Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Mezitím budeme web vykreslovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Tekutá biopsie (LB) je koncept, který si v biomedicíně rychle získává na popularitě. Koncept je založen především na detekci fragmentů cirkulující extracelulární DNA (ccfDNA), které se po buněčné smrti v různých tkáních uvolňují převážně jako malé fragmenty. Malá část těchto fragmentů pochází z cizích (cizích) tkání nebo organismů. V současné práci jsme tento koncept aplikovali na slávky, sentinelové druhy známé svou vysokou filtrační kapacitou mořské vody. Využíváme schopnost slávek působit jako přirozené filtry k zachycení fragmentů DNA z různých zdrojů, abychom poskytli informace o biodiverzitě mořských pobřežních ekosystémů. Naše výsledky ukazují, že hemolymfa slávek obsahuje fragmenty DNA, které se velmi liší velikostí, od 1 do 5 kb. Sekvenování metodou brokovnice ukázalo, že velké množství fragmentů DNA je cizího mikrobiálního původu. Mezi nimi jsme našli fragmenty DNA z bakterií, archeí a virů, včetně virů, o nichž je známo, že infikují různé hostitele běžně se vyskytující v pobřežních mořských ekosystémech. Závěrem lze říci, že naše studie ukazuje, že koncept LB aplikovaný na slávky představuje bohatý, ale dosud neprozkoumaný zdroj znalostí o mikrobiální rozmanitosti v mořských pobřežních ekosystémech.
Dopad změny klimatu (CC) na biodiverzitu mořských ekosystémů je rychle se rozvíjející oblastí výzkumu. Globální oteplování nejen způsobuje významné fyziologické stresy, ale také posouvá evoluční limity tepelné stability mořských organismů, což ovlivňuje biotopy řady druhů a nutí je hledat příznivější podmínky [1, 2]. Kromě ovlivnění biodiverzity mnohobuněčných živočichů CC narušuje křehkou rovnováhu interakcí mezi hostitelem a mikrobi. Tato mikrobiální dysbakterióza představuje vážnou hrozbu pro mořské ekosystémy, protože činí mořské organismy náchylnějšími k infekčním patogenům [3, 4]. Předpokládá se, že SS hrají důležitou roli v masových úhynech, což je vážný problém pro řízení globálních mořských ekosystémů [5, 6]. To je důležitá otázka vzhledem k ekonomickým, ekologickým a nutričním dopadům mnoha mořských druhů. To platí zejména pro mlže žijící v polárních oblastech, kde jsou účinky CK bezprostřednější a závažnější [6, 7]. Ve skutečnosti se mlži, jako jsou Mytilus spp., široce používají k monitorování účinků CC na mořské ekosystémy. Není divu, že pro sledování jejich zdraví byl vyvinut relativně velký počet biomarkerů, často s využitím dvoustupňového přístupu zahrnujícího funkční biomarkery založené na enzymatické aktivitě nebo buněčných funkcích, jako je životaschopnost buněk a fagocytární aktivita [8]. Tyto metody zahrnují také měření koncentrace specifických tlakových indikátorů, které se hromadí v měkkých tkáních po absorpci velkého množství mořské vody. Vysoká filtrační kapacita a polootevřený oběhový systém mlžů však poskytují příležitost k vývoji nových biomarkerů hemolymfy s využitím konceptu tekuté biopsie (LB), což je jednoduchý a minimálně invazivní přístup k léčbě pacientů. vzorky krve [9, 10]. Ačkoli v lidské LB lze nalézt několik typů cirkulujících molekul, tento koncept je primárně založen na analýze sekvenování DNA fragmentů cirkulující extracelulární DNA (ccfDNA) v plazmě. Ve skutečnosti je přítomnost cirkulující DNA v lidské plazmě známa již od poloviny 20. století [11], ale teprve v posledních letech vedl nástup vysoce výkonných sekvenčních metod ke klinické diagnóze založené na ccfDNA. Přítomnost těchto cirkulujících fragmentů DNA je částečně způsobena pasivním uvolněním genomové DNA (jaderné a mitochondriální) po buněčné smrti. U zdravých jedinců je koncentrace ccfDNA obvykle nízká (<10 ng/ml), ale u pacientů trpících různými patologiemi nebo vystavených stresu se může 5–10krát zvýšit, což vede k poškození tkání. U zdravých jedinců je koncentrace ccfDNA obvykle nízká (<10 ng/ml), ale u pacientů trpících různými patologiemi nebo vystavených stresu se může 5–10krát zvýšit, což vede k poškození tkání. У здоровых людей концентрация вккДНК в норме низкая (<10 нг/мл), но можетшат повы у больных с различной патологией или подвергающихся стрессу, приводящеЎоверн к тканей. U zdravých lidí je koncentrace cccDNA obvykle nízká (<10 ng/ml), ale u pacientů s různými patologií nebo ve stresu, který vede k poškození tkání, se může 5–10krát zvýšit.在健康个体中，ccfDNA 的浓度通常较低（<10 ng/mL），但在患有各种病理或承受压力的患者中可增加5-10 倍，从而寻臍椼在 健康 个体 中 ， ccfdna 的 浓度 较 低 （（<10 ng/ml） 但 在 各 种 病 剿 戗 担 艎囊 戗 或 日中 可 增加 5-10 倍 ， 从而 组织。。。 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 损伤 伤 损伤 植损伤Концентрации ccfDNA обычно низкие (<10 нг/мл) у здоровых людей, но могут бытиь уне пациентов с различными патологиями nebo стрессом, что приводит к поврежденией тканию Koncentrace ccfDNA jsou u zdravých jedinců obvykle nízké (<10 ng/ml), ale u pacientů s různými patologií nebo stresem se mohou 5–10krát zvýšit, což vede k poškození tkání.Velikost fragmentů ccfDNA se značně liší, ale obvykle se pohybuje od 150 do 200 bp. [12]. Analýza vlastní ccfDNA, tj. ccfDNA z normálních nebo transformovaných hostitelských buněk, může být použita k detekci genetických a epigenetických změn přítomných v jaderném a/nebo mitochondriálním genomu, což pomáhá lékařům vybrat specifické molekulárně cílené terapie [13]. CcfDNA však může být získána i z cizích zdrojů, jako je ccfDNA z fetálních buněk během těhotenství nebo z transplantovaných orgánů [14,15,16,17]. ccfDNA je také důležitým zdrojem informací pro detekci přítomnosti nukleových kyselin infekčního agens (cizího), což umožňuje neinvazivní detekci rozšířených infekcí, které nebyly identifikovány hemokulturami, a vyhýbá se tak invazivní biopsii infikované tkáně [18]. Nedávné studie skutečně ukázaly, že lidská krev obsahuje bohatý zdroj informací, které lze použít k identifikaci virových a bakteriálních patogenů, a že přibližně 1 % ccfDNA nalezené v lidské plazmě je cizího původu [19]. Tyto studie ukazují, že biodiverzitu cirkulujícího mikrobiomu organismu lze posoudit pomocí analýzy ccfDNA. Donedávna se však tento koncept používal výhradně u lidí a v menší míře u jiných obratlovců [20, 21].
V této práci využíváme LB potenciál k analýze ccfDNA Aulacomya atra, jižního druhu běžně se vyskytujícího na subantarktických Kerguelenských ostrovech, skupině ostrovů na vrcholu velké náhorní plošiny, která vznikla před 35 miliony let. sopečná erupce. Pomocí in vitro experimentálního systému jsme zjistili, že fragmenty DNA v mořské vodě jsou rychle přijímány slávkami a vstupují do hemolymfy. Sekvenování brokovnicí ukázalo, že ccfDNA hemolymfy slávek obsahuje fragmenty DNA vlastního i cizího původu, včetně symbiotických bakterií a fragmentů DNA z biomů typických pro chladné vulkanické mořské pobřežní ekosystémy. CcfDNA hemolymfy také obsahuje virové sekvence odvozené od virů s různými hostitelskými okruhy. Nalezli jsme také fragmenty DNA z mnohobuněčných živočichů, jako jsou kostnaté ryby, sasanky, řasy a hmyz. Závěrem lze říci, že naše studie ukazuje, že koncept LB lze úspěšně aplikovat na mořské bezobratlé k vytvoření bohatého genomového repertoáru v mořských ekosystémech.
Dospělí jedinci (55-70 mm dlouzí) druhu Mytilus platensis (M. platensis) a Aulacomya atra (A. atra) byli odebráni z přílivových skalnatých břehů Port-au-France (049°21.235 j. š., 070°13.490 v. d.) na ostrovech Kerguelen v prosinci 2018. Ostatní dospělí jedinci slávek modrých (Mytilus spp.) byli získáni od komerčního dodavatele (PEI Mussel King Inc., Ostrov prince Edwarda, Kanada) a umístěni do provzdušňované nádrže s řízenou teplotou (4 °C) obsahující 10–20 l umělého solného roztoku o koncentraci 32 ‰ (umělá mořská sůl Reef Crystal, Instant Ocean, Virginie, USA). Pro každý experiment byla měřena délka a hmotnost jednotlivých lastur.
Volně dostupný protokol pro tento program je k dispozici online (https://doi.org/10.17504/protocols.io.81wgb6z9olpk/v1). Stručně řečeno, LB hemolymfa byla odebrána z abduktorových svalů, jak je popsáno v [22]. Hemolymfa byla vyčištěna centrifugací při 1200×g po dobu 3 minut, supernatant byl zmrazen (-20 °C) do použití. Pro izolaci a purifikaci cfDNA byly vzorky (1,5-2,0 ml) rozmrazeny a zpracovány pomocí soupravy NucleoSnap cfDNA (Macherey-Nagel, Bethlehen, PA) podle pokynů výrobce. ccfDNA byla skladována při -80 °C do další analýzy. V některých experimentech byla ccfDNA izolována a purifikována pomocí soupravy QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN, Toronto, Ontario, Kanada). Purifikovaná DNA byla kvantifikována pomocí standardního testu PicoGreen. Distribuce fragmentů izolované ccfDNA byla analyzována kapilární elektroforézou za použití bioanalyzátoru Agilent 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) s použitím sady High Sensitivity DNA Kit. Test byl proveden s 1 µl vzorku ccfDNA dle pokynů výrobce.
Pro sekvenování fragmentů ccfDNA z hemolymfy připravila společnost Génome Québec (Montreal, Quebec, Kanada) sběrné knihovny s použitím soupravy Illumina DNA Mix ze soupravy Illumina MiSeq PE75. Byl použit standardní adaptér (BioO). Soubory s nezpracovanými daty jsou k dispozici v archivu NCBI Sequence Read Archive (SRR8924808 a SRR8924809). Základní kvalita čtení byla posouzena pomocí FastQC [23]. Pro ořezávání adaptérů a čtení nízké kvality byl použit program Trimmomatic [24]. Sběrné čtení s párovými konci bylo pomocí FLASH sloučeno do delších jednotlivých čtení s minimálním překrytím 20 bp, aby se zabránilo neshodám [25]. Sloučené čtení bylo anotováno pomocí BLASTN s využitím databáze taxonomie NCBI pro mlže (hodnota e < 1e−3 a 90% homologie) a maskování sekvencí s nízkou složitostí bylo provedeno pomocí DUST [26]. Sloučené čtení bylo anotováno pomocí BLASTN s využitím databáze taxonomie NCBI pro mlže (hodnota e < 1e−3 a 90% homologie) a maskování sekvencí s nízkou složitostí bylo provedeno pomocí DUST [26]. Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием баззы данныиданнованы двустворчатых моллюсков NCBI (значение < 1e-3 и 90% гомологии), а маскирование последовейтодова низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Souhrnné čtení bylo anotováno pomocí BLASTN s využitím databáze taxonomie mlžů NCBI (hodnota e < 1e-3 a 90% homologie) a maskování sekvencí s nízkou složitostí bylo provedeno pomocí DUST [26].使用双壳类NCBI 分类数据库（e 值< 1e-3 和90 % 同源性）用BLASTN 注释合并稔合并的读6数 的读6数的读6进行低复杂度序列的掩蔽。使用 双 壳类 ncbi 分类 （（（<1e-3 和 90 % 同源） 用 用 用 注释 合并 读敹] 用 敹进行 复杂度 序列 的。。。。 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掽蔽 掩詔 掩蔽 掩莔 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩詔 掩蔽 掩莔 詔掩蔽 掩蔽 掩蔽 掩蔽Объединенные чтения были аннотированы с помощью BLASTN с использованием таксономичаксономими данных двустворчатых моллюсков NCBI (значение e <1e-3 a 90% гомологии), а маскирование последовательностей низкой сложности было выполнено с использованием DUST [26]. Souhrnné čtení bylo anotováno pomocí BLASTN s využitím taxonomické databáze škeblí NCBI (hodnota e <1e-3 a 90% homologie) a maskování sekvencí s nízkou složitostí bylo provedeno pomocí DUST [26].Čtení byla rozdělena do dvou skupin: související se sekvencemi mlžů (zde nazývané autočtení) a nesouvisející (neautočtení). Dvě skupiny byly samostatně sestaveny pomocí programu MEGAHIT pro generování kontigů [27]. Taxonomické rozložení čtení cizího mikrobiomu bylo klasifikováno pomocí programu Kraken2 [28] a graficky znázorněno pomocí koláčového grafu Krona na platformě Galaxy [29, 30]. Optimální kmery byly z našich předběžných experimentů stanoveny jako kmery-59. Vlastní kontigy byly poté identifikovány zarovnáním s BLASTN (databáze škeblí NCBI, hodnota e < 1e−10 a 60% homologie) pro finální anotaci. Vlastní kontigy byly poté identifikovány zarovnáním s BLASTN (databáze škeblí NCBI, hodnota e < 1e−10 a 60% homologie) pro finální anotaci. Затем собственные контиги были идентифицированы путем сопоставления с BLASTN (базы Ѕаннный двустворчатых моллюсков NCBI, значение e <1e-10 a гомология 60%) для окончательной . Samostatné kontigy byly poté identifikovány porovnáním s BLASTN (databáze mlžů NCBI, hodnota e <1e-10 a 60% homologie) pro finální anotaci.然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 %同源性）对齐来识别自身重叠群以进行最终注释。然后通过与BLASTN（双壳贝类NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % Затем были идентифицированы собственные контиги для окончательной аннотацимиесионные BLASTN (především NCBI s rozlišením 60%). Samostatné kontigy byly poté identifikovány pro finální anotaci porovnáním s BLASTN (databáze mlžů NCBI, hodnota e <1e-10 a 60% homologie). Souběžně byly kontigy nevlastních skupin anotovány pomocí BLASTN (databáze nt NCBI, hodnota e < 1e−10 a 60% homologie). Souběžně byly kontigy nevlastních skupin anotovány pomocí BLASTN (databáze nt NCBI, hodnota e < 1e−10 a 60% homologie). Параллельно чужеродные групповые контиги были аннотированы с помощью BLASTN (базых дантант значение e <1e-10 a гомология 60%). Souběžně byly kontigy cizích skupin anotovány pomocí BLASTN (databáze NT NCBI, hodnota e <1e-10 a 60% homologie).平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重参组重叠组重叠组重叠组重叠平行地，用BLASTN（nt NCBI 数据库，e 值< 1e-10 和60 % 同源性）注释非自身组重参组重叠组重叠组重叠组重叠 Параллельно контиги, не относящиеся к собственной группе, были аннотированы с помой данных nt NCBI, значение e <1e-10 a гомология 60%). Souběžně byly kontigy ne-vlastních skupin anotovány pomocí BLASTN (databáze nt NCBI, hodnota e <1e-10 a 60% homologie). BLASTX byl proveden také na nevlastních kontizích s použitím databází proteinů NCBI nr a RefSeq (hodnota e < 1e−10 a 60% homologie). BLASTX byl proveden také na nevlastních kontizích s použitím databází proteinů NCBI nr a RefSeq (hodnota e < 1e−10 a 60% homologie). BLASTX takkже был проведен на несамостоятельных контигах с использованием баз дамостоятельных контигах с использованием баз дабнных BIданенных (значение e <1e-10 a гомология 60 %). BLASTX byl proveden také na ne-vlastních kontizích s použitím proteinových databází nr a RefSeq NCBI (hodnota e < 1e-10 a 60% homologie).还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和怼 和怼 吂怼 怼还使用nr 和RefSeq 蛋白NCBI 数据库对非自身重叠群进行了BLASTX（e 值< 1e-10 和怼 和怼 吂怼 怼 BLASTX также выполняли на несамостоятельных контигах с использованием баз даннеBIх n баз даннеBIх n (значение e <1e-10 a гомология 60 %). BLASTX byl proveden také na ne-vlastních kontizích s použitím proteinových databází nr a RefSeq NCBI (hodnota e <1e-10 a 60% homologie).Skupiny BLASTN a BLASTX, které nejsou vlastními kontigy, představují finální kontigy (viz doplňkový soubor).
Primery použité pro PCR jsou uvedeny v tabulce S1. K amplifikaci cílových genů ccfDNA byla použita Taq DNA polymeráza (Bio Basic Canada, Markham, ON). Byly použity následující reakční podmínky: denaturace při 95 °C po dobu 3 minut, 95 °C po dobu 1 minuty, nastavená teplota žíhání po dobu 1 minuty, elongace při 72 °C po dobu 1 minuty, 35 cyklů a nakonec 72 °C během 10 minut. . PCR produkty byly separovány elektroforézou na agarózových gelech (1,5 %) obsahujících barvivo SYBR™ Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) při 95 V.
Slávky (Mytilus spp.) byly aklimatizovány v 500 ml okysličené mořské vody (32 PSU) po dobu 24 hodin při teplotě 4 °C. Do lahvičky byla přidána plazmidová DNA obsahující inzert kódující sekvenci cDNA lidského galektinu-7 (přístupové číslo NCBI L07769) v konečné koncentraci 190 μg/μl. Slávky inkubované za stejných podmínek bez přidání DNA sloužily jako kontrola. Třetí kontrolní nádrž obsahovala DNA bez slávek. Pro sledování kvality DNA v mořské vodě byly z každé nádrže v uvedeném čase odebrány vzorky mořské vody (20 μl; tři opakování). Pro sledovatelnost plazmidové DNA byly slávky LB sklizeny v uvedených časech a analyzovány pomocí qPCR a ddPCR. Vzhledem k vysokému obsahu soli v mořské vodě byly alikvotní podíly před všemi PCR testy zředěny vodou v kvalitě PCR (1:10).
Digitální kapková PCR (ddPCR) byla provedena pomocí protokolu BioRad QX200 (Mississauga, Ontario, Kanada). Pro stanovení optimální teploty (tabulka S1) použijte teplotní profil. Kapky byly generovány pomocí generátoru kapek QX200 (BioRad). ddPCR byla provedena následovně: 95 °C po dobu 5 minut, 50 cyklů 95 °C po dobu 30 s a daná teplota žíhání po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 30 s, 4 °C po dobu 5 minut a 90 °C během 5 minut. Počet kapek a pozitivní reakce (počet kopií/µl) byly měřeny pomocí čtečky kapek QX200 (BioRad). Vzorky s méně než 10 000 kapkami byly odmítnuty. Kontrola vzoru nebyla prováděna při každém spuštění ddPCR.
qPCR byla provedena s použitím Rotor-Gene® 3000 (Corbett Research, Sydney, Austrálie) a specifických primerů LGALS7. Všechny kvantitativní PCR byly provedeny ve 20 µl s použitím sady QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN). qPCR byla zahájena 15minutovou inkubací při 95 °C, následovanou 40 cykly při 95 °C po dobu 10 sekund a při 60 °C po dobu 60 sekund s jedním sběrem dat. Křivky tání byly generovány pomocí postupných měření při 95 °C po dobu 5 s, 65 °C po dobu 60 s a 97 °C na konci qPCR. Každá qPCR byla provedena trojmo, s výjimkou kontrolních vzorků.
Vzhledem k tomu, že slávky jsou známé svou vysokou rychlostí filtrace, nejprve jsme zkoumali, zda dokáží filtrovat a zadržovat fragmenty DNA přítomné v mořské vodě. Zajímalo nás také, zda se tyto fragmenty hromadí v jejich polootevřeném lymfatickém systému. Tento problém jsme experimentálně vyřešili sledováním osudu rozpustných fragmentů DNA přidaných do nádrží s modrými slávkami. Pro usnadnění sledování fragmentů DNA jsme použili cizí (ne vlastní) plazmidovou DNA obsahující lidský gen galektinu-7. ddPCR sleduje fragmenty plazmidové DNA v mořské vodě a slávkách. Naše výsledky ukazují, že pokud množství fragmentů DNA v mořské vodě zůstalo v nepřítomnosti slávek v průběhu času relativně konstantní (až 7 dní), pak v přítomnosti slávek toto množství téměř úplně zmizelo do 8 hodin (obr. 1a,b). Fragmenty exogenní DNA byly snadno detekovatelné do 15 minut v intravalvulární tekutině a hemolymfě (obr. 1c). Tyto fragmenty bylo možné detekovat až 4 hodiny po expozici. Tato filtrační aktivita s ohledem na fragmenty DNA je srovnatelná s filtrační aktivitou bakterií a řas [31]. Tyto výsledky naznačují, že slávky dokáží filtrovat a akumulovat cizí DNA ve svých tekutých komůrkách.
Relativní koncentrace plazmidové DNA v mořské vodě v přítomnosti (A) nebo nepřítomnosti (B) slávek, měřené pomocí ddPCR. V A jsou výsledky vyjádřeny v procentech, přičemž okraje čtverců představují 75. a 25. percentil. Proložená logaritmická křivka je znázorněna červeně a šedě vyznačená plocha představuje 95% interval spolehlivosti. V B představuje červená čára průměr a modrá čára 95% interval spolehlivosti pro koncentraci. C Akumulace plazmidové DNA v hemolymfě a chlopňové tekutině slávek v různých časech po přidání plazmidové DNA. Výsledky jsou prezentovány jako absolutní počet detekovaných kopií/ml (±SE).
Dále jsme zkoumali původ ccfDNA ve slávkách odebraných ze slávičkových ložisek na Kerguelenských ostrovech, odlehlé skupině ostrovů s omezeným antropogenním vlivem. Za tímto účelem byla cccDNA z hemolymf slávek izolována a purifikována metodami běžně používanými k purifikaci lidské cccDNA [32, 33]. Zjistili jsme, že průměrné koncentrace ccfDNA v hemolymfě ve slávkách se pohybují v rozmezí nízkých mikrogramů na ml hemolymfy (viz tabulka S2, Doplňující informace). Toto rozmezí koncentrací je mnohem větší než u zdravých lidí (nízké nanogramy na mililitr), ale ve vzácných případech, u pacientů s rakovinou, může hladina ccfDNA dosáhnout několika mikrogramů na mililitr [34, 35]. Analýza distribuce velikosti ccfDNA v hemolymfě ukázala, že tyto fragmenty se značně liší velikostí, v rozmezí od 1000 bp do 5000 bp (obr. 2). Podobné výsledky byly získány s použitím sady QIAamp Investigator Kit na bázi oxidu křemičitého, což je metoda běžně používaná ve forenzní vědě k rychlé izolaci a purifikaci genomové DNA ze vzorků DNA s nízkou koncentrací, včetně ccfDNA [36].
Reprezentativní elektroforegram ccfDNA hemolymfy slávek. Extrahováno pomocí sady NucleoSnap Plasma Kit (nahoře) a sady QIAamp DNA Investigator Kit. B Houslový graf znázorňující distribuci koncentrací ccfDNA hemolymfy (±SE) ve slávkách. Černá a červená čára představují medián a první a třetí kvartil.
Přibližně 1 % ccfDNA u lidí a primátů má cizí zdroj [21, 37]. Vzhledem k polootevřenému oběhovému systému mlžů, mořské vodě bohaté na mikroby a distribuci velikostí ccfDNA slávek jsme vyslovili hypotézu, že ccfDNA z hemolymfy slávek může obsahovat bohatý a rozmanitý soubor mikrobiální DNA. Pro ověření této hypotézy jsme sekvenovali ccfDNA z hemolymfy ze vzorků Aulacomya atra odebraných z Kerguelenských ostrovů, což vedlo k více než 10 milionům odečtů, z nichž 97,6 % prošlo kontrolou kvality. Odečty byly poté klasifikovány podle vlastních a cizích zdrojů pomocí databází mlžů BLASTN a NCBI (obr. S1, Doplňující informace).
U lidí se do krevního oběhu může uvolňovat jak jaderná, tak mitochondriální DNA [38]. V této studii však nebylo možné podrobně popsat jadernou genomovou DNA slávek, vzhledem k tomu, že genom A. atra nebyl sekvenován ani popsán. Podařilo se nám však identifikovat řadu fragmentů ccfDNA našeho vlastního původu pomocí knihovny mlžů (obr. S2, Doplňující informace). Přítomnost fragmentů DNA našeho vlastního původu jsme také potvrdili řízenou PCR amplifikací genů A. atra, které byly sekvenovány (obr. 3). Podobně, vzhledem k tomu, že mitochondriální genom A. atra je dostupný ve veřejných databázích, lze nalézt důkazy o přítomnosti mitochondriálních fragmentů ccfDNA v hemolymfě A. atra. Přítomnost fragmentů mitochondriální DNA byla potvrzena PCR amplifikací (obr. 3).
V hemolymfě druhu A. atra (červené tečky – skladové číslo: SRX5705969) a M. platensis (modré tečky – skladové číslo: SRX5705968) amplifikované pomocí PCR byly přítomny různé mitochondriální geny. Obrázek adaptován z Breton et al., 2011 B Amplifikace supernatantu hemolymfy z A. atra Uloženo na FTA papíře. Pro přímé přidání do PCR zkumavky obsahující PCR směs použijte 3mm děrovač.
Vzhledem k hojnému mikrobiálnímu obsahu v mořské vodě jsme se zpočátku zaměřili na charakterizaci mikrobiálních DNA sekvencí v hemolymfě. K tomu jsme použili dvě různé strategie. První strategie využila Kraken2, algoritmický program pro klasifikaci sekvencí, který dokáže identifikovat mikrobiální sekvence s přesností srovnatelnou s BLAST a dalšími nástroji [28]. Bylo zjištěno, že více než 6719 čtení je bakteriálního původu, zatímco 124 a 64 pocházelo z archeí a virů (obr. 4). Nejhojnějšími fragmenty bakteriální DNA byly Firmicutes (46 %), Proteobacteria (27 %) a Bacteroidetes (17 %) (obr. 4a). Toto rozdělení je v souladu s předchozími studiemi mikrobiomu mořské modré slávky [39, 40]. Gammaproteobacteria byly hlavní třídou Proteobacteria (44 %), včetně mnoha Vibrionales (obr. 4b). Metoda ddPCR potvrdila přítomnost fragmentů DNA Vibrio v ccfDNA hemolymfy A. atra (obr. 4c) [41]. Pro získání více informací o bakteriálním původu ccfDNA byl použit další přístup (obr. S2, Doplňující informace). V tomto případě byly překrývající se čtení sestaveny jako čtení s párovými konci a klasifikovány jako vlastní (mlži) nebo nevlastní původ pomocí BLASTN s hodnotou e 1e−3 a mezní hodnotou s homologií >90%. V tomto případě byly překrývající se čtení sestaveny jako čtení s párovými konci a klasifikovány jako vlastní (mlži) nebo nevlastní původ pomocí BLASTN s hodnotou e 1e−3 a mezní hodnotou s homologií >90%. В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными конигамы классифицированы как собственные (двустворчатые моллюски) или чужие по происхиожден использованием BLASTN a значения e 1e-3 a отсечения с гомологией> 90%. V tomto případě byly překrývající se čtení shromážděny jako párově zakončená čtení a klasifikovány jako nativní (škeble) nebo neoriginální pomocí BLASTN a hodnoty e 1e-3 a hraniční hodnoty s >90% homologií.在这种情况下，重叠的读数组装为配对末端读数，并使用BLASTN 和1e-3 的e> 值%同源性的截止值分类为自身（双壳类）或非自身来源。在 这 种 情况 下 ， 重叠 读数 组装 为 配 末端 读数 ， 使用 使用 佄用 blast值 和> 90 % 同源性 的 分类 自身 （双 壳类） 非 自身。。。。。。。。。 В этом случае перекрывающиеся чтения были собраны как чтения с парными коницировимания как собственные (двустворчатые моллюски) или несобственные по происхождению с исповелю с исповель значений e BLASTN a 1e-3 a порога гомологии> 90%. V tomto případě byly překrývající se čtení shromážděny jako párově zakončená čtení a klasifikovány jako vlastní (mlži) nebo neoriginální pomocí hodnot e BLASTN a 1e-3 ​​a prahu homologie >90 %.Vzhledem k tomu, že genom A. atra dosud nebyl sekvenován, použili jsme strategii de novo sestavování pomocí assembleru MEGAHIT Next Generation Sequencing (NGS). Celkem bylo identifikováno 147 188 kontigů závislého původu (mlži). Tyto kontigy byly následně rozloženy s e-hodnotami 1e-10 pomocí programů BLASTN a BLASTX. Tato strategie nám umožnila identifikovat 482 fragmentů, které nejsou mlži, přítomných v ccfDNA A. atra. Více než polovina (57 %) těchto fragmentů DNA byla získána z bakterií, zejména z žaberních symbiontů, včetně sulfotrofních symbiontů, a z žaberních symbiontů Solemya velum (obr. 5).
Relativní početnost na úrovni typu. B Mikrobiální diverzita dvou hlavních kmenů (Firmicutes a Proteobacteria). Reprezentativní amplifikace ddPCR C Vibrio spp. A. Fragmenty genu 16S rRNA (modré) ve třech atra hemolymfách.
Celkem bylo analyzováno 482 shromážděných kontigů. Obecný profil taxonomického rozdělení metagenomických kontigových anotací (prokaryota a eukaryota). B Detailní rozdělení fragmentů bakteriální DNA identifikovaných pomocí BLASTN a BLASTX.
Analýza Kraken2 také ukázala, že ccfDNA slávek obsahovala fragmenty archaeální DNA, včetně fragmentů DNA druhů Euryarchaeota (65 %), Crenarchaeota (24 %) a Thaurmarcheota (11 %) (obr. 6a). Přítomnost fragmentů DNA odvozených od druhů Euryarchaeota a Crenarchaeota, které se dříve vyskytovaly v mikrobiální komunitě kalifornských slávek, by neměla být překvapením [42]. Ačkoli je Euryarchaeota často spojována s extrémními podmínkami, nyní se uznává, že Euryarchaeota i Crenarcheota patří mezi nejběžnější prokaryota v mořském kryogenním prostředí [43, 44]. Přítomnost methanogenních mikroorganismů ve slávkách není překvapivá, vzhledem k nedávným zprávám o rozsáhlých únicích metanu ze dna na Kerguelenské plošině [45] a možné mikrobiální produkci metanu pozorované u pobřeží Kerguelenských ostrovů [46].
Naše pozornost se poté přesunula k údajům z DNA virů. Pokud je nám známo, jedná se o první mimocílovou studii obsahu virů ve slávkách. Jak se očekávalo, našli jsme fragmenty DNA bakteriofágů (Caudovirales) (obr. 6b). Nejběžnější virová DNA však pochází z kmene nukleocytovirů, známého také jako jaderný cytoplazmatický velký DNA virus (NCLDV), který má největší genom ze všech virů. V rámci tohoto kmene patří většina sekvencí DNA do čeledí Mimimidoviridae (58 %) a Poxviridae (21 %), jejichž přirozenými hostiteli jsou obratlovci a členovci, zatímco malá část těchto sekvencí DNA patří ke známým virologickým řasám. Infikuje mořské eukaryotické řasy. Sekvence byly také získány z viru Pandora, obrovského viru s největší velikostí genomu ze všech známých virových rodů. Je zajímavé, že rozsah hostitelů, o nichž je známo, že jsou virem infikováni, jak bylo stanoveno sekvenováním ccfDNA hemolymfy, byl relativně velký (obrázek S3, Doplňující informace). Zahrnuje viry, které infikují hmyz, jako jsou Baculoviridae a Iridoviridae, a také viry, které infikují améby, řasy a obratlovce. Nalezli jsme také sekvence odpovídající genomu Pithovirus sibericum. Pitoviry (známé také jako „zombie viry“) byly poprvé izolovány z 30 000 let starého permafrostu na Sibiři [47]. Naše výsledky jsou tedy v souladu s předchozími zprávami, které ukazují, že ne všechny moderní druhy těchto virů vyhynuly [48] a že tyto viry mohou být přítomny ve vzdálených subarktických mořských ekosystémech.
Nakonec jsme otestovali, zda můžeme najít fragmenty DNA z jiných mnohobuněčných živočichů. Celkem bylo pomocí BLASTN a BLASTX s knihovnami nt, nr a RefSeq (genomovými a proteinovými) identifikováno 482 cizích kontigů. Naše výsledky ukazují, že mezi cizími fragmenty ccfDNA mnohobuněčných živočichů převládá DNA kostí (obr. 5). Byly také nalezeny fragmenty DNA z hmyzu a dalších druhů. Relativně velká část fragmentů DNA nebyla identifikována, pravděpodobně kvůli nedostatečnému zastoupení velkého počtu mořských druhů v genomických databázích ve srovnání se suchozemskými druhy [49].
V této práci aplikujeme koncept LB na slávky a tvrdíme, že sekvenování ccfDNA z hemolymfy může poskytnout vhled do složení mořských pobřežních ekosystémů. Zejména jsme zjistili, že 1) hemolymfa slávek obsahuje relativně vysoké koncentrace (mikrogramové hladiny) relativně velkých (~1-5 kb) cirkulujících fragmentů DNA; 2) tyto fragmenty DNA jsou nezávislé i nezávislé; 3) Mezi cizími zdroji těchto fragmentů DNA jsme našli bakteriální, archeální a virovou DNA, stejně jako DNA jiných mnohobuněčných živočichů; 4) K akumulaci těchto cizích fragmentů ccfDNA v hemolymfě dochází rychle a přispívá k vnitřní filtrační aktivitě slávek. Závěrem lze říci, že naše studie ukazuje, že koncept LB, který byl dosud aplikován hlavně v oblasti biomedicíny, kóduje bohatý, ale neprozkoumaný zdroj znalostí, který lze využít k lepšímu pochopení interakce mezi sentinelními druhy a jejich prostředím.
Kromě primátů byla izolace ccfDNA hlášena i u savců, včetně myší, psů, koček a koní [50, 51, 52]. Pokud je nám však známo, naše studie je první, která uvádí detekci a sekvenování ccfDNA u mořských druhů s otevřeným krevním oběhem. Tento anatomický rys a filtrační schopnost slávek může alespoň částečně vysvětlovat odlišné velikostní charakteristiky cirkulujících fragmentů DNA ve srovnání s jinými druhy. U lidí je většina fragmentů DNA cirkulujících v krvi malými fragmenty o velikosti od 150 do 200 bp s maximálním vrcholem 167 bp [34, 53]. Malá, ale významná část fragmentů DNA má velikost mezi 300 a 500 bp a asi 5 % je delších než 900 bp [54]. Důvodem tohoto rozdělení velikostí je, že hlavním zdrojem ccfDNA v plazmě je buněčná smrt, buď v důsledku buněčné smrti, nebo v důsledku nekrózy cirkulujících hematopoetických buněk u zdravých jedinců, nebo v důsledku apoptózy nádorových buněk u pacientů s rakovinou (známé jako cirkulující nádorová DNA). , ctDNA). Distribuce velikostí hemolymfové ccfDNA, kterou jsme zjistili u slávek, se pohybovala od 1000 do 5000 bp, což naznačuje, že ccfDNA slávek má jiný původ. Toto je logická hypotéza, protože slávky mají polootevřený cévní systém a žijí v mořském vodním prostředí obsahujícím vysoké koncentrace mikrobiální genomové DNA. Naše laboratorní experimenty s použitím exogenní DNA skutečně ukázaly, že slávky akumulují fragmenty DNA v mořské vodě, alespoň po několika hodinách, kdy jsou po buněčném příjmu degradovány a/nebo uvolněny a/nebo uloženy v různých organizacích. Vzhledem k vzácnosti buněk (prokaryotických i eukaryotických) sníží použití intravalvulárních kompartmentů množství ccfDNA z vlastních i cizích zdrojů. Vzhledem k důležitosti vrozené imunity mlžů a velkému počtu cirkulujících fagocytů jsme dále vyslovili hypotézu, že i cizí ccfDNA je obohacena o cirkulující fagocyty, které akumulují cizí DNA po požití mikroorganismů a/nebo buněčných zbytků. Naše výsledky dohromady ukazují, že ccfDNA z hemolymfy mlžů je jedinečným úložištěm molekulárních informací a posiluje jejich status sentinelového druhu.
Naše data naznačují, že sekvenování a analýza fragmentů ccfDNA z hemolymfy odvozených z bakterií může poskytnout klíčové informace o flóře hostitelských bakterií a bakteriích přítomných v okolním mořském ekosystému. Techniky shot sekvenování odhalily sekvence komenzální bakterie A. atra gill, které by byly přehlédnuty, pokud by byly použity konvenční metody identifikace 16S rRNA, částečně kvůli zkreslení referenční knihovny. Ve skutečnosti naše použití LB dat shromážděných z M. platensis ve stejné vrstvě slávek v Kerguelenu ukázalo, že složení bakteriálních symbiontů asociovaných s žaberami bylo pro oba druhy slávek stejné (obr. S4, Doplňující informace). Tato podobnost dvou geneticky odlišných slávek může odrážet složení bakteriálních společenstev v chladných, sirných a vulkanických sedimentech Kerguelenu [55, 56, 57, 58]. Vyšší hladiny mikroorganismů redukujících síru byly dobře popsány při sběru slávek z bioturbovaných pobřežních oblastí [59], jako je pobřeží Port-au-France. Další možností je, že flóra komenzálních slávek může být ovlivněna horizontálním přenosem [60, 61]. Je zapotřebí dalšího výzkumu, který by určil korelaci mezi mořským prostředím, povrchem mořského dna a složením symbiotických bakterií ve slávkách. Tyto studie v současné době probíhají.
Délka a koncentrace ccfDNA hemolymfy, snadná purifikace a vysoká kvalita umožňující rychlé sekvenování metodou shotgun jsou některé z mnoha výhod použití ccfDNA slávek k posouzení biodiverzity v mořských pobřežních ekosystémech. Tento přístup je obzvláště účinný pro charakterizaci virových společenstev (viromů) v daném ekosystému [62, 63]. Na rozdíl od bakterií, archeí a eukaryot virové genomy neobsahují fylogeneticky konzervované geny, jako jsou sekvence 16S. Naše výsledky naznačují, že tekuté biopsie z indikátorových druhů, jako jsou slávky, lze použít k identifikaci relativně velkého počtu fragmentů viru ccfDNA, o nichž je známo, že infikují hostitele, kteří typicky obývají pobřežní mořské ekosystémy. Patří sem viry, o kterých je známo, že infikují prvoky, členovce, hmyz, rostliny a bakteriální viry (např. bakteriofágy). Podobné rozložení bylo zjištěno, když jsme zkoumali virom ccfDNA hemolymfy slávek modrých (M. platensis) odebraný ve stejné vrstvě slávek v Kerguelenu (tabulka S2, doplňkové informace). Sekvenování ccfDNA metodou brokovnice je skutečně nový přístup, který získává na popularitě ve studiu viromu lidí nebo jiných druhů [21, 37, 64]. Tento přístup je obzvláště užitečný pro studium dvouvláknových DNA virů, protože mezi všemi dvouvláknovými DNA viry není konzervován jediný gen, což představuje nejrozmanitější a nejširší třídu virů v Baltimoru [65]. Ačkoli většina těchto virů zůstává neklasifikovaná a může zahrnovat viry ze zcela neznámé části virového světa [66], zjistili jsme, že viromy a hostitelské spektrum slávek A. atra a M. platensis spadají mezi tyto dva druhy podobně (viz obrázek S3, další informace). Tato podobnost není překvapivá, protože může odrážet nedostatečnou selektivitu v příjmu DNA přítomné v prostředí. Pro charakterizaci RNA viromu jsou v současné době zapotřebí další studie s použitím purifikované RNA.
V naší studii jsme použili velmi rigorózní postup adaptovaný z práce Kowarského a kolegů [37], kteří použili dvoustupňové deleční rozdělení sdružených čtení a kontigů před a po sestavení nativní ccfDNA, což vedlo k vysokému podílu nemapovaných čtení. Nemůžeme proto vyloučit, že některé z těchto nemapovaných čtení mohou mít stále svůj vlastní původ, a to především proto, že pro tento druh slávky nemáme referenční genom. Tento postup jsme použili také proto, že jsme se obávali chimér mezi vlastními a nevlastními čteními a délky čtení generovaných přístrojem Illumina MiSeq PE75. Dalším důvodem pro většinu nezmapovaných čtení je, že velká část mořských mikrobů, zejména v odlehlých oblastech, jako je Kerguelen, nebyla anotována. Použili jsme Illumina MiSeq PE75 za předpokladu, že délky fragmentů ccfDNA jsou podobné lidské ccfDNA. Vzhledem k našim výsledkům, které ukazují, že ccfDNA hemolymfy má delší čtení než lidské a/nebo savčí, doporučujeme pro budoucí studie použít sekvenční platformu vhodnější pro delší fragmenty ccfDNA. Tato praxe výrazně usnadní identifikaci dalších indikací pro hlubší analýzu. Získání v současnosti nedostupné kompletní sekvence jaderného genomu A. atra by také výrazně usnadnilo rozlišení ccfDNA z vlastních a cizích zdrojů. Vzhledem k tomu, že se náš výzkum zaměřil na možnost aplikace konceptu tekuté biopsie na slávky, doufáme, že s využitím tohoto konceptu v budoucím výzkumu budou vyvinuty nové nástroje a postupy, které zvýší potenciál této metody pro studium mikrobiální rozmanitosti slávek. mořský ekosystém.
Jako neinvazivní klinický biomarker jsou zvýšené hladiny ccfDNA v lidské plazmě spojovány s různými onemocněními, poškozením tkání a stresovými stavy [67,68,69]. Toto zvýšení je spojeno s uvolněním fragmentů DNA vlastního původu po poškození tkáně. Tuto problematiku jsme řešili pomocí akutního tepelného stresu, při kterém byly slávky krátce vystaveny teplotě 30 °C. Tuto analýzu jsme provedli na třech různých druzích slávek ve třech nezávislých experimentech. Nezjistili jsme však žádnou změnu hladin ccfDNA po akutním tepelném stresu (viz obrázek S5, další informace). Tento objev může alespoň částečně vysvětlit skutečnost, že slávky mají polootevřený oběhový systém a akumulují velké množství cizí DNA díky své vysoké filtrační aktivitě. Na druhou stranu, slávky, stejně jako mnoho bezobratlých, mohou být odolnější vůči poškození tkání vyvolanému stresem, čímž omezují uvolňování ccfDNA v jejich hemolymfě [70, 71].
Dosavadní analýza DNA biodiverzity ve vodních ekosystémech se zaměřovala především na metabarkódování environmentální DNA (eDNA). Tato metoda je však v analýze biodiverzity obvykle omezená, pokud se používají primery. Použití sekvenování „shotgun“ obchází omezení PCR a zkreslený výběr sad primerů. Naše metoda se tedy v jistém smyslu blíží nedávno používané vysoce výkonné metodě sekvenování eDNA „shotgun“, která je schopna přímo sekvenovat fragmentovanou DNA a analyzovat téměř všechny organismy [72, 73]. Existuje však řada zásadních problémů, které odlišují LB od standardních metod eDNA. Hlavním rozdílem mezi eDNA a LB je samozřejmě použití přirozených filtračních hostitelů. Bylo popsáno použití mořských druhů, jako jsou houby a mlži (Dresseina spp.), jako přirozeného filtru pro studium eDNA [74, 75]. Dreissenaova studie však použila biopsie tkání, ze kterých byla DNA extrahována. Analýza ccfDNA z LB nevyžaduje biopsii tkání, specializované a někdy drahé vybavení a logistiku spojenou s eDNA nebo biopsií tkání. Nedávno jsme dokonce informovali, že ccfDNA z LB lze skladovat a analyzovat s podporou FTA bez udržování chladicího řetězce, což je pro výzkum v odlehlých oblastech velkou výzvou [76]. Extrakce ccfDNA z tekutých biopsií je také jednoduchá a poskytuje vysoce kvalitní DNA pro sekvenování metodou shotgun a PCR analýzu. To je velká výhoda vzhledem k některým technickým omezením spojeným s analýzou eDNA [77]. Jednoduchost a nízké náklady na metodu odběru vzorků jsou také obzvláště vhodné pro dlouhodobé monitorovací programy. Kromě jejich vysoké filtrační schopnosti je další známou vlastností mlžů chemické mukopolysacharidové složení jejich hlenu, které podporuje absorpci virů [78, 79]. Díky tomu jsou mlži ideálním přírodním filtrem pro charakterizaci biodiverzity a dopadu klimatických změn v daném vodním ekosystému. Ačkoli přítomnost fragmentů DNA odvozených od hostitele lze považovat za omezení metody ve srovnání s eDNA, náklady spojené s držením takové nativní ccfDNA ve srovnání s eDNA jsou zároveň pochopitelné vzhledem k obrovskému množství informací dostupných pro zdravotní studie. offset hostitele. To zahrnuje přítomnost virových sekvencí integrovaných do genomu hostitele. To je obzvláště důležité pro slávky, vzhledem k přítomnosti horizontálně přenášených leukemických retrovirů u mlžů [80, 81]. Další výhodou LB oproti eDNA je, že využívá fagocytární aktivitu cirkulujících krevních buněk v hemolymfě, které pohlcují mikroorganismy (a jejich genomy). Fagocytóza je hlavní funkcí krevních buněk u mlžů [82]. Metoda navíc využívá vysoké filtrační kapacity slávek (průměrně 1,5 l/h mořské vody) a dvoudenní cirkulace, což zvyšuje promíchávání různých vrstev mořské vody, což umožňuje zachycení heterologní eDNA. [83, 84]. Analýza ccfDNA slávek je tedy zajímavou cestou vzhledem k nutričním, ekonomickým a environmentálním dopadům slávek. Podobně jako analýza LB odebrané od lidí, tato metoda také otevírá možnost měření genetických a epigenetických změn v DNA hostitele v reakci na exogenní látky. Například lze uvažovat o technologiích sekvenování třetí generace pro provádění celogenomové methylační analýzy v nativní ccfDNA pomocí nanopórového sekvenování. Tento proces by měl být usnadněn skutečností, že délka fragmentů ccfDNA slávek je ideálně kompatibilní s platformami pro sekvenování s dlouhým čtením, které umožňují celogenomovou methylační analýzu DNA z jediného sekvenčního běhu bez nutnosti chemických transformací.85,86] To je zajímavá možnost, protože bylo prokázáno, že vzorce metylace DNA odrážejí reakci na environmentální stres a přetrvávají po mnoho generací. Proto může poskytnout cenný vhled do základních mechanismů řídících reakci po vystavení klimatickým změnám nebo znečišťujícím látkám [87]. Použití LB však není bez omezení. Není třeba dodávat, že to vyžaduje přítomnost indikátorových druhů v ekosystému. Jak již bylo zmíněno výše, použití LB k posouzení biodiverzity daného ekosystému vyžaduje také důkladný bioinformatický postup, který zohledňuje přítomnost fragmentů DNA ze zdroje. Dalším velkým problémem je dostupnost referenčních genomů pro mořské druhy. Doufá se, že iniciativy, jako je Marine Mammal Genomes Project a nedávno založený projekt Fish10k [88], usnadní takovou analýzu v budoucnu. Aplikace konceptu LB na organismy živící se filtrací vody v moři je také kompatibilní s nejnovějšími pokroky v technologii sekvenování, což jej činí vhodným pro vývoj víceohmových biomarkerů, které poskytují důležité informace o zdraví mořských stanovišť v reakci na environmentální stres.
Data sekvenování genomu byla uložena v archivu čtení sekvencí NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRR8924808 v rámci Bioprojects SRR8924808.
Brierley AS, Kingsford MJ Dopad změny klimatu na mořský život a ekosystémy. Cole Biology. 2009; 19: P602–P614.
Gissi E, Manea E, Mazaris AD, Fraschetti S, Alppanidou V, Bevilacqua S a kol. Zvažte kombinované dopady změny klimatu a dalších lokálních stresorů na mořské prostředí. General Scientific Environment. 2021;755:142564.
Carella F, Antuofermo E, Farina S, Salati F, Mandas D, Prado P a kol. ). Věda prvního března. 2020; 7:48.
Seront L, Nicastro CR, Zardi GI, Goberville E. Snížená tolerance vůči teplu za opakovaných tepelných stresů vysvětluje vysokou letní úmrtnost slávek modrých. Vědecká zpráva 2019; 9:17498.
Fey SB, Siepielski AM, Nussle S, Cervantes-Yoshida K, Hwan JL, Huber ER a kol. Nedávné změny ve četnosti, příčinách a rozsahu úhynů zvířat. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:1083-8.
Scarpa F, Sanna D, Azzena I, Mughetti D, Cerruti F, Hosseini S, et al. Hromadnou mortalitu Pinna nobilis mohlo způsobit více druhově nespecifických patogenů. Život. 2020;10:238.
Bradley M, Coutts SJ, Jenkins E, O'Hara TM. Potenciální dopad změny klimatu na arktická zoonotická onemocnění. Int J Circumpolar health. 2005; 64:468–77.
Beyer J., Greene NW, Brooks S., Allan IJ, Ruus A., Gomez T. a kol. Slávky modré (Mytilus edulis spp.) jako signální organismy v monitorování znečištění pobřeží: přehled. Mar Environ Res 2017; 130:338-65.
Siravegna G, Marsoni S, Siena S, Bardelli A. Integrace tekuté biopsie do léčby rakoviny. Nat Rev Clean Oncol. 2017; 14:531–48.
Wan JCM, Massie C, Garcia-Corbacho J, Mouliere F, Brenton JD, Caldas C a kol. Zrání tekuté biopsie: Umožňuje cirkulaci nádorové DNA. Nat Rev Cancer. 2017;17:223–38.
Mandel P., Metais P. Nukleové kyseliny v lidské plazmě. Zápisy ze schůzí dceřiných společností Soc Biol. 1948; 142:241-3.
Bronkhorst AJ, Ungerer W, Holdenrieder S. Nová role bezbuněčné DNA jako molekulárního markeru pro léčbu rakoviny. Kvantifikace biomolární analýzy. 2019;17:100087.
Ignatiadis M., Sledge GW, Jeffrey SS Tekutá biopsie vstupuje do kliniky – problémy s implementací a budoucí výzvy. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18:297–312.
Lo YM, Corbetta N., Chamberlain PF, Rai W., Sargent IL, Redman CW a další. Fetální DNA je přítomna v mateřské plazmě a séru. Lancet. 1997; 350:485-7.
Mufarray MN, Wong RJ, Shaw GM, Stevenson DK, Quake SR Studie průběhu těhotenství a jeho komplikací s využitím cirkulující extracelulární RNA v krvi žen během těhotenství. Dopediatria. 2020;8:605219.
Ollerich M, Sherwood K, Keown P, Schütz E, Beck J, Stegbauer J a kol. Tekutá biopsie: DNA bez buněk dárce se používá k detekci alogenních lézí v štěpu ledviny. Nat Rev Nephrol. 2021; 17:591–603.
Juan FC, Lo YM Inovace v prenatální diagnostice: sekvenování genomu mateřské plazmy. Anna MD. 2016;67:419-32.
Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D a kol. Rychlá detekce patogenů pomocí metagenomického sekvenování infikovaných tělesných tekutin nové generace. Nat Medicine. 2021;27:115-24.