Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Mezitím budeme web vykreslovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Nekontrolované krvácení je jednou z hlavních příčin úmrtí. Dosažení rychlé hemostázy zajišťuje přežití subjektu jako první pomoc během boje, dopravních nehod a operací ke snížení úmrtnosti. Nanoporézní vlákny vyztužené kompozitní lešení (NFRCS) odvozené z jednoduché hemostatické filmotvorné kompozice (HFFC) jako kontinuální fáze může spustit a zesílit hemostázu. Vývoj NFRCS je založen na konstrukci křídla vážky. Struktura křídla vážky se skládá z příčných a podélných křídel a membrány křídel jsou vzájemně propojeny, aby se zachovala integrita mikrostruktury. HFFC rovnoměrně pokrývá povrch vlákna filmem o tloušťce nanometrů a spojuje náhodně rozloženou vrstvu bavlny (Ct) (disperzní fáze) za vzniku nanoporézní struktury. Kombinace kontinuální a disperzní fáze snižuje cenu produktu desetkrát ve srovnání s komerčně dostupnými produkty. Modifikované NFRCS (tampony nebo náramky) lze použít v různých biomedicínských aplikacích. Studie in vivo dospěly k závěru, že vyvinuté Cp NFRCS spouští a zesiluje proces koagulace v místě aplikace. NFRCS dokáže modulovat mikroprostředí a působit na buněčné úrovni díky své nanoporézní struktuře, což vede k lepšímu hojení ran v modelu excizní rány.
Nekontrolované krvácení během boje, intraoperačních a nouzových situací může představovat vážné ohrožení života zraněných1. Tyto stavy dále vedou k celkovému zvýšení periferního cévního odporu, což vede k hemoragickému šoku. Vhodná opatření ke kontrole krvácení během operace a po ní jsou považována za potenciálně život ohrožující2,3. Poškození velkých cév vede k masivní ztrátě krve, což má za následek úmrtnost ≤ 50 % v boji a 31 % během operace1. Masivní ztráta krve vede ke snížení tělesného objemu, což snižuje srdeční výdej. Zvýšení celkového periferního cévního odporu a progresivní zhoršení mikrocirkulace vedou k hypoxii v orgánech podporujících život. Pokud stav pokračuje bez účinného zásahu, může dojít k hemoragickému šoku1,4,5. Mezi další komplikace patří progrese hypotermie a metabolické acidózy, stejně jako porucha koagulace, která brání procesu koagulace. Těžký hemoragický šok je spojen s vyšším rizikem úmrtí6,7,8. U šoku III. stupně (progresivního) je krevní transfuze nezbytná pro přežití pacienta během intraoperační a pooperační morbidity a mortality. Abychom překonali všechny výše uvedené život ohrožující situace, vyvinuli jsme nanoporézní kompozitní lešení vyztužené vlákny (NFRCS), které využívá minimální koncentraci polymeru (0,5 %) za použití kombinace ve vodě rozpustných hemostatických polymerů.
Použitím vláknité výztuže lze vyvíjet cenově efektivní produkty. Náhodně uspořádaná vlákna připomínají strukturu křídla vážky, vyváženou horizontálními a vertikálními pruhy na křídlech. Příčné a podélné žilky křídla komunikují s membránou křídla (obr. 1). NFRCS se skládá z vyztuženého Ct jako nosného systému s lepší fyzikální a mechanickou pevností (obrázek 1). Vzhledem k cenové dostupnosti a řemeslnému zpracování chirurgové dávají přednost použití bavlněných nití (Ct) během operací a obvazů. Vzhledem k jeho četným výhodám, včetně > 90 % krystalické celulózy (která přispívá ke zvýšení hemostatické aktivity), byl Ct použit jako kosterní systém NFRCS9,10. Vzhledem k jeho četným výhodám, včetně > 90 % krystalické celulózy (která přispívá ke zvýšení hemostatické aktivity), byl Ct použit jako kosterní systém NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, в том числе > 90 % кричейталле целлюлозы (участвует в повышении гемостатической активности), Ct использовалти в каче systémy NFRCS9,10. Vzhledem k jeho mnoha výhodám, včetně >90% krystalické celulózy (podílející se na zvýšené hemostatické aktivitě), byl Ct použit jako kosterní systém NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 % 的结晶纤维素（有助于增Ｚ滭血洼Ct滌血洼被用作NFRCS9,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Vzhledem k jeho mnoha výhodám, včetně více než 90 % krystalické celulózy (která pomáhá zlepšit hemostatickou aktivitu), byl Ct použit jako nosná konstrukce pro NFRCS9,10.Ct byl povrchově potažen (byla pozorována tvorba nanofilmu) a propojen s hemostatickou filmotvornou kompozicí (HFFC). HFFC funguje jako matrigel, který drží náhodně umístěný Ct pohromadě. Vyvinutý design přenáší napětí v dispergované fázi (výztužná vlákna). Je obtížné získat nanoporézní struktury s dobrou mechanickou pevností za použití minimálních koncentrací polymerů. Kromě toho není snadné přizpůsobit různé formy pro různé biomedicínské aplikace.
Obrázek ukazuje schéma konstrukce NFRCS založeného na struktuře křídla vážky (A). Tento obrázek ukazuje srovnávací analogii struktury křídla vážky (křížící se a podélné žilky křídla jsou vzájemně propojeny) a průřezovou mikrofotografii Cp NFRCS (B). Schematické znázornění NFRCS.
NFRC byly vyvinuty s použitím HFFC jako kontinuální fáze, aby se řešila výše uvedená omezení. HFFC se skládá z různých filmotvorných hemostatických polymerů, včetně chitosanu (jako hlavního hemostatického polymeru) s methylcelulózou (MC), hydroxypropylmethylcelulózou (HPMC 50 cp) a polyvinylalkoholem (PVA) (125 kDa) jako nosným polymerem, který podporuje tvorbu trombu. Přidání polyvinylpyrrolidinu K30 (PVP K30) zlepšilo schopnost absorpce vlhkosti NFRCS. Polyethylenglykol 400 (PEG 400) byl přidán pro zlepšení zesíťování polymerů ve směsích vázaných polymerů. Na Ct byly aplikovány tři různé hemostatické kompozice HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC a Cp HFFC), a to chitosan s MC (Cm), chitosan s HPMC (Ch) a chitosan s PVA (Cp). Různé charakterizační studie in vitro a in vivo potvrdily hemostatickou aktivitu a aktivitu NFRCS při hojení ran. Kompozitní materiály nabízené společností NFRCS lze použít k přizpůsobení různých forem lešení specifickým potřebám.
Kromě toho lze NFRCS upravit jako obvaz nebo roli, která pokryje celou oblast poranění dolních končetin a dalších částí těla. Konkrétně pro poranění končetin v boji lze navržený design NFRCS změnit na polovinu paže nebo celou nohu (doplňkový obrázek S11). Z NFRCS lze s tkáňovým lepidlem vyrobit náramek, který lze použít k zastavení krvácení při těžkých sebevražedných poraněních zápěstí. Naším hlavním cílem je vyvinout NFRCS s co nejmenším počtem polymerů, který lze dodat velké populaci (pod hranicí chudoby) a který lze umístit do lékárničky. Díky jednoduché, efektivní a ekonomické konstrukci prospívá NFRCS místním komunitám a může mít globální dopad.
Chitosan (molekulová hmotnost 80 kDa) a amarant byly zakoupeny od společnosti Merck v Indii. Hydroxypropylmethylcelulóza 50 Cp, polyethylenglykol 400 a methylcelulóza byly zakoupeny od společnosti Loba Chemie Pvt. LLC v Bombaj. Polyvinylalkohol (molekulová hmotnost 125 kDa) (hydrolyzovaný z 87 do 90 %) byl zakoupen od společnosti National Chemicals v Gudžarátu. Polyvinylpyrrolidin K30 byl zakoupen od společnosti Molychem v Bombaj a sterilní tampony od společnosti Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd. v Tamilnádu. Jako nosič byla použita voda Milli Q (systém čištění vody Direct-Q3, Merck, Indie).
NFRCS byl vyvinut lyofilizační metodou11,12. Všechny kompozice HFFC (tabulka 1) byly připraveny za použití mechanického míchadla. Připravte 0,5% roztok chitosanu za použití 1% kyseliny octové ve vodě za stálého míchání při 800 ot/min na mechanickém míchadle. Přesná hmotnost naplněného polymeru uvedená v tabulce 1 byla přidána do roztoku chitosanu a míchána, dokud nebyl získán čirý polymerní roztok. Do výsledné směsi byly přidány PVP K30 a PEG 400 v množství uvedeném v tabulce 1 a míchání pokračovalo, dokud nebyl získán čirý viskózní polymerní roztok. Výsledná lázeň polymerního roztoku byla sonikována po dobu 60 minut, aby se z polymerní směsi odstranily zachycené vzduchové bubliny. Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku S1(b), Ct byl rovnoměrně rozložen v každé jamce 6jamkové destičky (formy) doplněné 5 ml HFFC.
Šestijamková destička byla sonikována po dobu 60 minut, aby se dosáhlo rovnoměrného smáčení a distribuce HFFC v Ct síti. Poté byla šestijamková destička zmrazena při -20 °C po dobu 8–12 hodin. Zmrazené destičky byly lyofilizovány po dobu 48 hodin, aby se získaly různé formulace NFRCS. Stejný postup se používá k výrobě různých tvarů a struktur, jako jsou tampony nebo válcové tampony, nebo jakýkoli jiný tvar pro různé aplikace.
Přesně odvážený chitosan (80 kDa) (3 %) se rozpustí v 1% kyselině octové za použití magnetického míchadla. K výslednému roztoku chitosanu se přidá 1% PEG 400 a míchá se 30 minut. Výsledný roztok se nalije do čtvercové nebo obdélníkové nádoby a zmrazí se na 12 hodin při teplotě -80 °C. Zmrazené vzorky se lyofilizují po dobu 48 hodin, aby se získal porézní Cs13.
Vyvinutý NFRCS byl podroben experimentům s využitím infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japonsko) za účelem potvrzení chemické kompatibility chitosanu s jinými polymery14,15. FTIR spektra (šířka spektrálního rozsahu od 400 do 4000 cm-1) všech testovaných vzorků byla získána provedením 32 skenů.
Rychlost absorpce krve (BAR) pro všechny formulace byla vyhodnocena metodou popsanou Chenem a kol. 16 s drobnými úpravami. Vyvinuté NFRK všech složení byly sušeny ve vakuové peci při 105 °C přes noc, aby se odstranilo zbytkové rozpouštědlo. 30 mg NFRCS (počáteční hmotnost vzorku – W0) a 30 mg Ct (pozitivní kontrola) bylo umístěno do samostatných misek obsahujících premix 3,8 % citrátu sodného. V předem stanovených časových intervalech, tj. 5, 10, 20, 30, 40 a 60 sekund, byly NFRCS odstraněny a jejich povrchy očištěny od neabsorbované krve umístěním vzorků na Ct po dobu 30 sekund. V každém časovém bodě byla uvažována konečná hmotnost krve absorbované NFRCS 16 (W1). Vypočítejte procento BAR pomocí následujícího vzorce:
Doba srážení krve (BCT) byla stanovena dle Wanga a kol.17. Doba potřebná ke srážení plné krve (krev potkanů ​​předem smíchaná s 3,8% citrátem sodným) v přítomnosti NFRCS byla vypočtena jako BCT testovaného vzorku. Různé složky NFRCS (30 mg) byly umístěny do 10ml lahviček se šroubovacím uzávěrem a inkubovány při 37 °C. Do lahvičky byla přidána krev (0,5 ml) a 0,3 ml 0,2 M CaCl2 pro aktivaci srážení krve. Nakonec lahvičku obraťte každých 15 sekund (až o 180 °), dokud se nevytvoří pevná sraženina. BCT vzorku se odhaduje počtem převrácených lahviček17,18. Na základě BCT byla pro další charakterizační studie vybrána dvě optimální složení z NFRCS Cm, Ch a Cp.
BCT složení Ch NFRCS a Cp NFRCS byla stanovena metodou popsanou Li et al. 19. 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs (pozitivní kontrola) bylo umístěno do samostatných Petriho misek (37 °C). Krev obsahující 3,8 % citrátu sodného byla smíchána s 0,2 M CaCl2 v objemovém poměru 10:1 pro zahájení procesu srážení krve. 20 µl směsi 0,2 M CaCl2 krve potkana bylo naneseno na povrch vzorku a umístěno do prázdné Petriho misky. Kontrolou byla krev nalitá do prázdných Petriho misek bez Ct. V pevných intervalech 0, 3 a 5 minut bylo srážení zastaveno přidáním 10 ml deionizované (DI) vody do vzorku obsahujícího misku, aniž by se narušila sraženina. Nekoagulované erytrocyty (erytrocyty) podléhají hemolýze v přítomnosti deionizované vody a uvolňují hemoglobin. Hemoglobin v různých časových bodech (HA(t)) byl měřen při 540 nm (λmax hemoglobin) pomocí UV-Vis spektrofotometru. Jako referenční standard byla použita absolutní absorpce hemoglobinu (AH(0)) za 0 minut z 20 µl krve v 10 ml deionizované vody. Relativní absorpce hemoglobinu (RHA) srážené krve byla vypočtena z poměru HA(t)/HA(0) za použití stejné šarže krve.
Pomocí analyzátoru textury (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) byly stanoveny adhezní vlastnosti NFRK k poškozené tkáni. Válcová miska s otevřeným dnem byla přitlačena k vnitřní straně vepřové kůže (bez vrstvy tuku). Vzorky (Ch NFRCS a Cp NFRCS) byly aplikovány kanylou do válcových forem, aby se vytvořila adheze ke kůži prasete. Po 3minutové inkubaci při pokojové teplotě (RT) (25 °C) byla zaznamenána adhezní síla NFRCS konstantní rychlostí 0,5 mm/s.
Hlavním rysem chirurgických tmelů je zvýšení srážlivosti krve a zároveň snížení krevních ztrát. Bezztrátová koagulace v NFRCS byla hodnocena pomocí dříve publikované metody s drobnými úpravami 19. Vyrobte mikrozkumavku (2 ml) (vnitřní průměr 10 mm) s otvorem 8 × 5 mm2 na jedné straně zkumavky (představujícím otevřenou ránu). K uzavření otvoru se použije NFRCS a k utěsnění vnějších okrajů páska. Do mikrozkumavky obsahující 3,8% premix citrátu sodného se přidá 20 µl 0,2 M CaCl2. Po 10 minutách byly mikrozkumavky vyjmuty z misek a byl stanoven nárůst hmotnosti misek v důsledku odtoku krve z NFRK (n = 3). Ztráta krve Ch NFRCS a Cp NFRCS byly porovnány s Cs.
Mokrá integrita NFRCS byla stanovena na základě metody popsané Mishra a Chaudhary21 s drobnými úpravami. NFRCS byl umístěn do 100ml Erlenmeyerovy baňky s 50 ml vody a vířen po dobu 60 sekund, aniž by se vytvořil víčko. Vizuální kontrola a stanovení priority vzorků z hlediska fyzické integrity na základě odběru.
Vazebná síla HFFC k Ct byla studována za použití dříve publikovaných metod s drobnými úpravami. Integrita povrchového povlaku byla posouzena vystavením NFRK akustickým vlnám (vnější stimul) v přítomnosti vody milliQ (Ct). Vyvinuté NFRCS Ch NFRCS a Cp NFRCS byly umístěny do kádinky naplněné vodou a sonikovány po dobu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 a 30 minut. Po vysušení byl procentuální rozdíl mezi počáteční a konečnou hmotností NFRCS použit k výpočtu procentuální ztráty materiálu (HFFC). In vitro BCT dále podpořil vazebnou sílu nebo ztrátu povrchových materiálů. Účinnost vazby HFFC na Ct zajišťuje srážení krve a elastický povlak na povrchu Ct22.
Homogenita vyvinutého NFRCS byla stanovena pomocí BCT vzorků (30 mg) odebraných z náhodně vybraných obecných míst NFRCS. Pro určení shody s NFRCS postupujte podle výše uvedeného postupu BCT. Blízkost mezi všemi pěti vzorky zajišťuje rovnoměrné pokrytí povrchu a depozici HFFC v síti Ct.
Nominální kontaktní plocha s krví (NBCA) byla stanovena dle dříve popsané metody s určitými úpravami. Krev se sráží vložením 20 µl krve mezi dva povrchy Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs. Po 1 hodině byly obě části stentu odděleny a ručně změřena plocha sraženiny. Průměrná hodnota ze tří opakování byla považována za NBCA NFRCS19.
Pro vyhodnocení účinnosti NFRCS absorbovat vodu z vnějšího prostředí nebo z místa poranění, které je zodpovědné za zahájení koagulace, byla použita analýza dynamické sorpce par (DVS). DVS vyhodnocuje nebo zaznamenává příjem a ztrátu par ve vzorku gravimetricky pomocí ultracitlivé váhy s hmotnostním rozlišením ±0,1 µg. Parciální tlak par (relativní vlhkost) je generován elektronickým regulátorem hmotnostního průtoku kolem vzorku smícháním nasycených a suchých nosných plynů. Podle pokynů Evropského lékopisu byly vzorky na základě procentuální absorpce vlhkosti rozděleny do 4 kategorií (0–0,012 % hm./hm. – nehygroskopické, 0,2–2 % hm./hm. mírně hygroskopické, 2–15 % středně hygroskopické a > 15 % velmi hygroskopické)23. Podle pokynů Evropského lékopisu byly vzorky na základě procentuální absorpce vlhkosti rozděleny do 4 kategorií (0–0,012 % hm./hm. – nehygroskopické, 0,2–2 % hm./hm. mírně hygroskopické, 2–15 % středně hygroskopické a > 15 % velmi hygroskopické)23.V souladu s doporučeními Evropského lékopisu byly vzorky v závislosti na procentu absorpce vlhkosti rozděleny do 4 kategorií (0–0,012 % h/h – nehygroskopické, 0,2–2 % h/h mírně hygroskopické, 2–patnáct %).% умеренно гигроскопичен a > 15 % очень гигроскопичен)23. % mírně hygroskopických a > 15 % velmi hygroskopických)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品分为4 类（0-0,012 % t/d非吸湿性、0,2–2 % t/t 轻微吸湿性、2–15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为 分︺ 刻12% 爻02% 的W/w- 吸湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸3㹿）2V souladu s doporučeními Evropského lékopisu jsou vzorky rozděleny do 4 tříd v závislosti na procentu absorbované vlhkosti vzorkem (0–0,012 % hmotnostních – nehygroskopické, 0,2–2 % hmotnostní mírně hygroskopické, 2–15 % hmotnostních).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % mírně hygroskopické, > 15 % velmi hygroskopické) 23.Hygroskopická účinnost NFCS X NFCS a TsN NFCS byla stanovena na analyzátoru DVS TA TGA Q5000 SA. Během tohoto procesu byla získána doba běhu, relativní vlhkost (RH) a hmotnost vzorku v reálném čase při 25 °C24. Obsah vlhkosti se vypočítá přesnou hmotnostní analýzou NFRCS pomocí následující rovnice:
MC je vlhkost v NFRCS. m1 – suchá hmotnost NSAID. m2 je hmotnost v NFRCS v reálném čase při dané relativní vlhkosti.
Celková povrchová plocha byla odhadnuta pomocí experimentu s adsorpcí dusíku s kapalným dusíkem po vyprázdnění vzorků při teplotě 25 °C po dobu 10 hodin (< 7 × 10–3 Torr). Celková povrchová plocha byla odhadnuta pomocí experimentu s adsorpcí dusíku s kapalným dusíkem po vyprázdnění vzorků při teplotě 25 °C po dobu 10 hodin (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адисиорбиоц азотом после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Celková povrchová plocha byla odhadnuta pomocí experimentu s adsorpcí dusíku kapalným dusíkem po vyprázdnění vzorků při teplotě 25 °C po dobu 10 hodin (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 torrů在 25 °C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов потиброадоадо жидким азотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 тор). Celková povrchová plocha byla odhadnuta pomocí experimentů s adsorpcí dusíku s kapalným dusíkem po 10 hodinách vyprázdnění vzorků při teplotě 25 °C (< 7 x 10-3 torr).Celková plocha povrchu, objem pórů a velikost pórů NFRCS byly stanoveny pomocí přístroje Quantachrome od společnosti NOVA 1000e, Rakousko, s použitím softwaru RS 232.
Z plné krve připravte 5% erytrocytů (s fyziologickým roztokem jako ředidlem). Poté přeneste alikvotní podíl HFFC (0,25 ml) a 5% hmotnostních erytrocytů (0,1 ml) na 96jamkovou destičku. Směs inkubujte při 37 °C po dobu 40 minut. Směs červených krvinek a séra byla považována za pozitivní kontrolu a směs fyziologického roztoku a červených krvinek za negativní kontrolu. Hemaglutinace byla stanovena podle Stajitzkyho stupnice. Navrhované stupnice jsou následující: + + + + husté granulární agregáty; + + + hladké spodní polštářky se zakřivenými okraji; + + hladké spodní polštářky s roztrženými okraji; + úzké červené kroužky kolem okrajů hladkých polštářků; – (negativní) diskrétní červené tlačítko 12 uprostřed spodní jamky.
Hemokompatibilita NFRCS byla studována podle metody Mezinárodní organizace pro normalizaci (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27. Gravimetrická metoda byla popsaná Singhem a kol. Byly provedeny drobné úpravy pro posouzení tvorby trombu v přítomnosti nebo na povrchu NFRCS. 500 mg Cs, Ch NFRCS a Cp NFRCS bylo inkubováno ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) po dobu 24 hodin při 37 °C. Po 24 hodinách byl PBS odstraněn a NFRCS byl ošetřen 2 ml krve obsahující 3,8 % citrátu sodného. Na povrch NFRCS bylo k inkubovaným vzorkům přidáno 0,04 ml 0,1 M CaCl2. Po 45 minutách bylo přidáno 5 ml destilované vody k zastavení koagulace. Sražená krev na povrchu NFRK byla ošetřena 36-38% roztokem formaldehydu. Sraženiny fixované formaldehydem byly vysušeny a zváženy. Procento trombózy bylo odhadnuto výpočtem hmotnosti sklenice bez krve a vzorku (negativní kontrola) a sklenice s krví (pozitivní kontrola).
Pro úvodní potvrzení byly vzorky vizualizovány pod optickým mikroskopem, aby se zjistila schopnost povrchového povlaku HFFC, propojení Ct a sítě Ct vytvářet póry. Tenké řezy Ch a Cp z NFRCS byly oříznuty skalpelem. Výsledný řez byl umístěn na podložní sklíčko, zakryt krycím sklíčkem a okraje byly zafixovány lepidlem. Připravené sklíčka byly prohlíženy pod optickým mikroskopem a fotografie byly pořízeny při různém zvětšení.
Depozice polymerů v Ct sítích byla vizualizována pomocí fluorescenční mikroskopie na základě metody popsané Rice et al.29. Složení HFFC použité pro formulaci bylo smícháno s fluorescenčním barvivem (amarantem) a NFRCS (Ch a Cp) byly připraveny dle výše uvedené metody. Složení HFFC použité pro formulaci bylo smícháno s fluorescenčním barvivem (amarantem) a NFRCS (Ch a Cp) byly připraveny dle výše uvedené metody.Složení HFFC použité pro formulaci bylo smícháno s fluorescenčním barvivem (amarantem) a NFRCS (Ch a Cp) byl získán podle výše uvedené metody.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前提到到的方椼到的方椼到的方椼Cp).将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前提到到的方椼到的方椼到的方椼Cp).Složení HFFC použité ve formulaci bylo smícháno s fluorescenčním barvivem (amaranth) a přidáno NFRCS (Ch a Cp), jak bylo zmíněno dříve.Z získaných vzorků byly nařezány tenké řezy NFRK, umístěny na podložní sklíčka a zakryty krycími sklíčky. Připravená sklíčka pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem s použitím zeleného filtru (310-380 nm). Snímky byly pořízeny při 4násobném zvětšení, aby se pochopily vztahy Ct a nadměrná depozice polymerů v síti Ct.
Povrchová topografie NFRCS Ch a Cp byla stanovena pomocí mikroskopu atomárních sil (AFM) s ultraostrou konzolou TESP v režimu poklepávání: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Tchaj-wan. Drsnost povrchu byla stanovena pomocí efektivní hodnoty drsnosti povrchu (RMS) pomocí softwaru (Scanning Probe Image Processor). Různá umístění NFRCS byla vykreslena na 3D snímcích pro kontrolu rovnoměrnosti povrchu. Standardní odchylka skóre pro danou oblast je definována jako drsnost povrchu. Rovnice RMS byla použita pro kvantifikaci drsnosti povrchu NFRCS31.
Studie založené na FESEM byly provedeny s použitím FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, za účelem pochopení povrchové morfologie Ch NFRCS a Cp NFRCS, které vykazovaly lepší BCT než Cm NFRCS. Studie FESEM byla provedena podle metody popsané Zhao et al.32 s drobnými úpravami. NFRCS 20 až 30 mg Ch NFRCS a Cp NFRCS bylo předem smícháno s 20 µl 3,8% citrátu sodného předem smíchaného s krví potkanů. Do vzorků ošetřené krve bylo přidáno 20 μl 0,2 M CaCl2 pro zahájení koagulace a vzorky byly inkubovány při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Kromě toho byly přebytečné erytrocyty z povrchu NFRCS odstraněny opláchnutím fyziologickým roztokem.
Následné vzorky byly ošetřeny 0,1% glutaraldehydem a poté sušeny v horkovzdušné peci při teplotě 37 °C za účelem odstranění vlhkosti. Vysušené vzorky byly potaženy a analyzovány 32. Dalšími snímky získanými během analýzy byla tvorba sraženiny na povrchu jednotlivých bavlněných vláken, ukládání polymeru mezi Ct, morfologie (tvar) erytrocytů, integrita sraženiny a morfologie erytrocytů v přítomnosti NFRCS. Neošetřené oblasti NFRCS a oblasti NFRCS ošetřené Ch a Cp inkubované s krví byly skenovány na elementární ionty (sodík, draslík, dusík, vápník, hořčík, zinek, měď a selen) 33. Porovnejte procenta elementárních iontů mezi ošetřenými a neošetřenými vzorky, abyste pochopili akumulaci elementárních iontů během tvorby sraženiny a homogenitu sraženiny.
Tloušťka povrchové vrstvy Cp HFFC na povrchu Ct byla stanovena pomocí FESEM. Průřezy Cp NFRCS byly vyříznuty z konstrukce a naprašovány. Výsledné vzorky naprašované vrstvy byly pozorovány pomocí FESEM a byla změřena tloušťka povrchové vrstvy 34, 35, 36.
Rentgenové mikro-CT poskytuje nedestruktivní 3D zobrazování s vysokým rozlišením a umožňuje studovat vnitřní strukturální uspořádání NFRK. Mikro-CT využívá rentgenový paprsek procházející vzorkem k zaznamenání lokálního lineárního koeficientu útlumu rentgenového záření ve vzorku, což pomáhá získat morfologické informace. Vnitřní umístění Ct v Cp NFRCS a Cp NFRCS ošetřené krví bylo zkoumáno pomocí mikro-CT za účelem pochopení účinnosti absorpce a srážení krve v přítomnosti NFRCS37,38,39. 3D struktury vzorků Cp NFRCS ošetřené krve a neošetřené krve byly rekonstruovány pomocí mikro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Německo). Pomocí softwaru VG STUDIO-MAX verze 2.2 bylo pořízeno několik rentgenových snímků z různých úhlů (ideálně s 360° pokrytím) pro vytvoření 3D obrazů pro NFRCS. Shromážděná projekční data byla rekonstruována do 3D volumetrických obrazů pomocí odpovídajícího jednoduchého softwaru 3D ScanIP Academic.
Kromě toho bylo pro pochopení distribuce sraženiny do NFRCS přidáno 20 µl předem smíchané citrátové krve a 20 µl 0,2 M CaCl2 pro zahájení srážení krve. Připravené vzorky se nechaly ztvrdnout. Povrch NFRK byl ošetřen 0,5% glutaraldehydem a sušen v horkovzdušné peci při teplotě 30–40 °C po dobu 30 minut. Krevní sraženina vytvořená na NFRCS byla naskenována, rekonstruována a byl vizualizován 3D obraz krevní sraženiny.
Antibakteriální testy byly provedeny na Cp NFRCS (nejlépe srovnatelném s Ch NFRCS) za použití dříve popsané metody s drobnými úpravami. Antibakteriální aktivita Cp NFRCS a Cp HFFC byla stanovena za použití tří různých testovacích mikroorganismů [S. aureus (grampozitivní bakterie), E. coli (gramnegativní bakterie) a bílá Candida (C. albicans)] rostoucích na agaru v Petriho miskách v inkubátoru. Rovnoměrně naočkujte 50 ml zředěné suspenze bakteriální kultury o koncentraci 105-106 CFU ml-1 na agarové médium. Médium nalijte do Petriho misky a nechte ztuhnout. Na povrchu agarové plotny byly vytvořeny jamky pro naplnění HFFC (3 jamky pro HFFC a 1 pro negativní kontrolu). Do 3 jamek přidejte 200 µl HFFC a do 4. jamky 200 µl PBS o pH 7,4. Na druhou stranu Petriho misky umístěte na ztuhlý agar 12mm disk Cp NFRCS a navlhčete ho PBS (pH 7,4). Tablety ciprofloxacinu, ampicilinu a flukonazolu jsou považovány za referenční standardy pro Staphylococcus aureus, Escherichia coli a Candida albicans. Změřte inhibiční zónu manuálně a pořiďte její digitální snímek.
Po schválení etickou komisí institucí byla studie provedena na Kasturba Medical College of Education and Research v Manipalu v Karnátake v jižní Indii. Experimentální protokol in vitro TEG byl přezkoumán a schválen Institucionální etickou komisí Kasturba Medical College v Manipalu v Karnátake (IEC: 674/2020). Subjekty byly rekrutovány z řad dobrovolných dárců krve (ve věku 18 až 55 let) z nemocniční krevní banky. Kromě toho byl od dobrovolníků získán informovaný souhlas s odběrem vzorků krve. Nativní TEG (N-TEG) ​​byl použit ke studiu vlivu formulace Cp HFFC na plnou krev předem smíchanou s citrátem sodným. N-TEG je široce uznáván pro svou roli v resuscitaci v místě péče, což lékařům vytváří problémy kvůli možnému klinicky významnému zpoždění výsledků (běžné koagulační testy). Analýza N-TEG byla provedena s použitím plné krve. Od všech účastníků byl získán informovaný souhlas a podrobná anamnéza. Studie nezahrnovala účastníky s hemostatickými nebo trombotickými komplikacemi, jako je těhotenství/poporodní období nebo onemocnění jater. Ze studie byli rovněž vyloučeni subjekty užívající léky ovlivňující koagulační kaskádu. U všech účastníků byly provedeny základní laboratorní testy (hemoglobin, protrombinový čas, aktivovaný tromboplastin a počet krevních destiček) podle standardních postupů. N-TEG určuje viskoelasticitu krevní sraženiny, počáteční strukturu sraženiny, interakci částic, zpevnění sraženiny a lýzu sraženiny. Analýza N-TEG poskytuje grafická a numerická data o kolektivních účincích několika buněčných prvků a plazmy. Analýza N-TEG byla provedena na dvou různých objemech Cp HFFC (10 µl a 50 µl). Výsledkem bylo přidání 1 ml plné krve s kyselinou citronovou k 10 μl Cp HFFC. Do misky s TEG s 20 µl 0,2 M CaCl2 přidejte 1 ml (Cp HFFC + citrátovaná krev) a 340 µl smíšené krve. Poté byly misky TEG vloženy do přístroje TEG® 5000, US, aby se změřily R, K, úhel alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY u 30 % vzorků krve za přítomnosti Cp HFFC41.
Protokol studie in vivo byl přezkoumán a schválen Institucionálním výborem pro etiku zvířat (IAEC), Lékařské fakulty Kasturba, Manipalského institutu vyššího vzdělávání, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Všechny experimenty na zvířatech byly provedeny v souladu s doporučeními Výboru pro kontrolu a dohled nad experimenty na zvířatech (CPCSEA). Všechny studie NFRCS in vivo (2 × 2 cm2) byly provedeny na samicích potkanů ​​Wistar (o hmotnosti 200 až 250 g). Všechna zvířata byla aklimatizována při teplotě 24–26 °C, zvířata měla volný přístup ke standardní potravě a vodě ad libitum. Všechna zvířata byla náhodně rozdělena do různých skupin, každá skupina se skládala ze tří zvířat. Všechny studie byly provedeny v souladu se Zprávou o experimentech in vivo 43 ze studie Animal Studies: Report of In Vivo Experiments. Před studií byla zvířata anestetizována intraperitoneálním (ip) podáním směsi 20-50 mg ketaminu (na 1 kg tělesné hmotnosti) a 2-10 mg xylazinu (na 1 kg tělesné hmotnosti). Po studii byl objem krvácení vypočítán vyhodnocením rozdílu mezi počáteční a konečnou hmotností vzorků, přičemž průměrná hodnota získaná ze tří testů byla vzata jako objem krvácení vzorku.
Pro pochopení potenciálu NFRCS modulovat krvácení při traumatu, boji nebo dopravní nehodě (model zranění) byl implementován model amputace ocasu krysy. Skalpelem odřízněte 50 % ocasu a na 15 sekund jej umístěte na vzduch, aby se zajistilo normální krvácení. Kromě toho byly na ocas krysy tlakem umístěny testovací vzorky (Ct, Cs, Ch NFRCS a Cp NFRCS). U testovaných vzorků bylo hlášeno krvácení a PCT (n = 3)17,45.
Účinnost kontroly tlaku pomocí NFRCS v boji byla zkoumána na modelu povrchové femorální tepny. Femorální tepna byla odkryta, propíchnuta trokarem 24G a do 15 sekund byla odebrána krvácení. Po zjištění nekontrolovaného krvácení byl testovaný vzorek umístěn na místo vpichu s tlakem. Ihned po aplikaci testovaného vzorku byl zaznamenán čas srážení a po dobu dalších 5 minut byla sledována hemostatická účinnost. Stejný postup byl opakován s Cs a Ct46.
Dowling a kol.47 navrhli model poškození jater pro posouzení hemostatického potenciálu hemostatických materiálů v kontextu intraoperačního krvácení. BCT (bodová hladina jater) byla zaznamenána u vzorků Ct (negativní kontrola), Cs framework (pozitivní kontrola), Ch NFRCS a Cp NFRCS. Suprahepatální vena cava krysy byla odkryta provedením mediánní laparotomie. Poté byla distální část levého laloku vyříznuta nůžkami. Skalpelem byl proveden řez v játrech a nechán několik sekund krvácet. Přesně zvážené testovací vzorky Ch NFRCS a Cp NFRCS byly umístěny na poškozený povrch bez jakéhokoli pozitivního tlaku a byla zaznamenána BCT. Kontrolní skupina (Ct) poté aplikovala tlak a následně Cs 30 s47 bez porušení poranění.
In vivo testy hojení ran byly provedeny s použitím modelu excizní rány za účelem vyhodnocení hojivých vlastností vyvinutých polymerních NFRCS. Modely excizních ran byly vybrány a provedeny podle dříve publikovaných metod s drobnými úpravami19,32,48. Všechna zvířata byla anestetizována, jak bylo popsáno dříve. Pomocí bioptické raznice (12 mm) byl proveden kruhový hluboký řez do kůže na zádech. Připravená místa rány byla ošetřena Cs (pozitivní kontrola), Ct (s vědomím, že vatové tampony narušují hojení), Ch NFRCS a Cp NFRCS (experimentální skupina) a negativní kontrola bez jakékoli léčby. Každý den studie byla u všech potkanů ​​změřena plocha rány. Pomocí digitálního fotoaparátu byla vyfocena oblast rány a aplikován nový obvaz. Procento uzavření rány bylo měřeno podle následujícího vzorce:
Na základě procentuálního uzavření rány 12. den studie byla z nejlepší skupiny potkanů ​​((Cp NFRCS) a kontrolní skupiny) vyříznuta kůže a studována barvením H&E a Massonovým trichromovým barvením. Na základě procentuálního uzavření rány 12. den studie byla z nejlepší skupiny potkanů ​​((Cp NFRCS) a kontrolní skupiny) vyříznuta kůže a studována barvením H&E a Massonovým trichromovým barvením.Na základě procentuálního uzavření rány 12. den studie byla u krys nejlepší skupiny ((Cp NFRCS) a kontrolní skupiny) vyříznuta kůže a vyšetřena barvením hematoxylin-eosinem a Massonovým trichromem.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和Masson三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的大鼠皮肤，进行H&E染色和眳组）Krysy v nejlepší skupině ((Cp NFRCS) a kontrolní skupině) byly 12. den studie vyříznuty pro barvení hematoxylinem-eosinem a barvení Massonovým trichromem na základě procentuálního uzavření rány.Použitý postup barvení byl proveden podle dříve popsaných metod49,50. Stručně řečeno, po fixaci v 10% formalínu byly vzorky dehydratovány pomocí řady odstupňovaných alkoholů. Pomocí mikrotomu byly získány tenké řezy (o tloušťce 5 µm) vyříznuté tkáně. Tenké sériové řezy kontrolních vzorků a Cp NFRCS byly ošetřeny hematoxylinem a eosinem pro studium histopatologických změn. Massonovo trichromové barvení bylo použito k detekci tvorby kolagenních fibril. Získané výsledky byly patology studovány naslepo.
Stabilita vzorků Cp NFRCS byla studována při pokojové teplotě (25 °C ± 2 °C/60 % relativní vlhkosti ± 5 %) po dobu 12 měsíců51. Cp NFRCS (změna barvy povrchu a mikrobiální růst) byl vizuálně zkontrolován a testován na odolnost proti opotřebení v přehybu a BCT podle výše uvedených metod popsaných v části Materiály a metody.
Škálovatelnost a reprodukovatelnost Cp NFRCS byla zkoumána přípravou Cp NFRCS o velikosti 15 × 15 cm2. Kromě toho byly z různých frakcí Cp NFRCS odebrány vzorky o hmotnosti 30 mg (n = 5) a BCT studovaných vzorků byl vyhodnocen, jak je popsáno dříve v části Metody.
Pokusili jsme se vyvinout různé tvary a struktury s použitím kompozic Cp NFRCS pro různé biomedicínské aplikace. Mezi takové tvary nebo konfigurace patří kuželovité tampony pro krvácení z nosu, zubní zákroky a válcové tampony pro vaginální krvácení.
Všechny datové soubory jsou vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka a byly analyzovány pomocí ANOVA s použitím programu Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) a následně Bonferroniho testu vícenásobného srovnání (*p<0,05).
Všechny postupy provedené v rámci studií na lidech byly v souladu se standardy Institutu a Národní výzkumné rady, jakož i s Helsinskou deklarací z roku 1964 a jejími následnými dodatky nebo podobnými etickými standardy. Všichni účastníci byli informováni o charakteru studie a její dobrovolné povaze. Údaje o účastnících zůstávají po jejich shromáždění důvěrné. Experimentální protokol in vitro TEG byl přezkoumán a schválen etickou komisí Institucionální léčebné komise Lékařské fakulty Kasturba v Manipalu v Karnátake (IEC: 674/2020). Dobrovolníci podepsali informovaný souhlas s odběrem vzorků krve.
Všechny postupy provedené ve studiích na zvířatech byly provedeny v souladu s pokyny Lékařské fakulty Kastuba, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020). Všechny navržené experimenty na zvířatech byly provedeny v souladu s pokyny Výboru pro kontrolu a dohled nad experimenty na zvířatech (CPCSEA). Všichni autoři se řídí pokyny ARRIVE.
FTIR spektra všech NFRCS byla analyzována a porovnána se spektrem chitosanu znázorněným na obrázku 2A. Charakteristické spektrální píky chitosanu (zaznamenané) při 3437 cm-1 (protažení OH a NH, překrytí), 2945 a 2897 cm-1 (protažení CH), 1660 cm-1 (deformace NH2), 1589 cm-1 (ohyb N–H), 1157 cm-1 (protažení můstku O-), 1067 cm-1 (protažení C–O, sekundární hydroxyl), 993 cm-1 (protažení CO, Bo-OH) 52,53,54. Doplňková tabulka S1 ukazuje hodnoty absorpčního spektra FTIR NFRCS pro chitosan (reportér), čistý chitosan, Cm, Ch a Cp. FTIR spektra všech NFRCS (Cm, Ch a Cp) vykazovala stejné charakteristické absorpční pásy jako čistý chitosan bez jakýchkoli významných změn (obr. 2A). Výsledky FTIR potvrdily absenci chemických nebo fyzikálních interakcí mezi polymery použitými k vývoji NFRCS, což naznačuje, že použité polymery jsou inertní.
In vitro charakterizace Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs. (A) představuje kombinovaná FTIR spektra složení chitosanu a Cm NFRCS, Ch NFRCS a Cp NFRCS za komprese. (B) a) Rychlost absorpce plné krve v NFRCS Cm, Ch, Cp a Cg (n = 3); Vzorky Ct vykazovaly vyšší BAR, protože vatový tampon má vyšší absorpční účinnost; b) Krev po absorpci krve. Ilustrace absorbovaného vzorku. Grafické znázornění BCT testovaného vzorku C (Cp NFRCS měl nejlepší BCT (15 s, n = 3)). Data v C, D, E a G byla uvedena jako průměr ± SD a chybové úsečky představují SD, ***p < 0,0001. Data v C, D, E a G byla uvedena jako průměr ± SD a chybové úsečky představují SD, ***p < 0,0001. Данные в C, D, E a G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки поЎтрейпЏстрейнос стандартное отклонение, ***p <0,0001. Data v C, D, E a G jsou prezentována jako průměr ± směrodatná odchylka a chybové úsečky představují směrodatnou odchylku, ***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E a G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки погрере представляют стандартное отклонение, ***p <0,0001. Data v C, D, E a G jsou uvedena jako průměr ± směrodatná odchylka, chybové úsečky představují směrodatnou odchylku, ***p<0,0001.