem naše studie prokazuje, že koncept LB, který byl dosud uplatňován především v oblasti biomedicíny, v sobě kóduje bohatý, ale neprobádaný zdroj znalostí, který lze využít k lepšímu pochopení interakce mezi sentinelovými druhy a jejich prostředím.
Kromě primátů byla izolace ccfDNA popsána u savců, včetně myší, psů, koček a koní [50, 51, 52].Nicméně, pokud je nám známo, naše studie je první, která uvádí detekci a sekvenování ccfDNA u mořských druhů s otevřeným oběhovým systémem.Tento anatomický rys a filtrační schopnost slávek může, alespoň částečně, vysvětlit rozdílné velikostní charakteristiky cirkulujících fragmentů DNA ve srovnání s jinými druhy.U lidí je většina fragmentů DNA cirkulujících v krvi malé fragmenty o velikosti od 150 do 200 bp.s maximálním vrcholem 167 bp [34, 53].Malá, ale významná část fragmentů DNA má velikost mezi 300 a 500 bp a asi 5 % je delších než 900 bp.[54].Důvodem této distribuce velikosti je to, že hlavní zdroj ccfDNA v plazmě nastává v důsledku buněčné smrti, buď v důsledku buněčné smrti, nebo v důsledku nekrózy cirkulujících hematopoetických buněk u zdravých jedinců nebo v důsledku apoptózy nádorových buněk u pacientů s rakovinou (známá jako cirkulující nádorová DNA).ctDNA).Distribuce velikosti ccfDNA hemolymfy, kterou jsme našli u mušlí, se pohybovala od 1000 do 5000 bp, což naznačuje, že ccfDNA mušlí má jiný původ.To je logická hypotéza, protože slávky mají polootevřený cévní systém a žijí v mořských vodních prostředích obsahujících vysoké koncentrace mikrobiální genomové DNA.Naše laboratorní experimenty využívající exogenní DNA ve skutečnosti ukázaly, že mušle akumulují fragmenty DNA v mořské vodě, alespoň po několika hodinách jsou degradovány po buněčném příjmu a/nebo uvolněny a/nebo uloženy v různých organizacích.Vzhledem k vzácnosti buněk (prokaryotických i eukaryotických) použití intravalvulárních kompartmentů sníží množství ccfDNA z vlastních zdrojů i z cizích zdrojů.Vzhledem k důležitosti vrozené imunity mlžů a velkému počtu cirkulujících fagocytů jsme dále předpokládali, že i cizí ccfDNA je obohacena o cirkulující fagocyty, které akumulují cizorodou DNA po požití mikroorganismů a/nebo buněčných zbytků.Celkově naše výsledky ukazují, že ccfDNA hemolymfy mlžů je jedinečným úložištěm molekulárních informací a posiluje jejich status jako sentinelové druhy.
Naše data naznačují, že sekvenování a analýza fragmentů ccfDNA hemolymfy pocházejících z bakterií může poskytnout klíčové informace o hostitelské bakteriální flóře a bakteriích přítomných v okolním mořském ekosystému.Techniky sekvenování výstřelem odhalily sekvence komenzálních bakterií A. atra gill, které by byly přehlédnuty, pokud by byly použity konvenční metody identifikace 16S rRNA, částečně kvůli zkreslení referenční knihovny.Ve skutečnosti naše použití dat LB shromážděných z M. platensis ve stejné vrstvě mušlí v Kerguelen ukázalo, že složení bakteriálních symbiontů spojených s žábrami bylo stejné pro oba druhy mušlí (obr. S4, doplňkové informace).Tato podobnost dvou geneticky odlišných mlžů může odrážet složení bakteriálních společenství v chladných, sirných a vulkanických ložiskách Kerguelen [55, 56, 57, 58].Vyšší hladiny mikroorganismů redukujících síru byly dobře popsány při sběru slávek z bioturbovaných pobřežních oblastí [59], jako je pobřeží Port-au-France.Další možností je, že flóra mušlí může být ovlivněna horizontálním přenosem [60, 61].K určení korelace mezi mořským prostředím, povrchem mořského dna a složením symbiotických bakterií v mušlích je zapotřebí více výzkumu.Tyto studie v současné době probíhají.
Délka a koncentrace ccfDNA hemolymfy, její snadné čištění a vysoká kvalita umožňující rychlé sekvenování pomocí brokovnice jsou některé z mnoha výhod použití ccfDNA mušlí k posouzení biologické rozmanitosti v mořských pobřežních ekosystémech.Tento přístup je zvláště účinný pro charakterizaci virových společenstev (viromů) v daném ekosystému [62, 63].Na rozdíl od bakterií, archeí a eukaryot neobsahují virové genomy fylogeneticky konzervované geny, jako jsou sekvence 16S.Naše výsledky naznačují, že tekuté biopsie z indikátorových druhů, jako jsou mušle, lze použít k identifikaci relativně velkého počtu fragmentů viru ccfDNA, o kterých je známo, že infikují hostitele, kteří typicky obývají pobřežní mořské ekosystémy.To zahrnuje viry, o kterých je známo, že infikují prvoky, členovce, hmyz, rostliny a bakteriální viry (např. bakteriofágy).Podobná distribuce byla nalezena, když jsme zkoumali virom ccfDNA hemolymfy modrých mušlí (M. platensis) shromážděných ve stejné vrstvě mušlí v Kerguelen (tabulka S2, doplňkové informace).Shotgun sekvenování ccfDNA je skutečně novým přístupem, který získává na síle ve studiu viromu lidí nebo jiných druhů [21, 37, 64].Tento přístup je zvláště užitečný pro studium virů s dvouvláknovou DNA, protože mezi všemi viry s dvouvláknovou DNA, které představují nejrozmanitější a nejširší třídu virů v Baltimoru, není zachován jediný gen [65].Ačkoli většina těchto virů zůstává neklasifikována a mohou zahrnovat viry ze zcela neznámé části virového světa [66], zjistili jsme, že viromy a hostitelské oblasti slávek A. atra a M. platensis spadají mezi tyto dva druhy.podobně (viz obrázek S3, další informace).Tato podobnost není překvapující, protože může odrážet nedostatek selektivity při příjmu DNA přítomné v prostředí.K charakterizaci viromu RNA jsou v současnosti zapotřebí budoucí studie využívající purifikovanou RNA.
V naší studii jsme použili velmi přísnou pipeline upravenou z práce Kowarskiho a kolegů [37], kteří použili dvoukrokovou deleci sdružených čtení a kontigů před a po sestavení nativní ccfDNA, což vedlo k vysokému podílu nezmapovaných čtení.Proto nemůžeme vyloučit, že některé z těchto nezmapovaných čtení mohou mít stále svůj vlastní původ, především proto, že nemáme referenční genom pro tento druh mušlí.Tento kanál jsme také použili, protože jsme se obávali chimér mezi vlastním a nevlastním čtením a čtecími délkami generovanými Illumina MiSeq PE75.Dalším důvodem pro většinu nezmapovaných údajů je to, že velká část mořských mikrobů, zejména v odlehlých oblastech, jako je Kerguelen, nebyla popsána.Použili jsme Illumina MiSeq PE75 za předpokladu, že délky fragmentů ccfDNA jsou podobné délce lidské ccfDNA.Pro budoucí studie, vzhledem k našim výsledkům, které ukazují, že ccfDNA hemolymfy má delší čtení než lidé a/nebo savci, doporučujeme použít sekvenační platformu vhodnější pro delší fragmenty ccfDNA.Tato praxe výrazně usnadní identifikaci více indikací pro hlubší analýzu.Získání v současnosti nedostupné kompletní sekvence jaderného genomu A. atra by také velmi usnadnilo rozlišení ccfDNA z vlastních a jiných zdrojů.Vzhledem k tomu, že se náš výzkum zaměřil na možnost aplikace konceptu tekuté biopsie na slávky, doufáme, že s využitím tohoto konceptu v budoucím výzkumu budou vyvinuty nové nástroje a potrubí pro zvýšení potenciálu této metody pro studium mikrobiální diverzity slávek.mořský ekosystém.
Jako neinvazivní klinický biomarker jsou zvýšené hladiny ccfDNA v lidské plazmě spojeny s různými onemocněními, poškozením tkání a stresovými stavy [67,68,69].Toto zvýšení je spojeno s uvolněním fragmentů DNA vlastního původu po poškození tkáně.Tuto problematiku jsme řešili pomocí akutního tepelného stresu, kdy byly mušle krátce vystaveny teplotě 30 °C.Tuto analýzu jsme provedli na třech různých typech mušlí ve třech nezávislých experimentech.Nezjistili jsme však žádnou změnu hladin ccfDNA po akutním tepelném stresu (viz obrázek S5, další informace).Tento objev může alespoň částečně vysvětlit skutečnost, že slávky mají polootevřený oběhový systém a díky své vysoké filtrační aktivitě akumulují velké množství cizí DNA.Na druhou stranu, mušle, stejně jako mnoho bezobratlých, mohou být odolnější vůči poškození tkání vyvolaným stresem, čímž omezují uvolňování ccfDNA v jejich hemolymfě [70, 71].
Dosud se analýza DNA biologické rozmanitosti ve vodních ekosystémech soustředila především na metabarkódování environmentální DNA (eDNA).Tato metoda je však obvykle omezena v analýze biologické rozmanitosti, když se používají primery.Použití brokovnicového sekvenování obchází omezení PCR a zkreslený výběr sad primerů.Naše metoda je tedy v jistém smyslu blíže nedávno používané vysokokapacitní metodě sekvenování eDNA Shotgun, která je schopna přímo sekvenovat fragmentovanou DNA a analyzovat téměř všechny organismy [72, 73].Existuje však řada zásadních problémů, které odlišují LB od standardních metod eDNA.Hlavním rozdílem mezi eDNA a LB je samozřejmě použití přirozených hostitelů filtrů.Bylo popsáno použití mořských druhů, jako jsou houby a mlži (Dresseina spp.) jako přirozeného filtru pro studium eDNA [74, 75].Dreissenaova studie však používala tkáňové biopsie, z nichž byla extrahována DNA.Analýza ccfDNA z LB nevyžaduje tkáňovou biopsii, specializované a někdy drahé vybavení a logistiku spojenou s eDNA nebo tkáňovou biopsií.Ve skutečnosti jsme nedávno uvedli, že ccfDNA z LB lze ukládat a analyzovat s podporou FTA bez udržování chladicího řetězce, což je hlavní výzva pro výzkum ve vzdálených oblastech [76].Extrakce ccfDNA z tekutých biopsií je také jednoduchá a poskytuje vysoce kvalitní DNA pro sekvenování brokovnicí a analýzu PCR.To je velká výhoda vzhledem k některým technickým omezením spojeným s analýzou eDNA [77].Jednoduchost a nízká cena metody odběru vzorků je také zvláště vhodná pro dlouhodobé monitorovací programy.Kromě vysoké filtrační schopnosti je další známou vlastností mlžů chemické mukopolysacharidové složení jejich hlenu, které podporuje vstřebávání virů [78, 79].Díky tomu jsou mlži ideálním přirozeným filtrem pro charakterizaci biologické rozmanitosti a dopadu změny klimatu v daném vodním ekosystému.Ačkoli přítomnost fragmentů DNA pocházejících z hostitele může být považována za omezení metody ve srovnání s eDNA, náklady spojené s takovou nativní ccfDNA ve srovnání s eDNA jsou současně pochopitelné pro obrovské množství informací dostupných pro zdravotní studie.ofsetový hostitel.To zahrnuje přítomnost virových sekvencí integrovaných do genomu hostitelského hostitele.To je důležité zejména pro mlže, vzhledem k přítomnosti horizontálně přenášených leukemických retrovirů u mlžů [80, 81].Další výhodou LB oproti eDNA je, že využívá fagocytární aktivitu cirkulujících krvinek v hemolymfě, která pohlcuje mikroorganismy (a jejich genomy).Fagocytóza je hlavní funkcí krvinek u mlžů [82].Nakonec metoda využívá vysoké filtrační kapacity slávek (průměrně 1,5 l/h mořské vody) a dvoudenní cirkulace, které zvyšují promíchávání různých vrstev mořské vody, což umožňuje zachycení heterologní eDNA.[83, 84].Analýza ccfDNA mušlí je tedy zajímavou cestou vzhledem k nutričním, ekonomickým a environmentálním dopadům mušlí.Podobně jako analýza LB odebraných od lidí, tato metoda také otevírá možnost měření genetických a epigenetických změn v hostitelské DNA v reakci na exogenní látky.Například lze uvažovat o technologiích sekvenování třetí generace pro provádění methylační analýzy v celém genomu v nativní ccfDNA pomocí sekvenování nanoporů.Tento proces by měl být usnadněn skutečností, že délka fragmentů ccfDNA mušlí je ideálně kompatibilní se sekvenačními platformami s dlouhým čtením, které umožňují analýzu methylace DNA v celém genomu z jediného sekvenačního běhu bez nutnosti chemických transformací.85,86] To je zajímavá možnost, protože se ukázalo, že vzorce metylace DNA odrážejí reakci na stres prostředí a přetrvávají po mnoho generací.Proto může poskytnout cenný pohled na základní mechanismy, kterými se řídí reakce po vystavení změně klimatu nebo znečišťujícím látkám [87].Použití LB však není bez omezení.Netřeba dodávat, že to vyžaduje přítomnost indikačních druhů v ekosystému.Jak již bylo zmíněno výše, použití LB k posouzení biodiverzity daného ekosystému vyžaduje také přísné bioinformatické potrubí, které bere v úvahu přítomnost fragmentů DNA ze zdroje.Dalším velkým problémem je dostupnost referenčních genomů pro mořské druhy.Doufáme, že iniciativy jako Marine Mammal Genomes Project a nedávno založený projekt Fish10k [88] takovou analýzu v budoucnu usnadní.Aplikace konceptu LB na mořské organismy krmící filtry je také kompatibilní s nejnovějšími pokroky v technologii sekvenování, díky čemuž se dobře hodí pro vývoj multi-ohmových biomarkerů, které poskytují důležité informace o zdraví mořských biotopů v reakci na environmentální stres.
Data o sekvenování genomu byla uložena v NCBI Sequence Read Archive https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 pod Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Dopad změny klimatu na mořský život a ekosystémy.Coleova biologie.2009;19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Almpanidou V, Bevilacqua S, et al.Zvažte kombinované dopady změny klimatu a dalších místních stresorů na mořské prostředí.obecné vědecké prostředí.2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P a kol.).Věda prvního března.2020; 7:48.
Seront L, Nicastro ČR, Zardi GI, Goberville E. Snížená tolerance tepla za podmínek opakovaného tepelného stresu vysvětluje vysokou letní úmrtnost slávek modrých.Vědecká zpráva 2019;9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER a kol.Nedávné změny ve frekvenci, příčinách a rozsahu úmrtí zvířat.Proč Natl Acad Sci USA.2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al.Hromadnou mortalitu Pinna nobilis mohlo způsobit více druhově nespecifických patogenů.Život.2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM.Potenciální dopad změny klimatu na arktické zoonotické choroby.Int J Cirkumpolární zdraví.2005;64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. a kol.Slávky modré (Mytilus edulis spp.) jako signální organismy při monitorování znečištění pobřeží: přehled.Mar Environ Res 2017;130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrace tekuté biopsie v léčbě rakoviny.Nat Rev Clean Oncol.2017;14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C a kol.Zrání tekuté biopsie: Umožňuje cirkulaci nádorové DNA.Nat Rev Cancer.2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleové kyseliny v lidské plazmě.Zápis z jednání dceřiných společností Soc Biol.1948;142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nová role pro bezbuněčnou DNA jako molekulárního markeru pro léčbu rakoviny.Kvantifikace biomolární analýzy.2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Tekutá biopsie vstupuje na kliniku – problémy s implementací a budoucí výzvy.Nat Rev Clin Oncol.2021;18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW a další.Fetální DNA je přítomna v mateřské plazmě a séru.Lanceta.1997;350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studium průběhu těhotenství a jeho komplikací pomocí cirkulující extracelulární RNA v krvi žen během těhotenství.Dopediatrie.2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J a kol.Tekutá biopsie: dárcovská bezbuněčná DNA se používá k detekci alogenních lézí v ledvinovém štěpu.Nat Rev Nephrol.2021;17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovace v prenatální diagnostice: sekvenování genomu mateřské plazmy.Anna MUDr.2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D a kol.Rychlá detekce patogenu s metagenomickým sekvenováním nové generace infikovaných tělesných tekutin.Nat Medicine.2021;27:115-24.