Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Nekontrolované krvácení je jednou z hlavních příčin úmrtí.Dosažení rychlé hemostázy zajišťuje přežití subjektu jako první pomoc během boje, dopravních nehod a operací na snížení úmrtí.Nanoporézní vlákny vyztužené kompozitní lešení (NFRCS) odvozené z jednoduché hemostatické filmotvorné kompozice (HFFC) jako kontinuální fáze může spustit a zlepšit hemostázu.Vývoj NFRCS je založen na konstrukci křídla vážky.Struktura křídla vážky se skládá z příčných a podélných křídel a membrány křídel jsou vzájemně spojeny, aby byla zachována integrita mikrostruktury.HFFC rovnoměrně pokrývá povrch vlákna filmem o tloušťce nanometrů a spojuje náhodně rozloženou tloušťku bavlny (Ct) (dispergovaná fáze) za vzniku nanoporézní struktury.Kombinace kontinuální a dispergované fáze snižuje cenu produktu desetkrát ve srovnání s komerčně dostupnými produkty.Modifikované NFRCS (tampony nebo náramky) lze použít v různých biomedicínských aplikacích.Studie in vivo dospěly k závěru, že vyvinutý Cp NFRCS spouští a zvyšuje koagulační proces v místě aplikace.NFRCS může modulovat mikroprostředí a působit na buněčné úrovni díky své nanoporézní struktuře, což vede k lepšímu hojení ran v modelu excisní rány.
Nekontrolované krvácení během bojových, intraoperačních a mimořádných situací může představovat vážné ohrožení života raněných1.Tyto stavy dále vedou k celkovému zvýšení periferní vaskulární rezistence, což vede ke hemoragickému šoku.Vhodná opatření ke kontrole krvácení během a po operaci jsou považována za potenciálně život ohrožující2,3.Poškození velkých cév vede k masivní ztrátě krve, což má za následek úmrtnost ≤ 50 % v boji a 31 % během operace1.Masivní ztráta krve vede ke snížení objemu těla, což snižuje srdeční výdej.Zvýšení celkové periferní vaskulární rezistence a progresivní zhoršení mikrocirkulace vede k hypoxii orgánů podporujících život.Hemoragický šok může nastat, pokud stav pokračuje bez účinné intervence1,4,5.Mezi další komplikace patří progrese hypotermie a metabolické acidózy a také porucha koagulace, která brání procesu koagulace.Těžký hemoragický šok je spojen s vyšším rizikem úmrtí6,7,8.U šoku stupně III (progresivního) je krevní transfuze nezbytná pro přežití pacienta během intraoperační a pooperační morbidity a mortality.Abychom překonali všechny výše uvedené život ohrožující situace, vyvinuli jsme nanoporézní kompozitní lešení vyztužené vlákny (NFRCS), které využívá minimální koncentraci polymeru (0,5 %) pomocí kombinace ve vodě rozpustných hemostatických polymerů.
S použitím vláknité výztuže lze vyvinout cenově výhodné produkty.Náhodně uspořádaná vlákna připomínají strukturu křídla vážky, vyváženou vodorovnými a svislými pruhy na křídlech.Příčné a podélné žíly křídla komunikují s membránou křídla (obr. 1).NFRCS se skládá z vyztuženého Ct jako systému lešení s lepší fyzikální a mechanickou pevností (obrázek 1).Vzhledem k cenové dostupnosti a řemeslnému provedení chirurgové preferují při operacích a převazech používání bavlněných nití (Ct). S ohledem na jeho četné výhody, včetně > 90 % krystalické celulózy (přispívá ke zvýšení hemostatické aktivity), byl Ct použit jako kosterní systém NFRCS9,10. S ohledem na jeho četné výhody, včetně > 90 % krystalické celulózy (přispívá ke zvýšení hemostatické aktivity), byl Ct použit jako kosterní systém NFRCS9,10. Следовательно, учитывая его многочисленные преимущества, v том числе > 90% криселюлолцесленные частвует в повышении гемостатической активности), Ct использовали, в качестве скелетнойCS9. Vzhledem k mnoha výhodám, včetně >90% krystalické celulózy (podílí se na zvýšené hemostatické aktivitě), byl proto Ct použit jako kosterní systém NFRCS9,10.因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 % 的结晶纤维素（有助于增Ｚ滜衫洴稔NF ,10 的骨架系统。因此，考虑到它的多重益处，包括> 90 %Proto, vzhledem k mnoha výhodám, včetně více než 90% krystalické celulózy (pomáhá zvýšit hemostatickou aktivitu), byl Ct použit jako lešení pro NFRCS9,10.Ct byl povrchově potažen (byla pozorována tvorba nano-silného filmu) a propojen s hemostatickou filmotvornou kompozicí (HFFC).HFFC působí jako matrigel, drží náhodně umístěné Ct pohromadě.Vyvinutá konstrukce přenáší napětí v rozptýlené fázi (výztužná vlákna).Při použití minimálních koncentrací polymeru je obtížné získat nanoporézní struktury s dobrou mechanickou pevností.Kromě toho není snadné přizpůsobit různé formy pro různé biomedicínské aplikace.
Obrázek ukazuje schéma návrhu NFRCS založeného na konstrukci křídla vážky (A).Tento obrázek ukazuje komparativní analogii struktury křídla vážky (protínající se a podélné žíly křídla jsou propojeny) a průřezovou fotomikrografii Cp NFRCS (B).Schematické znázornění NFRCS.
NFRC byly vyvinuty s použitím HFFC jako kontinuální fáze, aby se vyřešila výše uvedená omezení.HFFC se skládá z různých filmotvorných hemostatických polymerů včetně chitosanu (jako hlavního hemostatického polymeru) s methylcelulózou (MC), hydroxypropylmethylcelulózou (HPMC 50 cp) a polyvinylalkoholem (PVA)) (125 kDa) jako podpůrným polymerem, který podporuje tvorbu trombu.formace.Přídavek polyvinylpyrrolidinu K30 (PVP K30) zlepšil schopnost NFRCS absorbovat vlhkost.Polyethylenglykol 400 (PEG 400) byl přidán pro zlepšení zesíťování polymeru ve vázaných polymerních směsích.Na Ct byly aplikovány tři různé hemostatické kompozice HFFC (Cm HFFC, Ch HFFC a Cp HFFC), konkrétně chitosan s MC (Cm), chitosan s HPMC (Ch) a chitosan s PVA (Cp).Různé in vitro a in vivo charakterizační studie potvrdily hemostatickou aktivitu NFRCS a aktivitu při hojení ran.Kompozitní materiály nabízené NFRCS lze použít k přizpůsobení různých forem lešení tak, aby vyhovovaly specifickým potřebám.
Kromě toho lze NFRCS upravit jako obvaz nebo váleček, aby pokryl celou oblast poranění dolních končetin a dalších částí těla.Speciálně pro bojová zranění končetin lze navržený design NFRCS změnit na polovinu paže nebo celou nohu (doplňkový obrázek S11).Z NFRCS lze vyrobit náramek s tkáňovým lepidlem, který lze použít k zastavení krvácení při těžkých sebevražedných poraněních zápěstí.Naším hlavním cílem je vyvinout NFRCS s co nejmenším množstvím polymerů, které lze dodat velké populaci (pod hranicí chudoby) a které lze umístit do lékárničky.Jednoduchý, efektivní a ekonomický design NFRCS prospívá místním komunitám a může mít globální dopad.
Chitosan (molekulová hmotnost 80 kDa) a amarant byly zakoupeny od společnosti Merck, Indie.Hydroxypropylmethylcelulóza 50 Cp, polyethylenglykol 400 a methylcelulóza byly zakoupeny od Loba Chemie Pvt.LLC, Bombaj.Polyvinylalkohol (molekulová hmotnost 125 kDa) (87-90% hydrolyzovaný) byl zakoupen od National Chemicals, Gujarat.Polyvinylpyrrolidin K30 byl zakoupen od Molychem, Mumbai, sterilní tampony byly zakoupeny od Ramaraju Surgery Cotton Mills Ltd., Tamil Nadu, s vodou Milli Q (Direct-Q3 water purification system, Merck, India) jako nosičem.
NFRCS byl vyvinut pomocí lyofilizační metody11,12.Všechny kompozice HFFC (tabulka 1) byly připraveny za použití mechanického míchadla.Připravte 0,5% roztok chitosanu za použití 1% kyseliny octové ve vodě za stálého míchání při 800 otáčkách za minutu na mechanickém míchadle.Přesná hmotnost naneseného polymeru uvedená v tabulce 1 byla přidána k roztoku chitosanu a míchána, dokud nebyl získán čirý roztok polymeru.K výsledné směsi byly přidány PVP K30 a PEG 400 v množstvích uvedených v tabulce 1 a míchání pokračovalo, dokud nebyl získán čirý roztok viskózního polymeru.Výsledná lázeň roztoku polymeru byla sonikována po dobu 60 minut, aby se odstranily zachycené vzduchové bubliny z polymerní směsi.Jak je znázorněno na doplňkovém obrázku S1 (b), Ct byl rovnoměrně distribuován v každé jamce 6-jamkové destičky (formy) doplněné 5 ml HFFC.
Šestijamková destička byla sonikována po dobu 60 minut, aby se dosáhlo rovnoměrného smáčení a distribuce HFFC v Ct síti.Poté zmrazte šestijamkovou destičku při -20 °C na 8-12 hodin.Zmrazovací destičky byly lyofilizovány po dobu 48 hodin, aby se získaly různé formulace NFRCS.Stejný postup se používá k výrobě různých tvarů a struktur, jako jsou tampony nebo válcové tampony nebo jakýkoli jiný tvar pro různé aplikace.
Přesně navážený chitosan (80 kDa) (3 %) se rozpustí v 1% kyselině octové za použití magnetického míchadla.K výslednému roztoku chitosanu byl přidán 1% PEG 400 a míchán po dobu 30 minut.Výsledný roztok nalijte do čtvercové nebo obdélníkové nádoby a zmrazte při -80 °C po dobu 12 hodin.Zmrazené vzorky byly lyofilizovány po dobu 48 hodin, aby se získal porézní Cs13.
Vyvinutý NFRCS byl podroben experimentům využívajícím infračervenou spektroskopii s Fourierovou transformací (FTIR) (Shimadzu 8400 s FTIR, Tokio, Japonsko), aby se potvrdila chemická kompatibilita chitosanu s jinými polymery14,15.FTIR spektra (šířka spektrálního rozsahu od 400 do 4000 cm-1) všech testovaných vzorků byla získána provedením 32 skenů.
Rychlost absorpce krve (BAR) pro všechny formulace byla vyhodnocena za použití metody popsané Chen et al.16 s drobnými úpravami.Vyvinuté NFRK všech kompozic byly sušeny ve vakuové sušárně při 105 °C přes noc, aby se odstranilo zbytkové rozpouštědlo.30 mg NFRCS (počáteční hmotnost vzorku – W0) a 30 mg Ct (pozitivní kontrola) bylo umístěno do samostatných misek obsahujících premix 3,8% citrátu sodného.V předem stanovených časových intervalech, tj. 5, 10, 20, 30, 40 a 60 sekund, byly NFRCS odstraněny a jejich povrchy očištěny od nevstřebané krve umístěním vzorků na Ct po dobu 30 sekund.Konečná hmotnost krve absorbované NFRCS 16 byla uvažována (W1) v každém časovém bodě.Vypočítejte procento BAR pomocí následujícího vzorce:
Doba srážení krve (BCT) byla stanovena, jak uvádí Wang et al.17.Doba potřebná pro srážení celé krve (krysí krev předem smíchaná s 3,8% citrátem sodným) v přítomnosti NFRCS byla vypočtena jako BCT testovaného vzorku.Různé složky NFRCS (30 mg) byly umístěny do 10ml lahviček se šroubovacím uzávěrem a inkubovány při 37 °C.Krev (0,5 ml) byla přidána do lahvičky a bylo přidáno 0,3 ml 0,2 M CaCl2 pro aktivaci krevní koagulace.Nakonec lahvičku obraťte každých 15 sekund (až o 180°), dokud se nevytvoří pevná sraženina.BCT vzorku se odhaduje podle počtu flipů17,18.Na základě BCT byly vybrány dvě optimální kompozice z NFRCS Cm, Ch a Cp pro další charakterizační studie.
BCT kompozic Ch NFRCS a Cp NFRCS byla stanovena implementací metody popsané v Li et al.19.Umístěte 15 x 15 mm2 Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs (pozitivní kontrola) do samostatných Petriho misek (37 °C).Krev obsahující 3,8 % citrátu sodného byla smíchána s 0,2 M CaCl2 v objemovém poměru 10:1 pro zahájení procesu srážení krve.20 ul 0,2 M CaCl2 krysí krevní směsi bylo aplikováno na povrch vzorku a umístěno do prázdné Petriho misky.Kontrolou byla krev nalitá do prázdných Petriho misek bez Ct.V pevných intervalech 0, 3 a 5 minut zastavte srážení přidáním 10 ml deionizované (DI) vody do vzorku obsahujícího misku, aniž byste narušili sraženinu.Nesrážlivé erytrocyty (erytrocyty) podléhají hemolýze v přítomnosti deionizované vody a uvolňují hemoglobin.Hemoglobin v různých časových bodech (HA(t)) byl měřen při 540 nm (Amax hemoglobin) pomocí UV-Vis spektrofotometru.Jako referenční standard byla brána absolutní absorpce hemoglobinu (AH(0)) za 0 min. 20 µl krve v 10 ml deionizované vody.Relativní příjem hemoglobinu (RHA) koagulované krve byl vypočten z poměru HA(t)/HA(0) za použití stejné šarže krve.
Pomocí analyzátoru textury (Texture Pro CT V1.3 Build 15, Brookfield, USA) byly stanoveny adhezivní vlastnosti NFRK k poškozené tkáni.Na vnitřní stranu vepřové kůže (bez vrstvy tuku) přitlačte válcovou misku s otevřeným dnem.Vzorky (Ch NFRCS a Cp NFRCS) byly aplikovány pomocí kanyly do válcových forem pro vytvoření adheze ke kůži prasete.Po 3 minutách inkubace při teplotě místnosti (RT) (25 °C) byla zaznamenávána adhezní síla NFRCS konstantní rychlostí 0,5 mm/s.
Hlavním rysem chirurgických tmelů je zvýšení srážlivosti krve a zároveň snížení krevních ztrát.Bezeztrátová koagulace u NFRCS byla hodnocena pomocí dříve publikované metody s mírnými úpravami19.Vytvořte mikrocentrifugační zkumavku (2 ml) (vnitřní průměr 10 mm) s otvorem 8 × 5 mm2 na jedné straně centrifugační zkumavky (představující otevřenou ránu).NFRCS se používá k uzavření otvoru a páska se používá k utěsnění vnějších okrajů.Přidejte 20 µl 0,2 M CaCl2 do mikrocentrifugační zkumavky obsahující premix 3,8% citrátu sodného.Po 10 minutách byly mikrocentrifugační zkumavky vyjmuty z misek a bylo stanoveno zvýšení hmotnosti misek v důsledku odtoku krve z NFRK (n = 3).Krevní ztráta Ch NFRCS a Cp NFRCS byly porovnány s Cs.
Mokrá integrita NFRCS byla stanovena na základě metody popsané Mishra a Chaudhary21 s malými modifikacemi.NFRCS se umístí do 100 ml Erlenmeyerovy baňky s 50 ml vody a míchá se 60 s, aniž by se vytvořila vršek.Vizuální kontrola a stanovení priorit vzorků z hlediska fyzické integrity na základě odběru.
Vazebná síla HFFC k Ct byla studována pomocí dříve publikovaných metod s menšími úpravami.Integrita povrchového povlaku byla hodnocena vystavením NFRK akustickým vlnám (vnější podnět) v přítomnosti milliQ vody (Ct).Vyvinuté NFRCS Ch NFRCS a Cp NFRCS byly umístěny do kádinky naplněné vodou a sonikovány po dobu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, respektive 30 minut.Po vysušení byl procentuální rozdíl mezi počáteční a konečnou hmotností NFRCS použit k výpočtu procenta ztráty materiálu (HFFC).In vitro BCT dále podporovala vazebnou sílu nebo ztrátu povrchových materiálů.Účinnost vazby HFFC na Ct zajišťuje koagulaci krve a elastický povlak na povrchu Ct22.
Homogenita vyvinutého NFRCS byla stanovena pomocí BCT vzorků (30 mg) odebraných z náhodně vybraných obecných míst NFRCS.Pro stanovení shody NFRCS postupujte podle výše uvedeného postupu BCT.Blízkost mezi všemi pěti vzorky zajišťuje rovnoměrné pokrytí povrchu a ukládání HFFC do Ct sítě.
Nominální oblast kontaktu s krví (NBCA) byla stanovena tak, jak bylo uvedeno dříve, s některými modifikacemi.Koagulujte krev upnutím 20 µl krve mezi dva povrchy Ct, Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs.Po 1 hodině byly obě části stentu odděleny a ručně změřena plocha sraženiny.Průměrná hodnota tří opakování byla považována za NBCA NFRCS19.
Analýza dynamické sorpce par (DVS) byla použita k vyhodnocení účinnosti NFRCS absorbovat vodu z vnějšího prostředí nebo z místa poranění odpovědného za iniciaci koagulace.DVS vyhodnocuje nebo zaznamenává absorpci a ztrátu páry ve vzorku gravimetricky pomocí ultracitlivých vah s hmotnostním rozlišením ±0,1 µg.Částečný tlak par (relativní vlhkost) je generován elektronickým regulátorem hmotnostního průtoku kolem vzorku smícháním nasycených a suchých nosných plynů. Podle pokynů Evropského lékopisu byly vzorky na základě procenta absorpce vlhkosti vzorky rozděleny do 4 kategorií (0–0,012 % hm. – nehygroskopické, 0,2–2 % hm. mírně hygroskopické, 2–15 % středně hygroskopické a > 15 % velmi hygroskopické)23. Podle pokynů Evropského lékopisu byly vzorky na základě procenta absorpce vlhkosti vzorky rozděleny do 4 kategorií (0–0,012 % hm. – nehygroskopické, 0,2–2 % hm. mírně hygroskopické, 2–15 % středně hygroskopické a > 15 % velmi hygroskopické)23.V souladu s doporučením Evropského lékopisu, v závislosti na procentu absorpce vlhkosti vzorky, byly vzorky rozděleny do 4 kategorií (0–0,012 % hm. – nehygroskopické, 0,2–2 % hm. mírně hygroskopické, 2–15 %).% умеренно гигроскопичен a > 15 % очень гигроскопичен)23. % středně hygroskopických a > 15 % velmi hygroskopických)23.根据欧洲药典指南，根据样品吸收水分的百分比，样品比，样品分为4 类（0-0,-2% t./. /w 轻微吸湿性、2–15 % 适度吸湿，> 15 % 非常吸湿）23。根据 欧洲 药典 指南 ， 根据 吸收 水分 的 百分比 样品 分为分︺ 分︺ 刻02% W.0 刻 丼 W.0 刻 丼 W.0 刻 丼湿 性 、 、 、 、 0,2-2 % W/w 轻微 、 2-15 % 适度 吸湿 ，> 15 %非常吸湿）23。V souladu s doporučením Evropského lékopisu jsou vzorky rozděleny do 4 tříd podle procenta vlhkosti absorbované vzorkem (0-0,012 % hm. – nehygroskopické, 0,2-2 % hm. mírně hygroskopické, 2-15 % hm.).% умеренно гигроскопичен, > 15 % очень гигроскопичен) 23. % středně hygroskopický, > 15 % velmi hygroskopický) 23.Hygroskopická účinnost NFCS X NFCS a TsN NFCS byla stanovena na analyzátoru DVS TA TGA Q5000 SA.Během tohoto procesu byla získána doba běhu, relativní vlhkost (RH) a hmotnost vzorku v reálném čase při 25 °C24.Obsah vlhkosti se vypočítá přesnou hmotnostní analýzou NFRCS pomocí následující rovnice:
MC je vlhkost NFRCS.m1 – suchá hmotnost NSAID.m2 je hmotnost NFRCS v reálném čase při dané relativní vlhkosti.
Celková plocha povrchu byla odhadnuta pomocí experimentu adsorpce dusíku s kapalným dusíkem po vyprázdnění vzorků při 25 °C po dobu 10 hodin (< 7 × 10–3 Torr). Celková plocha povrchu byla odhadnuta pomocí experimentu adsorpce dusíku s kapalným dusíkem po vyprázdnění vzorků při 25 °C po dobu 10 hodin (< 7 × 10–3 Torr). Общая площадь поверхности оценивалась с помощью эксперимента по адисорбоца по адисорбоц м после опорожнения образцов при 25 °С в течение 10 ч (< 7 × 10–3 Торр). Celková plocha povrchu byla odhadnuta pomocí experimentu adsorpce dusíku s kapalným dusíkem poté, co byly vzorky vyprázdněny při 25 °C po dobu 10 hodin (< 7 × 10–3 Torr).在25°C 清空样品10 小时（< 7 × 10-3 torrů在 25 °C Общая площадь поверхности оценивалась с использованием экспериментов потироадо ам aзотом после опорожнения образцов в течение 10 часов при 25°C (< 7 × 10-3 торр). Celková plocha povrchu byla odhadnuta pomocí experimentů adsorpce dusíku s kapalným dusíkem poté, co byly vzorky vyprázdněny po dobu 10 hodin při 25 °C (< 7 x 10-3 torr).Celková plocha povrchu, objem pórů a velikost pórů NFRCS byly stanoveny pomocí Quantachrome od NOVA 1000e, Rakousko pomocí softwaru RS 232.
Připravte 5% červených krvinek (fyziologický roztok jako ředidlo) z plné krve.Poté přeneste alikvot HFFC (0,25 ml) na 96jamkovou destičku a 5% RBC hmotu (0,1 ml).Směs se inkubuje při 37 °C po dobu 40 minut.Směs červených krvinek a séra byla považována za pozitivní kontrolu a směs fyziologického roztoku a červených krvinek za negativní kontrolu.Hemaglutinace byla stanovena podle Stajitzkého stupnice.Navrhovaná měřítka jsou následující: + + + + husté zrnité kamenivo;+ + + hladké spodní vycpávky se zakřivenými okraji;+ + hladké spodní vycpávky s roztrhanými okraji;+ úzké červené kroužky kolem okrajů hladkých polštářků;– (negativní) diskrétní červené tlačítko 12 uprostřed spodní prohlubně.
Hemokompatibilita NFRCS byla studována podle metody Mezinárodní organizace pro standardizaci (ISO) (ISO10993-4, 1999)26,27.Gravimetrická metoda popsaná Singhem et al.Pro hodnocení tvorby trombu v přítomnosti nebo na povrchu NFRCS byly provedeny drobné úpravy.500 mg Cs, Ch NFRCS a Cp NFRCS bylo inkubováno ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) po dobu 24 hodin při 37 °C.Po 24 hodinách byl PBS odstraněn a NFRCS byl ošetřen 2 ml krve obsahující 3,8% citrát sodný.Na povrch NFRCS přidejte k inkubovaným vzorkům 0,04 ml 0,1 M CaCl2.Po 45 minutách bylo přidáno 5 ml destilované vody pro zastavení koagulace.Koagulovaná krev na povrchu NFRK byla ošetřena 36-38% roztokem formaldehydu.Sraženiny fixované formaldehydem byly vysušeny a zváženy.Procento trombózy bylo odhadnuto výpočtem hmotnosti sklenice bez krve a vzorku (negativní kontrola) a sklenice s krví (pozitivní kontrola).
Jako počáteční potvrzení byly vzorky vizualizovány pod optickým mikroskopem, aby se pochopila schopnost povrchového povlaku HFFC, Ct propojeného a Ct sítě tvořit póry.Tenké řezy Ch a Cp z NFRCS byly oříznuty čepelí skalpelu.Výsledný řez byl umístěn na podložní sklíčko, překryt krycím sklíčkem a okraje byly fixovány lepidlem.Připravená sklíčka byla prohlížena pod optickým mikroskopem a fotografie byly pořízeny při různém zvětšení.
Depozice polymeru v Ct sítích byla vizualizována pomocí fluorescenční mikroskopie založené na metodě popsané Rice et al.29. Kompozice HFFC použitá pro formulaci byla smíchána s fluorescenčním barvivem (amaranth) a NFRCS (Ch & Cp) byly připraveny způsobem uvedeným výše. Kompozice HFFC použitá pro formulaci byla smíchána s fluorescenčním barvivem (amaranth) a NFRCS (Ch & Cp) byly připraveny způsobem uvedeným výše.Kompozice HFFC použitá pro formulaci byla smíchána s fluorescenčním barvivem (amaranth) a NFRCS (Ch a Cp) byl získán podle výše uvedeného způsobu.将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方椼到的方椼到的方椼到的料将用于配方的HFFC 组合物与荧光染料（苋菜）混合，并按照前面提到的方椼到的方椼到的方椼到的料Kompozice HFFC použitá ve formulaci byla smíchána s fluorescenčním barvivem (Amaranth) a obdržela NFRCS (Ch a Cp), jak bylo zmíněno dříve.Ze získaných vzorků byly nařezány tenké řezy NFRK, umístěny na podložní sklíčka a překryty krycími sklíčky.Připravená sklíčka pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem pomocí zeleného filtru (310-380 nm).Snímky byly pořízeny při 4násobném zvětšení, aby bylo možné porozumět vztahům Ct a nadměrnému ukládání polymeru v síti Ct.
Povrchová topografie NFRCS Ch a Cp byla stanovena pomocí mikroskopu atomárních sil (AFM) s ultra ostrou konzolou TESP v režimu klepání: 42 N/m, 320 kHz, ROC 2-5 nm, Bruker, Taiwan.Drsnost povrchu byla stanovena střední hodnotou čtverce (RMS) pomocí softwaru (Scanning Probe Image Processor).Různá místa NFRCS byla vykreslena na 3D snímcích, aby se zkontrolovala jednotnost povrchu.Směrodatná odchylka skóre pro danou oblast je definována jako drsnost povrchu.Rovnice RMS byla použita pro kvantifikaci drsnosti povrchu NFRCS31.
Studie založené na FESEM byly provedeny s použitím FESEM, SU8000, HI-0876-0003, Hitachi, Tokio, aby porozuměly povrchové morfologii Ch NFRCS a Cp NFRCS, které vykazovaly lepší BCT než Cm NFRCS.Studie FESEM byla provedena podle metody popsané Zhao et al.32 s drobnými úpravami.NFRCS 20 až 30 mg Ch NFRCS a Cp NFRCS bylo předem smícháno s 20 ul 3,8% citrátu sodného předem smíchaného s krysí krví.Ke vzorkům ošetřeným krví bylo přidáno 20 ul 0,2 M CaCl2 pro zahájení koagulace a vzorky byly inkubovány při pokojové teplotě po dobu 10 minut.Kromě toho byly z povrchu NFRCS odstraněny přebytečné erytrocyty opláchnutím fyziologickým roztokem.
Následující vzorky byly ošetřeny 0,1% glutaraldehydem a poté vysušeny v horkovzdušné sušárně při 37 °C, aby se odstranila vlhkost.Vysušené vzorky byly potaženy a analyzovány32.Další snímky získané během analýzy byly tvorba sraženiny na povrchu jednotlivých bavlněných vláken, depozice polymeru mezi Ct, morfologie erytrocytů (tvar), integrita sraženiny a morfologie erytrocytů v přítomnosti NFRCS.Neošetřené oblasti NFRCS a oblasti NFRCS ošetřené Ch a Cp inkubované s krví byly skenovány na elementární ionty (sodík, draslík, dusík, vápník, hořčík, zinek, měď a selen)33.Porovnejte procenta elementárních iontů mezi ošetřenými a neošetřenými vzorky, abyste pochopili akumulaci elementárních iontů během tvorby sraženiny a homogenitu sraženiny.
Tloušťka povrchového povlaku Cp HFFC na povrchu Ct byla stanovena pomocí FESEM.Příčné řezy Cp NFRCS byly vyříznuty z kostry a potaženy rozprašováním.Výsledné vzorky naprašovaného povlaku byly pozorovány pomocí FESEM a byla změřena tloušťka povrchového povlaku 34, 35, 36 um.
Rentgenové mikro-CT poskytuje 3D nedestruktivní zobrazování s vysokým rozlišením a umožňuje studovat vnitřní strukturní uspořádání NFRK.Micro-CT využívá rentgenový paprsek procházející vzorkem k záznamu lokálního lineárního koeficientu zeslabení rentgenového záření ve vzorku, což pomáhá získat morfologické informace.Vnitřní umístění Ct v Cp NFRCS a krví ošetřeném Cp NFRCS bylo vyšetřeno pomocí mikro-CT, aby se pochopila účinnost absorpce a srážení krve v přítomnosti NFRCS37,38,39.3D struktury vzorků Cp NFRCS ošetřených krví a neošetřených vzorků byly rekonstruovány pomocí micro-CT (V|tome|x S240, Phoenix, Německo).Pomocí softwaru VG STUDIO-MAX verze 2.2 bylo pořízeno několik rentgenových snímků z různých úhlů (ideálně 360° pokrytí) pro vytvoření 3D snímků pro NFRCS.Shromážděná data z projekce byla rekonstruována do 3D objemových snímků pomocí odpovídajícího jednoduchého softwaru 3D ScanIP Academic.
Kromě toho, aby se porozumělo distribuci sraženiny, bylo k NFRCS přidáno 20 ul předem smíchané citrátové krve a 20 ul 0,2 M CaCl2 pro zahájení srážení krve.Připravené vzorky se nechají vytvrdit.Povrch NFRK byl ošetřen 0,5% glutaraldehydem a sušen v horkovzdušné sušárně při 30–40°C po dobu 30 minut.Krevní sraženina vytvořená na NFRCS byla naskenována, rekonstruována a byl vizualizován 3D obraz krevní sraženiny.
Antibakteriální testy byly provedeny na Cp NFRCS (nejlépe ve srovnání s Ch NFRCS) za použití dříve popsané metody s menšími úpravami.Antibakteriální aktivita Cp NFRCS a Cp HFFC byla stanovena pomocí tří různých testovacích mikroorganismů [S.aureus (grampozitivní bakterie), E.coli (gramnegativní bakterie) a bílé Candida (C.albicans)] rostoucích na agaru v Petriho miskách v inkubátoru.Rovnoměrně naočkujte 50 ml zředěné suspenze bakteriální kultury v koncentraci 105-106 CFU ml-1 na agarové médium.Médium nalijeme do Petriho misky a necháme ztuhnout.Na povrchu agarové plotny byly vytvořeny jamky pro naplnění HFFC (3 jamky pro HFFC a 1 pro negativní kontrolu).Přidejte 200 ul HFFC do 3 jamek a 200 ul pH 7,4 PBS do 4. jamky.Na druhou stranu Petriho misky položte 12 mm Cp NFRCS disk na ztuhlý agar a navlhčete PBS (pH 7,4).Tablety ciprofloxacin, ampicilin a flukonazol jsou považovány za referenční standardy pro Staphylococcus aureus, Escherichia coli a Candida albicans.Změřte zónu inhibice ručně a pořiďte digitální snímek zóny inhibice.
Po institucionálním etickém schválení byla studie provedena na Kasturba Medical College of Education and Research v Manipalu, Karnataka, v jižní Indii.Experimentální protokol TEG in vitro byl přezkoumán a schválen Institucionálním etickým výborem Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Subjekty byly rekrutovány z dobrovolných dárců krve (ve věku 18 až 55 let) z nemocniční krevní banky.Kromě toho byl od dobrovolníků získán formulář informovaného souhlasu s odběrem vzorků krve.Nativní TEG (N-TEG) ​​byl použit ke studiu účinku formulace Cp HFFC na plnou krev předem smíchanou s citrátem sodným.N-TEG je široce uznáván pro svou roli při resuscitaci v místě péče, což způsobuje problémy klinickým lékařům kvůli možnosti klinicky významného zpoždění výsledků (rutinní koagulační testy).N-TEG analýza byla provedena s použitím plné krve.Od všech účastníků byl získán informovaný souhlas a podrobná anamnéza.Studie nezahrnovala účastníky s hemostatickými nebo trombotickými komplikacemi, jako je těhotenství/poporodní období nebo onemocnění jater.Ze studie byli také vyloučeni jedinci užívající léky ovlivňující koagulační kaskádu.U všech účastníků byly standardními postupy provedeny základní laboratorní testy (hemoglobin, protrombinový čas, aktivovaný tromboplastin a počet trombocytů).N-TEG určuje viskoelasticitu krevní sraženiny, počáteční strukturu sraženiny, interakci částic, zpevnění sraženiny a lýzu sraženiny.Analýza N-TEG poskytuje grafická a numerická data o společných účincích několika buněčných prvků a plazmatu.Analýza N-TEG byla provedena na dvou různých objemech Cp HFFC (10 ul a 50 ul).Ve výsledku byl k 10 μl Cp HFFC přidán 1 ml plné krve s kyselinou citrónovou.Přidejte 1 ml (Cp HFFC + citrátová krev), 340 ul smíšené krve do 20 ul 0,2 M CaCl2 obsahující TEG misku.Poté byly misky TEG vloženy do TEG® 5000, USA pro měření R, K, úhlu alfa, MA, G, CI, TPI, EPL, LY 30 % krevních vzorků v přítomnosti Cp HFFC41.
Protokol studie in vivo byl přezkoumán a schválen Institucionálním výborem pro etiku zvířat (IAEC), Kasturba School of Medicine, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny v souladu s doporučeními Výboru pro kontrolu a dohled nad pokusy na zvířatech (CPCSEA).Všechny in vivo studie NFRCS (2 x 2 cm2) byly provedeny na samicích potkanů ​​Wistar (o hmotnosti 200 až 250 g).Všechna zvířata byla aklimatizována na teplotu 24-26 °C, zvířata měla volný přístup ke standardní potravě a vodě ad libitum.Všechna zvířata byla náhodně rozdělena do různých skupin, každá skupina sestávala ze tří zvířat.Všechny studie byly provedeny v souladu s Animal Studies: Report of In vivo Experiments43.Před studií byla zvířata anestetizována intraperitoneálním (ip) podáním směsi 20-50 mg ketaminu (na 1 kg tělesné hmotnosti) a 2-10 mg xylazinu (na 1 kg tělesné hmotnosti).Po studii byl vypočítán objem krvácení vyhodnocením rozdílu mezi počáteční a konečnou hmotností vzorků, průměrná hodnota získaná ze tří testů byla vzata jako objem krvácení vzorku.
Model amputace potkaního ocasu byl implementován pro pochopení potenciálu NFRCS modulovat krvácení při traumatu, boji nebo dopravní nehodě (model zranění).Skalpelem odřízněte 50 % ocasu a umístěte na 15 s na vzduch, abyste zajistili normální krvácení.Kromě toho byly testované vzorky umístěny na ocas krysy působením tlaku (Ct, Cs, Ch NFRCS a Cp NFRCS).Krvácení a PCT byly hlášeny u testovacích vzorků (n ​​= 3)17,45.
Účinnost regulace tlaku NFRCS v boji byla zkoumána na modelu povrchové femorální tepny.Femorální tepna se obnaží, propíchne trokarem 24G a během 15 sekund se vykrvácí.Poté, co je pozorováno nekontrolované krvácení, je zkušební vzorek umístěn na místo vpichu za tlaku.Bezprostředně po aplikaci testovaného vzorku byla zaznamenána doba srážení a hemostatická účinnost byla pozorována po dobu dalších 5 minut.Stejný postup byl opakován s Cs a Ct46.
Dowling a kol.47 navrhl model poškození jater pro posouzení hemostatického potenciálu hemostatických materiálů v kontextu intraoperačního krvácení.BCT byla zaznamenána pro vzorky Ct (negativní kontrola), rámec Cs (pozitivní kontrola), vzorky Ch NFRCS a vzorky Cp NFRCS.Suprahepatická vena cava krysy byla obnažena provedením střední laparotomie.Poté byla distální část levého laloku vystřižena nůžkami.Skalpelem proveďte řez do jater a nechte je několik sekund vykrvácet.Přesně zvážené testovací vzorky Ch NFRCS a Cp NFRCS byly umístěny na poškozený povrch bez jakéhokoli pozitivního tlaku a byla zaznamenána BCT.Kontrolní skupina (Ct) poté aplikovala tlak následovaný Cs 30 s47 bez porušení poranění.
Testy hojení ran in vivo byly provedeny za použití modelu excizního poranění, aby se vyhodnotily vlastnosti hojení ran vyvinutých NFRCS na bázi polymeru.Modely excizních ran byly vybrány a provedeny podle dříve publikovaných metod s drobnými úpravami19,32,48.Všechna zvířata byla anestetizována, jak bylo popsáno dříve.Pomocí bioptického děrovače (12 mm) proveďte hluboký kruhový řez do kůže na zádech.Připravená místa rány byla pokryta Cs (pozitivní kontrola), Ct (rozpoznalo se, že vatové tampony narušují hojení), Ch NFRCS a Cp NFRCS (experimentální skupina) a negativní kontrola bez jakéhokoli ošetření.Každý den studie byla u všech potkanů ​​měřena plocha rány.Pomocí digitálního fotoaparátu vyfoťte oblast rány a nasaďte nový obvaz.Procento uzavření rány bylo měřeno podle následujícího vzorce:
Na základě procenta uzavření rány 12. den studie byla vyříznuta kůže potkana nejlepší skupiny ((Cp NFRCS) a kontrolní skupina) a studována barvením H&E a barvením Massonovým trichromem. Na základě procenta uzavření rány 12. den studie byla vyříznuta kůže potkana nejlepší skupiny ((Cp NFRCS) a kontrolní skupina) a studována barvením H&E a barvením Massonovým trichromem.Na základě procenta uzavření rány 12. den studie byla kůže krys nejlepší skupiny ((Cp NFRCS) a kontrolní skupiny) vyříznuta a vyšetřena barvením hematoxylinem-eosinem a Massonovým trichromem.根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的塣组)的塡毤服三色染色研究。根据研究第12天的伤口闭合百分比，切除最佳组((Cp NFRCS)和对照组)的塣组)的塥蒛E蛤茤朿眳组)Krysy v nejlepší skupině ((Cp NFRCS) a kontrolní skupiny) byly vyříznuty pro barvení hematoxylinem-eosinem a barvení Massonovým trichromem na základě procenta uzavření rány v den 12 studie.Implementovaný postup barvení byl proveden podle dříve popsaných metod49,50.Stručně řečeno, po fixaci v 10% formalínu byly vzorky dehydratovány za použití řady odstupňovaných alkoholů.Použijte mikrotom k získání tenkých řezů (5 µm silných) vyříznuté tkáně.Tenké sériové řezy kontrol a Cp NFRCS byly ošetřeny hematoxylinem a eosinem ke studiu histopatologických změn.Massonovo trichromové barvení bylo použito k detekci tvorby kolagenových fibril.Získané výsledky byly slepě studovány patology.
Stabilita vzorků Cp NFRCS byla studována při pokojové teplotě (25 °C ± 2 °C/60 % RH ± 5 %) po dobu 12 měsíců51.Cp NFRCS (povrchová změna barvy a mikrobiální růst) byla vizuálně kontrolována a testována na odolnost proti otěru a BCT podle výše uvedených metod uvedených v části Materiály a metody.
Škálovatelnost a reprodukovatelnost Cp NFRCS byla zkoumána přípravou Cp NFRCS o velikosti 15×15 cm2.Kromě toho byly vzorky o hmotnosti 30 mg (n = 5) vyříznuty z různých frakcí Cp NFRCS a BCT studovaných vzorků byla vyhodnocena, jak bylo popsáno dříve v části Metody.
Pokusili jsme se vyvinout různé tvary a struktury pomocí kompozic Cp NFRCS pro různé biomedicínské aplikace.Takové tvary nebo konfigurace zahrnují kónické výtěry pro krvácení z nosu, stomatologické výkony a válcové výtěry pro vaginální krvácení.
Všechny soubory dat jsou vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka a byly analyzovány pomocí ANOVA s použitím Prism 5.03 (GraphPad, San Diego, CA, USA) následovaným Bonferroniho testem vícenásobného srovnání (*p<0,05).
Všechny postupy prováděné při studiích na lidech byly v souladu se standardy Ústavu a Národní výzkumné rady, jakož i Helsinskou deklarací z roku 1964 a jejími následnými dodatky, případně podobnými etickými standardy.Všichni účastníci byli informováni o rysech studie a její dobrovolnosti.Údaje o účastnících zůstávají po shromáždění důvěrné.Experimentální protokol TEG in vitro byl přezkoumán a schválen Institucionálním etickým výborem Kasturba Medical College, Manipal, Karnataka (IEC: 674/2020).Dobrovolníci podepsali informovaný souhlas s odběrem vzorků krve.
Všechny postupy provedené ve studiích na zvířatech byly provedeny v souladu s lékařskou fakultou Kastuba, Manipal Institute of Higher Education, Manipal (IAEC/KMC/69/2020).Všechny navržené pokusy na zvířatech byly provedeny v souladu s pokyny Výboru pro kontrolu a dohled nad pokusy na zvířatech (CPCSEA).Všichni autoři se řídí pokyny ARRIVE.
FTIR spektra všech NFRCS byla analyzována a porovnána se spektrem chitosanu ukázaným na obrázku 2A.Charakteristické spektrální píky chitosanu (zaznamenané) při 3437 cm-1 (OH a NH protažení, překrytí), 2945 a 2897 cm-1 (CH natažení), 1660 cm-1 (napětí NH2), 1589 cm-1 (N-H ohyb), 1157 cm-1 (Ostrech-16 cm-1, C10-most (roztažení), C10-most 993 cm-I (roztažení CO, Bo-OH) 52,53,54.Doplňková tabulka S1 ukazuje hodnoty absorpčního spektra FTIR NFRCS pro chitosan (reportér), čistý chitosan, Cm, Ch a Cp.FTIR spektra všech NFRCS (Cm, Ch a Cp) vykazovala stejné charakteristické absorpční pásy jako čistý chitosan bez jakýchkoliv významných změn (obr. 2A).Výsledky FTIR potvrdily nepřítomnost chemických nebo fyzikálních interakcí mezi polymery použitými k vývoji NFRCS, což ukazuje, že použité polymery jsou inertní.
In vitro charakterizace Cm NFRCS, Ch NFRCS, Cp NFRCS a Cs.(A) představuje kombinovaná FTIR spektra kompozic chitosanu a Cm NFRCS, Ch NFRCS a Cp NFRCS při kompresi.(B) a) Rychlost absorpce NFRCS Cm, Ch, Cp a Cg plnou krví (n = 3);Vzorky Ct vykazovaly vyšší BAR, protože vatový tampon má vyšší absorpční účinnost;b) Krev po absorpci krve Ilustrace absorbovaného vzorku.Grafické znázornění BCT testovaného vzorku C (Cp NFRCS měl nejlepší BCT (15 s, n = 3)). Data v C, D, E a G byla ukázána jako průměr ± SD a chybové úsečky představují SD,***p < 0,0001. Data v C, D, E a G byla ukázána jako průměr ± SD a chybové úsečky představují SD,***p < 0,0001. Данные в C, D, E a G представлены как среднее ± стандартное отклонение, а планки поЎтрейшнос дартное отклонение, ***p <0,0001. Data v C, D, E a G jsou prezentována jako průměr ± standardní odchylka a chybové úsečky představují standardní odchylku,***p<0,0001. C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 C、D、E 和G 中的数据显示为平均值± SD，误差线代表SD，***p < 0,0001。 Данные в C, D, E a G показаны как среднее значение ± стандартное отклонение, планки посетрех стандартное отклонение, ***p <0,0001. Data v C, D, E a G jsou uvedena jako průměr ± standardní odchylka, chybové úsečky představují standardní odchylku,***p<0,0001.